JPH0735340B2 - 血栓溶解促進剤 - Google Patents
血栓溶解促進剤Info
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- JPH0735340B2 JPH0735340B2 JP60109256A JP10925685A JPH0735340B2 JP H0735340 B2 JPH0735340 B2 JP H0735340B2 JP 60109256 A JP60109256 A JP 60109256A JP 10925685 A JP10925685 A JP 10925685A JP H0735340 B2 JPH0735340 B2 JP H0735340B2
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- plasmin
- plasmin inhibitor
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 a.産業上の利用分野 本発明はヒトα2−プラスミンインヒビター（α2−plas
min inhibitor;α2−antiplasmin）に対するモノクロー
ナル抗体、特にヒトα2−プラスミンインヒビターの線
維素溶解部位（reactive site）を抗原として認識し、
その結果ヒトα2−プラスミンインヒビターの、プラス
ミンの線維素溶解作用に対する阻害活性を抑制し、線溶
促進させる働きを有するモノクローナル抗体を有効成分
とする、血栓症（Thrombosis），広汎性血管内凝固症
（DIC;Disseminated intravascular coagulation）等の
如き血栓性疾患の新規治療剤として使用される血栓溶解
促進剤に関する。
min inhibitor;α2−antiplasmin）に対するモノクロー
ナル抗体、特にヒトα2−プラスミンインヒビターの線
維素溶解部位（reactive site）を抗原として認識し、
その結果ヒトα2−プラスミンインヒビターの、プラス
ミンの線維素溶解作用に対する阻害活性を抑制し、線溶
促進させる働きを有するモノクローナル抗体を有効成分
とする、血栓症（Thrombosis），広汎性血管内凝固症
（DIC;Disseminated intravascular coagulation）等の
如き血栓性疾患の新規治療剤として使用される血栓溶解
促進剤に関する。
b.従来技術 ヒトα2−プラスミンインヒビターは、青木と諸井によ
つて最初に単離・精製され、線維素溶解酵素のプラスミ
ン（plasmin）のエステラーゼ活性を瞬間的に阻害する
強力なプラスミンインヒビターであり、11.7％の糖を含
む分子量約67,000の１本鎖の糖蛋白質であることが知ら
れている〔Moroi＆Aoki;The Journal of Biological Ch
emistry,251,5956-5965（1976）参照〕。
つて最初に単離・精製され、線維素溶解酵素のプラスミ
ン（plasmin）のエステラーゼ活性を瞬間的に阻害する
強力なプラスミンインヒビターであり、11.7％の糖を含
む分子量約67,000の１本鎖の糖蛋白質であることが知ら
れている〔Moroi＆Aoki;The Journal of Biological Ch
emistry,251,5956-5965（1976）参照〕。
一方ヒトのα2−プラスミンインヒビターには３種類の
活性部位があることが知られている。第１はプラスミン
の線維素溶解作用阻害部位（以下これを“リアクテイブ
サイト”ということがある）〔B.Wiman＆D.Collen;The
Journal of Biological Chemistry,254,9291-9297（197
9）参照〕であり、第２はカルボキシル基末端側のプラ
スミン結合部位〔B.Wiman＆D.Collen;European Journal
of Biochemistry,84,573-578（1978）参照〕であり、
第３はアミノ基末端のフイブリン結合部位である〔Y.Sa
kata,et al.,Thrombosia Rcsearch,16,279-282（1979）
参照〕。
活性部位があることが知られている。第１はプラスミン
の線維素溶解作用阻害部位（以下これを“リアクテイブ
サイト”ということがある）〔B.Wiman＆D.Collen;The
Journal of Biological Chemistry,254,9291-9297（197
9）参照〕であり、第２はカルボキシル基末端側のプラ
スミン結合部位〔B.Wiman＆D.Collen;European Journal
of Biochemistry,84,573-578（1978）参照〕であり、
第３はアミノ基末端のフイブリン結合部位である〔Y.Sa
kata,et al.,Thrombosia Rcsearch,16,279-282（1979）
参照〕。
ヒトα2−プラスミンインヒビターにおけるこれら３種
類の活性部位のうち、リアクテイブサイトを抗原として
選択的に認識するモノクローナル抗体を提供できれば、
これを使用することによつてヒトα2−プラスミンイン
ヒビターの線維素溶解阻害作用を直接抑え、線溶を促進
することができるので非常に興味あることである。
類の活性部位のうち、リアクテイブサイトを抗原として
選択的に認識するモノクローナル抗体を提供できれば、
これを使用することによつてヒトα2−プラスミンイン
ヒビターの線維素溶解阻害作用を直接抑え、線溶を促進
することができるので非常に興味あることである。
一方、血栓性疾患は血液の性状の変化、血流のうつ滞、
血管壁の変化等により、血管内で血液が凝固する病気で
あり、DICは凝固活性因子の血管内侵入等により、全身
の細小血管に血栓が形成された病気である。これらの治
療に於て血栓の溶解を目的として、プラスミノーゲンを
活性化させる為の酵素、例えばウロキナーゼの投与が行
われている。しかし、血中のα2−プラスミンインヒビ
ターによつてプラスミンが速やかに阻害されるので効果
的ではなかつた。従つて血中のα2−プラスミンインヒ
ビターのプラスミン活性阻害作用を直接抑えるモノクロ
ーナル抗体を治療に用いれば血栓を速やかに消失させる
事ができる。
血管壁の変化等により、血管内で血液が凝固する病気で
あり、DICは凝固活性因子の血管内侵入等により、全身
の細小血管に血栓が形成された病気である。これらの治
療に於て血栓の溶解を目的として、プラスミノーゲンを
活性化させる為の酵素、例えばウロキナーゼの投与が行
われている。しかし、血中のα2−プラスミンインヒビ
ターによつてプラスミンが速やかに阻害されるので効果
的ではなかつた。従つて血中のα2−プラスミンインヒ
ビターのプラスミン活性阻害作用を直接抑えるモノクロ
ーナル抗体を治療に用いれば血栓を速やかに消失させる
事ができる。
c.本発明の構成 本発明によれば、ヒトα2−プラスミンインヒビターに
対するモノクローナル抗体であつて、ヒトα2−プラス
ミンインヒビターにおけるプラスミンの線維素溶解阻止
作用を抑制するモノクローナル抗体或いはその少なくと
もFab部分を有する断片を有効成分とする血栓溶解促進
剤が提供される。かゝる本発明の血栓溶解促進剤は、例
えば血栓が原因となつている血栓性疾患を治療するため
に有効である。
対するモノクローナル抗体であつて、ヒトα2−プラス
ミンインヒビターにおけるプラスミンの線維素溶解阻止
作用を抑制するモノクローナル抗体或いはその少なくと
もFab部分を有する断片を有効成分とする血栓溶解促進
剤が提供される。かゝる本発明の血栓溶解促進剤は、例
えば血栓が原因となつている血栓性疾患を治療するため
に有効である。
本発明のモノクローナル抗体はケーラーとミルシユタイ
ンの方法〔Ｋhler and Milstein,Nature 256,495〜49
7（1975）〕として知られた手法によつて産生される。
すなわち、ヒトα2−プラスミンインヒビターでマウス
を免疫した後、このマウスの脾臓細胞をマウスミエロー
マ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマ細胞は、マ
イクロタイタープレート（microtiter plates）に固定
されたヒトα2−プラスミンインヒビターと反応する抗
体に対し系統的に検査し選択される。このようにしてヒ
トα2−プラスミンインヒビターに対する抗体を合成
し、分泌するハイブリドーマ細胞を選別する。得られた
ハイブリドーマ細胞を無血清培地中で培養し、その培養
上清中に分泌されたヒトα2−プラスミンインヒビター
に対する抗体は、フイブリンプレート（fibrin plate
s）上でヒトα2−プラスミンインヒビターの線維素溶解
阻害作用を抑える活性について検査を行なう。その結
果、ヒトα2−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻
止作用を特異的に抑える活性を有するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞が単離された。
ンの方法〔Ｋhler and Milstein,Nature 256,495〜49
7（1975）〕として知られた手法によつて産生される。
すなわち、ヒトα2−プラスミンインヒビターでマウス
を免疫した後、このマウスの脾臓細胞をマウスミエロー
マ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマ細胞は、マ
イクロタイタープレート（microtiter plates）に固定
されたヒトα2−プラスミンインヒビターと反応する抗
体に対し系統的に検査し選択される。このようにしてヒ
トα2−プラスミンインヒビターに対する抗体を合成
し、分泌するハイブリドーマ細胞を選別する。得られた
ハイブリドーマ細胞を無血清培地中で培養し、その培養
上清中に分泌されたヒトα2−プラスミンインヒビター
に対する抗体は、フイブリンプレート（fibrin plate
s）上でヒトα2−プラスミンインヒビターの線維素溶解
阻害作用を抑える活性について検査を行なう。その結
果、ヒトα2−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻
止作用を特異的に抑える活性を有するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞が単離された。
本発明のモノクローナル抗体は、かゝるハイブリドーマ
細胞が産生する産出物から得られる。かくして得られた
モノクローナル抗体は、ヒトα2−プラスミンインヒビ
ターのリアクテイブサイトに対して単一特異的（monosp
ecitic）に作用する。
細胞が産生する産出物から得られる。かくして得られた
モノクローナル抗体は、ヒトα2−プラスミンインヒビ
ターのリアクテイブサイトに対して単一特異的（monosp
ecitic）に作用する。
次に本発明のハイブリドーマ細胞を産生する具体的方法
について詳細に説明する。
について詳細に説明する。
A.抗原の単離．精製； 抗原に用いるヒトα2−プラスミンインヒビターは前記
青木と諸井の方法によりヒト血漿中より単離精製され
た。
青木と諸井の方法によりヒト血漿中より単離精製され
た。
B.ヒトα2−プラスミンインヒビターによるマウスの免
疫； 雄Balb/cマウスを用いるが、他の系（strains）のマウ
スを使用することもできる。その際、免疫計画及びヒト
α2−プラスミンインヒビターの濃度は十分な量の抗原
刺激を受けたリンパ球が形成されるよう選ばれるべきで
ある。例えばマウスに少量のα2−プラスミンインヒビ
ターで或る間隔で腹腔に数回免疫の後、さらに数回静脈
に投与した。最終免疫の数日後に融合の為に脾臓細胞を
取り出す。
疫； 雄Balb/cマウスを用いるが、他の系（strains）のマウ
スを使用することもできる。その際、免疫計画及びヒト
α2−プラスミンインヒビターの濃度は十分な量の抗原
刺激を受けたリンパ球が形成されるよう選ばれるべきで
ある。例えばマウスに少量のα2−プラスミンインヒビ
ターで或る間隔で腹腔に数回免疫の後、さらに数回静脈
に投与した。最終免疫の数日後に融合の為に脾臓細胞を
取り出す。
C.細胞融合； 脾臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸濁液を調製
する。それらの脾臓細胞を適当なラインからのマウス骨
髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用により細胞融合させ
る。脾臓細胞対骨髄腫細胞の好ましい比率は約20:1〜約
2:1の範囲である。約108個の脾臓細胞について0.5〜1.5
mlの融合媒体の使用が適当である。
する。それらの脾臓細胞を適当なラインからのマウス骨
髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用により細胞融合させ
る。脾臓細胞対骨髄腫細胞の好ましい比率は約20:1〜約
2:1の範囲である。約108個の脾臓細胞について0.5〜1.5
mlの融合媒体の使用が適当である。
細胞融合に用いる骨髄腫細胞は多く知られているが、本
発明ではP3-X63-Ag8-U1細胞（以下P3-U1と略記する）
〔Yelton,D.E.et al.,Current Topics in Microbiology
and Immunology,81,1（1978）参照〕を用いた。これ
は、８−アザグアニン耐性の細胞ラインであり、酵素ヒ
ポキサンチン−グアニンホスホリポシルトランスフエラ
ーゼ（hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transfer
ase）が欠失しており、それゆえにHAT（ヒポキサンチ
ン，アミノプリテン，チミジン）培地中では生存しな
い。また、この細胞ラインは、それ自体抗体を分泌しな
い、いわゆる非分泌型である。
発明ではP3-X63-Ag8-U1細胞（以下P3-U1と略記する）
〔Yelton,D.E.et al.,Current Topics in Microbiology
and Immunology,81,1（1978）参照〕を用いた。これ
は、８−アザグアニン耐性の細胞ラインであり、酵素ヒ
ポキサンチン−グアニンホスホリポシルトランスフエラ
ーゼ（hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transfer
ase）が欠失しており、それゆえにHAT（ヒポキサンチ
ン，アミノプリテン，チミジン）培地中では生存しな
い。また、この細胞ラインは、それ自体抗体を分泌しな
い、いわゆる非分泌型である。
好ましい融合促進剤としては例えば平均分子量が1,000
〜4,000のポリエチレングリコールを有利に使用できる
が、この分野で知られている他の融合促進剤を使用する
こともできる。本発明の実施例では平均分子量1,540の
ポリエチレングリコールを用いた。
〜4,000のポリエチレングリコールを有利に使用できる
が、この分野で知られている他の融合促進剤を使用する
こともできる。本発明の実施例では平均分子量1,540の
ポリエチレングリコールを用いた。
D.融合した細胞の選択； 別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未融
合の脾臓細胞，未融合の骨髄腫細胞および融合した細胞
の混合物を、未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培地
で希釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間
（約１週間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−
アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しな
いもの（例えば前記HAT培地）が使用される。この選択
培地中では未融合の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合
の脾臓細胞は非腫瘍性細胞なのである一定期間後（約１
週間後）死滅する。これらに対して融合した細胞は骨髄
腫の親細胞の腫瘍性と親脾臓細胞の性質をあわせ持つた
めに選択培地中で生存できる。
合の脾臓細胞，未融合の骨髄腫細胞および融合した細胞
の混合物を、未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培地
で希釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間
（約１週間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−
アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しな
いもの（例えば前記HAT培地）が使用される。この選択
培地中では未融合の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合
の脾臓細胞は非腫瘍性細胞なのである一定期間後（約１
週間後）死滅する。これらに対して融合した細胞は骨髄
腫の親細胞の腫瘍性と親脾臓細胞の性質をあわせ持つた
めに選択培地中で生存できる。
E.各容器中のヒトα2−プラスミンインヒビターに対す
る抗体の確認； かくしてハイブリドーマ細胞が検出された後、その培養
上清を採取し、ヒトα2−プラスミンインヒビターに対
する抗体について酵素免疫定量法（Enzyme Linked Immu
no Sorbent Assay）によりスクリーニングする。
る抗体の確認； かくしてハイブリドーマ細胞が検出された後、その培養
上清を採取し、ヒトα2−プラスミンインヒビターに対
する抗体について酵素免疫定量法（Enzyme Linked Immu
no Sorbent Assay）によりスクリーニングする。
F.ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する活性を持
つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択； ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する抗体を産生
しているハイブリドーマ細胞を、無血清培地で培養して
得られた、抗体を含んだ培養上澄液を濃縮し、ヒトα2
−プラスミンインヒビターと共に一定時間インキユベー
トした。さらにこのヒトα2−プラスミンインヒビター
混合液にプラスミンを加え、フイブリンプレート上にの
せ、フイブリン溶解面積を測定した。このようにして、
ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する活性を持つ
抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する。
つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択； ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する抗体を産生
しているハイブリドーマ細胞を、無血清培地で培養して
得られた、抗体を含んだ培養上澄液を濃縮し、ヒトα2
−プラスミンインヒビターと共に一定時間インキユベー
トした。さらにこのヒトα2−プラスミンインヒビター
混合液にプラスミンを加え、フイブリンプレート上にの
せ、フイブリン溶解面積を測定した。このようにして、
ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する活性を持つ
抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する。
G.目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞のクローン
化； 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限定希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なつた方法で産生される。その第１の方法によれば
ハイブリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養するこ
とにより、その培養上清からそのハイブリドーマ細胞の
産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第２
の方法によればハイブリドーマ細胞は同質遺伝子又は半
同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射することができ
る。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹水中より、そ
のハイブリドーマ細胞の産生するモノクローナル抗体を
得ることができる。
化； 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限定希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なつた方法で産生される。その第１の方法によれば
ハイブリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養するこ
とにより、その培養上清からそのハイブリドーマ細胞の
産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第２
の方法によればハイブリドーマ細胞は同質遺伝子又は半
同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射することができ
る。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹水中より、そ
のハイブリドーマ細胞の産生するモノクローナル抗体を
得ることができる。
本発明で用いるモノクローナル抗体は、抗体全体を用い
るのはもちろんの事、抗体を、蛋白質分解酵素であるパ
パインを用いてPorterの方法〔R.R.Porter,Biochemical
Journal 73,119〜126（1959）参照〕により切断し、添
付図面の点線で囲まれた部分、いわゆるFab成分を含む
構造のモノクローナル抗体であればよい。
るのはもちろんの事、抗体を、蛋白質分解酵素であるパ
パインを用いてPorterの方法〔R.R.Porter,Biochemical
Journal 73,119〜126（1959）参照〕により切断し、添
付図面の点線で囲まれた部分、いわゆるFab成分を含む
構造のモノクローナル抗体であればよい。
このモノクローナル抗体のFabの部分構造はフイブリン
プレート上でヒトα2−プラスミンインヒビターの線維
素溶解阻害作用を抑える活性について調べられた。その
結果、上記のモノクローナル抗体のFabの部分構造のみ
でヒトα2−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻害
作用を特異的に抑える活性を有する事が確かめられた。
プレート上でヒトα2−プラスミンインヒビターの線維
素溶解阻害作用を抑える活性について調べられた。その
結果、上記のモノクローナル抗体のFabの部分構造のみ
でヒトα2−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻害
作用を特異的に抑える活性を有する事が確かめられた。
本発明のFab構造の少なくとも有するモノクローナル抗
体及び部分は、ヒトα2−プラスミンインヒビターのリ
アクテイブサイトに対して単一特異的に作用する。
体及び部分は、ヒトα2−プラスミンインヒビターのリ
アクテイブサイトに対して単一特異的に作用する。
本発明に使用される抗体である“α2−プラスミンイン
ヒビターにおけるプラスミンの線維素溶解作用の阻止部
位を特異的に認識して結合し得るモノクローナル抗体”
は、本発明者らによつて初めて見出され、先に特許出願
された（昭和59年４月17日出願：発明の名称“モノクロ
ーナル抗体，ハイブリドーマ細胞及びモノクローナル抗
体の製造方法",昭和59年10月12日出願：発明の名称“モ
ノクローナル抗体”）。
ヒビターにおけるプラスミンの線維素溶解作用の阻止部
位を特異的に認識して結合し得るモノクローナル抗体”
は、本発明者らによつて初めて見出され、先に特許出願
された（昭和59年４月17日出願：発明の名称“モノクロ
ーナル抗体，ハイブリドーマ細胞及びモノクローナル抗
体の製造方法",昭和59年10月12日出願：発明の名称“モ
ノクローナル抗体”）。
かくして、本発明においては前記モノクローナル抗体或
いはそのFab部分を少なくとも有する抗体の断片を有効
成分と含有するものであれば、それを血栓に接触させる
ことによりそれがヒトα2−プラスミンインヒビターに
おけるプラスミンのリアクテイブサイトに特異的に作用
し、結果的に血栓を溶解させるので血栓溶解促進剤とし
て利用できる。例えば本発明の血栓溶解促進剤は、静注
用製剤として使用することができ、その場合、上記モノ
クローナル抗体或いはそのFab部分を少なくとも有する
抗体断片は広い範囲の含有割合でよく、またこれらは通
常静注用として使用されている水性媒体中に溶解乃至分
散して使用することができる。例えば該モノクローナル
抗体を、ヒト血清アルブミン等の安定化剤、pH、浸透圧
などの調節剤例えばアミノ酢酸を含む生理食塩に溶か
し、凍結乾燥して製剤化できる。かかる方法は当業界周
知であるが、例えば以下の組成、 モノクローナル抗体 5 重量％ アミノ酢酸 2.25 〃 人血清アルブミン 0.25 〃 D-マンニトール 1.0 〃 塩化ナトリウム 0.9 〃 が例示できる。
いはそのFab部分を少なくとも有する抗体の断片を有効
成分と含有するものであれば、それを血栓に接触させる
ことによりそれがヒトα2−プラスミンインヒビターに
おけるプラスミンのリアクテイブサイトに特異的に作用
し、結果的に血栓を溶解させるので血栓溶解促進剤とし
て利用できる。例えば本発明の血栓溶解促進剤は、静注
用製剤として使用することができ、その場合、上記モノ
クローナル抗体或いはそのFab部分を少なくとも有する
抗体断片は広い範囲の含有割合でよく、またこれらは通
常静注用として使用されている水性媒体中に溶解乃至分
散して使用することができる。例えば該モノクローナル
抗体を、ヒト血清アルブミン等の安定化剤、pH、浸透圧
などの調節剤例えばアミノ酢酸を含む生理食塩に溶か
し、凍結乾燥して製剤化できる。かかる方法は当業界周
知であるが、例えば以下の組成、 モノクローナル抗体 5 重量％ アミノ酢酸 2.25 〃 人血清アルブミン 0.25 〃 D-マンニトール 1.0 〃 塩化ナトリウム 0.9 〃 が例示できる。
かかる薬剤を例えば点滴静注で400〜500mg/人・日で投
与することができる。
与することができる。
以下実施例を掲げ本発明を詳細に説明する。
実施例１ （１）ヒトα2−プラスミンインヒビターの調製 前記、青木及び諸井の方法に従い、ヒト血漿2,360mlか
らヒトα2−フラスミンインヒビター7.7mgを得た。
らヒトα2−フラスミンインヒビター7.7mgを得た。
（２）マウスの免疫 雄のBalb/cマウスをヒトα2−プラスミンインヒビター1
00μｇと完全なフロイントのアジユバント（Complete F
reund′s adjuvant）とのエマルジヨン（emulsion）で2
1日間の間隔をおいて２回腹腔に免疫した。さらに７日
後及び88日後にヒトα2−プラスミンインヒビター30μ
ｇを生理食塩水とともに静脈に追加投与した。最終免疫
の４日後にその脾臓細胞を細胞融合のために用いた。
00μｇと完全なフロイントのアジユバント（Complete F
reund′s adjuvant）とのエマルジヨン（emulsion）で2
1日間の間隔をおいて２回腹腔に免疫した。さらに７日
後及び88日後にヒトα2−プラスミンインヒビター30μ
ｇを生理食塩水とともに静脈に追加投与した。最終免疫
の４日後にその脾臓細胞を細胞融合のために用いた。
（３）脾臓細胞の懸濁液の調製 脾臓を無菌的に取り出し、ステンレス製メツシユを通過
させることにより単細胞懸濁液が得られた。細胞をＬ−
グルタミン0.39g/l,硫酸カナマイシン0.2g/l及びNaHCO3
2.0g/lを補充したRPMI-1640培地（GIBCO製）に移した。
増殖した細胞をRPMI-1640で３回洗浄しRPMI-1640培地に
再懸濁させた。
させることにより単細胞懸濁液が得られた。細胞をＬ−
グルタミン0.39g/l,硫酸カナマイシン0.2g/l及びNaHCO3
2.0g/lを補充したRPMI-1640培地（GIBCO製）に移した。
増殖した細胞をRPMI-1640で３回洗浄しRPMI-1640培地に
再懸濁させた。
（４）骨髄腫細胞の調製 マウス骨髄種細胞P3-U1は、Ｌ−グルタミン0.39g/l,硫
酸カナマイシン0.2g/l,NaHCO32.0g/l及び10％のウシ胎
児血清で補充されたRPMI-1640培地（10％FCS-RPMI-1640
と略記する）中で培養した。骨髄腫細胞は細胞融合の時
点に細胞分裂の対数期にあつた。
酸カナマイシン0.2g/l,NaHCO32.0g/l及び10％のウシ胎
児血清で補充されたRPMI-1640培地（10％FCS-RPMI-1640
と略記する）中で培養した。骨髄腫細胞は細胞融合の時
点に細胞分裂の対数期にあつた。
（５）細胞融合 脾臓細胞と骨髄腫細胞とを10:1の比率で無血清RPMI-164
0培地中に懸濁し、５分間約200gで遠心分離した。上澄
液培地を除去した後、沈降物を平均分子量1.540の50％
ポリエチレングリコール溶液（pH8.2）1mlと共に２分間
37℃でインキユベーシヨンした。次いで無血清RPMI-164
0培地9mlを加え、細胞を５分間注意深く再懸濁した。次
いでこの懸濁液を５分間約200gで遠心分離し、その後８
×106細胞/mlの濃度が得られるように10％FCS-RPMI-164
0培地に再懸濁し、次いで96マイクロウエルプレート上
に分配した（ウエル１個につき約100μｌ）。この融合
細胞は37℃において５％CO2を使用して培養した。
0培地中に懸濁し、５分間約200gで遠心分離した。上澄
液培地を除去した後、沈降物を平均分子量1.540の50％
ポリエチレングリコール溶液（pH8.2）1mlと共に２分間
37℃でインキユベーシヨンした。次いで無血清RPMI-164
0培地9mlを加え、細胞を５分間注意深く再懸濁した。次
いでこの懸濁液を５分間約200gで遠心分離し、その後８
×106細胞/mlの濃度が得られるように10％FCS-RPMI-164
0培地に再懸濁し、次いで96マイクロウエルプレート上
に分配した（ウエル１個につき約100μｌ）。この融合
細胞は37℃において５％CO2を使用して培養した。
（６）ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する抗体
産生ハイブリドーマ細胞の選択及び培養 細胞融合の１日後にHAT培地をウエル１個につき100μｌ
加えた。以後２日間隔で半分量の培地を新たなHAT培地
と交換して培養した。８日後、ハイブリドーマ細胞の培
養上澄液中のヒトα2−プラスミンインヒビターに対す
る抗体について酵素免疫定量法によりスクリーニングを
おこなつた。スクリーニングに用いられた抗原はヒトα
2−プラスミンインヒビター、第２抗体はアルカリフオ
スフアターゼ（alkali phosphatase）標識付のウサギ抗
マウス抗体であつた。
産生ハイブリドーマ細胞の選択及び培養 細胞融合の１日後にHAT培地をウエル１個につき100μｌ
加えた。以後２日間隔で半分量の培地を新たなHAT培地
と交換して培養した。８日後、ハイブリドーマ細胞の培
養上澄液中のヒトα2−プラスミンインヒビターに対す
る抗体について酵素免疫定量法によりスクリーニングを
おこなつた。スクリーニングに用いられた抗原はヒトα
2−プラスミンインヒビター、第２抗体はアルカリフオ
スフアターゼ（alkali phosphatase）標識付のウサギ抗
マウス抗体であつた。
総数349個のウエルの全てが酵素免疫定量法により陽性
であり、α2−プラスミンインヒビターに対する抗体を
産生しているという結果が得られた。
であり、α2−プラスミンインヒビターに対する抗体を
産生しているという結果が得られた。
細胞の増殖が活発になつたと観察されたとき、HT培地を
加えた。１日間隔で計４回HT培地を用いて培地交換をお
こない、その後は通常の10％FCS-RPMI-1640培地を用い
て培養した。
加えた。１日間隔で計４回HT培地を用いて培地交換をお
こない、その後は通常の10％FCS-RPMI-1640培地を用い
て培養した。
実施例２（ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する
抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択） 上記ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する抗体を
産生しているハイブリドーマ細胞中からヒトα2−プラ
スミンインヒビターの線維素溶解阻害活性を抑える働き
を持つた抗体を産生するハイブリドーマ細胞を次の方法
でスクリーニングした。
抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択） 上記ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する抗体を
産生しているハイブリドーマ細胞中からヒトα2−プラ
スミンインヒビターの線維素溶解阻害活性を抑える働き
を持つた抗体を産生するハイブリドーマ細胞を次の方法
でスクリーニングした。
各ウエルのハイブリドーマを10％FCS-RPMI-1640培地中
で培養し、細胞数を約２×107個とした。この細胞を５
分間約200gで遠心分離し、培養上澄液を除去した後、細
胞を無血清RPMI-1640培地10mlで洗浄した。さらに５分
間約200gで遠心分離し、上澄液を除去し、細胞を２−メ
ルカフトエタノール5.0ml/l,インシユリン7.5ml/l,トラ
ンスフエリン5.0ml/l,エタノールアミン5.0ml/l,ナトリ
ウムセレナイト5.0ml/l,L−グルタミン0.39g/l,硫酸カ
ナマイシン0.2g/l,Hepes2.38g/l及びNaHCO31.5g/lで補
充されたRPMI-1640:Dulbecco′sMEM:Ham′sF-12（2:1:
1）の混合無血清培地（以下これを“MITES培地”と略記
する）10mlに懸濁し、３日間培養した。
で培養し、細胞数を約２×107個とした。この細胞を５
分間約200gで遠心分離し、培養上澄液を除去した後、細
胞を無血清RPMI-1640培地10mlで洗浄した。さらに５分
間約200gで遠心分離し、上澄液を除去し、細胞を２−メ
ルカフトエタノール5.0ml/l,インシユリン7.5ml/l,トラ
ンスフエリン5.0ml/l,エタノールアミン5.0ml/l,ナトリ
ウムセレナイト5.0ml/l,L−グルタミン0.39g/l,硫酸カ
ナマイシン0.2g/l,Hepes2.38g/l及びNaHCO31.5g/lで補
充されたRPMI-1640:Dulbecco′sMEM:Ham′sF-12（2:1:
1）の混合無血清培地（以下これを“MITES培地”と略記
する）10mlに懸濁し、３日間培養した。
培養上澄液を回収し、これを25倍に濃縮した。この濃縮
液25μｌにヒトα2−プラスミンインヒビター0.4μｇを
加え、37℃で30分間インキユベーシヨンした。次いでプ
ラスミノーゲン0.025ユニツト及びウロキナーゼ0.031ユ
ニツトを加え液量を40μｌとした。このうち10μｌをフ
イブリンプレートにのせた。フイブリンプレートは、37
℃，湿度95％以上の条件下で18時間静置し溶解した面積
を測定した。
液25μｌにヒトα2−プラスミンインヒビター0.4μｇを
加え、37℃で30分間インキユベーシヨンした。次いでプ
ラスミノーゲン0.025ユニツト及びウロキナーゼ0.031ユ
ニツトを加え液量を40μｌとした。このうち10μｌをフ
イブリンプレートにのせた。フイブリンプレートは、37
℃，湿度95％以上の条件下で18時間静置し溶解した面積
を測定した。
その結果、1D10ハイブリドーマ細胞の産生する抗体に加
えたヒトα2−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻
害活性を完全に抑える働きが見出された。
えたヒトα2−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻
害活性を完全に抑える働きが見出された。
実施例３ ハイブリドーマ細胞のクローニング； ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する抗体の活性
試験において陽性の結果を示したハイブリドーマ細胞
（1D10）を次の方法でクローン化した。
試験において陽性の結果を示したハイブリドーマ細胞
（1D10）を次の方法でクローン化した。
1D10細胞を96ウエルマイクロタイタープレートの１ウエ
ルあたり0.9細胞となるよう希釈し、Balb/cマウス胸腺
細胞をフイーダー細胞として加えプレートに分配し10％
FCS-RPMI-1640倍で培養した。顕微鏡下で観察し、確実
にシングルセルコロニーであることを認めた。ハイブリ
ドーマ細胞の培養上澄液中のヒトα2−プラスミンイン
ヒビターに対する抗体につき酵素免疫定量法によりスク
リーニングをおこなつた。
ルあたり0.9細胞となるよう希釈し、Balb/cマウス胸腺
細胞をフイーダー細胞として加えプレートに分配し10％
FCS-RPMI-1640倍で培養した。顕微鏡下で観察し、確実
にシングルセルコロニーであることを認めた。ハイブリ
ドーマ細胞の培養上澄液中のヒトα2−プラスミンイン
ヒビターに対する抗体につき酵素免疫定量法によりスク
リーニングをおこなつた。
総数26個のウエルが酵素免疫定量法により陽性でありヒ
トα2−プラスミンインヒビターに対するモノクローナ
ル抗体を産生していた。
トα2−プラスミンインヒビターに対するモノクローナ
ル抗体を産生していた。
モノクローナル抗体の精製； 大量のヒトα2−プラスミンインヒビターに対するモノ
クローナル抗体を産生させるために、約107個のハイブ
リドーマ細胞をプリスタンで前処理したBalb/cマウスに
腹腔内注射した。約１週間後採取された腹水液よりEyら
の方法〔P.L.Ey,S.J.Prowse and C.R.Jenkin,Immunoche
mistry,15,429-436（1978）参照〕に従いプロテインＡ
−セフアロース4B（proteinA-Sepharose4B）カラムを用
いて抗体を精製した。腹水液2.5mlよりヒトα2−プラス
ミンインヒビターに対するモノクローナル抗体20mgを得
た。
クローナル抗体を産生させるために、約107個のハイブ
リドーマ細胞をプリスタンで前処理したBalb/cマウスに
腹腔内注射した。約１週間後採取された腹水液よりEyら
の方法〔P.L.Ey,S.J.Prowse and C.R.Jenkin,Immunoche
mistry,15,429-436（1978）参照〕に従いプロテインＡ
−セフアロース4B（proteinA-Sepharose4B）カラムを用
いて抗体を精製した。腹水液2.5mlよりヒトα2−プラス
ミンインヒビターに対するモノクローナル抗体20mgを得
た。
精製したモノクローナル抗体の特徴； 精製したモノクローナル抗体の特定のクラスを、クラス
特異性抗マウス抗血清を使用してオクタロニーゲル拡散
試験で決定した。その結果を下記表１に示した。ヒトα
2−プラスミンインヒビターに対する抗体は、その多く
がＨ鎖γ1,L鎖Ｋであつた。
特異性抗マウス抗血清を使用してオクタロニーゲル拡散
試験で決定した。その結果を下記表１に示した。ヒトα
2−プラスミンインヒビターに対する抗体は、その多く
がＨ鎖γ1,L鎖Ｋであつた。
実施例４ ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する抗体による
ヒトα2−プラスミンインヒビター活性の抑制 ヒトα2−プラスミンインヒビター１μｇと各モノクロ
ーナル抗体５μｇを0.05Mリン酸緩衝生理食塩水（以下P
BSと略す）50μｌに溶解させ、37℃で30分間インキユベ
ーシヨンした。次いでプラスミノーゲン0.025ユニツト
及びウロキナーゼ0.031ユニツトを加え液量を60μｌと
した。このうち10μｌをフイブリンプレートにのせた。
フイブリンプレートは37℃，湿度95％以上の条件下で18
時間静置し、溶解した面積を測定した。その結果を下記
表２に示した。
ヒトα2−プラスミンインヒビター活性の抑制 ヒトα2−プラスミンインヒビター１μｇと各モノクロ
ーナル抗体５μｇを0.05Mリン酸緩衝生理食塩水（以下P
BSと略す）50μｌに溶解させ、37℃で30分間インキユベ
ーシヨンした。次いでプラスミノーゲン0.025ユニツト
及びウロキナーゼ0.031ユニツトを加え液量を60μｌと
した。このうち10μｌをフイブリンプレートにのせた。
フイブリンプレートは37℃，湿度95％以上の条件下で18
時間静置し、溶解した面積を測定した。その結果を下記
表２に示した。
なお、プラスミノーゲン0.025ユニツトとウローキナー
ゼ0.031ユニツトとによる溶解面積を100％とした。
ゼ0.031ユニツトとによる溶解面積を100％とした。
実施例５ ヒトα2−プラスミンインヒビターとフイブリンの結合
に及ぼすヒトα2−プラスミンインヒビターに対するモ
ノクローナル抗体の効果 I125標識したヒトα2−プラスミンインヒビター0.01μ
Ｍとα2−プラスミンインヒビターに対するモノクロー
ナル抗体0.05μＭを２％牛血清アルブミン−0.05Mトリ
ス緩衝液（pH7.4）−0.15M NaClを加えて、37℃で30分
間インキユベーシヨン後、４℃で一晩放置した。この抗
原−抗体反応混液に、2.5mM CaCl7,7μＭフイブリノー
ゲン画分,2ユニツト/mlトロンビンを加え、全量で100μ
ｌとして37℃で30分間インキユベーシヨンした。凝固物
（フイブリン塊）の形成が認められた。30分後に200mM
EDTAを100μｌ加え、カルシウムイオンを除いた後、竹
串でこの凝固物を巻き取つた。竹串に巻き取つた凝固物
は５分間,3回洗浄液（２％BSA,0.05Mトリス緩衝液（pH
7.4）,0.15M NaCl,2mM EDTA〕で洗つた。最後に凝固物
を竹串から試験管に回収し、凝固物の放射活性（cpm）
を測定した。元の反応混液中の放射活性に対する凝固物
の放射活性の割合を表３に示す。
に及ぼすヒトα2−プラスミンインヒビターに対するモ
ノクローナル抗体の効果 I125標識したヒトα2−プラスミンインヒビター0.01μ
Ｍとα2−プラスミンインヒビターに対するモノクロー
ナル抗体0.05μＭを２％牛血清アルブミン−0.05Mトリ
ス緩衝液（pH7.4）−0.15M NaClを加えて、37℃で30分
間インキユベーシヨン後、４℃で一晩放置した。この抗
原−抗体反応混液に、2.5mM CaCl7,7μＭフイブリノー
ゲン画分,2ユニツト/mlトロンビンを加え、全量で100μ
ｌとして37℃で30分間インキユベーシヨンした。凝固物
（フイブリン塊）の形成が認められた。30分後に200mM
EDTAを100μｌ加え、カルシウムイオンを除いた後、竹
串でこの凝固物を巻き取つた。竹串に巻き取つた凝固物
は５分間,3回洗浄液（２％BSA,0.05Mトリス緩衝液（pH
7.4）,0.15M NaCl,2mM EDTA〕で洗つた。最後に凝固物
を竹串から試験管に回収し、凝固物の放射活性（cpm）
を測定した。元の反応混液中の放射活性に対する凝固物
の放射活性の割合を表３に示す。
なお表３中に通常の市販のマウスIgGを比較抗体として
使用した結果を併せて示した。
使用した結果を併せて示した。
この結果から各ヒトα2−プラスミンインヒビターに対
するモノクローナル抗体はヒトα2−プラスミンインヒ
ビターのフイブリン結合部位を認識していないモノクロ
ーナル抗体であることがわかる。
するモノクローナル抗体はヒトα2−プラスミンインヒ
ビターのフイブリン結合部位を認識していないモノクロ
ーナル抗体であることがわかる。
実施例６（ヒトα2−プラスミンインヒビターのリアク
テイブサイトを認識するモノクローナル抗体の検索） 本実施例はヒトα2−プラスミンインヒビターによるプ
ラスミンの不活性化に及ぼすα2−プラスミンインヒビ
ターに対するモノクローナル抗体の効果を調べたもので
ある。
テイブサイトを認識するモノクローナル抗体の検索） 本実施例はヒトα2−プラスミンインヒビターによるプ
ラスミンの不活性化に及ぼすα2−プラスミンインヒビ
ターに対するモノクローナル抗体の効果を調べたもので
ある。
α2−プラスミンインヒビター0.15μＭとα2−プラスミ
ンインヒビターに対するモノクローナル抗体0.75μＭを
２％牛血清アルブミン溶液0.05Mトリス緩衝液（pH7.
4）,0.15M NaCl〕中で37℃,30分間インキユベーシヨン
し、４℃で一晩放置した。
ンインヒビターに対するモノクローナル抗体0.75μＭを
２％牛血清アルブミン溶液0.05Mトリス緩衝液（pH7.
4）,0.15M NaCl〕中で37℃,30分間インキユベーシヨン
し、４℃で一晩放置した。
この反応混液60μｌとプラスミン溶液（0.47μＭ）20μ
ｌを混ぜ、0.05Mトリス緩衝液（pH7.4）,0.15M NaClを
加えて全量を500μｌとしたものを各サンプルについて
２本ずつ用意し、37℃で２分又は20分間インキユベーシ
ヨンした。次に3.5mM合成基質S-2251（Ｈ−Ｄ−バリル
−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リジル−ｐ−ニトロアニリド・二
塩酸塩）を200μｌ加え、分光光度計（Beckman,DU-8）
によつて単位時間当りの405nmの波長における吸光度の
変化を測定した。対照としてプラスミンのみを反応させ
た試料とモノクローナル抗体を加えずにヒトα2−プラ
スミンインヒビターとプラスミンを反応させた試料につ
いても同様に吸光度の変化を調べた。その結果を下記表
４に示した。
ｌを混ぜ、0.05Mトリス緩衝液（pH7.4）,0.15M NaClを
加えて全量を500μｌとしたものを各サンプルについて
２本ずつ用意し、37℃で２分又は20分間インキユベーシ
ヨンした。次に3.5mM合成基質S-2251（Ｈ−Ｄ−バリル
−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リジル−ｐ−ニトロアニリド・二
塩酸塩）を200μｌ加え、分光光度計（Beckman,DU-8）
によつて単位時間当りの405nmの波長における吸光度の
変化を測定した。対照としてプラスミンのみを反応させ
た試料とモノクローナル抗体を加えずにヒトα2−プラ
スミンインヒビターとプラスミンを反応させた試料につ
いても同様に吸光度の変化を調べた。その結果を下記表
４に示した。
以上実施例５及び６の結果から本発明のモノクローナル
抗体はヒトα2−プラスミンインヒビターのリアクテイ
ブサイトを特異的に認識し、プラスミン結合部位及びフ
イブリン結合部位のいずれをも認識していないことがわ
かつた。
抗体はヒトα2−プラスミンインヒビターのリアクテイ
ブサイトを特異的に認識し、プラスミン結合部位及びフ
イブリン結合部位のいずれをも認識していないことがわ
かつた。
実施例７ ヒトα2−プラスミンインヒビターのリアクテイブサイ
トを認識するモノクローナル抗体のパパインによる切断 ヒトα2−プラスミンインヒビターのリアクテイブサイ
トを特異的に認識する上記実施例記載のモノクローナル
抗体1D10C1 1mgを溶解液〔2mM EDTA,12.5mMシステイン,
50mMトリス緩衝液（pH7.4）,0.15M NaCl〕300μｌに溶
解し、1mg/ml濃度のパパイン溶液100μｌを加え、37℃
で18時間反応させた。
トを認識するモノクローナル抗体のパパインによる切断 ヒトα2−プラスミンインヒビターのリアクテイブサイ
トを特異的に認識する上記実施例記載のモノクローナル
抗体1D10C1 1mgを溶解液〔2mM EDTA,12.5mMシステイン,
50mMトリス緩衝液（pH7.4）,0.15M NaCl〕300μｌに溶
解し、1mg/ml濃度のパパイン溶液100μｌを加え、37℃
で18時間反応させた。
この反応液を液体クロマトグラフイーにかけ、Fab成分
を分取した。これをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により、還元条件及び非還元条件下で分子量を測定
したところ、抗体のＨ鎖（Heavy chain）のアミノ基末
端より分子量約23,000の断片と分子量約23,000のＬ鎖全
体から成るFab成分であることが認識された。
を分取した。これをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により、還元条件及び非還元条件下で分子量を測定
したところ、抗体のＨ鎖（Heavy chain）のアミノ基末
端より分子量約23,000の断片と分子量約23,000のＬ鎖全
体から成るFab成分であることが認識された。
実施例８ ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する抗体のFab成
分によるヒトα2−プラスミンインヒビター活性の抑制 ヒトα2−プラスミンインヒビター１μｇと、各モノク
ローナル抗体３μｇを0.05M PBS50μｌに溶解させ37℃
で30分間インキユベーシヨンした。次いでプラスミノー
ゲン0.025ユニツト及びウロキナーゼ0.031ユニツトを加
え液量を60μｌとした。このうち10μｌをフイブリンプ
レートにのせた。フイブリンプレートは37℃湿度95％以
上の条件で18時間静置し、溶解した面積を測定した。そ
の結果を下記表５に示した。なお下記表の値は、プラス
ミノーゲン0.025ユニツトとウロキナーゼ0.031ユニツト
とによる溶解面積を100％とした時の相対値である。
分によるヒトα2−プラスミンインヒビター活性の抑制 ヒトα2−プラスミンインヒビター１μｇと、各モノク
ローナル抗体３μｇを0.05M PBS50μｌに溶解させ37℃
で30分間インキユベーシヨンした。次いでプラスミノー
ゲン0.025ユニツト及びウロキナーゼ0.031ユニツトを加
え液量を60μｌとした。このうち10μｌをフイブリンプ
レートにのせた。フイブリンプレートは37℃湿度95％以
上の条件で18時間静置し、溶解した面積を測定した。そ
の結果を下記表５に示した。なお下記表の値は、プラス
ミノーゲン0.025ユニツトとウロキナーゼ0.031ユニツト
とによる溶解面積を100％とした時の相対値である。
また、実施例６と同様の方法でこのモノクローナル抗体
のFab成分によるヒトα2−プラスミンインヒビター活性
の抑制の検討をおこなつた。
のFab成分によるヒトα2−プラスミンインヒビター活性
の抑制の検討をおこなつた。
α2−プラスミンインヒビター0.6μｇ（9pmol）とα2−
プラスミンインヒビターに対するモノクローナル抗体40
pmolを２％牛血清アルブミン溶液〔0.05Mトリス緩衝液
（pH7.4）,0.15M NaCl〕60μｌに溶解し、37℃,30分間
インキユベーシヨンし、４℃で一晩放置した。
プラスミンインヒビターに対するモノクローナル抗体40
pmolを２％牛血清アルブミン溶液〔0.05Mトリス緩衝液
（pH7.4）,0.15M NaCl〕60μｌに溶解し、37℃,30分間
インキユベーシヨンし、４℃で一晩放置した。
この反応混液とプラスミン溶液（0.47μＭ）20μｌを混
ぜ、0.05Mトリス緩衝液（pH7.4）0.15M NaClを加えて全
量を500μｌとした。次に3.5mM合成基質S-2251水溶液を
200μｌ加え、分光光度計（日立100-50）によつて405nm
の波長における単位時間当りの吸光度の変化を測定し
た。対照としてプラスミンのみを反応させた試料とモノ
クローナル抗体を加えずにヒトα2−プラスミンインヒ
ビターとプラスミンを反応させた試料についても同様に
吸光度の変化を調べた。その結果を下記表６に示した。
ぜ、0.05Mトリス緩衝液（pH7.4）0.15M NaClを加えて全
量を500μｌとした。次に3.5mM合成基質S-2251水溶液を
200μｌ加え、分光光度計（日立100-50）によつて405nm
の波長における単位時間当りの吸光度の変化を測定し
た。対照としてプラスミンのみを反応させた試料とモノ
クローナル抗体を加えずにヒトα2−プラスミンインヒ
ビターとプラスミンを反応させた試料についても同様に
吸光度の変化を調べた。その結果を下記表６に示した。
以上実施例８の結果から、本発明のFabを有するモノク
ローナル抗体はヒトα2−プラスミンインヒビターのリ
アクテイブサイトを特異的に認識し、ヒトα2−プラス
ミンインヒビターの線維素溶解阻止作用を抑制すること
がわかつた。
ローナル抗体はヒトα2−プラスミンインヒビターのリ
アクテイブサイトを特異的に認識し、ヒトα2−プラス
ミンインヒビターの線維素溶解阻止作用を抑制すること
がわかつた。
実施例９ ヒト血漿を用いた血栓溶解試験 正常人血漿150μｌにトロンビン溶液（200ユニツト/m
l）60μｌを加え、37℃で２分間加温して血漿を凝固さ
せ凝固塊を得た。一方、正常人血漿290μｌに、α2−プ
ラスミンインヒビターに対するモノクローナル抗体溶液
（1D10C1;3.39mg/ml）を27μｌ加え、37℃で30分間加温
した。これにプラスミン溶液（1,000ユニツト/ml）100
μｌを加え同時に凝固塊を浸し、37℃で加温した。比較
対照としてモノクローナル抗体溶液の代わりにリン酸緩
衝生理食塩水で置換えたものと、凝固塊溶解時間を比較
した。その結果、α2−プラスミンインヒビターに対す
るモノクローナル抗体を用いた場合、凝固塊は約２時間
で完全に溶解したのに比べ、モノクローナル抗体を用い
ない場合には10時間以上を要した。
l）60μｌを加え、37℃で２分間加温して血漿を凝固さ
せ凝固塊を得た。一方、正常人血漿290μｌに、α2−プ
ラスミンインヒビターに対するモノクローナル抗体溶液
（1D10C1;3.39mg/ml）を27μｌ加え、37℃で30分間加温
した。これにプラスミン溶液（1,000ユニツト/ml）100
μｌを加え同時に凝固塊を浸し、37℃で加温した。比較
対照としてモノクローナル抗体溶液の代わりにリン酸緩
衝生理食塩水で置換えたものと、凝固塊溶解時間を比較
した。その結果、α2−プラスミンインヒビターに対す
るモノクローナル抗体を用いた場合、凝固塊は約２時間
で完全に溶解したのに比べ、モノクローナル抗体を用い
ない場合には10時間以上を要した。
実施例10 ヒト血液を用いた血栓溶解試験 正常人血液150μｌにトロンビン溶液（200ユニツト/m
l）60μｌを加え、37℃で２分間加温して血液を凝固さ
せ、凝固塊を得た。一方、正常人血液300μｌに、α2−
プラスミンインヒビターに対するモノクローナル抗体溶
液（1D10C1;3.39mg/ml）を27μｌ加え、37℃で30分間加
温した。これにプラスミン溶液（1,000ユニツト/ml）10
0μｌを加え、同時に凝固塊を浸し37℃で加温した。比
較対照としてモノクローナル抗体溶液の代わりにリン酸
緩衝生理食塩水で置換えたものと、凝固塊溶解時間を比
較した。その結果、α2−プラスミンインヒビターに対
するモノクローナル抗体を用いた場合、凝固塊は約２時
間で完全に溶解したのに比べ、モノクローナル抗体を用
いない場合には10時間以上を要した。
l）60μｌを加え、37℃で２分間加温して血液を凝固さ
せ、凝固塊を得た。一方、正常人血液300μｌに、α2−
プラスミンインヒビターに対するモノクローナル抗体溶
液（1D10C1;3.39mg/ml）を27μｌ加え、37℃で30分間加
温した。これにプラスミン溶液（1,000ユニツト/ml）10
0μｌを加え、同時に凝固塊を浸し37℃で加温した。比
較対照としてモノクローナル抗体溶液の代わりにリン酸
緩衝生理食塩水で置換えたものと、凝固塊溶解時間を比
較した。その結果、α2−プラスミンインヒビターに対
するモノクローナル抗体を用いた場合、凝固塊は約２時
間で完全に溶解したのに比べ、モノクローナル抗体を用
いない場合には10時間以上を要した。
添付図面は、本発明におけるモノクローナル抗体を、パ
パインを用いて分解したときの抗体のFabの部分構造を
示す図である。図中Ｖは可変領域、Ｃは定常領域を示
す。
パインを用いて分解したときの抗体のFabの部分構造を
示す図である。図中Ｖは可変領域、Ｃは定常領域を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 青木 延雄 東京都文京区本郷４−20―２―304
Claims (2)
- 【請求項１】ヒトα2−プラスミンインヒビターに対す
るモノクローナル抗体であつて、ヒトα2−プラスミン
インヒビターにおけるプラスミンの線維素溶解阻止作用
を抑制するモノクローナル抗体を有効成分とする血栓溶
解促進剤。 - 【請求項２】ヒトα2−プラスミンインヒビターに対す
るモノクローナル抗体であつて、ヒトα2−プラスミン
インヒビターにおけるプラスミンの線維素溶解阻止作用
を抑制する少なくともFab部分を有するモノクローナル
抗体を有効成分とする血栓溶解促進剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60109256A JPH0735340B2 (ja) | 1985-05-23 | 1985-05-23 | 血栓溶解促進剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60109256A JPH0735340B2 (ja) | 1985-05-23 | 1985-05-23 | 血栓溶解促進剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61268630A JPS61268630A (ja) | 1986-11-28 |
| JPH0735340B2 true JPH0735340B2 (ja) | 1995-04-19 |
Family
ID=14505564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60109256A Expired - Fee Related JPH0735340B2 (ja) | 1985-05-23 | 1985-05-23 | 血栓溶解促進剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0735340B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5372812A (en) * | 1988-04-04 | 1994-12-13 | The General Hospital Corporation | Composition and method for acceleration of clot lysis |
| US5582862A (en) | 1988-04-04 | 1996-12-10 | General Hospital Corporation | Antibodies that bind to α2-antiplasmin crosslinked to fibrin which do not inhibit plasma α2-antiplasmin |
| WO1989009817A1 (en) * | 1988-04-04 | 1989-10-19 | The General Hospital Corporation | Composition and method for acceleration of clot lysis |
| JPH02268694A (ja) * | 1989-04-07 | 1990-11-02 | Teijin Ltd | 血栓溶解剤 |
| CA2266339A1 (en) * | 1996-09-20 | 1998-03-26 | The General Hospital Corporation | Chimeric, humanized and single chain antibodies to alpha-2-antiplasmin |
-
1985
- 1985-05-23 JP JP60109256A patent/JPH0735340B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61268630A (ja) | 1986-11-28 |
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|---|---|---|---|
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