JPH09104637A

JPH09104637A - 過凝固または低線溶状態およびその類縁疾患の予防治療剤

Info

Publication number: JPH09104637A
Application number: JP7260184A
Authority: JP
Inventors: Minoru Tsukada; 稔塚田; Masakazu Niitome; 正和新留; Tomohiko Matsui; 智彦松井; Hiromi Tsuchiyama; 博美土山; Masahiro Watanabe; 正弘渡辺
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1995-10-06
Publication date: 1997-04-22

Abstract

(57)【要約】【解決手段】プロウロキナーゼを有効成分とする、過
凝固または低線溶状態の予防治療剤、ならびにその類縁
疾患である汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）および臓
器不全の予防治療剤の提供。【効果】血栓溶解率を上昇させるとともに、臓器の水
分蓄積（浮腫）を軽減する作用を有し、かつ血液凝固線
溶系パラメータに対して有意な影響を及ぼさないから、
過凝固または低線溶状態の予防治療剤、ＤＩＣの予防治
療剤、臓器不全の予防治療剤、および浮腫の予防治療剤
として極めて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、過凝固または低線
溶状態の予防治療剤、ならびにその類縁疾患である汎発
性血管内凝固症候群（以下「ＤＩＣ」という。）、臓器
不全および浮腫の予防治療剤に関する。

【０００２】

【発明の背景】敗血症（循環血液を介して微生物または
その毒素が広がることによる全身性疾患）などにより、
血中プラスミノーゲン活性が低下し、あるいは血中プラ
スミノーゲン・アクチベーター・インヒビター（以下
「ＰＡＩ−１」という。）活性が上昇する過凝固または
低線溶状態となる。

【０００３】このような状態のときは、全身の血管に血
栓が多発してＤＩＣを発症しやすい。また、臓器内の血
栓が増加すると、臓器機能障害が生じ、多臓器不全（Ｍ
ＯＦ）などの臓器不全および浮腫の発症頻度が高くな
る。例えばＭＯＦ〔ＡＲＤＳ（成人呼吸窮迫症候群）、
ＡＲＦ（急性腎不全）など〕は重篤となりやすく、死亡
率が極めて高い。

【０００４】過凝固または低線溶状態とは、血中プラス
ミノーゲン活性が低下し（ヒトの場合、例えば正常レベ
ルの７５％以下）、あるいは血中ＰＡＩ−１活性が上昇
している状態（ヒトの場合、例えば正常レベルの２倍以
上）をいう。ＤＩＣとは、白血病、悪性腫瘍、感染症な
どの種々の基礎疾患の存在下、何らかの誘発因子によっ
て血液凝固系が過度に活性化をうけ、各種臓器を含む全
身の細小血管内に多数の血栓が形成される症候群をい
い、とりわけ、重症感染症（敗血症）転帰のＤＩＣで
は、血中ＰＡＩ−１活性が異常上昇するなど低線溶（凝
固優位）の状態を来たすので、臓器血栓が溶けにくく、
その結果、臓器の循環障害を招来し、多臓器不全、浮腫
に陥りやすい。臓器不全とは、腎臓、肺、肝臓などの各
種臓器に血栓が生じることによる臓器組織の機能障害の
病態をいう。また、浮腫とは、腎臓、肺、肝臓などの各
種臓器や組織に当該部位の毛細血管より水分や血漿など
が漏出して生じる病態をいう。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、敗血症など
による過凝固または低線溶状態を改善し、ＤＩＣの発症
阻止または憎悪化抑制、ＭＯＦなどの臓器不全および浮
腫の発症阻止または改善を目的とするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、プロウロキナー
ゼが血栓の自然溶解率を上昇させることを見いだし、本
発明を完成するに至った。

【０００７】即ち、本発明は、プロウロキナーゼを有効
成分とする、過凝固または低線溶状態の予防治療剤、Ｄ
ＩＣの予防治療剤、臓器不全の予防治療剤、および浮腫
の予防治療剤である。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明で使用されるプロウロキナ
ーゼは、そのままでは殆ど線溶活性を有しないが、プラ
スミンなどの酵素処理により、二本鎖ウロキナーゼに変
換されて線溶活性を示すものである。また、フィブリン
存在下では線溶活性を示すものである。

【０００９】本発明で使用されるプロウロキナーゼのま
ず第１の代表例は、分子量５０，０００〜５５，０００
程度で、一本鎖のペプチド結合構造を有するものであ
る。このようなプロウロキナーゼとしては、例えば構成
アミノ酸４１１個のものが挙げられる（アミノ酸配列は
特開昭６０−６２９８１号公報参照）。

【００１０】上記プロウロキナーゼの由来には特に制限
はなく、例えば細胞培養法、遺伝子工学法などにより調
製されたものが例示される。細胞培養法は特開昭６０−
６２９８１号公報などに、遺伝子工学法は特開昭６０−
１８０５９１号公報、同６１−１７７９８７号公報、同
６２−１４９６２５号公報、同６３−１０５６７５号公
報などにそれぞれ開示されている。

【００１１】本発明で使用されるプロウロキナーゼは上
記のものに限定されず、その誘導体をも包含する概念で
ある。かかる誘導体としてはプロウロキナーゼのエピダ
ーマルグロースファクタードメインの全領域もしくはそ
の一部が欠失された蛋白質分子、または該全領域もしく
はその一部が他のアミノ酸残基で置換されている蛋白質
分子などが挙げられる（特開昭６３−１４６７８９号公
報、特開平３−８７１８０号公報、同３−８７１８１号
公報など）。従って、特に言及しない限り、本明細書に
おけるプロウロキナーゼとは、プロウロキナーゼ自体お
よび上記の如きプロウロキナーゼ誘導体を意味するもの
である。プロウロキナーゼ誘導体は、通常、分子量４
０，０００〜５５，０００程度で、プロウロキナーゼ自
体と同様に一本鎖のペプチド結合構造を有する。また、
線溶活性の発現様式もプロウロキナーゼ自体と同じであ
る。この誘導体は、例えば遺伝子工学的な手法により調
製される（特開昭６０−１４６７８９号公報など参
照）。

【００１２】プロウロキナーゼは高度精製品であること
が望ましい。例えば、少なくとも３００Ｕ（単位）／ｍ
ｇ蛋白程度のものが例示される。プロウロキナーゼ活性
における１Ｕ（単位）は、プラスミンで活性化したプロ
ウロキナーゼを合成基質Ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ−２４４４，Ｋａｂｉ社製）と反応さ
せたとき、１秒間に１ｎｍｏｌのｐＮＡを遊離させる量
とした。なお、本測定法でプロウロキナーゼ活性を測定
するとき、３００Ｕはウロキナーゼ国際単位力価の１×
１０⁵ＩＵに相当する。

【００１３】本発明の予防治療剤は、溶液、懸濁液、乳
濁液として、または用時に溶剤に溶解もしくは懸濁して
用いられ、薬理的に許容される補助成分を含んでいても
よい。補助的成分としては、例えば安定剤、溶解補助
剤、懸濁化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤、賦
形剤が例示される。

【００１４】本発明の予防治療剤は、ヒトを始めとする
哺乳類動物に投与でき、動脈内注入、静脈内注射、持続
点滴あるいは局所投与などが例示される。本発明の予防
治療剤の投与量は、性別、年齢、体重、症状、治療効
果、投与方法、投与期間などにより異なるが、成人１日
当たり１５００〜２００００Ｕ程度、投与期間は１〜１
０日間程度が例示される。

【００１５】本発明の予防治療剤の有効成分であるプロ
ウロキナーゼは、血液凝固線溶系パラメーターに対して
有意な影響を及ぼすことなく、線溶能を高めることか
ら、本発明の予防治療剤は、過凝固または低線溶状態の
予防および／または治療に極めて有用である。さらに、
かかる過凝固または低線溶状態に起因して惹起し得るＤ
ＩＣ、臓器不全または浮腫に対して、本発明の予防治療
剤は極めて有用である。

【００１６】以下、参考例、実施例、参考実験例および
実験例により、本発明をさらに詳しく説明するが、これ
らにより本発明が限定されるものではない。

【００１７】

【参考例・実施例・参考実験例・実験例】

参考例：プロウロキナーゼの調製培養人腎細胞を０．１％ヒト血清アルブミン添加無血清
培養液に３日間培養し、培養液を遠心分離し、その上清
を凍結して保存した。プールした培養上清をｐＨ５．５
に調製した後、ＣＭ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−５０に接
触させた。０．１６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）でカ
ラムを洗浄した後、０．１６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．
５）で吸着していたプロウロキナーゼを溶出した。

【００１８】一方、プロウロキナーゼで予め免疫したウ
マから得られた抗血清を精製して抗プロウロキナーゼ抗
体を回収した。このウマ由来の抗プロウロキナーゼ抗体
をＢｒＣＮ活性化アガロース（セファロース４Ｂ、ファ
ルマシア社製）に固定化した。この抗体カラムを０．５
Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
５）で平衡化し、これに上記プロウロキナーゼを含有す
る溶出液を接触させた。０．５Ｍ塩化ナトリウム含有
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）でカラムを洗浄し
た後、吸着していたプロウロキナーゼを０．５Ｍ塩化ナ
トリウム含有０．２Ｍグリシン−塩酸水溶液（ｐＨ２．
５）で溶出させた。溶出液を０．５Ｍ塩化ナトリウム含
有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）により濃縮・透
析した。

【００１９】ウサギ由来抗ウマＩｇＧ抗体（ウマＩｇＧ
をウサギに免疫して得られた抗血清を精製したもの）を
固定化したアガロース（セファロース４Ｂ、ファルマシ
ア社製）を上記緩衝液で平衡化しておき、このプロウロ
キナーゼ含有画分を接触させ、非吸着画分を回収した。
さらに、この画分を、上記緩衝液で平衡化したパラアミ
ノベンズアミジン−アガロース（ベンザミジン−セファ
ロース６Ｂ、ファルマシア社製）に接触させ、その非吸
着画分を回収した。当該画分を除菌濾過した後、凍結乾
燥した。

【００２０】実施例１細胞培養由来の精製プロウロキナーゼ（比活性４００Ｕ
／ｍｇ）１５００Ｕ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）５
０ｍｇを含有する製剤を調製した。

【００２１】実施例２細胞培養由来の精製プロウロキナーゼ（比活性４００Ｕ
／ｍｇ）９０００Ｕ、ＨＳＡ３００ｍｇを含有する製剤
を調製した。

【００２２】参考実験例：ラット肺塞栓モデルの作製ａ）リポポリサッカライド（ＬＰＳ）の投与体重２０９〜２３８ｇのＳＤ系雄性ラットを２０匹ずつ
以下の４つの実験群に分け、それぞれ以下の要領で１ｍ
ｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ０２６：Ｂ６，Ｄｉ
ｆｃｏ社製）または生理食塩液を２ｍｌ／ｋｇ静脈内投
与した。

【００２３】肺塞栓を作製する２時間前に生理食塩
液を投与する（ＬＰＳ無投与群）。肺塞栓を作製する２時間前にＬＰＳを投与する（Ｌ
ＰＳ投与２時間後群）。肺塞栓を作製する２６時間前にＬＰＳを投与し、そ
の２４時間後（肺塞栓を作製する２時間前）に生理食塩
液を投与する（ＬＰＳ投与２６時間後群）。肺塞栓を作製する２６時間前にＬＰＳを投与し、そ
の２４時間後（肺塞栓を作製する２時間前）に再度同量
のＬＰＳを投与する（ＬＰＳ２回投与群）。

【００２４】ｂ）血栓溶解率の測定方法ａ）に従ってそれぞれＬＰＳ処理したラットを１．
２５ｇ／ｋｇのウレタンの皮下注射により麻酔した。尾
静脈より１％（ｗ／ｖ）ＮａＩ溶液を２００μｌ／ｂｏ
ｄｙ投与した。その後、あらかじめ放射活性を測定した
¹²⁵Ｉ−プラズマクロットサスペンジョン（以下「ＰＣ
Ｓ」という。）１ｍｌ（約３．０×１０ ⁵ｃｐｍ）を同
様に尾静脈内に投与した。ＰＣＳ投与５分後、１，２ま
たは３時間後に腹部大静脈より２ｍｌクエン酸採血し、
動物を屠殺して肺を摘出した。この肺に残存する放射活
性を測定して血栓溶解率を測定した。なお、血栓溶解率
は次式により求めた。

【００２５】

【数１】

【００２６】１）実験終了時の肺放射活性残存率２）ＰＣＳ投与５分後に動物を屠殺し、その肺放射活性
を求めた。

【００２７】また、ＰＣＳの作製法は、以下の通りであ
る。ラット血漿１２０ｍｌに約１８０μＣｉの¹²⁵Ｉ−
ヒトフィブリノーゲンを加え充分に攪拌後、それぞれ
２．０ｍｌを２５０ｍＭのＣａＣｌ₂および１００Ｕ／
ｍｌのヒトトロンビンの混液（２００μｌ）を予め入れ
ておいた試験管に加え、３７℃で３０分間以上放置して
クロットを作製した。作製したクロットを生理食塩液で
３回洗浄後、さらに生理食塩液中で１時間放置して充分
に洗浄を行い、引き続き液体窒素で冷却した乳鉢中で凍
結粉砕し、クロット１個あたり５ｍｌの生理食塩液を加
えてＰＣＳとした。

【００２８】ｃ）血漿中パラメーターの測定採血した血液を４℃，３０００ｒｐｍで１０分間遠心分
離して血漿を得、５０μｌずつ４本に分注して、以下の
血中パラメーターの測定に供した。

【００２９】ＰＡＩ−１活性キット〔Spectrolyse （登録商標）(pl)PAI ，Biopool
社製〕の測定法に準じて測定した。

【００３０】プラスミノーゲン（ｐｌｇ）活性採取した血漿を血漿希釈緩衝液〔０．９％（ｗ／ｖ）Ｇ
ｌｙ，０．２５ＭＬｙｓ−ＨＣｌ，０．０５％（ｗ／
ｖ）ＮａＮ₃，ｐＨ７．８〕で１６倍希釈して被験血漿
とした。被験血漿５０μｌにウロキナーゼ（ミドリ十字
社製）２．０×１０⁴ＩＵ／ｍｌ（生理食塩液で調製）
５０μｌを加えて室温で５分間静置した。合成基質液
（Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ，ペプチド
研究所社製、０．１ｍＭ，０．１５ＭＮａＣｌ含，５
０ｍＭトリス緩衝液，ｐＨ７．４）５０μｌを加え、室
温で１０分間静置した。

【００３１】その後、５０％（ｗ／ｖ）酢酸を加えて反
応を停止させ、蛍光光度計（フルオロスキャンII，Tite
rtek社製）を用いて励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６
０ｎｍにて蛍光強度を測定した。

【００３２】なお、標準物質としては、３７匹のＳＤ系
雄性ラットから採取した血漿をプールし、これを被験血
漿と同様に１６倍希釈して、プラスミノーゲン活性１０
０％とした。また、これを２，４，８，１６倍に希釈し
て検量線を作成した。

【００３３】フィブリノーゲン量キット（フィブリノーゲン測定用試薬・Ｂ，国際試薬社
製）の測定法に従い、トロンビン凝固時間を測定して求
めた。凝固時間の測定には、血液凝固自動測定装置（Am
elung CoagulometerＫＣ４Ａ，バクスタトラベノール社
製）を用いた。

【００３４】 α₂−ＰＩ（プラスミン・インヒビ
タ）活性キット（テストチームＡＰＬ・２キット，第一化学薬品
社製）の測定法に従って測定した。

【００３５】血栓溶解率の結果を図１に、血中パラメー
ターの結果を要約して表１にそれぞれ示す。

【００３６】

【表１】

【００３７】以上の結果から、ＬＰＳ投与により臓器中
血栓の自然溶解能が少なくとも一定期間低下することが
わかる。血栓の自然溶解能の低下が、血中ＰＡＩ−１活
性が増加した時期のみならず、血中ＰＡＩ−１活性の増
加が認められず、血中ｐｌｇ活性のみが低下した時期に
おいても認められ、また血中ｐｌｇ活性が低下した時期
に再度ＬＰＳを投与し、血中ＰＡＩ−１活性が増加した
ラットではさらに血栓の自然溶解能が低下したことか
ら、血中ＰＡＩ−１活性、血中ｐｌｇ活性のそれぞれが
血栓の自然溶解能の低下に関与することが示唆された。

【００３８】実験例１（ラット肺塞栓モデルにおけるプ
ロウロキナーゼの血栓溶解作用）血中ｐｌｇ活性が低下したラット、ならびに血中ｐｌｇ
活性の低下および血中ＰＡＩ−１活性の上昇が同時に誘
導されたラットを用いて、プロウロキナーゼの単独投与
による血栓溶解作用を調べた。具体的には、参考実験例
に準じて、エンドトキシン（ＬＰＳ２ｍｇ／ｋｇ）を投
与することにより血中ｐｌｇ活性を低下させたラット
（ＬＰＳ投与２６時間後のラット）、およびエンドトキ
シン投与により血中ｐｌｇ活性の低下と血中ＰＡＩ−１
活性の上昇を同時に誘導したラット（ＬＰＳ２回投与後
のラット）を用いて肺塞栓モデルをそれぞれ作製し、Ｐ
ＣＳ投与５分後に尾静脈より被験薬剤をボーラス投与
（１ｍｌ／ｂｏｄｙ）した。

【００３９】ラット肺塞栓モデルで有意な血栓溶解効果
を示し、臨床投与量に相当するトロンボリーゼ（ＰＰ
Ａ，ミドリ十字社製）１０万ＩＵ／ｋｇを被験薬剤とし
て投与した。なお、ビークルの組成は、５０ｍＭリン酸
塩，０．１５ＭのＮａＣｌ，５．０％（ｗ／ｖ）ショ
糖，０．２％（ｗ／ｖ）Ｌｙｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２で
ある。

【００４０】また、エンドトキシンを投与しないノーマ
ルラットを用いた肺塞栓モデルに、ビークルを１ｍｌ投
与してノーマル群とした。

【００４１】以上の実験群を要約すると以下のように列
挙される。ａ）ＬＰＳ投与２６時間後のラット（ＰＣＳにより肺塞
栓を作製する２６時間前にＬＰＳ投与） (1) ＬＰＳ投与２６時間後に１０万ＩＵ／ｋｇのＰＰ
Ａを投与する。 (2) ＬＰＳ投与２６時間後にビークルを投与する（ビ
ークル群）。 (3) ＬＰＳを投与せずに、ＰＣＳ投与後にビークルを
投与する（ノーマル群）。

【００４２】ｂ）ＬＰＳ２回投与後のラット（ＰＣＳに
より肺塞栓を作製する２６時間前にＬＰＳを投与し、そ
の２４時間後に再度同量のＬＰＳ投与） (1) 再度のＬＰＳ投与２時間後に１０万ＩＵ／ｋｇの
ＰＰＡを投与する。 (2) 再度のＬＰＳ投与２時間後にビークルを投与する
（ビークル群）。 (3) ＬＰＳを１回だけ投与して２時間後にＰＣＳを投
与し、ビークルを投与する（ＬＰＳ１回投与２時間後
群）。 (4) ＬＰＳを投与せずに、ＰＣＳ投与後にビークルを
投与する（ノーマル群）。

【００４３】参考実験例に準じて、ＰＣＳ投与２時間後
における血栓溶解率および血中パラメーター（ＰＡＩ−
１活性、ｐｌｇ活性、フィブリノーゲン量、α₂−ＰＩ
活性、ｔ−ＰＡ活性）を調べた。但し、ｔ−ＰＡ活性に
ついては、キット〔Spectrolyse （登録商標）／fibri
n，Biopool 社製〕の測定法に準じて測定した。上記
ａ）のＬＰＳ投与２６時間後のラットにおけるＰＣＳ投
与２時間後の血栓溶解率を図２に、ｂ）のＬＰＳ２回投
与後のラットにおけるＰＣＳ投与２時間後の血栓溶解率
を図３にそれぞれ示す。

【００４４】ａ）ＬＰＳ投与２６時間後のラットにおけ
るＰＣＳ投与２時間後の血栓溶解率の結果（図２参照）

【００４５】ＬＰＳを投与して２６時間後、血中ｐｌｇ
活性３５．２±３．１％にまで低下したラット（ビーク
ル群）においては、ビークル投与時の血栓溶解率は５
５．０±３．２％であり、ノーマルラットを用いた時
（ノーマル群）と比較して有意な差でなかったものの、
低下傾向が認められた。

【００４６】ｂ）ＬＰＳ２回投与後のラットにおけるＰ
ＣＳ投与２時間後の血栓溶解率の結果（図３参照）

【００４７】ＬＰＳ投与２４時間後に再びＬＰＳを投与
して２時間経過し血中ｐｌｇ活性の低下と血中ＰＡＩ−
１活性の上昇とを伴うラットを用いた時、ビークル群の
血栓溶解率は２４．６±１．４％であり、ノーマル群の
６２．８±３．１％に比べて有意に低い値であった。ま
た、血中ｐｌｇ活性がほぼ正常で血中ＰＡＩ−１活性の
みが高値を示すＬＰＳ投与２時間後のラット（ＬＰＳ１
回投与２時間後群）でのビークル投与時の血栓溶解率
（４３．４±４．１％）に比べても有意に低い値であっ
た。

【００４８】血中ＰＡＩ−１活性のみが顕著に上昇した
ラット（ＬＰＳ１回投与２時間後群）においては、ＰＰ
Ａ・１０万ＩＵ／ｋｇ投与時の血栓溶解作用はノーマル
群と同等であった。ところが、血中ｐｌｇ活性のみが顕
著に低下した時（ＬＰＳ投与２６時間後のラット）に
は、ＰＰＡ・１０万ＩＵ／ｋｇ投与による血栓溶解率は
軽度ではあるが有意に低下し（ノーマル群で７７．２±
２．１％に対して６７．０±１．７％）、血中ｐｌｇ活
性の低下と血中ＰＡＩ−１活性の上昇を同時に誘導した
ラット（ＬＰＳ２回投与後のラット）においては、ＰＰ
Ａ・１０万ＩＵ／ｋｇ投与時の血栓溶解率は３５．２±
４．１％にまで低下した。即ち、ＰＰＡによる血栓溶解
効果は、血中ｐｌｇ活性が正常であれば、血中ＰＡＩ−
１活性の影響を受けにくい可能性が示唆された。

【００４９】実験例２（ラット実験的ＤＩＣモデルにお
けるプロウロキナーゼの血栓溶解作用）トロンビンを持続注入することによってＤＩＣを誘導し
たラットにおいて、ＬＰＳ前投与の影響およびプロウロ
キナーゼ投与による効果を調べるために、以下の６通り
の実験群を作製した。

【００５０】正常ラットに¹²⁵Ｉ−ヒトフィブリノ
ーゲン（０．５ｍｌ／ｂｏｄｙ）を続けてボーラス投与
した後、生理的食塩液（以下「saline」または「生食」
という。２ｍｌ／ｂｏｄｙ）を３０分間かけて持続注入
した（ノーマル群）。

【００５１】生食（１ｍｌ／ｋｇ）をボーラス投与
した２２時間後に、再度生食（１ｍｌ／ｋｇ）をボーラ
ス投与した。その２時間後にビークル（０．５ｍｌ／ｂ
ｏｄｙ）、¹²⁵Ｉ−ヒトフィブリノーゲン（０．５ｍｌ
／ｂｏｄｙ）を続けてボーラス投与した後、ヒトトロン
ビン（１０００Ｕ／ｋｇ，２ｍｌ／ｂｏｄｙ）を３０分
間かけて持続注入した（saline＋saline＋thrombin
群）。

【００５２】ＬＰＳ（２ｍｇ／ｋｇ）をボーラス投
与した２２時間後に、生食（１ｍｌ／ｋｇ）をボーラス
投与した。その２時間後にビークル（０．５ｍｌ／ｂｏ
ｄｙ）、¹²⁵Ｉ−ヒトフィブリノーゲン（０．５ｍｌ／
ｂｏｄｙ）を続けてボーラス投与した後、ヒトトロンビ
ン（１０００Ｕ／ｋｇ，２ｍｌ／ｂｏｄｙ）を３０分間
かけて持続注入した（ＬＰＳ＋saline＋thrombin群）。

【００５３】ＬＰＳ（２ｍｇ／ｋｇ）をボーラス投
与した２２時間後に、再度ＬＰＳ（２ｍｇ／ｋｇ）をボ
ーラス投与した。その２時間後にビークル（０．５ｍｌ
／ｂｏｄｙ）、¹²⁵Ｉ−ヒトフィブリノーゲン（０．５
ｍｌ／ｂｏｄｙ）を続けてボーラス投与した後、生食
（２ｍｌ／ｂｏｄｙ）を尾静脈より３０分間かけて持続
注入した（ＬＰＳ＋ＬＰＳ＋saline群）。

【００５４】ＬＰＳ（２ｍｇ／ｋｇ）をボーラス投
与した２２時間後に、再度ＬＰＳ（２ｍｇ／ｋｇ）をボ
ーラス投与した。その２時間後にビークル（０．５ｍｌ
／ｂｏｄｙ）、¹²⁵Ｉ−ヒトフィブリノーゲン（０．５
ｍｌ／ｂｏｄｙ）を続けてボーラス投与した後、ヒトト
ロンビン（１０００Ｕ／ｋｇ，２ｍｌ／ｂｏｄｙ）を３
０分間かけて持続注入した（ＬＰＳ＋ＬＰＳ＋thrombin
群）。

【００５５】ＬＰＳ（２ｍｇ／ｋｇ）をボーラス投
与した２２時間後に、再度ＬＰＳ（２ｍｇ／ｋｇ）をボ
ーラス投与した。その２時間後にＰＰＡ（１０万ＩＵ／
ｋｇ）、¹²⁵Ｉ−ヒトフィブリノーゲン（０．５ｍｌ／
ｂｏｄｙ）を続けてボーラス投与した後、ヒトトロンビ
ン（１０００Ｕ／ｋｇ，２ｍｌ／ｂｏｄｙ）を３０分間
かけて持続注入した（ＰＰＡ投与群）。

【００５６】なお、各実験群とも最後のトロンビンまた
は生食の持続注入開始１５分前に１％（ｗ／ｖ）ＮａＩ
水溶液（０．２ｍｌ／ｂｏｄｙ）を静脈内投与した。
¹²⁵Ｉ−ヒトフィブリノーゲンは、参考実験例における
ＰＣＳと同じものであり、約６０〜７４万ｃｐｍ／ｂｏ
ｄｙを投与した。ビークルは実験例１に記載のものを用
いた。ヒトトロンビンはトロンビン−ミドリ（ミドリ十
字社製）を用いた。また、あらかじめラットの尾静脈に
カテーテルを確保し、各薬剤の投与に供した。

【００５７】上記の〜の各実験群（各１０匹）につ
いてトロンビンまたは生食の持続注入終了直後およびそ
の６０分後に５匹ずつネンブタール（５０ｍｇ／ｋｇ）
麻酔し、血液４ｍｌをクエン酸採血後、肺、腎臓、肝臓
を摘出した。各臓器の重量を測定した後、肺は全組織
を、腎臓は左右２個を、肝臓は一部（約１ｇ前後）を、
血液は０．５ｍｌの放射活性をγカウンターで計測し
た。肺、腎臓、肝臓の血栓量は、投与した総放射活性の
組織１ｍｇ当たりの集積率を相対放射活性（％／ｇ）と
して下式に基づいて算出した。また、血液については１
ｍｌ中の相対放射活性（％／ｍｌ）を算出した。さらに
腎臓、肺、肝臓の臓器重量は体重１００ｇ当たりの重量
を算出した。

【００５８】

【数２】

【００５９】但し、血液の比重は１．０として計算し
た。

【００６０】一方、各臓器摘出時に採血した血液は、３
０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離で血漿を得、血液凝
固線溶系パラメーター［フィブリノーゲン濃度、血漿中
プラスミノーゲン活性、ＰＡＩ−１活性、ＰＴ（プロト
ロンビン時間）、ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラス
チン時間）、α₂−ＰＩ］の測定に供した。また血液の
一部（０．５ｍｌ）はＥＤＴＡ入り採血容器に入れ、血
小板数の測定に供した。

【００６１】ＰＴおよびＡＰＴＴの測定は、トロンボプ
ラスチン・Ｃおよびデータファイ・ＡＰＴＴ（いずれも
Baxter Diagnostics社製）をそれぞれ用い、血液凝固自
動測定装置（Amelung CoagulometerＫＣ４Ａ，バクスタ
トラベノール社製）を用いて測定した。血小板数は血球
計数装置（Ｆ−８００，東亜医用電子社製）を用いて測
定した。他の血漿中パラメーター（フィブリノーゲン濃
度、血漿中ｐｌｇ活性、ＰＡＩ−１活性およびα₂−Ｐ
Ｉ活性）は、参考実験例に準じて測定した。

【００６２】ａ）トロンビン惹起ＤＩＣモデルにおける
ＬＰＳ前投与の影響上記の正常ラットに生食を持続注入したラット（ノー
マル群）、正常ラットにトロンビンを持続注入して
ＤＩＣを惹起させたラット（saline＋saline＋thrombin
群）、ＬＰＳを投与した２４時間後にトロンビンを持
続注入したラット（ＬＰＳ＋saline＋thrombin群）、
ＬＰＳを投与した２２時間後に再度ＬＰＳを投与し、そ
の２時間後に生食を持続注入したラット（ＬＰＳ＋ＬＰ
Ｓ＋saline群）およびＬＰＳを投与した２２時間後に
再度ＬＰＳを投与し、その２時間後にトロンビンを持続
注入したラット（ＬＰＳ＋ＬＰＳ＋thrombin群）の５群
に分け、血栓の自然溶解、臓器重量、血液凝固線溶系パ
ラメーターをトロンビン（または生食）持続注入終了直
後および６０分後で比較した。

【００６３】腎臓、肺、肝臓の相対放射活性の変動を図
４に示す。トロンビン投与終了直後の各臓器の血栓形成
は、トロンビンを投与した全ての実験群でノーマル群に
比べて有意な増加が認められた。トロンビン投与終了６
０分後の各臓器の相対放射活性は、いずれの実験群でも
トロンビン投与終了直後に比べて低値を示し、血栓の自
然溶解の進行が示唆された。

【００６４】しかし、ＬＰＳ＋ＬＰＳ＋thrombin群の各
臓器の血栓の自然溶解は、ほかの実験群に比べて明らか
に遅延し、特に肺および肝臓でその遅延が顕著であっ
た。また腎臓でもトロンビン投与終了直後から６０分後
までの放射活性の減衰は他群に比べて低下していた。

【００６５】血液の放射活性はいずれのトロンビンの投
与群でも投与終了直後において低値であった（図示せ
ず）。これは血栓形成に伴って血液中の¹²⁵Ｉ標識フィ
ブリノゲンが消費されたものと推察された。また、６０
分後における血中放射活性はＬＰＳ＋ＬＰＳ＋thrombin
群ではその推移は不変であったのに対し、saline＋sali
ne＋thrombin群および、ＬＰＳ＋saline＋thrombin群で
は放射活性の上昇が認められた。この相違は後者２群で
は血栓の自然溶解が速やかに生じた結果、流血中の放射
活性が上昇したものと推測され、また前者においては血
栓の自然溶解が遅延したことを示唆する結果と考えられ
る。

【００６６】腎臓、肺、肝臓の臓器重量の変動を図５に
示す。臓器重量は腎臓および肺において、すべてのＬＰ
Ｓを投与した群でノーマル群に比べて有意な増加が認め
られた。特に、肺においてはトロンビン投与により顕著
な増加が認められた。さらに６０分後においては、ＬＰ
Ｓ＋saline＋thrombin群、ＬＰＳ＋ＬＰＳ＋saline群で
は腎臓および肺重量の低下が認められたのに対して、Ｌ
ＰＳ＋ＬＰＳ＋thrombin群ではその重量はほぼ一定で推
移した。このことはトロンビン投与により、投与終了直
後から６０分後にかけて臓器重量がほとんど減少しない
ことを示唆するものである。

【００６７】トロンビン投与によるｐｌｇ低下は軽微で
あることが示唆された。それに対していずれのＬＰＳ投
与群でもｐｌｇ活性は４０％以下であったが、ＬＰＳ投
与群のｐｌｇの低下はＬＰＳ投与に起因すると考えられ
る。

【００６８】血中ＰＡＩ−１活性はノーマル群、saline
＋saline＋thrombin群、ＬＰＳ＋saline＋thrombin群で
は低値（３１．３Ｕ／ｍｌ以下）を示したが、ＬＰＳ＋
ＬＰＳ＋saline群、ＬＰＳ＋ＬＰＳ＋thrombin群では約
１０００Ｕ／ｍｌであった。これは、ＬＰＳの２回投与
に起因すると考えられた。

【００６９】血小板数はＬＰＳを投与した群ではいずれ
も最初のＬＰＳ投与の１日後に顕著な減少が認められた
（４．２×１０⁴／μｌ以下）。また、saline＋saline
＋thrombin群においても血小板数はノーマル群の約４１
％に低下した。

【００７０】ＰＴおよびＡＰＴＴはトロンビンを投与し
た群において、トロンビン投与終了直後および６０分後
ともにその延長が認められた。なお、ＬＰＳ２回投与群
ではＰＴは影響しなかったのに対し、ＡＰＴＴは顕著な
延長が認められた。α₂−ＰＩ活性はいずれの実験群で
もトロンビン投与終了直後において軽度の低下が認めら
れた。saline＋saline＋thrombin群、ＬＰＳ＋saline＋
thrombin群では、トロンビン投与６０分後のα₂−ＰＩ
はノーマル群の約７０％まで低下したが、ＬＰＳ＋ＬＰ
Ｓ＋thrombin群ではα₂−ＰＩの低下はそれらに比べて
少なかった。これらの結果からsaline＋saline＋thromb
in群、ＬＰＳ＋saline＋thrombin群では、トロンビン投
与終了直後から６０分後にかけて線溶が亢進しているこ
と、ＬＰＳ＋ＬＰＳ＋thrombin群ではそれらの群に比べ
て線溶活性が低下していることが示唆された。

【００７１】血漿クレアチニンはいずれの群ともに、ト
ロンビン投与終了直後に増加が認められ、６０分後では
ＬＰＳ＋ＬＰＳ＋thrombin群のみさらに増加し、他の群
では逆に低下傾向が認められた。

【００７２】ｂ）ＬＰＳ＋ＬＰＳ＋thrombin群における
プロウロキナーゼ投与の効果上記ａ）の結果から、ＬＰＳ＋ＬＰＳ＋thrombin群で臓
器内血栓の自然溶解の遅延が認められた。そこでＬＰＳ
＋ＬＰＳ＋thrombinによってＤＩＣを惹起したラットを
用いて、プロウロキナーゼ（ＰＰＡ、１０万ＩＵ／ｋ
ｇ）投与の効果を調べた。

【００７３】上記の正常ラットに生食を持続注入した
ラット（ノーマル群）、ＬＰＳを投与した２２時間後
に再度ＬＰＳを投与し、その２時間後にビークルおよび
生食を持続注入したラット（ＬＰＳ＋ＬＰＳ＋saline
群）、ＬＰＳを投与した２２時間後に再度ＬＰＳを投
与し、その２時間後にビークルおよびトロンビンを持続
注入したラット（Vehicle 群）、ＬＰＳを投与した２
２時間後に再度ＬＰＳを投与し、その２時間後にＰＰＡ
（１０万ＩＵ／ｋｇ）およびトロンビンを持続注入した
ラット（ＰＰＡ投与群）の４群に分け、血栓の自然溶
解、臓器重量、血液凝固線溶系パラメーターをトロンビ
ン（または生食）持続注入終了直後および６０分後で比
較した。なお、ＰＰＡまたはビークルは、トロンビン
（または生食）持続注入開始直前にボーラス投与した。

【００７４】腎臓、肺、肝臓の相対放射活性の変動を図
６に示す。トロンビン投与終了直後では、いずれの投与
群においても腎臓、肺、肝臓の相対放射活性のビークル
群に対する有意な減少は認められなかった。しかし、６
０分後では、腎臓、肺、肝臓において、ビークル群に比
べて有意な相対放射活性の減少が認められた。

【００７５】腎臓および肺の臓器重量の変動を図７に示
す。臓器重量に関しては、腎臓においてＰＰＡ（１０万
ＩＵ／ｋｇ）投与群でビークル群に比べて有意な減少が
認められた。肺においては、有意差はなかったものの、
用量依存的な肺重量の減少が認められた。肝臓において
は、ＬＰＳ投与により重量の軽度な減少が認められたの
みであり、プロウロキナーゼ投与による変化は認められ
なかった。

【００７６】次に、ＬＰＳ＋ＬＰＳ＋thrombin群におけ
る腎臓と肺の臓器重量の増加が臓器内水分蓄積を伴って
いるかを臓器湿重量／乾燥重量の比の増加を指標に検討
した。また、その増加に対するプロウロキナーゼ投与の
効果を検討した。

【００７７】実験は上記と同様にして行い、６０分後に
おける腎臓および肺の湿重量および乾燥重量を測定し
て、臓器湿重量／乾燥重量（Ｗ／Ｄ）比をそれぞれ求め
た。

【００７８】その結果を図８に示す。図８の結果から、
トロンビン投与によるＤＩＣ惹起により、腎臓および肺
においてＷ／Ｄ比が有意に増加することが確認され、臓
器重量の増加が水分蓄積（浮腫）による増加であること
が示唆された。また、腎臓におけるＰＰＡ（１０万ＩＵ
／ｋｇ）投与群では有意な抑制作用が認められた。

【００７９】以上のａ）およびｂ）の結果から、ＬＰＳ
の２回前投与およびトロンビン投与によって惹起された
ＤＩＣ群では、ＬＰＳの１回前投与およびトロンビン投
与の場合、ならびにトロンビン単独投与の場合に比較し
て、腎臓、肺、肝臓の血栓自然溶解の遅延が認められた
が、この遅延条件下において、プロウロキナーゼを投与
することによって、腎臓、肺、肝臓のいずれにおいても
有意な血栓溶解促進作用を示したことが判った。

【００８０】プロウロキナーゼ（ＰＰＡ）は、腎臓の臓
器重量のＬＰＳ投与による増加を低減する作用を有し、
水分蓄積（浮腫）を軽減する作用を有することが示唆さ
れた。また、血液凝固線溶系パラメーターに対して有意
な影響を及ぼさないことが判った。

【００８１】

【発明の効果】本発明の予防治療剤は、血栓溶解率を上
昇させるとともに、臓器の水分蓄積（浮腫）を軽減する
作用を有し、かつ血液凝固線溶系パラメーターに対して
有意な影響を及ぼさないから、過凝固または低線溶状態
の予防治療剤、ＤＩＣの予防治療剤、臓器不全の予防治
療剤、および浮腫の予防治療剤として極めて有用であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】参考実験例における血栓溶解率の結果を示す図
である。

【図２】実験例１のＬＰＳ投与２６時間後のラットにお
けるＰＣＳ投与２時間後の血栓溶解率の結果を示す図で
ある。

【図３】実験例１のＬＰＳ２回投与後のラットにおける
ＰＣＳ投与２時間後の血栓溶解率の結果を示す図であ
る。

【図４】実験例２のトロンビン惹起ＤＩＣモデルにおけ
る臓器の相対放射活性の変動を示す図である。

【図５】実験例２のトロンビン惹起ＤＩＣモデルにおけ
る臓器重量の変動を示す図である。

【図６】実験例２のトロンビン惹起ＤＩＣモデルにおけ
るＰＰＡ投与による臓器の相対放射活性の変動を示す図
である。

【図７】実験例２のトロンビン惹起ＤＩＣモデルにおけ
るＰＰＡ投与による臓器重量の変動を示す図である。

【図８】実験例２のトロンビン惹起ＤＩＣモデルにおけ
るＰＰＡ投与による臓器湿重量／乾燥重量の比の変動を
示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 9/72 Ａ６１Ｋ 37/47 ＡＤＤ (72)発明者土山博美大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者渡辺正弘大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号株式会社ミドリ十字中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】プロウロキナーゼを有効成分とする、過
凝固または低線溶状態の予防治療剤。
【請求項２】プロウロキナーゼを有効成分とする、汎
発性血管内凝固症候群の予防治療剤。
【請求項３】プロウロキナーゼを有効成分とする、臓
器不全の予防治療剤。
【請求項４】プロウロキナーゼを有効成分とする、浮
腫の予防治療剤。