JPS633795A - モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ、産業上の利用分野 本発明はヒトプラスミノーゲン（Ｐｌａａｍｉｎｏｇａ
ｎンに対するモノクローナル抗体、特にプラスミン（Ｐ
１ａａｍｉｚ＋　）には結合せず、プラスミノーゲン（
対して特異的に結合するモノクローナル抗体、該モノク
ローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞及び該モノ
クローナル抗体の製造方法に関するものである。

ｂ、従来技術 プラスミノーゲン（Ｐｌａｓｒｎｉｎｏｇ＊ｎ　）は、
血漿中の唯一の消化性プロテアーゼ前駆体であり、その
活性型のプラスミンは、主に＃固反応の結果生じるフィ
ブリンＪｌＫ作用して、それ？溶解する。この現象は線
維素溶解（線溶ンと呼ばれ、プラスミンは七の線溶機ｓ
Ｋ関与する主因子である。

プラスミノーゲンは、肝で合成されるが、その血中含量
は１５０〜２００　ｊ！ｌ／ｄと非常に高いことが知ら
れている。精製はＬｙｓ−セフ７０−ス力ラムによる７
フイニテイクロマトグラフイー及びＤＥＡＥイオン交換
カラムクロマトグラフィーの２段隋の操作ではぼ定量的
に単一成分として分離することができる。ヒトプラスミ
ノーゲンは、総アミノ酸約８００塩基からなる、分子量
９０，０００〜９４，０００の１本鎖の糖タンパク質で
ある。また、シトプラスミノーゲンには、ＮＨ，末端に
グルタミン酸残基な有するＧｌｕ−プラスミノーゲンと
りジン残基を有するＬｙｅ　−プラスミノーゲンが知ら
れているが、前者が１ｎｔａｃｔ　　なプラスミノーゲ
ンであり、後者はプラスミノーゲンの活性化の際にプラ
スミンによってＧｌｕ−プラスミノーゲンのＮＨ，末地
領域にあるＬｙｓ　−Ｌｙｓ結合が切断されて生成した
ものである。従って、　Ｌｙｍ−プラスミノーゲンの分
子量は１ｎｔａｃｔのものより８１０００はど小さい。

−方、プラスミノーゲンはウロキナーゼや種々のｍｌ！
（メラノーマ、血管内皮細胞など）の分泌す、る組織ア
クチベータ−により５６０番目のＡｒｇと５６１番目の
Ｖａｌの結合、すなわちＡｒｇ　−Ｍａｌが切断され、
２本鎖のプラスミンに変換する。

このプラスミンは２本鎖からなり、ＮＨ，末端側が分子
量の大きいＨｌｌであり、Ｃ０ＯＨ末端側がＬ鎖である
。Ｈ−Ｌ鏡開のＳ−８結合は２カ所存在する。酵素活性
に重要な働きをしている部位はＬ鎖に存在する。Ｈ鎖に
は糖鎖のほか、アミノ酸配列の上で相互に酷似するドメ
イン（それぞれ約８０残基）が５つ存在する。これらの
ドメインは、−般Ｋ　ｋｒｉｎｇｌｅと呼ばれ、約３４
％の相同配列が各ドメイン間に見出されている。これら
Ｋｒｉｎｇｌ・領域はフィブリンやα、−プラスミンイ
ンしビターとの相互作用部位としての機能を果しており
、中でもリジン結合部位（ＬＢＳ）は重要である。Ｃ−
７ミノカプロン酸は、このＬＢＳ　Ｋ反応し、高次構造
を変化させ、フィブリンやα、−プラスミンインしビタ
ーとの作用圧影響を及ばすことが知られている（　Ｅ。

５ｕｅｎａｏｎ　＆　Ｓ、Ｔｈｏｒｓｅｎ　：　Ｂｉｏ
ｃｈ＊ｍ、Ｊ、ｔ　１９７　。

６１９−６２８（１９８１）参照ン。

従つ又、プラスミノーゲン、プラスミンを抗原として選
択的にｖｌＲするモノクローナル抗体を提供できれば、
これを使用することによって線溶系を生化学的、生理学
的により一層広（研究することができるので、非常に興
味あることである。

例えば、ヒト血液中のプラスミノーゲン量を特異的に、
モノクローナル抗体を用いて測定できれば、生体内の凝
固線溶の状ｎＭ握、血栓症。

汎発性静脈血栓症（ＤＩＣ）等の病状の診断に有効であ
ると考えられる。また、プラスミノーゲンのタンパク分
子異常等の解析などタンパク生化学的な面からも、非常
九興味あることである。

Ｃ０本発明の構成 本発明者の研究によれば、ヒトプラスミノーゲンに対す
るモノクローナル抗体、特にヒトプラスミンには全く結
合せず、ヒトプラスミノーゲンを抗原として選択的に結
合する性質を有する高度°ｒｃ特異的なモノクローナル
抗体（ｍｏｎｏ−ｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
　）、それらを分泌するへイプリドーマ細胞（ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａ　ｃｅｌｌ　）および該モノクローナル抗体
の製造方法が提供される。

本発明のへイプリドーマ細胞は、ケーラーとミルシュタ
インの方法（Ｋ’ｊｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌａｔｅｉｎ　
ｅＮａｔｕｒｅ　２５６．４９５−４９７．（１９７５
ン〕　としてそれ自体知られた手法によって産生される
。

すなわち、ヒトプラスミノーゲンでマウスを免疫した後
、このマウスの膵臓細胞を取り出しこれとマウスミエロ
ーマ細胞とを融合させ、得られた目的とするハイブリド
ーマ細胞はマイクロタイタープレート（ｍ１ｃｒｏｔｉ
ｔｅｒ　ｐｌａｔｅａ　）　Ｋ固定されたヒトプラスミ
ノーゲンと反応する抗体罠対し、系統的（検査し選択さ
れる。

このよ５に：Ｌ、て、ヒトプラスミノーゲンに対する抗
体を合成し、分泌するハイブリドーマ細胞を選別する。

得られたへイプリドーマＪａ砲の培養上清中に分泌され
たヒトプラスミノーゲンに対する抗体は、Ｉｍｍｕｎｏ
　−Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法を用いて、プラスξン、プラス
ミンーα、−プラスミンインヒビタ−複合体そしてプラ
スミン−α、−マクーグロブリン複合体との反応性につ
いて検査を行なう。その結果、ヒトプラスミンには全く
反応性、結合性を示さず、シトプラスミノーゲンに対し
て選択的、特異的に反応し結合す唇モノクローナル抗体
を産生ずる・〜イプリドーマ細胞が単離された。

本発明のモノクローナル抗体は、かかる＾イプリドーム
細胞が産生ずる産生物から分離することによって得られ
る。

かくして得られた七ツクローナル抗体はヒトプラスミノ
ーゲンとプラスミンを区別して認識し、特異的にヒトプ
ラスミノーゲンに結合する。

次に本発明のハイブリドーマ細胞を産生ずる具体的方法
について詳細に説明する。

抗原に用いるヒトプラスミノーゲンはウオーレンとライ
−マン（Ｗａｌｌ！ｎ　＆　Ｗｉｍａｎ　）　　の方法
に従い、Ｌｙｓｉｎ＠Ｓ＠ｐｈａｒｏａｅ　　カラムク
ロマト、及びＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｄ＠ｘ　Ｊｙラムク
Ｉｌｌ　マドによりヒト血漿中より単離、）１１ｇされ
た。

塩Ｂａ１ｂ／ｃマウスを用いるが、他の系（５ｔｒａｉ
ｎｓ　）のマウスを使用することもできる。その際、免
疫計画及びしトプラスミノーゲンの濃度は十分な童の抗
原刺−激を受けたリンパ球が形成されるよう選ばれるべ
きである。

例えばマウスに少量のプラスミノーゲンで戒ろ間隔で腹
腔に数回免疫の後、さらに数回靜脈罠投与した。最終免
疫の数日後に融合の為に膵臓細胞を取り出す。

膵臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸濁液を調製
する。それらの膵臓細胞を適当なラインからのマウス骨
髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用によりａｍ融合させ
る。膵臓細胞対骨髄腫細胞の好ましい北軍は約２０：１
〜約２：ｌの範囲である。約１０６個の膵臓細胞につい
て０．５〜１．５−の融合媒体の使用が適当である。

細胞融合に用いる骨髄腫１１１Ｂ胞は多く知られている
が、本発明ではＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ細胞（以下
Ｐ３−Ｕｌと略記する）　（Ｙｅｌｔｏｎ＊Ｄ、　Ｅ、
　ａｔ　ａｌ、ｗ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉ
ｎ　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙｔ　８１＊　１　（１９７８）参照〕を用い
た。これは、８−７ザグアニン耐性のｌｌ１８１ｉ！ラ
インであり、酵素Ｌポキサンチンークアニンホスホリボ
シルトラやス７エラーゼ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎ＠−
ｇｕａｎｉｎｅ　ｐｈｏａｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａ
ｎｓｆ＊ｒａｔ＠）が欠失しており、それゆえにＨＡＴ
　（ヒポキサンチン、アミノプテリン。

チミジン）培地中では生存しない。また、この細胞ライ
ンは、それ自体抗体を分泌しない、いわゆる非分ｇｍで
ある。

好ましい融合促進剤としては例えば平均分子量が１．０
００〜４．０００のポリエチレングリコールを有利に使
用できるが、この分野で知られている他の融合促進剤を
使用することもできる。本発明の実施例では平均分子蓋
１、ｓ４ｏのポリエチレングリコールを用いた。

Ｄ、融合した細胞の選択： 別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未融
合のＪｔ［Ｉ＃ｉｌｌ牌、未融合の骨髄腫細胞および触
合した細胞の混合物を、未融合の骨髄腫細胞を支持しな
い選択培地で希釈し、未融合の１＊砲を死滅させるの罠
十分な時間（約１週間）培養する。培地は薬物抵抗性（
例えば８−７ザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄ｍＩａ
胞を支持しないもの（例えば前記ＨＡＴ培地）が使用さ
れる。この選択培地中では未融合の骨髄ａｍ胞は死滅す
る。この未融合の膵臓ａ旭は非腫瘍性細胞なのである一
定期間後（約１週間後）死滅する。これらに対して融合
した細胞は骨髄腫の親細抱のｍ優性とｆｉ祥臓細抱の性
質をあわせ持つため（選択培地中で生存できる。

かくしてハイグリドーマ細胞が検出された後、その培養
上清を採取し、ヒトプラスミノーゲンに対する抗体くつ
いて酵素免疫定量法（Ｅｎｚｙｍ＠Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍ
ｍｕｎｏ　５ｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ　）によりスク
リーニングする。

ヒトプラスミン、フラスミンーα、−フラスミンインＬ
ビクー複合体、プラスミン−α、−マクログロブリン複
合体及びプラスミノーゲンを５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動後、ニトロセルロース膜に電気的に移行
（Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　）　Ｌ、前項Ｅでスクリーニング
し、得られたノーイブリドーマ細胞の培養上清と反応さ
せた。抗原タンパク質と結合した抗体の検出は酵素標識
化した抗マウスＩｙ　　抗体を用いた。このよ５ＫＬ、
て、ヒトプラスミンとプラスミノーゲンを選択的に認識
し、プラスミノーゲンに対して特異的に結合する抗体を
産生ずるハイグリドーマ細胞を選択する。

目的の抗体を産生ずるノーイブリドーマ細亀を適当な方
法（例えば限定希釈法）でクローン化すると、抗体は２
つの異なった方法で産生される。その第１の方法によれ
ば・・イブリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養す
ることにより、その培養上清からそのハイブリドーマ細
胞の産生ずるモノクローナル抗体を得ることができる。

第２の方法によれば／１イプリドーマ細胞は同質遺伝子
又は半同質遺伝子を持つマクスの腹腔に注射することが
でき　；る。−定時間後の宿主動物の血液中及び腹水中
より、七〇へイブリドーマ細胞の産生ずるモノクローナ
ル抗体を得ることができる。

以下実施例を掲げ本発明の詳細な説明する。

実施例１ リジン−七フ７０−スとＤＥＡｇ−８＠ｐｈａｄｅｘに
よりＬト血漿２００ｄからヒトプラスミノーゲン１４ダ
を得た。

（２）　　マウスの免疫 准のＢａ１ｂ／ｃマウスをヒトプラスミノーゲン１００
　ｔｔｊｌと完全な７ａインドの７ジユバン）　（Ｃｏ
ｍｐｌｅｔ＠Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ　）
とのエマルジョン（＠ｍｕｌｓｉｏｎ　）で１４日間の
間隔をおいて２回腹腔に免疫した。さらに７日後にヒト
プラスミノーゲン５０μ９を生理食塩水とと　・もに静
脈に追加投与した。最終免疫の４日後にその牌ａｍ胞を
細胞融合のために用いた。

３）　膵臓細胞の懸濁液の調製 膵臓を無菌的に取り出し、ステンレス製メツシュを通過
させることにより単細胞懸濁液が得られた。ａｍをＬ−
グルタミン０．３９１／ｌ　、硫酸カナマイシン０．２
１／ｌ及びＮａＨＣＯｓ　２　、ＯＩ　／　ｌを補充し
たＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ製ンに移した。

増殖した細胞なＲＰＭＩ−１６４０で３回洗浄しＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地に再懸濁させた。

マウス骨髄腫ＩＩＩａ砲Ｐ３−Ｕｌは、Ｌ−グルタミン
０．３９１／ｌ−硫酸カナマイシン０．２９／）、　Ｎ
ａＨＣｏ、　２．ＯＪｉ’　／　ｌ及び１０％のウシ胎
児血清で補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％Ｆ
Ｃ８−ＲＰＭＩ−１６４０と略記する）中で培養した。

骨髄！！細抱は細胞融合の時点Ｋｍ胞分裂の対数期にあ
った。

１５）　　ｍ胞融合 膵臓細胞と骨髄腫細胞とを７：１の比率で無血清ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地中に懸濁し、５分間約２００９で遠心
分離した。上澄液培地を除去した後、沈降物を平均分子
量１．５４０の５０％ポリエチレングリコ−／し溶液（
ｐＨ８，２ン１ｄと共に２分間３７℃でインキュベーシ
ョンした。次いで無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地９−を
加え、細胞を５分間注意深（再懸濁した。

次いでこの懸濁徹を５分間約２００ｙで遠心分離し、そ
の後８Ｘ１０＠細胞／−の濃度が得られるように１０％
ＦＣ８−ＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁し、久いで９
６マイクロウエルプレート上に分配した（ウェル１個に
つき約１００μ！ン。この融合細胞は３７℃におい又５
％ＣＯ１を使用して培養した。

細胞融合の１日後にＨＡＴ培地をウェル１個につき１０
０μ！加えた。以後２日間隔で半分量の培地を新たなＨ
ＡＴ培地と交換して培養した。８日後、ハイブリドーマ
細胞砲の培養上澄液中に含まれる抗体罠ついて酵素面積
定量法によりスクリーニングをおこなった。スクリーニ
ングに用いられた抗原はヒトプラスミノーゲン、第２抗
体はアルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉ　ｐｈｏ
ｓｐｈａｔａｓ＠）標識対のヤギ抗マウス抗体であった
。

総数４６４個のウェルの全てが酵素免疫定量法により陽
性であり、ヒトプラスミノーゲンに対する抗体を産生し
℃いるという結果が得られた。

ｍａの増′清が活発（なったと観察されたとき、ｆ（Ｔ
培地を加えた。１日間隔で計４回ＨＴ培地を用いて培地
交換をおこない、その後は通常の１０％ＦＣ３−ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地を用いて培養した。

実施例２ 上記、ヒトプラスミノーゲンに対する抗体を産生じてい
るハイブリドーマ細胞中からヒトプラスミノーゲンに特
異的に結合し、ヒトプラスミンには結合しない性質を有
する抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を、その培養上
澄液を用いて酵素免疫定量法によりスクリーニングをお
こなった。

スクリーニングに用いられた抗ぶはｔヒトプラスミン、
プラスミン−α、−プラスミンインヒビター複合体及び
プラスミン−α、−マクログロブリン複合体であり、第
２抗体は、アルカリ７オスフアターゼ凛識付のヤギ抗マ
ウス抗体であった。

前記、ヒトプラスミノーゲンに対する抗体を産生じてい
るウェルのうち、１８個のウェルがヒトプラスミン、プ
ラスミン−α、−プラスミンインヒビター複合体、並び
罠プラスミンーα、−マクログロブリン複合体、いずれ
にも結合せず、ヒトプラスミノーゲンにのみ特異的に結
合することを認めた。

実施例３ 実施例２においてスクリーニングしたハイブリドーマ細
胞（３１（１）を久の方法でクローン化した。

３ＨＩＪＩＢｍを９６ウエルマイクロタイタープレート
のｌウェルあたり０．９　ｍ胞となるよ５に希釈し、Ｂ
ａ１ｂ／ｃマウス胸腺細胞ｔｔフイーダー細胞として加
えフレートに分配し１０％ＦＣ８−ＲＰＭＩ−１６４０
培地で培養した。顕微鏡下で観察し、確実にシングルセ
ルコロニーでアルことを認めた。ハイブリドーマ細胞の
培養上澄液中のヒトプラスミノーゲンに対する抗体につ
き酵素免疫定量法により、スクリーニングをおこなった
。

総数２３個のウェルが＃素免疫定量法により陽性であり
ヒトプラスミノーゲンに特異的に結合する七ツクｐ−ナ
ル抗体を産生じていた。

他のハイブリドーマ細胞も同様の操作を行ない、モノク
ローン化を行なった。

にツクローナル抗体の精製； 大量のヒトプラスミノーゲンに対するモノクローナル抗
体を産生させるために、約１０’個のへイプリドーマ細
胞をプリスタンで前処理したＢａ１ｂ／ｃマウスに腹腔
内注射した。約１週間抜採取された腹水液よりＥＹらの
方法（Ｐ、　１．、　ＥｙｅＳ、Ｊ、　Ｐｒｏｖｓｅ　
ａｎｄ　Ｃ，Ｒ，Ｊｅｎｋｉｎｗ　Ｉｒｍｎｕｎｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙｔ１５．４２９−４３６（１９７８）＃
照〕に従いプロティンＡ−セフ７ｏ−ス４　Ｂ　（ｐｒ
ｏｔ＠ｉｎ　Ａ　−８ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ　）カ
ラムを用いて抗体を精製した。腹水液２．５ｄよりヒト
プラスミノーゲンに対するモノクローナル抗体２０ダを
得た。

ｆａｌｌしたモノクローナル抗体の特定のクラスを、ク
ラス特異性抗マウス抗血清を使用してオフタロニーゲル
拡散試験で決定した。その結果を下紀表ＩＫ示した。

表１　　モノクローナル抗体のクラス 以下の実施例においては上記、ａｌｌモノクローナル抗
体３ＨＩＥ６及び４Ａ３Ｅ８の２１１１類について、さ
らに詳′ａＫ諸性質を検討した。

実施例４ ヒトプラスミノーゲンとモノクローナル抗体３ＨＩＥ６
、あるいは４Ａ３Ｅ８を表２に示すようなモル比で混合
し、３７℃で３０分間反応し、４℃で終夜放置した。

この溶液（ウロキナーゼ２００単位を加え、３７℃で２
５分間反応後、攪拌し、１０μｊをフィブリンプレート
のウェルに添加した。３７℃で４時間反応後、溶解面積
を測定した。モノクローナル抗体と反応させていないプ
ラスミノーゲンをウロキナーゼにより活性化した反応混
液を添加したウェルなＣｏｎｔｒｏｌとし、その溶解面
積を１００とした。

表２　　フィブリン溶解面積 フィブリン溶解面積の測定の結果、抗プラスミノーゲン
モノクローナル抗体４Ａ３Ｅ８及び３ＨＩＥ６は、ウロ
キナーゼによるプラスミ／−ゲンの活性化には影響を及
ぼさないこと、すなわち、抗体に結合したプラスミノー
ゲンは、阻害されることな（、ウロキナーゼ等のプラス
ミノーゲン活性化因子の作用でプラスミンに変換し工い
ることがわかる。

実施例５ ！ ２０　ｍＭ　ｔ−７ミノカプロン酸（ｇＡｃＡ）共存下
での結合性を酵素免疫測定法により調べた。

抗原として、プラスミノーゲン、プラスミンを９６ウエ
ルマイクロタイタープレートに５μｌ／−の濃度、１０
０μｌ／ウエルで添加し、４℃、−晩装置して吸着させ
た。２０ｍＭ　　ｇＡｃＡと１％　ＢＳＡを含む、リン
酸緩衝液（以下、ＰＢＳと記す）をｉｓｏμｌ／’）エ
ルで添加し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ後、０．０５％Ｔｖｅｅ
ｎ　２０を含むＰＢＳで３回、ウェルを洗浄した。続い
”Ｃ２０ｍＭεＡＣＡを含むＰＢＳを用いて、０．５μ
ｊｌｌＬｌｆ１度に希釈した各種抗体溶液を１００　Ａ
ｔ／ウェルで添加し、３７℃で２時間反応させた。洗浄
後、２０　ｍＭ　ｇＡｃＡを含むＰＢＳ　　を用いて３
０００倍希釈したアルカリフォスファターゼＩ＠識化ヤ
ギ抗マウス抗体溶液、あるいはヤギ抗ウサギ抗体溶液を
１００μｊ／ワエルで添加し、３７℃、２時間反応させ
た。洗浄後、１ｍ９ＺＫｔ濃五の７７レカリ７オスフア
ターゼ基質溶液を１００μｌ／ウエルで添加し、３０分
後に波長４０５　ｎｍにおける吸光度を測定した。

尚、対照とし″″ＣｇＡＣＡ非共存化での反応も、上記
と同じ方法で行ない、その結果を表３にまとめて示す。

表３　■−アミノカプロン酸（ｇＡｃＡ）による、プラ
スミノーゲン、プラス ミンに対する抗体の結合性への影響 この結果から、３１（１ｇ６．４Ａ３Ｅ８　２種のモノ
クローナル抗体は、ｅ−７ミノカブロン酸と反応し、構
造変化を受けたプラスミノーゲン（あるいはプラスミン
ンに対しても結合することがわかる。

実施例６ の反応性 各種抗原（タンパク量０．５μｙ）を１０％グル濃度の
５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行すい、続いて
ニトロセルロース膜に電気的に５０Ｖ、１時間でタンパ
クを固定化した。このニトロセルロース膜を３％ｗｏｗ
　Ｇｅ１ａｔｉｎ　　を含むトリス緩（ＩｉｉｆＬ（以
下ＴＢＳと記すンでＢｌｏｃｋｉｎｇ　Ｌ、３ＨＩＥ６
及び４Ａ３Ｅ８モノクロ一ナル抗体溶液（１μｉ／−濃
度、１％Ｇｅ１ａｔｉｎ　−ＴＢＳ希釈溶液）と室温で
一晩反応させた。

０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＴＢＳで３回洗浄後
、１％Ｇｅ１ａｔｉｎ　−Ｔ　Ｂ　Ｓ　　で３０００倍
に希釈したパーオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウス抗体溶
液を加え、室温で２時間反応させた。Ｏ，ＯＳ％Ｔｗｅ
＠ｎ　２０−　Ｔ　Ｂ　Ｓでニトロセルロース膜を洗浄
後、パーオキシダーゼ基質溶ｇに移し、５分間放置し取
り出し水洗した。モ／り冒−ナル抗体が反応した抗原は
、磯肯色のバンドとして認めることができた。

その結果、３Ｈ１１６，４Ａ３Ｅ８モノクロ一ナル抗体
は、Ｇｌｕ−ブラスミ／−ゲン、　Ｌｙａ−プラスミノ
ーゲン両方に結合し、いずれを還元したプラスミノーゲ
ンにも結合しなかった。また、組織型プラスミノーゲン
活性化因子（ｔ−ＰＡ）のＫｒｉｎｇｌｅ領域（構造）
とプラスミ／−ゲンのＫｒｉｎｇｌ＠領域の相同性は高
いが、どちらのモノクローナル抗体もｔ−ＰＡに４１反
応しなかった２、表４　Ｋ３）１１Ｅ６．４Ａ３Ｅ８モ
ノクロ一ナル抗体の抗原反応性並びに諸性質をまとめて
示す。

表４　抗Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎモノクローナル抗体の
性質 手続補正書 昭和６１年２月９゜日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトプラスミノーゲンに対するモノクローナル抗体
   。 ２、ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンおよびＬｙｓ−プラ
   スミノーゲンに対して特異的な結合性を示し、ヒトプラ
   スミンに対しては結合性を示さない第１項記載のモノク
   ローナル抗体。 ３、■−アミノカプロン酸によつて、プラスミノーゲン
   に対する結合を阻害されない第１項記載のモノクローナ
   ル抗体。 ４、プラスミノーゲンアクチベーターによるプラスミノ
   ーゲンの活性化に対して影響を及ぼさない第１項記載の
   モノクローナル抗体。 ５、ヒトプラスミノーゲンに対するモノクローナル抗体
   を産生するハイブリドーマ細胞。 ６、ヒトプラスミノーゲンで免疫された哺乳動物から得
   られた細胞とミエローマ細胞とを融合させて、ヒトプラ
   スミノーゲンに対するモノクローナル抗体を産生するハ
   イブリドーマ細胞を選択し、そのハイブリドーマ細胞の
   産生するモノクローナル抗体を他の産生物と分離、精製
   し取得することを特徴とするヒトプラスミノーゲンに対
   するモノクローナル抗体の製造方法。 ７、前記哺乳動物から得られた細胞がマウス細胞である
   第６項のモノクローナル抗体の製造方法。