JPH0677518B2

JPH0677518B2 - ヒトｐｓｔｉを認識するモノクローナル抗体、該抗体産生ハイブリドーマおよびヒトｐｓｔｉの測定方法

Info

Publication number: JPH0677518B2
Application number: JP63055431A
Authority: JP
Inventors: 恭三林; 真章黒部; 清永田; 信男吉田; 昌雄河野
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1988-03-08
Filing date: 1988-03-08
Publication date: 1994-10-05
Anticipated expiration: 2009-10-05
Also published as: CA1334077C; JPH01228494A; EP0332421A3; ATE94881T1; ES2059726T3; DE68909276T2; KR970008426B1; EP0332421A2; EP0332421B1; DE68909276D1; KR890014129A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、抗ヒト膵分泌性トリプシンインヒビターモノ
クローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマおよび該モノクローナル抗体を利用したヒト
PSTIの測定方法に関する。

従来の技術膵分泌性トリプシンインヒビター（PSTI）はKazalや
（J.Am.Chem.Soc.70,3034−3040（1948））によりウシ
膵液中に発見されたトリプシンインヒビターで、その
後、ブタ、ヒツジ、ヒト、イヌ、ラットの膵液からも同
様のインヒビターが精製されている。膵液中では本来消
化酵素類は不活性な前駆体として分泌され存在するが、
なんらかの要因により酵素の活性化が著しく進行する
と、膵組織の壊死のみならず他臓器の機能不全も伴う急
性膵炎を発症すると考えられる。PSTIは他の酵素前駆体
と同時に膵腺房細胞より膵液中に分泌され、酵素活性化
の引き金となるトリブシンがその前駆体より活性化され
た場合、直ちにそれに結合阻害し、酵素の本来の活性化
の場である十二指腸に達するまでその活性を制御するも
のと考えられる。このようにPSTIは急性膵炎の発症過程
における制御に大きな役割を果たしているが、また急性
膵炎の患者においては、このPSTIの血清中濃度が著しく
上昇することも知られている（北原他、胆と膵、３,383
−388（1892））。その他最近の知見によると、PSTIは
α₁-アンチトリプシンなどと同様な急性相反応物質とし
ての挙動（小川、胆と膵、７、1541−1549（1986））を
示すこと、及びある種の腫瘍マーカーともなりうること
（小川、臨床病理、34、1229−1235（1986））も示され
ている。このようにPSTIはその診断上の意義も大きいも
のがある。血清中PSTIの濃度測定については、本来のイ
ンヒビターとしての活性を調べる酵素学的方法は血清中
に他の多量のトリプシンインヒビターが存在することに
より困難であるが、すでにウサギ抗ヒトPSTI抗血清を用
いた拮抗法によるラジオイムノアッセイ（RIA）が確立
され（Eddeland＆Ohlsson、Hoppe-Seyler′s Z.Physio
l.Chem.,359、671−675（1978）；北原他、Biomedical
J.,３,1119−1123（1979）；特開昭56−46465、特開昭5
6−74653、特開昭56−74654）、同原理に基づきキット
化されたものも市販されている。これにより、該患者血
清中のPSTI測定値は、正常人に比べて著しい高値を示
し、実際に急性膵炎等の診断に利用されている。

発明が解決しようとする課題上記の様に、ヒトPSTIは免疫学的に測定されうるように
なっているが、上記の報告等で使用されている抗体は、
いずれもポリクローナル抗体（ウサギ抗血清）であり、
診断薬として用いるには、特異性、均一性、安定した供
給などの点から、モノクローナル抗体の方が望ましい。
また、異なる特異性を有し、かつ親和性の高いモノクロ
ーナル抗体を得ることができれば、それを用いて、PSTI
のより簡便な測定方法を開発することが可能になる。

課題を解決するための手段本発明は、ヒトPSTIに特異的でかつ親和性の高いモノク
ローナル抗体を得、もって急性膵炎などの診断に有効に
用いることができる測定方法を提供する。

本発明者らは、上記の状況を鑑み、鋭意研究を進め、ヒ
トPSTIに特異的でかつ親和性の高いモノクローナル抗体
を得た。

すなわち、本発明の抗ヒトPSTIモノクローナル抗体は、
ヒトPSTIで免疫したマウスリンパ球とミエローマ細胞と
の融合によって得たハイブリドーマが産生したものであ
ることを特徴とする。

本発明のモノクローナル抗体を得るために、まず、免疫
原としてヒトPSTIを精製することが必要である。ヒトPS
TIの精製は上記の通りいくつかの報告があり、該方法に
よって精製することができる。

得られた精製ヒトPSTIを免疫原として、実験動物例えば
マウスを免疫する。免疫方法は定法に従えばよく、例え
ば生理食塩水に溶かした抗原をフロイントの完全アジュ
バントと混合し、乳濁液としたものを投与する。

このようにして免疫された動物からＢリンパ球を得、こ
れを永久骨髄腫細胞系（例えばマウスX63-Ag8、NSI-Ag4
/1、P3X63-Ag8-U1など）と融合させる。この融合はＫ
hlerおよびMilsteinの公知方法（Nature 256,495−497,
1975）に準じて行なえばよい。これによって得られたハ
イブリドーマの中から抗ヒトPSTI抗体を産生しているも
のを選択する。

この選択は、培養上清中に抗ヒトPSTI抗体を有無を適当
な方法、例えば酵素免疫測定法（ELISA法）やラジオイ
ムノアッセイで調べて行なう。上清中に抗ヒトPSTI抗体
活性が確認されたウエルのハイブリドーマを培地２〜10
ml程度まで増殖させてから凍結保存する。その際採取し
た培養上清を用いて各ハイブリドーマの産生する抗体の
性質を調べ、目的にあった性質の抗体を産生するハイブ
リドーマを選び出す。選び出されたハイブリドーマを常
法、例えば限界希釈法でモノクローン化し、細胞株を確
立する。確立されたハイブリドーマ細胞株を、免疫に使
用した動物の腹腔内に移植し、抗体濃度の高い腹水を得
ることができるし、培地に培養しその培養液から該抗体
を得ることもできる。

このようにして得られた抗体は、必要に応じて精製して
使用することができる。例えば、硫安分画、イオン交換
クロマトグラフィー、プロテインＡカラム等の常法を用
いることによって精製することができる。

本発明においては、以上のようにして、抗ヒトPSTI抗体
を産生するハイブリドーマhPSTI−150、167および360と
それぞれの産生するモノクローナル抗体150、167及び36
0を得た。

得られたハイブリドーマ細胞株は、昭和62年12月３日か
ら、茨城県つくば市東１丁目１番３号の微生物工業技術
研究所に、下記の受託番号の下に、ブダペスト条約に基
づいて寄託されている。

Hybridoma hPSTI−150 ：微工研条寄第1585号（FERM BP−1585） Hybridoma hPSTI−167 ：微工研条寄第1583号（FERM BP−1583） Hybridoma hPSTI−360 ：微工研条寄第1584号（FERM BP−1584）モノクローナル抗体150、167、360は以下のような性質
を有している。

（１）イムノグロブリンクラス、サブクラスは、150
はIgG₂a、167と360はIgG₁でＬ鎖はいずれもκ型であ
る。

（２）結合定数は、150は4.9×10⁸M^-1、167は3.7×10
⁹M^-1、360は1.4×10⁹M^-1であり、いずれも親和性が高い
抗体である。

（３） 150はPSTIのトリプシン阻害活性を中和しない
が、167と360は阻害活性を中和する。すなわち、少なく
とも150は167、360と異なった特異性を有する。

このように、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトPSTI
に特異的でかつ親和性が高く、ヒトPSTIの免疫学的測定
法に用いる抗体として非常に優れた性質を有するもので
ある。

本発明のモノクローナル抗体を用いれば、例えば、以下
の様にしてPSTIを免疫学的に測定できる。

本発明のモノクローナル抗体を、¹²⁵I、¹³¹I等の放射性
同位元素で標識したヒトPSTIとともに使用することを特
徴とする競合法により、ヒト血清PSTIのラジオイムノッ
セイを行なうことができる。すなわち、イムノッセイ自
体は公知の方法に従って行ない、一定量の該モノクロー
ナル抗体に対し、一定量の¹²⁵I標識PSTI（公知のクロラ
ミンＴ法等によりPSTIのTyr残基に¹²⁵Iを導入したも
の）と標識ヒトPSTIあるいは血清試料を競合反応させ、
二抗体法あるいはポリエチレングリコール法等により抗
体と結合した¹²⁵I標識PSTI（bound）と遊離の¹²⁵I標識P
STI（free）を分離したのち、boundあるいはfreeの放射
活性を計測し、標準PSTIと血清試料の放射活性の対比に
よって血清PSTI濃度を求める。

また、本発明のモノクローナル抗体をペルオキシダー
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素で標識したヒト
PSTIとともに使用することを特徴とする競合法により、
ヒト血清PSTIのエンザイムノアッセイを行なうことがで
きる。すなわち、上記のラジオイムノアッセイの¹²⁵I標
識PSTIの代わりにペルオキシダーゼ等の酵素で標識した
ヒトPSTIを用いて、上記と同じ手順で測定する。酵素活
性は、たとえばペルオキシダーゼの場合には、ｏ−フェ
ニレンジアミンなどの発色剤を用いた比色法、ｐ−ヒド
ロキシフェニルプロピオン酸などの螢光基質を用いた螢
光法等により測定することができる。

このエンザイムノアッセイではboundとfreeの分離を必
要としない均一系の測定も可能である。たとえば、EMIT
（enzyme multiplied immunoassay technique）の商
品名で知られる測定法で、boundの酵素標識ヒトPSTIの
酵素活性が、抗体の立体障害あるいは酵素の活性中心の
構造変化によってfreeの場合に比べ減少したとき、その
減少度からboundの割合を知ることができる。その他、
エンザイムチャンネリングイムノアッセイ等の均一系の
測定法が挙げられる。

本発明のモノクローナル抗体を、アクリジニウムエステ
ルやイソルミノール等の化学発光物質あるいはルシフェ
リン等の生物発光物質で標識したヒトPSTIとともに使用
することを特徴とする競合法によりケミルミネッセント
イムノアッセイあるいはバイオルミネッセントイムノア
ッセイを行なうことができる。すなわち、上記のラジオ
イムノアッセイの¹²⁵I標識PSTIの代わりにアクリジニウ
ムエステル等の発光物質を標識したヒトPSTIを用いて上
記と同じ手順で測定する。boundあるいはfreeの発光強
度はルミノメーターにより計測する。

その他、フルオレッセインイソチオシアネート等の螢光
物質を標識したヒトPSTIを用いることを特徴とするフル
オロイムノアッセイが可能である。

また、本発明のモノクローナル抗体のうち、ヒトPSTI分
子に対する認識部位が異なる二種類のモノクローナル抗
体を使用することが特徴とする非競合法によるイムノア
ッセイが挙げられる。

上記に記載の二種類のモノクローナル抗体のうち、一方
が固相化されたもの、他方が¹²⁵I等の放射性同位元素で
標識されたものを用いることを特徴とするヒト血清PSTI
のイムノラジオメトリックアッセイも可能である。すな
わち、該モノクローナル抗体の一方をポリスチレンビー
ズ等の固相に吸着あるいは化学結合させ、他方を¹²⁵I等
の放射性同位元素で標識しておき、固相抗体に標準ヒト
PSTIあるいは血清試料を加えてヒトPSTIを抗体に結合さ
せ、次いで¹²⁵I標識抗体を加えて固相抗体上のヒトPSTI
に結合させたのち、上清（free）を除去し、boundの放
射活性を計測して標準ヒトPSTIと血清試料の放射活性の
対比によって血清PSTI濃度を求める。

また、固相抗体に標準ヒトPSTIあるいは血清試料と¹²⁵I
標識抗体を同時に加え、次いで上清を除去してboundの
放射活性を計測する方法（上記の二段階法に対し一段階
法）も可能である。

次に、上記に記載のモノクローナル抗体のうち、一方が
固相化されたもの、他方がペルオキシダーゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ等の酵素で標識されたものを使用する
ことを特徴とする広義のイムノエンザイモメトリックア
ッセイが挙げられる。すなわち、該モノクローナル抗体
の一方をポリスチレンビーズ等の固相に吸着あるいは化
学結合させ、他方をペルオキシダーゼ（マレイイミド
法、過ヨウ素酸酸化法等により標識）、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ（マレイイミド法、グルタールアルデヒド法
等により標識）等の酵素で標識しておき、固相抗体に標
準ヒトPSTIあるいは血清試料を加えてヒトPSTIを抗体に
結合させ、ついで酵素標識抗体を加えて固相抗体上のヒ
トPSTIに結合させたのち、上清（free）を除去し、boun
dの酵素活性を測定して標準ヒトPSTIと血清試料の酵素
活性の対比によって血清PSTI濃度を求める。また、一段
階法による測定も可能である。ペルオキシダーゼあるい
はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素活性は、それぞれ
ｏ−フェニレンジアミンあるいはｏ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトシドなどの発色剤を用いた比色法、ｐ
−ヒドロキシフェニルプロピオン酸あるいは４−メチル
ウンベリフェリール−β−Ｄ−ガラクトシドなどの螢光
基質を用いた螢光法等により測定することができる。

非競合法によるエンザイムイムノアッセイでは、bound
とfreeを分離する必要がない均一系の測定法も可能であ
る。

上記に記載のモノクローナル抗体のうち、一方がβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼで標識されたもの、他方がサクシニ
ル化されたもので、これらをデキスランに結合させたｏ
−フェニル−β−Ｄ−ガラクトシドとともに用いること
を特徴とするヒト血清PSTIのエンザイムインハンスドイ
ムノアッセイ（enzyme enhanced immunoassay）も可能
である。すなわち、マイレイミド法等により該モノクロ
ーナル抗体の一方をβ−Ｄ−ガラクトシダーゼで標識
し、他方を無水コハク酸でサクシニル化しておく。標識
ヒトPSTIあるいは血清試料に前記の二種類の修飾抗体を
加えてヒトPSTI分子に結合させ、これにデキストランを
結合させたｏ−フェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを加え
たのち、比濁計により濁度を測定する。標準ヒトPSTIと
血清試料の濁度の対比によって血清PSTI濃度を求める。

また、上記に記載のモノクローナル抗体のうち、一方が
固相化されたもの、他方がアクリジニウムエステル等の
発光物質で標識されたものを用いることを特徴とするイ
ムノルミノメトリックアッセイが挙げられる。すなわ
ち、該モノクローナル抗体の一方をポリスチレンビーズ
等の固相に吸着あるいは化学結合させ、他方を４−（２
−サクシンイミジルオキシカルボキシエチル）フェニル
−10−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレート
フルオロスルフォネートのようなアクリジニウムエステ
ルなどで標識（上記のアクリジニウムエステルのDMF溶
液に抗体を含むリン酸緩衝液、pH8.0を加えることによ
り標識する。）しておき、固相抗体に標準ヒトPSTIある
いは血清試料を加えてヒトPSTIを抗体に結合させ、次い
で発光物質を標識した抗体を加えて固相抗体上のヒトPS
TIに結合させたのち、上清（free）を除去し、boundの
発光強度をルミノメーターにより計測して、標準ヒトPS
TIと血清試料の発光強度の対比によって血清PSTI濃度を
求める。

本発明のモノクローナル抗体の１つを、ウサギなどを感
作して作製した抗ヒトPSTIポリクローナル抗体とともに
使用することを特徴とする非競合法によるイムノアッセ
イも可能である。モノクローナル抗体とポリクローナル
抗体の一方を固相化し、他方を放射性同位元素、酵素あ
るいは発光物質等で標識し、上記と同じ手順で測定す
る。

また、上記の２種類の抗体を組合わせた非競合法による
イムノアッセイの場合には以下に示す方法も可能であ
る。

あらかじめ、該モノクローナル抗体をポリスチレンボー
ルなどの固相に吸着あるいは化学結合し、またヤギ抗ウ
サギIgG抗体を前記の放射性同位元素、酵素あるいは発
光物質等で標識しておく、固相抗体に標準ヒトPSTIある
いは血清試料を加え、次いでウサギ抗ヒトPSTIポリクロ
ーナル抗体（抗血清）を加えて固相抗体上のヒトPSTIに
結合させたのち、酵素等で標識したヤギ抗ウサギIgG抗
体を加えてウサギ抗ヒトPSTIポリクローナル抗体に結合
させ、boundの酵素活性を前記と同じ方法で測定する。

以上の様に、様々な免疫学的測定法が実施可能である
が、これらに限定されるものではなく、公知の殆どの測
定法が適用可能である。

実施例実施例１抗ヒトPSTIモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマの作成と抗体の産生（１）抗原の調製抗原として用いたヒトPSTI（以後、PSTIと略する場合が
ある。）はヒト膵液から菊池らの方法（J.Biochemistry
98,687−694,1985）に従って精製した。

（２）免疫ヒトPSTIの生理食塩水溶液（0.5あるいは0.1mg/ml）と
フロイントの完全アジュバントを当量ずつ混合して乳濁
液とし、これをBALB/cマウス（雌、５週令）の背部皮下
に0.2mlずつ４週間隔で４回注射した。マウス１匹当りP
STIの投与量は50あるいは10μｇである。さらに、４回
目免疫の10日後にブースター免疫として、ヒトPSTI50μ
ｇを溶解した生理食塩水200μｌを腹腔内に投与した。

（３）細胞融合ブースター免疫から３日後にマウスの脾臓を摘出し、そ
の細胞を0.17M塩化アンモニウム溶液中に氷冷下５分間
置いて赤血球を破壊した。残った細胞をRPMI1640培地に
懸濁して、細胞融合に用いる脾リンパ球とした。次に、
同じくRPMI1640培地に懸濁した８−アザグアニン耐性ミ
エローマ細胞（NS−１）6.3×10⁷（あるいは3.5×10⁷）
個と脾リンパ球1.9×10⁸（あるいは3.5×10⁸）個を混合
し、遠心（1,000rpm、10分間）後上清を除去した。細胞
沈澱物に、RPMI1640培地に溶かした50％ポリエチレング
リコール（分子量4,000、Merck）1.0mlを１分間かけて
ピペットの先で撹拌しながら加え、さらに1.5分間撹拌
した。その後2mlのRPMI1640を２分間かけて、次に同じ
く2mlを１分間かけて撹拌しながら加えた。さらに、18m
lのRPMI1640を緩やかに撹拌しながら徐々に滴加した。
遠心（1,000rpm、10分間）後、上清を除去し、沈殿した
細胞をHAT培地（１×10^-4Mヒポキサンチン、４×10^-7M
アミノプテリン、1.6×10^-5Mチミジンを含む20％FCS−R
PMI1640培地）90（あるいは160）mlに懸濁し、96ウエル
細胞培養プレート（Costar）９（あるいは16）枚の各ウ
エルに0.1mlずつ分注した。細胞培養プレートには前も
って栄養細胞としてマウス脾臓細胞のHAT培地懸濁液を
１×10⁵個/0.1ml/ウエルずつ入れておいた。以後２〜３
日に一度ずつHAT培地を半量ずつ新しいものと入れ変え
た。約10日後にはハイブリドーマの増殖が認められた。
ハイブリドーマが増殖してきたウエルは全部で629ウエ
ル（25％）であった。

（４）ハイブリドーマの凍結保存増殖してきたすべてのハイブリドーマをHT培地（上記HA
T培地からアミノプテリンを除いたもの）中で培地約2ml
まで増殖させ、凍結用培地（10％DMSOを含むウシ胎児血
清）0.15mlに懸濁して−80℃に凍結保存した。各培養上
清は、産生抗体の性質を調べるために採取保存した。

（５）ハイブリドーマの選択予備的にPSTIをコートした96ウエルマイクロプレート
（0.1μg/ウエル）によるELISA法で、大部分のハイブリ
ドーマが抗PSTI抗体を産生していることがわかったた
め、イムノアッセイに適するような高親和性の抗体産生
株を選択するためにラジオイムノアッセイを試みた。

上記のハイブリドーマ凍結保存時に採取した培養上清の
原液、10倍、100倍希釈液100μｌと¹²⁵I標識ヒトPSTI
（実施例３に記載）100μｌおよび２％ウシガンマグロ
ブリンを含むアッセイ用緩衝液（0.9％塩化ナトリウ
ム、0.1％アジ化ナトリウム、1mMエチレンジアミン四酢
酸四ナトリウムおよび0.5％牛血清アルブミンを有する
0.01Mリン酸緩衝液（pH7.4））50μｌを混合し、37℃で
１時間インキュベーションした。次に、２％ウシガンマ
グロブリンを含むリン酸緩衝化生理食塩液100μｌと20
％ポリエチレングリコール6000溶液500μｌを加えて直
ちに撹拌し、遠心（3,000rpm、20分間）後、上清を吸引
除去して沈殿の放射能を測定し、抗体に結合した¹²⁵I標
識ヒトPSTIの割合を求めた。同時に、50μｌのアセイ用
緩衝液の代わりに、ヒトPSTI 40ng/mlを含むアッセイ用
緩衝液50μｌを加えて同様の操作を行ない、¹²⁵I標識ヒ
トPSTIの放射能の沈殿からの減少、すなわち添加したヒ
トPSTIによって¹²⁵I標識ヒトPSTIがどの程度抗体から置
換されたかを調べた。この置換の割合が大きな培養上清
が親和性の高い抗体を含んでいるものとした。このよう
な方法により、10倍希釈した上清を用いたときに総PSTI
量に対する結合PSTI量（B/T）の割合が20％以上のも
の、さらに10倍あるいは100倍希釈液でPSTIにより結合
標識PSTIの10％以上が置換されるものという条件で、21
株のハイブリドーマを選択した。

（６）ハイブリドーマの選択（５）で選択した21株のハイブリドーマの培養上清をB/
T＝25となるように調整した希釈液を用いて、（５）と
同様にRIAを行なった。今回はPSTIの標準曲線を求める
ため、標準PSTI溶液（０、２、８、32、125、500ng/m
l）各50μｌをアッセイ用緩衝液50μｌの代わりに加え
た。（５）と同様の操作の後、得られた結合標識PSTI量
に基づいて標準曲線を作成し、さらに公知のScatchard
Plot法（Ann.N.Y.Acad.Sci.51,660（1949））により、
各上清に含まれる抗体とPSTIの結合定数を求めた。この
結果、結合定数として１×10⁸M^-1以上の値を示したハイ
ブリドーマのみを選択し、150、167、179、360、384、4
32、622の７株を得た。各抗体の結合定数は各々4.9×10
⁸、3.7×10⁹、4.8×10⁸、1.4×10⁹、6.0×10⁹、5.1×10
⁸、1.7×10⁸M^-1であった。

これらの抗体のうち親和性が高く、かつ抗体産生率の高
い167株を選択した。また、上記の抗体を組み合わせた
イムノラジオメトリックアッセイ（後記）により、該サ
ンドイッチ法に最適な抗体の組み合わせを調べ（第１図
参照）、150と360株を選択した。

（７）モノクローン化上記の選択法により選択されたハイブリドーマを凍結か
ら起こし、限界希釈法でクローニングした。96ウエル細
胞培養プレートにハイブリドーマを0.5個/200μl/ウエ
ルの濃度で培養し、ハイブリドーマが単一コロニーで増
殖してきたウエルの培養上清について上記ラジオイムノ
アッセイを行ない、抗ヒトPSTI抗体陽性のウエルのハイ
ブリドーマを培養拡大した。このようにして抗ヒトPSTI
抗体産生ハイブリドーマ細胞株150、167及び360を確立
した。

（８）腹水抗体液の作製確立したハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、抗体
濃度の高い腹水を作製した。マウス（BALB/c、雌、10日
前にプリスタンを0.5ml腹腔内投与）にリン酸緩衝化生
理食塩液に懸濁したハイブリドーマ約３×10⁶個の腹腔
内に投与した。１〜３週目に適宜腹水を採取し、細胞を
遠心分離した後、上清にアジ化ナトリウム0.1％を加え
て、凍結保存した。この方法でハイブリドーマ150、167
及び360の産生するモノクローナル抗体を高濃度に含む
腹水150A、167A及び360Aを得た。

（９）モノクローナル抗体の精製アフィゲルプロテインＡ MAPS−IIキット（Bio-Rad
社）を用いて、腹水150A、167A及び360Aより抗体を精製
した。ゲル2mlを用いて、腹水それぞれ1mlをキットの操
作手順に従って精製したところ、150Aから約7mg、167A
から約6mg、360Aから約6mgの抗体を得ることができた。
抗体の純度の確認には、SDS−ポリアクリルアミド電気
泳動を用いた。精製した抗体画分を２−メルカプトエタ
ノールで還元した後、12.5％SDSゲルで泳動を行なっ
た。その結果、分子量約53,000前後にＨ鎖、約26,000前
後にＬ鎖の２つのバンドが認められた。

実施例２モノクローナル抗体の性質（１）クラス・サブクラスの決定ハイブリドーマが産生した免疫グロブリンのクラス・サ
ブクラスの決定は、マウスイムノグロブリン各クラス・
サブクラスに特異的なウサギIgG抗体およびペルオキシ
ダーゼ標識したヤギ抗ウサギ抗体（MonoAb-ID EIA Ki
t、Zymed Laboratories）を用いて、上記のELISAに準じ
て行なった。その結果、腹水150Aは抗γ₂a抗体及び抗κ
抗体、167A及び360Aは抗γ_１抗体および抗κ抗体を用い
たときに発色が認められた。

従って、150はIgG₂a、167と360はIgG₁に属し、Ｌ鎖はい
ずれもκ型であることが判った。

（２）モノクローナル抗体の免疫学的性質後記実施例に示すラジオイムノアッセイにより、前記実
施例１−（８）に記載した抗PSTIモノクローナル抗体を
含む腹水150A、167Aおよび360Aの免疫学的性質を調べ
た。

抗体価段階的に４倍希釈（2000〜2048000倍）した抗体溶液500
μｌをポリスチレンチューブにとり¹²⁵I標識PSTI溶液
（5.5×10⁵dpm/ml）100μｌおよび測定緩衝液（標準PST
I0濃度溶液）50μｌを加え混和し、37℃で２時間インキ
ュベーションした。以下、前記の方法に従って測定し
た。

加えた¹²⁵I標識PSTIのカウント数（Ｔ）に対する各希釈
抗体のカウント数（Ｂ）の比率（B/T％）をlin側に、抗
体の希釈倍数をlog側にプロットして希釈曲線を作成し
た。抗体価は、¹²⁵I標識PSTI55000dpmの20％が結合する
のに要する150、167及び360抗体の希釈倍数で表わした
値で、それぞれ100000、150000及び360000倍であった。

それぞれの抗体の希釈曲線は第２図に示すとおりであっ
た。

親和性公知のScatchard Plot法［Ann.N.Y.Acad.Sci.,51,660
（1949）］より求めた150A、167Aおよび360AとPSTIとの
結合定数は、それぞれ4.9×10⁸M^-1、3.7×10⁹M^-1および
1.4×10⁹M^-1であった。

交差反応性 150A、167Aおよび360Aに対するdes（１−５）−PSTIの
交差反応性は第３図に示すとおりで、PSTIを100％とし
たとき、それぞれ＜５、90及び290％であった。

また、150A、167Aおよび360Aは動物血清に対して全く交
差反応性を示さなかった。

モノクローナル抗体によるPSTIのトリプシン阻害活性の
中和実施例１（９）の方法で腹水150A、167A、360Aより精製
したIgG各々約15μｇとPSTI0.5μｇを含む0.9mlの0.1M
トリス塩酸緩衝液（pH8.0）を25℃で30分間加温後、ウ
シトリプシン2.3μｇを含む1mM塩酸、20mM塩化カルシウ
ム水溶液0.1mlを加え混合する。25℃で15分間加温後、8
68μｇのベンゾイル‐L-アルギニン‐p-ニトロアニリド
塩酸塩を含む1mlの0.1Mトリス塩酸緩衝液を加えさらに1
0分間25℃に加温後、0.5mlの30％酢酸水溶液を加え、酸
素反応を停止する。酵素の残存活性は410nmでの反応液
の吸光度として得られる。PSTI、IgG共に含まない反応
系での吸光度値を酵素の全活性とする。IgGを含まずPST
Iとトリプシンのみの反応系での酵素の残存活性は全活
性の20％であったが、腹水167A及び360A由来のIgGが存
在する場合の酵素の残存活性は約80％に回復した。一方
腹水150A由来のIgG存在下では残存活性は20％のままで
あった。このことはハイブリドーマ167及び360が産生す
るモノクローナル抗体167及び360はPSTIのトリプシン阻
害活性を中和するが、抗体150は中和しない、すなわ
ち、167、360と150は異なった特異性を有することを示
している。

実施例３ラジオイムノアッセイ（１） ¹²⁵I標識PSTIの調製 PSTI5μｇを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）10μｌに0.
5Mリン酸緩衝液50μｌおよび［¹²⁵I］ヨウ化ナトリウム
（Amersham、100mCi/ml）10μｌを加え混和後、0.2％ク
ロラミンT10μｌを加えて室温で30秒間撹拌した。次い
で、１％ピロ亜硫酸ナトリウム10μｌを加え混和後、10
％ヨウ化ナトリウムおよび１％牛血清アルブミンをそれ
ぞれ10μｌ加え、反応溶液をゲル濾過［セファデックス
Ｇ−25（Fine、0.9×25cm、Pharmacia）、0.1Mリン酸緩
衝液（pH7.4）］により精製して、比放射能200μCi/μ
ｇの¹²⁵I標識PSTIを得た。クロマドグラム（溶出曲線）
は第４図に示すとおりであった。

（２） PSTIのラジオイムノアッセイ測定法試薬の希釈および調製は、すべて0.9％塩化ナトリウ
ム、0.1％アジ化ナトリウム、1mMエチレンジアミン四酢
酸四ナトリウムおよび0.5％牛血清アルブミンを含有す
る0.01Mリン酸緩衝液（pH7.4）を用いて行なった。

標準PSTI溶液（０、２、５、10、50、150、500ng/ml）
あるいは血清試料50μｌをポリスチレンチューブにと
り、前記の¹²⁵I標識PSTI溶液（5.5×10⁵dpm/ml）100μ
ｌおよび167Aの希釈液（1:150,000）500μｌを加え、37
℃で２時間インキュベーションしたのち、固相化したヤ
ギ抗マウスIgG抗体の懸濁液（1mg/ml、Bio-Rad）100μ
ｌを加え、37℃で30分間インキュベーションした。次い
で、室温で遠心分離（1500×ｇ、10分間）したのち上清
を吸引除去し、その沈澱の放射能をガンマ線シンチレー
ションカウンターで測定した。

標準曲線標準曲線は、標準PSTI濃度をlog側に、PSTI0ng/mlのカ
ウント数（B₀）に対する各標準PSTIのカウント数（Ｂ）
の比率（B/B₀％）をlin側にプロットして作成し、これ
に血清試料のB/B₀％を対応させて血清中のPSTI濃度を求
めた。

上記の測定法に従って作成した標準曲線ならびに急性膵
炎等の体外診断薬として既に市販されているPSTIテスト
シオノギ（塩野義製薬製）の標準曲線は第５図に示すと
おりであった。

血清PSTIの回収試験健常人血清に標準PSTIを添加し、本法により測定したと
きのPSTIの回収率は表１に示すとおりで、平均回収率は
102.2±6.8％であった。

ヒト血清の希釈曲線健常人あるいは膵疾患患者から採取した血清を段階的に
２倍希釈した試料を測定し、希釈率をlog側に、B/B₀％
をlin側にプロットした曲線は第６図に示すとおりであ
った。

健常人の血清PSTI濃度前記の測定法に従って測定した健常人10例の血清PSTI濃
度は、表１に示すとおりで、平均濃度は9.4±1.9ng/ml
であった。これらの血清試料を前出のPSTIテストシオノ
ギで測定したときの血清PSTI濃度は表２に示すとおり
で、平均濃度は8.4±2.3ng/mlであった。

急性膵炎における血清PSTI濃度急性膵炎患者の血清PSTI濃度は、表３に示すとおりで、
上記の健常人の血清PSTI濃度に比べ、有意に高値を示し
た。

PSTIテストシオノギによる測定値との相関ヒト血清15検体を前記の測定法ならびに前出のPSTIテス
トシオノギにより測定した。両測定値の関係は第７図に
示すとおりで、両者間には良好な相関関係が認められ
た。

（３） PSTIのイムノラジオメトリックアッセイ腹水の精製前記のハイブリドーマクローン150および360から得た腹
水をアフィゲルプロテインＡ、MAPS−IIキット［Bio-Ra
d社製］により精製した。すなわち、腹水1mlに結合バッ
ファー1mlを加え、この溶液をあらかじめ結合バッファ
ーで平衡化したアフィゲルプロテインＡカラム（0.7cm
φ×5.5cm）に加え、結合バッファー30mlで洗浄した。
次いで溶出バッファー10mlで展開し、溶出液を1mlずつ
分取して吸光度（280nm）が0.1以上の画分を集め、これ
を蒸留水に対して透析してIgG画分を得た。

固相化抗体の調製ポリスチレンビーズ（積水化学社製、直径6.4mm）50個
を、前記実施例１（９）で得た抗PSTI抗体150を0.35mg
含む0.05Mリン酸緩衝液（pH7.5）50mlに浸漬し、室温で
16時間静置した。次いで0.2％牛血清アルブミン、5mMエ
チレンジアミン四酢酸四ナトリウム、0.15M塩化ナトリ
ウムおよび0.1％アジ化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩
衝液、pH7.4（緩衝液Ａ）で十分に洗浄後、同緩衝液中
に４℃で保した。¹²⁵ I標識抗PSTI抗体の調製前記実施例１（９）で得た抗PSTIモノクローナル抗体36
0（５μｇ）に0.5Mリン酸緩衝液（pH7.5）50μｌと［
¹²⁵I］ヨウ化ナトリウム（Amersham）1mCiを加え混和
後、0.2％クロラミンT10μｌを加え、室温で45秒間撹拌
した。次いで、１％ピロ亜硫酸ナトリウム10μｌを加え
混和後、10％ヨウ化カリウムおよび１％牛血清アルブミ
ンをそれぞれ10μｌずつ加え、反応溶液をゲル濾過［セ
ファデックスG-25（Fine、0.75cmφ×25cm、Pharmaci
a）;0.1Mリン酸緩衝液、pH7.4］により精製した。この
時の溶出曲線は第８図に示すとおりであった。

サンドイッチ法ポリスチレンチューブに前記固相化抗体ビーズ１個を入
れ、これに標準PSTI溶液200μｌを加えて37℃で２時間
インキュベーションした。反応溶液を吸引除去し、緩衝
液 A 2mlで２回洗浄した後、前記の¹²⁵I標識抗PSTI抗体
溶液200μｌを加え、37℃で２時間インキュベーション
した。反応溶液を吸引除去し、緩衝液 A 2mlで２回洗浄
して固相に結合した放射能をガンマカウンターで測定し
た。標準PSTI濃度を横軸に、放射能を縦軸にプロットし
た標準曲線は、第９図に示すとおりであった。

実施例４エンザイムイムノアッセイ抗PSTI抗体Fab′フラグメントの調製前記実施例１（９）で得た抗PSTIモノクローナル抗体36
0（4.4mg）を、0.1M酢酸緩衝液（pH4.5）に溶解し、220
μｇのペプシンで37℃10時間消化した。これを、セファ
デックス G-100カラム（1.0×47cm、Pharmacia）に付
し、0.1Mホウ酸緩衝液（pH8.0）で流速4.8ml/hrで溶出
し、1mlずつ分画した。その分画16〜22を、アフィゲル
プロテインＡカラム（2.0ml、Pharmacia）に付し、通過
画分を得た。該通過画分をアミコンウルトロフィルトレ
ーターPM-10（Amicon）で濃縮して、溶媒を0.1Mリン酸
緩衝液（pH6.1）に交換した。これを濃縮して、15mlの
Ｆ（ab′）_２フラグメント（OD₂₈₀0.850）を得た。15μ
ｌの0.1M 2-メルカプトエチルアミンを加え、37℃で120
分間インキュベーションした。これをセファデックスG-
25カラム（1.0×51.5cm、Pharmacia）に付し、0.1Mリン
酸緩衝液（pH6.1）により流速24ml/hrで溶出し、分画15
〜25を得た。これらをアミコンウルトロフィルトレータ
ーPM-10（Amicon）で濃縮して0.5mlとし、Fab′フラグ
メントを得た。

マレイミド‐PODの調製ペルオキシダーゼ（POD）（3.0mg、Sigma）を0.3mlの0.
1Mリン酸緩衝液（pH6.1）に溶解した。3.2mgのN-スクシ
ンイミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン‐
1-カルボキシレート（Pierce）を40μｌのジメチルホル
ムアミドに溶解したものを30μｌ加え、30℃で60分間イ
ンキュベーションした。これを3000rpmで10分間遠心分
離した上清を、セファデックスG-25カラム（1.4×41.0c
m、Pharmacia）に付し、0.1Mリン酸緩衝液（pH6.1）に
より、流速18ml/hrで溶出して、1.0mlずつに分画した。
分画13〜17を、アミコンウルトフィルトレイターPM-10
（Amicon）で0.5mlまで濃縮し、マレイミド‐PODを得
た。

POD標識抗PSTI抗体Fab′フラグメントの調製上記のマレイミド‐POD（0.5ml）とFab′フラグメント
（0.5ml）を混合し、４℃16時間放置した。ウルトロゲ
ルAcA44カラム（1.6×55.5cm、LKB Produkter AB）に付
し、0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）により流速13ml/hrで溶
出し、1.0mlずつに分画して、分画48〜53（6.0ml）とし
て、POD標識抗PSTI抗体Fab′フラグメントを得た。

抗PSTIモノクローナル抗体（150）感作ビーズの調製 252個のビーズ（0.18g/10ビーズ、ポリスチレンビー
ズ、直径3mm、和光純薬）を、0.1Mトリス‐塩酸緩衝液
（pH8.5）に抗PSTIモノクローナル抗体（150）を溶解し
た溶液20ml（15.5μg/ml）に浸す。４℃で24時間放置
し、緩衝液Ａ（0.1％ウシ血清アルブミン、0.3M塩化ナ
トリウム、1mM塩化マグネシウム、0.1％アジ化ナトリウ
ムを含む0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0）で４回洗浄して、
抗PSTIモノクローナル抗体（150）固相化ビーズを得
た。

２段階測定法 96ウエルマイクロプレートのウエルに１個の抗PSTIモノ
クローナル抗体（150）固相化ビーズを入れ、250μｌの
緩衝液Ａを加え、室温で10分間放置した後、溶液を吸引
除去した。そこへ、200μｌの緩衝液Ａと20μｌのサン
プルまたは標準PSTIを加え、室温で90分間放置した。25
0μｌの緩衝液Ｂ（0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.01
Mリン酸緩衝液、pH7.0）で４回洗浄した後、200μｌのP
OD標準抗PSTI抗体Fab′フラグメント（緩衝液Ｂで100倍
に希釈）を加え、室温で90分間放置する。吸引除去後、
250μｌの緩衝液Ｂで４回洗浄し、ビーズを異なる96ウ
エルマイクロプレートに移す。次いで、3mg/mlのオルト
フェニレンジアミン（OPD）および0.02％過酸化水素を
含む0.1Mマクルバイン緩衝液（pH6.5）200μｌを加え
た。室温で20分間でインキュベートした後、1N硫酸50μ
ｌを加えて酵素反応を止めた。492nmにおける吸光度を
測定することにより、PSTI濃度を求めた。

１段階測定法 96ウエルマイクロプレートのウエルに１個の抗PSTIモノ
クローナル抗体（150）固相化ビーズを入れ、20μｌの
サンプルまたは標準PSTIをとり、200μｌのPOD標準抗PS
TI抗体Fab′フラグメント（緩衝液Ｂで100倍に希釈）を
加えた。室温で120分間放置した後、吸引除去し、250μ
ｌの緩衝液Ｂで４回洗浄した。ビーズを他の96ウエルマ
イクロプレートに移して、0.3mg/mlのOPDを含む0.1Mマ
クルバイン緩衝液（pH6.5）200μｌを加え、室温で20分
間でインキュベーションした後、1N硫酸50μｌを加えて
酵素反応を止めた。492nmにおける吸光度を測定するこ
とにより、PSTI濃度を求めた。

結果を、第10〜11図に示す。図から明らかなように、本
法によってもPSTIを定量することが可能であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はモノクローナル抗体を用いたイムノラジオメト
リックアッセイの標準曲線を示す。第２図は各モノクロ
ーナル抗体の希釈曲線を示す。第３図は各モノクローナ
ル抗体の交差反応性を示す。第４図は¹²⁵I標識PSTIの溶
出曲線を示す。第５図はラジオイムノアッセイにおける
167抗体の標準曲線およびPSTIテストシオノギの標準曲
線を示す。第６図は167抗体を用いたラジオイムノアッ
セイにおけるヒト血清の希釈曲線を示す。第７図は167
抗体を用いたラジオイムノアッセイによる測定値とPSTI
テストシオノギによる測定値の相関関係を示す。第８図
は¹²⁵I標識抗PSTI抗体の溶出曲線を示す。第９図は167
抗体を用いたサンドイッチ法によるラジオイムノアッセ
イにおける標準曲線を示す。第10図は１段階測定法によ
るエンザイムイムノアッセイの標準曲線を示す。第11図
は２段階測定法によるエンザイムイムノアッセイの標準
曲線を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ // Ｇ０１Ｎ 33/573 Ｚ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献特開昭56−74654（ＪＰ，Ａ) 特開昭56−74653（ＪＰ，Ａ) 特開昭56−46465（ＪＰ，Ａ) ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ 12Ｂ，（1988）Ｐ．276

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ハイブリドーマhPSTI−150（FERM BP−15
85）により産生されるモノクローナル抗体150、ハイブ
リドーマhPSTI−167（FERM BP−1583）により産生され
るモノクローナル抗体167およびハイブリドーマhPSTI−
360（FERM BP−1584）により産生されるモノクローナ
ル抗体360からなる群から選択され、動物血清に交差反
応性を示さない、ヒト膵分泌性トリプシンインヒビター
を認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】ハイブリドーマhPSTI−150（FERM BP−15
85）、ハイブリドーマhPSTI−167（FERM BP−1583）お
よびハイブリドーマhPSTI−360（FERM BP−1584）から
なる群から選択され、ヒト膵分泌性トリプシンインヒビ
ターで免疫したマウスのリンパ球とミエローマ細胞との
融合によって得られ、請求項１に記載のヒト膵分泌性ト
リプシンインヒビターを認識するモノクローナル抗体を
産性するハイブリドーマ。
【請求項３】請求項１に記載のヒト膵分泌性トリプシン
インヒビターを認識するモノクローナル抗体を用いるラ
ジオイムノアッセイ法またはエンザイムイムノアッセイ
法によりヒト膵分泌性トリプシンインヒビターを測定す
ることを特徴とするヒト膵分泌性トリプシンインヒビタ
ーの測定方法。