KR20110009604A - Ｐｓａ를 인지하는 단클론 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PSA 단백질을 인지하는 단클론 항체, 상기 단클론 항체를 포함하는 인간 전립선암 진단 키트, 상기 단클론 항체를 이용한 전립선암 의심 환자의 소변 시료 중의 PSA 농도를 측정하는 방법 및 상기 단클론 항체를 이용한 인간 전립선암 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, PSA 단백질을 인지하는 단클론 항체를 이용하여 소변 중의 PSA를 검출함으로써 전립선암의 진단에 유용하게 이용할 수 있다.
PSA 단백질, 단클론 항체, 진단 키트, 전립선암, 소변

Description

ＰＳＡ를 인지하는 단클론 항체 및 이의 용도{Monoclonal antibody recognizing prostate specific antigen and use thereof}
본 발명은 PSA를 인지하는 단클론 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 PSA 단백질을 인지하는 단클론 항체, 상기 단클론 항체를 포함하는 인간 전립선암 진단 키트, 상기 단클론 항체를 이용한 전립선암 의심 환자의 소변 시료 중의 PSA 농도를 측정하는 방법 및 상기 단클론 항체를 이용한 인간 전립선암 진단 방법에 관한 것이다.
전립선은 고환, 정낭과 함께 생식기능을 가능하게 하는 성 부속기관 중의 하나로서, 이곳에서 나오는 전립선 액은 남성 정액의 액체 성분 중 약 1/3을 차지한다. 따라서 전립선에 이상이 발생하면 성기능의 장애를 가져올 수 있으며 배뇨에도 큰 어려움을 느끼게 된다.
국내 전립선암의 발생빈도는 남성 인구 10만 명당 2.7명 정도이나 미국에서는 폐암과 함께 남자에게 발생하는 암 중 1-2위를 다투고 있으며 암 사망 원인의 3위를 차지한다. 또한, 무증상의 환자를 계산에 넣으면 전립선암 환자의 수는 훨씬 더 많을 것으로 추정되고 있다. 전립선암의 발생 원인으로는 유전적 소인, 남성 호 르몬 영향, 음식 및 식이 습관, 직업, 과거 전립선염을 앓은 적이 있는지 유무 등이 거론되나 아직 구체적인 위험인자가 확인되지는 않고 있다.
전립선암 환자의 양상은 혈중 전립선-특이 항원(PSA; prostate specific antigen, 이하 "PSA"라 명명한다)의 증가, 직장수지검사(DRE; digital rectal examination)에서 딱딱한 결절의 관찰, 경직장 초음파 검사(TRUS; transrectal ultrasound)에서 이상 조직의 관찰, 또는 전립선 비대증으로 생각하고 떼어낸 조직에서 암세포가 발견되는 경우가 대부분이다. 전립선암이 국소암인 경우 별다른 증상이 없으나 어느 정도 진행되면 방광출구 막힘 증상, 급성 요 막힘, 혈뇨(피 오줌) 및 요실금과 같은 증상을 나타내기도 한다. 심하면 콩팥이 망가져 신부전에 의한 증상이 있을 수 있다. 가끔 골전이에 의한 골통증이라든가 척수압박에 의한 신경증상 또는 병적 골절이 있어 우연히 발견되기도 한다. 전립선암은 다른 암과는 달리 매우 천천히 증식하는 특징이 있다. 따라서 이 암을 조기에 진단할 수 있다면 치료의 가능성을 높일 수 있기 때문에 초기 진단의 중요성이 대두된다.
PSA는 분자량이 약 33 kDa로 전립선 표피에서 높은 수준으로 발현되는 세린 단백질 분해효소이다(Ulf-Hakan Stenman et al., Cancer Biology, 9: 83-93, 1999). 건강한 남자의 혈액에서는 2ng/ml 이하의 PSA가 존재하며 악성 전립선 조직, 전립선암 등에서 그 양이 증가하는 것으로 알려져 있다. 혈액에서의 PSA 양이 증가하면 전립선암, 전립선비대증과 같은 전립선 질환의 발생을 표시한다. 혈액에서의 전립선-특이 항원은 여러 가지 형태로 존재하는데, 전립선암 진단에 주로 사용되는 PSA 형태는 전체 PSA(total PSA, 이하 "tPSA"라 한다)이다. 전립선암을 양 성으로 판정하는 tPSA의 컷 오프(cut off)는 4ng/ml로 보는 것이 일반화되어 있으며 tPSA의 양이 10 ng/ml 이상이면 전립선암일 확률이 67%라는 보고가 있다 (Metthew B. Gretzer, European Urology Supplement 1(2002) 21-27).
통상 항원 자극에 의해 생체 내에서 생산되는 항체는 항원에 대한 여러 가지 결합력을 가진 항체의 혼합물(폴리클로날 항체(polyclonal antibody))이지만 어떤 한 개의 항체 생산 세포는 한 종류의 항체만을 생산하는 바, 단클론 항체는 단일의 항체 생산 세포로부터 증식해온 세포(단일 클론)에 의해 형성된 동일한 구조를 갖는 균일한 항체를 의미한다. 단클론 항체를 생산하는 세포를 제조하는 방법은 쾰러와 마일스타인(Koller and Milstein)에 의해 1975년에 개발되었다. 이 방법은 특정 항원에 의해 면역화된 동물의 비장 또는 림프절로부터 수득한 B-림프구를 골수종 세포와 융합시키는 것인데, B-림프구는 단클론 항체를 생산할 수 있는 능력을 갖는 정상 세포이고 골수종 세포는 암화된 B-림프구로부터 수득한 세포로서 면역글로불린을 생산하는 능력은 갖지 않지만 계속적으로 성장할 수 있는 비정상적인 증식 능력을 갖는 세포이므로, 결과적으로 이들 세포의 융합세포는 B-림프구의 단클론 항체를 생산할 수 있는 능력과 골수종 세포의 사멸하지 않고 계속적으로 성장할 수 있는 능력을 동시에 보유하게 되는 것이다.
세포융합이 완료되면 융합이 수행된 배지 내에는 융합세포, 비융합 비장세포 그리고 골수종 세포가 혼재해 있게 되므로 융합세포만을 선별하여야 할 필요가 발생한다. 이 목적을 위하여 세포를 HAT 배지에서 성장시킨다. 퓨린(아데닌, 구아닌)은 엔도제네스 경로(endogenous pathway)와 샐비지 경로(salvage pathway)의 두 가 지 경로를 통하여 생합성되므로 야생균주의 경우 어느 한 경로를 상실하더라도 치명적이지는 않게 된다. HAT 배지는 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 배지로서, 아미노프페린은 엔도제네스 경로의 DHFR(dihydrofolate reductase)의 작용을 저해하여 엔도제네스 경로를 차단하므로, 샐비지 경로의 HGPRT(hypoxanthine phosphoribosyl transferase)가 결핍되어(따라서 독성 염기 유사체(티오구아닌(thioguanine)이나 아자구아닌(azaguanine))에 내성을 갖는) 샐비지 경로 또한 차단된 비융합 골수종 세포는 야생 균주와 달리 HAT 배지에서는 성장하지 못하고 사멸하며, 비융합 비장세포는 분리된 후 1∼2주 후에 자연적으로 사멸하므로 결국 배지 중에는 융합세포만이 성장하게 되어 융합세포의 선별이 가능해진다.
그러나, 이상과 같은 항체를 생산하는 융합세포를 제조하는 방법에도 불구하고, 인간 PSA 단백질의 특정 부위를 인지하는 단클론 항체는 보고된 바가 없었다. 더욱이, PSA를 인지하는 단클론 항체를 이용하여 소변 중의 PSA의 양을 측정함으로써 전립선암 환자의 소변 중의 PSA의 양과 정상인의 소변 중의 PSA의 양에 대한 상관 관계로부터 전립선암을 진단하는 방법에 대한 연구는 더더욱 없는 실정이다.
단클론 항체는 단일 항원결정기 (epitope)를 인식하기 때문에 특이반응을 보이는 단클론 항체만을 선별할 수 있다. 또한 전체 항원 내에는 항체 형성에 큰 영향을 미치는 주요 항원부위가 존재하는데, 이 항원부위에 대한 단클론 항체의 이용은 항혈청을 이용한 항원진단법에 비해 민감도를 향상시킬 수 있다. 따라서 특이적인 항원에 대한 단클론 항체의 생산 및 이를 이용한 진단제에 대한 개발의 요구가 지속되어 왔다.
한국특허공개 제2009-0023372호에는 전립선암의 검출을 위한 단일클론 항-아넥신 A3 항체가 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2003-0066672호에는 전립선 특이성 막 항원 및 기타 전립선 마커의 정량 검출방법 및 장치가 개시되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 이에 본 발명자들은 PSA 단백질의 특정 부위를 인지하는 단클론 항체를 수득하고, 이를 이용하여 전립선암 환자의 소변 중의 PSA의 양이 정상인의 소변 중의 PSA의 양보다 현저하게 적다는 것을 발견하고, 이에 기초한 전립선암을 진단하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 인간 PSA (prostate specific antigen)의 특정 아미노산 부위를 인지하는 단클론 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PSA를 인지하는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PSA를 인지하는 단클론 항체를 포함하는 인간 전립선암 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단클론 항체를 이용한 전립선암 의심 환자의 소변 시료 중의 PSA 농도를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단클론 항체를 이용한 인간 전립선암 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, PSA 단백질을 인지하는 단클론 항체를 이용하여 소변 중 의 PSA를 검출함으로써 전립선암의 진단에 유용하게 이용할 수 있다.
하기 본 발명에 대한 설명에서, 재조합 DNA 및 면역학에서 사용되는 많은 용어들이 광범위하게 사용된다. 본원 명세서 및 특허청구범위에 대한 보다 더 명료하고 일관된 이해를 제공하기 위해서, 하기와 같은 정의를 제공한다.
용어 "항체"는 당해 분야에 공지된 용어이며 공지된 항원에 결합하는 분자 또는 분자의 활성 단편을 의미한다. 공지된 항원에 결합하는 활성 단편의 예는 Fab 및 F(ab)2 단편을 포함한다. 상기 활성 단편은 수 많은 기술에 의해서 본 발명의 항체로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 정제된 단클론 항체는 펩신 같은 효소에 의해 절단되어 HPLC 겔 여과시킬 수 있다. Fab 단편을 함유하는 적합한 분획을 수집하여 막 여과 등에 의해 농축시킬 수 있다. 항체의 활성 단편 분리에 대한 일반적인 기술들에 대한 설명은 문헌[예를 들면, Khaw, B.A. et al., J. Nucl. Med. 23: 1011-1019 (1982)]을 참조한다. 용어 "항체"는 또한 이특이적(bispecific) 및 키메라(chimeric) 항체를 포함한다.
용어 "단클론 항체" 는 당해 분야에 공지된 용어이며, 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도로 특이적인 항체이다. 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체와는 다르게, 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 본 발명의 단클론 항체는 통상적인 클로닝 및 세포 융합 기술들을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 관심 대상의 면역원(항원)을 야생형이나 육종된 마우스(예를 들면, BALB/c)에 투여하여 천연 또는 사람 단클론 항체를 생산할 수 있다. 이러한 항원은 단독으로 투여되거나, 애주번트와 혼합하여 투여되거나, 벡터로부터 발현될 수 있으며 DNA 또는 융합 단백질로서 면역 반응을 유도할 수 있다. 융합 단백질은 면역 반응에 의도된 펩티드와 커플링된 담체 단백질, 예를 들면, β-갈락토시다제, 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 및 소 혈청 알부민을 포함하며, 담체 단백질은 이에 제한되지는 않는다. 상기의 경우에 펩티드는 담체 단백질에 대해서 합텐(hapten)으로 작용한다. 단클론 항체 제조 방법을 간략히 설명하면 다음과 같다. 동물을 부스팅시킨 후, 비장을 제거하고 비장 세포를 추출하여 당해 분야에 공지된 방법[Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)]으로 골수종 세포와 융합시킨다. 수득되는 하이브리드 세포를 통상적인 방법, 예를 들면, 제한 희석으로 클로닝하고, 목적하는 단클론 항체를 생산하는 수득된 클론을 배양하는 것이다. 단클론 항체는 항원-항체 결합을 사용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한, 하이브리도마 배양에 의해 합성되기 때문에, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 또 다른 장점을 갖는다.
용어 "에피토프" 는 당해 분야에 공지된 용어로서, 일반적으로 항체와 상호 작용하는 항원의 영역을 의미한다. 펩티드 또는 단백질 항원의 에피토프는 항원의 연속하는 또는 비연속하는 아미노산 서열로부터 형성될 수 있다. 많은 단백질이 많 은 에피토프를 함유할 수 있다. 본 발명의 항체에 의해서 인식되는 에피토프는 본 발명의 한 양태를 형성한다. 특정 에피토프를 인식하는 항체는 특정 에피토프를 정제하기 위한 면역친화도 컬럼에서 사용될 수 있다. 항원성 에피토프는 5개 정도의 적은 아미노산 잔기에 의해서 나타날 수 있는 것으로 보고되어져 있기 때문에, 특정 에피토프의 말단 절단형도 또한 가능할 수 있다.
용어 "하이브리도마" 는 당해 분야에 공지되어 있으며, 항체 생산 세포와 불멸 세포, 예를 들면 골수종 세포와의 융합에 의해서 형성된 세포를 의미한다. 상기 하이브리드 세포는 항체를 지속적으로 공급할 수 있다.
본 발명에서 사용되는, 용어 "면역학적 복합체를 형성하는" 이란 시료 중에서 PSA 항원의 존재 또는 부재를 확인하는 것을 포함함을 의도한다. PSA 항원의 존재 또는 부재는 면역분석법을 사용하여 검출할 수 있다. 항원을 검출하고/하거나 정량하는데 사용되는 수 많은 면역분석법들이 당해 분야의 통상적인 숙련자에게 공지되어 있으며, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988, 556-612]을 참조한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "검출 표지제"는 면역복합체의 검출을 위한 표지를 의미하며, 구체적인 예로는 방사성 동위원소 표지, 효소, 화학발광화합물(chemoluminescent compound), 플루오레세인, 피코빌리프로테인, 희토류 킬레이트, 로다민 등과 같은 형광 물질, 효소 보조인자(enzyme cofactor), 바이오틴 등을 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 인간 PSA (prostate specific antigen)의 아미노 말단으로부터 107번째 ~ 119번째 아미노산 부위 및 248번째 ~ 260번째 아미노산 부위를 인지하는 단클론 항체에 관한 것이며, 상기 단클론 항체는 바람직하게는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표지제가 결합될 수 있으며, 상기 검출 표지제는 효소, 형광물질, 발광물질 또는 방사성 물질일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 단클론 항체를 포함하는 인간 전립선암 진단 키트에 관한 것이며, 바람직하게는 상기 키트는 인간 소변 중의 PSA를 검출함으로써 인간 전립선암을 진단하기 위한 것이다. 상기 키트는 단클론 항체를 인지하는 2차 항체를 추가로 포함하며, 검출 표지제가 2차 항체에 결합될 수 있다. 또한, 상기 키트는 상기 검출 표지제가 효소이고, 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트 내의 단클론 항체는 스트립(strip) 형태일 수 있다.
본 발명은 또한,
전립선암 의심 환자의 소변 시료와 본 발명의 PSA 단클론 항체를 접촉시켜 면역학적 복합체를 수득하는 단계; 및
상기 수득된 면역학적 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 전립선암 의심 환자의 소변 시료 중의 PSA 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한,
전립선암 의심 환자의 소변 시료와 본 발명의 PSA 단클론 항체를 접촉시켜 면역학적 복합체를 수득하는 단계;
상기 수득된 면역학적 복합체를 검출하는 단계; 및
상기 검출 결과를 정상인의 것과 비교하는 단계를 포함하는 인간 전립선암의 진단 방법에 관한 것이다.
상기 방법에서, 정상인과 전립선암 의심 환자의 소변 중의 PSA를 정량하여 전립선암 의심 환자의 소변 중의 PSA의 측정 양이 정상인의 소변 중의 PSA의 측정 양에 비해 현저하게 적다면 전립선암 의심 환자를 전립선암으로 진단할 수 있는 것이다.
상기 단클론 항체는 스트립(strip) 형태일 수 있으며, 상기 면역학적 복합체 검출은 웨스턴 블롯(western blot), ELISA, 면역조직화학법(immunohistochemistry) 또는 면역세포화학법(immunocytochemistry)에 의해 수행될 수 있다.
이후, 본 발명은 보다 상세히 기술된다.
본 발명은 PSA 단백질 또는 이의 에피토프에 면역학적으로 반응성인 항체를 제공한다. 본원에서 제공되는 항체는 당해 분야에 공지된 방법으로 PSA 단백질 또는 이의 에피토프를 발현하는 세포를 접종시켜 동물에서 생성시킬 수 있다. 상기 단백질은 통상적인 생화학적 방법으로 다양한 수준의 균질성으로 상기 세포로부터 분리될 수 있다. 시험관내에서 확립된 합성 방법으로 제조되고 이종성 아미노산 서열에 임의로 접합된 합성 펩티드가 또한 본 발명의 항체 제조 방법에 포함된다. 상기 접종에 사용되는 동물은 소, 양, 돼지, 마우스, 랫트, 토끼, 햄스터, 염소 및 영장류를 포함한다. 접종에 바람직한 동물은 설치류, 예를 들면, 마우스, 랫트, 햄스터를 포함한다. 가장 바람직한 동물은 마우스이다.
본 발명에 의해 제공되는 단클론 항체는 또한, 당해 분야의 숙련자에게 공지된 재조합 유전공학 방법에 의해 생산되며, 본 발명은 본 발명의 PSA 단백질의 에피토프와 면역학적으로 반응성인, 상기 방법에 의한 항체를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 항체의 단편들, 예를 들면, F(ab) 및 F(ab)2를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 단편들을 포함한다. 상기 단편들은 단백질가수분해 절단, 화학적 합성 또는 유전공학적 방법에 의한 상기 단편들의 제조를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 방법으로 제조된다. 본 발명은 또한 당해 분야의 숙련자에게 공지된 방법들에 의해 제조되는, PSA 단백질과 면역학적으로 반응성인 일본쇄 항체를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명에 의한 PSA 유도된 에피토프와 면역학적으로 반응성인 경쇄 및 중쇄 펩티드를 포함하는 키메라 항체를 포함한다. 본 발명에서 제공되는 키메라 항체는 천연 항체 뿐만 아니라 당해 분야의 숙련자에게 공지된 유전공학적 기술들의 방법들로 제조된 키메라 항체를 포함한다.
본 발명에 따른 단클론 항체는 사람의 PSA, 또는 재조합 PSA를 항원으로 하여 제조된 항체로서 PSA를 인지하는 항체를 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용할 수 있는 세포는 본 발명에 의해 제공되는 천연 또는 유전공학적으로 조작된 PSA 단백질을 발현할 수 있는 임의의 세포 또는 세포주이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 세포는 포유동물 세포인 HEK-293 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 제공되는 단클론 항체는 하이브리도마 세포주에 의해서 생산되고, 상기 하이브리도마 세포주는 또한 본 발명에 의해 제공되며 당해 분야에 공지된 방법으로 제조된다[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)]. 하이브리도마 세포주는 골수종 세포주의 각각의 세포를 PSA 단백질 그 자체 또는 이종성 또는 융합성 단백질 작제물을 포함하는, PSA 단백질의 균질화 제제, 이를 포함하는 막, 상기 단백질을 암호화하는 세포, 상기 단백질로 면역화시킨 동물로부터 유도된 비장 세포와 융합시켜 제조된다. 본 발명에서 사용되는 골수종 세포주는 마우스, 랫트, 햄스터, 영장류 및 사람의 골수종으로부터 유도된 세포주를 포함한다. 골수종 세포로는, 예를 들면 P3X63Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP-2/0, F0, P3x63Ag8. V653 및 S194 등의 마우스 유래의 것이 사용될 수 있다. 또한, 랫트 유래 세포인 R-210 등의 세포주가 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 바람직한 골수종 세포주는 P3X63Ag8.653 (ATCC CRL-1580)을 포함한다.
면역화 후에 비장을 수득할 수 있는 바람직한 동물은 랫트, 마우스 및 햄스터를 포함하며, 바람직하게는 마우스이다. 비장 세포 및 골수종 세포는 당해 분야에 공지된 수 많은 방법들을 사용하여 융합시킬 수 있으며, 센다이 바이러스(Sendai virus)를 사용한 접종 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 사용한 접종 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 하이브리도마 세포주에 의해서 생성된 단클론 항체는 시험관내 세포 성장을 통해 세포 배양 상등액으로부터 회수할 수 있거 나, 하이브리도마 세포는 동물, 가장 바람직하게는 마우스의 피하 및/또는 복강내로 주입할 수 있으며, 단클론 항체는 혈액 또는 복수액(ascite)으로부터 수득된다.
본 발명에 따른 PSA에 대한 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 골수종 세포 P3X63Ag8.653 세포 (ATCC CRL-1580, USA)와 PSA에 대한 항체를 생성하는 비장 세포를 융합한 세포이다.
본 발명은 또한, 동물, 바람직하게는 사람, 더욱 바람직하게는 사람의 소변에서 PSA 단백질의 발현을 검출함으로써, 인간 전립선암의 진단 방법을 제공한다. 상기 방법에서 사용하기 위한 진단 시약은 항체, 가장 바람직하게는 본 발명의 단클론 항체를 포함한다. 상기 항체는, 예를 들면, 효소-결합된 면역흡착 분석(ELISA), 방사면역 분석(RIA), 웨스턴 블롯 분석, 면역학적 역가 분석, 면역학적 확산 분석, 및 당해 분야의 숙련자에게 공지된 기타 방법들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 통상적인 면역학적 기술들에서 사용될 수 있다.
면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표지제, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는 이에 한정되지는 않으나 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액(예를 들어, PBS) 또는 불용성 담체, 예컨대 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 항체는 검출 가능한 물질, 즉 검출 표지제와 커플링시켜 검출을 용이하게 할 수 있다. 검출 표지제의 예는 다양한 효소, 보결분자족, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질, 방사성 물질 등을 포함한다. 검출 표지제는 당해 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 본 발명의 PSA 단클론 항체에 직접적으로 커플링 또는 결합되거나 중간체(예를 들면, 당해 분야에 공지된 링커)를 통해 간접적으로 커플링되거나 결합될 수 있거나, PSA 단백질을 인식하는 또 다른 다클론항체 또는 PSA 항체를 인식하는 항체인 2차 항체에 커플링 또는 결합될 수 있다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 아세틸콜린 에스터라제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, β-D-갈락토시다아제, 글루코스 옥시다아제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산 디하이드로게나아제, 인버타제 등을 포함하고; 적합한 보결분자족 복합체의 예는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드, 피코에리트린 또는 피코빌리프로테인 등을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀, 이소루시놀, 루시제닌을 포함하고; 생물 발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린 및 아에쿠오린을 포함하며; 적합한 방사선 물질의 예는 125I, 131I, 111In, 99Tc 14C, 3H 등을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 PSA에 대한 단클론 항체를 이용하여 단클론 항체와의 면역학적 복합체 형성을 검출하는, 면역분석법 또는 면역분석용 키트에 적용하여 시료내 PSA의 탐지 또는 정량을 위한 분석방법 또는 분석 키트를 제공하는 것이다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 단클론 항체를 이용한 면역분석법 및 면역분석용 키트, 예컨대 ELISA 분석 및 방사선 면역 분석 등은 모두 본 발명에 적용 가능하다. 예를 들면, 본 발명의 PSA 정량 분석에 사용되는 키트는 본 발명에 따른 PSA 단클론 항체, 적합한 담체 용액, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표지제, 용해제, 세정제를 포함하는 용기 및 사용설명서를 포함할 수 있다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 추가로, 검출 표지제는 본 발명에 따른 PSA 단클론 항체에 직접적으로 또는 링커를 통해 결합되어 있거나, 검출 표지제와 결합된 PSA에 대한 다른 2차 항체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일례에서, 본 발명에 따른 단클론 항체가 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 생물학적 시료를 첨가하여 반응시키고, 효소-항체 결합체를 반응시킨 후 상기 효소의 기질을 처리하여 흡광도를 측정하고, 상기 흡광도를 표준곡선과 비교하여 생물학적 시료내에 존재하는 PSA를 정량하는 PSA의 정량 방법을 제공한다. 여기서, 상기 효소-항체 결합체 중 항체에 바이오틴을 결합하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 효소는 서양고추냉이 퍼옥시다제(horse radish peroxidase, 이후 HRP로 인용됨)일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, ELISA 분석법에 사용되는 효소 및 기질을 모두 본 발명에 적용할 수 있다.
ELISA 분석은 항체, 항원반응을 이용하여 시료 중에 존재하는 항원의 존재 유무 및 정량을 할 수 있는 분석 방법이다. 하나의 ELISA 키트에 필요한 항체는 2 내지 3개 정도이다. PSA를 인식하는 단클론 항체를 이용한 ELISA 키트에서는 상기 언급된 3개의 항체로 구성된다. 그 구성과 원리는 다음과 같다.
먼저, 96-웰 플레이트(사람 소변에서 PSA 정량 시)에 단클론 항체(1차 항체)를 코팅하고, PSA를 포함하는 시료를 상기 웰에 첨가하여 반응시키고, 효소 표지된 다클론 항체(2차 항체)를 반응시키고, 상기 효소 표지와 반응가능한 기질을 처리한 후에, 효소-기질 반응을 탐지하고, 표준곡선과 비교하여 시료내에 존재하는 PSA를 정량할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일례에서, 효소와 기질은 바이오틴과 스트렙타비딘 컨쥬게이트 HRP를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 항원용 펩티드 합성
인간 PSA (protein ID: P07288)의 항원 제작을 위하여 1번째 아미노산인 메티오닌부터 261번째 아미노산인 프롤린까지 아미노산 서열을 분석하여 항원성(antigenicity)이 높은 부분인 107~119 아미노산 (KNRFLRPGDDSSH) 및 248~260 아미노산 (HYRKWIKDTIVAN)을 선정하였다. KLH를 펩티드에 컨쥬게이션(conjugation)하기 위하여 107~119 아미노산의 C-말단에 시스테인 아미노산을 추가하였고, 248~260 아미노산의 N-말단 부분에 시스테인을 추가하여 펩티드를 합성하여 KLH에 컨쥬게이션하였다.
실시예 2: PSA 특이적 단클론 항체 세포주 제작
1) 항원 면역
KLH가 컨쥬게이션된 펩티드를 20 ㎍/마우스의 농도로 같은 부피의 Complete Freund's Adjuvant (Sigma, USA)가 섞인 에멀젼을 제조하였다. 상기 에멀젼을 생후 7 주령 암컷 Balb/c 마우스 (오리엔트) 3 마리에 복강 주사하였다. 1 마리당 20 ㎍의 항원을 주사하되 총 부피는 400 ㎕로 하였다. 2주 뒤에 Incomplete Freund's Adjuvant (Sigma, USA)와 항원을 혼합한 에멀전을 상기 마우스의 복강에 주입한 후, 2주일 후 PBS에 녹인 항원을 (20 ㎍/마우스) 복강 내에 주사하여 항체 생성을 유도하였다. 항체 생성을 효소면역법 및 웨스턴 블롯 분석을 실시하여 항체를 확인한 후, 세포 융합에 들어가기 3일 전에 쥐의 꼬리 정맥에 PBS에 녹인 항원으로 추가접종 하였다.
2) 항체 생성 세포의 확인 및 선별
상기 방법에 따라 면역화된 쥐의 안와 정맥 총 (eye ball)으로부터 혈액을 취득하여 1.5 ㎖ 원심분리 튜브에 담아 13,000 rpm, 10분 원심분리로 혈청을 분리하여 항체의 생성 여부를 실험하기까지 -20℃에서 보관하였다. 항원 단백질로 효소면역법 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 항체의 생성을 확인한 후 항체 생성 쥐의 비장 세포에 대한 융합(fusion)에 착수하였다.
3) 융합 세포 제조
항체 생성이 확인된 후 쥐를 희생시켜 항체생산 세포 (splenocyte)를 분리하고, 이와 골수종 세포 (myeloma cell) P3X63Ag8.653 (ATCC CRL-1580, USA)를 융합하였다. 즉, 쥐의 P3X63Ag8.653 세포를 배양 접시에 10% 우 태아 혈청 (Biowhittaker, USA)이 포함된 RPMI1640 배지를 이용하여 최적 성장기에 이르도록 유지시켰다. 세포 융합을 위하여 P3X63Ag8.653 세포를 무 혈청 RPMI 1640 배지 (Biowhittaker, USA)로 2번을 세척한 후 1 x 107 세포 되게 농도를 맞추었다. 쥐를 경추이탈 (cervical dislocation)에 의해 희생시켜 비장을 취득하고 이것을 메쉬 (Sigma, USA) 용기에 넣고 세포를 하나씩 분리시켰다. 비장세포 부유액을 만든 후 원심 세척한 다음 비장세포액을 Tris-NH4CI 용액 (Tris 20.6 g/L, NH4Cl 8.3 g/L)에 노출시켜 적혈구를 용해시킨 후, 완전히 분리된 항체 생산 세포를 5분간 400 g에서 원심분리한 후 무 혈청 배지로 2번 세척하고 10 ㎖의 배지에 현탁시켰다. 림프세포를 혈구계수판 (haemocytometer)으로 계수하여 1 x 108의 림프구를 1 x 107 P3X63Ag8.653 세포 (10:1)와 무 혈청 배지에 섞어 5분간 400g로 원심분리하였다. 37℃에서 전 처리된 50% (M/V) 폴리에틸렌 글리콜 1500 (Sigma, USA)을 이용하여 1 ㎖ 용액을 1분에 걸쳐 서서히 떨어뜨리면서 섞었다. 위에서 생성된 융합 혼합액을 무 혈청 RPMI 1640 배지로 희석하고 3분 동안 400 g에서 원심분리한 후 20% 우 태아 혈청과 HAT (100 μM hypoxanthine, 0.4 μM aminopterin, 16 μM thymidine)가 포함된 RPMI 1640 선택 배지 35 ㎖에 세포를 현탁시켰다. 100 ㎕의 현탁액을 하루 전에 feeder cells (쥐의 복강에서 RPMI 1640 배지로 분리한 macrophage)를 코팅한 96 웰 플레이트에 분주하여 37℃, 5% CO2 에서 배양하였으며, 5일 후부터는 2-3일 간격으로 HAT 선택 배지를 번갈아 주면서 14 일간 배양하였다. 14일 이후부터는 20% 우 태아 혈청과 HT (HAT 선택 배지에서 0.4 μM aminopterin을 제거한 배지)가 포함된 RPMI 1640 배지로 교환하면서 계대 배양을 진행하였다.
4) 각 항체를 생산하는 융합세포의 선별 및 분리
상기 3)의 방법에서 융합이 된 배양 상층액을 취득하여 제공된 항원에 대한 특이 항체 생성 여부를 조사하기 위하여 효소면역 측정법으로 검색하였으며, 융합 세포의 배양액을 음성대조군에 비해 4배 이상의 역가를 나타내는 웰의 세포만 선택하여 24 웰 배양 플레이트 및 25cm2 배양 플라스크로 옮겨 증식시켰다.
5) 면역 글로블린 분리 및 개별형 결정
단클론 항체의 개별형은 배양 상층액을 이용하여 효소면역측정법을 이용하는 Isotyping kit (Zymed Labomouseories Inc. USA)를 사용하여 결정하였다 (도 1). 그 결과, 인간 PSA에 대한 항체는 IgG1인 것으로 판명되었다.
또한, 제작된 인간 PSA 단클론 항체 세포주의 배양액을 이용하여 제작된 세포주로부터 나온 항체가 인간 PSA를 특이적으로 인식하는지 확인하기 위하여 전립선암 세포주인 LNCAP(인간), TRAMP-C3 (마우스)의 단백질 추출액 40 ㎍을 이용한 웨스턴 블롯 결과에서 제작된 단클론 항체 세포주가 인간 PSA 특이적임을 확인하였 다 (도 2).
실시예 3: PSA 특이적 단클론 항체를 이용한 소변 중의 PSA 정량
정상인과 전립선암 환자의 소변 시료를 채취하고, 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 소변 시료 내 PSA를 ELISA (Abazyme cat no EL10005)를 이용하여 정량하였는데, 정량 방법은 다음과 같다.
1) ELISA KIT 내에 있는 플레이트(PSA에 대한 항체가 코팅되어 있음) 각 웰에 시료를 50㎕ 씩 넣는다.
2) 잘 퍼지도록 섞어준 후, 37℃에서 30분간 보관한다.
3) 증류수로 각 웰을 5회 세척한다.
4) Horseradish peroxidase가 표지된 2차 항체 100㎕를 처리하고 37℃에서 30분간 둔다.
5) 증류수로 각 웰을 5회 세척한다.
6) 기질 용액 100㎕을 처리한 후 37℃에서 15분간 둔다.
7) 반응이 진행되면 stop solution을 넣고 반응을 멈춘다.
8) ELISA reader 450nm 파장에서 발색된 정도를 읽는다.
9) 정량한다.
측정 결과, 정상인 20명의 평균값은 50-80ng/ml 이었으며, 전립선암 환자 10명의 평균값은 5ng/ml 이하이었다 (도 3). PSA는 정상적인 전립선 상피 세포에서 분비되는 인자로서 정상인의 소변 내에 존재한다. 하지만 이것이 암으로 되면서 혈 액으로 전이되면 혈중에 없던 PSA가 매우 높아진다. 대신 소변으로의 분비는 오히려 감소하는 경향을 보이는 것이다.
따라서, 정상인과 전립선암 의심 환자의 소변 중의 PSA를 정량하여 전립선암 의심 환자의 소변 중의 PSA의 양이 정상인의 것에 비해 현저하게 적다면 전립선암으로 추정할 수 있는 것이다.
도 1은 본 발명의 단클론 항체의 개별형을 결정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 단클론 항체가 인간 전립선암 특이적임을 확인한 결과이다. LNCAP: 인간 전립선암 세포주, TRAMP-C3: 마우스 전립선암 세포주
도 3은 본 발명의 단클론 항체를 이용하여 소변 중의 PSA를 정량한 결과이다.
<110> YOON, Kang Jun <120> Monoclonal antibody recognizing prostate specific antigen and use thereof <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly 1 5 10 15 Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu 20 25 30 Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala 35 40 45 Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala 50 55 60 His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu 65 70 75 80 Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe 85 90 95 Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg 100 105 110 Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu 115 120 125 Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln 130 135 140 Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile 145 150 155 160 Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu 165 170 175 His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val 180 185 190 Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr 195 200 205 Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln 210 215 220 Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro 225 230 235 240 Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr 245 250 255 Ile Val Ala Asn Pro 260

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 인간 PSA (prostate specific antigen)의 아미노 말단으로부터 107번째 ~ 119번째 아미노산 부위 및 248번째 ~ 260번째 아미노산 부위를 인지하는 단클론 항체.
  2. 제1항에 있어서, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표지제가 결합된 단클론 항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 검출 표지제가 효소, 형광물질, 발광물질 또는 방사성 물질인 단클론 항체.
  4. 제1항의 단클론 항체를 포함하는 인간 전립선암 진단 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 진단 키트는 인간 소변 중의 PSA를 검출함으로써 인간 전립선암을 진단하기 위한 것을 특징으로 하는 키트.
  6. 제4항에 있어서, 상기 단클론 항체는 스트립(strip) 형태인 것을 특징으로 하는 키트.
  7. 전립선암 의심 환자의 소변 시료와 제1항의 PSA 단클론 항체를 접촉시켜 면역학적 복합체를 수득하는 단계; 및
    상기 수득된 면역학적 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 전립선암 의심 환자의 소변 시료 중의 PSA 농도를 측정하는 방법 .
  8. 전립선암 의심 환자의 소변 시료와 제1항의 PSA 단클론 항체를 접촉시켜 면역학적 복합체를 수득하는 단계;
    상기 수득된 면역학적 복합체를 검출하는 단계; 및
    상기 검출 결과를 정상인의 것과 비교하는 단계를 포함하는 인간 전립선암의 진단 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 PSA 단클론 항체는 스트립(strip) 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 면역학적 복합체 검출은 웨스턴 블롯(western blot), ELISA, 면역조직화학법(immunohistochemistry) 또는 면역세포화학법(immunocytochemistry)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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KR101323371B1 (ko) * 2011-05-03 2013-10-29 김수동 인간의 소변을 검체로 이용하여 전립선암을 진단하는 진단키트 및 그 제조방법

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