KR101685091B1

KR101685091B1 - 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트

Info

Publication number: KR101685091B1
Application number: KR1020160060183A
Authority: KR
Inventors: 신동진
Original assignee: (주)큐브바이오
Priority date: 2016-05-17
Filing date: 2016-05-17
Publication date: 2016-12-12

Abstract

본 발명은 소변에 존재하는 암 바이오마커 티로신(Tyrosine)의 농도를 검출하기 위한 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하는 효소 조성물을 이용하여 암 및 대사질환의 존재 여부를 진단하는 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트에 관한 것으로, 소변이 투입되는 투입구를 구비한 케이스와;상기 케이스의 내부에서 상기 투입구와 연통되게 형성된 효소수용부와;상기 효소수용부 내에 수용되며, 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하여, 소변 내에 존재하는 티로신(L-Tyrosine)을 멜라닌으로 전환시키는 티로신 검출용 효소 조성물;상기 효소수용부 내에 소변이 투입되었을 때 효소수용부 내의 티로신 검출용 효소 조성물의 티로신과의 반응에 의한 색상 변화를 육안으로 관찰할 수 있도록 상기 케이스에 투명하게 형성된 윈도우; 및 윈도우의 표면에 구성되어 외부 광에 의한 색상 왜곡을 방지하기 위한 광학 필름;을 포함하는 것이다.

Description

고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트{High Resolution Window Diagnostic Kit for Detecting Cancer Existence}

본 발명은 암의 존재 여부를 진단하는 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 소변에 존재하는 암 바이오마커 티로신(Tyrosine)의 농도를 검출하기 위한 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하는 효소 조성물을 이용하여 암 및 대사질환의 존재 여부를 진단하는 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트에 관한 것이다.

암 마커는 악성 종양 세포 자체 내에서 생기거나 또는 암에 대한 정상조직의 반응으로 만들어져 혈액, 소변 또는 조직 내에서 비정상적으로 높은 농도를 나타내는 물질이며, 혈액, 소변 또는 조직 내의 암 마커 농도를 통해 암의 진행과 퇴화를 진단, 스크리닝, 추적할 수 있다.

일반적으로 암 마커의 농도 측정 또는 검출은 혈액을 통해 이루어지고 있으나, 혈액은 일반인이 스스로 채취하기 어렵다는 문제점이 있었다.

이에 채취하기 어려운 혈액, 조직 등의 생체물질이 아닌 입수가 용이한 소변을 이용하여 소변 내에 존재하는 암 바이오마커 농도를 검출함으로써 암을 진단하는 방법에 대한 개발이 이루어져 왔다.

한편, 일반인과 비교해볼 때 암 환자의 경우 소변 내에 존재하는 티로신(Tyrosine)의 농도가 높아 상기 티로신을 암 바이오마커로서 사용할 수 있음이 알려졌다.

한국 등록특허 제10-0033547호는 암환자의 소변중에 공통적으로 존재하는 방향족 아민(Tyrosine)을 검출하여 암을 진단하는 혼합 시약에 관한 것으로서, 상기 혼합 시약은 수은과 니켈, 질산 및 증류수로 구성된 것으로 기재되어 있다.

그러나, 상기 혼합 시약은 수은을 포함하고 있어 환경 및 인체에 막대한 영향을 미치기 때문에 현재 사용 금지되어 있다.

따라서, 채취하기 어려운 생체물질이 아닌 입수가 용이한 소변을 이용함으로써, 소변 내에 존재하는 암 바이오마커 티로신(Tyrosine)의 농도를 친환경적으로 검출하여 암을 진단하기 위한 조성물에 대한 개발이 절실한 실정이다.

또한 한국 등록특허 제10-1323371호에는 면역크로마토그래피(Immunochromatography)법을 이용하여 소변에서 전체 전립선-특이 항원의 양을 키트 상에서 반 정량적으로 측정할 수 있는 전립선암 진단 키트가 개시되어 있다. 이 등록특허의 전립선암 진단 키트는 전립선 표피에서 높은 수준으로 발현되는 세린 단백질 분해 효소인 전립선-특이항원(Prostate specific antigen;PSA)의 항원, 항체 반응에 따른 발색을 통해 육안으로 전립선 암을 진단할 수 있도록 한 것이다.

그러나 상기 등록특허의 전립선암 진단 키트는 전립선 암만 제한적으로 진단할 수 있으며, 전립선 암 이외의 다른 암이 존재하는지는 진단할 수 없는 문제가 있다.

특히, 종래 기술의 진단 키트는 항원, 항체 반응에 따른 발색을 통해 육안으로 진단을 하는 편리성은 있지만, 개인적인 주관에 의해 발색 정도의 판단이 이루어지는 것이다.

따라서, 외부 영향에 의해 표시되는 색상이 왜곡되는 경우에는 정확한 판단이 어려운 문제가 있다.

즉, 진단 키트의 윈도우를 통한 판단시에 외부의 빛에 의한 산란, 굴절, 난반사 등의 문제에 의해 발색 정도의 판단이 정밀성을 갖기 어렵다.

따라서, 진단 키트의 발색 정도의 판단시에 외부 빛에 의한 영향을 최대한 억제하고 시인성을 개선한 새로운 기술의 개발이 요구되고 있다.

한국 등록특허 제10-0033547호 한국 등록특허 제10-1323371호

본 발명은 이와 같은 종래 기술의 진단 키트의 문제를 해결하기 위한 것으로, 멜라닌 세포에서 L-티로신(L-Tyrosine)을 유멜라닌(Eumelanin)으로 전환하는데 있어 특성화된 효소들을 포함함으로써, 소변 내에 존재하는 티로신의 농도를 친환경적으로 검출하여 암 및 대사질환의 존재 여부를 진단할 수 있는 암 바이오마커 검출용 효소 조성물을 이용한 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 용이하게 채취 가능한 소변을 이용함으로써, 사용자들이 병원과 같은 전문기관을 방문하여 암 진단을 받아야 하는 불편함 없이 간편하게 가정에서 암 및 대사질환의 존재 여부를 진단할 수 있는 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 외부 광의 반사에 의하여 콘트라스트 비를 감소시키고 외부의 그림자를 윈도우 표면상에 투영시키는 것을 방지하기 위한 광학 필름층을 구비한 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 진단 키트의 발색 정도의 판단시에 외부 빛에 의한 영향을 최대한 억제하고 시인성을 개선하여 개인의 주관적 판단에 의한 오류를 최소화하고 정확한 판단이 가능하도록 한 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트는 소변이 투입되는 투입구를 구비한 케이스와;상기 케이스의 내부에서 상기 투입구와 연통되게 형성된 효소수용부와; 상기 효소수용부 내에 수용되며, 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하여, 소변 내에 존재하는 티로신(L-Tyrosine)을 멜라닌으로 전환시키는 티로신 검출용 효소 조성물;상기 효소수용부 내에 소변이 투입되었을 때 효소수용부 내의 티로신 검출용 효소 조성물의 티로신과의 반응에 의한 색상 변화를 육안으로 관찰할 수 있도록 상기 케이스에 투명하게 형성된 윈도우; 및 윈도우의 표면에 구성되어 외부 광에 의한 색상 왜곡을 방지하기 위한 광학 필름;을 포함하는 것을 특징으로 한다.

여기서, 상기 티로신 검출용 효소 조성물은, 티로시나아제 40 unit을 1중량비로 하고, 상기 티로시나아제 1 중량비 대비 도파크롬 상호변이효소(DCT)를 0.5 내지 2 중량비 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 0.5 내지 2 중량비로 포함하며, L-티로신(L-Tyrosine)을 유멜라닌(Eumelanin)으로 전환시켜 티로신의 농도가 증가함에 따라 소변 색상이 갈색에서 검정색으로 변색되는 것을 특징으로 한다.

그리고 상기 티로신 검출용 효소 조성물은, 최종 농도가 50 내지 100 mM인 인산완충용액(Phosphate buffer) 또는 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액, 최종 농도가 0.1~0.5%인 Tween20, 및 증류수를 더 포함하고, 최종 반응 pH 7.0 내지 8.5 인 액체로 되어 효소저장부 내에 밀봉되게 수용되는 것을 특징으로 한다.

그리고 광학 필름은, 윈도우 표면 반사를 억제하기 위한 반사 방지 필름(anti-reflection film) 또는 외부 물체의 그림자가 윈도우 표면에 투영되는 것을 방지하기 위한 눈부심 방지 필름(anti-glare film) 또는 윈도우 내부의 효소수용부의 구조에 의한 외부 광의 반사를 방지하기 위한 선형 편광 필름(Linear polarizer) 또는 원형 편광 필름(circular polarizer)의 어느 하나 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트는 다음과 같은 효과를 갖는다.

첫째, 소변 내에 존재하는 티로신의 농도를 친환경적으로 검출하여 암 및 대사질환의 존재 여부를 진단할 수 있는 암 바이오마커 검출용 효소 조성물을 이용한 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트를 제공할 수 있다.

둘째, 용이하게 채취 가능한 소변을 이용함으로써, 사용자들이 병원과 같은 전문기관을 방문하여 암 진단을 받아야 하는 불편함 없이 간편하게 가정에서 암 및 대사질환의 존재 여부를 진단할 수 있도록 한다.

셋째, 진단 키트의 발색 정도의 판단시에 외부 빛에 의한 영향을 최대한 억제하고 시인성을 개선하여 개인의 주관적 판단에 의한 오류를 최소화하고 정밀한 판단이 가능하도록 한다.

넷째, 외부 광의 반사에 의하여 콘트라스트 비를 감소시키고 외부의 그림자를 윈도우 표면상에 투영시키는 것을 방지하여 윈도우에 나타나는 색상 왜곡을 방지할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트를 나타낸 사시도
도 2는 도 1의 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트의 단면도
도 3은 도 1의 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트의 사용례를 나타낸 단면도
도 4a내지 도 4d는 본 발명에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트의 윈도우 표면에 구성되는 광학 필름의 구성도
도 5는 생성된 유멜라닌의 색상을 측정하기 위한 대조 색상표
도 6은 생성된 멜라닌의 색상을 비교한 사진
도 7은 본 발명의 다른 실시예에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트를 나타낸 사시도
도 8은 도 7의 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트의 단면도

이하, 본 발명에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트의 바람직한 실시 예에 관하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트의 특징 및 이점들은 이하에서의 각 실시 예에 대한 상세한 설명을 통해 명백해질 것이다.

도 1 내지 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트를 나타낸 것으로, 본 발명의 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트는 소변이 투입되는 투입구를 구비한 케이스(10)와, 상기 케이스(10)의 내부에서 상기 투입구(11)와 연통되게 형성된 효소수용부(20)와, 상기 효소수용부(20) 내에 수용되어 소변 내에 존재하는 티로신(L-Tyrosine)을 멜라닌으로 전환시키는 티로신 검출용 효소 조성물(30)을 포함한다.

상기 케이스(10)의 상부면에는 소변을 투입하기 위한 투입구(11)가 상하 방향으로 관통되게 형성되어 있다. 상기 투입구(11)는 소변이 투입구(11) 내측으로 원활히 유도되고 외부로 흘러 나가지 않도록 외주부가 하향 경사진 형태로 형성됨이 바람직하다. 그리고, 상기 티로신 검출용 효소 조성물(30)이 외부로 유출되는 것을 방지하기 위하여 투입구(11)의 외부에서 내부로의 유체 유동만 허용하는 체크밸브(50)가 투입구(11)의 하단부 또는 효소수용부(20)의 상단부에 설치되고, 상기 투입구(11)에는 투입구(11)를 개폐하는 마개(40)가 설치될 수 있다.

이 실시예에서 상기 체크밸브(50)는 일단이 효소수용부(20)의 상단 입구 부분에 일체로 형성되어, 투입구(11)를 통해 소변이 투입되면 소변의 하중에 의해 하측으로 휘어지면서 투입구(11)를 개방하고, 소변이 투입되지 않을 때는 자체의 탄성력에 의해 투입구(11)의 하단부를 폐쇄하며, 테두리 부분이 투입구(11)의 하단부에 의해 지지되어 효소수용부(20)로부터 투입구(11) 쪽으로 티로신 검출용 효소 조성물(30)이 빠져나가지 못하게 한다.

상기 마개(40)는 투입구(11)에 꼭 맞게 삽입되어 투입구(11)를 개폐한다. 물론 이 실시예와 다르게 마개(40)를 사용하지 않고 테이프나 공지의 밀봉 기구를 사용하여 투입구(11)를 개폐할 수도 있을 것이다.

상기 효소수용부(20)는 상단의 입구 부분이 투입구(11)의 하단부에 연통되는 통 형상으로 이루어지며, 내부에 액체로 된 티로신 검출용 효소 조성물(30)를 수용하는 용기로서 기능한다. 상기 효소수용부(20)는 티로신 검출용 효소 조성물(30)이 소변 내의 티로신과 반응하여 변색되는 것을 외부에서 사용자가 육안으로 관찰할 수 있도록 투명한 소재로 만들어진다.

또한 상기 케이스(10)에도 상기 효소수용부(20) 내의 티로신 검출용 효소 조성물(30)의 색상을 육안으로 용이하게 확인할 수 있도록 투명한 윈도우(12)가 형성된다. 상기 윈도우(12) 부근에는 윈도우(12)를 통해 관찰되는 색상을 통해 사용자가 암 발생 여부를 용이하게 판별할 수 있도록 대조색상표(13)가 표시될 수 있다.

상기 티로신 검출용 효소 조성물(30)은 소변 내의 티로신 농도가 증가함에 따라 소변 색상이 갈색에서 검정색으로 변색되므로, 상기 대조색상표(13)의 색상도 갈색과 검정색 사이의 색상들이 표시된다.

이와 같은 구조의 본 발명에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트는 외부 광의 반사에 의하여 콘트라스트 비를 감소시키고 외부의 그림자를 윈도우 표면상에 투영시키는 것을 방지하기 위한 광학 필름이 윈도우 표면에 구성된다.

본 발명에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트에 적용되는 광학 필름의 구조 및 특성을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

도 4a내지 도 4d는 본 발명에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트의 윈도우 표면에 구성되는 광학 필름의 구성도이다.

본 발명에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트에 적용되는 광학 필름은 반사 방지 필름(anti-reflection film), 눈부심 방지 필름(anti-glare film) 또는 편광 필름(polarizer)일 수 있으며, 이들을 적층한 다층구조일 수 있다.

이하에서 설명하는 광학 필름의 구조는 본 발명에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트에 적용되는 광학 필름의 일 예를 나타낸 것으로 이로 한정되지 않는다.

또한, 광학 필름의 제조에 사용되는 물질 및 광학 필름을 윈도우 표면에 점착제의 종류는 본 발명에 적용될 수 있는 일 예를 나타낸 것으로 이로 제한되지 않는다.

도 4a는 윈도우 표면 반사를 최소화하기 위한 반사 방지 필름(anti-reflection film)의 일 예를 나타낸 것이다.

반사 방지 필름(12a)은,

폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethyleneterephtalate; PET)와 같은 기재 필름(12b) 상에 굴절률(Reflective index)이 다른 물질로 된 다층 박막(12c)을 증착법이나 코팅법에 의해서 필름의 표면에 형성함으로써 반사 방지 효과를 갖도록 한 것이 사용될 수 있다.

예를 들면, 실리콘 산화물(SiO₂)과 티타늄 산화물(TiO₂)을 교대로 적층할 수 있다.

도 4b는 외부 물체의 그림자가 윈도우 표면에 투영되는 것을 방지하기 위한 눈부심 방지 필름(anti-glare film)의 일 예를 나타낸 것이다.

눈부심 방지 필름(13a)은,

폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethyleneterephtalate; PET)와 같은 기재 필름(13b)의 표면 상에 불규칙한 면(13c)을 포함하고 있어, 외부 빛을 난반사시킨다.

이와 같은 불규칙한 면(13c)은 실리콘 입자를 뿌려서 형성할 수 있다.

도 4c는 윈도우(12) 내부의 효소수용부(20)의 구조에 의한 외부 광의 반사를 방지하기 위한 선형 편광 필름(Linear polarizer)의 일 예를 나타낸 것이다.

선형 편광 필름(14a)은 입사광을 편광시키는 폴리비닐알코올(polyvinylalcohol; PVA))과 같은 고분자 편광 매질(14c)을 중심으로, 트리아세틸셀룰로오스(tri-acetyl-cellulose; TAC)와 같은 지지체(14b)(14d)가 고분자 편광 매질(14c)의 양쪽에 위치할 수 있다.

도 4d는 윈도우(12) 내부의 효소수용부(20)의 구조에 의한 외부 광의 반사를 방지하기 위한 선형 편광 필름(Linear polarizer)의 기능을 높이기 위한 원형 편광 필름(circular polarizer)의 일 예를 나타낸 것이다.

원형 편광 필름(15a)은 위상차를 보상하기 위한 보상 필름(retardation film)(15b)상에, 입사광을 편광시키는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol; PVA))과 같은 고분자 편광 매질(15d)을 중심으로 트리아세틸셀룰로오스(tri-acetyl-cellulose; TAC)와 같은 지지체(15c)(15e)가 고분자 편광 매질(15d)의 양쪽에 위치할 수 있다.

이와 같은 본 발명에 적용되는 광학 필름은 윈도우(12) 표면에 점착되고, 진단 키트를 육안에 의한 판정이 아니고, 별도의 분석 장치를 사용하는 경우에는 필요에 의해 탈착될 수도 있다.

이와 같은 광학 필름의 점착과 탈착을 위하여 점착제의 박리력 제어가 중요하다.

본 발명은 이와 같은 박리력의 제어를 위하여 사용되는 점착제를 아크릴계 수지, 폴리에스테르계 수지, 실리콘계 수지 조성물로 이루어지는 물질을 사용할 수 있다.

이와 같은 수지 조성물은, 올리고머(oligomer), 모노머(monomer), 광개시제(photoinitiator), 접착력 증가제(adhesion promotor), 레벨링제(leveling agent) 및 기타 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트는 외부 광의 반사에 의하여 콘트라스트 비를 감소시키고 외부의 그림자를 윈도우 표면상에 투영시키는 것을 방지하기 위한 광학 필름이 윈도우 표면에 구성되어, 도 5에서와 같은 생성된 유멜라닌의 색상을 측정하기 위한 대조 색상표에서와 같은 음성,양성 판정시에 외부 영향을 효과적으로 억제하여 정밀성을 높일 수 있다.

이와 같은 구조를 갖는 본 발명에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트를 이용한 진단 메커니즘을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 소변 내에 존재하는 암 바이오마커 티로신(Tyrosine)의 농도를 검출하기 위한 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하는 암 바이오마커 티로신 검출용 효소 조성물(30)을 진단 물질로 사용한다.

좀 더 구체적으로, 상기 티로신 검출용 효소 조성물(30)은 티로시나아제(Tyrosinase)에 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1) 효소를 추가한 효소 조성물로 이루어져, 소변 내에 존재하는 암 바이오마커 티로신(L-Tyrosine)을 멜라닌으로 전환시키고, 상기 멜라닌의 색상을 통해 농도를 측정함으로써 암을 진단할 수 있다.

특히 본 발명에서 상기 티로신 검출용 효소 조성물(30)을 이용하여 L-티로신(L-Tyrosine)을 멜라닌으로 전환하는데 있어서, 상기 멜라닌은 유멜라닌(Eumelanin)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 티로신 검출용 효소 조성물(30)은 소변을 이용하여 암을 진단하기 위한 것이므로, 소변의 색상을 고려해 볼 때 황갈색을 나타내는 페오멜라닌(Pheomelanin) 또는 갈색을 나타내는 혼합 멜라닌(Mixed melanins)을 통해 농도를 측정하는 경우, 소변의 색상과 비슷하여 농도 측정이 어려울 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 티로신 검출용 효소 조성물(30)은 검정색을 띠는 유멜라닌을 통해 농도를 측정하는 것이 바람직하다.

상기 티로신 검출용 효소 조성물(30)은 티로시나아제에 DCT 및 Tyrp1 효소를 추가함으로써, 유멜라닌 생합성 경로를 가속시킬 뿐만 아니라, 생성되는 유멜라닌의 색상을 보다 더 검정색을 띠는 경로로 유도할 수 있다.

소변 내에 존재하는 티로신의 농도는 상기 티로신 검출용 효소 조성물(30)과 반응하여 생성되는 유멜라닌의 색상을 통해 측정될 수 있기 때문에 생성된 유멜라닌에 의한 소변의 색상이 검정색에 가까울 경우, 일정한 소변 양에 티로신의 농도가 높다라는 것을 알 수 있다.

상기 티로신 검출용 효소 조성물(30)에 의한 티로신 검출 반응은 최종 농도가 50 내지 100 mM인 인산완충용액(Phosphate buffer) 또는 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액, 및 최종 농도가 0.1% 내지 0.5%인 Tween20, 최종 반응 pH 7.0 내지 8.5 조건 하에서 측정되는 것이 바람직하다.

예를 들어, 상기 티로신 검출용 효소 조성물(30)에 포함되는 인산완충용액은 200mM이고, 효소 조성물 500 ㎕와 소변 샘플 500 ㎕의 총 부피가 1000 ㎕인 경우, 티로신 검출 반응은 최종 농도 50mM에서 수행될 수 있다.

본 발명의 일 실시형태로서 상기 티로신 검출용 효소 조성물(30)은 티로시나아제, DCT 및 Tyrp1을 포함하고, 인산완충용액(Phosphate buffer) 또는 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액과 Tween 20 및 증류수를 추가하여 제조될 수 있다.

바람직하기로, 상기 티로신 검출용 효소 조성물(30)은 티로시나아제 40 unit을 1중량비로 하고, 상기 티로시나아제 1 중량비 대비 DCT를 0.5 내지 2 중량비 및 Tyrp1을 0.5 내지 2 중량비로 포함한다.

상기 함량을 만족하지 않는 경우, 생성되는 멜라닌의 색상이 황갈색계통 색상이 나타날 수 있어 소변색과 혼합되므로 티로신의 농도를 측정하기 어려울 수 있다.

전술한 것과 같이 상기 티로신 검출용 효소 조성물(30)은 티로시나아제에 DCT 및 Tyrp1 효소에 의해 유멜라닌 생합성 경로를 가속시키고, 생성되는 유멜라닌의 색상을 보다 더 검정색을 띠는 경로로 유도하게 된다.

하기 반응식 1을 참조하면, L-티로신은 티로시나아제에 의해 산화되어 L-도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)를 형성하고, 다시 티로시나아제에 의해 산화되어 DOPA 퀴논(Quinone)을 형성하며, 루코도파크롬(Leucodopachrome)을 거쳐 도파크롬(Dopachrome)을 형성한다.

상기 도파크롬은 멜라닌 전구체로서, DCT에 의해 토토머화(Tautomerization)되어 5,6-디히드록시인돌-2-카르복실산(5,6-Dihydroxyindole-2-carboxylic acid, DHICA)을 형성한다.

상기 5,6-디히드록시인돌-2-카르복실산은 Tyrp 1에 의해 산화되어 인돌-5,6-퀴논 카르복실산을 형성하고 상기 인돌-5,6-퀴논 카르복실산은 중합되어 유멜라닌을 형성한다.

[반응식 1]

상기 티로시나아제(Tyrosinase)는 미생물 및 식물 및 유기체 조직에서 발견될 수 있는 티로시나아제 수산화효소 및 도파 산화효소 촉매적 활성을 갖는 구리-함유 효소이다. 특히, 상기 티로시나아제는 티로신과 같은 페놀의 산화에 의하여 멜라닌 및 다른 색소의 생성을 촉진한다.

상기 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT)는 티로시나아제-관련 단백질 2(Tyrp 2)로도 알려져 있으며, 티로시나아제 및 Tyrp1과 결합하여 멜라닌 세포에서 L-티로신을 멜라닌으로 전환하는데 있어 특성화된 멜라닌세포특이적 효소이다.

상기 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)은 티로시나아제를 안정화시키는데 도움을 주는 역할을 한다.

본 발명에 따른 티로신 검출용 효소 조성물(30)은 상기 도파크롬이 티로시나아제에 의해 5,6-디히드록시인돌(5,6-dihydroxyindole)을 거쳐 인돌-5,6-퀴논(Indole-5,6-quinone)을 형성하여 갈색에 가까운 멜라닌을 형성하는 과정이 아닌(하기 반응식 2 참조), DCT에 의해 토토머화되고 Tyrp 1에 의해 산화되어 검은색에 가까운 멜라닌을 형성하도록 하여 시료인 소변의 색상과 구분되게 함으로써 농도 측정을 효과적으로 수행할 수 있도록 한다.

[반응식 2]

본 발명의 일 실시형태에서, 생성된 유멜라닌의 색상을 통해 소변 내에 존재하는 티로신의 농도 측정시, 대조색상표(13)와 상기 생성된 유멜라닌의 색상을 비교하여 소변 내의 티로신 농도를 확인 할 수 있다. 이를 통해, 암 및 대사질환의 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다.

이하, 실시 예에 의해 본 발명의 티로신 검출용 효소 조성물(30)을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다.

제조예 1: 효소 조성물 각 구성요소의 제조

티로시나아제 효소는 Sigma사로부터 구매하여 사용하였다.

DCT와 Tyrp1은 아래 단계를 참조로 생쥐 혈액으로부터 유전자를 확보하고 대장균에서 단백질 발현 후 정제하여 실험에 사용하였다.

(i) 생쥐 혈액으로부터 RNA 추출하는 단계

RNA 추출은 상용화된 추출키트를 사용하였으며, 본 실시예에서는 RiboEx RNA extraction solution키트 (진올 바이오테크놀로지, 한국)를 사용하였다. 과정은 아래와 같다.

a. 생쥐혈액으로부터 생쥐 혈액 300 ㎕와 RiboEx RNA extraction solution (진올 바이오테크놀로지, 한국) 600 ㎕를 넣고 강하게 섞고 5 ~ 10분간 상온 방치하여 세포막을 녹였다.

b. 클로로포름 200 ㎕를 넣고 강하게 섞고 원심분리기를 이용해 13000 rpm, 4℃, 10분간 원심분리하여 상하층으로 분리하였다.

c. 상층만 회수한 후 동일한 양의 컬럼 결합buffer를 넣고 잘 섞은 후 키트에서 제공하는 컬럼에 투입하고 원심분리 (spin down) 하여 RNA 만 컬럼에 결합시켰다.

d. 컬럼에 키트에서 제공하는 세척버퍼를 투입한 후 원심분리 (spin down) 하여 RNA 이외 물질을 제거하였다. 추가 1분 정도 원심분리하여 잔존하는 세척버퍼를 제거하였다.

e. 컬럼에 결합된 RNA를 회수하는 elution buffer를 투입한 후 5분 후 원심분리 (spin down)하여 최종적으로 RNA를 회수하였다.

(ii) 확보한 RNA로부터 cDNA를 제조하는 단계

1 ㎍ RNA, Reverse transcriptase(역전사효소) 5 unit, oligo dT - 50 pmol, 0.1 M DTT- 2 ㎕, 10x 반응버퍼(reaction buffer)- 2 ㎕, 물- 약 20 ㎕; 위 조성으로 혼합물을 제조하고 PCR 기기에서 45℃에서 10분, 38℃에서 3시간 이상 반응시켰다.

(iii) cDNA로부터 유전자 (DCT, Tyrp1) 확보 단계

a. 위의 단계에서 생성된 cDNA로부터 유전자를 증폭해 내기 위해 아래와 같은 조성으로 혼합물을 제조한 후 아래 조건 하에서 유전자증폭반응(PCR)을 수행하였다.

혼합물 조성: cDNA액 - 2 ㎕, pfu DNA증폭효소- 5 unit, 10mM dNTP- 2 ㎕, 10x 반응버퍼 4 ㎕, 각 2 pmol- 프라이머 쌍, 물- 약 40 ㎕.

증폭반응조건: 95℃ 4분- 1회; 95℃ 20초, 60℃ 20초, 72℃ 1분 50초- 35회; 72℃ 10분- 1회; 4℃ 계속.

상기 반응에 사용된 프라이머쌍의 정보는 하기 표 1과 같다.

구분		염기서열
DCT 증폭용 프라이머	순방향 프라이머	Atgggccttgtgggatggg (서열번호 1)
DCT 증폭용 프라이머	역방향 프라이머	Ctaggcttcctccgtgtatctcttgc (서열번호 2)
Tyrp1 증폭용 프라이머	순방향 프라이머	Atgaaatcttacaacgtcctccccct (서열번호 3)
Tyrp1 증폭용 프라이머	역방향 프라이머	Tcagaccatggagtggttaggattcg (서열번호 4)

DCT와 Tyrp1 효소는 상기 방법으로 확보된 유전자를 pET28a 벡터에 삽입하여 6x His 가 N-말단에 부착된 융합단백질 형태로 제작하였고, BL21(DE3) 대장균에 형질전환시켜 단백질을 제조하였다. 그 과정은 아래와 같다.

(i) 형질전환 대장균 배양단계

a. pET28a 벡터의 NdeI, XhoI 제한효소 site에 DCT 또는 Tyrp1 유전자를 삽입함으로써 6x His ~단백질을 생산하는 재조합DNA를 완성하였다.

b. BL21(DE3)대장균에 heat shock 형질전환법을 이용해 형질전환 대장균을 제조하였다.

c. 해당 대장균주를 3 L Luria broth액에서 37℃, 200 rpm 하에서 OD600 ~ 0.7까지 배양 후 0.1M IPTG 를 처리하여 단백질생산을 induction하였다.

d. 30℃, 4시간 추가배양 후 원심분리를 통해 대장균을 침전시켰다.

(ii) 대장균 파쇄 단계

a. 침전된 대장균을 1x PBS 200 ml을 투입하여 resuspend 시켰다가 원심분리기에서 침전시킴으로써 세척과정을 수행하였다.

b. 침전된 대장균을 40 ml- 0.5 M NaCl, 5mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9; 에 투입하였다.

c. 초음파 세포파쇄기에서 대장균을 Energy 38% max, total cell breaking time 4분(2초 sonic treatment/4초 pause) 조건 하에서 파쇄하였다. 대장균 샘플을 담은 병은 세포파쇄과정동안 얼음에 담긴 상태를 유지하였다.

d. 파쇄된 대장균은 13000 rpm, 30분, 4℃ 조건에서 원심분리하였다.

e. 상등액만 깨끗한 conical tube에 모아두었다.

(iii) Ni-NTA Agarose resin을 이용한 his tag-융합단백질 정제

a. 위의 단계에서 얻어진 수용성 단백질액을 Ni-NTA Agarose resin 과 혼합하고 30분간 4℃ 조건하에서 흔들어 주면서 his tag-융합단백질과 Ni-NTA Agarose resin이 서로 결합하도록 유도하였다.

b. 단백질액, resin 혼합액을 컬럼에 투입하고 컬럼 코크를 열어 액체를 뽑아 내었다.

c. Washing buffer (0.5 M NaCl, 60mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9) 400 ml을 통과시켜 불순물과 융합단백질 이외의 단백질을 제거하였다.

d. Elution buffer (0.25 M NaCl, 500mM imidazole, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9) 3 ml을 투입하고 10분간 방치한 후 코크를 열어 단백질을 회수하였다.

e. d 과정을 2회 반복하였다.

(iii) FPLC-size exclusion법을 이용한 단백질 정제

a. 회수된 단백질을 superdex S200 (GE healthcare) 컬럼이 장착된 FPLC에 투입하고 단백질을 크기에 따라 분리하였다.

b. 얻어진 fraction샘플들 가운데 his tag 융합단백질에 해당하는 fraction을 polyacrylamide gel electrophoresis 법으로 확인하고 최종적으로 원하는 his tag 융합단백질을 확보하였다.

c. Abs 280값을 측정하고 얻어진 값으로부터 단백질 농도를 환산하여 하기 표 2에 기재하였다.

구분	단백질 농도(OD₂₈₀ nm)
1 mg DCT/ml	1.65
1 mg Tyrp1/ml	1.42

실시예1

아래의 표 3을 참조로, 활성이 1000 unit/㎖인 티로시나아제 효소 40㎕에 상기 제조예 1에서 제조된 활성이 1000unit/㎖인 DCT 40㎕ 및 활성이 1000 unit/㎖ 인 Tyrp1 40㎕, 200mM Tris buffer pH 8을 250㎕, 10% Tween20 25 ㎕, 증류수(Distilled water) 105 ㎕를 넣어 효소 조성물(Stock solution)을 제조하였다.

Stock solution	Volumn(500㎕)
200 mM Tris buffer pH8	250 ㎕
10% Tween 20	25 ㎕
Tyrosinase(>=1000 unit/㎖)	40 ㎕
DCT(>=1000 unit/㎖)	40 ㎕
TYRP1(>=1000 unit/㎖)	40 ㎕
D.W	105 ㎕

다음으로 정상인과 암환자의 소변 시료를 채취하였다. 소변 시료의 채취 방식은 아침 기상 후 첫 소변을 채취함에 있어 요도로부터 흘러나오는 처음 소변은 채취하지 않으며, 중간 소변에서 샘플을 30 ml 채취하는 방식으로 이루어졌다.

일정량 내에 존재하는 티로신의 농도를 측정하기 위해 채취된 정상인과 암환자의 소변 각각 500 ㎕의 동일한 양을 상기 실시예 1의 티로신 검출용 효소 조성물과 반응시켰다(각각 총 1000 ㎕).

그런 다음, 생성된 각 유멜라닌에 의한 소변의 색상을 도 5의 대조 색상표와 비교하고 하기 표 4에 기재하였다.

	유멜라닌에 의한 소변의 색상
정상인의 소변	황색~황갈색
암환자의 소변	검정색

상기 표 4에서 보듯이, 정상인의 소변이 본 발명의 효소 조성물과 반응하여 생성된 유멜라닌에 의한 소변 색상은 황색에서 황갈색인 반면, 암환자의 소변이 효소 조성물과 반응하여 생성된 유멜라닌에 의한 소변의 색상은 검정색으로 나타났음을 확인하였다.

이를 통해, 암환자의 소변 내에 티로신이 다량으로 존재함을 알 수 있었다.

실시예 2

티로시나아제만을 포함하는 기존의 효소 조성물에 비해, 티로시나아제에 DCT 및 Tyrp1을 추가로 포함한 본 발명의 효소 조성물(30)을 사용한 경우, 생성된 유멜라닌에 의한 소변의 색상이 더욱 검정색으로 나타날 수 있음을 알아보기 위해, 아래와 같이 실험을 수행하였다.

상기 실시예 1에서와 같은 방식으로 채취된 정상인의 소변 500 ㎕을 티로시나아제 40 unit, DCT 20 unit 및 Tyrp1 20 unit을 포함하는 본 발명의 효소 조성물과 혼합한 혼합물 (A), 암환자의 소변 500 ㎕을 티로시나아제 40 unit만을 포함하는 기존의 효소 조성물과 혼합한 혼합물 (B), 및 암환자의 소변 500 ㎕을 티로시나아제 40 unit, DCT 20 unit 및 Tyrp1 20 unit을 포함하는 본 발명의 효소 조성물과 혼합한 혼합물 (C)를 37℃에서 30분 동안 각각 반응시켰다.

도 6을 참조하면, 본 발명에 따른 효소 조성물과 정상인의 소변을 반응시킨 혼합물 (A)는 황색을 나타내는데 비해, 암환자의 소변을 반응시킨 혼합물 (B) 및 (C)는 더욱 짙은 황갈색 또는 검은색을 나타내는 것을 확인하였다.

특히, 암환자의 소변 검출 결과, DCT 및 Tyrp 1를 더 포함한 혼합물 (C)의 색상이 티로시나아제만을 포함한 혼합물 (B)에 비해 더욱 검은색을 나타내는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 효소 조성물이 티로시나아제에 DCT 및 Tyrp1 효소를 추가함으로써, 유멜라닌 생합성 경로를 가속시킬 뿐만 아니라, 생성되는 유멜라닌의 색상을 보다 더 검정색을 띠는 경로로 유도할 수 있음을 확인하였다.

도 7 및 도 8은 본 발명에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트의 다른 실시예를 나타낸 것으로, 이 실시예의 암 진단 키트는 케이스(10)의 높이가 가로 및 세로 보다 작은 직육면체 형태로 이루어지며, 케이스(10)의 상부면에 티로신 검출용 효소 조성물(30)의 색상을 확인할 수 있도록 투명한 윈도우(12)가 설치된 구성으로 이루어진다.

그리고 티로신 검출용 효소 조성물(30)이 수용된 효소수용부(20)와 투입구(11) 사이에 소변이 효소수용부(20) 내측으로 원활하게 유도될 수 있도록 안내유로(22)가 투입구(11)에서 효소수용부(20) 쪽으로 하향 경사지게 형성되어 있다.

상기 티로신 검출용 효소 조성물(30)은 전술한 실시예의 티로신 검출용 효소 조성물(30)과 동일한 조성으로 이루어지므로 그 상세한 설명은 생략한다.

이와 같이 구성된 본 발명의 암 진단 키트는 케이스(10)에 형성된 투입구(11)를 통해 소변을 투입하면, 효소수용부(20) 내의 티로신 검출용 효소 조성물(30)이 소변 내에 존재하는 암 바이오마커 티로신과 반응하여 티로신 농도에 따라 소변 색상이 갈색에서 검정색으로 변색되므로 육안으로 암 및 대사질환의 발생을 바로 확인할 수 있다.

마찬가지로, 본 발명의 다른 실시 예에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트는 외부 광의 반사에 의하여 콘트라스트 비를 감소시키고 외부의 그림자를 윈도우 표면상에 투영시키는 것을 방지하기 위한 광학 필름이 윈도우 표면에 구성된다.

따라서, 본 발명의 다른 실시 예에 따른 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트를 이용한 판정 과정에서, 도 5에서와 같은 생성된 유멜라닌의 색상을 측정하기 위한 대조 색상표에서와 같은 음성,양성 판정시에 외부 영향을 효과적으로 억제하여 정밀성을 높일 수 있다.

이상에서의 설명에서와 같이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 본 발명이 구현되어 있음을 이해할 수 있을 것이다.

그러므로 명시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 하고, 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구 범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

10 : 케이스 11 : 투입구
12 : 윈도우 20 : 효소수용부
22 : 안내유로 30 : 티로신 검출용 효소 조성물
40 : 마개 50 : 체크밸브

Claims

소변이 투입되는 투입구를 구비한 케이스와;
상기 케이스의 내부에서 상기 투입구와 연통되게 형성된 효소수용부와;
상기 효소수용부 내에 수용되며, 티로시나아제(Tyrosinase), 도파크롬 상호변이효소(Dopachrome tautomerase, DCT) 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 포함하여, 소변 내에 존재하는 티로신(L-Tyrosine)을 멜라닌으로 전환시키는 티로신 검출용 효소 조성물;
상기 효소수용부 내에 소변이 투입되었을 때 효소수용부 내의 티로신 검출용 효소 조성물의 티로신과의 반응에 의한 색상 변화를 육안으로 관찰할 수 있도록 상기 케이스에 투명하게 형성된 윈도우; 및 윈도우의 표면에 구성되어 외부 광에 의한 색상 왜곡을 방지하기 위한 광학 필름;을 포함하는 것을 특징으로 하는 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 티로신 검출용 효소 조성물은,
티로시나아제 40 unit을 1중량비로 하고, 상기 티로시나아제 1 중량비 대비 도파크롬 상호변이효소(DCT)를 0.5 내지 2 중량비 및 티로시나아제-관련 단백질 1(Tyrp1)을 0.5 내지 2 중량비로 포함하며, L-티로신(L-Tyrosine)을 유멜라닌(Eumelanin)으로 전환시켜 티로신의 농도가 증가함에 따라 소변 색상이 갈색에서 검정색으로 변색되는 것을 특징으로 하는 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 티로신 검출용 효소 조성물은,
최종 농도가 50 내지 100 mM인 인산완충용액(Phosphate buffer) 또는 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충용액, 최종 농도가 0.1~0.5%인 Tween20, 및 증류수를 더 포함하고, 최종 반응 pH 7.0 내지 8.5 인 액체로 되어 효소저장부 내에 밀봉되게 수용되는 것을 특징으로 하는 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트.
제 1 항에 있어서, 광학 필름은,
윈도우 표면 반사를 억제하기 위한 반사 방지 필름(anti-reflection film) 또는 외부 물체의 그림자가 윈도우 표면에 투영되는 것을 방지하기 위한 눈부심 방지 필름(anti-glare film) 또는 윈도우 내부의 효소수용부의 구조에 의한 외부 광의 반사를 방지하기 위한 선형 편광 필름(Linear polarizer) 또는 원형 편광 필름(circular polarizer)의 어느 하나 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 고선명 윈도우를 갖는 암 진단 키트.