JP3362038B2 - 抗凝血剤 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、凝血性疾患またはガンを治療するための製
剤であって、抗凝血活性を有するタンパク質および前記
タンパク質と相乗的に作用する物質とを含む製剤に関す
る。本発明はさらにこの製剤を用いた凝血性疾患または
ガンの治療方法に関する。
剤であって、抗凝血活性を有するタンパク質および前記
タンパク質と相乗的に作用する物質とを含む製剤に関す
る。本発明はさらにこの製剤を用いた凝血性疾患または
ガンの治療方法に関する。
発明の背景
血液凝固は、多くの活性化および不活化血液凝固因子
が関連する複雑な過程である。抗凝血タンパク質は凝血
過程の調整に重要であることが知られており（ビィ．レ
ームレB.Lammleおよびジェイ．グリフィンJ.Griffin（C
linics in Heamatology 14（1985）,281〜342参照）、
したがって抗凝血剤は様々な疾患たとえば血栓症、心筋
梗塞、播種性血管内凝固等の治療に重要である。
が関連する複雑な過程である。抗凝血タンパク質は凝血
過程の調整に重要であることが知られており（ビィ．レ
ームレB.Lammleおよびジェイ．グリフィンJ.Griffin（C
linics in Heamatology 14（1985）,281〜342参照）、
したがって抗凝血剤は様々な疾患たとえば血栓症、心筋
梗塞、播種性血管内凝固等の治療に重要である。
すなわちヘパリンがアンチトロンビンIIIおよびヘパ
リン補因子IIの活性を高めるために臨床的に使用され
る。アンチトロンビンIIIはX a因子およびトロンビンの
阻害のために使用される。ヒルジンはトロンビンの阻害
のために使用されそしてタンパク質ＣはＶ因子およびVI
II因子の阻害のために使用されうる。
リン補因子IIの活性を高めるために臨床的に使用され
る。アンチトロンビンIIIはX a因子およびトロンビンの
阻害のために使用される。ヒルジンはトロンビンの阻害
のために使用されそしてタンパク質ＣはＶ因子およびVI
II因子の阻害のために使用されうる。
抗凝血タンパク質ばまたガンの治療にも使用されう
る。したがって、アンチスタチンは抗転移性を有するこ
とが示されている（ジェイ．エイチ．ハンJ.H.Hanら、G
ene 75（1989），（47−57）。またヘパリンおよびワル
ファリンは抗転移性を有することも示されている（ジ
ィ．ジェイ．ガシックG.J.Gasicら、Int.Rev.Exp.Patho
l.29（1985）,173−209）。
る。したがって、アンチスタチンは抗転移性を有するこ
とが示されている（ジェイ．エイチ．ハンJ.H.Hanら、G
ene 75（1989），（47−57）。またヘパリンおよびワル
ファリンは抗転移性を有することも示されている（ジ
ィ．ジェイ．ガシックG.J.Gasicら、Int.Rev.Exp.Patho
l.29（1985）,173−209）。
凝血は組織因子（TF）の循環血液への暴露により外因
系を介して開始されうる（ワイ．ネマーソンY.Nemerso
n,Blood 71（1988）,1−８）。組織因子はF VII/VII a
に対するタンパク質補因子であり、組織因子の結合はそ
の基質F IXおよびF Xに対するF VII aの酵素活性を増強
する。胎盤抗凝血タンパク質は、たぶんTF/F VII a−リ
ン脂質相互反応を妨害することにより、組織因子活性を
阻害することができる（エス．コンドーS.Kondoら、Tbr
omb.Res.48（1987）,449−459）。
系を介して開始されうる（ワイ．ネマーソンY.Nemerso
n,Blood 71（1988）,1−８）。組織因子はF VII/VII a
に対するタンパク質補因子であり、組織因子の結合はそ
の基質F IXおよびF Xに対するF VII aの酵素活性を増強
する。胎盤抗凝血タンパク質は、たぶんTF/F VII a−リ
ン脂質相互反応を妨害することにより、組織因子活性を
阻害することができる（エス．コンドーS.Kondoら、Tbr
omb.Res.48（1987）,449−459）。
最近、新しい抗凝血タンパク質、外因系阻害剤（EP
I）が単離された（ブローゼBrozeら、Proc.Natl.Acad.S
ci.84（1987）,1886−1890）。
I）が単離された（ブローゼBrozeら、Proc.Natl.Acad.S
ci.84（1987）,1886−1890）。
分子規模でEPIは胎盤抗凝血タンパク質よりTF/F VII
で起きる凝血のさらに強力な阻害剤であることがわかっ
た（アール．エー．グラムジンスキーR.A.Gramzinski
ら、Blood 73（1989）,983−989）。EPIはF X aと結合
しそして阻害し、EPIとX a間の複合体がTF/F VII aを阻
害する（エスアイ ラパポートSI Rapaport,Blood 73
（1989）,359−365）。EPIは、多くのガン細胞がTF活性
を示し（ティ．サカイT.Sakaiら、J.Biol.Chem.264（19
89）,9980−9988）、そしてEPIはアンチスタチンのよう
に抗X a活性を示すので抗凝血剤／抗転移剤として特に
興味深い。
で起きる凝血のさらに強力な阻害剤であることがわかっ
た（アール．エー．グラムジンスキーR.A.Gramzinski
ら、Blood 73（1989）,983−989）。EPIはF X aと結合
しそして阻害し、EPIとX a間の複合体がTF/F VII aを阻
害する（エスアイ ラパポートSI Rapaport,Blood 73
（1989）,359−365）。EPIは、多くのガン細胞がTF活性
を示し（ティ．サカイT.Sakaiら、J.Biol.Chem.264（19
89）,9980−9988）、そしてEPIはアンチスタチンのよう
に抗X a活性を示すので抗凝血剤／抗転移剤として特に
興味深い。
EPIはHepG2ヘパトーム細胞からブローゼら（前出）に
より単離された（ブローゼ、ドイツ国特許出願第4135/8
8号）。タンパク質に対する遺伝子をクローン化し、そ
してタンパク質は３個のタンデムクニッツ型阻害剤ドメ
インからなることが明らかになった（ブローゼ、ドイツ
国特許出願第3907/88号）。タンパク質は276個のアミノ
酸残基からなり、そして３個のクニッツ型阻害剤ドメイ
ンに加えて、Asn117,Asn167,およびAsn229の位置に３個
の潜在的グリコシル化部位を有する。分子量はこれらの
部位の幾つかがグリコシル化されていることを示す。さ
らに、クニッツ領域２がF X aと結合し、一方第一のク
ニッツ領域はF VII a/TFと結合することがわかった（ジ
ラルドら、Nature 338（1989）,518−520）。EPIはまた
Hela細胞から単離され（ドイツ国特許出願第6199/88
号）そしてHeLa EPIはヘパリンと結合することが示され
た。
より単離された（ブローゼ、ドイツ国特許出願第4135/8
8号）。タンパク質に対する遺伝子をクローン化し、そ
してタンパク質は３個のタンデムクニッツ型阻害剤ドメ
インからなることが明らかになった（ブローゼ、ドイツ
国特許出願第3907/88号）。タンパク質は276個のアミノ
酸残基からなり、そして３個のクニッツ型阻害剤ドメイ
ンに加えて、Asn117,Asn167,およびAsn229の位置に３個
の潜在的グリコシル化部位を有する。分子量はこれらの
部位の幾つかがグリコシル化されていることを示す。さ
らに、クニッツ領域２がF X aと結合し、一方第一のク
ニッツ領域はF VII a/TFと結合することがわかった（ジ
ラルドら、Nature 338（1989）,518−520）。EPIはまた
Hela細胞から単離され（ドイツ国特許出願第6199/88
号）そしてHeLa EPIはヘパリンと結合することが示され
た。
本発の開示
本発明は、付随的にヘパリンを投与することにより血
漿において注入されたEPIの抗凝血活性および半減期
（すなわち、血管においてEPIが循環する期間）を向上
する可能性に基づくものである。
漿において注入されたEPIの抗凝血活性および半減期
（すなわち、血管においてEPIが循環する期間）を向上
する可能性に基づくものである。
したがって、本発明は外因系阻害剤（EPI）タンパク
質およびヘパリンまたは他のムコ多糖類と薬剤上許容さ
れうる希釈剤またはビヒクルとを含む凝血性疾患または
ガンの予防または治療のための薬剤に関する。
質およびヘパリンまたは他のムコ多糖類と薬剤上許容さ
れうる希釈剤またはビヒクルとを含む凝血性疾患または
ガンの予防または治療のための薬剤に関する。
すなわち、本発明はEPIがヘパリン結合タンパク質で
あるという知見（たとえば、デンマーク特許出願第6199
/88号）を利用するものである。さらに、サンドセット
（Sandset）らの研究（Thromb.Res.50,1988,p803−81
3）によれば、EPIの天然血漿レベルはヘパリンの皮下注
射の後で２倍まで上昇することがわかっている。これら
の知見により、本発明者らは循環するヘパリンが内皮細
胞表面においてEPIのヘパリン様物質（主にムコ多糖
類）の結合を妨げるのではないかと考えた。逆に、ヘパ
リンはまたすでに結合したEPIを内皮から放出する作用
も行なう。いずれの場合でも、内皮表面に対する結合よ
りむしろ循環系において見出されるということがEPIの
抗凝血活性にとって重要であるということが考えられ
る。それゆえヘパリンは、遊離EPIまたは内皮から放出
されるEPIと結合することによりEPIの抗凝血活性を向上
しそして血液におけるEPIの循環を可能にするという点
でEPIの活性における相乗効果を示すことが言われてい
る、インビトロ研究によれば、ヘパリンはアンチトロン
ビンIIIの活性を強めることが知られている（エル．ロ
ーゼンフェルドL.Rosenfeld,Biochem.J.237,1986,p.639
〜646）。しかしながら、ヘパリンの注射時に注射され
たアンチトロンビンIIIの半減期の増加は観察されず、
そしてヘパリンは播種性血管内凝血の場合アンチトロン
ビンIIIと何らの相乗効果も示さない（たとえば、ビ
ィ．ブロウハットB.Blauhut,Thromb.Res.39,1985,p81〜
89）。
あるという知見（たとえば、デンマーク特許出願第6199
/88号）を利用するものである。さらに、サンドセット
（Sandset）らの研究（Thromb.Res.50,1988,p803−81
3）によれば、EPIの天然血漿レベルはヘパリンの皮下注
射の後で２倍まで上昇することがわかっている。これら
の知見により、本発明者らは循環するヘパリンが内皮細
胞表面においてEPIのヘパリン様物質（主にムコ多糖
類）の結合を妨げるのではないかと考えた。逆に、ヘパ
リンはまたすでに結合したEPIを内皮から放出する作用
も行なう。いずれの場合でも、内皮表面に対する結合よ
りむしろ循環系において見出されるということがEPIの
抗凝血活性にとって重要であるということが考えられ
る。それゆえヘパリンは、遊離EPIまたは内皮から放出
されるEPIと結合することによりEPIの抗凝血活性を向上
しそして血液におけるEPIの循環を可能にするという点
でEPIの活性における相乗効果を示すことが言われてい
る、インビトロ研究によれば、ヘパリンはアンチトロン
ビンIIIの活性を強めることが知られている（エル．ロ
ーゼンフェルドL.Rosenfeld,Biochem.J.237,1986,p.639
〜646）。しかしながら、ヘパリンの注射時に注射され
たアンチトロンビンIIIの半減期の増加は観察されず、
そしてヘパリンは播種性血管内凝血の場合アンチトロン
ビンIIIと何らの相乗効果も示さない（たとえば、ビ
ィ．ブロウハットB.Blauhut,Thromb.Res.39,1985,p81〜
89）。
本発明はまた、投与前にEPIタンパク質をヘパリンと
実際に結合するようにしたEPIタンパク質をヘパリンと
組合わせてなる製剤、ならびにEPIタンパク質とヘパリ
ンをほぼ同時にまたは逐次共同投与するのに適する形態
で使用前に別々の容器にEPIタンパク質とヘパリンを保
持してなる製剤（たとえば製剤の意図する用途に適合す
るEPIタンパク質の含有量および投与されるべきEPIタン
パク質のすべてと実質的に結合するのに十分なヘパリン
の含有量とを有する）を提供するものであることを注意
すべきである。後者の場合、両方の物質を投与すると血
管においてEPIタンパク質が循環するヘパリンと結合す
るであろう。
実際に結合するようにしたEPIタンパク質をヘパリンと
組合わせてなる製剤、ならびにEPIタンパク質とヘパリ
ンをほぼ同時にまたは逐次共同投与するのに適する形態
で使用前に別々の容器にEPIタンパク質とヘパリンを保
持してなる製剤（たとえば製剤の意図する用途に適合す
るEPIタンパク質の含有量および投与されるべきEPIタン
パク質のすべてと実質的に結合するのに十分なヘパリン
の含有量とを有する）を提供するものであることを注意
すべきである。後者の場合、両方の物質を投与すると血
管においてEPIタンパク質が循環するヘパリンと結合す
るであろう。
本発明製剤を用いて治療されるべき凝血性疾患は主に
抗凝血剤での治療が必要な疾患である。このような疾患
の例としては、通常ヘパリンだけを投与することにより
治療されるもの、たとえば血栓症、塞栓症、梗塞症また
は播種性血管内凝血症である。本発明の製剤はガンの治
療に有効であることも予期される。この用途は他の抗凝
血剤たとえばアンチスタチン（たとえば、ジェス．エッ
チ．ハンら、Gene 75,1989,p47〜57）、ヘパリンおよび
ワルファリン（たとえばジィ．ジェイ．ガシック（G.J.
Gasic）ら、Int.Rev.Exp.Pathol.29,1985,p173〜209）
の抗転移性により示唆される。
抗凝血剤での治療が必要な疾患である。このような疾患
の例としては、通常ヘパリンだけを投与することにより
治療されるもの、たとえば血栓症、塞栓症、梗塞症また
は播種性血管内凝血症である。本発明の製剤はガンの治
療に有効であることも予期される。この用途は他の抗凝
血剤たとえばアンチスタチン（たとえば、ジェス．エッ
チ．ハンら、Gene 75,1989,p47〜57）、ヘパリンおよび
ワルファリン（たとえばジィ．ジェイ．ガシック（G.J.
Gasic）ら、Int.Rev.Exp.Pathol.29,1985,p173〜209）
の抗転移性により示唆される。
本明細書において、用語“EPIタンパク質”は天然ま
たは完全長さのEPIばかりでなくヘパリンに対し親和性
を有するEPI類似物も含むことが意図される。このよう
な類似物の例としてはヘパリン結合領域（天然EPI分子
の範囲内においてアミノ酸残基165位から276位のＣ末端
アミノ酸残基までに位置するものと考えられ、そして特
にArg246〜Lys265までのプラスに帯電したアミノ酸残基
が豊富な領域を含むものと考えられる）を含むEPIフラ
グメントである。
たは完全長さのEPIばかりでなくヘパリンに対し親和性
を有するEPI類似物も含むことが意図される。このよう
な類似物の例としてはヘパリン結合領域（天然EPI分子
の範囲内においてアミノ酸残基165位から276位のＣ末端
アミノ酸残基までに位置するものと考えられ、そして特
にArg246〜Lys265までのプラスに帯電したアミノ酸残基
が豊富な領域を含むものと考えられる）を含むEPIフラ
グメントである。
用語“別のムコ多糖類”とはEPIに結合する能力を有
するヘパリン様物質を含むことが意図される。このよう
な物質の例としてはヘパリンスルフェート、デルマタン
スルフェートおよびプロタミンスルフェートから選択さ
れるスルフェート化グルコサミノグリカンである。しか
しながら、本発明の目的に対し一般的に好ましいムコ多
糖類はヘパリンであり、本発明はここにおいて主にヘパ
リンとして説明しているがしかしながらこれは本発明が
ヘパリンの使用に制限されることを意図するものではな
い。
するヘパリン様物質を含むことが意図される。このよう
な物質の例としてはヘパリンスルフェート、デルマタン
スルフェートおよびプロタミンスルフェートから選択さ
れるスルフェート化グルコサミノグリカンである。しか
しながら、本発明の目的に対し一般的に好ましいムコ多
糖類はヘパリンであり、本発明はここにおいて主にヘパ
リンとして説明しているがしかしながらこれは本発明が
ヘパリンの使用に制限されることを意図するものではな
い。
本発明製剤は、たとえば滅菌水または等張性食塩水中
で上記で説明したように別々にまたは一緒にEPIタンパ
ク質およびヘパリンを溶解または懸濁することにより腸
管外投与（たとえば静脈内もしくは皮下注射または点
滴）に適するいずれかの形に配合されうる。所望の治療
効果を達成するのに必要な投与レベルは、健康な人の血
管における天然EPIの含有量および内皮からこれを放出
するのに必要なヘパリンの量に基づいて評価される。EP
Iは健康な人の血液において血漿1m中50ngの量で存在
する。たとえばヘパリン5000IUの注射は理論的には内皮
表面からEPIを放出して血漿1m中500ngまでの濃度にす
る。EPIタンパク質の十分な抗凝血効果を得るために、E
PIの適当な投与量（単位投与）はEPIでの治療が示唆さ
れる疾患の型および程度に応じてEPI約0.5〜40mgの範囲
内であることが予定される。ヘパリンの相当する適当な
投与量はEPIタンパク質を循環系に維持するためにEPIタ
ンパク質のこの量と結合しうるものである。すなわち、
EPIタンパク質と共同投与されるべきヘパリンの投与量
は一単位投与当り約1000〜15000IUの範囲たとえば2000
〜10000IU/単位投与、特に約5000IU/単位投与である。
で上記で説明したように別々にまたは一緒にEPIタンパ
ク質およびヘパリンを溶解または懸濁することにより腸
管外投与（たとえば静脈内もしくは皮下注射または点
滴）に適するいずれかの形に配合されうる。所望の治療
効果を達成するのに必要な投与レベルは、健康な人の血
管における天然EPIの含有量および内皮からこれを放出
するのに必要なヘパリンの量に基づいて評価される。EP
Iは健康な人の血液において血漿1m中50ngの量で存在
する。たとえばヘパリン5000IUの注射は理論的には内皮
表面からEPIを放出して血漿1m中500ngまでの濃度にす
る。EPIタンパク質の十分な抗凝血効果を得るために、E
PIの適当な投与量（単位投与）はEPIでの治療が示唆さ
れる疾患の型および程度に応じてEPI約0.5〜40mgの範囲
内であることが予定される。ヘパリンの相当する適当な
投与量はEPIタンパク質を循環系に維持するためにEPIタ
ンパク質のこの量と結合しうるものである。すなわち、
EPIタンパク質と共同投与されるべきヘパリンの投与量
は一単位投与当り約1000〜15000IUの範囲たとえば2000
〜10000IU/単位投与、特に約5000IU/単位投与である。
別の見地において、本発明は、凝血性疾患またはガン
の治療が必要な患者へEPIおよびヘパリンの治療または
予防有効量を投与することを含む前記疾患またはガンの
治療または予防方法に関する。
の治療が必要な患者へEPIおよびヘパリンの治療または
予防有効量を投与することを含む前記疾患またはガンの
治療または予防方法に関する。
本発明の一実施態様において、EPIタンパク質の投与
はヘパリンの投与とほぼ同時である。これはたとえばEP
Iタンパク質とヘパリンを混合してから投与しEPIタンパ
ク質をヘパリンと結合した形で投与するか、または２つ
の物質を同時に投与することができるようにする装置を
用いてEPIタンパク質とヘパリンを別々に投与すること
により行なわれる。最後に、EPIタンパク質またはヘパ
リンのいずれかを最初に投与しそして残りの成分をその
直後に投与してもよい（“直後”とは最初の物質投与後
１分までのいずれかの期間を意味する）。
はヘパリンの投与とほぼ同時である。これはたとえばEP
Iタンパク質とヘパリンを混合してから投与しEPIタンパ
ク質をヘパリンと結合した形で投与するか、または２つ
の物質を同時に投与することができるようにする装置を
用いてEPIタンパク質とヘパリンを別々に投与すること
により行なわれる。最後に、EPIタンパク質またはヘパ
リンのいずれかを最初に投与しそして残りの成分をその
直後に投与してもよい（“直後”とは最初の物質投与後
１分までのいずれかの期間を意味する）。
別の実施態様において、EPIタンパク質を投与後にヘ
パリンを投与してもよい。この場合、EPIタンパク質は
短期間（一般には10分間）のみ循環しその後内皮細胞表
面上でヘパリン様ムコ多糖類と結合ししたがって不活性
化されることが予想される。しかしながら、別の血液タ
ンパク質（血小板因子4;たとえばジィ．セラ（G.Cell
a）ら、Eur.J.Clin.Invest.17,1987,p.548〜554）と同
じ様に、結合したEPIはヘパリンの続く投与により放出
されそして代わりに投与された循環するヘパリンと結合
することが観察される。
パリンを投与してもよい。この場合、EPIタンパク質は
短期間（一般には10分間）のみ循環しその後内皮細胞表
面上でヘパリン様ムコ多糖類と結合ししたがって不活性
化されることが予想される。しかしながら、別の血液タ
ンパク質（血小板因子4;たとえばジィ．セラ（G.Cell
a）ら、Eur.J.Clin.Invest.17,1987,p.548〜554）と同
じ様に、結合したEPIはヘパリンの続く投与により放出
されそして代わりに投与された循環するヘパリンと結合
することが観察される。
代わりの実施態様において、ヘパリンを投与後にEPI
タンパク質を投与してもよい。この場合において、EPI
タンパク質は投与してからほとんどすぐに循環するヘパ
リンと結合するであろう。ヘパリンの所望の相乗効果を
得るために、EPIタンパク質はヘパリン投与後０〜24時
間、好ましくは０〜２時間、最も好ましくは０〜0.5時
間に投与される。
タンパク質を投与してもよい。この場合において、EPI
タンパク質は投与してからほとんどすぐに循環するヘパ
リンと結合するであろう。ヘパリンの所望の相乗効果を
得るために、EPIタンパク質はヘパリン投与後０〜24時
間、好ましくは０〜２時間、最も好ましくは０〜0.5時
間に投与される。
後の二つの実施態様において、EPIタンパク質および
ヘパリンは別々の容器から別々に投与されうる。上記で
示したように、EPIは0.5〜40mg EPIの量で投与され、そ
してヘパリンは1000〜15000IU/単位投与の量、たとえば
2000〜10000IU/単位投与の量で投与されうる。EPIタン
パク質およびヘパリンの投与が示唆される凝血性疾患は
上記したもののいずれかである。
ヘパリンは別々の容器から別々に投与されうる。上記で
示したように、EPIは0.5〜40mg EPIの量で投与され、そ
してヘパリンは1000〜15000IU/単位投与の量、たとえば
2000〜10000IU/単位投与の量で投与されうる。EPIタン
パク質およびヘパリンの投与が示唆される凝血性疾患は
上記したもののいずれかである。
別の見地において、本発明はEPIタンパク質およびヘ
パリンを凝血性疾患またはガンの予防または治療のため
の医薬品を作るために使用することに関する。上記で詳
しく検討したように、EPIタンパク質は投与前にヘパリ
ンと結合してもよく、またはEPIタンパク質およびヘパ
リンはEPIタンパク質およびヘパリンのほぼ同時投与ま
たは逐次共同投与に適する形態の別々の容器に準備され
てもよい。
パリンを凝血性疾患またはガンの予防または治療のため
の医薬品を作るために使用することに関する。上記で詳
しく検討したように、EPIタンパク質は投与前にヘパリ
ンと結合してもよく、またはEPIタンパク質およびヘパ
リンはEPIタンパク質およびヘパリンのほぼ同時投与ま
たは逐次共同投与に適する形態の別々の容器に準備され
てもよい。
以下の方法を用いて本発明製剤投与後の血漿における
EPI活性を示す。
EPI活性を示す。
EPI活性についての分析:EPIを、サンドセットらの方法
の後に修正したクロモゲンマイクロプレート分析におい
て測定した（Thromb.Res.47（1989）,389−400）。熱処
理した血漿プールを標準物として使用した。この標準物
はIU/m EPI活性を含むよう準備される。標準物および
サンプルを２μg/mポリブレンおよび0.2％ウシ血清ア
ルブミンを含む緩衝液Ａ（0.05Mトリス/0.1M NaCl/0.1M
Na−クエン酸塩/0.02％NaN3/pH8.0）中で希釈した。F
VII a/TF/F X/CaCl2組合せ剤を緩衝液Ａ中で調製し、1.
6ng/mF VII a（ノボ−ノルディスク社）、60倍に薄め
たヒト組織因子（ヒヨールト（Hjort）,Scand.J.Clin.L
ab.Invest.9（1957）,50ng/mF X（シグマ）および18m
M CaCl2を含む。分析を37℃にてマイクロプレートスト
リップ中で実施した。サンプルと標準物50μをピペッ
トでストリップへ入れ、組合せ剤100μを各凹所へ加
えた。10分間インキュベーション後、F X（3.2μg/m
）25μを各凹所へ加え、さらに10分後F X a（S222
2）に対するクロモゲン基質25μを加え、10分後に基
質を加えた。クエン酸1.0M,pH3.0 50μを添加するこ
とにより反応を停止した。マイクロプレートを405nmで
読み取った。
の後に修正したクロモゲンマイクロプレート分析におい
て測定した（Thromb.Res.47（1989）,389−400）。熱処
理した血漿プールを標準物として使用した。この標準物
はIU/m EPI活性を含むよう準備される。標準物および
サンプルを２μg/mポリブレンおよび0.2％ウシ血清ア
ルブミンを含む緩衝液Ａ（0.05Mトリス/0.1M NaCl/0.1M
Na−クエン酸塩/0.02％NaN3/pH8.0）中で希釈した。F
VII a/TF/F X/CaCl2組合せ剤を緩衝液Ａ中で調製し、1.
6ng/mF VII a（ノボ−ノルディスク社）、60倍に薄め
たヒト組織因子（ヒヨールト（Hjort）,Scand.J.Clin.L
ab.Invest.9（1957）,50ng/mF X（シグマ）および18m
M CaCl2を含む。分析を37℃にてマイクロプレートスト
リップ中で実施した。サンプルと標準物50μをピペッ
トでストリップへ入れ、組合せ剤100μを各凹所へ加
えた。10分間インキュベーション後、F X（3.2μg/m
）25μを各凹所へ加え、さらに10分後F X a（S222
2）に対するクロモゲン基質25μを加え、10分後に基
質を加えた。クエン酸1.0M,pH3.0 50μを添加するこ
とにより反応を停止した。マイクロプレートを405nmで
読み取った。
血液凝固分析
APTT分析：活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）
分析において、血漿インキュベーション混合物55μを
37℃で300秒間APTT試薬55μと混合し、その後0.025M
CaCl255μを加え、凝血時間を測定した。
分析において、血漿インキュベーション混合物55μを
37℃で300秒間APTT試薬55μと混合し、その後0.025M
CaCl255μを加え、凝血時間を測定した。
PT分析：プロトロンビン時間（PT）分析において、ウサ
ギトロンボプラスチンを製造手引書にしたがって溶解
し、トロンボプラスチン１容量を0.03M CaCl2 ２容量
とともに混合した。分析において、インキュベーション
混合物75μをトロンボプラスチン/CaCl2試薬75μと
ともに37℃にて混合し、その後に凝血時間を測定した。
希釈組織因子（dTF）分析:dTF分析はPT分析と同様であ
った。しかしながら、この分析において我々はPT分析に
使用した未希釈ウサギトロンボプラスチンと対照するも
のとして凝血緩衝液中7.000倍に希釈したヒトトロンボ
プラスチンを使用した。
ギトロンボプラスチンを製造手引書にしたがって溶解
し、トロンボプラスチン１容量を0.03M CaCl2 ２容量
とともに混合した。分析において、インキュベーション
混合物75μをトロンボプラスチン/CaCl2試薬75μと
ともに37℃にて混合し、その後に凝血時間を測定した。
希釈組織因子（dTF）分析:dTF分析はPT分析と同様であ
った。しかしながら、この分析において我々はPT分析に
使用した未希釈ウサギトロンボプラスチンと対照するも
のとして凝血緩衝液中7.000倍に希釈したヒトトロンボ
プラスチンを使用した。
実施例
凝血における相乗効果の証明
凝血分析は、添加されたEPIおよび／またはLMWヘパリ
ンを用い、凝血緩衝剤（0.1％ウシ血清アルブミン、50m
Mイミダゾール、100mM NaCl,pH7.3）ですべてを希釈し
た血漿サンプル中で実施した。全容量の1/6がrEPIであ
り、容量の1/20はLMWヘパリンであった。サンプルにお
いてこれら試薬の幾つかは添加されず、凝血緩衝剤を加
えて血漿の希釈率を一定に保った。すべてのサンプルを
室温にて15分間インキュベートしてから分析を始めた。
インストゥメンテーション ラボラトリィーズ アスコ
リピセノ，イタリー（Instumentation Laboratories,As
coli Piceno,Italy）からのACL 300R凝血装置において
すべての凝集時間を測定した。
ンを用い、凝血緩衝剤（0.1％ウシ血清アルブミン、50m
Mイミダゾール、100mM NaCl,pH7.3）ですべてを希釈し
た血漿サンプル中で実施した。全容量の1/6がrEPIであ
り、容量の1/20はLMWヘパリンであった。サンプルにお
いてこれら試薬の幾つかは添加されず、凝血緩衝剤を加
えて血漿の希釈率を一定に保った。すべてのサンプルを
室温にて15分間インキュベートしてから分析を始めた。
インストゥメンテーション ラボラトリィーズ アスコ
リピセノ，イタリー（Instumentation Laboratories,As
coli Piceno,Italy）からのACL 300R凝血装置において
すべての凝集時間を測定した。
結 果
結果を図１〜３に示す。
図１（APTT分析）から、10μg/m rEPI単独の添加に
より正常なヒトの血漿のAPTT凝集時間が26秒まで上昇
し、一方LMWヘパリン（0.4F X aI U/m）単独の添加に
より57秒まで時間を増やすことが明らかである。上述の
量で二成分をコインキュベーションするとより優れた効
果すなわち凝血時間を283秒まで延長するという結果に
なる。
より正常なヒトの血漿のAPTT凝集時間が26秒まで上昇
し、一方LMWヘパリン（0.4F X aI U/m）単独の添加に
より57秒まで時間を増やすことが明らかである。上述の
量で二成分をコインキュベーションするとより優れた効
果すなわち凝血時間を283秒まで延長するという結果に
なる。
第２図（PT分析）によれば、４μg/m rEPIだけを添
加すると正常な血漿の凝血時間を4.4秒まで増加し一方L
MWヘパリン（2F X aI U/m）だけを添加すると10.4秒
まで時間を増やすことが示される。上述の量で二成分を
コインキュベーションすると141秒ほど長い間凝血時間
を延長した。
加すると正常な血漿の凝血時間を4.4秒まで増加し一方L
MWヘパリン（2F X aI U/m）だけを添加すると10.4秒
まで時間を増やすことが示される。上述の量で二成分を
コインキュベーションすると141秒ほど長い間凝血時間
を延長した。
第３図（dTF分析）によれば、0.8μg/m rEPI単独の
添加で正常血漿の凝血時間を35秒まで増加したが一方LM
Wヘパリン（0.2F X aI U/m）単独の添加では時間を10
5秒まで増加することが明らかである。上述の量で二成
分をコインキュベーションすると凝血時間が341秒まで
延長した。
添加で正常血漿の凝血時間を35秒まで増加したが一方LM
Wヘパリン（0.2F X aI U/m）単独の添加では時間を10
5秒まで増加することが明らかである。上述の量で二成
分をコインキュベーションすると凝血時間が341秒まで
延長した。
したがって、三つの分析すべてにおいて結果によりrE
PIとLMWヘパリンの間の相乗効果が明らかである。
PIとLMWヘパリンの間の相乗効果が明らかである。
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A61K 38/55
A61K 31/727
A61P 7/02
ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ)
ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ)
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)
Claims (9)
- 【請求項１】薬剤上許容されうる希釈剤またはビヒクル
と一緒に外因性の経路の阻害剤（EPI）タンパク質およ
びヘパリンまたは他のムコ多糖類を含む凝血性疾患の予
防または治療のための薬剤。 - 【請求項２】EPIタンパク質がヘパリンと結合する請求
項１に記載の薬剤。 - 【請求項３】EPIタンパク質およびヘパリンをほぼ同時
または逐次共同投与に適する形で別々の容器に含む請求
の範囲第１項に記載の薬剤。 - 【請求項４】EPIタンパク質が0.5〜40mgの量で存在する
請求項１〜３のいずれか１に記載の薬剤。 - 【請求項５】ヘパリンが単位投与量当り1000〜15000IU
の量で存在する請求項１〜４のいずれか１に記載の薬
剤。 - 【請求項６】ヘパリンが単位投与量当り2000〜10000IU
の量で存在する請求項５に記載の薬剤。 - 【請求項７】外因性の経路の阻害剤（EPI）タンパク質
およびヘパリンまたは他のムコ多糖類と薬剤上許容され
うる希釈剤またはビヒクルを混合することを含む凝血性
疾患の予防または治療のための医薬品の調製方法。 - 【請求項８】EPIタンパク質がヘパリンと結合する請求
項７に記載の方法。 - 【請求項９】EPIタンパク質およびヘパリンを、EPIタン
パク質およびヘパリンのほぼ同時または逐次共同投与に
適する形態の別々の容器に準備する凝血性疾患の予防ま
たは治療のための医薬品の調製方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK1488/90 | 1990-06-19 | ||
| DK148890A DK148890D0 (da) | 1990-06-19 | 1990-06-19 | Farmaceutisk praeparat |
| PCT/DK1991/000145 WO1991019514A1 (en) | 1990-06-19 | 1991-05-30 | An anticoagulant preparation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05507926A JPH05507926A (ja) | 1993-11-11 |
| JP3362038B2 true JP3362038B2 (ja) | 2003-01-07 |
Family
ID=8105367
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51133391A Expired - Fee Related JP3362038B2 (ja) | 1990-06-19 | 1991-05-30 | 抗凝血剤 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0535129B1 (ja) |
| JP (1) | JP3362038B2 (ja) |
| AT (1) | ATE119781T1 (ja) |
| AU (1) | AU645581B2 (ja) |
| BG (1) | BG61181B1 (ja) |
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| ES (1) | ES2069894T3 (ja) |
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| WO (1) | WO1991019514A1 (ja) |
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| US20030171292A1 (en) | 1992-06-01 | 2003-09-11 | Creasey Abla A. | Method for using lipoprotein associated coagulation inhibitor to treat sepsis |
| AU4408493A (en) * | 1992-06-11 | 1994-01-04 | Washington University | Prophylaxis and treatment of sepsis and sepsis-associated coagulation disorders |
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| US5981471A (en) * | 1997-02-06 | 1999-11-09 | Entremed, Inc. | Compositions and methods for inhibiting cellular proliferation |
| CN1604790A (zh) | 2001-10-15 | 2005-04-06 | 希龙公司 | 通过施用组织因子途径抑制剂(tfpi)治疗严重性肺炎 |
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| US4689323A (en) * | 1983-09-26 | 1987-08-25 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently bound heparin--antithrombin-III complex |
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| US4900723A (en) * | 1988-04-29 | 1990-02-13 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Method of preventing or reducing venous thrombosis using a thromboxane A2 receptor antagonist in conjunction with heparin and combination |
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