JPH0235099A - プラスミノーゲンアクティベーターインヒビターに対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ、産業上の利用分野 ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーターの活性を抑
制する因子としてＰｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖ
ａ−ｔｏｒ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　　−１（ＰＡＩ　−
１）、　Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　１ｎ−ｈｉｂｉｔｏｒ（
ＰＡＩ　　−２）及びＩＪｒｏｋｉｎａｓｅ　１ｉｋｅ
（ＰＡＩ　−３）が知られている。本発明はＰＡＩ　　
・１すなわちヒトブラスミノーゲンアクティベーターイ
ンヒビタ１　（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａ
ｔｏｒ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　・ｌ；以後ＰＡＩと略す
）を特異的に認識するモノクローナル抗体、それを産生
するハイブリドーマ、その抗体の製造方法及びＦＡＩの
分離方法に関する。

ｂ、従来技術 Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆらにより、ウシ大動脈血管壁内皮細
胞の培養上清より、分子量５０．０００のウシＦＡＩが
生成された［Ｍｏｕｒｉｋ、Ｊ、Ａ、　ｅｔ　ａｔ　Ｊ
、Ｂｏｉｌ、　Ｃｈｅｍ、。

ｙム１４９１４−１４９２１　＜１９８４１］。

このウシＦＡＩは、種々の蛋白変性剤、　ｐｌ、加熱な
どに対して極めて安定であり、ａｃｔｉｖｅなＦＡＩと
ｑｕｉｅｓｃｅｎｔなＰＡＩの存在が示唆されている。

このＰＡＩは、セリンプロテアーゼインヒビターの一種
であり、組織型プラスミノーゲンアクティベーター（Ｔ
ｉｓｓｕｅ　ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔ
ｏｒ；以降ｔＰＡと略記する〉と速やかに複合体を形成
し、ｔＰＡ活性を抑制することが知られている。

［Ｌｅｖｉｎ、Ｅ、Ｇ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ
、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、、　　ｔｌｓＡ８０、６
８０４−６８０８　（１９８６）、　Ｐｈ１ｌｉｐｓ　
Ｍ、　ｅｔ　ａｔ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、、　
８０２．９９−１１０　（１９８４）参照］また、同様
のＦＡＩ−ｔＰＡ複合体は血漿中にも存在することが知
られている［Ｂｏｏｔｈ、　Ｎ、　Ａ。

ｅｔ　ａｌ　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、、　３８．２６
１−２６７　（１９８５）参照］さらに、血中ＦＡＩ活
性値と血栓症との相関が示唆されており［Ｎｉ１ｓｓｏ
ｎ、　　ｅｔ　ａｔ　Ｂｒ１ｔ、　　Ｍｅｄ、　　Ｊ、
。

２９０、　１４５３−１４５６　（１９８５）、　　Ｐ
ａｒａｍｏ、　　Ｊ、Ａ、　　ｅｔ、ａｌＴｈｒｏｍｂ
、　Ｈａｅｍｏｓｔ、、　５４．７１３−７１６　（１
９８５）参照］ＰＡＩは血液凝固線溶系の開始機構の重
要な制御因子であることが明らかにされている。

したがってＰＡＩの作用機構を明らかにすること、また
、ＦＡＩの血中における抗原量、活性量を測定し、その
動向を把握することができれば、それは基礎医学、臨床
医学の領域において非常に重要な意味を持つと考えられ
る。

一方モツクローナル抗体は単一の抗原決定基に対して特
異的であり、かつ同一の特異性を有する抗体を安定的に
産生できるという利点から抗原蛋白質の機能及び構造の
解析、或いは免疫測定（ＥＩＡ、ＲＩＡ）に近時−船釣
に広く利用されるようになってきた。特に抗原蛋白質の
機能解析１分子解析には抗原蛋白の機能に関与する部位
、又は特殊な構造部位を認識する抗体を見出すことが有
力な手段となり得る。

従来、ＦＡＩのモノクローナル抗体は、ヒト血漿由来Ｐ
ＡＩを抗原としたもの［ｔｌｒｄｅｎ、Ｇ、　ｅｔ　ａ
ｌ。

Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔ、、　５５．３８３−
３８７　（１９８６）］　、ヒト胎盤由来ＦＡＩを抗原
としたもの［Ｐｈ１ｌｉｐｓ、Ｍ。

ｅｔ　ａｌ、　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔ、、　
５５．２１３−２１７　（１９８６１参照コ、ヒトＦｉ
ｂｒｏｓａｒｃｏｍａ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ由来ＦＡＩ
を抗原としたもの［Ｎ１ｅｌｓｅｎ、Ｌ、Ｓ、　　ｅｔ
　ａｌ、Ｔｈｒｏｍｂ）ｌａｅｍｏｓｔ、、　５５．２
０６−２１２　（１９８６）参照］が報告されている。

そこで本発明者は、ヒト血管壁内皮細胞由来ＰＡＩを抗
原としたモノクローナル抗体を作製し、あわせてウシ血
清含有ヒト血管壁内皮細胞培養上清よりのＦＡＩ精製法
を確立した。

Ｃ０発明の構成 本発明者はヒト血管壁内皮細胞由来のＰＡＩを特異的に
認識するモノクローナル抗体、ヒト血管壁内皮細胞由来
のＰＡＩを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ、このモノクローナル抗体を用いて
ヒト血管壁内皮細胞由来ＰＡＩを免疫吸着し精製する方
法、ＰＡＩ及びＰＡＩ−ｔＰＡ複合体を測定する方法を
見出し、本発明に到達しな。すなわち、本発明者は、血
管壁内皮細胞由来のＦＡＩを精製し、クーラーとミルシ
ュタインの方法［Ｋ１１ｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎＮａｔｕｒｅ；　２５６．４９５−４９７　（１９７
５）参照］として知られた方法によって血管壁内皮細胞
由来ＦＡＩを特異的に認識するモノクローナル抗体を得
な。ヒト血管壁内皮細胞由来ＦＡＩでマウスを免疫した
後このマウスのｇｍ細胞をマウス・ミエローマ細胞と融
合させ、得られたハイブリドーマ細胞はマイクロタイタ
ープレートに固定されなＰＡＩと反応する抗体に対し、
系統的に検査し、選択される。

ＦＡＩに陽性を示すハイブリドーマを選別することによ
り、目的とする抗体を合成し分泌するハイブリドーマを
単離することができる。

本発明のモノクローナル抗体は抗体はががる新規なハイ
ブリドーマ細胞が産生する産生物がら得られ、ＦＡＩ分
子上の特定の抗原決定基に対して単一特異的に作用する
。

本発明のモノクローナル抗体はその特性からＰＡＩの精
製に利用する場合非常に有利である。すなわち、不溶性
担体に本発明におけるモノクローナル抗体を固定化し、
ウシ胎児血清を含むヒト血管内皮細胞培養上清、または
他のＦＡＩを含む試料、あるいはそれらの粗抽出物、″
ｍ精製物及び遺伝子発現によるｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
　−ＰＡ　Ｉを含む溶液からＦＡＩを吸着１分離し、吸
着体を洗浄後ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ　ＰＡ　Ｉをａｃｔｉ
ｖｅＰＡ　Ｉに活性化することがない様な条件下（例え
ば０．２Ｍグリシン／塩酸溶液）でＰＡＩを溶出するこ
とができる。また本発明のモノクローナル抗体を用いれ
ばＦＡＩ−ｔＰＡ複合体の精製にとっても有利である。

すなわち不溶性担体に本発明におけるモノクローナル抗
体を固定化し、ＦＡＩ−ｔＰＡ複合体を含む溶液からＰ
ＡＩ−ｔＰＡ複合体を吸着分離し、吸着体を洗浄後適当
な条件下（例えば０．２Ｍグリシン／塩酸溶液）でＰＡ
Ｉ−ｔＰＡ複合体を溶出することができる。またこのＦ
ＡＩを認識するモノクローナル抗体を用いて免疫学的手
段、例えばＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏ　ａｓ
ｓａｙ）やＲＩ　Ａ　（Ｒａｄｉｏ　ｉｍｍｕｎ。

ａｓｓａｙｌにより血漿中あるいはその他試料中のＰＡ
■抗原量を測定することができる。また、ｔＰＡを認識
する抗体と組合せることにより、血漿中あるいはその他
試料中のＦＡＩ−ｔＰＡ複合体の抗原量を測定すること
ができる。

本発明者は、さらに研究を勧めた結果、得られなＰＡＩ
を認識するモノクローナル抗体の中に次のような特徴を
有するものがあることを確認した。

すなわち、ＰＡＩ及びＰＡＩ−ｔＰＡ複合体には結合す
るが、ＦＡＩに対する他のモノクローナル抗体が結合し
ているＦＡＩ−ｔＰＡ複合体には結合しないという特殊
な性舅を有する抗ＰＡＩモノクローナル抗体を見出した
。この特殊なモノクローナル抗体を利用すると、ＰＡＩ
、ｔＰＡ、ＰＡＩ−ｔＰＡ複合体の混在する溶液の中か
ら、ＦＡＩのみを測定する系を作製することができる。

また、ＦＡＩを人工的に処理して、ｔＰＡと複合体形成
能を有するようにしたＦＡＩ、あるいは活性形ＦＡＩの
どちらの場合でも抗ＰＡＩモノクローナル抗体が結合し
た場合、複合体形成を抑制する性質を有する抗ＰＡＩモ
ノクローナル抗体を見出した。

本発明においては前記モノクローナル抗体あるいはその
Ｆａｂ部分を少くとも有する抗体の断片を有効成分とし
て含有するものであれば、それを血栓に接触させること
によりそれがＰＡＩにおけるｔＰＡとのＰＡＩ−ｔＰＡ
複合体形成を抑制し、結果的に血栓を溶解させるので、
血栓溶解促進剤として利用できる。例えば本発明の血栓
溶解促進剤は、静注用製剤として使用することができ、
その場合、上記モノクローナル抗体あるいはそのＦａｂ
部分を少くとも有する抗体断片は広い範囲の含有割合で
よく、またこれらは通常静注用として使用されている水
性媒体中に溶解乃至分散して使用することができる。

すなわち本発明は下記の発明を包含する。

（１）ヒト組織プラスミノーゲンアクティベータの結合
によっては結合を阻害されないヒトプラスミノーゲンア
クティベーターインヒビター・１の抗原決定部位を認識
するヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビタ
ー・１に対するモノクローナル抗体。

（２）ヒト組織プラスミノーゲンアクティベータ単独の
結合によっては結合を阻害されないが、ヒト組織プラス
ミノーゲンアクティベーターと１種のヒトプラスミノー
ゲンアクティベーターインヒビター・１に対するモノク
ローナル抗体が両方結合した場合には結合を阻害される
ヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・
１の抗原決定部位を認識するヒトプラスミノーゲンアク
ティベーターインヒビター・１に対するモノクローナル
抗体。

（３）ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター単独
の結合によっても、ヒト組織プラスミノーゲンアクティ
ベーターと１種のヒトプラスミノーゲンアクティベータ
ーインヒビター・１に対するモノクローナル抗体が両方
結合しｆＳ場合にも結合を阻害されないヒトプラスミノ
ーゲンアクティベーターインヒビター・１の抗原決定部
位を認識するヒトプラスミノーゲンアクティベーターイ
ンヒビター・１に対するモノクローナル抗体。

（４）ヒト組織プラスミノーゲンの結合によっては結合
を阻害されない抗原決定部位であるが、その部位にその
モノクローナル抗体が結合するとヒト組織プラスミノー
ゲンアクティベーターの結合が阻害されるような抗原決
定部位を認識するヒトプラスミノーゲンアクティベータ
ーインヒビター・１に対するモノクローナル抗体。

（５）上記第１項、第２項、第３項又は第４項のモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ。

（６）上記第５項のハイブリドーマを遷択し、そのハイ
ブリドーマの産生するモノクローナル抗体を他の産生物
と分離し、精製し取得することを特徴とするモノクロー
ナル抗体の製造方法。

（７）上記第２項のモノクローナル抗体を不溶性担体に
固相化し、これにヒトプラスミノーゲンアクティベータ
ーインヒビター・１及び／又はヒトプラスミノーゲンア
クティベーターインヒビター・１−ヒト組織プラスミノ
ーゲンアクティベーター複合体を含有し、ヒトプラスミ
ノーゲンアクティベーター・１−ヒト組織プラスミノゲ
ンアクティベーターー抗プラスミノーゲンアクティベー
ターインヒビター・１モノクローナル抗体複合体の含有
が予想される混合物を接触させてヒトプラスミノーゲン
アクティベーターインヒビター・１及び／又はヒトプラ
スミノーゲンアクティベーターインヒビター・１−ヒト
組織プラスミノーゲンアクティベーター複合体を特異的
に結合させることを特徴とするヒトプラスミノーゲンア
クティベーターインヒビタ・１及び／又はヒトプラスミ
ノーゲンアクティベーターインヒビター・１−ヒト組織
プラスミノーゲンアクティベーターの複合体分離除去方
法又は分離精製方法。

（８）上記第２項のモノクローナル抗体を不溶性担体に
固相化した免疫吸着体。

（９）該不溶性担体が、プラスチック容器、プラスチッ
クビーズ、ラテックスビーズ、ガラスピーズ又は金属粒
子である上記第８項記載の免疫吸着体。

（１０）サンドイッチ法による免疫学的測定キットにお
いて、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とのいずれ
か一方或いは両方が上記第２項記載のモノクローナル抗
体であることを特徴とするヒトプラスミノーゲンアクテ
ィベーターインヒビター・１の免疫学的測定のためのキ
ット。

（１１）サンドイッチ法による免疫学的測定キットにお
いて、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とのいずれ
か一方が、上記第２項記載のモノクローナル抗体であり
、他方がヒト組織プラスミノーゲンアクティベーターに
対する抗体であることを特徴とするヒトプラスミノーゲ
ンアクティベーターインヒビター・１−ヒト組織プラス
ミノーゲンアクティベーター複合体の免疫学的測定のた
めのキット。

（１２）該不溶性担体が、プラスチック容器、プラスチ
ックビーズ、ラテックスビーズ、ガラスピーズ又は金属
粒子である第１０項又は第１１項記載のキット。

（１３）該標識抗体が、酵素、放射性同位元素又は蛍光
物質で標識化された抗体である第１０項又は第１１項記
載のキット。

（１４）不溶性担体に結合した抗体と標識抗体を含み、
これらの抗体のいずれか一方又は両方が第２項記載のモ
ノクローナル抗体であり、これに（ａ）溶解剤、（ｂ）
洗浄剤及び酵素で８識化した抗体を用いる場合には、（
ｃ）酵素活性を測定するための基質及びその反応停止剤
を組合せてなる免疫学的測定のためのキット。

（１５）不溶性担体に結合した抗体と標識抗体を含み、
これらの抗体のいずれか一方は第２項記載のモノクロー
ナル抗体であり、他方はヒト組織プラスミノーゲンアク
ティベーターに対する抗体であり、これに（ａ）溶解剤
、（ｂ）洗浄剤及び酵素で標識化した抗体を用いる場合
には、ｔｃ＞酵素活性を測定するための基質及びその反
応停止剤を組合せてなる免疫学的測定のためのキット。

（１６）ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーターの
結合によっては結合を阻害されない抗原決定部位である
が、その部位にそのモノクローナル抗体が結合するとヒ
ト組織プラスミノーゲンアクティベーターの結合が阻害
されるような抗原決定部位を認識するヒトプラスミノー
ゲンアクティベーターインヒビター・１に対するモノク
ローナル抗体を有効成分とする血栓溶解促進剤。

（１７）ヒト組織プラスミノーゲンアクティベータの結
合によっては結合を阻害されない抗原決定部位であるが
、その部位にそのモノクローナル抗体が結合するとヒト
組織プラスミノーゲンアクティベーターの結合が阻害さ
れるような抗原決定部位を認識するヒトプラスミノーゲ
ンアクティベーターインヒビタ〜・１に対するモノクロ
ーナル抗体のＦａｂ部分を少くとも有するモノクローナ
ル抗体又はその断片を有効成分とする血栓溶解促進剤。

次に本発明におけるモノクローナル抗体を作製する方法
について詳細に説明する。

Δ、抗原の単離・精製 抗原に用いるＰＡＩはｖａｎ　Ｍｏｕｒｉｋ　Ｊ、Ａ、
　　らの方法［ｖａｎ　Ｍｏｕｒｉｋ　Ｊ、Ａ、　ｅｔ
　ａｔ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２５９、　１４９１４−１４９２１　（１９８４１参照
］を応用しヒト血管壁内皮細胞の培養上清から単離・精
製した。

ｒ３．ＰＡＩによるマウスの免疫 １Ｂａｌｂ／Ｃマウスを用いることができるが他の系（
Ｓｔｒａｉｎ）のマウスを使用してもよい。その際、免
疫計画、及びＦＡＩの濃度は十分な量の抗原刺激を受け
た、リンパ球が形成されるよう選ばれるべきである。例
えばマウスに５０μｇのＦＡＩを２週間間隔で腹腔に３
回免疫の後、さらに３０μｇを静脈に投与する。最終免
疫の数日後に融合の為に肺臓細胞をとり出す。

Ｃ０ＭＡ胞融合 上記の如く免疫したマウスの牌膿を無菌的に取り出し、
そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの肺臓細胞を
適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により、細胞融合させる。押臓細胞・対、骨髄
腫細胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲で
ある。約１０８個の牌ｌＶｉ細胞について０．５〜１．
５ｍｌの融合媒体の使用が適当である。

細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は、よく知られてい
るが、本発明では、Ｐ　３−　Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ１細胞
（Ｐ３−Ｕｌ　）　　［Ｙｅｌｔｏｎ、Ｄ、Ｔ、　ｅｔ
　ａｌ。

Ｃｕｒｒｅｎｔ、　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇＬ　８１．１
　（１９７８）参照］を用いた。

好ましい融合促進剤としては、例えば、平均分子Ｊｔ１
０００〜４０００のポリエチレングリコールを有利に使
用できるが、この分野で知られている他の融合促進剤を
使用することもできる。本発明においては、平均分子１
４０００のポリエチレングリコールを用いた。

Ｄ、融合した細胞の選択 別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未融
合の肺臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞および融合し
たハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのに十分な時間（約１週間）培養する。培地は
、薬物抵抗性（例えば８−アザグアニン抵抗性）で未融
合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、（例えばＨＡ
Ｔ培地）が使用される。この選択培地中では、未融合の
骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の肺臓細胞は非腫瘍
性細胞なので、ある一定期間後（約１週間後）死滅する
。これらに対して融合した細胞は骨髄腫の親細胞の腫瘍
性と親牌１細胞の性質をあわせ持つなめに選択培地中で
生存できる。

Ｅ、各容器中のＰ、ｌに対する抗体の確認かくしてハイ
ブリドーマ細胞が検出された後、その培養上清を採取し
、ＰＡＩに対する抗体について酵素免疫定量法（Ｅｎｚ
ｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎ。

５ｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ）によりスクリーニングす
る。

目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限界希釈法〉でクローン化すると、抗体は２つ
の異なった方法で産生される。その第１の方法によれば
ハイブリドーマ細胞を一定時間、適当な培地で培養する
ことにより、その培養上清からそのハイブリドーマ細胞
の産生ずるモノクローナル抗体を得ることができる。第
２の方法によればハイブリドーマ細胞は同質遺伝子、又
は半同賀遺伝子を持つマウスの腹腔に注射することがで
きる。一定時間後の宿主動物の血液中および腹水中より
、そのハイブリドーマ細胞の産生ずるモノクローナル抗
体を得ることができる。

Ｇ、ＦＡＩ含有液からのＦＡＩの分離 まず前記ＦＡＩに対するモノクローナル抗体を不溶性担
体に固定化又は結合させて吸着体を得る。

その際使用される不溶性担体としては、モノクロナル抗
体を用いた測定試薬又は測定用キットの基材として一般
的使用されるものであればよい。

例えば材質としてセファロース、ポリアクリルアミド、
セルロース、デキストラン、又はマレイン酸ポリマーあ
るいはこれらの混合物が好ましく用いられる。これら不
活性担体の形態としては、粉末状５粒状、ペレット状、
ビーズ状、フィルム状。

繊維状など種々の形態であることができる。また一般に
血漿、又はその分画成分の測定や分離に用いられる多数
の凹状のくぼみを有するプレート（ウェル）を用いるこ
とが有利である。

前記吸着体を用い、これにＦＡＩ含有混合物を接触せし
めると、該吸着体に固定化したモノクロナル抗体とＦＡ
Ｉとが結合して、結果的にＦＡＩが該吸着体に結合する
。かくすることによりＰＡＩを分離、除去することが可
能である。

また前記の如くしてＦＡＩを吸着体に結合させ、できれ
ば残余の混合物を洗浄して除去する。次いで吸着体に結
合したＦＡＩを酸性条件（０，２Ｍグリシン塩酸）で離
脱し、これを取得することによってＰＡＩ単離すること
ができる。

かくして前記本発明の分離法によれば、ＰＡＩを含有す
る混合物からのＦＡＩの除去、該混合物からのＦＡＩの
分離および精製、該混合物中のＰＡＩの含有量の測定な
どが極めて簡単な操作で達成される。

Ｈ，ＦＡＩ−ｔＰＡ複合体含有液からのヒトＦＡＩの分
離 まず前記ＦＡＩに対するモノクローナル抗体を不溶性担
体に固定化又は結合させて吸着体を得る。

その際使用される不溶性担体としては、モノクロナル抗
体を用いた測定試薬又は測定用キットの基材として一般
的使用されるものであればよい。

例えば材質としてセファロース、ポリアクリルアミド、
セルロース、デキストラン、又はマレイン酸ポリマーあ
るいはこれらの混合物が好ましく用いられる。これら不
活性担体の形態としては、粉末状５粒状、ペレット状、
ビーズ状、フィルム状。

繊維状など種々の形態であることができる。また一般に
血漿、又はその分画成分の測定や分離に用いられる多数
の凹状のくぼみのプレート（ウェル）を用いることが有
利である。

前記吸着体を用い、これにＦＡＩ−ｔＰＡ複合体含有混
合物を、接触せしめると、該吸着体に固定化したモノク
ローナル抗体とＦＡＩ−ｔＰＡ複合体とが結合して、結
果的にＦＡＩ−ｔＰＡ複合体が該吸着体に結合する。か
くすることによりＰＡＩ−ｔＰＡ複合体を分離・除去す
ることが可能である。また前記の如くしてＰＡＩ−ｔＰ
Ａ複合体を吸着体に結合させ、できれば残余の混合物を
洗浄して除去する。次いで吸着体に結合したＦＡＩ−ｔ
ＰＡ複合体を酸性条件（０，２Ｍグリシン塩酸）で離脱
し、これを取得することによってＰＡＩｔＰＡ複合体を
単離することができる。

かくして前記本発明の分離法によれば、ＰＡＩｔＰＡ複
合体を含有する混合物からのＰＡＩＬＰＡ複合体の除去
、該混合物からのＰＡＩ−ｔＰＡ複合体の分離および精
製、該混合物中のＰＡｌ−ｔＰＡ複合体量の含有量の測
定などが極めて簡単な操作で達成される。

ｄ１発明の効果 ＦＡＩは血液凝固線溶系の開始機構の重要な制御因子で
あり、ＦＡＩの作用機構を明らかにすること、またＦＡ
Ｉの血中における抗原量、活性量を測定し、その動向を
把握することは基礎医学。

臨床医学の領域において非常に重要な意味を持つ。

本発明のＦＡＩを認識するモノクローナル抗体によれば
血漿中あるいはその他の試料中のＦＡＩ抗原量を測定す
ることができ、またｔＰＡを認識する抗体と組合せるこ
とにより、血漿中あるいはその他試料中のＰＡＩ−ｔＰ
Ａ複合体の抗原量を測定することができる。また本発明
のモノクローナル抗体を用いればＦＡＩあるいはＦＡＩ
−ｔＰＡ複合体の精製も容易に行なうことができる。

ｅ、実施例 以下実施例を掲げ本発明の詳細な説明する。

実施例１（モノクローナル抗体の取得）精製したＦＡＩ
を雌のＢａ１ｂ／Ｃマウス（４周齢）２匹に対して１４
日間隔で４回免疫した。初回の免疫はＰＢＳに溶解した
。５０μｇのＦＡＩを等量のフロイントの完全アジュバ
ント（ｃｏｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖ
ａｎｔ）と混合し、そのエマルジョンを、腹腔内に投与
しな（０，５ｍｇ　／ｈｅａｄ）　、２回目。

３回目は、同じ＜５０μｇのＦＡＩをフロイントの不完
全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ｉｍｃｏｍｐｌｅ
ｔｅａｄｊｕｖａｎｔ）と混合し、同じく腹腔内に投与
した。

最終免疫は１０μｇのＰＡＩをＰＢＳ溶液のまま、マウ
ス尾静脈から追加投与した。最終免疫の３日後に免疫し
たマウスの肺臓細胞を細胞融合に用いた。

免疫したマウスの牌！ｉｉ！ｉ細胞と、同系マウスの骨
髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１）を約２二１〜約１５：１の割り合
いで混合し、５０％ポリエステルグリコール４０００　
（Ｍｅｒｃｋ）を融合促進剤としてＫｏｈｌｅｒとＭｉ
ｌｓｔｅｉｎの方法に従い細胞融合を行なった。融合後
の細胞は、１　ｘｌＯｅ　ｃｅｌｌ／ｍｌの細胞濃度と
なるように１０％ＦＣ３・−ＲＰＭ　Ｉ　−１６４０培
地に懸濁し、９６ｗｅｌｌｓマイクロプレート（ｃｏｓ
ｔｅｒ）に１ウェル当り１００μβずつ分注した。

融合細胞は、ＣＯ２インキユベータ−（５％Ｃ０２゜３
７°Ｃ〉中で培養し、ヒボキサンチン、アミノプテリン
；チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地〉で培地交換を行な
い、ＨＡＴ培地中で増殖させて、肺臓細胞と、骨髄腫細
胞からなるハイブリドーマのスクリーニングを行なった
。

ハイブリドーマの培養上清中の抗体は抗原ＰＡ■をコー
ティングしたマイクロタイタープレートを用いＥＬＩＳ
Ａ法により検出した。第２抗体には、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（以降ＨＲＰと略す）標識ウサギ抗マウスＩ
ｇＧ抗体を用いた。

融合細胞をまいた合計５７０のウェルのうち５１１のウ
ェルにコロニーの形成が認められる。このうち抗体産生
陽性ウェルは下記衣１に示すように８ウエルであった。

これらの抗体産生陽性ウェルについて限界希釈法による
クローニングを２回繰り返して行ない４個のクローンを
得た。このクローンから産生されるモノクローナル抗体
をそれぞれＪＴＩ−１，ＪＴＩ−２，ＪＴＩ−３，ＪＴ
Ｉ４とする。得られたクローンは９０％ＦＣ３−１０％
ＤＭＳＯ中に懸濁させ液体窒素生保存した。各クローン
の産生するモノクローナル抗体は、クローンをＢａ１ｂ
／Ｃマウス腹腔内で増殖させ、その腹水からプロティン
Ａ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂカラムを用いて精製
した。

表　１　　（ａｌ胞融合） 月中臓糸田胞　［ｃｅｌｌ／ｍ！］　　　　　　　　　
９．ＯＸＩＯ’骨髄腫細胞［ｃｅｌｌ／ｍ！］　　１．
３Ｘ１０’牌！ｉｉ細胞 比　　　　　　６．９ 骨髄ＨＭＡ胞 細胞数［ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ］　　　１．５８Ｘ１０５
ｗｅｌｌ数　　　　　　　　５７０ コロニーを形成した 陽性５ｅｌｌ数　　　　５１１　（８９，６％）抗体酸
性陽性ｗｅｌｌ数　　　　８（１，５７％）実施例２ くドデシル硫酸ナトリウム活性化ＦＡＩとモノクローナ
ル抗体とのエンザイムイムノアッセイ法での結合能） ドデシル硫酸ナトリウム（以後ＳＤＳと略す）で活性化
したＦＡＩへのモノクローナル抗体結合能を、抗原固定
化エンザイムイムノアッセイ法を用いて検定した。ｑｕ
ｉｅｓｃｅｎｔ　ＰＡ　Ｉ溶液に、終濃度０．１％とな
るようにＳＤＳを加え、３７℃で１時間静置しな。その
後終濃度１％となるようにトライトンＸ−１００を加え
、水冷上で１時間静置した。

この操作でＳＤＳ活性化ＰＡＩが得られた。

このＳＤＳ活性化ＰＡＩを抗原とし、また比較のために
ＦＡＩ−ｔＰＡ複合体、　ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ　ＦＡＩ
も抗原とし、エンザイムイムノアッセイを行なった。

ポリスチレンプラスチックウェルを１夜４℃で、各々の
抗原を１μｇ／ｍｌのタンパク濃度に調製し、これをコ
ーティングした。表２に示すように抗原との結合能を検
定した。ウェルを洗浄し、ＢＳＡでブロックし、３７℃
で２時間、５μｇ／ｍｌのタンパク濃度に調製した４種
のモノクローナル抗体とともに保温しな。洗浄後、ＨＲ
Ｐ標識ウサギ抗マウス抗体とともに保温した。洗浄後、
ウェルに残存しているペルオキシダーゼ活性を定量し、
結合能を検定した。４種のモノクローナル抗体とともに
ＦＡＩ−ｔＰＡ複合体、　ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ　ＰＡ　
Ｉ　、　ＳＤＳ活性化ＰＡＩに結合能を示したが、ＪＴ
Ｉ−１はｑｕｉｅｓｃｅｎｔ　ＰＡ　Ｉへの結合がより
強く、ＪＴＩ−２はＳＤＳ活性化ＰＡＩへの結合がより
強かった。ＪＴＩ−３，−４はともに３種の抗原に強く
結合した。

表　３Ｋｄ（解離定数） ｑＰＡ　Ｉ　　　　Ｃｏｍｐｌｅｘ ＪＴＩ−１９，１ｘｌＯ−９Ｍ　　４．４　Ｘ１０−９
ＭＪＴＩ−２４，７Ｘ１０−９Ｍ　　１．０３Ｘ１０−
８ＭＪＴＩ−３２，ｌＸ１０−９Ｍ　　５．ＯＸｌｏ−
８ＭＪＴＩ−４９，２Ｘ１０−９Ｍ　　２．８Ｘ１０−
８ＭｑＰＡ　Ｉ　；　ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ　ＰＡ　ＩＣ
ｏｍｐｌｅｘ；　ＰＡ　Ｉ−ｔＰＡ複合体また、抗原固
定化法で、モノクローナル抗体の抗原への結合能を分析
した結果、表３に示した解離定数（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔ
ｉｏｎ　Ｃｏｎ５ｔａｎｔ、以後Ｋｄと略す）を得た。

実施例３ （ＪＴ　Ｉ−２のイムノブロッティングでの結合能）Ｐ
ＡＩ又はＰＡＩ−ｔＰＡ複合体の各々３０Ｑｎｇを、Ｓ
ＤＳスラブゲル電気泳動し、この後電気的にニトロセル
ロースメンブレン上にタンパクを転移しな。このニトロ
セルロースメンブレンをＢＳＡでブロックし、洗浄後、
室温で２時間１０μｇ／ｍ１のタンパク濃度になるよう
調製したＪＴＩ−２溶液中で保温した。洗浄後ＨＲＰ標
識ウサギ抗マウス抗体とともに保温した。洗浄後、ニト
ロセルロース上に、抗原と結合して残存しているＨＲＰ
標識抗体のペルオキシダーゼ活性を検出した。結果を図
１に示した。ＪＴＩ−２は、ＰＡＩ単独。

ＰＡＩ−ｔＰＡ複合体ともに結合能を示した。

実施例４ （ＰＡＩ単独とＰＡＩ−ｔＰＡ複合体との全ＰＡ■抗Ｍ
量の測定） ＪＴＩ−３をタンパク濃度５０μ、ｇ／ｍｌでポリスチ
レンプラスチックウェル上に４℃で一夜静置し、コーテ
ィングした。次に１％ＢＳＡを含むトリス塩酸緩衝液（
以後ＴＢＳと略す）を加え、３７℃で２時間静置した後
０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むトリス塩酸緩衝液（
以後ＴＢＳ−Ｔｗと略す）で４回洗浄した。次にＦＡＩ
あるいはＦＡＩ−ｔＰＡ複合体を、タンパク濃度ｉ０．
２０あるいは４０ｎｇ／ｍｌになるようにＴＢＳ−Ｔｗ
で希釈した溶液を加え３７℃で２時間静１した。ＴＢＳ
−Ｔｗで４回洗浄後、ペルオキシダーゼで標識したＪＴ
Ｉ−４を、ＴＢＳＴｗで２μｇ　／　ｍｌになるように
希釈した溶液を加え、３７℃で２時間静置した。ＴＢＳ
−Ｔｗで４回洗浄後、ペルオキシダーゼ基質溶液を加え
室温で反応後、波長４９５ｎｍで吸光度を測定した。結
果を図２に示す。この図より、ＦＡＩ単独でのタンパク
濃度あるいはＰＡＩ−ｔＰＡ複合体のタンパク濃度と吸
光度の関係は、同様の直線関係になることが示された。

以上のことから、この測定系では、ＰＡＩ単独とＰＡＩ
−ｔＰＡ複合体をあわせた全ＰＡＩ抗原量を測定しうろ
ことが示された。

実施例５ （ＰＡＩ単独の抗原量の測定） ＪＴＩ−２をタンパク濃度５０μｇ　／　ｍｌでポリス
チレンプラスチックウェル上に４℃で一夜静置しコーテ
ィングした。次に１％ＢＳＡを含むＴＢＳを加え、３７
℃で２時間静置した後、ＴＢＳ−Ｔｗで４回洗浄した。

次にＦＡＩあるいはＦＡＩ−ｔＰＡ複合体をタンパク濃
度１０．２０あるいは４０ｎｇ／ｍｌになるようにＴＢ
Ｓ−Ｔｗで希釈した溶液を加え、３７°Ｃで２時間静１
した。ＴＢＳ−Ｔｗで４回洗浄した後、ペルオキシダー
ゼで標識したＪＴｌｌを、ＴＢＳ−Ｔｗで２μｇ／ｍｌ
になるように希釈した溶液を加え、３７℃で２時間静置
した。ＴＢＳ−Ｔｗで４回洗浄後、ペルオキシダーゼ基
質溶液を加え室温で反応後、波長４９５ｎｍで吸光度を
測定した。結果を図３に示す。この図よりＦＡＩ単独で
はタンパク濃度と吸光度は直線関係になることが示され
たが、ＦＡＩ−ｔＰＡ複合体については、タンパク量の
増加に伴う吸光度の増加はみられなかった。以上のこと
から、この測定系では、ＦＡＩ単独での抗原量は測定し
うるが、ＰＡＩｔＰＡ複合体の抗原量は測定しないこと
が示された。

実施例６ （ＦＡＩ−ｔＰＡ複合体の抗原量の測定）測定系■ ｔＰＡ単独およびＰＡＩ−ｔＰＡ複合体ともに結合しろ
る抗ｔＰＡモノクローナル抗体を、タンパク濃度５０μ
ｇ　／　ｍｌでポリスチレンプラスチックウェル上に４
℃で一夜静置し、コーティングした。

次に１％ＢＳＡを含むＴＢＳを加え、７℃で２時間静置
した後、ＴＢＳ−Ｔｗで４回洗浄した。次にＰＡＩ−ｔ
ＰＡ複合体をタンパク濃度１０．２０あるいは４０ｎｇ
／ｍｌになるようにＴＢＳ−Ｔｗで希釈した溶液を加え
、３７℃で２時間静置した。ＴＢＳで４回洗浄後、ペル
オキシダーゼで標識しなＪＴＩ−１，−３あるいは−４
をＴＢＳ−Ｔｗで２μｇ／ｍｌになるように希釈した溶
液を加え、３７℃で２時間静置した。ＴＢＳ−Ｔｗで４
回洗浄後ペルオキシダーゼ基質溶液を加え、室温で反応
後、波長４９５ｎｍで吸光度を測定した。結果を図４に
示す。

この図より、いずれのペルオキシダーゼ標識化抗体でも
、ＦＡＩ−ｔＰＡ複合体量と吸光度の関係は、直線関係
になることが示された。以上のことからこの測定系では
、ＰＡＩ−ｔＰＡ複合体の抗原量を測定しうろことが示
された。

測定系■ ＪＴＩ−１，−３あるいは−４を、タンパク濃度５０μ
ｇ／ｍｌでポリスチレンプラスチックウェル上に４℃で
一夜静置し、コーティングしな。次に１％ＢＳＡを含む
ＴＢＳを加え、３７℃で２時間静置した後、ＴＢＳ−Ｔ
ｗで４回洗浄した。次にＦＡＩ−ｔＰＡ複合体をタンパ
ク濃度１０．２０あるいは４０ｎｇ／ｍｌになるように
ＴＢＳ−Ｔｗで希釈した溶液を加え、７℃で２時間静置
した。ＴＢＳ−ＴＷで４回洗浄後、ペルオキシダーゼで
標識しなｔＰＡ単独およびＰＡＩ−ｔＰＡ複合体に結合
しうる抗ｔＰＡモノクローナル抗体をＴＢＳ−Ｔｗで２
μｇ／ｍｌになるように希釈した溶液を加え、３７℃で
２時間静置した。ＴＢＳ−Ｔｗで４回洗浄後、ペルオキ
シダーゼ基質溶液を加え、室温で反発後波長４９５ｎｍ
で吸光度を測定した。結果を図５に示す。この図より、
いずれの抗ＰＡＩモノクローナル抗体を用いてコーティ
ングした場合でも、ＦＡＩ−ｔＰＡ複合体量と吸光度の
関係は直線関係になることが示された。以上のことから
この測定系では、ＰＡＩ−ｔＰＡ複合体の抗原量を測定
しうろことが示された。

実施例７ （抗ＰＡＩモノクローナル抗体による、試験管内でのＰ
ＡＩ−ｔＰＡ複合体形成抑制） ＱｕｉｓｃｅｎｔＰ　Ａ　Ｉを、ＳＤＳを用いて活性化
し、ＳＤＳ活性化ＰＡＩを得た。このＳＤＳ活性化ＰＡ
　Ｉ　１１００ｎにＪＴＩ−１，−２，−３，−４，マ
ウスＩｇＧあるいはウサギ抗ＰＡＩポリクローナル抗体
をモル比にして１０倍又は１００倍加え３７℃で１時間
Ｍ装置した。次に１２５工標識化ｔＰＡを０．　ｌｎｇ
（Ｉ　Ｘ　１０’　ｃｐｍ）加え、３７℃で３０分間静
置した。このものをＳＤＳスラブゲル電気泳動し、ゲル
を乾燥後オートラジオグラフィーを行なった。ここで検
出されなｔＰＡ単独あるいはＦＡＩ−ｔＰＡ複合体に相
当するーにある放射活性を測定し、ｔｐＡ単独とＰＡＩ
−ｔＰＡ複合体の放射活性の比を百分率表示で表４に示
した。表に示されたように、抗ＰＡＩポリクローナル抗
体をＦＡＩの１００倍モル量加えた場合、はぼ完全に複
合体形成が抑制された。またＪＴＩ−３を１０倍量ある
いは１００倍量加えた場合も、強く複合体形成が抑制さ
れた。まなＪＴＩ−２も複合体形成を抑制する傾向を示
した。以上のことより少くともＪＴＩ−３は試験管内で
のＰＡＩ−ｔＰＡ複合体形成を抑制することが示された
。

表４ 試験管内でのＦＡＩ−ｔＰＡ 複合体形成抑制 ｔ　Ｐ　Ａ　　　Ｃｏｍｐｌｅｘ ４１％　　　５９％ 抗体 なし マウスＩｇＧ　　１００倍 ＪＴＩ−１１０倍 １００倍 ＪＴＩ−２１０倍 １００倍 ＪＴＩ−３１０倍 １００倍 ＪＴＩ−４１０倍 １００倍 ポリクロ−１００倍 ナル抗体 Ｃｏｍｐｌｅｘ　；　ＰＡ　Ｉ　−ｔ　ＰＡ複合体実施
例８ （抗ＰＡＩモノクローナル抗体による、ＦＡＩのｔＰＡ
依存性プラスミノーゲン活性化阻害の抑制〉Ｑｕｉｓｃ
ｅｎｔＰ　Ａ　Ｉを、ＳＤＳを用いて活性化し、ＳＤＳ
活性化ＰＡＩを得た。このＳＤＳ活性化ＰＡ　Ｉ　２０
ｎｇに、ＪＴＩ−１，−２，−３，−４あるいはウサギ
抗ＰＡＩポリクローナル抗体をモル比にして１０倍又は
１００倍加え、３７℃で１時間静置した。次にｔＰＡを
０．２５ｎｇ加え、３７℃で３０分間静置した。次にプ
ラスミノーゲン２２μｇ、プラスミンの合成発色基質で
あるＳ−２２５１を０．１５ｍＭになるように加え、３
７℃で３時間静置した後、波長４０５ｎｍで吸光度を測
定した。なお、ここで用いたＳＤＳ活性化ＰＡＩの量は
、ｔＰＡ活性の９０％を阻害する量だった。結果を表５
に示した。表５は残存するｔＰＡ活性が、ＳＤＳ活性化
ＰＡＩを含まない場合の何％に当るかを表示しな。表に
示されたように抗ＰＡＩポリクローナル抗体をＦＡＩの
１００倍モル量加えた場合、ｔＰＡ活性はほぼ完全に回
復した。またＪＴＩ−３を１００倍モル量加えた場合も
約５０％ｔＰＡ活性が回復した。以上のことよりＪＴＩ
−３はＳＤＳ活性化ＰＡＩによるｔＰＡ依存性プラスミ
ノーゲン活性化阻害を抑制することが示された。

表５　抗ＰＡＩモノクローナル抗体によるＰＡＩのｔＰ
Ａ依存性プラスミノーゲン活性化阻害の抑制杭木　　　
　　　　　　残存ｔＰＡ活性活性上　　　　　　　　　
　　５．９％ マウスＩｇＧ　　　１００倍　　　５．９ＪＴＩ−１１
０倍　　７．１ １００倍　　４．７ ＪＴＩ−２１０ｒ音　　　５．４ １００倍　　４，８ ＪＴＩ−３１０倍　１１．９ １００倍　４８．９ ＪＴＩ−４１０倍　　５．９ １００倍　　７．１ ポリクロ−１０倍　　　５．９ ナル抗体　　　１００倍　　９５．２ 木ｔＰＡ単独で活性測定した場合を１００％とした。

実施例９ （抗ＰＡＩモノクローナル抗体による、血管壁内皮細胞
上でのＦＡＩ−ｔＰＡ複合体形成の抑制）血管壁内皮細
胞を、直径３５ｍｍの細胞培養皿上にコンフルエントに
なるよう培養した。細胞を無血清１９９培地で洗浄後２
ｍｌの無血清１９９培地、終濃度１１００ｎ　／ｍｌの
ｔＰＡおよび終濃度１０μｇ、／ｍｌのＪＴＩ−１，−
２，−３，−４，マウスＩｇＧあるいはウサギ抗ＰＡＩ
ポリクローナル抗体を加え３７°Ｃで３時間静置し、上
清を回収した。この上清をＳＤＳスラブゲル電気泳動を
行なった後フィブリンオートグラフィーで分析した。結
果を図６に示した。図６において記号１〜５はそれぞれ
以下の場合を示す。

１；ＪＴＩ−１を加えた場合、２．ＪＴＩ−３を加えた
場合、３；ポリクローナル抗体を加えた場合、４；ＪＴ
Ｉ−４を加えた場合、５；実験に用いたｔＰＡ。

図６より、ウサギ抗ＰＡＩポリクローナル抗体を加えた
場合、ＦＡＩ−ｔＰＡ複合体形成は完全に抑制されたこ
とがわかる。まなＪＴＩ−１，ＪＴＩ−３を加えた場合
もＰＡＩ−ｔＰＡ複合体形成の抑制がみられた。以上の
ことから、ＪＴｌｌ、ＪＴＩ−３は血管壁内皮細胞が作
る活性形ＰＡ１によるＰＡＩ−ｔＰＡ複合体形成を抑制
することがわかった。

実施例１０ （ヒト血管壁内皮細胞ＰＡ■の精製） ヒト血管壁内皮細胞培養上清１１に、ｐＨ７，０に調製
した飽和硫安１１を、１時間かけ水冷撹拌しながら加え
た。すべての硫安溶液を加えおえなのら、２時間撹拌を
する。この溶液を１０．０ＯＯＸ　Ｇ　。

３０分間４℃で遠心分離し、沈澱を分離しな。

この沈澱を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　　−ＨＣ２ｐＨ７，４
−０，１５ＭＮａＣ９−０，０１％Ｔｗｅｅｎ　８０　
（以後Ｔｗ８０と略す）に１ｍＭ　Ｂｅｎｚａｍｉｄｉ
ｎｅ緩衝液１００　ｍｌに溶解し同緩衝液に対して４°
Ｃで透析した。

透析を終えた試料を、前記抗ＰＡＩモノクロナル抗体Ｊ
ＴＩ−１を、１ｍｇ／ｍｌ・抗体の濃度で結合させた杭
木−担体結合体１０ｍ１と混合、撹拌し４°Ｃ１１８時
間の反応をおえた抗体−担体結合体を集め、これを１０
０　ｍｌの２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　　−ＨＧ−１，０ＭＮ
ａＧ−０，０１％Ｔｗ　８ｏ　−１ｍＭ　Ｂｅｎｚａｍ
ｉｄｉｎ　緩衝液で洗浄し、さらに２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
　　−ＨＧ９−０．１５Ｍ　Ｎａ（ＪＯ６０１％Ｔｗ　
８０−１　ｍＭ　Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ　１００ｍ１
で洗浄する。ＰＡＩを吸着している抗体・担体結合体が
ら０．２Ｍグリシン・塩酸ｐＨ２，５−〇、０１％Ｔｗ
８０！ｉ！Ｉ液を用いてＦＡＩを溶出した。

カラムからの溶出液は３ｍｌずつ分画しな。また溶出後
各分画はＩ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ９，０を加えてｐＨ７
，４に調製した。

得られた試料に存在するＰＡ　Ｉ−ｔ、　ＰＡ複合体を
除くために抗ｔＰＡポリクローン抗体を不溶化した担体
と４℃、１８時間撹拌しその上清を得た。

上記の実施例において、ＦＡＩの精製を確認のためのＳ
ＤＳ電気泳動を行ない、タンパク染色と抗ＰＡＩモノク
ローナル抗体ＪＴＩ−２およびＨＲＰ標識標識化ウサギ
抗マウス１奢Ｇいたイムノブロッティングの結果を図７
に示しな。

図７において記号Ａ〜Ｆはそれぞれ以下の銀染色を示す
。

Ａ；培養上清、Ｂ；抗体カラム素通りｌ　Ｃ；分画１．
Ｄ；分画２．Ｅ；分画３．Ｆ；分画４゜またＧはイムノ
ブロッティング発色を示す。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例３におけるゲル電気泳動結果を示す。図２
は実施例４における全ＰＡＩ抗原量の測定結果を示す。 図３は実施例５におけるＦＡＩ単独の抗原量の測定結果
を示す。図４は実施例６における測定系工のＦＡＩ−ｔ
ＰＡ複合体抗原量の測定結果を示す。図５は実施例６に
おける測定系■のＦＡＩ−ｔＰＡ複合体の測定結果を示
す。図６は実施例９におけるゲル電気泳動結果を示す。 図７は実施例１０におけるゲル電気泳動結果を示す。 力、ｒ函Ｌ（Ｉ層の視’ｉ！ Ｏ汀 抗原壕ｔ（’≠１） １目午、ＰＡｌ−ぜＡ籟ｇ４Ｉ”１扉１４′１気７櫂を
廓５工−−−噌ゴ丁Ｚ−３ ４た 滑、 ｔ（・にヱ） ｌ？′１３ ピＡＬ　　第４％　ｑ４ｎ−Ｑ　ｉ　ｎ；ｌ’ｌ　Ｕ４
台、　８歇　ｔ（”／ζ４又） 凹ダ。 ｆ’ＡＩ・丸ｆＡオ少有４本イへＮの躍り定Ｃρ１１舒
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Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーターの結
   合によっては結合を阻害されないヒトプラスミノーゲン
   アクティベーターインヒビター・１の抗原決定部位を認
   識するヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビ
   ター・１に対するモノクローナル抗体。
2. （２）ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター単独
   の結合によっては結合を阻害されないが、ヒト組織プラ
   スミノーゲンアクティベーターと１種のヒトプラスミノ
   ーゲンアクティベーターインヒビター・１に対するモノ
   クローナル抗体が両方結合した場合には結合を阻害され
   るヒトプラスミノーゲンアクティベーターインヒビター
   ・１の抗原決定部位を認識するヒトプラスミノーゲンア
   クティベーターインヒビター・１に対するモノクローナ
   ル抗体。
3. （３）ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター単独
   の結合によっても、ヒト組織プラスミノーゲンアクティ
   ベーターと１種のヒトプラスミノーゲンアクティベータ
   ーインヒビター・１に対するモノクローナル抗体が両方
   結合した場合にも結合を阻害されないヒトプラスミノー
   ゲンアクティベーターインヒビター・１の抗原決定部位
   を認識するヒトプラスミノーゲンアクティベーターイン
   ヒビター・１に対するモノクローナル抗体。
4. （４）ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーターの結
   合によっては結合を阻害されない抗原決定部位であるが
   、その部位にそのモノクローナル抗体が結合するとヒト
   組織プラスミノーゲンアクティベーターの結合が阻害さ
   れるような抗原決定部位を認識するヒトプラスミノーゲ
   ンアクティベーターインヒビター・１に対するモノクロ
   ーナル抗体。
5. （５）請求項１、請求項２、請求項３又は請求項４記載
   のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
6. （６）請求項５記載のハイブリドーマを選択し、そのハ
   イブリドーマの産生するモノクローナル抗体を他の産生
   物と分離し、精製し取得することを特徴とするモノクロ
   ーナル抗体の製造方法。
7. （７）請求項２記載のモノクローナル抗体を不溶性担体
   に固相化し、これにヒトプラスミノーゲンアクティベー
   ターインヒビター・１及び／又はヒトプラスミノーゲン
   アクティベーターインヒビター・１−ヒト組織プラスミ
   ノーゲンアクティベーター複合体を含有し、ヒトプラス
   ミノーゲンアクティベーター・１−ヒト組織プラスミノ
   ーゲンアクティベーター−抗プラスミノーゲンアクティ
   ベーターインヒビター・１モノクローナル抗体複合体の
   含有が予想される混合物を接触させてヒトプラスミノー
   ゲンアクティベーターインヒビター・１及び／又はヒト
   プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・１−
   ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター複合体を特
   異的に結合させることを特徴とするヒトプラスミノーゲ
   ンアクティベーターインヒビター・１及び／又はヒトプ
   ラスミノーゲンアクティベーターインヒビター・１−ヒ
   ト組織プラスミノーゲンアクティベーター複合体の分離
   除去方法又は分離精製方法。
8. （８）請求項２記載のモノクローナル抗体を不溶性担体
   に固相化した免疫吸着体。
9. （９）該不溶性担体が、プラスチック容器、プラスチッ
   クビーズ、ラテックスビーズ、ガラスビーズ又は金属粒
   子である請求項８記載の免疫吸着体。
10. （１０）サンドイッチ法による免疫学的測定キットにお
    いて、不溶生担体に結合した抗体と標識抗体とのいずれ
    か一方或いは両方が請求項２記載のモノクローナル抗体
    であることを特徴とするヒトプラスミノーゲンアクティ
    ベーターインヒビター・１の免疫学的測定キット。
11. （１１）不溶生担体に結合した抗体と標識抗体を含み、
    これらの抗体のいずれか一方又は両方が請求項２記載の
    モノクローナル抗体であり、これに（ａ）溶解剤、（ｂ
    ）洗浄剤及び酵素で標識化した抗体を用いる場合には、
    （ｃ）酵素活性を測定するための基質及びその反応停止
    剤を組合せてなる免疫学的測定のためのキット。
12. （１２）不溶生担体に結合した抗体と標識抗体を含み、
    これらの抗体のいずれか一方は請求項２記載のモノクロ
    ーナル抗体であり、他方はヒト組織プラスミノーゲンア
    クティベーターに対する抗体であり、これに（ａ）溶解
    剤、（ｂ）洗浄剤及び酵素で標識化した抗体を用いる場
    合には、（ｃ）酵素活性を測定するための基質及びその
    反応停止剤を組合せてなる免疫学的測定のためのキット
    。
13. （１３）ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーターの
    結合によっては結合を阻害されない抗原決定部位である
    が、その部位にそのモノクローナル抗体が結合するとヒ
    ト組織プラスミノーゲンアクティベーターの結合が阻害
    されるような抗原決定部位を認識するヒトプラスミノー
    ゲンアクティベーターインヒビター・１に対するモノク
    ローナル抗体を有効成分とする血栓溶解促進剤。
14. （１４）ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーターの
    結合によっては結合を阻害されない抗原決定部位である
    が、その部位にそのモノクローナル抗体が結合するとヒ
    ト組織プラスミノーゲンアクティベーターの結合が阻害
    されるような抗原決定部位を認識するヒトプラスミノー
    ゲンアクティベーターインヒビター・１に対するモノク
    ローナル抗体のＦａｂ部分を少くとも有するモノクロー
    ナル抗体又はその断片を有効成分とする血栓溶解促進剤
    。