KR970008426B1 - 인간 psti를 인지하는 단클론성 항체, 이러한 항체를 생산하는 하이브리도마 및 인간 psti의 결정 방법 - Google Patents

Abstract

요약없슴

Description

인간 PSTI를 인지하는 단클론성 항체, 이러한 항체를 생산하는 하이브리도마 및 인간 PSTI의 결정 방법

제1도는 본 발명의 단클론성 항체를 사용하는 면역 방사선 측정 분석용 표준 곡선을 나타낸다.

제2도는 본 발명의 단클론성 항체의 희석 곡선을 나타낸다.

제3도는 본 발명의 단클론성 항체의 교차 반응성을 나타낸다. 제3A,3B 및 3C도는 각각 단클론성 항체 167, 150 및 360의 교차 반응성을 나타낸다.

제4도는¹²⁵I-표지화 PSTI의 용출 곡선을 나타낸다.

제5도는 본 발명의 항체 167을 사용하는 방사선 면역 분석용 표준곡선 및 PSTI 테스트 시오노기에 의해 제작된 표준 곡선을 나타낸다.

제6도는 항체 167을 사용하는 방사선 면역 분석에 의한 인간 혈청의 희석 곡선을 나타낸다.

제7도는 항체 167을 사용하는 본 발명의 방사선 면역 분석에 의해 수득된 데이타와 PSTI 테스트 시오노기에 의해 수득된 데이타간의 상호관계를 나타낸다.

제8도는¹²⁵I-표지화 항-PSTI 항체의 용출 곡선을 나타낸다.

제9도는 항체 167을 사용하는 샌드위치 방법에 의한 방사선 면역 측정 분석용 표준 곡선을 나타낸다.

제10도는 일단계 방법에 의한 효소 면역 분석용 표준 곡선을 나타낸다.

제11도는 이단계 방법에 의한 효소 면역 분석용 표준 곡선을 나타낸다.

본 발명은 항-인간 췌장 분비 트립신 억제제 단클론성 항체, 이러한 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마 및 단클론성 항체를 사용하는 인간 췌장 분비 트립신 억제제의 정량 결정 방법에 관한 것이다.

췌장 분비 트립신 억제제(이하 PSTI로 약칭함)는 암소의 췌장액에서 처음으로 발견된 트립신 억제제이다(Kazeal et al., J. Am. Chem. Soc. 70, 3034∼3040, 1948). 그 이후로, 상동 억제제가 또한 돼지, 양, 인간, 개 및 쥐의 췌장액으로부터 단리되었다. 소화 효소는 불활성 전구체의 형태로 정상적으로 분비되며 췌장액에 존재한다. 소화 효소가 어떤 이유에서인지 췌장내에서 비정상적으로 활성화되면, 췌장 조직의 괴사 뿐만 아니라 다른 연합 기관의 이기능이 수반될 수 있는 급성 췌장염을 초래하는 것으로 믿어진다. 다른 효소의 전구체와 함께 PSTI는 췌장 선방 세포로부터 췌장액으로 분비되고, 효소 활성의 트리거인 트립신이 그의 전구체로부터 활성화되어지면 PSTI는 활성화 트립신과 즉시 결합하고 효소가 보통 작용하는 십이지장에 도달할때까지 효소의 활성을 나타내지 못하게 한다고 믿어진다. 그러므로, PSTI는 급성 췌장염을 막는데 중요한 역할을 한다. 그러나, 또한 PSTI의 농도가 급성 췌장염 환자의 혈청에서 상당히 증가된다고 공지되어 있다(Kitahare et al., Gall Bladder and Pancreas, 3, 383∼388, 1892). 최근의 발견에 따르면, PSTI는 α₁-항트립신 등과 같은 급성기 반응물로 작용하며(Ogawa, Gall Bladder and Pancreas, 7, 1541∼1549, 1986), 그것은 또한 어떤 종양에 대한 마커로 작용할 수 있다(Ogawa, Clinical Pathology, 34, 1229∼1235, 1986). 따라서, PSTI는 진단 부문에서 상당한 중요성을 갖는다.

혈청내 PSTI의 농도 측정방법으로는, 상기 억제 활성의 측정을 특징으로 하는 효소 방법은 혈청내 다른 트립신 억제제가 다량으로 함께 존재하기 때문에 어려움을 갖는다. 그러나, 방사선 면역 분석법(RIA)은 이미 혈청 PSTI의 결정을 위해 수립되었는데, 토끼 항-인간 PSTI혈청을 사용하는 길항 작용의 방법을 사용하며(Eddeland & Ohlsson, Hoppe-Seyler's Z. Physiol Chem., 359, 671∼675, 1978 ; Kitahara et al., Biomedical J., 3, 1119∼1123, 1979 ; 일본국 특허 공개 제46465/1981, 74653/1981 및 74654/1981). 면역 분석용 키트는 시판되고 있다. 이 방법에 따르면, 급성 췌장염 환자의 PSTI의 혈청 수준은 건강한 사람의 것과 비교할 때 상당히 높아서, 키트를 급성 췌장염 및 연합 질병의 진단에 사용하여 왔다.

그러나, 상기 문헌에 기재된 방법에서 사용되는 항체는 모두 다클론성 항체(토끼 항혈청)이다. 일반적으로 단클론성 항체의 사용은 특이성, 획일성 및 고정된 공급의 관점에서 볼 때 바람직하다고 일반적으로 인식되어 있다. 특이성 및 친화력 면에서 다클론성 항체보다 우수한 단클론성 항체가 주어진다면, 이러한 단클론성 항체를 사용하는 더 용이한 인간 PSTI 측정 방법을 개발할 수 있을 것이다.

상기 상황하에서, 본 발명가들은 열심히 연구하여, 인간 PSTI에 매우 특이적이고 PSTI에 대해 높은 친화력을 갖는 일군의 단클론성 항체를 수득하는데 성공하였다.

그러므로, 본 발명은 인간 PSTI에 특이적이고 PSTI에 대해 높은 친화력을 갖는 단클론성 항체를 제공하며, 또한 이러한 단클론성 항체를 사용하는 급성 췌장염 및 관련 질병의 진단 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다.

본 발명의 항-인간 PSTI 단클론성 항체는 그 항체가 인간 PSTI-면역화 생쥐 임파구를 골수 세포와 융합시킴으로써 수득된 하이브리도마에 의해 생산됨을 특징으로 한다. 본 발명의 단클론성 항체의 제조방법을 하기에서 상세히 기술하겠다.

우선, 인간 PSTI를 면역원으로 사용하기 위해 정제한다. 인간 PSTI의 정제는 통상적인 방법중 어느 한가지로 수행할 수 있다.

그런 후 실험 동물, 예를 들면 생쥐를 면역원, 즉, 수득된 정제 인간 PSTI로 면역화시킨다. 면역화는 통상적인 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들면, 생리식염수에 용해시킨 항원을 프로인트 완전 보조액과 혼합하여 유제를 만든 후, 동물에 투여한다.

B임파구를 이렇게 면역화된 동물로부터 회수한 후, 영구 골수 세포주(예를들면, 생쥐 X63-Ag8, NSI-Ag4/1, P3X63-Ag8-U1등)중 어느것과 융합시킨다. 융합은 문헌(K

hler 및 Milstein, Nature 256, 495∼497, 1978)에 보고된 공지 방법에 따라 수행할 수 있다. 항-인간 PSTI 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택한다. 선택은 하이브리도마가 성장한 배양 배지내의 항-인간 PSTI 항체의 존재 유무를 효소 면역 분석법(예. ELISA)또는 방사선 면역 분석법과 같은 적당한 방법으로 조사함으로써 수행할 수 있다. 항-인간 PSTI 항체를 생산하는 하이브리도마를 배양 배지의 부피가 약 2-10ml로 증가할때까지 배양한 후, 동결시키고 저장한다. 목적하는 성질을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마를 배양 배지에 분비된 항체를 조사함으로써 선택한다. 이렇게 선택된 목적 하이브리도마를 한계 희석법과 같은 통상적인 방법으로 클로닝하여 세포주를 확립한다. 확립된 세포주를 면역화에 사용된 것과 동일한 종의 동물의 복강내에 이식하고, 고농도의 항체를 함유하는 복수를 수득한다. 세포주를 또한 시험관내 배양할 수 있으며, 항체를 배양 배지로부터 수득할 수 있다.

이렇게 수득된 단클론성 항체를 필요하다면 정재후 면역분석에서 사용한다. 예를 들면, 정제를 황산암모늄 분별법, 이온 교환 크로마토그래피 및 단백질 A 컬럼 크로마토그래피와 같은 통상적인 방법으로 수행할 수 있다.

모두 항-인간 PSTI 항체를 생산하는 하이브리도마 hPSTI-150, 167 및 360 및 상기 하이브리도마에 의해 각기 생산된 항-PSTI 단클론성 항체 150,167 및 360을 상기 방법에 따라 수득한다.

이 하이브리도마가 세포주는 부다페스트 조약하에 일본국 이바라끼껭 쓰꾸바시 히가시 1-1-3에 위치한 일본국 통상 산업성 공업 기술원 미생물 공업 기술 연구소에 하기 수탁번호로 1987년 12월 3일에 기탁되었다 :

하이브리도마 hPSTI-150 : 비꼬껭 조끼제 1585호(FERM BP-1585).

하이브리도마 hPSTI-167 : 비꼬껭 조끼 제 1583호(FERM BP-1583).

하이브리도마 hPSTI-360 : 비꼬껭 조끼 제1584호(FERM BP-1584).

단클론성 항체 150, 167 및 360은 하기 성질을 갖는다.

(1) 단클론성 항체 150의 면역글로불린 군 및 아군은 IgG_2a이고, 항체 167 및 360은 각각 IgG₁이며, 이 항체의 L사슬은 모두 K형태이다.

(2)단클론성 항체 150, 167 및 360의 결합 상수는 각각 4.9×10⁸M^-1, 3.7×10⁹M^-1및 1.4×10⁹M^-1이다. 이 항체는 모두 높은 친화력을 나타낸다.

(3) 단클론성 항체 150은 PSTI의 트립신-억제활성을 중화시킬 수 없지만, 167 및 360은 억제 활성은 중화시킨다. 즉, 단클론성 항체 150은 단클론성 항체 167 및 360의 특이성과는 다른 특이성을 갖는다.

따라서, 본 발명의 단클론성 항체는 인간 PSTI에 매우 특이적이며, 인간 PSTI와의 높은 친화력을 가지므로, 그것은 인간 PSTI의 면역학적 측정용으로 우수한 항체이다.

본 발명의 단클론성 항체의 사용과 함께, 예를 들면 하기와 같은 방법으로 PSTI를 면역학적으로 측정할 수 있다.

인간 혈청 PSTI는 본 발명의 단클론성 항체를¹²⁵I 및¹³¹I와 같은 방사선 동위원소로 표지화된 인간 PSTI와 함께 사용함을 특징으로 하는 경쟁 방법을 사용하는 방사선 면역 분석에 의해 측정할 수 있다. 즉, 면역 분석 자체는 공지된 방법으로 수행할 수 있지만, 본 발명의 소정량의 단클론성 항체를 소정량의¹²⁵I-표지화 PSTI(¹²⁵I는 클로라민 T방법과 같은 공지된 방법으로 PSTI의 티로신 잔기에 도입한다) 및 표준 인간 PSTI 또는 혈청 시료와 경쟁적으로 반응시킨다. 그런후, 이중-항체 방법 또는 폴리에틸렌글리콜 방법에 의해 항체에 결합된¹²⁵I-표지화 PSTI(이러한 PSTI를 이하 "결합"으로 약칭함)를 유리¹²⁵I-표지화 PSTI(이러한 PSTI를 이하 "유리"로 약칭함)로부터 분리한다. 그런후, 결합 PSTI 또는 유리 PSTI의 방사능을 측정한다. 표준 PSTI의 방사능과 혈청 시료의 것과의 비교로 혈청 PSTI의 농도가 제시된다.

인간 혈청 PSTI는 또한 본 발명의 단클론성 항체를 더욱 시다제 및 β-D-갈락토시다제와 같은 효소 표지화된 인간 PSTI와 함께 사용함을 특징으로 하는 경쟁 효소 면역 분석법에 의해 측정할 수 있다. 즉, 효소 표지화된 인간 PSTI를 상기 방사선 면역 분석에서 사용되는¹²⁵I로 표지화된 PSTI 대신에 사용할 수 있다. 효소 활성은 퍼옥시다제를 효소로 사용하면, o-페닐렌디아민과 같은 발색제를 사용하는 비색방법 또는 p-히드록시페닐프로피온산과 같은 형광 기질을 사용하는 형광분석에 의해 측정할 수 있다.

효소 면역 분석은 "유리"로 부터의 "결합"의 분리가 요구되지 않는 균질계에서 수행할 수 있다. 예를 들면 EMIT

(효소 다중 면역 분석 기술)의 시판명으로 공지된 방법에서, "결합"의 양은 "유리"의 것과 비교하여 효소의 활성 중심내 결합된 항체 또는 구조적 변화로 인한 입체장해에 따른 결합 효소-표지화 인간 PSTI의 효소활성의 감소로부터 측정할 수 있다. 효소 면역 분석은 또한 효소 채널링 면역 분석과 같은 또 다른 균질계에 적용할 수 있다.

화학발광 면역 분석 또는 생물 발광 면역 분석은 또한 본 발명의 단클론성 항체를 사용하여 수행할 수 있는데, 아크리디늄 에스테르 및 이소루비늄과 같은 화학 발광 물질 및 루시페린과 같은 생물 발광물질로 표지화된 인간 PSTI를 사용한다. 즉, 측정은 상기 방사선 면역 분석에서¹²⁵I-표지화 PSTI 대신에 발광물질로 표지화된 인간 PSTI를 사용한다는 점을 제외하고는 상기 방법에 따라서 수행한다. "결합" 또는 "유리"의 발광 강도는 광도계로 측정한다.

또한 형광면역 분석은 플루오레스세인 이소티오시아네이트와 같은 형광물질로 표지화된 인간 PSTI를 사용하여 수행할 수 있다.

비-경쟁 면역 분석은 또한 인간 PSTI분자의 다른 부위를 인지하는 본 발명의 두개의 다른 단클론성 항체를 사용하여 수행할 수 있다.

두개의 다른 단클론성 항체를 사용하는 각종 가능한 방법중 하나는 하나의 단클론성 항체를 고정시키고, 다른 하나는¹²⁵I와 같은 방사선 동위원소로 표지화된 면역 방사선 측정 분석법이다. 즉, 하나의 단클론성 항체를 폴리스티렌 비이드와 같은 고체상에 흡착시키거나 화학적으로 결합시키고, 다른 하나를¹²⁵I와 같은 방사선 동위원소로 표지화시킨다. 그런후, 표준 인간 PSTI 또는 혈청시료를 고정 항체와 접촉시킨 뒤,¹²⁵I-표지화 항체를 가하여 고체상에 포획된 인간 PSTI에 결합시킨다. 그런 후, 상층액("유리"함유)을 제거하고, "결합"의 방사능을 측정한다. 표준 인간 PSTI의 방사능과 혈청 시료의 것과의 비교로 혈청시료의 PSTI농도가 제시된다.

상기 "이단계" 방법에 덧붙여, 분석은 표준 인간 PSTI 또는 혈청시료를¹²⁵I-표지화 항체와 함께 고체상에 동시에 가한 후, 상층액을 제거하고, "결합"의 방사능을 측정하는 일단계로 수행할 수 있다.

방사선 동위원소로 표지화된 단클론성 항체 대신에, 효소로 표지화된 항체를 상기 분석에서 사용할 수 있다. 효소로서, 퍼옥시다제 및 β-D-갈락토시다제를 언급할 수 있다. 특히, 본 발명의 하나의 단클론성 항체를 폴리스티렌 비이드와 같은 고체상에 흡착시키거나 화학적으로 결합시키고, 또 다른 항체를 퍼옥시다제 및 β-D-갈락토시다제와 같은 효소로 표지화시킨다. 전자는 말레이미드법 또는 퍼요오드산 산화법으로 표지화시킬 수 있는 반면에, 후자는 말레이미드법 또는 글루타르알데히드법으로 표지화시킬 수 있다.

그런후, 표준인간 PSTI 또는 혈청시료를 고정 항체와 접촉시킨 뒤, 효소-표지화 항체를 가하여 고체상에 포획된 인간 PSTI에 결합시킨다. 그런 후 상층액(유리)을 제거하고, "결합"의 방사능을 측정한다. 표준 인간 PSTI의 방사능과 혈청 시료의 것과의 비교로 혈청 시료의 PSTI농도가 제시된다. 상기 일단계 방법 또한 여기에서 사용할 수 있다.

퍼옥시다제 또는 β-D-갈락토시다제의 효소활성은 o-페닐렌디아민 또는 o-니트로페닐-β-D-갈락토시드와 같은 발색제를 사용하는 비색법 또는 p-히드록시페닐프로피온산 또는 4-메틸올벨리페릴-β-D-갈락토시드와 같은 형광 기질을 사용하는 형광 분석법으로 측정할 수 있다.

비-경쟁 효소 면역 분석은 "유리"로부터 "결합"의 분리를 요구하지 않는 균질계에 적용할 수 있다.

효소-강화 면역 분석은 인간 혈청 PSTI 측정용으로 사용할 수 있는데, β-D-갈락토시다제로 표지화된 본 발명의 하나의 단클론성 항체 및 숙시닐화에 의해 표지화된 또 다른 항체를 덱스트란에 결합된 o-피닐-β-D-갈락토시드와 함께 사용한다. 특히, 본 발명의 하나의 단클론성 항체를 말레이미드 방법 등에 의해 β-D-갈락토시다제로 표지화시키고, 본 발명의 또 다른 항체를 숙신 무수물에 의해 숙시닐화시킨다. 그런 후 이 변형 항체를 표준 인간 PSTI 또는 혈청 시료와 접촉시켜 인간 PSTI분자에 결합시킨다. 혼합물에 덱스트란에 결합된 o-페닐-β-D-갈락토시드를 가하고, 혼탁도를 네펠로미터를 사용하여 측정된다. 표준 인간 PSTI의 혼탁도와 혈청 시료의 것을 비교하여 시료내 PSTI의 농도를 제시한다.

고체상에 고정된 하나의 단클론성 항체 및 아크리디늄 에스테르와 같은 발광 물질로 표지화된 또 다른 항체를 사용하는 면역 발광 측정 분석을 또한 사용할 수 있다. 특히, 본 발명의 하나의 다늘론성 항체를 폴리스틸렌 비이드와 같은 고체상에 흡착시키거나 화학적으로 결합시키고, 또 다른 항체를 4-(2-숙신이미딜옥시카르복시에틸)-페닐-10-메틸아크리디늄-9-카르복실레이트 플루오로술포네이트와 같은 아크리디늄 에스테르로 표지화시킨다. 표지화는 pH 8.0의 항체-함유 인산염 완충액을 DMF에 용해시킨 상기 아크리디늄 에스테르 용액에 가함으로써 수행할 수 있다.

그런 후, 표준 인간 PSTI 또는 혈청 시료를 고정 항체와 접촉시킨 뒤, 상층액(유리)를 제거하고 "결합"의 발광 강도를 발광계로 측정한다. 표준 인간 PSTI상의 발광 강도와 혈청 시료상의 것을 비교하여 혈청시료의 PSTI 농도를 제시한다.

본 발명의 하나의 단클론성 항체를 토끼 등을 감작화하여 제조된 항-인간 PSTI 단클론성 항체와 함께 사용하는 비경쟁 면역 분석 또한 유용하다. 단클론성 항체 또는 다클론성 항체중 한가지를 고체상에 고정시키고, 나머지를 방사선 동위원소, 효소 또는 발광 물질로 표지화시킨다. 측정은 상기 방법에 따라 수행한다.

두가지 다른 항체를 사용하는 비경쟁 면역 분석은 하기 특별한 기술을 포함한다.

본 발명의 단클론성 항체를 폴리스티렌 볼과 같은 고체상에 흡착시키거나 화학적으로 결합시키는 반면에, 염소 항-토끼 IgG항체는 상기 방사선 동위원소, 효소 또는 발광 물질로 표지화시킨다. 표준 인간 PSTI 또는 혈청 시료를 고체상의 항체와 접촉시킨 후, 토끼 항-인간 PSTI 다클론성 항체(항혈청)을 가하여 다클론성 항체를 고체상에 포획된 인간 PSTI와 결합시킬 수 있다. 효소등으로 표지화된 염소 항-토끼 IgG항체를 가하여 토끼 항-인간 PSTI 다클론성 항체에 결합시키고, "결합"의 효소활성을 상기와 동일한 방법으로 측정한다.

본 발명의 단클론성 항체를 사용하는 각종 면역 분석법을 상기에서 설명했다. 그러나 본 발명의 범위를 여기에 제한하려는 의도는 아니다.

[실시예 1]

항-인간 PSTI 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마의 제조 및 단클론성 항체의 제조.

(1) 항원의 제조

하기 면역화 단계에서 면역원으로 사용되는 인간 PSTI를 문헌(Kikuchi et al., J. Biochemistry 98, 687∼694, 1985)의 방법에 따라서 인간 췌장액으로부터 단리 및 정제한다.

(2) 면역화

생리 식염수에 용해시킨 인간 PSTI 용액(0.5 또는 0.1mg/ml)을 동량의 프로인트 완전 보조액과 혼합하여 유제를 제조한다. 유제(0.2mg/동물)를 BALB/c 생쥐(5주된 암컷)의 등에 4주 간격으로 4회 피하 주사한다. 각각의 생쥐는 50㎍ 또는 10㎍의 인간 PSTI를 함유하는 200㎕의 생리식염수를 복강내 부스터 한다.

(3) 세포 융합

부스터 면역화 3일후, 생쥐 비장을 꺼내고, 세포를 5분동안 빙냉하에 0.17M 염화 암모늄 용액에 넣어 적혈구를 파괴시킨다. 잔류 세포를 RPMI1640 배지에 현탁시키고, 융합을 위해 비장 임파구를 사용한다.

그런 후, RPMI 1640 배지에 현탁시킨 8-아자구아닌-내성 골수세포(NS-1)6.3×10⁷(또는 3.5×10⁷) 세포를 비장 임파구 1.9×10⁸(또는 3.5×10⁸)세포와 혼합한다. 혼합물을 원심 분리(1000rpm, 10분) 한후, 상층액을 제거한다. 침전된 세포에 RPMI1640배지에 용해시킨 1.0ml의 50% 폴리에틸렌글리콜(분자량 4000, Merck)을 1분 동안에 걸쳐 피펫의 팁으로 교반하면서 가하고, 혼합물을 또한 1.5분 동안 교반한다.

그런 후 2ml의 RPMI 1640을 2분 동안에 걸쳐 가한 뒤, 또 2ml의 배지를 1분 동안에 걸쳐 교반하면서 가한다. 또한 18ml의 RPMI 1640을 부드럽게 교반하면서 천천히 적가한다. 혼합물을 원심분리(1000rpm, 10분)한후, 상층액을 제거하고, 침전된 세포를 90ml(또는 160ml)의 HAT 배지(1×10^-4히포크산틴, 4×10^-7M 아미노프테린 및 1.6×10^-5M티미딘을 함유하는 20% FCS-RPMI 1640 배지)에 현탁시킨다. 현탁액을 9(또는 16)피스의 96-웰 배양 플레이트(Coster)에 웰당 0.21ml로 분획한다.

세포 배양 플레이트에 영양세포인 HAT배지내의 생쥐 비장 세포 현탁액을 1×10⁵세포/0.1m/웰 정도로 담는다. 그런 후, HAT 배지의 반을 2 또는 3일 간격으로 신선한 배지로 바꿔준다. 하이브리도마의 성장이 약 10일내에 관찰된다. 하이브리도마가 자란 것은 총 629웰(25%)이다.

(4) 하이브리도마의 동결 저항

모든 하이브리도마를 아미노프테린이 없는 상기 HAT배지에 해당하는 HT 배지에서 약 2ml의 배지에 도달할 때까지 성장시킨다. 그런 후, 하이브리도마를 0.5ml의 동결 배지(10% DMSO를 함유하는 소태아 혈청)에 현탁시키고, -80℃에서 저장한다. 각 배양액의 상층액을 별도로 조장하여 생산된 항체의 특성을 조사한다.

(5) 하이브리도마의 선택(I부)

PSTI로 피복된 96-웰 마이크로플레이트(0.1㎍/웰)를 사용한 예비 ELISA는 대부분의 하이브리도마가 항-PSTI항체를 생산함을 나타내준다. 그러므로 면역 분석에 대해 적합성을 나타내는 고친화력의 항체를 생산하는 목적 균주를 선택하기 위하여, 방사선 면역 분석을 수행한다.

100㎕의 상기 배양 상층액 및 상층액의 1 : 10 및 1 : 100희석액 각각 100㎕를 별도로 100㎕의¹²⁵I-표지화 인간 PSTI(실시예 3에서 언급) 및 2% 소 γ-글로블린을 함유하는 50㎕의 분석용 완충액(0.9% 염화나트륨, 0.1% 아지드화나트륨, 1mM 테트라소듐, 에틸렌디아민테트라아세테이트 및 0.5% 소혈청 알부민을 함유하는 pH 7.4의 0.01M 인산염 완충액)과 혼합하고, 수득된 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 보온한다. 각각의 상기 혼합물에 2% 소 γ-글로불린을 함유하는 100㎕의 인산염-완충된 생리식염수 및 500㎕의 20% 폴리에틸렌 글리콜 6000을 가한다. 혼합물을 즉시 교반하고, 원심분리(3000rpm, 20분) 한후, 상층액을 흡인 제거하고, 각 시료내 생성 침전의 방사능을 항체에 결합된¹²⁵I-표지화 인간 PSTI의 양을 반영하여 측정한다.

한편, 40ng/ml의 인간 PSTI를 함유하는 50㎕의 분석용 완충액을 상기 분석용 완충액 대신에 가한다는 점을 제외하고는 상기와 동일한 방법을 반복하고, 침전내¹²⁵I-표지화 인간 PSTI의 방사능의 감소를 조사한다. 즉,¹²⁵I-표지화 인간 PSTI가 전에 가한 인간 PSTI에 의해 대체된 정도를 조사한다. 높은 대체 정도를 나타내는 배양 상층액을 고친화력의 항체를 함유하는 것으로 간주한다. 이런 방식으로 21균주를 하기 기준으로 선택한다 : 상층액의 1 : 10 희석액을 사용하면, PSTI총량에 대해 "결합" PSTI의 양(B/T)이 20%이상이어야 하고 ; 1 : 10 또는 1 : 100 희석액을 사용하면, 10% 이상의 "결합" 표지화 PSTI가 PSTI로 대체되어야 한다.

(6) 하이브리도마의 선택(II부)

상기 유사한 RIA를 (5)에서 선택된 21하이브리도마 배양 상층액의 희석액을 사용하여 반복한 후, 상층액을 B/T=25%로 조정한다. 이때, 50㎕의 표준 PSTI용액(0,2,8,32,125 또는 500ng/ml)을 50㎕의 분석용 완충액 대신에 가하여 PSTI의 표준 곡선을 수득한다. 실험을 (5)와 동일한 방법으로 수행하고, 수득된 "결합" 표지화 PSTI의 양을 기준으로 표준 곡선을 제작한다. 또한, 각 상층액에 함유된 항체와 PSTI간의 결합 상수를 공지된 스캐챠드 플롯 방법(Ann. N. Y. Acad. Sci. 51, 660, 1949)에 따라서 계산한다. 1×10⁸M^-1이상의 결합 상수를 나타내는 하이브리도미만을 선택하여, 7군주를 하이브리도마 hPSTI-150, 167, 179, 360, 384, 432 및 622로 명명한다. 항체의 결합 상수는 각각 4.9×10⁸, 3.7×10⁹, 4.8×10⁸, 1.4×10⁹, 6.0×10⁹, 5.1×10⁸및 1.7×10⁸M^-1이다.

이 균주중에서, 고친화력 및 고항체 생산성을 나타내는 하이브리도마 hPSTI-167을 선택한다. 또한, 이하 상세히 기술할 면역방사선 측정 분석은 추가 균주, 즉 하이브리도마 hPSTI-150 및 360의 조합 사용이 샌드위치 방법에 적합함을 나타내준다(제1도 참조).

(7) 클로닝

상기 선택된 하이브리도마를 해동시키고 한계 희석으로 클로닝한다. 하이브리도마를 0.5세포/200㎕/웰의 농도로 96-웰 세포 배양 플레이트에 배양하고, 상기 방사선 면역 분석을 하이브리도마가 성장하여 단일 콜로니를 형성하는 웰의 상층액에 대해 수행한다. 항-인간 PSTI 항체를 생산하는 하이브리도마를 또한 배양한다. 이런 방법으로, 항-인간 PSTI 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 hPSTI-150, 167 및 360를 확립한다.

(8) 항체-함유 복수의 제조

이렇게 확립된 하이브리도마를 생쥐의 복강내에 이식하여 고농도의 목적 단클론성 항체를 함유하는 복수를 제조한다.

인산염-완충된 생리 식염수내 약 3×10⁶하이브리도마 세포 현탁액을 생쥐(BALB/c, 암컷 ; 0.5ml의 프리스탄을 10일전에 복강내 주사한다)의 복강내에 주사하고, 복수를 주사후 1∼3주 간격으로 수집한다. 세포를 원심분리로 분리한 후, 0.1%의 아지드화나트륨을 상층액에 가하고, 냉동 저장한다. 이런 방법으로 각각 하이브리도마 hPSTI-150, 167 및 360을 사용하여 생산된 고농도의 단클론성 항체를 함유하는 복수 150A, 167A 및 360A를 수득한다.

(9)단클론성 항체의 정체

항체를 아피겔 프로테인 A 맵스-II 키트(Affigel Protein A MAPS-II Kit, Bio-Rad)에 의해 복수 150A, 167A 및 360A로부터 단리 및 정제한다.

1ml의 각각의 복수를 키트에 제시된 방법에 따라 2ml의 겔을 사용하여 정제함으로써 복수 150A로부터 약7mg의 항체를 복수 167A로부터 약 6mg을 및 복수 360A로부터 약 6mg을 수득한다. 항체를 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동시켜 그의 순도를 조사한다. 2-메르캅토에탄올로 환원시킨 후 정제된 항체를 12.5% SDS겔에 전기영동시킨다. 약 53000(MW) 및 약 26000(MW)의 2밴드가 관찰되는데 전자는 H-사슬이고 후자는 L-사슬이다.

[실시예 2]

[단클론성 항체의 특성]

(1) 군 및 이군의 결정

하이브리도마에 의해 제조된 면역 글로블린의 군 및 아군의 결정은 생쥐 면역글로블린 및 퍼옥시다제-표지화 염소 항-토끼 항체의 각 군 및 아군에 특이적인 토끼 IgG항체를 사용하는 상기 ELISA에 의해 수행한다(MonoAb-ID EIA Kit, Zymed Laboratories). 항-γ_2a항체 및 항-k항체를 사용하면 복수 150A에서, 및 항-γ₁항체 및 항-k항체를 사용하면 복수 167A 및 360A에서 발색이 관찰되는데, 단클론성 항체 150이 IgG_2a에 속하고, 단클론성 항체 167 및 360이 IgG₁에 속하며, L-사슬은 각각 k형임을 나타내준다.

(2) 단클론성 항체의 면역학적 특성

상기 실시예 1-(8)에서 언급된 항-PSTI 단클론성 항체를 함유하는 복수 150A, 167A 및 360A의 면역학적 특성을 하기 실시예에서 기술된 방사선 면역 분석으로 결정한다.

[항체 역가]

항체 용역을 연속적으로 4배 희석한다(1 : 2000∼1 : 2048000). 각 희석 용액(500㎕)을 폴리스티렌튜브에 채우고 100㎕의¹²⁵I-표지화 PSTI 용액(5.5×10⁵dpm/ml) 및 표준 PSTI를 함유하지 않는 50㎕의 측정용 완충액과 혼합하고, 혼합물을 37℃에서 2시간동안 보온한다. 항체 역가를 상기 방법에 따라서 생성된 혼합물에 대해 측정한다.

가해진¹²⁵I-표지화 PSTI의 계수(T)에 대한 각 희석 항체 용액의 계수(B)의 비율(B/T%)을 직선축에 플롯팅하는 반면에, 항체의 희석배수를 로그축에 플롯팅하여, 희석 곡선을 제작한다. 항체에 대한 결합을 위해 20%의 55000dpm의¹²⁵I-표지화 PSTI에 요구되는 항체의 희석 배수를 항체 역가로 나타낸다. 단클론성 항체 150, 167 및 360의 항체 역가는 각각 100000, 150000 및 360000이다. 각 항체의 희석 곡선을 제2도에 나타낸다.

[친화력]

공지된 스캐챠드 플롯방법(Ann. N. Y. Acad. Sci., 51, 660, 1949)에 의해 계산된 복수 150A, 167A 및 360A와 PSTI와의 결합 상수는 각각 4.9×10⁸M^-1, 3.7×10⁹M^-1및 1.4×10⁹M^-1이다.

[교차반응성]

150A, 167A 및 360A와 des(1-5)-PSTI와의 교차 반응성을 제3도에 제시한다. 교차 반응성은 PSTI와의 반응성을 100%로 간주했을 때 각 <5, 90 및 290%이다.

150A, 167A 및 360A중 어느것도 동물 혈청과는 전혀 교차 반응성을 보이지 않는다.

[PSTI의 트립신-억제활성과 단클론성 항체와의 중화]

복수 150A, 167A 또는 360A로부터 단리된 약 15㎍의 IgG를 0.5㎍의 PSTI를 함유하는 0.9ml의 0.1M 트리스 염산 완충액(pH 8.0)과 혼합하고, 혼합물을 25℃에서 30분동안 가온한 후, 2.3㎍의 소트립신을 함유하는 1mM 염산 및 0.1ml의 20mM 염화칼슘 수용액을 여기에 가하고 혼합한다. 혼합물을 25℃에서 15분동안 가온한 후, 868㎍의 벤조일-L-아르기닌-p-니트로아닐리드 염산염을 함유하는 1ml의 0.1M트리스 염산 완충액을 가하고, 또한 혼합물을 25℃에서 10분 동안 가온한다. 그런 후, 0.5ml의 30% 아세트산 수용액을 가하여 효소 반응을 중지시킨다. 잔류 효소 활성을 410mm에서의 반응용액의 흡광도 결정으로 측정할 수 있다. PSTI도 IgG도 함유하지 않는 반응계에서의 흡광도를 효소의 총활성 또는 완전한 활성으로 간주한다. IgG가 없고 PSTI 및 트립신을 함유하는 반응계는 20%의 잔류 활성을 나타낸다. 복수 167A 또는 360A로부터 유래된 IgG의 존재는 80%의 잔류 활성을 나타낸다. 한편, 복수 150A로부터 유래된 IgG의 존재는 20%의 잔류 활성을 나타낸다.

상기 시험 결과는 하이브리도마 hPSTI-167 및 360에 의해 생산된 단클론성 항체 167 및 360이 PSTI의 트립신-억제 활성을 중화시키지만, 단클론성 항체 150은 억제 활성을 중화시키지 않음을 나타내준다. 즉 단클론성 항체 167 및 360은 단클론성 항체 150의 것과 다른 특이성을 갖는다.

[실시예 3]

[방사선 면역 분석]

(1)¹²⁵I-표지화 PSTI의 제조

5㎍의 PSTI를 함유하는 10㎕의 0.1M 인산염 완충액(pH 7.4)에 50㎕의 0.5M 인산염 완충액 및 10㎕의 Na¹²⁵I(Amersham, 100mCi/ml)를 가하고 혼합한다. 혼합물에 10㎕의 0.2% 클로라민 T를 가하고 실온에서 30초 동안 교반한다. 그런 후, 10㎕의 1% 피로아황산 나트륨을 여기에 가하고, 혼합한 뒤, 각각 10% 요오드화 나트륨 및 1% 소혈청 알부민 10㎕를 가한다. 반응 혼합물을 겔여과[세파덱스 G-25(Fine, 0.9×25cm, pharmacia), 0.1M 인산염 완충액(pH 7.0)]에 의해 정제하여, 200μCi/㎍의 특이적 방사능을 갖는¹²⁵I-표지화 PSTI를 수득한다. 겔여과의 크로마토그램(용출 곡선)을 제4도에 제시한다.

(2) PSTI의 방사선 면역 분석

[측정 방법]

이 방법에서 사용되는 시약의 희석 및 제조는 항상 0.9% 염화나트륨, 0.1% 아지드화나트륨, 1mM 테트라소듐 에틸렌디아민 테트라아세테이트 및 0.5% 소혈청 알부민을 함유하는 0.01M 인산염 완충액(pH 7.4)을 사용하여 수행한다.

50㎕의 표준 PSTI용액(0, 2, 5, 10, 50, 150, 500ng/ml) 또는 혈청 시료를 폴리스티렌 튜브에 채운다. 튜브에 100㎕의 상기¹²⁵I-표지화 PSTI용액(5.5×10⁵dpm/ml) 및 500㎕의 복수 167A 희석액(1 : 150000)을 가하고, 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 보온한다. 고체상에 고정시킨 100㎕의 염소항-생쥐 IgG 항체 현탁액(1mg/ml, Bio-Rad)을 가하고, 혼합물을 37℃에서 30분동안 보온한다. 그런 후, 혼합물을 원심분리(1500×g, 10분)하고, 상층액을 흡인 제거하고, 침전의 방사능을 감마선 신틸레이션 카운터에 의해 측정한다.

[표준 곡선]

표준곡선은 로그측에 표준 PSTI의 농도를, 직선 축에 PSTI의 0ng/ml의 계수(Bo)에 대한 각 표준 PSTI의 계수(B)의 비율(B/Bo%)을 플롯팅하여 제작한다.

혈청내의 PSTI농도는 혈청에 대해 결정된 B/Bo%로부터 측정한다. 상기 방법으로 제작된 표준 곡선 및 급성 췌장염 등의 시험관내 진단용 시약키트로 시판되는 PSTI 테스트 시오노기(Shionogi & Co., Ltd.)에 첨부된 통상적인 표준 곡선을 제5도에 제시한다.

[혈청 PSTI의 회수 시험]

표준 PSTI를 건강인의 혈청에 가하고, PSTI의 회수율을 상기 방법으로 측정한다. PSTI의 회수율을 표1에 제시한다. 평균 회수율은 102.2±6.8%이다.

[표 1]

혈청 PSTI의 회수시험

[인간 혈청의 희석 곡선]

PSTI의 농도를 건강인 및 췌장 질환 환자로부터 수득된 원 혈청의 2배 연속 희석으로 제조된 각종 혈청 시료에 대해 측정한다. 희석율을 로그측에, 및 B/Bo를 직선축에 플롯팅한다. 제작된 곡선을 제6도에 제시한다.

[건강인의 혈청내 PSTI 농도]

혈청내 PSTI 농도는 상기 방법에 따라 10사람의 건강인에 대해 측정한다. 표 2는 9.4±1.9ng/ml의 평균 농도를 갖는 시험 결과를 나타낸다. 동일한 혈청시료를 상기 PSTI 테스트 시오노기를 측정하여, 표2에 제시된 대로 8.4±2.3ng/ml의 평균 농도를 갖는 시험 결과를 얻는다.

[표 2]

건강인의 혈청내 PSTI 농도

[급성 췌장염 환자의 혈청내 PSTI 농도]

급성 췌장염 환자의 혈청내 PSTI농도를 제3도에 제시하는데, 건강인의 혈청내 함유된 것과 비교할 때 상당히 고농도의 PSTI를 나타낸다.

[표 3]

급성 췌장염 환자의 혈청내 PSTI 농도

총 15시료의 인간 혈청을 본 발명의 방법 및 상기 PSTI 테스트 시오노기에 의해 측정한다. 제7도는 시험 결과를 나타낸다. 두 방법간에 우수한 상호 관계가 관찰된다.

(3) PSTI의 면역 방사선 측정 분석

[복수의 정제]

상기 하이브리도마 hPSTI-150 및 360을 사용하여 수득된 복수를 하기 방법에 따라 아피겔 프로테인 A-맵스-II키트(Bio-Rad)에 의해 젱제한다.

1ml의 복수를 1ml의 결합 완충액에 가하고, 혼합물을 결합 완충액으로 평형된 아피겔 프로테인 A컬(0.7cm

×5.5cm)에 가한다. 그런후 칼럼을 30ml의 결합 완충액으로 세척하고, 10ml의 용출 완충액으로서 용출한다. 용출액을 1ml분획으로 수집하고, 280nm에서 0.1이상의 흡광도를 나타내는 분획을 수집하고, 증류수로 투석하여 IgG분획을 수득한다.

[고체상에 고정된 항체의 제조]

50피스의 폴리스티렌비이드(Sekisui Chemical Co., Ltd., 직경 : 6.4mm)를 상기 실시예 1(9)에서 수득된 0.35mg의 항-PSTI단클론성 항체를 함유하는 50ml의 0.05M 인산염 완충액(pH 7.5)에 침지시키고, 실온에서 16시간 동안 방치한다. 그런 후, 비이드를 0.2% 소혈청 알부민, 5mM 테트라소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트, 0.15M 염화나트륨 및 0.1% 아지드화 나트륨을 함유하는 pH 7.4의 0.01M 인산염 완충액(완충액A)로 완전히 세척한다. 그런 후, 비이드를 4℃에서 완충액 A에 저장한다.

[¹²⁵I-표지화 PSTI항체의 제조]

상기 실시예 1(9)에서 수득된 항-PSTI단클론성 항체 360(5㎍)을 50㎕의 0.5M 인산염 완충액(pH 7.5) 및 1mCi의 Na¹²⁵I(Amersham)과 혼합한다. 10㎕의 0.2% 클로라민 T를 여기에 가하고, 혼합물을 실온에서 45초동안 교반한다. 혼합물에, 10㎕의 1% 피로아황산 나트륨을 가하고 혼합한 후, 각각 10㎕의 10% 요오드화합물 및 1%의 소혈청 알부민을 가한다. 반응 혼합물을 겔 여과[세파덱스 G-25(Fine, 0.75cm

×25cm, Pharmacia) ; 0.1M 인산염 완충액, pH 7.4]시킨다. 제작된 용출곡선을 제8도에 제시한다.

[샌드위치 방법]

고정 항체를 운반하는 상기 비이드 한 피스를 폴리스티렌 비이드에 넣는다. 200㎕의 표준 PSTI용액을 여기에 가하고, 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 보온한다. 용액을 흡인제거하고 비이드를 각각 2ml의 완충액 A로 2회 세척한다. 그런후, 200㎕의¹²⁵I-표지화 PSTI항체 용액을 가한 뒤, 37℃에서 2시간 동안 보온한다. 용액을 흡인 제거하고, 비이드를 각각 2ml의 완충액 A로 2회 세척하고, 고체상의 방사능을 감마선 신틸레이션 카운터로 측정한다. 가로축에 표준 PSTI의 농도를, 세로축에 방사능을 플롯팅하여 제9도에 제시된 표준 곡선을 제작한다.

[실시예 4]

[효소 면역 분석]

[항-PSTI항체 Fab' 단편의 제조]

상기 실시예 1(9)에서 수득된 항-PSTI 단클론성 항체 360(4.4mg)을 0.1M 아세테이트 완충액(pH 4.5)에 용해시키고, 200㎍의 펩신으로 37℃에서 10시간 동안 소화시킨다.

반응 혼합물을 세파덱스 G-100 칼럼(1.0×47cnm, Pharm-acia)에 적용시키고, 0.1M 붕산염 완충액(pH 8.0)을 사용하여 4.8ml/시간의 유속으로 용출시킨다. 용출액을 1ml분획으로 회수하고, 분획 16∼22를 아피겔 프로테인 A 컬럼 (2.0ml, Bio-Rad)에 통과시킨다. 용출액을 아미콘 울트라-필트레이터(Amicon Ultra-filtrator, PM-10, Amicon)을 사용하여 농축시키고, 0.1M 인산염 완충액(pH 6.1)을 여기에 가한다. 혼합물을 다시 농축하여 1.5ml의 F(ab')₂단편(OD₂₈₀0.850)을 수득한다. 단편에 150㎕의 0.1M 2-메르캅토에틸아민을 가하고, 혼합물을 37℃에서 120분 동안 보온하고, 세파덱스 G-25컬럼(1.0×51.5cm, Pharmacia)에 적용시키고, 0.1M 인산염 완충액(pH 6.1)을 사용하여 24ml/시간의 유속으로 용출시킨다. 분획 15∼25을 아미콘 울트라-필트레이터 PM-10(Amicon)으로 농축시켜, 0.5ml의 Fab'단편을 수득한다.

[말레이미도-POD의 제조]

퍼옥시다제(POD)(3.0mg, Sigma)를 0.3ml의 0.1M 인산염 완충액(pH 6.1)에 용해시키고, 여기에 40㎕의 디메틸포름아미드에 용해시킨 3.2mg의 N-숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(Pierce)용액 30㎕를 가하고, 혼합물을 30℃에서 60분 동안 보온한다. 반응 혼합물을 3000rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 세파덱스 G-25컬럼(1.4×41.0cm, Pharmacia)에 적용시키고, 0.1M 인산염 완충액(pH 6.1)을 사용하여 18ml/시간의 유속으로 용출시킨다. 용출액을 1ml 분획으로 수집하고, 분획 13∼17을 아미콘울트라-필트레이터 PM-10을 사용하여 0.5ml로 농축시킴으로써, 말레이미도-POD를 수득한다.

[항-PSTI 항체의 POD-표지화 Fab'단편의 제조]

상기 말레이미도-POD(0.5ml)를 Fab'단편(0.5ml)과 혼합하고, 혼합물을 4℃에서 16시간 동안 방치한다. 그런 후 혼합물을 울트라겔 AcA 44 칼럼(1.6×55.5cm, LKB Produkter AB)에 적용시키고, 0.1M 인산염 완충액(pH 6.5)을 사용하여 13ml/시간의 유속으로 용출시킨다. 용출액을 1.0ml분획으로 수집한다. 항-PSTI 단클론성 항체의 POD-표시화 Fab' 단편을 분획 48~53(6.0ml)으로부터 수득한다.

[항-PSTI 단클론성 항체 150으로 감작화된 비이드의 제조]

252 피스의 비이드(10폴리스티렌 비이드당 0.18g, 직경 : 3mm, Wako Pure Chemicals)를 0.1M 트리스-염산 완충액(pH 8.5)에 용해시킨 20ml(15.5㎍/ml)의 항-PSTI 단클론성 항체 150 용액에 침지시키고, 4℃에서 24시간 동안 방치한다. 그런 후, 비이드를 완충액 A(0.1% 소혈청 알부민, 0.3M 염화나트륨, 1mM 염화마그네슘 및 0.1% 아지드화나트륨을 함유하는 0.1M 인산염 완충액, pH 7.0)로 4회 세척하여, 항-PSTI 단클론성 항체 105를 운반하는 비이드를 수득한다.

[이단계 측정]

한 피스의 항-PSTI 단클론성 항체 150-운반비이드를 96-웰 마이크로플레이트의 한 웰에 담는다. 웰에 250㎕의 완충액 A를 가지고, 실온에서 10분 동안 방치한다. 그런 후, 완충액을 흡인 제거하고, 200㎕의 완충액 A 및 20㎕의 시험 시료 또는 표준 PSTI를 여기에 가하고, 혼합물을 실온에서 90분 동안 방치한다. 그런 후 비이드를 각각 250㎕의 완충액 B(0.1% 소혈청 알부민을 함유하는 0.01M 인산염 완충액, pH 7.0)로 4회 세척한 뒤, 200㎕의 항-PSTI 항체의 POD-표지화 Fab'단편(완충액 B를 사용하여 1 : 100으로 희석)을 가하고, 혼합물을 실온에서 90분 동안 방치한다. 완충액을 흡인 제거한 후, 비이드를 각각 250㎕의 완충액 B로 4회 세척한다. 비이드를 또 다른 96-웰 마이크로플레이트의 한 웰에 옮긴다. 웰에 3mg/ml의 오르토-페닐렌디아민(OPD) 및 0.02% 과산화수소를 함유하는 200㎕의 맥클바인 완충액(pH 6.5)을 가한다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 보온한 후, 50㎕의 1N 황산을 가하여 효소 반응을 중지시킨다. PSTI의 농도는 492nm에서 혼합물의 흡광도를 측정하여 결정한다.

[일단계 측정]

한 피스의 항-PSTI 단클론성 항체 150-운반 비이드를 96-웰 마이크로플레이트의 한 웰에 담는다. 20㎕의 시험 시료 또는 표준 PSTI를 여기에 가한 후, 200㎕의 항-PSTI항체의 POD-표지화 Fab'단편(완충액 B를 사용하여 1 : 100으로 희석한다)을 가한다. 플레이트를 실온에서 120분 동안 방치한 후, 완충액을 흡인 제거하고, 비이드를 각각 250㎕의 완충액 B로 4회 세척한다. 그런 후, 비이드를 또 다른 96-웰 마이크로플레이트의 한 웰에 옮긴다. 웰에 0.3mg/ml의 OPD를 함유하는 200㎕의 0.1M 맥클바인 완충액을 가하고, 실온에서 20분 동안 보온한다. 그런 후 50㎕의 1N황산을 가하여 효소 반응을 중지시킨다. PSTI의 농도는 492nm에서의 흡광도를 측정한다.

실험결과를 제10 및 11도에 제시하는데, 상기 방법이 PSTI의 정량 측정을 가능하게 함을 보여준다.

Claims (8)

1. 하이브리도마 hPSTI-150에 의해 생산되고 항-인간 PSTI 단클론성 항체 150으로 명명된 인간 PSTI를 인지하는 단클론성 항체.
2. 하이브리도마 hPSTI-167에 의해 생산되고 항-인간 PSTI 단클론성 항체 167으로 명명된 인간 PSTI를 인지하는 단클론성 항체.
3. 하이브리도마 hPSTI-360에 의해 생산되고 항-인간 PSTI 단클론성 항체 360으로 명명된 인간 PSTI를 인지하는 단클론성 항체.
4. 단클론성 항체 150을 생산할 수 있는 하이브리도마 hPSTI-150으로 명명된 인간 PSTI를 인지하는 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마.
5. 단클론성 항체 167을 생산할 수 있는 하이브리도마 hPSTI-167으로 명명된 인간 PSTI를 인지하는 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마.
6. 단클론성 항체 360을 생산할 수 있는 하이브리도마 hPSTI-360으로 명명된 인간 PSTI를 인지하는 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마.
7. 인간 PSTI를 인지하는 단클론성 항체 또는 항체를 사용하는 방사선 면역 분석 또는 효소 면역 분석에 의해 in vitro에서 인간 PSTI를 측정함을 특징으로 하는 인간 PSTI의 결정방법.
8. 제7항에 있어서, 적어도 하나의 단클론성 항체를 항-인간 PSTI단클론성 항체 150, 167 및 360에서 선택하는 방법.

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