KR101323371B1 - 인간의 소변을 검체로 이용하여 전립선암을 진단하는 진단키트 및 그 제조방법 - Google Patents

인간의 소변을 검체로 이용하여 전립선암을 진단하는 진단키트 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본원 발명은 소변을 검체로 전립선 질환을 진단할 수 있는 진단스트립의 제조방법과 결과를 판독하는 진단키트 장치에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 면역크로마토그래피(Immunochromatography)법을 이용하여 소변에서 전체 전립선-특이 항원의 양을 키트 상에서 반 정량적으로 측정할 수 있는 진단 키트에 관한 것이다.
본원에서 사람의 초변을 검체로 활용하여 전립선 질환을 진단하도록 제공되는 진단키트는 PSA 단일클론 항체를 흡착시킨 항체패드 및 PSA 항체를 골드입자에 부착시키고 항체-골드 접합체를 함침시켜 건조한 항체-골드 접합패드(conjugate pad)와, 검체의 흐름을 도와주는 샘플패드와 흡수패드를 적층시킨 진단스트립과, 검체 투입구와 결과표시창과 손잡이를 구비하며 상기 진단스트립을 내부에 조립하여 검사 결과를 관찰할 수 있도록 하는 플라스틱 하우징을 포함하여 이루어지는 진단장치를 이용하여 전립선-특이항원(prostate specific antigen, PSA)의 항원, 항체 반응에 따른 발색을 통해 전립선암을 진단할 수 있는 기계장치에 관한 것이다.

Description

인간의 소변을 검체로 이용하여 전립선암을 진단하는 진단키트 및 그 제조방법{Apparatus and manufacturing method of a diagnostic kit with the sample of urine to diagnose the prostate cancer}
본 발명은 인간의 소변을 검체로 하여 전립선암을 진단할 수 있는 진단키트 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 면역 크로마토그래피 (Immunochromatography)법을 이용하여 육안으로 전립선암 발생 여부를 진단할 수 있는 진단키트에 관한 것이다.
전립선은 고환, 정낭과 함께 생식기능을 가능케 하는 기관 중의 하나로서, 이곳에서 나오는 전립선액은 남성 정액의 액체성분 중 약 1/3을 차지하는바 따라서 전립선에 이상이 발행하면 성기능의 장애를 가져올 수 있으며 배뇨에도 큰 어려움을 느끼게 된다.
국내 전립선암의 발생빈도는 남성인구 10만 명당 2.7명 정도이나 미국에서는 폐암과 함께 남자에게 발생하는 암 중 1~2위에 이르고 있으며, 암 사망 원인의 3위를 차지하고 있는바, 무증상의 환자를 계산하면 전립선암 환자의 수는 훨씬 더 많을 것으로 추정되고 있다.
전립선암의 발생 원인으로는 유전적 요소, 남성호르몬 영향, 음식 및 식습관, 직업, 과거 전립선염을 앓은 적이 있는지의 유무 등이 거론되고 있으나 아직 구체적인 원인자는 확인되고 있지 않다.
전립선질환이나 암 환자의 양상은 혈중 전립선-특이항원(Prostate specific antigen)의 증가, 직장수지검사에서 딱딱한 결절의 관찰, 경직장 초음파검사에서 이상조직의 관찰, 또는 전립선 비대증으로 생각하고 떼어낸 조직에서 암세포가 발견되는 경우 등으로 발견된다.
그러나 전립선암이 국소 암인 경우 별다른 증상이 없으나 어느 정도 진행되면 방광출구 막힘 증상, 급성 요막힘, 혈뇨 및 요실금과 같은 증상을 나타내기도 하며 심하면 신장이 망가져서 신부전에 의한 증상이 있을 수 있으며, 가끔 골 전이에 의한 골 통증이나 척수압박에 의한 신경증상 또는 병적골절이 있어 우연히 발견되기도 하나 전립선암은 다른 암과는 달리 매우 천천히 증식하는 특징을 갖기에 전립선암을 조기에 진단할 수 있다면 치료의 가능성을 훨씬 높일 수 있기 때문에 초기진단의 중요성이 대두 되고 있다.
전립선-특이항원(Prostate specific antigen;PSA)은 분자량이 43,000Dalton으로 전립선 표피에서 높은 수준으로 발현되는 세린 단백질 분해 효소로서 현재 혈중 PSA(Prostate specific antigen)의 양을 측정하는 키트들이 많이 유통되고 있으며, 건강한 남자의 혈액에는 2ng/㎖ 이하의 PSA가 존재하며 전립선암이 발병하면 그 양이 증가하는 것으로 진단된다.
따라서 혈액에서 PSA양이 증가하면 전립선암, 전립선 비대증과 같은 전립선 질환의 발생을 표시하는바, 전립선암 진단에 주로 사용되는 PSA의 컷오프(cut-off)는 3 내지 4 ng/㎖로 보는 것이 일반화되어 있으며, PSA양이 10ng/㎖ 이상이면 전립선암일 확률이 67% 라는 보고가 있다.
그러나 상기와 같이 종래의 혈액을 이용하는 ELISA형태의 진단키트는 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) Reader기 및 Automation 장비와 같은 특수장비 및 전문인력을 필요로 하기 때문에 가정에서는 적용할 수 없는 사용상의 제약을 갖고 있고, 검사 결과를 얻기까지 오랜 시간이 걸린다는 문제점이 있다.
또한 혈액을 이용하여 PSA양을 측정하여 전립선질환 및 전립선암을 진단할 수 있다는 것은 중요한 의미를 갖는 것은 사실이나 신체에 주사기를 사용하여 채혈을 하는 복잡한 과정을 갖고, 혈액 중의 PSA의 양을 측정하기 위해서는 간호원이나 전문의가 판독/수행하는 시스템으로 병원을 내원해서 전문 의료인의 도움을 받는 방식이 아니면 전립선질환 및 전립선암을 진단 및 판독, 예방을 위한 사전 조치 등을 취할 수 없다는 문제점을 갖는다.
본원은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로서, 인간의 소변에서 검출되는 지표물질을 검체로 이용하여 면역학적 방법으로 전립선암 발병 여부를 간단하게 확인할 수 있는 진단키트를 제공하고자 하는 목적을 갖는 것이다.
본원의 또 다른 목적은 특별한 장비 없이도 의료기관이나 가정 등에서 소변을 검체로 이용해 육안으로 간단히 전립선암 여부를 확인, 판독 가능한 전립선암 진단키트 및 그 진단키트의 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 제안되는 본원의 진단키트는 인간의 초변을 검체로 하여 전립선-특이항원(prostate specific antigen, PSA)의 항원, 항체 반응에 따른 발색을 통해 전립선암을 진단할 수 있다.
본원 발명자는 인간의 초변(야간 취침 후 아침에 기상하여 첫 배뇨되는 소변)을 검체로 하여 전립선-특이항원(prostate specific antigen, PSA)의 반응을 살피며 상기 항원, 항체 반응에 따른 발색을 통한 전립선암 진단 가능성 여부를 확인하고자 수많은 시행오차법에 따른 실험 및 검측 결과, 인간의 초변 중 전립선-특이항원의 수치가 정상인은 40 ~ 75 ng/㎖임에 비하여, 전립선 질환 중 암환자 평균값은 9.1 ng/㎖ 이하로 나타내는 사실을 확인하였으며, 발명자 등은 다양한 실험 데이터 및 관련 문헌 조사결과를 통해 초변 중 PSA cut-off농도를 10 ng/㎖로 정하였고 이보다 적은 수치일 때 전립선암으로 판정하는 진단장치를 구현할 수 있음을 확인하여 완성된 발명이다.
본원에서 제공되는 전립선-특이항원(prostate specific antigen, PSA)의 항원, 항체 반응에 따른 발색을 통해 전립선암을 진단하는 진단키트는, PSA 단일클론 항체를 흡착시킨 항체패드와 PSA 항체를 골드입자에 부착시키고 항체-골드 접합체를 함침시켜 건조한 항체-골드 접합패드(conjugate pad)와 검체의 흐름을 도와주는 샘플패드와 흡수패드를 적층시킨 진단스트립; 및 검체 투입구와 결과표시창과 손잡이를 구비하며 상기 진단스트립을 내부에 내장시켜 조립되는 플라스틱 하우징을 포함하는 진단키트를 바이오리더기에 내삽시키는 수단으로 전립선-특이항원(prostate specific antigen, PSA)의 항원, 항체 반응에 따른 발색을 통해 전립선암을 진단할 수 있다.
본 발명에서 진단 스트립의 제조에 사용할 수 있는 멤브레인은 통상의 진단스트립의 재료로 이용되는 소재로, 예를 들어 나이트로 셀룰로우즈, 셀룰로우즈, 셀룰로우즈 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체류가 사용될 수 있으며, 면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표지제, 용해제, 세정제가 포함되어 제공될 수 있다.
또한, 검출 표지제가 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제가 포함할 수 있는바 적합한 담체로는 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액(예를 들어, PBS) 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따르는 진단용 항체는 스트립의 제조에 사용할 수 있는 통상의 상업적으로 이용 가능한 항체의 원료인 정제된 단일클론 anti-PSA, 토끼 anti-PSA, 산양 anti-쥐 IgG, 45nm금입자골드(colloidal Gold) 원료로 제공되는 것들을 사용 할 수 있는바, 바람직하게는 HB-10494, HB-9119, HB-11426, HB-8051, HB-8525, HB-8527(American Type CultureCollection, VA, USA) 및 anti-PSA Ab(cat no: MO-C40081C: C-PSA1, Abazyme,Needham, MA, USA)로 구성된 그룹 중에서 선택된 1종 이상의 항체를 사용할 수 있다.
45nm 금입자골드(colloidal Gold)는 상기 발명품의 적합한 발색 물질로 125I,131I,111In,99Tc14C,3H 등 방사선 물질이 포함되어 있다.
본 발명의 기술사상이 적용되는 전립선질환 및 전립선암 진단용 키트 및 진단방법은, 소변 중의 PSA는 키트 내의 PSA에 대한 항체와 항원-항체 반응을 통해 면역학적 복합체를 형성하게 되고, 형성된 면역학적 복합체는 면역분석법을 사용하여 검출할 수 있으며, 항원을 검출하거나 정량하는데 사용되는 수많은 면역분석법들이 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988, 556-612, Reiter RE., Gu Z., Watabe T., Thomas G., Prostate stem cell antigen : A cell surface marker overexpressed n prostate cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 1998. Feb 17;95(4):1735-40]을 참조 가능하다.
본 발명의 전립선암 진단용 키트는 면역크로마토그래피법 (immunochromatograpic assay)을 기초로 고안되어 현재 시판되고 있는 전립선암 진단용 키트의 원리가 그대로 적용될 수 있는바, 면역크로마토그래피법은 면역화학법(immunochemistry)과 크로마토그래피법(chromatogrphic assay)를 결합한 검사방법으로 항원에 대한 항체의 특이적인 면역반응성, 금입자(colloidal gold)의 발색특성 및 유동성 막(porous membrane)의 모세관현상에 의한 분자의 이동을 응용한 검사방법이다.
면역크로마토그래피법은 기존의 멀티-스텝(multi-step) 면역측정법에서 요구되는 검체 희석, 세정 및 효소 결합체와 기질의 반응을 통한 발색 과정을 하나로 통합하여 원-스텝(one-step)으로 신속하게 검사할 수 있는 편리성이 있으며 또한 특정한 장비를 사용하지 않고 검사결과를 판정할 수 있는 용이성 및 경제성, 검사결과 판독의 신속성 등에서 장점을 갖는다.
본 발명의 바람직한 일 적용예에서, PSA에 대한 항체가 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 인간의 소변 시료를 첨가하여 반응시키고, 효소-2차 항체 결합체를 반응시킨 후 상기 효소의 기질을 처리하여 흡광도를 측정하고, 상기 흡광도를 표준곡선과 비교하여 인간 소변 내에 존재하는 PSA를 정량 비교한 결과를 바탕으로 전립선질환과 전립선암을 진단할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 적용예에서, 효소와 기질로서 바이오틴과 스트렙트 아비딘 컨쥬게이트된 호스래디쉬퍼옥시다제를 사용할 수 있다.
본원에서 인간의 초변 중 전립선-특이항원의 양이 10ng/㎖이하인 경우에 전립선암으로 판정하는 전립선-특이항원의 항원, 항체 반응 전립선암 진단 키트를 이루기 위한 진단스트립의 제조방법은, 나이트로셀룰로우즈 멤브레인에 점적된 제1라인의 산양-anti 마우스 IgG 다중클론항체 점적부와 상기 나이트로셀룰로우즈 멤브레인에 점적된 제 2라인의 토끼-anti PSA단일클론항체 점적부가 각각 상기 나이트로셀룰로우즈 멤브레인에 5㎝/sec 내지 8㎝/sec로 움직임으로써 상기 항체들을 각각 0.5㎕/㎝ 내지 1.3㎕/㎝의 점적 농도로 제조하는 방법으로 적용될 수 있다.
또한 본원에서 제공되는 진단키트는 소변을 검체로 이용할 수 있을뿐 아니라 혈액을 시료로 면역크로마토그래피법을 적용하여 PSA(prostate specific antigen)의 특이적인 항원를 측정함으로써 전립선암, 전립선비대증, 전립선관련 악성종양 및 양성종양 등 전립선질환의 진단방법에도 적용될 수 있다.
본 발명은 면역크로마토드래피(Immunochromatography)법에 의해 소변 및 혈액에서의 PSA의 양을 반정량적으로 측정할 수 있는 진단키트로 제공될 수 있으며,또한, 본 발명의 정확한 진단을 위해서 체액성분에 대한 면역반응 측정 리더기를 이용해 정확하게 진단하는 방법으로 적용될 수 있는바, 이의 구체적인 제조방법 및 적용 실시양태는 하기의 '발명을 실시하기 위한 구체적인 내용' 란 기재를 통하여 상세히 설명된다.
본 발명은 국내 및 해외 여러 나라의 전립선질환 및 전립선암 빈도가 증가하는 추세에 따라, 병원에서는 물론 가정에서 인간 소변을 검체로 진단 키트를 이용해 소변 중의 PSA 양 측정으로 일반 사용자가 자가진단으로 전립선암 여부를 신속하게 진단하는 것이 가능한 진단 키트를 제공하는 효과를 갖는다.
본원의 진단 키트는 병원을 가지 않고도 가정에서 쉽게 육안으로 전립선암 여부를 확인할 수 있고 1차 검진을 통해 이상을 발견하는 경우 병원에 찾아가 전립선암의 조기진단 확인이 가능하므로 치료의 가능성을 높이는 효과를 갖는다.
도 1은 전립선 질환 진단키트의 그림이다.
도 2는 전립선 질환을 진단하는 스트립 및 상부 케이스와 하부 케이스를 조립한 그림이다.
도 3은 전립선 질환을 진단하는 스트립의 모식도이다.
도 4는 정확한 진단을 목적으로 진단키트와 병행사용이 가능한 리더기와 액정을 통해 표현되는 그림이다.
본원의 기술사상이 구현되기 위한 발명의 실시내용을 실시 가능한 적용예를 발명의 실시예 및 도면을 통하여 상세히 설명하면 다음과 같다.
본원은 종래 혈액을 이용하는 진단키트는 ELISA Reader 및 Automation 장비와 같은 특수장비 및 전문인력을 필요로 하므로 병원에 가서 전문가에게 검사를 받고 검사결과를 얻기까지 복잡하고 오랜 시간이 걸리는 문제점을 해소하고자 한 것으로 본원에서 제공되는 진단키트는 검사결과를 5분~ 10분 이내에 확인할 수 있는 간단하고 신속한 진단 키트를 제공한다.
본원은 기존과 같이 혈중 PSA(prostate specific antigen)를 측정하는 방법이 아니라 하루 중 첫 소변 중의 PSA를 측정하여 전립선암을 진단하는 방법을 적용하고자 한 것으로, 정상인들은 일정한 수치를 보였으나, 정상 조직에서 암이 발생하게 되는 경우에는 관강(管腔; lumen)을 가득 채우면서 일부는 바깥쪽으로 침투를 시작하게 되고, 혈관을 통해 암세포의 전이를 일으키며 이와 동시에 전립선 샘에서 생성되는 물질들(PSA 등)이 혈관 내로 다량 유입됨에 따라서 전립선 암이 발생하게 되는 경우 혈중 PSA 수치가 증가하게 되는 반면에 평소처럼 정액에 분비가 되는 방향으로 이용되어야 할 PSA의 절대량이 감소하게 되므로, 소변에서 일정하게 검출되던 PSA의 양은 감소 된다는 사실을 확인하게 되었다.
이하, 본원에서 제공되는 발명의 기술사상이 구체적으로 구현되는 실시양태를 발명의 실시예를 통하여 구체적으로 설명하고자 하나 이들 제시되는 실시양태는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 하나의 구체화된 구현방법을 제시하는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안될 것임은 당연하다.
실시예 1 : PSA의 검출 방법
1-1. 인간의 소변 중의 PSA 검출 및 10 ng/㎖ cut-off 설정
정상인 10명과 전립선암 환자 10명의 소변을 각각 채취하고, 원심분리하여 침전물을 제거하였으며, 소변 시료 내 PSA를 Calbiotech, Inc (CBI) PSA ELISA Kit(Catalog No. PS067T)를 이용하여 다음과 같이 검출하였다.
1) PSA ELISA 키트를 사용 10분 전에 꺼내어 상온에 방치한다.
2) PSA ELISA 키트 내에 있는 플레이트에 anti-PSA 단일클론항체를 코팅하고, 각 웰에 시료를 피펫으로 50㎕씩 넣었다.
3) enzyme용액을 100㎕씩 피펫으로 각 웰에 결합시켰다.
4) 30초 동안, 부드럽게 플레이트를 섞어주어 반응시켜준다.
5) 플레이트 커버를 덮고 상온 18 내지 26에서 60분 정도 배양한다.
6) 플레이트 웰안에 있는 모든 액체를 제거하고, 1X로 희석한 세척액을 웰에 300㎕를 넣고 3번 세척한 후 흡수 타올을 이용 액채성분을 제거한다.
7) 모든 웰에 TMB기질을 100㎕씩 피펫을 이용해 추가한다.
8) 상온에서 15분 동안 배양한다.
9) 배양이 끝나면 모든 웰에 반응 정지액을 혼합하여 부드럽게 흔들어 준 후 15분 이내 450nm 파장에서 ELISA reader로 읽어주는 방법으로 표 3의 분석결과를 얻을 수 있었는바, 소변에서 정상인의 PSA평균 값은 40 내지 75 ng/㎖이고,전립선질환 중 암환자 평균 값은 9.1ng/㎖ 이하인 경우 전립선암으로 진단할 수 있다는 근거로부터 소변 중 PSA cut-off농도를 10 ng/㎖로 정하여 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.(도 5 참조)
실시예 2 : 소변을 검체로 한 스트립의 제조
2-1. 면역크로마토그래피 전립선 질환 스트립의 제조
1) 콜로이드 골드 용액의 제조
콜로이드 골드용액을 제조하는 증류수 300㎖를 80 내지 90로 가열한 후 25% 내지 30%로 희석한 골드용액(HAuCl4 3H2O)을 1.5㎖ 내지 2.0㎖ 첨가하여 교반하였고, 6분 경과 후 0.1% 내지 0.5%의 ascorbic acid를 1.5㎖ 내지 2.5㎖를 혼합하였으며 5분 동안 추가로 교반하여 제조한 45nm 크기의 골드용액을 제조하여 사용하였다.
2) 항체( anti-PSA)-골드 접합체의 접합(Conjugate)패드 제조
항체를 콜로이당 금 입자 용액에 골드 ㎖ 당 항체 0.3~0.7ng을 가하여 폴리에스테르(100% Polyester:6613) 패드에 고르게 분무하여 건조해 접합(Conjugate) 패드를 제조하여 사용하였다.
3) 접합(Conjugate)패드
시험하고자하는 시료를 흡수하기 위한 부분으로서 접합(Conjugate)패드는 폴리에스테르(100% Polyester:6613)를 사용하며, 검체의 흐름을 도와주는 스트립 하부 샘플패드는 유리섬유(Glass microfiber: Millipore 8964)또는 면섬유(AP31 Cotton Linter: Millipore)패드를 사용하여 0.1~3.0% TritonX-100 계면활성제로 고르게 분무해 건조 후 사용하였다.
4) 흡수패드
면역 반응 후 시료 내 미반응 물질들을 흡수하고 분석물질을 포함한 시료용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 역할을 하도록 흡수패드(100% Cotton Linter:Millipore 222)는 면 섬유 패드를 사용하였다.
5) 나이트로샐룰로우즈 멤브레인과 PSA항체의 결합
본 발명의 소변으로부터의 PSA 검출용 진단스트립에서, 나이트로셀룰로우즈 멤브레인에 2개의 라인(1라인:Control, 2라인:Test)이 제공되며, 제 1라인은 산양-anti 마우스에 IgG 다중클론항체가 1.5 내지 1.7㎎/㎖의 농도로 점적되어 제공되며, 제 2라인은 토끼-anti PSA단일클론항체가 0.7 내지 1.0㎎/㎖의 점적 농도를 갖도록 제공 된다.
이들 항체의 희석 방법은 1X PBS에 항체 농도에 맞게 희석한 다음 수크로우스 당을 최종농도 0.5% 내지 10%가 되게 혼합해 사용하며, 또한 나이트로샐룰로우즈 멤브레인과 PSA항체의 결합에 있어서 분주기를 사용, 2개의 라인(1라인:Control, 2라인:Test)을 점적 시, 2개의 항체를 각각 나이트로셀룰로우즈 멤브레인에 1초당 5cm 내지 8cm로 움직이게 조작하여 항체를 cm 당 0.5㎕ 내지 1.3㎕가 되게 점적하여 제조할 수 있다.
6) 라미네이션
각각의 구성물을 이용하여 적층시켜 un-cut시트를 만들고 스트립 형태로 절단하고 이 스트립을 플라스틱 하우징에 넣고 뚜껑을 덮어 조립된 키트는 실리카겔과 드롭퍼를 알루미늄포에 밀봉하여 습기로부터 보호하고자 하였다.
2-2. 결과 판정법
샘플패드에 시료로써 80 내지 120㎕의 소변을 가하고 5 내지 10분 후 대조선C(control line)과 결과선T(test line)의 발색 유무 및 진하기를 대조해 관찰한다. 양성시료의 경우 대조선만 발색되어 적자색으로 표시되고, 음성시료의 경우 대조선과 결과선이 같이 적자색으로 발색된다.
따라서 본원의 진단키트를 이용하는 경우 사람의 초변을 검체로 활용하여 전립선 질환을 진단하는 결과 판정방법은 진단키트의 샘플패드에 시료로 80 내지 120㎕의 소변을 가하고 5 내지 10분 후 대조선C(control line)와 결과선T(test line)의 발색 유무를 판단할 때 양성시료일 때는 대조선만 발색되어 적자색으로 표시되는 구성으로 제공되고, 음성시료일 때는 대조선과 결과선이 함께 적자색으로 발색되어 판정되는 극히 간단한 방법으로 진단키트의 판정결과를 얻을 수 있다.
실시예 3 : 본 발명에 따르는 진단 스트립 효능 확인시험
상기 실시예 2에서 제조한 본 발명에 따르는 진단 스트립의 효능을 시험하기 위해 전립선암 환자로 소변의 PSA 농도가 7ng/㎖이하인 전립선암 환자의 소변 검체 60개 그리고 정상인의 소변 검체 100개를 육안 확인, ELISA법, 그리고 정밀한 진단을 위해 자사가 개발한 리더기로 검사하였고 본 발명품으로 상기의 검사 방법과 판정기준에 따라 비교 시험을 하였다.
(1) 본 발명에 따르는 상기 실시예 2에서 제조된 진단 스트립을 구비하고 있는 장치를 이용하여 환자의 소변 중 PSA 농도가 7ng/㎖이하인 검체와 정상인의 검체를 이용하여 본 발명품으로 테스트한 결과를 나타난 검사결과는 표 1과 같았으며, 또한 표 1의 결과를 재 검증하기 위하여 PSA ELISA Kit(Catalog No. PS067T)를 사용하여 실험한 검사결과를 표 2로 나타내었다.
[표 1] 전립선 질환 키트의 육안 비교 실험 결과
구분 판정 개체수
양성 음성
발명품
육안확인결과		 음성 0 50
양성 30 0
# 양성기준 : 소변 중 PSA 10ng/㎖ 이하
[표 2] PSA ELISA Kit(Catalog No. PS067T)비교 실험 결과
구분 판정 개체수
양성 음성
발명품
ELISA정량 결과		 음성 0 50
양성 30 0
# 양성기준 : 소변 중 PSA 10ng/㎖ 이하
상기의 표 1의 결과와 표 2의 결과는 PSA 음성 및 양성 검체에서 동일한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었으며, 병원 및 임상병리기관에서 신뢰도가 높은 것으로 인식되어 일반적으로 적용되고 있는 정량 ELISA Kit 검증 결과와 비교했을 때 동일한 결과를 얻은 것으로부터 본 발명품의 테스트 결과를 신뢰할 수 있다고 판단된다.
따라서 본원 발명자 등은 상기의 실험결과로부터 PSA 단일클론 항체를 흡착시킨 항체패드 및 PSA 항체를 골드입자에 부착시키고 항체-골드 접합체를 함침시켜 건조한 항체-골드 접합패드(conjugate pad)와, 검체의 흐름을 도와주는 샘플패드와 흡수패드를 적층시킨 스트립과, 검체 투입구와 결과표시창과 손잡이를 구비하며 상기 진단스트립을 내부에 조립하여 검사 결과를 관찰할 수 있도록 하는 플라스틱 하우징을 포함하여 이루어지는 본원의 진단키트를 이용하여 전립선-특이항원(prostate specific antigen, PSA)의 항원, 항체 반응에 따른 발색을 통해 전립선암을 진단할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이하 본원의 기술사상이 현실적으로 적용되는 실시양태를 도면을 참조하여 설명하기로 한다.
도 1은 본원의 기술사상이 적용되어 전립선 질환 진단키트에 내장되는 스트립(10)을 나타낸 것으로, 스트립(10)은 나이트로셀룰로우즈 멤브레인(11)에 2개 라인을 갖고, 제 1라인은 산양-anti 마우스 IgG 다중클론항체가 1.5 내지 1.7㎎/㎖의 농도로 점적되어 대조선 Control기능을 갖도록 제공되고, 제 2라인은 결과선(test line)으로 토끼-anti PSA단일클론항체가 0.7 내지 1.0㎎/㎖의 농도로 점적 되어 건조 후 사용되는 구성으로 결과선 T(test line)의 발색 유무 및 농도 진하기를 대조해 관찰할 수 있도록 제공되며, 샘플패드(12)는 소변이 2~3방울 적가 되도록 제공되는 부위이며, 접합(Conjugate)패드(13)은 항체를 콜로이당 금 입자 용액에 골드 ㎖ 당 항체 0.3~0.7ng을 가하여 폴리에스테르(100% Polyester:6613) 패드에 고르게 분무하여 건조하여 제공되는 접합(Conjugate)패드를 나타낸 것이며, 흡수패드(14)는 면역 반응 후 시료 내 미반응 물질들을 흡수하고 분석물질을 포함한 시료용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 역할을 하도록 면 섬유로(100% Cotton Linter:Millipore 222)를 사용하여 도 1에 제시되는 스트립을 얻을 수 있음을 나타낸 것이다.
도 2는 상기 도 1에 제시된 스트립(10)을 하부케이스(20)와 상부케이스(30)에 수용하여 진단 키트(40)를 형성하는 분해사시도로 나타낸 것으로, 하부케이스(20)는 상부스트립홀더(21) 및 하부스트립홀더(22)와 측면으로 다수개의 지지구(23)를 가지며, 상단걸림턱(24) 및 하단걸림턱(25)을 갖는 구조로 제공되어 상단걸림턱(24)쪽에 도 1에 제시된 스트립(10)의 흡수패드(14)가 위치하고, 하단걸림턱(25)쪽에 도 1에 제시된 스트립(10)의 샘플패드(12)가 위치하여 상부스트립홀더(21)와 하부스트립홀더(22)에 안정적으로 재치/내삽되도록 제공되고, 상부케이스(30)는 일단으로 손잡이부(31)를 갖고 중앙부에는 소변샘플 주입구(32) 및 스트립(10)의 대조선 C-line과 결과선 T- line이 표시되는 결과표시부(33)를 가지며 리더기에 진입방향표시부(34)를 갖는 구조를 갖도록 제공될 수 있는 실시양태를 나타낸 것이다.
도 3은 본원에서 제공되는 진단키트(40)의 결합 과정을 나타낸 것으로, 도 3a에서는 하부케이스(20)의 상부스트립홀더(21)와 하부스트립홀더(22) 사이에 도 1에 제시된 스트립(10)이 먼저 재치하려는 과정도를 나타낸 것이고, 3b에서는 하부케이스(20)의 상단걸림턱(24)과 하단걸림턱(25)사이에서 상부스트립홀더(21)와 하부스트립홀더(22)에 도 1에 제시된 스트립(10)이 먼저 재치하려는 과정도를 나타낸 것이, 3b에서는 하부케이스(20)의 상부스트립홀더(21)와 하부스트립홀더(22) 사이에 스트립(10)이 재치/내삽 된 후 상부케이스(30)가 덮어지려는 과정도를 나타낸 것이며, 도 3c에서는 하부케이스(20) 내부에 스트립(10)이 재치/내삽 된 후 상부케이스(30)가 덮여서 진단키트(40)로 제공된 상태를 나타낸 것이다.
도 4는 본원의 진단키트(40)가 출원인 회사에서 개발되어 별도의 발명품으로 제공(특허출원 준비중)되는 리더기(Reader)를 통하여 소변을 검체로 하여 전립선 질환을 진단할 수 있는 적용예를 나타낸 것으로, 리더기(50)의 외관은 데이터표시부(51) 및 전원 on/off 표시를 통하여 감사시작 및 종료여부를 확인표시부(52)를 가지며, 분석이 완료된 후 진단키트를 분출시키기 위한 분출보턴(53)을 갖고, 리더기(50)의 일 측부로는 분석용 진단키트삽입구(54)를 갖는 구성으로 제공되어서 사용자가 기상을 하여 진단키트(40)의 손잡이부(31)를 잡고 중앙부에 있는 소변샘플 주입구(32)에 소변을 묻혀 리더기(50)의 진단키트삽입구(54)에 진입방향표시부(34)의 화살표 방향으로 꽂아주는 단순한 동작에 의해 전립선 질환의 발병 또는 전립선암 진행여부를 확인할 수 있는바, 이는 검체 중에 존재하는 PSA가 골드입자에 부착된 항체와 반응하면서 나이트로셀룰로우즈 멤브레인 위를 모세관현상에 의해서 진단이 전개되기 때문이다.
도 5는 본원의 진단키트를 이용하여 전립선암 환자와 정상인의 PSA를 검출하여 결과 값을 기준으로 10ng/㎖의 cut-off 수치를 정하게 된 실험결과의 도면을 나타낸 것으로, 상기의 실험결과로부터 본원에서 PSA 단일클론 항체를 흡착시킨 항체패드 및 PSA 항체를 골드입자에 부착시키고 항체-골드 접합체를 함침시켜 건조한 항체-골드 접합패드(conjugate pad)와, 검체의 흐름을 도와주는 샘플패드와 흡수패드를 적층시킨 진단스트립과, 검체 투입구와 결과표시창과 손잡이를 구비하며 상기 진단스트립을 내부에 조립하여 검사 결과를 관찰할 수 있도록 하는 플라스틱 하우징을 포함하여 이루어지는 진단장치를 이용하여 전립선-특이항원(prostate specific antigen, PSA)의 항원, 항체 반응에 따른 발색을 통해 사람의 초변을 검체로 활용하여 전립선 질환을 진단할 수 있는 기술사상의 발명이다.
10 : 스트립 11 : 나이트로셀룰로우즈 멤브레인
12 : 샘플패드 13 : 접합(Conjugate)패드
14 : 흡수패드 20 : 하부케이스
21 : 상부스트립홀더 22 : 하부스트립홀더
23 : 지지구 24 : 상단걸림턱
25 : 하단걸림턱 30 : 상부케이스
31 : 손잡이부 32 : 소변샘플 주입구
33 : 결과표시부 34 : 진입방향표시부
40 : 진단 키트 50 : 리더기
51 : 데이터표시부 52 : 확인표시부
53 : 분출보턴 54 : 진단키트삽입구

Claims (8)

  1. 전립선 질환을 진단할 때 사람의 초변을 검체로 활용하는 진단 스트립(10)을 진단키트(40)에 내장하고 진단키트(40)를 리더기((50)로 읽음으로 간단하게 전립선 질환을 진단하도록 제공되는 진단키트에 있어서,
    상기 진단 스트립(10)은 나이트로셀룰로우즈 멤브레인(11)과 소변이 2~3방울 적가되는 샘플패드(12)와 폴리에스테르로 제공되는 접합패드(13)와 면 섬유로 제공되는 흡수패드(14)로 제공되되, 나이트로셀룰로우즈 멤브레인(11)은 2개 라인으로 제1라인은 산양-anti 마우스 IgG 다중클론항체가 1.5 내지 1.7㎎/㎖의 농도로 점적되어 대조선 C-line을 이루며 제2라인은 토끼-anti PSA단일클론항체가 0.7 내지 1.0㎎/㎖의 농도로 점적되고 건조 후 사용되어 발색 유무 및 농도 진하기를 대조해 관찰할 수 있도록 제공되는 결과선 T-line을 갖는 구성으로 제공되고, 접합패드(13)은 항체를 콜로이당 금 입자 용액에 골드 ㎖ 당 항체 0.3~0.7ng을 가하여 폴리에스테르(100% Polyester) 패드에 고르게 분무시킨 후 건조하여 제공되며, 흡수패드(14)는 면역 반응 후 시료 내 미반응 물질들을 흡수하고 분석물질을 포함한 시료용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 역할을 하도록 면 섬유로(100% Cotton Linter)가 사용되어 제공되는 구성으로 진단 스트립(10)이 사용되고,
    상기 진단 키트(40)는 하부케이스(20)와 상부케이스(30)가 플라스틱 하우징을 이루어 제공되되, 하부케이스(20)는 상부스트립홀더(21) 및 하부스트립홀더(22)와 측면으로 다수개의 지지구(23)와 상단걸림턱(24) 및 하단걸림턱(25)을 갖는 구조로 제공되어 상단걸림턱(24)에 상기 진단 스트립(10)의 흡수패드(14)가 위치되고 하단걸림턱(25)에 진단 스트립(10)의 샘플패드(12)가 위치하는 구조로 상부스트립홀더(21)와 하부스트립홀더(22)에 안정적으로 재치/내삽되는 구성을 이루며, 상부케이스(30)는 일단으로 손잡이부(31)를 갖고 중앙부에는 소변샘플 주입구(32) 및 진단스트립(10)의 대조선 C-line과 결과선 T- line이 표시되는 결과표시부(33)를 가지며 리더기에 내삽되는 진입방향표시부(34)를 갖는 구성의 진단키트가 리더기(50)에 내삽되어 전립선-특이항원(prostate specific antigen, PSA)의 항원 및 항체 반응에 따른 발색을 통해 전립선암을 진단할 수 있도록 제공되는 것을 특징으로 하는 진단키트.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기의 샘플패드는 유리섬유(Glass microfiber)또는 면섬유(Cotton Linter)로 제공되되 0.1~3.0% Triton X-100 계면활성제가 고르게 분무되고 건조된 후 사용하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 진단키트는 사람의 초변 중 전립선-특이항원의 양이 10ng/㎖이하인 경우에 전립선암으로 판정되도록 제공되는 것을 특징으로 하는 진단키트.
  4. 사람의 초변을 검체로 활용하여 전립선 질환을 진단하도록 제공되는 진단 키트의 스트립 제조방법에 있어서,
    소변을 검체로 한 스트립을 얻기 위한 수단으로 증류수를 80~90℃로 가열한 후 25% ~ 30%로 희석한 골드용액(HAuCl4·3H2O)을 첨가하여 교반하고, 0.1%~0.5%의 ascorbic acid를 혼합하여 45±5nm 크기의 골드용액을 제조하는 단계;
    상기 단계로 제조된 45±5nm 크기의 골드용액에 ㎖당 anti-PSA단일클론 항체를 0.3ng~0.7ng의 비율로 항체-골드 접합체를 제조하는 과정과;
    폴리에스테르로 이루어진 패드에 상기 제조된 항체-골드 접합체를 14㎖~20㎖의 비율로 함침시켜 건조하는 단계;
    를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 스트립 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 스트립 소재가 나이트로셀룰로오즈 멤브레인이 이용되고, 멤브레인은 2개 라인(1라인:Control, 2라인:Test)이 점적되되, 제1조절 라인(Control)은 산양-anti 마우스 IgG다중클론항체로 1.5 내지 1.7㎎/㎖의 농도로 점적되고, 제2조절(Test) 라인은 토끼-anti PSA단일클론항체로 0.7 내지 1.0㎎/㎖의 농도로 점적 되어 건조 후 사용되는 것을 특징으로 하는 스트립 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 나이트로셀룰로우즈 멤브레인의 2개 라인(1라인:Control, 2라인:Test)에 항체를 5 ~ 8 ㎝/sec 속도로, 0.5㎕/㎝ ~ 1.3㎕/㎝의 분주량으로 주가하는 방법이 적용되는 것을 특징으로 하는 스트립 제조방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 멤브레인의 2개 라인(1라인:Control, 2라인:Test)에 사용되는 항체를 완충액 1X PBS(1x(ablet) 10mM phosphate buffer)로 희석하며, 추가로 수크로우스 당이 최종농도 0.5% 내지 10%의 비율로 혼합하여 적용되는 것을 특징으로 하는 스트립 제조방법.
  8. 전립선 질환을 진단할 때 사람의 초변을 검체로 활용하는 진단 스트립(10)을 진단키트(40)에 내장하고 진단키트(40)를 리더기((50)로 읽음으로 간단하게 결과를 판정하는 진단키트의 결과 판정방법에 있어서,
    상기 진단 스트립(10)은 나이트로셀룰로우즈 멤브레인(11)과 소변이 2~3방울 적가되는 샘플패드(12)와 폴리에스테르로 제공되는 접합패드(13)와 면 섬유로 제공되는 흡수패드(14)로 제공되되, 나이트로셀룰로우즈 멤브레인(11)은 2개 라인으로 제1라인은 산양-anti 마우스 IgG 다중클론항체가 1.5 내지 1.7㎎/㎖의 농도로 점적되어 대조선 C-line을 이루며 제2라인은 토끼-anti PSA단일클론항체가 0.7 내지 1.0㎎/㎖의 농도로 점적되고 건조 후 사용되어 발색 유무 및 농도 진하기를 대조해 관찰할 수 있도록 제공되는 결과선 T-line을 갖는 구성으로 제공되고, 접합패드(13)은 항체를 콜로이당 금 입자 용액에 골드 ㎖ 당 항체 0.3~0.7ng을 가하여 폴리에스테르(100% Polyester) 패드에 고르게 분무된 후 건조하여 제공되며, 흡수패드(14)는 면역 반응 후 시료 내 미반응 물질들을 흡수하고 분석물질을 포함한 시료용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 역할을 하도록 면 섬유로(100% Cotton Linter)가 사용되어 제공되는 구성으로 진단 스트립(10)이 사용되고,
    상기 진단 키트(40)는 하부케이스(20)와 상부케이스(30)가 플라스틱 하우징을 이루어 제공되되, 하부케이스(20)는 상부스트립홀더(21) 및 하부스트립홀더(22)와 측면으로 다수개의 지지구(23)와 상단걸림턱(24) 및 하단걸림턱(25)을 갖는 구조로 제공되어 상단걸림턱(24)에 상기 진단 스트립(10)의 흡수패드(14)가 위치되고, 하단걸림턱(25)에 진단 스트립(10)의 샘플패드(12)가 위치하는 구조로 상부스트립홀더(21)와 하부스트립홀더(22)에 안정적으로 재치/내삽되는 구성을 이루며, 상부케이스(30)는 일단으로 손잡이부(31)를 갖고 중앙부에는 소변샘플 주입구(32) 및 진단스트립(10)의 대조선 C-line과 결과선 T- line이 표시되는 결과표시부(33)를 가지며 리더기에 내삽되는 진입방향표시부(34)를 갖는 구성의 진단키트가 리더기(50)에 내삽되어 전립선-특이항원(prostate specific antigen, PSA)의 항원 및 항체 반응에 따른 발색을 통해 전립선암을 진단할 수 있는 구성을 이루고,
    진단키트(40)의 샘플패드(12)에 시료로 80 내지 120㎕의 소변을 가하고 5 내지 10분 후 대조선C(control line)와 결과선T(test line)의 발색 유무를 판단할 때 양성시료일 때는 대조선만 발색되어 적자색으로 표시되고, 음성시료일 때는 대조선과 결과선이 함께 적자색으로 발색되어 판정되는 하도록 적용되는 것을 특징으로 하는 진단키트의 결과 판정방법.
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