JP3226942B2 - スロンビンとスロンビン阻害物質とにより形成された複合体に対して向けられたモノクローナル抗体 - Google Patents
スロンビンとスロンビン阻害物質とにより形成された複合体に対して向けられたモノクローナル抗体Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/38—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against protease inhibitors of peptide structure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、スロンビン／ヒルジン
−複合体に対して向けられたモノクローナル抗体及びそ
の誘導体、それらの製造方法、それらのモノクローナル
抗体を分泌するハイブリドーマセルライン、並びに該ハ
イブリドーマセルラインの製造方法に関する。さらに、
本発明はスロンビン／ヒルジン−複合体の測定のための
モノクローナル抗体及び／又はその誘導体の使用、並び
に該モノクローナル抗体及び／又はその誘導体を含んで
成る試験キットに関する。
−複合体に対して向けられたモノクローナル抗体及びそ
の誘導体、それらの製造方法、それらのモノクローナル
抗体を分泌するハイブリドーマセルライン、並びに該ハ
イブリドーマセルラインの製造方法に関する。さらに、
本発明はスロンビン／ヒルジン−複合体の測定のための
モノクローナル抗体及び／又はその誘導体の使用、並び
に該モノクローナル抗体及び／又はその誘導体を含んで
成る試験キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】効果的に機能する止血系は哺乳類にとっ
て非常に重要である。健康な生物体においては、血管系
の欠陥、例えば血管の損傷は２段階の過程、すなわち栓
球の凝集、及びそれに続く、幾つかの血液凝固因子の関
与のもとでの酵素カスケードでのフィブリン塊の形成に
より修復される。これらの因子のほとんどがセリンプロ
テアーゼでありその一例がフィブリノーゲンからフィブ
リンへの反応を触媒するスロンビンである。
て非常に重要である。健康な生物体においては、血管系
の欠陥、例えば血管の損傷は２段階の過程、すなわち栓
球の凝集、及びそれに続く、幾つかの血液凝固因子の関
与のもとでの酵素カスケードでのフィブリン塊の形成に
より修復される。これらの因子のほとんどがセリンプロ
テアーゼでありその一例がフィブリノーゲンからフィブ
リンへの反応を触媒するスロンビンである。
【０００３】この凝固系は特にフィブリンを開裂するプ
ロテアーゼであるプラスミンを含む線溶系により対抗さ
れる。凝固系及び線溶系は通常、ダイナミックな平衡の
中にある。しかしながら、生物体の線溶能力が攪乱され
又は不十分な場合、例えば血栓塞栓症又は術後合併症に
罹っている患者においては、フィブリンの更なる形成を
防止するための抗凝固剤及び形成された血栓を溶解する
ための血栓溶解剤の投与により生物体を援助することが
必須である。
ロテアーゼであるプラスミンを含む線溶系により対抗さ
れる。凝固系及び線溶系は通常、ダイナミックな平衡の
中にある。しかしながら、生物体の線溶能力が攪乱され
又は不十分な場合、例えば血栓塞栓症又は術後合併症に
罹っている患者においては、フィブリンの更なる形成を
防止するための抗凝固剤及び形成された血栓を溶解する
ための血栓溶解剤の投与により生物体を援助することが
必須である。
【０００４】蛭(leech) 〔ヒルド・メディシナリス(Hir
odo medicinalis)中に天然に存在する抗凝固剤であるヒ
ルジンはスロンビンの強力且つ特異的な阻害物質であっ
て、フィブリノーゲンの開裂、及びそれに続くフィブリ
ンクロットの形成を防止する。ヒルジンは非常に迅速に
α−スロンビンと反応して、非常に安定でありそして酵
素的に全体として不活性である非常に堅い非共有結合複
合体（Ｋ1 ＝約１〜０．０１P Ｍ）を形成する。それぞ
れが６５個又は６６個のアミノ酸を含む幾つかの密接に
関連するヒルジン変形体（ｖａｒｉａｎｔ）、例えばヒ
ルジン変形体１（ＨＶ１）、ヒルジン変形体２（ＨＶ
２）、ヒルジン変形体ＰＡ（ＨＶ３）、及びｄｅｓ−
（Ｖａｌ）2 −ヒルジンが記載されている。
odo medicinalis)中に天然に存在する抗凝固剤であるヒ
ルジンはスロンビンの強力且つ特異的な阻害物質であっ
て、フィブリノーゲンの開裂、及びそれに続くフィブリ
ンクロットの形成を防止する。ヒルジンは非常に迅速に
α−スロンビンと反応して、非常に安定でありそして酵
素的に全体として不活性である非常に堅い非共有結合複
合体（Ｋ1 ＝約１〜０．０１P Ｍ）を形成する。それぞ
れが６５個又は６６個のアミノ酸を含む幾つかの密接に
関連するヒルジン変形体（ｖａｒｉａｎｔ）、例えばヒ
ルジン変形体１（ＨＶ１）、ヒルジン変形体２（ＨＶ
２）、ヒルジン変形体ＰＡ（ＨＶ３）、及びｄｅｓ−
（Ｖａｌ）2 −ヒルジンが記載されている。
【０００５】これらの変形体は多くのアミノ酸により相
互に異なるが、しかしすべてがＮ−末端での疎水性アミ
ノ酸の蓄積、Ｃ−末端における極性アミノ酸の蓄積、硫
酸モノエステルとして存在するチロシン残基（Ｔｙｒ６
３）、３個のジスルフィド橋、及び抗凝固活性を共通に
有する。最近、ヒルジン変形体をコードする CＤＮＡ及
び合成遺伝子がクローニングされ、そして微生物宿主中
で発現されている。組換えヒルジン変形体はＴｙｒ６３
における硫酸モノエステル基を欠いており、そしてそれ
故にデスルファトヒルジンと称される。しかしながら、
これらは天然硫酸化ヒルジンの生物学的性質と少なくと
も同等の生物学的性質を示す。
互に異なるが、しかしすべてがＮ−末端での疎水性アミ
ノ酸の蓄積、Ｃ−末端における極性アミノ酸の蓄積、硫
酸モノエステルとして存在するチロシン残基（Ｔｙｒ６
３）、３個のジスルフィド橋、及び抗凝固活性を共通に
有する。最近、ヒルジン変形体をコードする CＤＮＡ及
び合成遺伝子がクローニングされ、そして微生物宿主中
で発現されている。組換えヒルジン変形体はＴｙｒ６３
における硫酸モノエステル基を欠いており、そしてそれ
故にデスルファトヒルジンと称される。しかしながら、
これらは天然硫酸化ヒルジンの生物学的性質と少なくと
も同等の生物学的性質を示す。
【０００６】ヒルジンは、その低い毒性及び免疫学的副
作用の不存在と相まってスロンビンのその選択的阻害の
ために将来の療法的用途についての大きな可能性を有す
る。しかしながら、ヒルジンの好結果の療法的適用はま
た、その活性及び治療の経過をモノターする系を必要と
する。さらに、ヒルジン治療のための実際の必要量を活
定できることが望ましい。これらの問題点の１つの解決
策は少量でもスロンビンの形成を検出するために使用し
得る、スロンビンとヒルジンとによって形成された複合
体に対する抗体を開発することであろう。
作用の不存在と相まってスロンビンのその選択的阻害の
ために将来の療法的用途についての大きな可能性を有す
る。しかしながら、ヒルジンの好結果の療法的適用はま
た、その活性及び治療の経過をモノターする系を必要と
する。さらに、ヒルジン治療のための実際の必要量を活
定できることが望ましい。これらの問題点の１つの解決
策は少量でもスロンビンの形成を検出するために使用し
得る、スロンビンとヒルジンとによって形成された複合
体に対する抗体を開発することであろう。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、スロ
ンビン／ヒルジン−複合体に対して向けられたモノクロ
ーナル抗体製造することである。
ンビン／ヒルジン−複合体に対して向けられたモノクロ
ーナル抗体製造することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この目的は、適当なキャ
リャーに連結されたヒルジン又はスロンビン／ヒルジン
−複合体を用いて適当な哺乳類を免役し、そして該哺乳
類の抗体分泌細胞と連続セルラインの細胞とを融合せし
め、こうして目的とするモノクローナル抗体を分泌する
ハイブリドーマ細胞を製造することにより達成される。
本発明のモノクローナル抗体は、多くの診断的及び療法
的目的、例えばスロンビン形成及び血栓症の迅速な検出
のために有用である。
リャーに連結されたヒルジン又はスロンビン／ヒルジン
−複合体を用いて適当な哺乳類を免役し、そして該哺乳
類の抗体分泌細胞と連続セルラインの細胞とを融合せし
め、こうして目的とするモノクローナル抗体を分泌する
ハイブリドーマ細胞を製造することにより達成される。
本発明のモノクローナル抗体は、多くの診断的及び療法
的目的、例えばスロンビン形成及び血栓症の迅速な検出
のために有用である。
【０００９】
【具体的な説明】本発明は、スロンビン／ヒルジン−複
合体に対して向けられたモノクローナル抗体、及び由来
する抗体の特異性を維持しているそれらの誘導体に関す
る。この明細書において、「ヒルジン」なる語は特にこ
とわらない限り、（１）すべての天然及び合成ヒルジン
変形体及びヒルジン誘導体、例えばヒルジン断片、並び
に（２）すべての組換ヒルジン（デスルファトヒルジ
ン）変形体及び組換えヒルジン（デスルファトヒルジ
ン）誘導体、例えば文献に記載されているか又は組換え
ＤＮＡ技法により得られるＣ−末端短縮型デスルファト
ヒルジン、が含まれる。この様なヒルジンの例として、
合体に対して向けられたモノクローナル抗体、及び由来
する抗体の特異性を維持しているそれらの誘導体に関す
る。この明細書において、「ヒルジン」なる語は特にこ
とわらない限り、（１）すべての天然及び合成ヒルジン
変形体及びヒルジン誘導体、例えばヒルジン断片、並び
に（２）すべての組換ヒルジン（デスルファトヒルジ
ン）変形体及び組換えヒルジン（デスルファトヒルジ
ン）誘導体、例えば文献に記載されているか又は組換え
ＤＮＡ技法により得られるＣ−末端短縮型デスルファト
ヒルジン、が含まれる。この様なヒルジンの例として、
【００１０】(a) 次の式（Ｉ）で表わされるタイプＨＶ
１のヒルジン変形体：
１のヒルジン変形体：
【化１】
【００１１】〔式中、（Ｒ）はＴｒｙのフェノール性ヒ
ドロキシル基（デスルファトヒルジン）又は−Ｏ−ＳＯ
3 Ｈ基であり、そして／又は、Ｌｙｓ２７はＩｌｅもし
くはＧｌｕにより置換えられており、又はＬｙｓ２６は
ＩｌｅもしくはＧｌｕにより置換えられており、又はＬ
ｙｓ４７はＩｌｅもしくはＧｌｕにより置換えられてお
り、又はＨｉｓ５１はＬｅｕもしくはＡｓｐにより置換
えられており、又はＶａｌ１−Ｖａｌ２はＴｈｒにより
置換えられており、又はＶａｌ１はＬｅｕにより、そし
てＶａｌ２はＴｈｒにより置換えられており、又は分子
全体はＧｌｎ６５により、又はＬｅｕ６４及びＧｌｎ６
５により短縮されている〕；
ドロキシル基（デスルファトヒルジン）又は−Ｏ−ＳＯ
3 Ｈ基であり、そして／又は、Ｌｙｓ２７はＩｌｅもし
くはＧｌｕにより置換えられており、又はＬｙｓ２６は
ＩｌｅもしくはＧｌｕにより置換えられており、又はＬ
ｙｓ４７はＩｌｅもしくはＧｌｕにより置換えられてお
り、又はＨｉｓ５１はＬｅｕもしくはＡｓｐにより置換
えられており、又はＶａｌ１−Ｖａｌ２はＴｈｒにより
置換えられており、又はＶａｌ１はＬｅｕにより、そし
てＶａｌ２はＴｈｒにより置換えられており、又は分子
全体はＧｌｎ６５により、又はＬｅｕ６４及びＧｌｎ６
５により短縮されている〕；
【００１２】(b) 次の式（II）で表わされるタイプＨＶ
２のヒルジン変形体：
２のヒルジン変形体：
【化２】
【００１３】〔式中、（Ｒ）はＴｙｒのフェノール性ヒ
ドロキシル基（デスルファトヒルジン）又は−Ｏ−ＳＯ
3 Ｈ基であり、そして／又は、Ｉｌｅ１はＶａｌによ
り、そしてＴｈｒ２はＶａｌにより置換えられており、
又はＡｓｎ４７はＬｙｓ、ＡｒｇもしくはＨｉｓにより
置換えられており、又はＴｒｙ６３はＧｌｕもしくはＡ
ｓｐにより置換えられている〕；並びに、
ドロキシル基（デスルファトヒルジン）又は−Ｏ−ＳＯ
3 Ｈ基であり、そして／又は、Ｉｌｅ１はＶａｌによ
り、そしてＴｈｒ２はＶａｌにより置換えられており、
又はＡｓｎ４７はＬｙｓ、ＡｒｇもしくはＨｉｓにより
置換えられており、又はＴｒｙ６３はＧｌｕもしくはＡ
ｓｐにより置換えられている〕；並びに、
【００１４】(c) 次の式（III ）で表わされるタイプＰ
Ａ（ＨＶ３）のヒルジン変形体：
Ａ（ＨＶ３）のヒルジン変形体：
【化３】
【００１５】〔式中、（Ｒ）はＴｙｒのフェノール性ヒ
ドロキシル基（デスルファトヒルジン）又は−Ｏ−ＳＯ
3 Ｈ基であり、そして／又は、ポリペプチド鎖はＣ−末
端において１８，１０，９，６，４又は２個のアミノ酸
により短縮されており、又はポリペプチド鎖はＮ−末端
において１又は２個のアミノ酸により短縮されている〕
が挙げられる。
ドロキシル基（デスルファトヒルジン）又は−Ｏ−ＳＯ
3 Ｈ基であり、そして／又は、ポリペプチド鎖はＣ−末
端において１８，１０，９，６，４又は２個のアミノ酸
により短縮されており、又はポリペプチド鎖はＮ−末端
において１又は２個のアミノ酸により短縮されている〕
が挙げられる。
【００１６】本発明のモノクローナル抗体は、目的とす
る性質について、好ましくはラジオイムノアッセイ又は
エンザイムイムノアッセイにより試験される。例えば、
エンザイムイムノアッセイを行うに当っては、適当な抗
−α−スロンビンモノクローナル抗体、例えばスロンビ
ンへのヒルジンの結合を妨害しない抗−α−スロンビン
モノクローナル抗体によりミクロタイタープレートのご
とき適当なキャリャーをコートし、そしてスロンビン／
ヒルジン−複合体によりコートする。次に、本発明の酵
素ラベルされたモノクローナル抗体及び基質溶液を加
え、そしてキャリャーに結合した免疫複合体の酵素ラベ
ルを測定することにより本発明のモノクローナル抗体の
結合を検出する。
る性質について、好ましくはラジオイムノアッセイ又は
エンザイムイムノアッセイにより試験される。例えば、
エンザイムイムノアッセイを行うに当っては、適当な抗
−α−スロンビンモノクローナル抗体、例えばスロンビ
ンへのヒルジンの結合を妨害しない抗−α−スロンビン
モノクローナル抗体によりミクロタイタープレートのご
とき適当なキャリャーをコートし、そしてスロンビン／
ヒルジン−複合体によりコートする。次に、本発明の酵
素ラベルされたモノクローナル抗体及び基質溶液を加
え、そしてキャリャーに結合した免疫複合体の酵素ラベ
ルを測定することにより本発明のモノクローナル抗体の
結合を検出する。
【００１７】ヒルジンがヒルジン変形体１（ＨＶ１）で
あるスロンビン／ヒルジン−複合体に対して向けられた
モノクローナル抗体、及びその誘導体が好ましい。同様
に、ヒルジンが組換えヒルジン（ｒＨＶ）であるスロン
ビン／ヒルジン−複合体に対して向けられたモノクロー
ナル抗体及びその誘導体が好ましい。ヒルジンが組換え
ヒルジン変形体１（ｒＨＶ１）であるスロンビン／ヒル
ジン−複合体に対して向けられたモノクローナル抗体が
特に好ましい。
あるスロンビン／ヒルジン−複合体に対して向けられた
モノクローナル抗体、及びその誘導体が好ましい。同様
に、ヒルジンが組換えヒルジン（ｒＨＶ）であるスロン
ビン／ヒルジン−複合体に対して向けられたモノクロー
ナル抗体及びその誘導体が好ましい。ヒルジンが組換え
ヒルジン変形体１（ｒＨＶ１）であるスロンビン／ヒル
ジン−複合体に対して向けられたモノクローナル抗体が
特に好ましい。
【００１８】スロンビン／ヒルジン−複合体は２つの成
分、すなわちスロンビン及びヒルジンを含有するから、
該複合体と反応性のモノクローナル抗体は該複合体のヒ
ルジン成分もしくはスロンビン成分又は両成分の部分を
含む１個の決定基を認識することができる。さらに、第
２−スロンビン／ヒルジン−複合体モノクローナル抗体
は、スロンビン／ヒルジン−複合体の形成の間に生ずる
コンホーメーション変化から生ずる複合体に特異的ない
わゆるネオ（ｎｅｏ）−決定基を認識する可能性もあ
る。
分、すなわちスロンビン及びヒルジンを含有するから、
該複合体と反応性のモノクローナル抗体は該複合体のヒ
ルジン成分もしくはスロンビン成分又は両成分の部分を
含む１個の決定基を認識することができる。さらに、第
２−スロンビン／ヒルジン−複合体モノクローナル抗体
は、スロンビン／ヒルジン−複合体の形成の間に生ずる
コンホーメーション変化から生ずる複合体に特異的ない
わゆるネオ（ｎｅｏ）−決定基を認識する可能性もあ
る。
【００１９】本発明の好ましい態様は、スロンビン／ヒ
ルジン−複合体に対して向けられておりそして該スロン
ビン／ヒルジン−複合体中のヒルジン成分の決定基を認
識するモノクローナル抗体、及びその誘導体に関する。
ヒルジンがヒルジン変形体１（ＨＶ１）であるスロンビ
ン／ヒルジン−複合体に対して向けられておりそして該
複合体中のＨＶ１成分の決定基を認識するモノクローナ
ル抗体及びその誘導体が好ましい。ヒルジンが組換えヒ
ルジン（ｒＨＶ）であるスロンビン／ヒルジン−複合体
に対して向けられておりそして該複合体中のｒＨＶ成分
の決定基を認識するモノクローナル抗体、及びその誘導
体も好ましい。
ルジン−複合体に対して向けられておりそして該スロン
ビン／ヒルジン−複合体中のヒルジン成分の決定基を認
識するモノクローナル抗体、及びその誘導体に関する。
ヒルジンがヒルジン変形体１（ＨＶ１）であるスロンビ
ン／ヒルジン−複合体に対して向けられておりそして該
複合体中のＨＶ１成分の決定基を認識するモノクローナ
ル抗体及びその誘導体が好ましい。ヒルジンが組換えヒ
ルジン（ｒＨＶ）であるスロンビン／ヒルジン−複合体
に対して向けられておりそして該複合体中のｒＨＶ成分
の決定基を認識するモノクローナル抗体、及びその誘導
体も好ましい。
【００２０】ヒルジンが組換えヒルジン変形体１（ｒＨ
Ｖ１）であるスロンビン／ヒルジン−複合体に対して向
けられておりそして該複合体中のｒＨｖ１成分を認識す
るモノクローナル抗体、及びその誘導体が特に好まし
い。モノクローナル抗体のこの後者の群において、スロ
ンビン／ｒＨＶ１−複合体中のｒＨＶ１成分のＮ−末端
コアードメイン内の決定基、好ましくはｒＨＶ１成分の
アミノ酸残基１〜４３を含んで成る決定基を認識するモ
ノクローナル抗体、及びその誘導体が特に好ましい。特
に好ましいモノクローナル抗体及びその誘導体の例は、
ＭＡｂ４１５８−８１−７と称されるモノクローナル抗
体及びその誘導体である。
Ｖ１）であるスロンビン／ヒルジン−複合体に対して向
けられておりそして該複合体中のｒＨｖ１成分を認識す
るモノクローナル抗体、及びその誘導体が特に好まし
い。モノクローナル抗体のこの後者の群において、スロ
ンビン／ｒＨＶ１−複合体中のｒＨＶ１成分のＮ−末端
コアードメイン内の決定基、好ましくはｒＨＶ１成分の
アミノ酸残基１〜４３を含んで成る決定基を認識するモ
ノクローナル抗体、及びその誘導体が特に好ましい。特
に好ましいモノクローナル抗体及びその誘導体の例は、
ＭＡｂ４１５８−８１−７と称されるモノクローナル抗
体及びその誘導体である。
【００２１】本発明の他の好ましい具体例は、スロンビ
ン／ヒルジン−複合体に対して向けられておりそして該
スロンビン／ヒルジン−複合体中のスロンビン成分の決
定基を認識するモノクローナル抗体及びその誘導体に関
する。ヒルジンがヒルジン変形体１（ＨＶ１）であるス
ロンビン／ヒルジン−複合体に対して向けられておりそ
して該複合体中のスロンビン成分の決定基を認識するモ
ノクローナル抗体及びその誘導体が好ましい。ヒルジン
が組換ヒルジン（ｒＨＶ）であるスロンビン／ヒルジン
複合体に対して向けられておりそして該複合体中のスロ
ンビン成分の決定基を認識するモノクローナル抗体及び
その誘導体も好ましい。
ン／ヒルジン−複合体に対して向けられておりそして該
スロンビン／ヒルジン−複合体中のスロンビン成分の決
定基を認識するモノクローナル抗体及びその誘導体に関
する。ヒルジンがヒルジン変形体１（ＨＶ１）であるス
ロンビン／ヒルジン−複合体に対して向けられておりそ
して該複合体中のスロンビン成分の決定基を認識するモ
ノクローナル抗体及びその誘導体が好ましい。ヒルジン
が組換ヒルジン（ｒＨＶ）であるスロンビン／ヒルジン
複合体に対して向けられておりそして該複合体中のスロ
ンビン成分の決定基を認識するモノクローナル抗体及び
その誘導体も好ましい。
【００２２】ヒルジンが組換えヒルジン変形体１（ｒＨ
Ｖ１）であるスロンビン／ヒルジン−複合体に対して向
けられておりそして該複合体中のスロンビン成分を認識
するモノクローナル抗体及びその誘導体が特に好まし
い。モノクローナル抗体のこの後者の群において、スロ
ンビンがヒルジンに又は固体表面に結合している時にの
み抗体結合のために露出されるスロンビン成分の決定基
を認識するがしかし溶液中の遊離スロンビンを認識しな
いモノクローナル抗体及びその誘導体が特に好ましい。
特に好ましいモノクローナル抗体及びその誘導体の例は
ＭＡｂ４１０７−７６−１と称するモノクローナル抗体
及びその誘導体である。
Ｖ１）であるスロンビン／ヒルジン−複合体に対して向
けられておりそして該複合体中のスロンビン成分を認識
するモノクローナル抗体及びその誘導体が特に好まし
い。モノクローナル抗体のこの後者の群において、スロ
ンビンがヒルジンに又は固体表面に結合している時にの
み抗体結合のために露出されるスロンビン成分の決定基
を認識するがしかし溶液中の遊離スロンビンを認識しな
いモノクローナル抗体及びその誘導体が特に好ましい。
特に好ましいモノクローナル抗体及びその誘導体の例は
ＭＡｂ４１０７−７６−１と称するモノクローナル抗体
及びその誘導体である。
【００２３】本発明のモノクローナル抗体の誘導体はそ
れが由来する抗体の特異性を維持しているものであり、
すなわちそれらは親抗体の特徴的結合パターンを維持し
ている。この様な誘導体の例として、酵素、蛍光マーカ
ー、化学発光マーカー、金属キレート、常磁性粒子、ア
ビジン、ビオチン等との結合体、又は放射能ラベルされ
たモノクローナル抗体、又はモノクローナル抗体断片で
ある。本発明の抗体結合体のために使用される酵素は、
例えば、西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、グルコアミラーゼ、カーボニックアンヒドラ
ーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リン
ゴ酸デヒドロゲナーゼ又はグルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼである。
れが由来する抗体の特異性を維持しているものであり、
すなわちそれらは親抗体の特徴的結合パターンを維持し
ている。この様な誘導体の例として、酵素、蛍光マーカ
ー、化学発光マーカー、金属キレート、常磁性粒子、ア
ビジン、ビオチン等との結合体、又は放射能ラベルされ
たモノクローナル抗体、又はモノクローナル抗体断片で
ある。本発明の抗体結合体のために使用される酵素は、
例えば、西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、グルコアミラーゼ、カーボニックアンヒドラ
ーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リン
ゴ酸デヒドロゲナーゼ又はグルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼである。
【００２４】本発明の抗体と結合する蛍光マーカーはフ
ルオレッセイン、フルオロクローム、ローダミン等であ
ることができる。化学発光マーカーは化学的構造変化に
際して光を発射する有機分子、例えばルミノール、イソ
ルミノール、ピロガロール、ルシフェリン等である。金
属キレートの例はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）、１，
４，８，１１−テトラザテトラデカン、１，４，８，１
１−テトラザテトラデカン−１，４，８，１１−五酢
酸、１−オキサ−４，７，１２，１５−テトラザヘプタ
デカン−４，７，１２，１５五酢酸である。
ルオレッセイン、フルオロクローム、ローダミン等であ
ることができる。化学発光マーカーは化学的構造変化に
際して光を発射する有機分子、例えばルミノール、イソ
ルミノール、ピロガロール、ルシフェリン等である。金
属キレートの例はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）、１，
４，８，１１−テトラザテトラデカン、１，４，８，１
１−テトラザテトラデカン−１，４，８，１１−五酢
酸、１−オキサ−４，７，１２，１５−テトラザヘプタ
デカン−４，７，１２，１５五酢酸である。
【００２５】この様な結合体中で抗体は結合パートナー
に直接結合し、又はスペーサーもしくはリンカー基を介
して結合している。本発明の放射能ラベルされた抗体
は、例えば、放射能ヨウ素（123 Ｉ，125 Ｉ，
131 Ｉ）、トリチウム（3 Ｈ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（
35Ｓ）、イッテリウム（90Ｙ）、テクネチウム（99m Ｔ
C ) 、等を含有している。本発明の抗体断片は例えば断
片Ｆａｂ，Ｆａｂ′、又はＦ（ａｂ′）2 である。
に直接結合し、又はスペーサーもしくはリンカー基を介
して結合している。本発明の放射能ラベルされた抗体
は、例えば、放射能ヨウ素（123 Ｉ，125 Ｉ，
131 Ｉ）、トリチウム（3 Ｈ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（
35Ｓ）、イッテリウム（90Ｙ）、テクネチウム（99m Ｔ
C ) 、等を含有している。本発明の抗体断片は例えば断
片Ｆａｂ，Ｆａｂ′、又はＦ（ａｂ′）2 である。
【００２６】本発明のモノクローナル抗体及びその誘導
体はそれ自体既知の方法により得られ、この場合、目的
とするモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマセ
ルラインの細胞を生体内又は生体外で増加させ、そして
必要であれば得られた抗体を単離し、そして／又はその
誘導体に転換する。
体はそれ自体既知の方法により得られ、この場合、目的
とするモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマセ
ルラインの細胞を生体内又は生体外で増加させ、そして
必要であれば得られた抗体を単離し、そして／又はその
誘導体に転換する。
【００２７】生体外での増加は通常の標準的培地である
適当な培地、例えばダルベコの改変イーグル培地（Dulb
ecco's Modified Eagle Medium;DEME)、又はＲＰＭＩ１
６４０培地であって、場合によっては哺乳類血清、例え
ばウシ胎児血清、又は微量元素及び増殖維持補充剤、例
えばフィーダー細胞、例えば正常マウス腹腔滲出細胞、
脾細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、
インシュリン、トランスフェリン、低密度リポプロテイ
ン、オレイン等を補給したものの中で行われる。
適当な培地、例えばダルベコの改変イーグル培地（Dulb
ecco's Modified Eagle Medium;DEME)、又はＲＰＭＩ１
６４０培地であって、場合によっては哺乳類血清、例え
ばウシ胎児血清、又は微量元素及び増殖維持補充剤、例
えばフィーダー細胞、例えば正常マウス腹腔滲出細胞、
脾細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、
インシュリン、トランスフェリン、低密度リポプロテイ
ン、オレイン等を補給したものの中で行われる。
【００２８】生体外生産は比較的純粋な抗体調製物を措
握し、そして目的とする抗体を多量に得るためのスケー
ルアップを許容する。組織培養条件下での哺乳類細胞培
養の技法は当業界においてよく知られており、そして例
えばエアーリフト反応器もしくは連続攪伴反応器中での
均一懸濁培養、又は中空ファイバー中、マクロカプセル
中、アガロースマイクロビーズ上もしくはセラミックカ
ートリッジ上での固定化もしくは捕捉細胞培養が含まれ
る。
握し、そして目的とする抗体を多量に得るためのスケー
ルアップを許容する。組織培養条件下での哺乳類細胞培
養の技法は当業界においてよく知られており、そして例
えばエアーリフト反応器もしくは連続攪伴反応器中での
均一懸濁培養、又は中空ファイバー中、マクロカプセル
中、アガロースマイクロビーズ上もしくはセラミックカ
ートリッジ上での固定化もしくは捕捉細胞培養が含まれ
る。
【００２９】モノクローナル抗体の単離のためには、培
養上清中の免疫グロブリンをまず、例えば、硫酸アンモ
ニウムによる沈澱、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
のごとき吸湿性材料に対しての透析、選択膜を通しての
濾過等により濃縮する。必要であれば、そして／又は望
ましければ、濃縮された抗体を通常のクロマトグラフィ
ー法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ＤＥＡＥ−セルロースもしくはプロテインＡでのク
ロマトグラフィー、又はイムノアフィニティークロマト
グラフィーにより精製することができる。
養上清中の免疫グロブリンをまず、例えば、硫酸アンモ
ニウムによる沈澱、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
のごとき吸湿性材料に対しての透析、選択膜を通しての
濾過等により濃縮する。必要であれば、そして／又は望
ましければ、濃縮された抗体を通常のクロマトグラフィ
ー法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ＤＥＡＥ−セルロースもしくはプロテインＡでのク
ロマトグラフィー、又はイムノアフィニティークロマト
グラフィーにより精製することができる。
【００３０】細胞を生体内増殖させることにより多量の
目的とする抗体を得ることができる。この目的のため、
目的とする抗体を産生するハイブリドーマ細胞を組織適
合性哺乳類に注射して抗体産生腫瘍の増殖を惹起する。
場合によっては、前記の注射の前に、炭化水素、特に鉱
油、例えばプリスタン（テトラメチルペンタデカン）に
よりプライムする。１〜３週間後、それらの哺乳類の体
液から抗体を単離する。例えば、目的とするモノクロー
ナル抗体を生産するＢａｌｂ／ｃマウス由来のハイブリ
ドーマ細胞を、場合によってはプリスタンにより前処理
されたＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、そして１〜
２週間後に該動物から腹水を採取する。
目的とする抗体を得ることができる。この目的のため、
目的とする抗体を産生するハイブリドーマ細胞を組織適
合性哺乳類に注射して抗体産生腫瘍の増殖を惹起する。
場合によっては、前記の注射の前に、炭化水素、特に鉱
油、例えばプリスタン（テトラメチルペンタデカン）に
よりプライムする。１〜３週間後、それらの哺乳類の体
液から抗体を単離する。例えば、目的とするモノクロー
ナル抗体を生産するＢａｌｂ／ｃマウス由来のハイブリ
ドーマ細胞を、場合によってはプリスタンにより前処理
されたＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、そして１〜
２週間後に該動物から腹水を採取する。
【００３１】本発明のモノクローナル抗体の結合体は当
業界において知られている方法により、例えば前記のよ
うにして調製した抗体を、カップリング剤、例えばグル
タルアルデヒド、過ヨウ素酸塩、Ｎ，Ｎ′−ｏ−フェニ
レンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオ
キシ）−サクシンイミド、Ｎ−（３−〔２′−ピリジル
ジチオ〕−プロピオノキシ）−サクシンイミド、Ｎ−エ
チル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボ
ジイミド等の存在下で反応せしめることにより製造され
る。ビオチンとの結合体は例えば抗体をビオチンの活性
化エステル、例えばビオチンＮ−ヒドロキシサクシンイ
ミドエステルと反応せしめることにより製造される。蛍
光マーカー又は化学発光マーカーとの結合体は、カップ
リング剤、例えば上記のものの存在下で、又はイソチオ
シアネート、例えばフルオレッセイン−イソチオシアネ
ートとの反応により製造される。
業界において知られている方法により、例えば前記のよ
うにして調製した抗体を、カップリング剤、例えばグル
タルアルデヒド、過ヨウ素酸塩、Ｎ，Ｎ′−ｏ−フェニ
レンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオ
キシ）−サクシンイミド、Ｎ−（３−〔２′−ピリジル
ジチオ〕−プロピオノキシ）−サクシンイミド、Ｎ−エ
チル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボ
ジイミド等の存在下で反応せしめることにより製造され
る。ビオチンとの結合体は例えば抗体をビオチンの活性
化エステル、例えばビオチンＮ−ヒドロキシサクシンイ
ミドエステルと反応せしめることにより製造される。蛍
光マーカー又は化学発光マーカーとの結合体は、カップ
リング剤、例えば上記のものの存在下で、又はイソチオ
シアネート、例えばフルオレッセイン−イソチオシアネ
ートとの反応により製造される。
【００３２】ヨウ素（123 Ｉ，125 Ｉ，131 Ｉ）により
放射性ラベルされたモノクローナル抗体は、本発明の抗
体から、それ自体既知のヨウド化法により、例えば放射
性ヨウ化ナトリウムもしくはヨウ化カリウムと化学酸化
剤、例えば亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴ等、又は
酵素的酸化剤、例えばラクトパーオキシダーゼもしくは
グルコースオキシダーゼとグルコース、とを用いるヨウ
素化により得られる。本発明の抗体はイットリウム（90
Ｙ）により、例えばジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰ
ＴＡ）−キレート化を用いてラベルされる。
放射性ラベルされたモノクローナル抗体は、本発明の抗
体から、それ自体既知のヨウド化法により、例えば放射
性ヨウ化ナトリウムもしくはヨウ化カリウムと化学酸化
剤、例えば亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴ等、又は
酵素的酸化剤、例えばラクトパーオキシダーゼもしくは
グルコースオキシダーゼとグルコース、とを用いるヨウ
素化により得られる。本発明の抗体はイットリウム（90
Ｙ）により、例えばジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰ
ＴＡ）−キレート化を用いてラベルされる。
【００３３】テクネチウム９９ｍでラベルされた抗体は
リガンド交換法により、例えば過酸化テクネチウム（Ｔ
C Ｏ4 - ) を第一錫溶液で還元し、還元されたテクネチ
ウムをセファデックスカラムにキレート化し、そしてこ
のカラムに抗体を適用することにより、又は直接ラベル
化法により、例えば過酸化テクネチウム、Ｓn Ｃｌ2の
ごとき還元剤、フタル酸ナトリウムカリウム溶液のごと
き緩衝液、及び抗体をインキュベートすることにより製
造される。
リガンド交換法により、例えば過酸化テクネチウム（Ｔ
C Ｏ4 - ) を第一錫溶液で還元し、還元されたテクネチ
ウムをセファデックスカラムにキレート化し、そしてこ
のカラムに抗体を適用することにより、又は直接ラベル
化法により、例えば過酸化テクネチウム、Ｓn Ｃｌ2の
ごとき還元剤、フタル酸ナトリウムカリウム溶液のごと
き緩衝液、及び抗体をインキュベートすることにより製
造される。
【００３４】本発明のモノクローナル抗体の断片、例え
ばＦａｂ，Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）2 は、前記のよう
にして製造したモノクローナル抗体からそれ自体既知の
方法により、例えばパパインもしくはペプシンのごとき
酵素による消化、及び／又は化学還元によりジスルフィ
ド結合の開裂により得ることができる。本発明はまた、
本発明のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ
セルライン、特に、スロンビン／ＨＶ１−複合体又はス
ロンビン／ｒＨＶ−複合体、好ましくはスロンビン／ｒ
ＨＶ１−複合に対して向けられたモノクローナル抗体を
分泌するハイブリドーマセルラインに関する。
ばＦａｂ，Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）2 は、前記のよう
にして製造したモノクローナル抗体からそれ自体既知の
方法により、例えばパパインもしくはペプシンのごとき
酵素による消化、及び／又は化学還元によりジスルフィ
ド結合の開裂により得ることができる。本発明はまた、
本発明のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ
セルライン、特に、スロンビン／ＨＶ１−複合体又はス
ロンビン／ｒＨＶ−複合体、好ましくはスロンビン／ｒ
ＨＶ１−複合に対して向けられたモノクローナル抗体を
分泌するハイブリドーマセルラインに関する。
【００３５】特に、本発明は目的とする抗体を分泌する
ハイブリドーマセルラインに関し、このセルラインは、
適当なキャリャーに連結されたヒルジンにより又はスロ
ンビン／ヒルジン−複合体により免疫された哺乳類のＢ
リンパ球と骨髄腫細胞とのハイブリドである。好ましい
哺乳類及びキャリャーは後で詳細に記載する。適当なキ
ャリャーに連結された組換ヒルジン変形体１（ｒＨＶ
１）又はスロンビン／ｒＨＶ１−複合体により免疫され
たマウスのＢリンパ球とマウス骨髄腫細胞とのハイブリ
ドである本発明のハイブリドセルラインが好ましい。
ハイブリドーマセルラインに関し、このセルラインは、
適当なキャリャーに連結されたヒルジンにより又はスロ
ンビン／ヒルジン−複合体により免疫された哺乳類のＢ
リンパ球と骨髄腫細胞とのハイブリドである。好ましい
哺乳類及びキャリャーは後で詳細に記載する。適当なキ
ャリャーに連結された組換ヒルジン変形体１（ｒＨＶ
１）又はスロンビン／ｒＨＶ１−複合体により免疫され
たマウスのＢリンパ球とマウス骨髄腫細胞とのハイブリ
ドである本発明のハイブリドセルラインが好ましい。
【００３６】４１５８−８１−７及び４１０７−７６−
１と命名され、そしてEuropean Collection of Animal
Cell Cultures (ECACC) 、HPLS Certre for Applied Mi
crobiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wil
ts, SP4 OJG,英国、にそれぞれ寄託番号９００６１４０
５及び９００６１４０４のもとに１９９０年６月１４日
に寄託されたハイブリドーマセルラインが特に好まし
い。本発明のセルラインは一般に安定であり、一定の特
異性を有する本発明のモノクローナル抗体を分泌し、そ
して深冷凍結した培養物中に保存することができそして
解凍及び場合によっては再クローニングにより再活性化
することができる。
１と命名され、そしてEuropean Collection of Animal
Cell Cultures (ECACC) 、HPLS Certre for Applied Mi
crobiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wil
ts, SP4 OJG,英国、にそれぞれ寄託番号９００６１４０
５及び９００６１４０４のもとに１９９０年６月１４日
に寄託されたハイブリドーマセルラインが特に好まし
い。本発明のセルラインは一般に安定であり、一定の特
異性を有する本発明のモノクローナル抗体を分泌し、そ
して深冷凍結した培養物中に保存することができそして
解凍及び場合によっては再クローニングにより再活性化
することができる。
【００３７】本発明はまた、本発明のモノクローナル抗
体を分泌するバイブリドーマセルラインの製造方法に関
し、この方法においては適当な動物を適当なキャリャー
に連結されたヒルジンにより又はスロンビン／ヒルジン
−複合体により免疫し、該動物の抗体産生細胞を連続セ
ルラインの細胞と融合せしめ、この融合により得られた
ハイブリド細胞をクローニングし、そして目的とするモ
ノクローナル抗体を分泌する細胞クローンを選択する。
体を分泌するバイブリドーマセルラインの製造方法に関
し、この方法においては適当な動物を適当なキャリャー
に連結されたヒルジンにより又はスロンビン／ヒルジン
−複合体により免疫し、該動物の抗体産生細胞を連続セ
ルラインの細胞と融合せしめ、この融合により得られた
ハイブリド細胞をクローニングし、そして目的とするモ
ノクローナル抗体を分泌する細胞クローンを選択する。
【００３８】本発明のモノクローナル抗体を誘導するた
めの免疫原は、ヒルジン、特にヒルジン変形体ＨＶ１、
組換えヒルジン（ｒＨＶ）もしくは好ましくは組換ヒル
ジン変形体ＨＶ１（ｒＨＶ１）の免疫原性結合体、又は
スロンビン／ヒルジン−複合体、特にヒルジン／ＨＶ１
−複合体、もしくはスロンビン／ｒＨＶ−複合体、もし
くは好ましくはスロンビン／ｒＨＶ１−複合体である。
キャリャーにヒルジンを連結することによる免疫原性ヒ
ルジン結合体の形成は、それ自体としては弱い免疫原に
過ぎないヒルジンの免疫原性を増強するために必要であ
る。
めの免疫原は、ヒルジン、特にヒルジン変形体ＨＶ１、
組換えヒルジン（ｒＨＶ）もしくは好ましくは組換ヒル
ジン変形体ＨＶ１（ｒＨＶ１）の免疫原性結合体、又は
スロンビン／ヒルジン−複合体、特にヒルジン／ＨＶ１
−複合体、もしくはスロンビン／ｒＨＶ−複合体、もし
くは好ましくはスロンビン／ｒＨＶ１−複合体である。
キャリャーにヒルジンを連結することによる免疫原性ヒ
ルジン結合体の形成は、それ自体としては弱い免疫原に
過ぎないヒルジンの免疫原性を増強するために必要であ
る。
【００３９】適当なキャリャー分子は例えば、連結のた
めに利用可能な遊離アミノ基を有するリジンに富む蛋白
質、特に高分子量蛋白質、例えばウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ：ＭＷ６６，２００）、バシルズ・ズブチリス
（Bacillus subtilis)からのα−アミラーゼ（ＭＷ５
８，０００）又はキーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ：ＭＷ７１，０００，０００）であって商業的
に多量に入手可能なものである。ブタチログロブリン
（thyroglobulin)、破傷風トキシン、マレラトキシンも
しくはジフテリアトキシンのごときトキシン、ヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）、β−２マイクログロブリン等に
キャリャーとして使用することができる。
めに利用可能な遊離アミノ基を有するリジンに富む蛋白
質、特に高分子量蛋白質、例えばウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ：ＭＷ６６，２００）、バシルズ・ズブチリス
（Bacillus subtilis)からのα−アミラーゼ（ＭＷ５
８，０００）又はキーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ：ＭＷ７１，０００，０００）であって商業的
に多量に入手可能なものである。ブタチログロブリン
（thyroglobulin)、破傷風トキシン、マレラトキシンも
しくはジフテリアトキシンのごときトキシン、ヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）、β−２マイクログロブリン等に
キャリャーとして使用することができる。
【００４０】マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対する精製され
たラビットＩｇＧ分画（Kawamura &Berzofsky, J. Immu
nol. 136, 58, 1986 ）もキャリャーとして使用するこ
とができる。他の可能性あるキャリャー分子にはポリサ
ッカライド、天然もしくは合成リポポリサッカライド、
ポリリジンのごとき合成ポリペプチド、活性化された
膜、ラテックス粒子、サルモネラ（Salmonella) のごと
き細菌が含まれる。
たラビットＩｇＧ分画（Kawamura &Berzofsky, J. Immu
nol. 136, 58, 1986 ）もキャリャーとして使用するこ
とができる。他の可能性あるキャリャー分子にはポリサ
ッカライド、天然もしくは合成リポポリサッカライド、
ポリリジンのごとき合成ポリペプチド、活性化された
膜、ラテックス粒子、サルモネラ（Salmonella) のごと
き細菌が含まれる。
【００４１】ヒルジン、特にヒルジン変形体ＨＶ１がキ
ーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に連結され
ている免疫原性ヒルジン結合体が好ましい。組換えヒル
ジン変形体ＨＶ１（ｒＨＶ１）がＫＬＨに連結されてい
る免疫原性ヒルジン結合体が特に好ましい。
ーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に連結され
ている免疫原性ヒルジン結合体が好ましい。組換えヒル
ジン変形体ＨＶ１（ｒＨＶ１）がＫＬＨに連結されてい
る免疫原性ヒルジン結合体が特に好ましい。
【００４２】ヒルジン結合体はそれ自体既知の方法によ
り、キャリャーへのヒルジンの吸着により、又は過ヨウ
素酸塩、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、例えば
Ｎ，Ｎ′−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−マ
レイミドベンゾイルオキシ）−サクシンイミド、Ｎ−
（３−〔２′−ピリジルジチオ〕−プロピオノキシ）−
サクシンイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−カルボジイミド等を用いる連結により調
製される。カルボキシル基を介してのカップリングが意
図される場合、ヒルジンのアミノ基をまず例えばアセチ
ル基又はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基によるアシル
化により保護することができる。
り、キャリャーへのヒルジンの吸着により、又は過ヨウ
素酸塩、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、例えば
Ｎ，Ｎ′−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−マ
レイミドベンゾイルオキシ）−サクシンイミド、Ｎ−
（３−〔２′−ピリジルジチオ〕−プロピオノキシ）−
サクシンイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−カルボジイミド等を用いる連結により調
製される。カルボキシル基を介してのカップリングが意
図される場合、ヒルジンのアミノ基をまず例えばアセチ
ル基又はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基によるアシル
化により保護することができる。
【００４３】免疫感作に使用されるスロンビン／ヒルジ
ン−複合体は、ヒルジンをスロンビンと混合することに
より、特に過剰のヒルジンをスロンビンと混合すること
により調製される。スロンビン／ヒルジン−複合体は、
ゲル濾過高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によ
り遊離のヒルジンから分離することができる。免疫感作
のため、免疫原性ヒルジン結合体又はスロンビン／ヒル
ジン−複合体はアジュバント、すなわち免疫応答をさら
に強化する薬剤と混合することができる。可能性あるア
ジュバントはフロインド（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全アジュ
バント（鉱油、水及びミコバクテリア抽出物の乳剤）、
フロインドの不完全アジュバント（水と油のみの乳
剤）、鉱物質ゲル、例えば水酸化アルミニウムゲル、界
面活性剤、例えばリソレシチン、ポリアミン、ペプチ
ド、ＢＣＧ（Bacillus Calmette-Guerin) 等である。
ン−複合体は、ヒルジンをスロンビンと混合することに
より、特に過剰のヒルジンをスロンビンと混合すること
により調製される。スロンビン／ヒルジン−複合体は、
ゲル濾過高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によ
り遊離のヒルジンから分離することができる。免疫感作
のため、免疫原性ヒルジン結合体又はスロンビン／ヒル
ジン−複合体はアジュバント、すなわち免疫応答をさら
に強化する薬剤と混合することができる。可能性あるア
ジュバントはフロインド（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全アジュ
バント（鉱油、水及びミコバクテリア抽出物の乳剤）、
フロインドの不完全アジュバント（水と油のみの乳
剤）、鉱物質ゲル、例えば水酸化アルミニウムゲル、界
面活性剤、例えばリソレシチン、ポリアミン、ペプチ
ド、ＢＣＧ（Bacillus Calmette-Guerin) 等である。
【００４４】免疫原はそれらを外来分子として認識する
適当な哺乳類、例えばマウス、ラット、ラビット、ロ
バ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ又はチンパンジー、特に
マウス又はラット、好ましくはマウスを免疫するために
使用される。Ｂａｌｂ／ｃマウスが特に好ましい。
適当な哺乳類、例えばマウス、ラット、ラビット、ロ
バ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ又はチンパンジー、特に
マウス又はラット、好ましくはマウスを免疫するために
使用される。Ｂａｌｂ／ｃマウスが特に好ましい。
【００４５】免疫感作の経路は特に、膚内、膚下、筋肉
内、腹腔内、血管内及び頭蓋内注射が含まれる。高抗体
価が望ましいので、一連の注射が一般に与えられる。免
疫感作に例えば、免疫原性ヒルジン結合体を、場合によ
っては不完全又は完全フロインドアジュバントと混合し
て、３〜８回非経膓的に例えば、膓腔内及び／又は皮下
に、１０〜５０μｇの量でＢａｌｂ／ｃマウスに１〜３
週間の間隔で注射し、続いて約５０〜５００μｇを最後
免疫から１〜３ヶ月後に追加免疫注射することにより行
う。
内、腹腔内、血管内及び頭蓋内注射が含まれる。高抗体
価が望ましいので、一連の注射が一般に与えられる。免
疫感作に例えば、免疫原性ヒルジン結合体を、場合によ
っては不完全又は完全フロインドアジュバントと混合し
て、３〜８回非経膓的に例えば、膓腔内及び／又は皮下
に、１０〜５０μｇの量でＢａｌｂ／ｃマウスに１〜３
週間の間隔で注射し、続いて約５０〜５００μｇを最後
免疫から１〜３ヶ月後に追加免疫注射することにより行
う。
【００４６】最終注射の後例えば１〜６日で採取した、
免疫されたマウスからの抗体産生細胞、好ましくは脾臓
リンパ球のごときリンパ球を、連続セルライン、すなわ
ち融合から生ずるハイブリドーマ細胞にその複製能力を
付与する連結複製セルクローン、の細胞と融合せしめ
る。この様なセルラインの例は、それ自体は実際には免
疫グロブリン又はその断片を生産しないがしかし大量の
抗体を生産しそして分泌する能力を有し、そしてハイブ
リド細胞が未融合の親細胞に対して選択され得るように
遺伝マーカーを担持する腫瘍セルライン（骨髄腫）であ
る。幾つかの適当な骨髄腫セルラインが当業界において
知られている。
免疫されたマウスからの抗体産生細胞、好ましくは脾臓
リンパ球のごときリンパ球を、連続セルライン、すなわ
ち融合から生ずるハイブリドーマ細胞にその複製能力を
付与する連結複製セルクローン、の細胞と融合せしめ
る。この様なセルラインの例は、それ自体は実際には免
疫グロブリン又はその断片を生産しないがしかし大量の
抗体を生産しそして分泌する能力を有し、そしてハイブ
リド細胞が未融合の親細胞に対して選択され得るように
遺伝マーカーを担持する腫瘍セルライン（骨髄腫）であ
る。幾つかの適当な骨髄腫セルラインが当業界において
知られている。
【００４７】酵素ヒポキサンチンガアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は酵素チミジン
キナゼ（ＴＫ）を欠いており、そしてそれ故にヒポキサ
ンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する選択培
地（ＨＡＴ培地）中で生存しない骨髄腫セルラインが好
ましい。ＨＡＴ培地中で生存せずそして免疫グロブリン
又はその断片を分泌しない骨髄腫細胞及びそれに由来す
るセルライン、特にマウス骨髄腫セルラインＳｐ２／０
−Ａｇ１４(Shulmanら、Nature 276, 269, 1978)又はＸ
６３−Ａｇ８．６５３(Kearneyら、J.Immunol. 123,154
8,1976）（Ｆｌｏｗから商業的に入手可能）、あるいは
マウス骨髄腫セルラインＰＡＩ(Stockerら、Resarch Di
sclosure No.21713,1982) が特に好ましい。
ルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は酵素チミジン
キナゼ（ＴＫ）を欠いており、そしてそれ故にヒポキサ
ンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する選択培
地（ＨＡＴ培地）中で生存しない骨髄腫セルラインが好
ましい。ＨＡＴ培地中で生存せずそして免疫グロブリン
又はその断片を分泌しない骨髄腫細胞及びそれに由来す
るセルライン、特にマウス骨髄腫セルラインＳｐ２／０
−Ａｇ１４(Shulmanら、Nature 276, 269, 1978)又はＸ
６３−Ａｇ８．６５３(Kearneyら、J.Immunol. 123,154
8,1976）（Ｆｌｏｗから商業的に入手可能）、あるいは
マウス骨髄腫セルラインＰＡＩ(Stockerら、Resarch Di
sclosure No.21713,1982) が特に好ましい。
【００４８】融合は融合促進剤、例えば場合によっては
ＵＶ−不活性化形のＳｅｎｄａｉウイルスもしくは他の
パラミクソウイルス、又は化学融合原、例えばカルシウ
ムイオン、界面活性脂質、例えばリソレシチン、又はポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下で、あるいは
電気融合（electrofusion)により行われる。好ましく
は、骨髄腫細胞を、分子量１０００〜４０００のポリエ
チレングリコール約３０〜約６０％を含有する溶液中
で、免疫された哺乳類からの３〜２０倍過剰量の脾細胞
と融合せしめる。
ＵＶ−不活性化形のＳｅｎｄａｉウイルスもしくは他の
パラミクソウイルス、又は化学融合原、例えばカルシウ
ムイオン、界面活性脂質、例えばリソレシチン、又はポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下で、あるいは
電気融合（electrofusion)により行われる。好ましく
は、骨髄腫細胞を、分子量１０００〜４０００のポリエ
チレングリコール約３０〜約６０％を含有する溶液中
で、免疫された哺乳類からの３〜２０倍過剰量の脾細胞
と融合せしめる。
【００４９】融合の後、遺伝的選択マーカーに依存して
選択された選択培地、例えばＨＡＴ培地中で再懸濁し、
そして培養する。この培地中でハイブリドーマ細胞のみ
が生存する。なぜならこれらは、親細胞に由来する生体
外で増殖する能力を有し併せて、免疫された哺乳類の抗
体産生脾細胞に由来するＨＡＴ培地中で存在するために
必須のＨＧＰＲＴ又はＴＫ遺伝子欠失を有するからであ
る。
選択された選択培地、例えばＨＡＴ培地中で再懸濁し、
そして培養する。この培地中でハイブリドーマ細胞のみ
が生存する。なぜならこれらは、親細胞に由来する生体
外で増殖する能力を有し併せて、免疫された哺乳類の抗
体産生脾細胞に由来するＨＡＴ培地中で存在するために
必須のＨＧＰＲＴ又はＴＫ遺伝子欠失を有するからであ
る。
【００５０】ハイブリドーマ拡大のための適当な培地は
標準的培地、例えばDulbecoo's Modified Eagle Medium
(DMEM),最少必須培地、ＲＰＭＩ１６４０等であって、
場合によっては哺乳類血清例えば１０〜１５％のウシ胎
児血清が補充されたものである。好ましくは、フィーダ
ー細胞、例えば正常マウス腹腔滲出細胞、脾細胞、骨髄
マクロファージ等を細胞増殖の開始膜であって融合段階
の直後に添加して、特に細胞密度が低い場合、増殖因子
等を提供することによってハイブリドーマに栄養を与え
そしてその増殖を支持する。培地には、骨髄細胞がハイ
ブリドーマ細胞を圧倒するのを防止するために選択培地
を補給する。
標準的培地、例えばDulbecoo's Modified Eagle Medium
(DMEM),最少必須培地、ＲＰＭＩ１６４０等であって、
場合によっては哺乳類血清例えば１０〜１５％のウシ胎
児血清が補充されたものである。好ましくは、フィーダ
ー細胞、例えば正常マウス腹腔滲出細胞、脾細胞、骨髄
マクロファージ等を細胞増殖の開始膜であって融合段階
の直後に添加して、特に細胞密度が低い場合、増殖因子
等を提供することによってハイブリドーマに栄養を与え
そしてその増殖を支持する。培地には、骨髄細胞がハイ
ブリドーマ細胞を圧倒するのを防止するために選択培地
を補給する。
【００５１】ハイブリドーマ細胞上清を目的とするモノ
クローナル抗体についてイムノアッセイにより、好まし
くはラジオイムノアッセイ又はエンザイムイムノアッセ
イによりスクリーニングする。例えば、マイクロタイタ
ープレートのごとき適当なキャリャーをスロンビン／ヒ
ルジン−複合体によりコートし、そして試験されるべき
ハイブリドーマ上清と共にインキュベートする。次に、
キャリャー上のスロンビン／ヒルジン−複合体に結合し
た抗体を認識する酵素ラベルされた抗体及び基質溶液を
添加し、そして抗体−スロンビン／ヒルジン−複合体に
結合したラベルされた抗体を、キャリャーに結合した酵
素ラベルを測定することにより検出する。
クローナル抗体についてイムノアッセイにより、好まし
くはラジオイムノアッセイ又はエンザイムイムノアッセ
イによりスクリーニングする。例えば、マイクロタイタ
ープレートのごとき適当なキャリャーをスロンビン／ヒ
ルジン−複合体によりコートし、そして試験されるべき
ハイブリドーマ上清と共にインキュベートする。次に、
キャリャー上のスロンビン／ヒルジン−複合体に結合し
た抗体を認識する酵素ラベルされた抗体及び基質溶液を
添加し、そして抗体−スロンビン／ヒルジン−複合体に
結合したラベルされた抗体を、キャリャーに結合した酵
素ラベルを測定することにより検出する。
【００５２】陽性ハイブリドーマ細胞を、例えば限界希
釈法により又はソフトアガー中で好ましくは２〜３回ク
ローニングする。場合によっては、腹腔内注射及び腹水
の回収によってハイブリドーマ細胞を動物、例えばマウ
スを通して継代し、これによりハイブリドーマを安定化
しそして増殖特性を改善する。クローン化されたセルラ
インは常法に従って凍結することができる。
釈法により又はソフトアガー中で好ましくは２〜３回ク
ローニングする。場合によっては、腹腔内注射及び腹水
の回収によってハイブリドーマ細胞を動物、例えばマウ
スを通して継代し、これによりハイブリドーマを安定化
しそして増殖特性を改善する。クローン化されたセルラ
インは常法に従って凍結することができる。
【００５３】本発明のモノクローナル抗体及びその誘導
体は多くの生体内及び生体外医療目的のために有用であ
り、そのすべてが、スロンビン／ヒルジン−複合体の定
性的及び／又は定性的測定に基いている。特に、本発明
のモノクローナル抗体及びその誘導体は、特に血栓異状
を有する高危険部及び患者において、血栓症の早期診断
のために用いることができる。
体は多くの生体内及び生体外医療目的のために有用であ
り、そのすべてが、スロンビン／ヒルジン−複合体の定
性的及び／又は定性的測定に基いている。特に、本発明
のモノクローナル抗体及びその誘導体は、特に血栓異状
を有する高危険部及び患者において、血栓症の早期診断
のために用いることができる。
【００５４】これは、ヒルジンをトレーサーとして注射
し次に形成された複合体を測定することにより自然に生
じた少量のスロンビンを検出し、こうしてヒルジン治療
が必要な時又は予防的ヒルジン療法が当を得ている時を
決定することにより達成される。さらに、本発明のモノ
クローナル抗体及びその誘導体は、ヒルジン活性を測定
することによりヒルジン療法をモニターするため、ヒル
ジンの正しい投与量を確立するため、及び疾患の可能性
ある進行を記録するために有用である。
し次に形成された複合体を測定することにより自然に生
じた少量のスロンビンを検出し、こうしてヒルジン治療
が必要な時又は予防的ヒルジン療法が当を得ている時を
決定することにより達成される。さらに、本発明のモノ
クローナル抗体及びその誘導体は、ヒルジン活性を測定
することによりヒルジン療法をモニターするため、ヒル
ジンの正しい投与量を確立するため、及び疾患の可能性
ある進行を記録するために有用である。
【００５５】スロンビン／ヒルジン−複合体の定量のた
め、本発明のモノクローナル抗体及び／又はその誘導体
を、例えば、スロンビン／ヒルジン−複合体分子の抗原
決定基とモノクローナル抗体のパラトープとの間の結合
相互作用に基く既知のイムノアッセイのいずれかにおい
て使用することができる。この様なアッセイの例として
ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、フ
ルオレッセンスイムノアッセイ、化学発光イムノアッセ
イ、免疫沈澱イムノアッセイ、ラテックス凝集イムノア
ッセイ、ヘマグルチネーションイムノアッセイ、レーザ
ー光攪乱又はエバネッセント（evanescent）光試験が挙
げられる。
め、本発明のモノクローナル抗体及び／又はその誘導体
を、例えば、スロンビン／ヒルジン−複合体分子の抗原
決定基とモノクローナル抗体のパラトープとの間の結合
相互作用に基く既知のイムノアッセイのいずれかにおい
て使用することができる。この様なアッセイの例として
ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、フ
ルオレッセンスイムノアッセイ、化学発光イムノアッセ
イ、免疫沈澱イムノアッセイ、ラテックス凝集イムノア
ッセイ、ヘマグルチネーションイムノアッセイ、レーザ
ー光攪乱又はエバネッセント（evanescent）光試験が挙
げられる。
【００５６】本発明のモノクローナル抗体はラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）においてそのまま、又は放射性ラ
ベルされた誘導体の形で使用することができる。このよ
うなイムノアッセイにはまた、本発明の抗体のエピトー
プを認識しそして結合するそれ自体既知の放射性ラベル
された抗体を用いる試験方法が含まれる。ＲＩＡの任意
の既知の変法、例えば溶液相（均一）ＲＩＡ、固相（不
均一相）ＲＩＡ、シングルＲＩＡ又はダブル（サンドイ
ッチ）ＲＩＡであってスロンビン／ヒルジン−複合体の
直接又は間接（競争）測定を行うものを用いることがで
きる。
ノアッセイ（ＲＩＡ）においてそのまま、又は放射性ラ
ベルされた誘導体の形で使用することができる。このよ
うなイムノアッセイにはまた、本発明の抗体のエピトー
プを認識しそして結合するそれ自体既知の放射性ラベル
された抗体を用いる試験方法が含まれる。ＲＩＡの任意
の既知の変法、例えば溶液相（均一）ＲＩＡ、固相（不
均一相）ＲＩＡ、シングルＲＩＡ又はダブル（サンドイ
ッチ）ＲＩＡであってスロンビン／ヒルジン−複合体の
直接又は間接（競争）測定を行うものを用いることがで
きる。
【００５７】サンドイッチＲＩＡが好ましく、この方法
においては、適当なキャリャー、例えばポリスチレン、
ポリプロピレンもしくはポリ塩化ビニルのマイクロタイ
タープレートもしくは試験管、ガラスもしくはプラスチ
ックのビーズ、濾紙、デキストラン等、酢酸セルロース
もしくはニトロセルロースシート、磁性粒子、等の表面
に本発明のモノクローナル抗体、好ましくはＭＡｂ４１
０７−７６−１をコートする。
においては、適当なキャリャー、例えばポリスチレン、
ポリプロピレンもしくはポリ塩化ビニルのマイクロタイ
タープレートもしくは試験管、ガラスもしくはプラスチ
ックのビーズ、濾紙、デキストラン等、酢酸セルロース
もしくはニトロセルロースシート、磁性粒子、等の表面
に本発明のモノクローナル抗体、好ましくはＭＡｂ４１
０７−７６−１をコートする。
【００５８】次に、試験溶液、例えばスロンビン／ヒル
ジン−複合体を含有する患者からの血漿、そして最後に
キャリャーに結合した第一のモノクローナル抗体とは異
る抗原のエピトープを認識しそして例えば 125Ｉにより
放射性ラベルされた第二のポリクローナル又はモノクロ
ーナル抗体、好ましくは本発明の放射性ラベルされたモ
ノクローナル抗体、例えばＭＡｂ４１５８−８１−７を
加える。試験溶液中のスロンビン／ヒルジン−複合体の
量は結合した第二抗体の量に直接比例し、そしてキャリ
ャーに結合した放射能を測定することにより決定され
る。
ジン−複合体を含有する患者からの血漿、そして最後に
キャリャーに結合した第一のモノクローナル抗体とは異
る抗原のエピトープを認識しそして例えば 125Ｉにより
放射性ラベルされた第二のポリクローナル又はモノクロ
ーナル抗体、好ましくは本発明の放射性ラベルされたモ
ノクローナル抗体、例えばＭＡｂ４１５８−８１−７を
加える。試験溶液中のスロンビン／ヒルジン−複合体の
量は結合した第二抗体の量に直接比例し、そしてキャリ
ャーに結合した放射能を測定することにより決定され
る。
【００５９】本発明のモノクローナル抗体は、エンザイ
ムイムノアッセイにおいてそれ自体として又は酵素結合
誘導体として使用することができる。この様なイムノア
ッセイにはまた、本発明の抗体のエピトープを認識しそ
して結合するそれ自体既知の酵素ラベルされた抗体を用
いる試験方法が含まれる。ラジオイムノアッセイについ
て前記した様に、エンザイムイムノアッセイの任意の既
知の変法を用いることができる。
ムイムノアッセイにおいてそれ自体として又は酵素結合
誘導体として使用することができる。この様なイムノア
ッセイにはまた、本発明の抗体のエピトープを認識しそ
して結合するそれ自体既知の酵素ラベルされた抗体を用
いる試験方法が含まれる。ラジオイムノアッセイについ
て前記した様に、エンザイムイムノアッセイの任意の既
知の変法を用いることができる。
【００６０】試験は、前記のラジオイムノアッセイと同
様にして、放射能ラベルの代りに酵素ラベルを用いて行
われる。試験溶液中に存在するスロンビン／ヒルジン−
複合体の量に対応する形成された免疫複合体の量が、酵
素基質溶液の添加によって決定される。例えば、酵素基
質反応が、肉眼により又は光学測定装置により観察し得
る色の変化をもたらす。
様にして、放射能ラベルの代りに酵素ラベルを用いて行
われる。試験溶液中に存在するスロンビン／ヒルジン−
複合体の量に対応する形成された免疫複合体の量が、酵
素基質溶液の添加によって決定される。例えば、酵素基
質反応が、肉眼により又は光学測定装置により観察し得
る色の変化をもたらす。
【００６１】エンザイム−リンクドイムノソルベントア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）が好ましく、この方法において
は、ＲＩＡについて前記したようなキャリャーを本発明
のモノクローナル抗体、好ましくはＭＡｂ４１０７−７
６−１によりコートし、スロンビン／ヒルジン−複合体
を含有する試験溶液と共に、キャリャーに結合した第一
のモノクローナル抗体とは異る抗原のエピトープを認識
し、そして酵素と結合している第二のポリクローナル又
はモノクローナル抗体、例えば酵素と結合した本発明の
モノクローナル抗体、例えばＭＡｂ４１５８−８１−７
と共に、そして基質溶液と共にインキュベートする。
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）が好ましく、この方法において
は、ＲＩＡについて前記したようなキャリャーを本発明
のモノクローナル抗体、好ましくはＭＡｂ４１０７−７
６−１によりコートし、スロンビン／ヒルジン−複合体
を含有する試験溶液と共に、キャリャーに結合した第一
のモノクローナル抗体とは異る抗原のエピトープを認識
し、そして酵素と結合している第二のポリクローナル又
はモノクローナル抗体、例えば酵素と結合した本発明の
モノクローナル抗体、例えばＭＡｂ４１５８−８１−７
と共に、そして基質溶液と共にインキュベートする。
【００６２】酵素基質反応が例えば肉眼又は光学測定装
置により観察し得る色の変化をもたらし、試験溶液中の
スロンビン／ヒルジン−錯体の量に比例する結合した酵
素の量を決定することができる。他のエンザイムイムノ
アッセイは上記のものと実質的に同じであるが、キャリ
ャーに結合した本発明の第一のモノクローナル抗体をビ
オチンのごとき小形の化学物質に連結し、そしてラベル
された試薬、例えばアビジン又はストレプトアビジンの
ごときビオチン結合蛋白質により検出する。
置により観察し得る色の変化をもたらし、試験溶液中の
スロンビン／ヒルジン−錯体の量に比例する結合した酵
素の量を決定することができる。他のエンザイムイムノ
アッセイは上記のものと実質的に同じであるが、キャリ
ャーに結合した本発明の第一のモノクローナル抗体をビ
オチンのごとき小形の化学物質に連結し、そしてラベル
された試薬、例えばアビジン又はストレプトアビジンの
ごときビオチン結合蛋白質により検出する。
【００６３】本発明のモノクローナル抗体は化学発光イ
ムノアッセイにおいてそれ自体として又は化学発光マー
カーと結合した誘導体の形で使用することができる。こ
の様なイムノアッセイにはまた、本発明の抗体のエピト
ープを認識し、そして化学発光マーカーと結合したそれ
自体既知の抗体を用いる試験方法が含まれる。ラジオイ
ムノアッセイについて前記したように、化学発光イムノ
アッセイの任意の既知の変法を用いることができる。
ムノアッセイにおいてそれ自体として又は化学発光マー
カーと結合した誘導体の形で使用することができる。こ
の様なイムノアッセイにはまた、本発明の抗体のエピト
ープを認識し、そして化学発光マーカーと結合したそれ
自体既知の抗体を用いる試験方法が含まれる。ラジオイ
ムノアッセイについて前記したように、化学発光イムノ
アッセイの任意の既知の変法を用いることができる。
【００６４】この試験は前記のラジオイムノアッセイと
同様にして、放射能ラベルの代りに化学発光ラベルを用
いて行われる。試験溶液中に存在するスロンビン／ヒル
ジン−複合体に対して向けられた抗体の量に対応する形
成された免疫複合体の量が、発光を開始する化合物例え
ばＨ2 Ｏ2 及びＮａＯＨの添加、並びに光学測定装置に
よる発光の測定により決定される。
同様にして、放射能ラベルの代りに化学発光ラベルを用
いて行われる。試験溶液中に存在するスロンビン／ヒル
ジン−複合体に対して向けられた抗体の量に対応する形
成された免疫複合体の量が、発光を開始する化合物例え
ばＨ2 Ｏ2 及びＮａＯＨの添加、並びに光学測定装置に
よる発光の測定により決定される。
【００６５】モノクローナル抗体及び前記のごときその
誘導体の本発明による使用にはまた、それ自体既知の他
のイムノアッセイ、例えば、抗体又はフルオレッセイン
のごとき蛍光マーカーと結合した抗体誘導体を用いるイ
ムノフルオレッセンスアッセイ、抗体又は抗原によりコ
ートされたラテックス粒子を用いるラテックス凝集、抗
体又は抗原によりコートされた血球を用いる血球凝集、
抗体によりコートされた光ファイバー及び結合現象を電
気又は光シグナルに転換する他の直接作用イムノセンサ
ーを用いるエバレッセント光波測定、等が含まれる。
誘導体の本発明による使用にはまた、それ自体既知の他
のイムノアッセイ、例えば、抗体又はフルオレッセイン
のごとき蛍光マーカーと結合した抗体誘導体を用いるイ
ムノフルオレッセンスアッセイ、抗体又は抗原によりコ
ートされたラテックス粒子を用いるラテックス凝集、抗
体又は抗原によりコートされた血球を用いる血球凝集、
抗体によりコートされた光ファイバー及び結合現象を電
気又は光シグナルに転換する他の直接作用イムノセンサ
ーを用いるエバレッセント光波測定、等が含まれる。
【００６６】前記のアッセイにおける本発明のモノクロ
ーナル抗体及び／又はその誘導体の使用は、１〜２００
ng／mlの濃度範囲での緩衝液、尿及び血漿中のスロンビ
ン／ヒルジン−複合体の存在及び／又は濃度の決定を可
能にする。本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体
及び／又はその誘導体、並びに場合によっては他のモノ
クローナル又はポリクローナル抗体及び／又は付属品を
含んで成る、スロンビン／ヒルジン−複合体の定性及び
定量測定のための試験キットに関する。
ーナル抗体及び／又はその誘導体の使用は、１〜２００
ng／mlの濃度範囲での緩衝液、尿及び血漿中のスロンビ
ン／ヒルジン−複合体の存在及び／又は濃度の決定を可
能にする。本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体
及び／又はその誘導体、並びに場合によっては他のモノ
クローナル又はポリクローナル抗体及び／又は付属品を
含んで成る、スロンビン／ヒルジン−複合体の定性及び
定量測定のための試験キットに関する。
【００６７】ラジオイムノアッセイのための本発明の試
験キットは、例えば、本発明のモノクローナル抗体によ
りコートされているか又はコートされていない適当なキ
ャリャー、例えばミクロタイタープレート又はニトロセ
ルロースシート、キャリャーに結合した第一のモノクロ
ーナル抗体とは異るスロンビン／ヒルジン−複合体のエ
ピトープに対して向けられた放射性ラベルされた第二の
抗体及び／又はその放射性ラベルされた誘導体の場合に
よっては、凍結乾燥又は濃縮された溶液、スロンビン／
ヒルジン−複合体の標準溶液、緩衝液、並びに場合によ
っては非特異的吸着及び凝集の形成を防止するためのポ
リペプチド及び洗剤、ピペット、反応容器、検量線、指
示書等を含む。
験キットは、例えば、本発明のモノクローナル抗体によ
りコートされているか又はコートされていない適当なキ
ャリャー、例えばミクロタイタープレート又はニトロセ
ルロースシート、キャリャーに結合した第一のモノクロ
ーナル抗体とは異るスロンビン／ヒルジン−複合体のエ
ピトープに対して向けられた放射性ラベルされた第二の
抗体及び／又はその放射性ラベルされた誘導体の場合に
よっては、凍結乾燥又は濃縮された溶液、スロンビン／
ヒルジン−複合体の標準溶液、緩衝液、並びに場合によ
っては非特異的吸着及び凝集の形成を防止するためのポ
リペプチド及び洗剤、ピペット、反応容器、検量線、指
示書等を含む。
【００６８】エンザイムイムノアッセイのための本発明
の試験キットは、例えば、本発明のモノクローナル抗体
によりコートされているか又はコートされていない適当
なキャリャー、キャリャーに結合した第一のモノクロー
ナル抗体とは異るスロンビン／ヒルジン−複合体のエピ
トープに対して向けられた酵素ラベルされた第二の抗体
及び／又は酵素ラベルされたその誘導体の場合によって
は凍結乾燥又は濃縮された溶液、固体の又は溶解した形
の酵素基質、スロンビン／ヒルジン−複合体の標準溶
液、並びに場合によっては非特異的吸着及び凝集の形成
を防止するためのポリペプチド及び洗剤、ピペット、反
応容器、検量線、指示書等を含む。
の試験キットは、例えば、本発明のモノクローナル抗体
によりコートされているか又はコートされていない適当
なキャリャー、キャリャーに結合した第一のモノクロー
ナル抗体とは異るスロンビン／ヒルジン−複合体のエピ
トープに対して向けられた酵素ラベルされた第二の抗体
及び／又は酵素ラベルされたその誘導体の場合によって
は凍結乾燥又は濃縮された溶液、固体の又は溶解した形
の酵素基質、スロンビン／ヒルジン−複合体の標準溶
液、並びに場合によっては非特異的吸着及び凝集の形成
を防止するためのポリペプチド及び洗剤、ピペット、反
応容器、検量線、指示書等を含む。
【００６９】
【実施例】次に、例により本発明を説明するが、これに
より本発明の範囲を限定するものではない。略号 ＨＡＴ− ヒポキサンチン／アミノプリテン／チミジン ＨＰＬＣ− 高圧液体クロマトグラフィー ＭＡｂ− モノクローナル抗体 ＭＥＳ− ２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタン−スルホン酸 ＰＢＳ− リン酸緩衝液 ＰＥＧ− ポリエチレングリコール ｒＨＶ１− 組換ヒルジン変形体ＨＶ１ ＴＨＣ− スロンビン／ヒルジン−複合体
より本発明の範囲を限定するものではない。略号 ＨＡＴ− ヒポキサンチン／アミノプリテン／チミジン ＨＰＬＣ− 高圧液体クロマトグラフィー ＭＡｂ− モノクローナル抗体 ＭＥＳ− ２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタン−スルホン酸 ＰＢＳ− リン酸緩衝液 ＰＥＧ− ポリエチレングリコール ｒＨＶ１− 組換ヒルジン変形体ＨＶ１ ＴＨＣ− スロンビン／ヒルジン−複合体
【００７０】例１．スロンビン／ヒルジン−複合体に対
するモノクローナル抗体の調製 １．１ 免疫原の調製 免疫原として、（１）組換ヒルジン変形体ＨＶ１（ｒＨ
Ｖ１）とキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）
との結合体、及び（２）スロンビン／ヒルジン−複合体
を使用する。
するモノクローナル抗体の調製 １．１ 免疫原の調製 免疫原として、（１）組換ヒルジン変形体ＨＶ１（ｒＨ
Ｖ１）とキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）
との結合体、及び（２）スロンビン／ヒルジン−複合体
を使用する。
【００７１】ｒＨＶ１（Ｐｌａｎｔｏｒｇａｎ／Ｃｉｂ
ａ−Ｇｅｉｇｙ）をＫＬＨ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）
と、カルボジイミド法により次の様にして連結する。５
６０μｌの０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（pH４．７５）中２
mgのｒＨＶ１を１００μｌのＫＬＨ（１０mg／ml）及び
２００μｌのＮ−エチル−Ｎ′−（３ジメチルアミノプ
ロピル）−カルボジイミド塩酸塩（２０mg／ml）と混合
する。２２℃にて２時間後、混合物をＰＢＳ中で透析す
る。過剰のｒＨＶ１をスロンビンとＰＢＳ中で混合する
（モル比１．７：１）ことによりスロンビン／ｒＨＶ１
−複合体を調製する。
ａ−Ｇｅｉｇｙ）をＫＬＨ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）
と、カルボジイミド法により次の様にして連結する。５
６０μｌの０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（pH４．７５）中２
mgのｒＨＶ１を１００μｌのＫＬＨ（１０mg／ml）及び
２００μｌのＮ−エチル−Ｎ′−（３ジメチルアミノプ
ロピル）−カルボジイミド塩酸塩（２０mg／ml）と混合
する。２２℃にて２時間後、混合物をＰＢＳ中で透析す
る。過剰のｒＨＶ１をスロンビンとＰＢＳ中で混合する
（モル比１．７：１）ことによりスロンビン／ｒＨＶ１
−複合体を調製する。
【００７２】１．２ 免疫感作法 ２群の５匹ずつのＢａｌｂ／ｃ雌性マウス（４〜６週
令）に、ＨＬＨ−結合ｒＨＶ１（３０μｇ／注射；群
Ｉ）又はスロンビン／ｒＨＶ１−複合体（１５μｇ／注
射；群II）の３連の注射を行う。第１の注射は０．１ml
の完全フロインドアジュバント（Ｄｉｆｃｏ）と１：１
で混合されたＰＢＳ中対応する免疫原０．１mlから成
り、５０μｌを腹腔内にそして１５０μｌを皮下に注射
する。
令）に、ＨＬＨ−結合ｒＨＶ１（３０μｇ／注射；群
Ｉ）又はスロンビン／ｒＨＶ１−複合体（１５μｇ／注
射；群II）の３連の注射を行う。第１の注射は０．１ml
の完全フロインドアジュバント（Ｄｉｆｃｏ）と１：１
で混合されたＰＢＳ中対応する免疫原０．１mlから成
り、５０μｌを腹腔内にそして１５０μｌを皮下に注射
する。
【００７３】第２（１４日後）及び第３（３０日後）の
注射においては、完全フロインドアジュバントの代りに
不完全フロインドアジュバントを使用する。最後の注射
から１週間後、血清を集め、そして例１．３に記載する
ようにしてエンザイム−リンクドイムノソルベントアッ
セイ（ＥＬＩＳＡ）により抗体力価を決定する。
注射においては、完全フロインドアジュバントの代りに
不完全フロインドアジュバントを使用する。最後の注射
から１週間後、血清を集め、そして例１．３に記載する
ようにしてエンザイム−リンクドイムノソルベントアッ
セイ（ＥＬＩＳＡ）により抗体力価を決定する。
【００７４】１．３ 血清抗体価を決定するためのエン
ザイム−リンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ） 次に記載するようにして、血清中の抗体価をＥＬＩＳＡ
により決定する。２倍モル過剰のスロンビンをｒＨＶ１
と混合する（それぞれ０．２μｇ及び０．０２μｇ／ウ
エル）。ミクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）
を、コーティング緩衝液（５０mM炭酸ナトリウム緩衝
液、pH９．６：４７７mg ＮａＣＯ 3 、８７９mg Ｎａ
ＨＣＯ3 、１．８mlの０．５Ｍ ＮａＮ3 、３００mlの
Ｈ2Ｏを添加）中スロンビン／ヒルジン−複合体の溶液
１００μｌ／ウエルによりコートする。
ザイム−リンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ） 次に記載するようにして、血清中の抗体価をＥＬＩＳＡ
により決定する。２倍モル過剰のスロンビンをｒＨＶ１
と混合する（それぞれ０．２μｇ及び０．０２μｇ／ウ
エル）。ミクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）
を、コーティング緩衝液（５０mM炭酸ナトリウム緩衝
液、pH９．６：４７７mg ＮａＣＯ 3 、８７９mg Ｎａ
ＨＣＯ3 、１．８mlの０．５Ｍ ＮａＮ3 、３００mlの
Ｈ2Ｏを添加）中スロンビン／ヒルジン−複合体の溶液
１００μｌ／ウエルによりコートする。
【００７５】プレートを湿室中で４℃にて一夜インキュ
ベートし、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％（１ml
Ｔｗｅｅｎ−２０，Ｓｅｒｖａ，１０００ml ＰＢＳ）
で５回洗浄する。ウエルを乾燥させ、２００μｌ／ウエ
ルのＰＢＳ−ＢＳＡ１％（１ｇ ＢＳＡ、３mlの０．５
Ｍ ＮａＮ3 、１００mlのＰＢＳを添加）で満たし、室
温にて２時間インキュベートし、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎ０．１％で５回洗浄する。次に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎ０．１％中に希釈したそれぞれの血清１００μｌを各
ウエルに添加する。室温にて２時間のインキュベーショ
ンの後、プレートを５回ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％に
より洗浄する。
ベートし、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％（１ml
Ｔｗｅｅｎ−２０，Ｓｅｒｖａ，１０００ml ＰＢＳ）
で５回洗浄する。ウエルを乾燥させ、２００μｌ／ウエ
ルのＰＢＳ−ＢＳＡ１％（１ｇ ＢＳＡ、３mlの０．５
Ｍ ＮａＮ3 、１００mlのＰＢＳを添加）で満たし、室
温にて２時間インキュベートし、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎ０．１％で５回洗浄する。次に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎ０．１％中に希釈したそれぞれの血清１００μｌを各
ウエルに添加する。室温にて２時間のインキュベーショ
ンの後、プレートを５回ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％に
より洗浄する。
【００７６】次の段階において、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
０．１％に１：１５００で希釈した、マウスＩｇＧに対
するアフィニティー精製ヤギ抗体−アルカリホスファタ
ーゼ(Kirkegaard & Perry Laboratories) １００μｌを
各ウエルに加える。プレートを室温にて１．５時間イン
キュベートし、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％によ
り５回洗浄する。最後に、１５０μｌ／ウエルの基質溶
液（１mg ｐ−ニトロフェニルホスフェート〔Ｓｉｇｍ
ａ〕／ml ジエタノールアミン緩衝液pH９．８：９７ml
ジエタノールアミン〔Ｍｅｒｃｋ〕、６mlの０．５Ｍ
ＮａＮ3 、１００mg ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、濃塩酸
にてpH９．８に調整、１０００mlのＨ2 Ｏ添加）を加
え、５０μｌの３Ｍ ＮａＯＨを添加することにより反
応を停止し、そして暗所、室温にて２時間インキュベー
トした後４０５mmにて光学濃度を読み取る。
０．１％に１：１５００で希釈した、マウスＩｇＧに対
するアフィニティー精製ヤギ抗体−アルカリホスファタ
ーゼ(Kirkegaard & Perry Laboratories) １００μｌを
各ウエルに加える。プレートを室温にて１．５時間イン
キュベートし、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％によ
り５回洗浄する。最後に、１５０μｌ／ウエルの基質溶
液（１mg ｐ−ニトロフェニルホスフェート〔Ｓｉｇｍ
ａ〕／ml ジエタノールアミン緩衝液pH９．８：９７ml
ジエタノールアミン〔Ｍｅｒｃｋ〕、６mlの０．５Ｍ
ＮａＮ3 、１００mg ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、濃塩酸
にてpH９．８に調整、１０００mlのＨ2 Ｏ添加）を加
え、５０μｌの３Ｍ ＮａＯＨを添加することにより反
応を停止し、そして暗所、室温にて２時間インキュベー
トした後４０５mmにて光学濃度を読み取る。
【００７７】１．４ 融合法 ２ヶ月以上の休息期間の後、マウスに３００μｇのｒＨ
Ｖ１−ＫＬＨ結合体（群Ｉ）又は７０μｇのスロンビン
／ｒＨＶ１−複合体（群II）のいずれかにより腹腔内に
追加免疫する。３〜４日間の後、マウスを殺し、もとの
Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ法の変法（Ｇａｌ
ｆｒｅら、Nature 266, 550, 1977）によりＰＥＧ４０
００（Ｍｅｒｃｋ）を用いて脾細胞をネズミ骨髄腫セル
ラインＰＡＩ（Ｓｔｏｃｋｅｒら、Research Disclosur
e No.21713, p155, 1982）と融合させ、そして細胞を、
ＨＡＴ培地（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を収容したミクロ
タイタープレートのウエルに分配する。２〜４週間後、
増殖するハイブリドーマを含むウエルを例１．５のＥＬ
ＩＳＡにより特異的モノクローナル抗体について試験す
る。
Ｖ１−ＫＬＨ結合体（群Ｉ）又は７０μｇのスロンビン
／ｒＨＶ１−複合体（群II）のいずれかにより腹腔内に
追加免疫する。３〜４日間の後、マウスを殺し、もとの
Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ法の変法（Ｇａｌ
ｆｒｅら、Nature 266, 550, 1977）によりＰＥＧ４０
００（Ｍｅｒｃｋ）を用いて脾細胞をネズミ骨髄腫セル
ラインＰＡＩ（Ｓｔｏｃｋｅｒら、Research Disclosur
e No.21713, p155, 1982）と融合させ、そして細胞を、
ＨＡＴ培地（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を収容したミクロ
タイタープレートのウエルに分配する。２〜４週間後、
増殖するハイブリドーマを含むウエルを例１．５のＥＬ
ＩＳＡにより特異的モノクローナル抗体について試験す
る。
【００７８】１．５ ハイブリドーマのスクリーニング
のためのエンザイム−リンクドイムノソルベントアッセ
イ（ＥＬＩＳＡ） 増殖するハイブリドーマを例１．３に記載したようにし
て、ＥＬＩＳＡにより特異抗体の存在について試験す
る。血清の代りに、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％中に
１：２で希釈したハイブリドーマ細胞上清２００μｌ
を、スロンビン／ｒＨＶ１−複合体でコートしたミクロ
タイタープレートに加える。
のためのエンザイム−リンクドイムノソルベントアッセ
イ（ＥＬＩＳＡ） 増殖するハイブリドーマを例１．３に記載したようにし
て、ＥＬＩＳＡにより特異抗体の存在について試験す
る。血清の代りに、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％中に
１：２で希釈したハイブリドーマ細胞上清２００μｌ
を、スロンビン／ｒＨＶ１−複合体でコートしたミクロ
タイタープレートに加える。
【００７９】グループＩのマウスを用いて行った３回の
融合（融合効率１００％）から、スロンビン／ｒＨＶ１
−複合体と反応するＭＡｂを分泌する６個のハイブリド
ーマを得る。グループIIのマウスを用いた３回の融合は
４個の前記のごときハイブリドーマ４個をもたらし、そ
の１つはｒＨＶ１と交叉反応するＭＡｂを分泌し、他方
残りの３個のハイブリドーマにより分泌されたＭＡｂは
スロンビンと交叉反応する。各グループからの１個ず
つ、計２個のハイブリドーマセルラインを、分泌される
ＭＢのさらなる特徴付けのために選択する。
融合（融合効率１００％）から、スロンビン／ｒＨＶ１
−複合体と反応するＭＡｂを分泌する６個のハイブリド
ーマを得る。グループIIのマウスを用いた３回の融合は
４個の前記のごときハイブリドーマ４個をもたらし、そ
の１つはｒＨＶ１と交叉反応するＭＡｂを分泌し、他方
残りの３個のハイブリドーマにより分泌されたＭＡｂは
スロンビンと交叉反応する。各グループからの１個ず
つ、計２個のハイブリドーマセルラインを、分泌される
ＭＢのさらなる特徴付けのために選択する。
【００８０】両セルラインは１９９０年６月１４日に、
European Collection of Animal Cell Cultures(ＥＣＡ
ＣＣ) に、ハイブリドーマ４１５８−８１−７（グルー
プＩ）については寄託番号９００６１４０５として、そ
してハイブリドーマ４１０７−７６−１（グループII）
については寄託番号９００６１４０４として寄託されて
いる。これらのハイブリドーマにより分泌されるモノク
ローナル抗体は前置記号「ＭＡｂ」と各ハイブリドーマ
の内部番号とにより、例えばＭＡｂ４１０７−７６−１
として命名する。
European Collection of Animal Cell Cultures(ＥＣＡ
ＣＣ) に、ハイブリドーマ４１５８−８１−７（グルー
プＩ）については寄託番号９００６１４０５として、そ
してハイブリドーマ４１０７−７６−１（グループII）
については寄託番号９００６１４０４として寄託されて
いる。これらのハイブリドーマにより分泌されるモノク
ローナル抗体は前置記号「ＭＡｂ」と各ハイブリドーマ
の内部番号とにより、例えばＭＡｂ４１０７−７６−１
として命名する。
【００８１】１．６ ハイブリドーマの貯蔵及び処理 選択されたハイブリドーマ細胞は培養において増殖さ
せ、−８０℃にて凍結し、液体窒素中に保存し、そして
再活性化することができる。細胞を限界希釈法（J. W.
Goding, J. Immunol. Methods, 39, 285, 1980）により
クローニングし、そしてプリスタンによりプライムした
Ｂａｌｂ／ｃマウス中に腹水を形成することにより拡大
する（例２．１を参照のこと）。
せ、−８０℃にて凍結し、液体窒素中に保存し、そして
再活性化することができる。細胞を限界希釈法（J. W.
Goding, J. Immunol. Methods, 39, 285, 1980）により
クローニングし、そしてプリスタンによりプライムした
Ｂａｌｂ／ｃマウス中に腹水を形成することにより拡大
する（例２．１を参照のこと）。
【００８２】例２．モノクローナル抗−ＴＨＣ抗体の生
産、単離及び精製 ２．１ 生体内でのハイブリドーマの拡大及びモノクロ
ーナル抗体の精製 腹水の生産のため、雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２
５ｇ）（Ｔｉｅｒｆａｒｍ Ｓｉｓｓｅｌｎ、スイス）
を０．３mlのプリスタン油（Ａｌｄｒｉｃｈ）により腹
腔内前処理する。１〜３週間後、マウスにプリスタンの
第二の注射を行い（０．２ml ｉ．ｐ．）そして同時に
０．２mlのＰＢＳ中２×１０6 個のハイブリドーマ細胞
をｉ．ｐ．接種する。８〜１０日後、生ずる腹水を集
め、８００xgにて遠心し、そして−２０℃又は−８０℃
にて貯蔵する。
産、単離及び精製 ２．１ 生体内でのハイブリドーマの拡大及びモノクロ
ーナル抗体の精製 腹水の生産のため、雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２
５ｇ）（Ｔｉｅｒｆａｒｍ Ｓｉｓｓｅｌｎ、スイス）
を０．３mlのプリスタン油（Ａｌｄｒｉｃｈ）により腹
腔内前処理する。１〜３週間後、マウスにプリスタンの
第二の注射を行い（０．２ml ｉ．ｐ．）そして同時に
０．２mlのＰＢＳ中２×１０6 個のハイブリドーマ細胞
をｉ．ｐ．接種する。８〜１０日後、生ずる腹水を集
め、８００xgにて遠心し、そして−２０℃又は−８０℃
にて貯蔵する。
【００８３】解凍した腹水を３０，０００xgにて１時間
の遠心により透明にする。脂質を含有する上層を除去し
た後、蛋白質濃度を測定し、そしてＰＢＳにより１０〜
１２mg／mlに調整する。０℃にて０．９容量の飽和硫酸
アンモニウムを滴加することにより免疫グロブリンＧ画
分（ＩｇＧ）を沈澱せしめる。１時間後、ＩｇＧ画分を
２２，０００xgにて１時間の遠心分離によりペレット化
する。ペレットを、５０mM ＮａＣｌを含有する２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH７．９）に溶解し、そし
て同じ緩衝液に対して４℃にて一夜透析する。ＩｇＧ画
分をさらに、ＤＥ５２ジエチルアミノエチルセルロース
（Ｗｈａｔｍａｎ）のカラム上での陰イオン交換クロマ
トグラフィーにより精製する。
の遠心により透明にする。脂質を含有する上層を除去し
た後、蛋白質濃度を測定し、そしてＰＢＳにより１０〜
１２mg／mlに調整する。０℃にて０．９容量の飽和硫酸
アンモニウムを滴加することにより免疫グロブリンＧ画
分（ＩｇＧ）を沈澱せしめる。１時間後、ＩｇＧ画分を
２２，０００xgにて１時間の遠心分離によりペレット化
する。ペレットを、５０mM ＮａＣｌを含有する２０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH７．９）に溶解し、そし
て同じ緩衝液に対して４℃にて一夜透析する。ＩｇＧ画
分をさらに、ＤＥ５２ジエチルアミノエチルセルロース
（Ｗｈａｔｍａｎ）のカラム上での陰イオン交換クロマ
トグラフィーにより精製する。
【００８４】サンプルを２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．９）中に１：２（ｖ／ｖ）で希釈して最終濃度２５
mM ＮａＣｌとし、そしてゲル１ml当り１０mgの蛋白質
を該カラムに適用する。塩化ナトリウム濃度を２５mMか
ら２００mMに上昇せしめる（直線勾配）ことにより溶出
を行う。一般に、ＭＡｂは約８０mM ＮａＣｌにて溶出
する。画分をＰＢＳに対して４℃にて一夜透析し、そし
て−７０℃で貯蔵する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び等電点沈
澱により純度を評価する。純度は９０％より高い。
７．９）中に１：２（ｖ／ｖ）で希釈して最終濃度２５
mM ＮａＣｌとし、そしてゲル１ml当り１０mgの蛋白質
を該カラムに適用する。塩化ナトリウム濃度を２５mMか
ら２００mMに上昇せしめる（直線勾配）ことにより溶出
を行う。一般に、ＭＡｂは約８０mM ＮａＣｌにて溶出
する。画分をＰＢＳに対して４℃にて一夜透析し、そし
て−７０℃で貯蔵する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び等電点沈
澱により純度を評価する。純度は９０％より高い。
【００８５】２．２ ハイブリドーマの生体外での拡大 １０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ１６
４０培地（Ｓｅｒｏｍｅｄ）中で生理的温度（約３７
℃）にてハイブリドーマ細胞を培養して５×１０ 5 〜１
０6 細胞／mlの最終細胞濃度にすることによりセルライ
ンの前培養物を得る。この前培養物全体をＢｅｌｌｃｏ
培養器に入れ、そして新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地／１
０％ＦＣＳにより全体積１５００mlに調製する。培養物
を約３７℃にて５％ＣＯ2 のもとで３０rpm で２〜３日
間攪拌し、次にＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳにより
全体積３０００mlに希釈し、そしてさらに７〜１０日間
攪拌する。
４０培地（Ｓｅｒｏｍｅｄ）中で生理的温度（約３７
℃）にてハイブリドーマ細胞を培養して５×１０ 5 〜１
０6 細胞／mlの最終細胞濃度にすることによりセルライ
ンの前培養物を得る。この前培養物全体をＢｅｌｌｃｏ
培養器に入れ、そして新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地／１
０％ＦＣＳにより全体積１５００mlに調製する。培養物
を約３７℃にて５％ＣＯ2 のもとで３０rpm で２〜３日
間攪拌し、次にＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳにより
全体積３０００mlに希釈し、そしてさらに７〜１０日間
攪拌する。
【００８６】この時間の後９５％の細胞が死滅する。培
養液を１０００xgにて２０分間４℃で遠心分離する。上
清をポアーサイズ０．２μｍのフィルターに通して無菌
条件下で濾過する。０℃にて０．９容量の飽和硫酸アン
モニウムを徐々に滴加することにより粗免疫グロブリン
を沈澱せしめる。この沈澱を例２．１に記載したように
して精製する。
養液を１０００xgにて２０分間４℃で遠心分離する。上
清をポアーサイズ０．２μｍのフィルターに通して無菌
条件下で濾過する。０℃にて０．９容量の飽和硫酸アン
モニウムを徐々に滴加することにより粗免疫グロブリン
を沈澱せしめる。この沈澱を例２．１に記載したように
して精製する。
【００８７】例３．モノクローナル抗−ＴＨＣ抗体のク
ラス及びサブクラスの決定 モノクローナル抗体のクラス及びサブクラスをＢｉｏ−
Ｒａｄからのエンザイム−リンクドイムノソルベントア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定する。ＭＡｂ４１５８
−８１−７及びＭＡｂ４１０７−７６−１はクラスＩｇ
Ｇである。
ラス及びサブクラスの決定 モノクローナル抗体のクラス及びサブクラスをＢｉｏ−
Ｒａｄからのエンザイム−リンクドイムノソルベントア
ッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定する。ＭＡｂ４１５８
−８１−７及びＭＡｂ４１０７−７６−１はクラスＩｇ
Ｇである。
【００８８】例４．ｒＨＶ１類似体の調製 ４．１ 合成ｒＨＶ１ペプチドの調製 配列５２−６５，４０−６５，２９−３８、及び１−１
５の合成ｒＨＶ１ペプチドを当業界において知られてい
る固相法(Rink, Tetrahedron Letter 28, 3787, 1987)
により合成する。配列１−４３を有するｒＨＶ１ペプチ
ドは Changら、FEBS Letter 260, 209, 1990に記載され
ているようにして合成する。
５の合成ｒＨＶ１ペプチドを当業界において知られてい
る固相法(Rink, Tetrahedron Letter 28, 3787, 1987)
により合成する。配列１−４３を有するｒＨＶ１ペプチ
ドは Changら、FEBS Letter 260, 209, 1990に記載され
ているようにして合成する。
【００８９】４．２ 還元的Ｓ−カルボキシメチル化 ｒＨＶ１の還元的Ｓ−カルボキシメチル化をＨｉｒｓの
方法（Methods in Enzymol 11, 199, 1967）に従って行
う。これによりｒＨＶ１の三次元構造の完全な破壊が起
こる。
方法（Methods in Enzymol 11, 199, 1967）に従って行
う。これによりｒＨＶ１の三次元構造の完全な破壊が起
こる。
【００９０】４．３ Ｖ８スタフィロコッカスプロテア
ーゼによるｒＨＶ１の消化 ２mM ＥＤＴＡを補充した５０mM（ＮＨ4 ）ＨＣＯ3 緩
衝液（pH８．０）９０μｌ中に溶解した７０μｇの天然
ｒＨＶ１を２０μｇ（２０μｌ中）のスタフィロコッカ
ス・アウレウム(Staphylococcus aureus）Ｖ８株プロテ
アーゼ（Ｓｉｇｍａ）と混合し、そして３７℃にて３０
分間、２時間又は４時間インキュベートする。５μｌの
０．０１Ｍジイソプロピルフルオロホスフェート（Ｓｉ
ｇｍａ）の添加により反応を停止させる。消化の程度
を、Ｓｃｈｌａｅｐｐｉら（Eur. J. Biochem. 188, 46
3, 1990)により記載されている逆相ＨＰＬＣにより、又
はアミノ末端分析(Chang, Analytical Biochem. 170, 5
42, 1988) により、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価す
る。
ーゼによるｒＨＶ１の消化 ２mM ＥＤＴＡを補充した５０mM（ＮＨ4 ）ＨＣＯ3 緩
衝液（pH８．０）９０μｌ中に溶解した７０μｇの天然
ｒＨＶ１を２０μｇ（２０μｌ中）のスタフィロコッカ
ス・アウレウム(Staphylococcus aureus）Ｖ８株プロテ
アーゼ（Ｓｉｇｍａ）と混合し、そして３７℃にて３０
分間、２時間又は４時間インキュベートする。５μｌの
０．０１Ｍジイソプロピルフルオロホスフェート（Ｓｉ
ｇｍａ）の添加により反応を停止させる。消化の程度
を、Ｓｃｈｌａｅｐｐｉら（Eur. J. Biochem. 188, 46
3, 1990)により記載されている逆相ＨＰＬＣにより、又
はアミノ末端分析(Chang, Analytical Biochem. 170, 5
42, 1988) により、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価す
る。
【００９１】４．４ リシルエンドペプチダーゼによる
ｒＨＶ１の消化 ９７．５μｌの２５mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（pH８．３）
に溶解した７０μｇのｒＨＶ１に、２．５μｌ中２．５
μｇのリシルエンドペプチダーゼ（ＷａｋｏＣｈｅｍｉ
ｃａｌｓ）を加え、そして３７℃にて種々の時間にわた
りインキュベートする。蛋白質分解断片をＳｃｈｌａｅ
ｐｐｉら（ｌｏｃ．ｃｉｆ）により記載されたようにし
てＨＰＬＣにより分離し、そして消化の程度を定量的Ｎ
−末端分析により決定する。
ｒＨＶ１の消化 ９７．５μｌの２５mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（pH８．３）
に溶解した７０μｇのｒＨＶ１に、２．５μｌ中２．５
μｇのリシルエンドペプチダーゼ（ＷａｋｏＣｈｅｍｉ
ｃａｌｓ）を加え、そして３７℃にて種々の時間にわた
りインキュベートする。蛋白質分解断片をＳｃｈｌａｅ
ｐｐｉら（ｌｏｃ．ｃｉｆ）により記載されたようにし
てＨＰＬＣにより分離し、そして消化の程度を定量的Ｎ
−末端分析により決定する。
【００９２】例５．抗−ＴＨＣモノクローナル抗体の特
徴付けのために使用される試験法 ５．１ ｒＨＶ１、スロンビン及びモノクローナル抗体
のビオチン化 スロンビン（４０μｌのＰＢＳ中１．１nmol）をビオチ
ン−Ｘ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（２μ
ｌのＤＭＳＯ中４．４nmol）と４℃にて３時間混合す
る。次に、ＰＢＳに対する一夜の透析の前に３６０μｌ
のＰＢＳを加える。ＭＡｂのビオチン化は、Ｂａｙｅｒ
ら（Methods Enzymol. 62, 308, 1979）により記載され
ているのと実質的に同様にして行う。ビオチン−Ｘ−Ｎ
−ヒドロキシサクシンイミドエステル（２００μｌのＤ
ＭＳＯ中２００μｇ）を５mlのＰＢＳ（pH７．０）中５
mgの精製ＭＡｂに加える（モル比１３：１）。４℃にて
４時間後、混合物をＰＢＳ中で十分に透析する。
徴付けのために使用される試験法 ５．１ ｒＨＶ１、スロンビン及びモノクローナル抗体
のビオチン化 スロンビン（４０μｌのＰＢＳ中１．１nmol）をビオチ
ン−Ｘ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（２μ
ｌのＤＭＳＯ中４．４nmol）と４℃にて３時間混合す
る。次に、ＰＢＳに対する一夜の透析の前に３６０μｌ
のＰＢＳを加える。ＭＡｂのビオチン化は、Ｂａｙｅｒ
ら（Methods Enzymol. 62, 308, 1979）により記載され
ているのと実質的に同様にして行う。ビオチン−Ｘ−Ｎ
−ヒドロキシサクシンイミドエステル（２００μｌのＤ
ＭＳＯ中２００μｇ）を５mlのＰＢＳ（pH７．０）中５
mgの精製ＭＡｂに加える（モル比１３：１）。４℃にて
４時間後、混合物をＰＢＳ中で十分に透析する。
【００９３】２００μｌの酢酸緩衝液（２０mM，pH６．
０）中０．５mgのｒＨＶ１を、４０μｌのエタノール／
水（１：１ｖ／ｖ）に溶解した１００μｇのビオチン−
Ｘ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ）と混合してビオチン対ｒＨＶ１のモル比
を２．３：１とし、そしてこの混合物を室温にて２０分
間インキュベートする。次に、２６０μｌのＰＢＳを加
え、そして溶液を４℃にてＰＢＳに対して一夜透析す
る。
０）中０．５mgのｒＨＶ１を、４０μｌのエタノール／
水（１：１ｖ／ｖ）に溶解した１００μｇのビオチン−
Ｘ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ）と混合してビオチン対ｒＨＶ１のモル比
を２．３：１とし、そしてこの混合物を室温にて２０分
間インキュベートする。次に、２６０μｌのＰＢＳを加
え、そして溶液を４℃にてＰＢＳに対して一夜透析す
る。
【００９４】５．２ 競争ＥＬＩＳＡ ｒＨＶ１、例４に記載のｒＨＶ１類似体、及び組換ヒル
ジン変形体ＰＶ（ｒＨＶ３；Ｐｏｄｔら、Biol. Chem.
Hoppe-Seyler 367, 803, 1983)を用いる競争ＥＬＩＳＡ
実験によりエピトープマッピングを行う。次の様にして
二段階競争ＥＬＩＳＡを行う。
ジン変形体ＰＶ（ｒＨＶ３；Ｐｏｄｔら、Biol. Chem.
Hoppe-Seyler 367, 803, 1983)を用いる競争ＥＬＩＳＡ
実験によりエピトープマッピングを行う。次の様にして
二段階競争ＥＬＩＳＡを行う。
【００９５】ｒＨＶ１（１００μｌの５０mM コーティ
ング緩衝液中０．２μｇ）をマイクロタイタープレート
上に吸収される。４℃にて一夜のインキュベーションの
後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％によりプレートを洗浄
し、そして固体支持体上の残留遊離部位をＰＢＳ／ＢＳ
Ａ（１％ｗ／ｖ）とのインキュベーションによりブロッ
クする。別の試験管中で、５０μｌの各精製されたＭＡ
ｂ（４０〜４００ng／ml）を、増加する量のｒＨＶ１又
はｒＨＶ１類似体を含有する標準溶液６５０μｌと共に
インキュベートする。
ング緩衝液中０．２μｇ）をマイクロタイタープレート
上に吸収される。４℃にて一夜のインキュベーションの
後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％によりプレートを洗浄
し、そして固体支持体上の残留遊離部位をＰＢＳ／ＢＳ
Ａ（１％ｗ／ｖ）とのインキュベーションによりブロッ
クする。別の試験管中で、５０μｌの各精製されたＭＡ
ｂ（４０〜４００ng／ml）を、増加する量のｒＨＶ１又
はｒＨＶ１類似体を含有する標準溶液６５０μｌと共に
インキュベートする。
【００９６】４℃にて一夜のインキュベートの後、２０
０μｌの抗体−抗原混合物を各ウエルに加え、そしてさ
らに１時間インキュベートする。次にウエルを５回洗浄
し、そして１００μｌ／ウエルのアルカリホスファター
ゼに結合したヤギ抗−マウス抗体（希釈１：１５００）
を１．５時間ウエルに加える。洗浄の後、１５０μｌ／
ウエルの基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート（０．５
mM ＭｇＣｌ2 ・Ｈ2Ｏが補充されたジエタノールアミ
ン緩衝液、pH９．８、中１mg／ml）をウエルに加える。
固相に結合した抗原と反応する抗体の量に比例する色の
変化を４０５nmにてモニターする。すべてのサンプルを
三連で行う。
０μｌの抗体−抗原混合物を各ウエルに加え、そしてさ
らに１時間インキュベートする。次にウエルを５回洗浄
し、そして１００μｌ／ウエルのアルカリホスファター
ゼに結合したヤギ抗−マウス抗体（希釈１：１５００）
を１．５時間ウエルに加える。洗浄の後、１５０μｌ／
ウエルの基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート（０．５
mM ＭｇＣｌ2 ・Ｈ2Ｏが補充されたジエタノールアミ
ン緩衝液、pH９．８、中１mg／ml）をウエルに加える。
固相に結合した抗原と反応する抗体の量に比例する色の
変化を４０５nmにてモニターする。すべてのサンプルを
三連で行う。
【００９７】Ｂ／Ｂ0 ×１００（結合％）対存在する阻
害物質の濃度をプロットすることにより典型的な阻害曲
線を得る（Ｂ0 は抗体添加されたｒＨＶ１の非存在下で
測定された吸光度を示し、そしてＢは種々の濃度のｒＨ
Ｖ１の存在下で測定された吸収を示す。ＩＣ50値は固相
への抗体の結合を５０％阻害する抗原の濃度を示す。
害物質の濃度をプロットすることにより典型的な阻害曲
線を得る（Ｂ0 は抗体添加されたｒＨＶ１の非存在下で
測定された吸光度を示し、そしてＢは種々の濃度のｒＨ
Ｖ１の存在下で測定された吸収を示す。ＩＣ50値は固相
への抗体の結合を５０％阻害する抗原の濃度を示す。
【００９８】ＩＣ50は、４パラメーター理論曲線：Ｕ＝
（Ｄ−Ｃ）／１＋（Ｚ／Ａ）ｂ）＋Ｃ（ここで、Ｕは標
準の量Ｚについて予想される応答である）に基く曲線適
合プログラムＥＮＺＦＩＴＴＥＲ(R. J. Leatherbarro
w, Elsevies) の適合（ａｄａｐｔｉｏｎ）を用いて計
算する。４個のパラメーターが曲線の形を記述し、Ｄ及
びＣは上及び下の漸近線を与え、そしてＡは中間漸近線
の量である（Ｒａａｂ，Clin. Chem. 29, 1757, 198
3）。
（Ｄ−Ｃ）／１＋（Ｚ／Ａ）ｂ）＋Ｃ（ここで、Ｕは標
準の量Ｚについて予想される応答である）に基く曲線適
合プログラムＥＮＺＦＩＴＴＥＲ(R. J. Leatherbarro
w, Elsevies) の適合（ａｄａｐｔｉｏｎ）を用いて計
算する。４個のパラメーターが曲線の形を記述し、Ｄ及
びＣは上及び下の漸近線を与え、そしてＡは中間漸近線
の量である（Ｒａａｂ，Clin. Chem. 29, 1757, 198
3）。
【００９９】５．３ オーバーラップするエピトープを
決定するための遊離ヒルジンについて選択的なＭＡｂを
用いるダブルサンドイッチＥＬＩＳＡ 遊離ヒルジンについて選択的であるＭＡｂを用いるダブ
ル抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを次に記載するようにし
て行ってモノクローナル抗体がオーバーラップするエピ
トープを認識するか否かを決定する。
決定するための遊離ヒルジンについて選択的なＭＡｂを
用いるダブルサンドイッチＥＬＩＳＡ 遊離ヒルジンについて選択的であるＭＡｂを用いるダブ
ル抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを次に記載するようにし
て行ってモノクローナル抗体がオーバーラップするエピ
トープを認識するか否かを決定する。
【０１００】ミクロタイタープレートを、炭酸ナトリウ
ム緩衝液（５０mM，pH９．６）中に調製されたグループ
Ｉの精製された抗−ＴＨＣ ＭＡｂ ウエル当り０．５
μｇによりコートし、そして４℃にて一夜インキュベー
トする。ブロッキング及び洗浄段階（それぞれ１％ Ｂ
ＳＡ及び０．１％ ＢＲＳ−Ｔｗｅｅｎ）の後、ＰＢＳ
−Ｔｗｅｅｎ０．１％中に調製された増加する濃度のｒ
ＨＶ１（０〜１００ng／ウエル）を結合したＭＡｂに加
え、そして室温にて１時間インキュベートする。洗浄
後、遊離ｒＨＶ１について選択的なビオチン化された第
二ＭＡｂをプレートに加え（０．５μｇ／ウエル）そし
て２時間インキュベートする。
ム緩衝液（５０mM，pH９．６）中に調製されたグループ
Ｉの精製された抗−ＴＨＣ ＭＡｂ ウエル当り０．５
μｇによりコートし、そして４℃にて一夜インキュベー
トする。ブロッキング及び洗浄段階（それぞれ１％ Ｂ
ＳＡ及び０．１％ ＢＲＳ−Ｔｗｅｅｎ）の後、ＰＢＳ
−Ｔｗｅｅｎ０．１％中に調製された増加する濃度のｒ
ＨＶ１（０〜１００ng／ウエル）を結合したＭＡｂに加
え、そして室温にて１時間インキュベートする。洗浄
後、遊離ｒＨＶ１について選択的なビオチン化された第
二ＭＡｂをプレートに加え（０．５μｇ／ウエル）そし
て２時間インキュベートする。
【０１０１】第二モノクローナル抗体として、Ｓｃｈｌ
ａｅｐｐｉら（上記引用文）により記載されているそれ
ぞれＭＡｂ４１１４−９６−１，ＭＡｂ４１２０−３７
−７及びＭＡｂ４０４９−８３−１２を用いる。次に、
洗浄後、１００μｌのアルカリホスファターゼ結合スト
レプトアミジン（１：２５００に希釈）を加え、そして
室温にて１．５時間インキュベートする。洗浄後、基質
（例５．２を参照のこと）を加え、そして基質の添加後
１５分から始めて種々の時間の後４０５nmにて吸光度を
測定する。
ａｅｐｐｉら（上記引用文）により記載されているそれ
ぞれＭＡｂ４１１４−９６−１，ＭＡｂ４１２０−３７
−７及びＭＡｂ４０４９−８３−１２を用いる。次に、
洗浄後、１００μｌのアルカリホスファターゼ結合スト
レプトアミジン（１：２５００に希釈）を加え、そして
室温にて１．５時間インキュベートする。洗浄後、基質
（例５．２を参照のこと）を加え、そして基質の添加後
１５分から始めて種々の時間の後４０５nmにて吸光度を
測定する。
【０１０２】５．４ ｒＨＶ１／スロンビン−複合体を
測定するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ ０．１％のＢＳＡを含有する１００μｌのＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎ０．１％又はＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に１：３で希
釈された１００μｌのヒト血漿中で１５pmolのｒＨＶ１
と３pmolのα−スロンビン（３０００ＮＩＨユニット／
mg：CBR Laboratories）とを混合することによりスロン
ビン／ｒＨＶ１−複合体を調製する。
測定するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ ０．１％のＢＳＡを含有する１００μｌのＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎ０．１％又はＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に１：３で希
釈された１００μｌのヒト血漿中で１５pmolのｒＨＶ１
と３pmolのα−スロンビン（３０００ＮＩＨユニット／
mg：CBR Laboratories）とを混合することによりスロン
ビン／ｒＨＶ１−複合体を調製する。
【０１０３】ミクロタイタープレートを抗−スロンビン
ＭＡｂ ＥＳＴ６（０．２μｇ／１００μｌ；Bioscot,
Edinburgh, ＵＫ）によりコートする。４℃での一夜の
インキュベーション、ＰＢＳ−ＢＳＡ（０．１％）によ
るブロッキング、及びＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎによる洗浄の
後、前記のようにして調製したスロンビン／ｒＨＶ１−
複合体の一連の２倍希釈物（１：５モル比）１００μｌ
をウエルに加え、そして室温にて２時間インキュベート
する。
ＭＡｂ ＥＳＴ６（０．２μｇ／１００μｌ；Bioscot,
Edinburgh, ＵＫ）によりコートする。４℃での一夜の
インキュベーション、ＰＢＳ−ＢＳＡ（０．１％）によ
るブロッキング、及びＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎによる洗浄の
後、前記のようにして調製したスロンビン／ｒＨＶ１−
複合体の一連の２倍希釈物（１：５モル比）１００μｌ
をウエルに加え、そして室温にて２時間インキュベート
する。
【０１０４】次に、（１）０．５μｇ／１００μｌのビ
オチン化ＭＡｂ４１０７−７６−１及びＭＡｂ１４５８
−８１−７、それぞれ２時間、（２）アルカリホスファ
ターゼ結合ストレプトアビジン（１：１２００希釈）
１．５時間、及び（３）基質（例５．２を参照のこと）
を次々に添加する。２２℃にてインキュベーションを行
う。各段階の間、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１
％で洗浄する。１５〜３０分間の後４０５nmにて吸光度
をモニターする。
オチン化ＭＡｂ４１０７−７６−１及びＭＡｂ１４５８
−８１−７、それぞれ２時間、（２）アルカリホスファ
ターゼ結合ストレプトアビジン（１：１２００希釈）
１．５時間、及び（３）基質（例５．２を参照のこと）
を次々に添加する。２２℃にてインキュベーションを行
う。各段階の間、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１
％で洗浄する。１５〜３０分間の後４０５nmにて吸光度
をモニターする。
【０１０５】選択されたＭＡｂでコートされたミクロタ
イタープレートを用いて簡単化された測定法を開発す
る。ｒＨＶ１と結合したビオチン化スロンビン（０．２
μｇ／ウエル）をウエルに加え、そしてビオチン化され
たスロンビンをアルカリホスファターゼ結合ストレプト
アビジンにより直接検出する。
イタープレートを用いて簡単化された測定法を開発す
る。ｒＨＶ１と結合したビオチン化スロンビン（０．２
μｇ／ウエル）をウエルに加え、そしてビオチン化され
たスロンビンをアルカリホスファターゼ結合ストレプト
アビジンにより直接検出する。
【０１０６】５．５ ゲル濾過ＨＰＬＣ ゲル濾過ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）を用
いてスロンビン／ｒＨＶ１−複合体又は抗原−抗体複合
体を分析する。スロンビン（０．３nmol）及びｒＨＶ１
（１．５nmol）を含有するサンプルを１５分間インキュ
ベートする。被験抗−ＴＨＣ ＭＡｂ又は対照 抗−ヒ
ルジンＭＡｂ４０４９−８３−１２（０．２nmol；Ｓｃ
ｈｌａｅｐｐｉら、前に引用）を加え（合計容量４５μ
ｌ）そして室温にてさらに５時間インキュベートする。
サンプルをＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷゲル濾過カラム（Ｌ
ＫＢ；８×３００mm）に注入し、そして０．３ml／分の
流速でＰＢＳにより溶出する。蛋白質の吸光度を２８０
nmにてモニターする。
いてスロンビン／ｒＨＶ１−複合体又は抗原−抗体複合
体を分析する。スロンビン（０．３nmol）及びｒＨＶ１
（１．５nmol）を含有するサンプルを１５分間インキュ
ベートする。被験抗−ＴＨＣ ＭＡｂ又は対照 抗−ヒ
ルジンＭＡｂ４０４９−８３−１２（０．２nmol；Ｓｃ
ｈｌａｅｐｐｉら、前に引用）を加え（合計容量４５μ
ｌ）そして室温にてさらに５時間インキュベートする。
サンプルをＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷゲル濾過カラム（Ｌ
ＫＢ；８×３００mm）に注入し、そして０．３ml／分の
流速でＰＢＳにより溶出する。蛋白質の吸光度を２８０
nmにてモニターする。
【０１０７】例６．モノクローナル抗−ＴＨＣ抗体の特
徴付け ６．１ グループＩのモノクローナル抗体 ＭＡｂ４１５８−８１−７（グループＩ）についての例
５．２の競争ＥＬＩＳＡの結果を下の表１に示す。
徴付け ６．１ グループＩのモノクローナル抗体 ＭＡｂ４１５８−８１−７（グループＩ）についての例
５．２の競争ＥＬＩＳＡの結果を下の表１に示す。
【０１０８】 表 １ 競争ＥＬＩＳＡによるＭＡｂ４１５８−８１−７の特徴付け ─────────────────────────────────── ヒルジン変形体／類似体 ＩＣ50 (ng/ml)A ─────────────────────────────────── ｒＨＶ１ ３．５ ｒＨＶ３B １０００ ｒＨＶ１ １−４３ １．０ ＨＶ１ペプチド５２−６５ ＞１０００ ＨＶ１ペプチド４０−６５ ＞１０００ ＨＶ１ペプチド２９−３８ ＞１０００ ＨＶ１ペプチド１−１５ ＞１０００ Ｓ−ＣＭ−ｒＨＶ１C ２００ ｒＨＶ１＋Ｖ８プロテアーゼ（２時間）D ０．５ ｒＨＶ１＋リシルエンドペプチダーゼ（1.５時間）E １１．８ ───────────────────────────────────
【０１０９】Ａ：固相ＭＡｂの５０％阻害のための阻害
物質濃度 Ｂ：ｒＨＶ１と異るｒＨＶ３の残基：Ile １，Thr ２，
Lys ２４，Gln ３３，Lys ３５，Asp ３６，Gln ５３，
Pro ５８，Asp ６２，Ala ６３，Asp ６５，Glu ６６ Ｃ：還元されそしてＳ−カルボキシメチル化されたｒＨ
Ｖ１ Ｄ：Ｇｌｕ４３にて９７％の開裂；Ｇｌｕ６１にて５０
％の開裂 Ｅ：Ｌｙｓ４７にて１００％の開裂；Ｌｙｓ３６にて１
００％の開裂
物質濃度 Ｂ：ｒＨＶ１と異るｒＨＶ３の残基：Ile １，Thr ２，
Lys ２４，Gln ３３，Lys ３５，Asp ３６，Gln ５３，
Pro ５８，Asp ６２，Ala ６３，Asp ６５，Glu ６６ Ｃ：還元されそしてＳ−カルボキシメチル化されたｒＨ
Ｖ１ Ｄ：Ｇｌｕ４３にて９７％の開裂；Ｇｌｕ６１にて５０
％の開裂 Ｅ：Ｌｙｓ４７にて１００％の開裂；Ｌｙｓ３６にて１
００％の開裂
【０１１０】ＭＡｂ４１５８−８１−７は溶液中のｒＨ
Ｖ１を３．５ng／mlのＩＣ50値をもって結合するが、ｒ
ＨＶ１配列のほとんどを含む４種のｒＨＶ１ペプチド１
−１５，２９−３８，４０−６５及び５２−６５との交
叉反応性を示さない。さらに、還元されそしてＳ−カル
ボキシメチル化されたｒＨＶ１の結合は未修飾のｒＨＶ
１に比べて劇的に低下し、コンホーメーション依存的エ
ピトープが示唆される。
Ｖ１を３．５ng／mlのＩＣ50値をもって結合するが、ｒ
ＨＶ１配列のほとんどを含む４種のｒＨＶ１ペプチド１
−１５，２９−３８，４０−６５及び５２−６５との交
叉反応性を示さない。さらに、還元されそしてＳ−カル
ボキシメチル化されたｒＨＶ１の結合は未修飾のｒＨＶ
１に比べて劇的に低下し、コンホーメーション依存的エ
ピトープが示唆される。
【０１１１】ＭＡｂ４１５８−８１−７はｒＨＶ１のＮ
−末端コアードメイン及びｒＨＶ１コアードメインが無
傷のままであるＶ８プロテアゼで消化されたｒＨＶ１と
完全に交叉反応する。ｒＨＶ１の１−４３及びＶ８−消
化されたｒＨＶ１に対するＭＡｂの親和性は全体ｒＨＶ
１分子よりも高く、Ｃ−末端ドメインの幾らかの立体障
害が存在することが示唆される。確かに、免疫感作のた
めｒＨＶ１が主としてＣ−末端ドメインを介してＫＨＬ
に連結され、これはその自然のコンフィグレーションを
変えるのかも知れない。
−末端コアードメイン及びｒＨＶ１コアードメインが無
傷のままであるＶ８プロテアゼで消化されたｒＨＶ１と
完全に交叉反応する。ｒＨＶ１の１−４３及びＶ８−消
化されたｒＨＶ１に対するＭＡｂの親和性は全体ｒＨＶ
１分子よりも高く、Ｃ−末端ドメインの幾らかの立体障
害が存在することが示唆される。確かに、免疫感作のた
めｒＨＶ１が主としてＣ−末端ドメインを介してＫＨＬ
に連結され、これはその自然のコンフィグレーションを
変えるのかも知れない。
【０１１２】例５．３のダブルサンドイッチＥＬＩＳＡ
において、ＭＡｂ４１５８−８１−７は、Ｃ−末端ドメ
インに結合する任意の抗−ヒルジンＭＡｂに結合し（Ｓ
ｃｈｌａｅｐｐｉら、前に引用）、オーバラップするエ
ピトープが無いことが示唆される。しかしながら、ドメ
イン４１−４７内の残基に結合するＭＡｂ４０４９−８
３−１２にＭＡｂ４１５８−８１−７が結合する場合、
１０〜２０倍高い濃度のｒＨＶ１が必要である。これは
両ＭＡｂのエピトープの間の部分的オーバーラップを示
し、このことはＶ８−プロテアーゼによるｒＨＶ１／抗
体−複合体の限定的蛋白質分解によりさらに確認され
る。Ｇｌｕ４３とＧｌｙ４４との間の開裂はｒＨＶ１へ
のＭＡｂ４１５８−８１−７の結合により防止される。
において、ＭＡｂ４１５８−８１−７は、Ｃ−末端ドメ
インに結合する任意の抗−ヒルジンＭＡｂに結合し（Ｓ
ｃｈｌａｅｐｐｉら、前に引用）、オーバラップするエ
ピトープが無いことが示唆される。しかしながら、ドメ
イン４１−４７内の残基に結合するＭＡｂ４０４９−８
３−１２にＭＡｂ４１５８−８１−７が結合する場合、
１０〜２０倍高い濃度のｒＨＶ１が必要である。これは
両ＭＡｂのエピトープの間の部分的オーバーラップを示
し、このことはＶ８−プロテアーゼによるｒＨＶ１／抗
体−複合体の限定的蛋白質分解によりさらに確認され
る。Ｇｌｕ４３とＧｌｙ４４との間の開裂はｒＨＶ１へ
のＭＡｂ４１５８−８１−７の結合により防止される。
【０１１３】グループＩの残りのＭＡｂはｒＨＶ１ペプ
チド１−４３と交叉反応し、グループＩのＭＡｂがｒＨ
Ｖ１のＮ−末端コアードメインにのみ結合することを示
唆する。これらの結果はまた、スロンビン／ｒＨＶ１−
複合体の表面に接近可能なｒＨＶ１の主要抗原中決定基
がＮ−末端コアードメインに排他的に位置しこれはスロ
ンビン／ヒルジン−複合体の結晶構造により示唆される
(Gruetter ら、EMBO Journal ９，2361，1990）。
チド１−４３と交叉反応し、グループＩのＭＡｂがｒＨ
Ｖ１のＮ−末端コアードメインにのみ結合することを示
唆する。これらの結果はまた、スロンビン／ｒＨＶ１−
複合体の表面に接近可能なｒＨＶ１の主要抗原中決定基
がＮ−末端コアードメインに排他的に位置しこれはスロ
ンビン／ヒルジン−複合体の結晶構造により示唆される
(Gruetter ら、EMBO Journal ９，2361，1990）。
【０１１４】ＭＡｂ４１５８−８１−７は溶液中のスロ
ンビン／ｒＨＶ１−複合体には結合しないが、しかしミ
クロタイタープレートのごとき固体表面上に吸着された
又はＭＡｂ ＥＳＴ６又はＭＡｂ４１０７−７６−１に
より表される複合体に結合する。さらに、ＭＡｂ４１５
８−８１−７ビオチン化スロンビン／ｒＨＶ１−複合体
に結合しない（ＭＡｂ４１０７−７６−１とは対照的で
あり、下記参照のこと）。
ンビン／ｒＨＶ１−複合体には結合しないが、しかしミ
クロタイタープレートのごとき固体表面上に吸着された
又はＭＡｂ ＥＳＴ６又はＭＡｂ４１０７−７６−１に
より表される複合体に結合する。さらに、ＭＡｂ４１５
８−８１−７ビオチン化スロンビン／ｒＨＶ１−複合体
に結合しない（ＭＡｂ４１０７−７６−１とは対照的で
あり、下記参照のこと）。
【０１１５】従って、溶液中のスロンビン／ｒＨＶ１−
複合体のコンホーメーションは固体支持体上のそれと異
ること、及びＭＡｂ４１５８−８１−７が結合するｒＨ
Ｖ１のコアードメインは後者のコンホーメーションにお
いてのみ露出されることが確認される。その結果、ＭＡ
ｂ４１５８−８１−７は一般的にではなく限定された条
件下でのみスロンビン／ｒＨＶ１−複合体と交叉反応す
る。
複合体のコンホーメーションは固体支持体上のそれと異
ること、及びＭＡｂ４１５８−８１−７が結合するｒＨ
Ｖ１のコアードメインは後者のコンホーメーションにお
いてのみ露出されることが確認される。その結果、ＭＡ
ｂ４１５８−８１−７は一般的にではなく限定された条
件下でのみスロンビン／ｒＨＶ１−複合体と交叉反応す
る。
【０１１６】６．２ グループIIのモノクローナル抗体 グループIIの４種のＭＡｂの内、唯１種のＭＡｂがｒＨ
Ｖ１と交叉反応するが親和性は非常に低い。例５．２の
競争的ＥＬＩＳＡにより示されるように、このモノクロ
ーナル抗体はまたｒＨＶ１コアードメイン（残基１−４
３）と反応し、これがグループＩのＭＡｂに密接に関連
することが示される。残りＭＡｂの内ＭＡｂ４１０７−
７６−１は、スロンビン／ｒＨＶ１−複合体に非常に強
く結合するので、さらに詳細に研究される。これはｒＨ
Ｖ１にも溶液中のスロンビンにも結合しない。
Ｖ１と交叉反応するが親和性は非常に低い。例５．２の
競争的ＥＬＩＳＡにより示されるように、このモノクロ
ーナル抗体はまたｒＨＶ１コアードメイン（残基１−４
３）と反応し、これがグループＩのＭＡｂに密接に関連
することが示される。残りＭＡｂの内ＭＡｂ４１０７−
７６−１は、スロンビン／ｒＨＶ１−複合体に非常に強
く結合するので、さらに詳細に研究される。これはｒＨ
Ｖ１にも溶液中のスロンビンにも結合しない。
【０１１７】しかしながらこのＭＡｂはミクロタイター
プレート上に吸着したスロンビンに結合する。幾つかの
証拠が示すところによれば、スロンビンが固相に吸着さ
れた時にのみ結合が生じ、それが溶液中にある時には生
じない。まず、例５．６に記載したゲル濾過ＨＰＬＣ実
験において、ＭＡｂ４１０７−７６−１は複合体には結
合するが、遊離のスロンビンには結合しない。遊離ｒＨ
Ｖ１のみを認識する抗−ｒＨＶ１ ＭＡｂ４０４９−８
３−１２は対照として作用される。第二に、ビオチン化
されたスロンビンを用いて、ＭＡｂ４１０７−７６−１
は複合体にのみ結合し、しかし遊離ビオチン化スロンビ
ンには結合せず、他方抗−スロンビンＭＡｂ ＥＳＴ６
は両者を認識する。最後に、プレートへのスロンビンの
直接吸着を防止するためにＭＡｂ ＥＳＴ６を用いるダ
ブルサンドイッチＥＬＩＳＡにより、ＭＡｂ４１０７−
７６−１の結合は複合体とのみ生じ、遊離のスロンビン
とでは生じない。
プレート上に吸着したスロンビンに結合する。幾つかの
証拠が示すところによれば、スロンビンが固相に吸着さ
れた時にのみ結合が生じ、それが溶液中にある時には生
じない。まず、例５．６に記載したゲル濾過ＨＰＬＣ実
験において、ＭＡｂ４１０７−７６−１は複合体には結
合するが、遊離のスロンビンには結合しない。遊離ｒＨ
Ｖ１のみを認識する抗−ｒＨＶ１ ＭＡｂ４０４９−８
３−１２は対照として作用される。第二に、ビオチン化
されたスロンビンを用いて、ＭＡｂ４１０７−７６−１
は複合体にのみ結合し、しかし遊離ビオチン化スロンビ
ンには結合せず、他方抗−スロンビンＭＡｂ ＥＳＴ６
は両者を認識する。最後に、プレートへのスロンビンの
直接吸着を防止するためにＭＡｂ ＥＳＴ６を用いるダ
ブルサンドイッチＥＬＩＳＡにより、ＭＡｂ４１０７−
７６−１の結合は複合体とのみ生じ、遊離のスロンビン
とでは生じない。
【０１１８】ｒＨＶ１のＣ−末端ペプチド４０−６５が
複合体中のｒＨＶ１を置換する時、ＭＡｂ４１０７−７
６−１の結合が生じず、結合のために全体ｒＨＶ１分子
が必要であることが示される。しかしながら、変形体ｒ
ＨＶ３によるｒＨＶ１の置換は複合体へのＭＡｂ４１０
７−７６−１の結合を部分的にのみ低下せしめ、ＭＡｂ
が共通の決定基を認識することが示唆される。小分子量
阻害物質もヘパリンもスロンビンへのＭＡｂの結合を誘
導することができないであろう。これらの結果が示唆す
るところによれば、ＭＡｂ４１０７−７６−１は、固体
表面へのｒＨＶ１又はスロンビンの吸着の後に発現され
るスロンビン上のネオエピトープを認識する。
複合体中のｒＨＶ１を置換する時、ＭＡｂ４１０７−７
６−１の結合が生じず、結合のために全体ｒＨＶ１分子
が必要であることが示される。しかしながら、変形体ｒ
ＨＶ３によるｒＨＶ１の置換は複合体へのＭＡｂ４１０
７−７６−１の結合を部分的にのみ低下せしめ、ＭＡｂ
が共通の決定基を認識することが示唆される。小分子量
阻害物質もヘパリンもスロンビンへのＭＡｂの結合を誘
導することができないであろう。これらの結果が示唆す
るところによれば、ＭＡｂ４１０７−７６−１は、固体
表面へのｒＨＶ１又はスロンビンの吸着の後に発現され
るスロンビン上のネオエピトープを認識する。
【０１１９】クリスタログラフのデーター（Ｇｒｕｔｔ
ｅｒら、前記）により確認されるようにスロンビンはｒ
ＨＶ１の結合の後にコンホーメーション変化を受ける
（S. Konnoら、Arch. Biochem. Biophys. 267, 158,198
8)。このコンホーメーション変化がイムノドミナント
（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎｕｎｔ）ネオエピトープを形
成するのかも知れない。固体表面に吸着後の抗原のコン
ホーメーション変化又は部分的変性さえよく記載され、
そして表面吸着したスロンビンへのＭＡｂ４１０７−７
６−１の結合を説明することができよう。グループIIの
モノクローナル抗体ＭＡｂ４１０７−７６−１の幾つか
の試験結果を表２に示す。
ｅｒら、前記）により確認されるようにスロンビンはｒ
ＨＶ１の結合の後にコンホーメーション変化を受ける
（S. Konnoら、Arch. Biochem. Biophys. 267, 158,198
8)。このコンホーメーション変化がイムノドミナント
（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎｕｎｔ）ネオエピトープを形
成するのかも知れない。固体表面に吸着後の抗原のコン
ホーメーション変化又は部分的変性さえよく記載され、
そして表面吸着したスロンビンへのＭＡｂ４１０７−７
６−１の結合を説明することができよう。グループIIの
モノクローナル抗体ＭＡｂ４１０７−７６−１の幾つか
の試験結果を表２に示す。
【０１２０】 表 ２ ＭＡｂへのスロンビン／ｒＨＶ１−複合体の結合のＥＬＩＳＡ測定 ─────────────────────────────────── 吸光度（４０５nm） 添加した試薬A ────────────────── ＭＡｂ4107-76-1 ＭＡｂ ＥＳＴ６ ─────────────────────────────────── ビオチン化スロンビン ０．０４０ ０．７１９ ビオチン化スロンビン及びｒＨＶ１ １．０２７ １．０１８ ビオチン化ｒＨＶ１ ０．０１３ ０．０２０ ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ０．００９ ０．０１７ ─────────────────────────────────── Ａ：試薬はＭＡｂをコートしたミクロタイタープレート
に加えられ、そしてアルカリホスファターゼ結合ストレ
プトアビジンにより検出される。
に加えられ、そしてアルカリホスファターゼ結合ストレ
プトアビジンにより検出される。
【０１２１】例７．血漿中のスロンビン／ヒルジン−複
合体の測定のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ 血漿中のスロンビン／ヒルジン−複合体の特異的測定
を、捕捉抗体としてＭＡｂ４１０７−７６−１を用いそ
して第二抗体としてビオチン化ＭＡｂ４１５８−８１−
７を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡにより行う。このＥ
ＬＩＳＡは例５．４に記載したＥＬＩＳＡの変法であっ
て、ＭＡｂ ＥＳＴ６の代りにＭＡｂ４１０７−７６−
１を用い、そして次に記載する様にして行う。
合体の測定のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ 血漿中のスロンビン／ヒルジン−複合体の特異的測定
を、捕捉抗体としてＭＡｂ４１０７−７６−１を用いそ
して第二抗体としてビオチン化ＭＡｂ４１５８−８１−
７を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡにより行う。このＥ
ＬＩＳＡは例５．４に記載したＥＬＩＳＡの変法であっ
て、ＭＡｂ ＥＳＴ６の代りにＭＡｂ４１０７−７６−
１を用い、そして次に記載する様にして行う。
【０１２２】ミクロタイタープレートをＭＡｂ４１０７
−７６−１（０．２μｇ／１００μｌ）によりコートす
る。ＰＢＳ−ＢＳＡ１％によるブロッキング及びＰＢＳ
−Ｔｗｅｅｎ０．１％による洗浄の後、被験血漿２００
μｌをウエルに加え、そして２時間インキュベートす
る。
−７６−１（０．２μｇ／１００μｌ）によりコートす
る。ＰＢＳ−ＢＳＡ１％によるブロッキング及びＰＢＳ
−Ｔｗｅｅｎ０．１％による洗浄の後、被験血漿２００
μｌをウエルに加え、そして２時間インキュベートす
る。
【０１２３】次に、（１）０．５μｇ／１００μｌのビ
オチン化ＭＡｂ４１５８−８１−７を２時間、（２）ア
ルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（１：２
５００希釈）を１．５時間、及び（３）基質（例５．２
を参照のこと）を次々に加える。インキュベーションは
２２℃にて行う。各段階の間にプレートをＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎ０．１％により洗浄する。１５〜３０分間に４０
５nmにて吸光度をモニターする。この試験は、１〜２０
０ng／mlの濃度範囲でのスロンビン／ヒルジン−複合体
の存在及び／又は濃度を決定する。
オチン化ＭＡｂ４１５８−８１−７を２時間、（２）ア
ルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（１：２
５００希釈）を１．５時間、及び（３）基質（例５．２
を参照のこと）を次々に加える。インキュベーションは
２２℃にて行う。各段階の間にプレートをＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎ０．１％により洗浄する。１５〜３０分間に４０
５nmにて吸光度をモニターする。この試験は、１〜２０
０ng／mlの濃度範囲でのスロンビン／ヒルジン−複合体
の存在及び／又は濃度を決定する。
【０１２４】例８．スロンビン／ヒルジン−複合体の測
定のためのＥＬＩＳＡ用試験キット 例７に記載するＥＬＩＳＡ用試験キットは次のものを含
む。 ・ポリ塩化ビニル ミクロタイタープレート； ・コーティング緩衝液中モノクローナル抗体ＭＡｂ４１
０７−７６−１（１０μｇ／ml）２０ml； ・ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％中ビオチン化ＭＡｂ４１
５８−８１−７（５μｇ／ml）２０ml； ・５μｇのｒＨＶ１を含有する標準溶液２ml； ・３００mlのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％； ・３００mlのＰＢＳ−ＢＳＡ０．１％； ・０．５mlのアルカリホスファターゼ結合ストレプトア
ビジン； ・ジエタノールアミン緩衝液（１０％，０．５Ｍ Ｍｇ
Ｃｌ2 ，０．０２％ＮａＮ3 ，ＨＣｌにてpH８．９に調
整）中ｐ−ニトロフェニルホスフェート（１mg／ml）５
０ml； ・換算曲線； ・色度スケール；及び ・手引き書。
定のためのＥＬＩＳＡ用試験キット 例７に記載するＥＬＩＳＡ用試験キットは次のものを含
む。 ・ポリ塩化ビニル ミクロタイタープレート； ・コーティング緩衝液中モノクローナル抗体ＭＡｂ４１
０７−７６−１（１０μｇ／ml）２０ml； ・ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％中ビオチン化ＭＡｂ４１
５８−８１−７（５μｇ／ml）２０ml； ・５μｇのｒＨＶ１を含有する標準溶液２ml； ・３００mlのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％； ・３００mlのＰＢＳ−ＢＳＡ０．１％； ・０．５mlのアルカリホスファターゼ結合ストレプトア
ビジン； ・ジエタノールアミン緩衝液（１０％，０．５Ｍ Ｍｇ
Ｃｌ2 ，０．０２％ＮａＮ3 ，ＨＣｌにてpH８．９に調
整）中ｐ−ニトロフェニルホスフェート（１mg／ml）５
０ml； ・換算曲線； ・色度スケール；及び ・手引き書。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Claims (10)
- 【請求項１】 ヨーロピアン コレクション オブ ア
ニマル セル カルチャーズ（ECACC）にアクセス番号9
0061405として寄託されているハイブリドーマセルライ
ン4158−81−7により生産され、スロンビン／ヒルジン
複合体と反応するモノクローナル抗体4158−81−7、又
はこのモノクローナル抗体の特異性を維持している該モ
ノクローナル抗体の誘導体。 - 【請求項２】 ヨーロピアン コレクション オブ ア
ニマル セル カルチャーズ（ECACC）にアクセス番号9
0061404として寄託されているハイブリドーマセルライ
ン4107−76−1により生産され、スロンビン／ヒルジン
複合体と反応するモノクローナル抗体4107−76−1、又
はこのモノクローナル抗体の特異性を維持している該モ
ノクローナル抗体の誘導体。 - 【請求項３】 酵素、蛍光マーカー、化学発光マーカ
ー、金属キレート、アビジン又はビオチンとの結合体で
ある、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体の誘
導体。 - 【請求項４】 放射能ラベルされたモノクローナル抗体
である、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体の
誘導体。 - 【請求項５】 モノクローナル抗体の断片である、請求
項１又は２に記載のモノクローナル抗体の誘導体。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のモ
ノクローナル抗体又はその誘導体の製造方法において、
該モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマセルラ
インの細胞をインビボ又はイビトロで増加せしめ、所望
により得られたモノクローナル抗体を単離し、そして／
又はその誘導体に転換する、ことを特徴とする方法。 - 【請求項７】 ヨーロピアン コレクション オブ ア
ニマル セル カルチャーズ（ECACC）にアクセス番号9
0061405として寄託されており、請求項１に記載のモノ
クローナル抗体を分泌するハイブリドーマセルライン41
58−81−7。 - 【請求項８】 ヨーロピアン コレクション オブ ア
ニマル セル カルチャーズ（ECACC）にアクセス番号9
0061404として寄託されており、請求項２に記載のモノ
クローナル抗体を分泌するハイブリドーマセルライン41
07−76−1。 - 【請求項９】 請求項７又は８に記載のハイブリドーマ
セルラインの製造方法において、ヒト以外の動物を、キ
ャリヤーに結合したヒルジンにより又はスロンビン／ヒ
ルジン複合体により免疫し、前記動物の抗体産生細胞を
連続セルラインの細胞と融合せしめ、該融合において得
られたハイブリド細胞をクローニングし、そして所望の
モノクローナル抗体を分泌する細胞クローンを選択す
る、ことを特徴とする方法。 - 【請求項１０】 請求項１又は２に記載のモノクローナ
ル抗体及び／又はその誘導体、並びに所望により他のモ
ノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体及び／又
は助剤を含んで成る、スロンビン／ヒルジン複合体の定
性的又は定量的測定のための試験キット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB909021370A GB9021370D0 (en) | 1990-10-02 | 1990-10-02 | Monoclonal antibodies directed against complexes formed by thrombin and thrombin inhibitors |
| GB90213703 | 1990-10-02 | ||
| US07/763,860 US5296352A (en) | 1990-10-02 | 1991-09-23 | Monoclonal antibodies directed against complexes formed by thrombin and hirudin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05252984A JPH05252984A (ja) | 1993-10-05 |
| JP3226942B2 true JP3226942B2 (ja) | 2001-11-12 |
Family
ID=26297746
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25557891A Expired - Lifetime JP3226942B2 (ja) | 1990-10-02 | 1991-10-02 | スロンビンとスロンビン阻害物質とにより形成された複合体に対して向けられたモノクローナル抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5296352A (ja) |
| EP (1) | EP0479721B1 (ja) |
| JP (1) | JP3226942B2 (ja) |
| AU (1) | AU653549B2 (ja) |
| CA (1) | CA2052501A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994024566A1 (en) * | 1993-04-15 | 1994-10-27 | Baxter Diagnostics Inc. | Immunoassay and test kit for thrombin-antithrombin iii complex |
| AT404597B (de) * | 1995-11-24 | 1998-12-28 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von proteinen |
| IL209921A0 (en) | 2010-12-09 | 2011-02-28 | Omrix Biopharmaceuticals | Immunoassay for thrombin detection |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0168342B1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-03 | Ciba-Geigy Ag | Verfahren zur Herstellung von Thrombin-Inhibitoren |
| AU628921B2 (en) * | 1989-01-19 | 1992-09-24 | Teijin Limited | Immunoassay method, reagent and kit |
| DK0380443T4 (da) * | 1989-01-25 | 1999-11-29 | Novartis Ag | Monoklonale antistoffer specifikke for hirudin |
| AU628960B2 (en) * | 1989-04-07 | 1992-09-24 | Teijin Limited | Method of immunologically assaying human thrombin- antithrombin III complex, assay reagent and kit therefor |
-
1991
- 1991-09-23 US US07/763,860 patent/US5296352A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-24 AU AU84713/91A patent/AU653549B2/en not_active Ceased
- 1991-09-24 EP EP91810748A patent/EP0479721B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-30 CA CA002052501A patent/CA2052501A1/en not_active Abandoned
- 1991-10-02 JP JP25557891A patent/JP3226942B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU8471391A (en) | 1993-05-20 |
| AU653549B2 (en) | 1994-10-06 |
| EP0479721B1 (en) | 2002-08-07 |
| EP0479721A2 (en) | 1992-04-08 |
| EP0479721A3 (en) | 1992-08-05 |
| JPH05252984A (ja) | 1993-10-05 |
| CA2052501A1 (en) | 1992-04-03 |
| US5296352A (en) | 1994-03-22 |
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