JP5870027B2 - フルクトシルペプチジルオキシダーゼおよび糖化タンパク質アッセイ用センサー - Google Patents

Description

本発明は、新規フルクトシルペプチジルオキシダーゼ（ＦＰＯＸ）に関する。より詳細には、本発明は、糖化アルブミン、フルクトサミン、ＨｂＡ１ｃ、フルクトシルヘキサペプチド、フルクトシルバリンおよびフルクトシルバリルヒスチジンなどの糖化タンパク質の測定用キットおよびセンサーに使用するためのフルクトシルペプチジルオキシダーゼに関する。

糖化タンパク質は、タンパク質上のアミノ基と糖の還元末端との間の共有結合を介して非酵素的に生成され、アマドリ化合物とも言われる。血中において、グルコースはヘモグロビンのβ鎖のＮ末端のバリンに結合し、糖化ヘモグロビン（グリコヘモグロビン；ＨｂＡ１ｃ）を生成する。ヘモグロビン（Ｈｂ）に対するＨｂＡ１ｃの存在比は、正常な健常個体と比較して糖尿病患者においてより高く、ＨｂＡ１ｃの血中濃度は、過去数週間の血糖値を反映することが知られている。したがって、ＨｂＡ１ｃの血中濃度は、糖尿病の診断のための臨床試験において、また糖尿病患者の血糖コントロールにおいて非常に重要である。血中のＨｂＡ１ｃ濃度は、フルクトシルバリンに特異性を有する酵素を用いて測定することが可能である。

フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、フルクトシルアミノ酸が酸化され、２−ケト−Ｄ−グルコースと対応するアミノ酸を生成する反応を触媒するＦＡＤ依存性酵素である。フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、種々の生物から単離されており、糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃおよびフルクトサミンなどの糖化タンパク質がそのような酵素を用いて分析できることが示唆されている。

ＨｂＡ１ｃを高い特異性でアッセイするためには、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、好ましくは、フルクトシルリジンと比較してフルクトシルバリンに対する選択性を有する。より好ましくは、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、ＨｂのＮ−末端の２つのアミノ酸残基に対応するフルクトシルバリルヒスチジンに対してオキシダーゼ活性を有する。Hirokawaら（Biochem Biophys Res Commun, 311(1), 2003, 104-111）は、アカエトミエラ属（Achaetomiella）およびケトミウム属（Chaetomius）の糸状菌由来のフルクトシルペプチジルオキシダーゼを開示している。

本発明の目的は、糖化タンパク質の測定に使用するための新規なフルクトシルペプチジルオキシダーゼを提供することである。

本発明は、図１（配列番号：１）に示されるアミノ酸配列を有するファエオスフェリア・ノドラム（Phaeosphaeria nodorum）由来のフルクトシルペプチジルオキシダーゼの発見に基づく。１つの側面において、本発明は、配列番号：１記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつフルクトシルバリルヒスチジンに対して１ｍＭ以下のＫｍ値を有する、試料中の糖化タンパク質をアッセイするためのフルクトシルペプチジルオキシダーゼの使用を提供する。本発明はまた、配列番号：１記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつフルクトシルバリルヒスチジンに対して１０Ｕ／ｍｇ・ｍＭ以上のＶｍａｘ／Ｋｍ値を有する、試料中の糖化タンパク質をアッセイするためのフルクトシルペプチジルオキシダーゼの使用を提供する。本発明はまた、配列番号：１記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一性を有し、５０℃で１０分間加熱処理した場合に５０％以上の残存活性を有する、試料中の糖化タンパク質をアッセイするためのフルクトシルペプチジルオキシダーゼの使用を提供する。

別の側面において、本発明は、試料中の糖化タンパク質をアッセイするための方法であって、試料を前記フルクトシルペプチジルオキシダーゼと接触させること、およびフルクトシルペプチジルオキシダーゼにより酸化された糖化タンパク質の量を測定することを含む方法を提供する。

また別の側面において、本発明は、ＨｂＡ１ｃをアッセイするための方法であって、試料中のＨｂＡ１ｃを消化して、フルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを生成すること、フルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを前記フルクトシルペプチジルオキシダーゼと接触させること、および酸化されたフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの量を測定することを含む方法を提供する。

さらに別の側面において、本発明は、試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルヘキサペプチドまたはＨｂＡ１ｃをアッセイするための装置であって、前記フルクトシルペプチジルオキシダーゼ、および電子移動メディエーターを含む装置を提供する。好ましくは、電子移動メディエーターは、Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチル−４−ニトロソアニリンである。また、好ましくは、装置は、サポニン、ビリルビンオキシダーゼおよびプロテイナーゼＮから選択される１つ以上の試薬をさらに含む。

別の側面において、本発明は、試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルヘキサペプチドまたはＨｂＡ１ｃをアッセイするためのキットであって、前記フルクトシルペプチジルオキシダーゼ、および電子移動メディエーターを含むキットを提供する。

なお別の側面において、本発明は、電極上に固定化された前記フルクトシルペプチジルオキシダーゼを有する酵素電極を提供する。好ましくは、フルクトシルペプチジルオキシダーゼは、光架橋性ポリビニルアルコール樹脂を用いて電極上に固定化される。

また別の側面において、本発明は、作用電極として本発明の酵素電極を含む、フルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルヘキサペプチドまたはＨｂＡ１ｃをアッセイするための酵素センサーを提供する。

本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼは、糖尿病状態の診断およびコントロールにおいて臨床的に有用なヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）などの糖化タンパク質の測定のために使用することができる。

ファエオスフェリア・ノドラム（Phaeosphaeria nodorum）由来のフルクトシルペプチジルオキシダーゼのアミノ酸配列を示す。 フルクトシルペプチジルオキシダーゼの精製手順を示す。 精製されたフルクトシルペプチジルオキシダーゼのＳＶ曲線を示す。 フルクトシルペプチジルオキシダーゼの熱安定性を示す。 ｍ−ＰＭＳ／ＤＣＩＰ系におけるフルクトシルペプチジルオキシダーゼを用いるフルクトシルバリンの測定を示す。 フルクトシルペプチジルオキシダーゼを用いるフルクトシルヘキサペプチドの測定を示す。 フルクトシルペプチジルオキシダーゼを用いるＨｂＡ１ｃの測定を示す。 Ｈ₂Ｏ₂系におけるフルクトシルペプチジルオキシダーゼを有する電極を用いるフルクトシルバリンの測定を示す。 プルシアンブルー系におけるフルクトシルペプチジルオキシダーゼを有する電極を用いるフルクトシルバリンの測定を示す。 ニトロソアニリン（ＮＡ）系におけるフルクトシルペプチジルオキシダーゼを有する電極を用いるフルクトシルバリンの測定を示す。 ｍ−ＰＭＳ系におけるフルクトシルペプチジルオキシダーゼを有する電極を用いるフルクトシルバリンの測定を示す。

本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼ（ＰｎＦＰＯＸ）は、ファエオスフェリア・ノドラム（Phaeosphaeria nodorum）に由来し、図１（配列番号：１）に示すアミノ酸配列を有する。配列番号：１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する改変されたアミノ酸配列を有するフルクトシルペプチジルオキシダーゼの変異体もまた、本発明において使用することができる。好ましくは、配列同一性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％である。ファエオスフェリア・ノドラム（Phaeosphaeria nodorum）のゲノム配列は公開されているが、この遺伝子には注釈は付けられていない。ファエオスフェリア・ノドラム（Phaeosphaeria nodorum）がフルクトシルペプチジルオキシダーゼを有するという、またはその遺伝子がいかなるタイプの酵素をコードし得るという示唆や暗示は存在していなかった。

ＰｎＦＰＯＸのアミノ酸配列は、ＦＰＯＸ−Ｅ（ユーペニシリウム・テレヌム（Eupenicillum terrenum） ＡＴＣＣ １８５４７；ジーンバンク：ＢＡＤ００１８５．１）と７１％の同一性、そしてＦＰＯＸ−Ｃ（コニオカエタ・エスピー（Coniochaeta sp.） ＮＩＳＬ ９３３０；ジーンバンク：ＢＡＤ００１８６．１）と７４％の同一性を示す。他の公知のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとの配列相同性は、約３０％である。

下記実施例に記載するように、ＰｎＦＰＯＸは、フルクトシルリジンに対してよりもフルクトシルバリンに対してより高い活性を示す。また、フルクトシルバリルヒスチジンに対してさらにより高い活性を示す。ＰｎＦＰＯＸのフルクトシルバリルヒスチジンに対するＫｍ値は、１ｍＭ以下、好ましくは０．５ｍＭ以下、より好ましくは０．３ｍＭ以下であり、ＦＰＯＸ−ＥおよびＦＰＯＸ−ＣのＫｍ値より約１０倍小さい。ＰｎＦＰＯＸのフルクトシルバリルヒスチジンに対するＶｍａｘ／Ｋｍ値は、１０Ｕ／ｍｇ・ｍＭ以上である。この特徴は、より高い感度および特異性でＨｂＡ１ｃをアッセイするための酵素の使用において特別有利な点である。

本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼの別の有利な特徴は、その熱安定性である。ＰｎＦＰＯＸは、１０ｍＭ ＰＰＢ（ｐＨ７．０）中で１０分間、５０℃で加熱処理された場合、約７５％の残存活性が観測された。

本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼは、当技術分野において周知の技術を用いて組換え発現により製造することができる。ＰｎＦＰＯＸの核酸配列は、ジーンバンク：ＸＰ＿００１７９８７１１．１にある。その配列は、選択された宿主生物においてより大きな発現レベルを達成するように適切に改変または設計されてもよい。ＰｎＦＰＯＸをコードするポリヌクレオチドは、ファエオスフェリア・ノドラム（Phaeosphaeria nodorum）からクローン化でき、または化学的に合成された一連のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより製造してもよく、あるいは自動ＤＮＡ合成器を用いて完全に合成してもよい。

ＰｎＦＰＯＸをコードする遺伝子は、適切な発現ベクター中に挿入され、そのベクターは、大腸菌（E. coli）などの適切な宿主細胞中に導入される。形質転換体を培養し、その形質転換体において発現されたフルクトシルペプチジルオキシダーゼを、細胞または培養培地から回収することができる。

かくして得られた組換えフルクトシルペプチジルオキシダーゼは、当技術分野において公知の任意の精製技術、たとえばイオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、塩析沈殿、溶媒沈殿、免疫沈降、ゲル電気泳動、等電点電気泳動および透析などにより精製することができる。

本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼは、試料中の糖化タンパク質のアッセイにおいて有用である。アッセイ法は、試料を本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼと接触させること、およびフルクトシルペプチジルオキシダーゼにより酸化された糖化タンパク質の量を測定することを含む。本発明によりアッセイされる糖化タンパク質としては、たとえばフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルヘキサペプチド、ＨｂＡ１ｃ、糖化アルブミンおよびフルクトサミンなどが挙げられる。ある側面において、本発明は、試料中のＨｂＡ１ｃを消化してフルクトシルバリンを生成すること、そのフルクトシルバリンを本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼと接触させること、および酸化されたフルクトシルバリンの量を測定することを含むＨｂＡ１ｃをアッセイする方法を提供する。ＨｂＡ１ｃは、プロテアーゼやプロテイナーゼＮなどのプロテイナーゼで消化することができる。好ましい実施態様においては、その方法は、試料中のＨｂＡ１ｃをプロテイナーゼＮで消化してフルクトシルバリルヒスチジンを生成すること、そのフルクトシルバリルヒスチジンを本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼと接触させること、および酸化されたフルクトシルバリルヒスチジンの量を測定することを含む。別の側面では、本発明は、ＨｂＡ１ｃをエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃにより消化してフルクトシルヘキサペプチドを生成すること、およびそのフルクトシルヘキサペプチドを本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼによりアッセイすることによりＨｂＡ１ｃをアッセイする方法を提供する。今回、驚くべきことに、ファエオスフェリア・ノドラム（Phaeosphaeria nodorum）由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが、フルクトシルヘキサペプチドを酸化することができることが見出された。一方、先行技術であるＦＰＯＸ−Ｃ（コニオカエタ・エスピー（Coniochaeta sp.） ＮＩＳＬ ９３３０；ジーンバンク：ＢＡＤ００１８６．１）にはそのような能力はない。

フルクトシルペプチジルオキシダーゼにより酸化された糖化タンパク質の量の測定は、当技術分野において公知の任意の方法により、たとえば４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ（４−アミノアンチピリン／Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン二ナトリウム塩／西洋ワサビペルオキシダーゼ）などのＨ₂Ｏ₂検出試薬を用いるか、またはＰｔ電極により生成されたＨ₂Ｏ₂の量を測定することによってなすことができる。あるいは、アッセイは、電子メディエーターの存在下で実行することができ、そのメディエーターに移動された電子の量が、たとえば、ｍＰＭＳ／ＤＣＩＰ（メチル硫酸１−メトキシ−５−メチルフェナジニウム／２，６−ジクロロインドフェノール）、ｃＰＥＳ（トリフルオロ酢酸−１−（３−カルボキシ−プロポキシ）−５−エチル−フェナンジニウム、ＮＡ ＢＭ３１＿１１４４（Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−３−メトキシ−ニトロソアニリン塩酸塩、ＮＡ ＢＭ３１＿１００８（Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチル−４−ニトロソアニリン）およびＮ−Ｎ−４−ジメチル−ニトロソアニリンなどを用いて測定される。これらの中では、ＮＡ ＢＭ３１＿１００８が特に好ましい。

別の側面において、本発明は、試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルヘキサペプチドまたはＨｂＡ１ｃをアッセイするための装置であって、本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼを含む装置を提供する。

アッセイ装置は、任意の従来の市販されている血糖値をモニターするための電流測定バイオセンサーのテストストリップと同様の構造を有することができる。そのような装置の１つの例は、絶縁基材上に配置された２つの電極（作用電極と参照または対電極）、試薬ポートおよび試料受け（receiver）を有する。試薬ポートは、本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼ、ＦＡＤ、および電子移動メディエーターを含む。血液試料などの試料を、試料受けに添加すると、試料中に含まれるフルクトシルアミンがフルクトシルペプチジルオキシダーゼと反応して電流を生じ、これが該試料中のフルクトシルアミンの量の指標となる。全血が試料として使用される場合、装置には溶血のための試薬を含むこともできる。特に、好ましい溶血試薬は、サポニンである。別の好ましい実施態様においては、装置は、全血試料中に含まれる成分の還元により生じるセンサーのバックグラウンド電流を減少させるためにビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）を含むこともできる。別の好ましい実施態様において、装置は、血液中に存在する糖化アルブミンからフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの放出を行うためにプロテイナーゼＮを含むこともできる。サポニン、ＢＯＤおよびプロテイナーゼＮは、全血試料がサポニンと接触して溶血され、その後ＢＯＤおよびプロテイナーゼＮと接触するように、装置上に独立して固定化されてもよい。酵素基質の測定のために適した電気化学センサーの典型的な例は、たとえば国際公開第２００４／１１３９００号および米国特許第５，９９７，８１７号明細書より公知である。電気化学センサーの代替物としては、光学的検出技術も使用可能なはずである。典型的には、そのような光学的装置は、酵素、電子移動メディエーターおよび指示薬を含む試薬系において起こる色の変化に基づくものである。色の変化は、蛍光、吸収または緩和（remission）測定を用いて定量することができる。酵素基質の測定に適した光学的装置の典型的な例は、たとえば米国特許第７，００８，７９９号明細書、米国特許第６，０３６，９１９号明細書および米国特許第５，３３４，５０８号明細書により公知である。

なお別の側面において、本発明は、本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼを含む、試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルヘキサペプチドまたはＨｂＡ１ｃをアッセイするためのキットを提供する。

フルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジンまたはフルクトシルヘキサペプチドの測定のためのキットは、本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼにより構築することができる。本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼに加えて、キットは、測定のために必要な緩衝液、適切なメディエーター、較正曲線の作製のためのフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジンまたはフルクトシルヘキサペプチドまたはそれらの誘導体の標準品、および使用説明書を含んでもよい。キットは、ＨｂＡ１ｃを消化してフルクトシルヘキサペプチドを生成するためのエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃを含むこともできる。本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼは、様々な形態、たとえば凍結乾燥試薬または適切なストレージソリューションの溶液として提供されてもよい。

本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼを用いて、フルクトサミン、糖化アルブミンまたはＨｂＡ１ｃアッセイキットを構築することも可能である。フルクトシルアミン、糖化アルブミンまたはＨｂＡ１ｃは、酵素的にまたは化学的に消化され、フルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンなどのフルクトシルアミン化合物を生成し、これが次に本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼを用いて定量される。したがって、フルクトサミン、糖化アルブミンまたはＨｂＡ１ｃのための本発明のアッセイキットは、さらに加水分解のための試薬またはプロテイナーゼを含むことができる。好ましいプロテイナーゼは、ＨｂＡ１ｃを消化してフルクトシルバリルヒスチジンを生成するプロテイナーゼＮである。

別の側面において、本発明は、電極上に固定された本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼを有する酵素電極を提供する。好ましい実施態様において、本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、ＢＯＤおよびプロテイナーゼＮがフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびそのメディエーターと接触しないようにポリマーを用いて電極に固定化される。さもなければ、ＢＯＤは、メディエーターの酸化還元特性を干渉し、またプロテイナーゼＮはフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを分解するであろう。好ましいポリマーは、たとえば、東洋合成工業株式会社（千葉、日本）から供給されているアジド基ペンダント水溶性感光性樹脂（azide-unit pendant water-soluble photopolymer）（ＡＷＰ）などの光架橋性ポリビニルアルコール樹脂である。酵素電極を構築するために、ＡＷＰ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびＮＡ＿ＢＭ３１＿１００８などのメディエーターを含む緩衝溶液が電極の表面に適用される。その溶液を乾燥した後、ＵＶ光を照射し、ポリマーを架橋させる。

別の側面において、本発明は、作用電極として本発明の酵素電極を含む、フルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルヘキサペプチドまたはＨｂＡ１ｃをアッセイするための酵素センサーを提供する。

試料中のフルクトシルアミンの濃度は、酵素反応により生成される電子の量を測定することにより決定することができる。本発明のフルクトシルペプチジルオキシダーゼは、炭素電極、金属電極、および白金電極などの電極に固定化される。酵素の固定化は、架橋、高分子マトリックスへの封入、透析膜での被覆、光架橋性ポリマー、電気伝導性ポリマー、酸化−還元ポリマー、または他の当業者に周知の方法、ならびにそれらの組合せによりなすことができる。

測定が電流測定系において実施される場合、固定化ＰｎＦＰＯＸを有する炭素電極、金電極またはプラチナ電極が作用電極として、対電極（白金電極など）および参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と一緒に使用される。電極は、メディエーターを含有する緩衝液中に挿入され、所定の温度に保たれる。所定の電圧を作用電極に適用し、その後試料を添加、増加した電流の値を測定する。アッセイに使用されるメディエーターの例としては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、ルテニウム誘導体、フェナジンメトスルファート（phenazine methosulfate）などが挙げられる。通常、作用電極と１つの対電極または偽−参照電極とを有するいわゆる二電極系を使用することも可能である。

フルクトシルアミン、糖化アルブミンまたはＨｂＡ１ｃの測定のためのセンサーを製造するために、フルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの測定のための前記センサーは、さらに固定化プロテイナーゼ（プロテイナーゼＮまたはプロテアーゼなど、好ましくはプロテイナーゼＮ）を含む膜と組合せられて複合センサーが構築される。複数の酵素の組合せによる連続反応に基づくそのような複合センサーの構造は、本技術分野において周知である。たとえば、Anthony P. F. Tuner, Isao Karube and George S. Wilsonによる「バイオセンサー−基礎と応用」（“Biosensor-Fundamental and Applications”）、オクスフォード大学出版、１９８７年を参照。

本明細書において引用した全ての特許文献および参考文献の内容は、参照により本明細書中に完全に組み込まれる。

本発明は、以下の実施例により詳細に説明されるが、本発明はそれらの実施例に限定されるべきものではない。

実施例１
ファエオスフェリア・ノドラム（Phaeosphaeria nodorum） フルクトシルペプチジルオキシダーゼの製造

ＰｎＦＰＯＸのヌクレオチド配列は、公的なデータベースにおけるファエオスフェリア・ノドラム（Phaeosphaeria nodorum）のゲノム情報（ジーンバンク：ＸＰ＿００１７９８７１１．１）にある。推定ＯＲＦが大腸菌（E.coli）のいくつかのマイナーコドンに含まれるので、遺伝子のコドン利用を、大腸菌（Escherichial coli）において遺伝子を発現するために最適化した。この最適化の後、顕著なマイナーコドンは配列には存在しない。合成遺伝子を、発現ベクターｐＥＴ２８ａ中にサブクローニングし、ｐＥＰＮ（ｐＥＴ２８ａ−ＰｎＰＦＯＸ）を構築した。

ＰｎＦＡＯＤ発現ベクター（ｐＥＰＮ）で形質転換した大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを追加した５０ｍｌのＬＢ培地中で３７℃で培養し、ＩＰＴＧ（ｆ．ｃ．０．４ｍＭ）をＯＤ６６０ｎｍ＝０．８で添加した。ＯＤ６６０ｎｍが約３に達するまで２５℃で培養を続けた。細胞を遠心分離（５，０００×ｇ、４℃、１０分）により回収し、洗浄（０．８５％ ＮａＣｌ水溶液、６，０００×ｇ、４℃、５分）し、３ｍｌの１０ｍＭ ＰＰＢ（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波ホモジナイザーにより均質化した。得られた懸濁液を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、２０分）し、そして上清をさらに遠心分離（６０，０００ｒｐｍ、４℃、６０分）した。上清を１０ｍＭ ＰＰＢ（ｐＨ７．０）＋２５μＭ ＦＡＤに対して透析し、水溶性画分を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、水溶性画分は、約４８〜５０ｋＤａにバンドを示した。これはＰｎＦＰＯＸの推定分子量と一致する。

水溶性画分を、３つの基質：フルクトシルバリン（ＦＶ）、フルクトシルリジン（ＦＫ）、およびフルクトシルバリルヒスチジン（ＦＶＨ）でＰＯＤ／ＴＯＤＢ／４Ａ．Ａ．法を用いてオキシダーゼ活性について調べた。フルクトシルペプチジルオキシダーゼは、フルクトシルアミノ酸（Ｆｖ、ＦＫ）に対して酸化活性を示すだけでなく、フルクトシルジペプチド（ＦＶＨ）にも酸化活性を示した。

実施例２
ファエオスフェリア・ノドラム（Phaeosphaeria nodorum） フルクトシルペプチジルオキシダーゼの精製および特徴付け

精製手法は、図２にまとめられている。ｐＥＰＮ（ｐＥＴ２８ａ−ＰｎＦＰＯＸ）で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（７Ｌ）中において３７℃で好気的に培養した。Ａ６６０ｎｍ値が１．４に達した後、細胞を０．３ｍＭ ＩＰＴＧで誘発し、Ａ６６０ｎｍ値が３．０に達するまで２５℃でインキュベーションを続けた。細胞を遠心分離により採取し、採取した細胞の４分の１（約１０．５ｇ）を１０ｍＭのＰＰＢ、ｐＨ７．０に再懸濁し、フレンチプレス（１，０００ｋｇ／ｃｍ²）に２回かけることにより溶菌した。ライセートを４℃、１０，０００ｇで２０分遠心分離し、上清を４℃、４０，０００ｒｐｍで９０分間遠心分離した。ついで上清を２５μＭ ＦＡＤを含む１０ｍＭのＰＰＢ、ｐＨ８．０に対して透析した。

硫酸アンモニウムを透析した上清に３５％飽和まで添加し、ついで形成された沈殿を１５，０００ｇで２０分間遠心分離によりペレットとした。硫酸アンモニウムが９５％飽和まで添加された上清を、１５，０００ｇで２０分間遠心分離した。得られた沈殿を、２５μＭ ＦＡＤおよび１％マンノースを含む１０ｍＭ ＰＰＢ、ｐＨ８．０に溶解し、同じ緩衝液に対して４℃で透析し、その後、２５μＭ ＦＡＤを含む１０ｍＭのＰＰＢ、ｐＨ８．０に対して透析した。透析された酵素溶液を、１０ｍＭのＰＰＢ、ｐＨ８．０で平衡化したＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ カラム（ＧＥヘルスケア社）にかけた。活性な素通り画分（active flow-through fraction）を回収し、ＦＡＯＤ活性を示さない吸着タンパク質を１Ｍ ＮａＣｌで溶出した。活性な素通り画分を回収し、１０ｍＭのＰＰＢ、ｐＨ７．０に対して透析した。

透析された酵素溶液を１０ｍＭのＰＰＢ、ｐＨ７．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ カラム（ＧＥヘルスケア社）にかけた。同じ緩衝液でゲルろ過クロマトグラフィーを行なった。活性な画分を回収し、精製した酵素溶液を１００μＭ ＦＡＤを含有する１０ｍＭのＰＰＢ、ｐＨ７．０に対して透析し、４℃に保管した。精製した酵素の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、タンパク質濃度は、ＤＣタンパク質アッセイキット（バイオ−ラッド（Bio-Rad）社、ＣＡ、米国）を用いて測定した。

表１にまとめたように、ＰｎＦＰＯＸは、硫酸アンモニウム沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびゲルろ過クロマトグラフィーにより、大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＰＮ（ｐＥＴ２８ａ−ＰｎＦＰＯＸ）の細胞抽出物から３５倍精製された。精製した調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にほぼ単一のバンドを示した。

オキシダーゼ活性は、基質、ＦＶ、ＦＫおよびＦＶＨの種々の濃度により４Ａ．Ａ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤを用いてアッセイした。５４６ｎｍでの吸光度をモニターした。結果は、図３に示す。ＦＶおよびＦＶＨでは典型的なミカエルス−メンテン曲線が得られたが、ＦＫでは得られなかった。見かけのＫｍ値はＦＶで０．６４ｍＭ、ＦＶＨで０．２０ｍＭである（表２）。ＦＶに対する高いＶｍａｘＫｍ^-1値（４２．８Ｕｍｇ^-1ｍＭ^-1）は、この酵素のＦＶへの高い特異性を示している。ＦＶＨに対するＶｍａｘＫｍ^-1値もかなり高いことにも注目すべきである（１４．７Ｕｍｇ^-1ｍＭ^-1、ＦＶに対するＶｍａｘＫｍ^-1の３４％）。ＰｎＦＰＯＸのＦＶＨに対するこの活性は、ＨｂＡ１ｃの酵素に基づく測定において有益なものとなる。比較のために、公知のフルクトシルペプチジルオキシダーゼ（ＦＰＯＸ−ＣおよびＦＰＯＸ−Ｅ）のオキシダーゼ活性についても表に含めた（同書にあるHirokawa et al.）。

ＰｎＦＰＯＸの熱安定性は、１０ｍＭ ＰＰＢ（ｐＨ７．０）中で精製した酵素溶液を１０分間種々の温度でインキュベートし、ついで残存活性を測定することにより評価した。結果を図４に示す。ＰｎＦＰＯＸの活性は、５０℃まで約７５％維持した。これは、５０℃でほぼすべての活性が失われる公知のフルクトシルペプチジルオキシダーゼ（ＦＰＯＸ−ＣおよびＦＰＯＸ−Ｅ）（同書にあるHirokawa et al.）と対照的である。

実施例３
フルクトシルペプチジルオキシダーゼを用いるフルクトシルアミンの測定

（１） ＦＶ − ｍ−ＰＭＳ／ＤＣＩＰ 系
フルクトシルバリン（ＦＶ）を、０．６ｍＭ ＰＭＳおよび０．０６ｍＭ ＤＣＩＰの存在下でｍ−ＰＭＳ／ＤＣＩＰ系においてＰｎＦＰＯＸを用いてアッセイした。６００ｎｍの吸光度をモニターした。結果を図５に示す。ＦＶの濃度は、０．０５ｍＭおよび１ｍＭの間の範囲内で測定することができる。

（２） Ｆ６Ｐ − ４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ
ＨｂＡ１ｃベータ鎖のＮ−末端アミノ酸残基を有するフルクトシルヘキサペプチド（Ｆ６Ｐ：Ｆｒｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ）を、ＰｎＦＰＯＸを用いてアッセイした。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で最終濃度３００μＭのフルクトシルヘキサペプチドの溶液に、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）由来のプロテイナーゼＮ（シグマ社）を最終濃度２０ｍｇ／ｍｌで添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。プロテイナーゼＮを、１０ｋＤａ排除スピンカラムで除去し、切断産物を４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ系においてＰｎＦＰＯＸでアッセイした。試料中のフルクトシルヘキサペプチドの量は、基質としてＦＶＨで作製した較正曲線を用いて計算した。結果は３００μＭのＦＶＨが検出されたことを示した（図６）。

（３） ＨｂＡ１ｃ − ４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ
末梢血から赤血球を単離し、ボロン酸カラムにより精製した。吸着および非吸着画分をそれぞれＨｂＡ１ｃ試料およびＨｂ試料と指定した。これらの試料を、０．２％ＨＣｌを含むアセトンにおいて脱ヘム処理に付し、脱−ヘムＨｂＡ１ｃおよび脱−ヘムＨｂ試料を調製した。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で最終濃度３００μＭの脱−ヘムＨｂＡ１ｃ試料および脱−ヘムＨｂ試料に、プロテイナーゼＮを最終濃度２０ｍｇ／ｍｌで添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。プロテイナーゼＮは、１０ｋＤａ排除スピンカラムで除去し、切断産物を４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ系においてＰｎＦＰＯＸでアッセイした。試料中のＨｂＡ１ｃの量は、プロテイナーゼＮ−処理Ｈｂの存在下で基質としてＦＴＶにより作製した較正曲線を用いて計算した。結果は３５０μＭのＦＶＨが検出されたことを示した（図７）。ＦＶＨは、Ｈｂから検出されず、ＨｂＡ１ｃが特異的に検出できることを示している。

（４） ＦＶ − 電極 − Ｈ₂Ｏ₂ 系
ＰｎＦＰＯＸ酵素溶液（１２ｕ／ｍｌ）３．３ｕｌ（０．０４Ｕ）を、１．７ｕｌの６％光架橋性樹脂ＡＷＰ（東洋合成工業株式会社）で、最終濃度２％で混合し、混合物の５μｌを、７ｍｍ²の表面積を有するＰｔ電極上に適用した。電極を３０℃で３０分間風乾し、ＵＶ光を１分間照射し、作用電極を作製した。その電極と対電極（Ｐｔ線）および参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）を、２ｍｌの５０ｍＭ ＰＰＢ（ｐＨ７．０）に浸漬し、Ａｇ／ＡｇＣｌに対し＋６００ｍＶを適用した。定常電流が観測された場合、表示された量のＦＶを含む試料溶液を反応混合物に添加し、電流の増加をモニターした。結果を図８に示す。ＦＶの濃度は、０．０５ｍＭおよび１．５ｍＭの範囲内で測定することができる。

（５） ＦＶ − 電極 プルシアンブルー 系
ガラス状炭素電極（ＢＡＳ、表面積７ｍｍ²）を１ｍＭ ＦｅＣｌ₃、１ｍＭ フェリシアン化カリウムおよび２Ｍ ＫＣｌの溶液中に浸漬し、Ａｇ／ＡｇＣｌに対し＋０．４Ｖの電圧を１分間かけ、プルシアンブルー膜を作製した。その後、電極を、Ａｇ／ＡｇＣｌに対し−５０ｍＶから＋３５０ｍＶまで５ｍＶ／秒の掃引速度で１０回ＣＶ処置に付し、プルシアンブルー膜を安定化させた。電極を水で洗浄し乾燥させた。ＰｎＦＰＯＸ酵素溶液（１２ｕ／ｍｌ）３．３ｕｌ（０．０４Ｕ）を６％の光架橋性樹脂ＡＷＰ（東洋合成工業株式会社）１．７ｕｌと最終濃度２％に混合し、電極上に適用し、電極を３０℃で３０分風乾し、その後、ＵＶ光を１分間照射し、作用電極としてプルシアンブルー酵素固定化電極を作製した。その電極と対電極（Ｐｔ線）および参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）を、２ｍｌの５０ｍＭ ＰＰＢ（ｐＨ７．０）に浸漬し、Ａｇ／ＡｇＣｌに対し−１５０ｍＶを適用した。ＦＶを反応混合物に添加し、電流の増加をモニターした。結果を図９に示す。ＦＶの濃度は、０．０５ｍＭおよび１ｍＭの範囲内で測定することができる。

（４） ＦＶ − 電極 − ＮＡ 系
ＰｎＦＰＯＸ酵素溶液（１２ｕ／ｍｌ）３．３ｕｌ（０．０４Ｕ）を６％の光架橋性樹脂ＡＷＰ（東洋合成工業株式会社）１．７ｕｌと最終濃度２％に混合し、混合物の５μｌを、表面積７ｍｍ²の金電極上に適用した。電極を３０℃で３０分風乾し、ＵＶ光を１分間照射し、作用電極を作製した。その電極と対電極（Ｐｔ線）および参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）を、５ｍＭ Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）−３−メトキシ−４−ニトロソアニリン（ＮＡ）を含む５０ｍＭ ＰＰＢ（ｐＨ７．０）２ｍｌに浸漬し、Ａｇ／ＡｇＣｌに対し＋２００ｍＶを適用した。ＦＶを反応混合物に添加し、電流の増加をモニターした。酸素の影響を回避するために、Ａｒガスで反応チャンバー中を連続的に不活化した。結果を図１０に示す。ＦＶの濃度は、０．０５ｍＭおよび１．５ｍＭの範囲内で測定することができる。

（５） ＦＶ − 電極 − ｍ−ＰＭＳ 系
ＰｎＦＰＯＸ固定化金電極を前記（４）に記載したように作製した。その電極と対電極（Ｐｔ線）および参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）を、２ｍＭ ｍ−ＰＭＳを含む５０ｍＭ ＰＰＢ（ｐＨ７．０）２ｍｌに浸漬し、Ａｇ／ＡｇＣｌに対し＋１００ｍＶを適用した。ＦＶを反応混合物に添加し、電流の増加をモニターした。結果を図１１に示す。ＦＶの濃度は、０．０５ｍＭおよび１．５ｍＭの範囲内で測定することができる。

実施例４
フルクトシルペプチジルオキシダーゼのフルクトシルヘキサペプチドに対するオキシダーゼ活性

フルクトシルペプチジルオキシダーゼＰｎＦＰＯＸおよびＦＰＯＸ−Ｃのフルクトシルヘキサペプチド（Ｆ６Ｐ：Ｆｒｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ）に対するオキシダーゼ活性は、プロテイナーゼＮの添加なしにアッセイされた。酵素活性は、実施例２に記載されているような４ＡＡ／ＴＯＤＢ／ＰＯＤ系において、ＦＶおよびＦＶＨの基質濃度１ｍＭおよびＦ６Ｐ ５ｍＭで測定された。結果を表３に示す。

フルクトシルペプチジルオキシダーゼＰｎＦＰＯＸは、フルクトシルヘキサペプチドを酸化することができた。

Claims (15)

1. 配列番号：１記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつフルクトシルバリルヒスチジンに対して１ｍＭ以下のＫｍ値を有するフルクトシルペプチジルオキシダーゼの、電子移動メディエーターの存在下で試料中の糖化タンパク質をアッセイするための使用であって、電子移動メディエーターが、ＮＡ ＢＭ３１＿１１４４（Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−３−メトキシ−ニトロソアニリン塩酸塩）、ＮＡ ＢＭ３１＿１００８（Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチル−４−ニトロソアニリン）またはＮ−Ｎ−４−ジメチル−ニトロソアニリンである使用。
2. 配列番号：１記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつフルクトシルバリルヒスチジンに対して１０Ｕ／ｍｇ・ｍＭ以上のＶｍａｘ／Ｋｍ値を有するフルクトシルペプチジルオキシダーゼの、電子移動メディエーターの存在下で試料中の糖化タンパク質をアッセイするための使用であって、電子移動メディエーターが、ＮＡ ＢＭ３１＿１１４４（Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−３−メトキシ−ニトロソアニリン塩酸塩）、ＮＡ ＢＭ３１＿１００８（Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチル−４−ニトロソアニリン）またはＮ−Ｎ−４−ジメチル−ニトロソアニリンである使用。
3. 配列番号：１記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ５０℃で１０分間熱処理した場合に５０％以上の残存活性を有するフルクトシルペプチジルオキシダーゼの、電子移動メディエーターの存在下で試料中の糖化タンパク質をアッセイするための使用であって、電子移動メディエーターが、ＮＡ ＢＭ３１＿１１４４（Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−３−メトキシ−ニトロソアニリン塩酸塩）、ＮＡ ＢＭ３１＿１００８（Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチル−４−ニトロソアニリン）またはＮ−Ｎ−４−ジメチル−ニトロソアニリンである使用。
4. 試料中の糖化タンパク質をアッセイするための方法であって、試料を請求項１〜３のいずれか１項に定義されるフルクトシルペプチジルオキシダーゼと接触させること、および電子移動メディエーターの存在下で該フルクトシルペプチジルオキシダーゼにより酸化された糖化タンパク質の量を測定することを含む方法であって、電子移動メディエーターが、ＮＡ ＢＭ３１＿１１４４（Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−３−メトキシ−ニトロソアニリン塩酸塩）、ＮＡ ＢＭ３１＿１００８（Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチル−４−ニトロソアニリン）またはＮ−Ｎ−４−ジメチル−ニトロソアニリンである方法。
5. ＨｂＡ１ｃをアッセイするための方法であって、試料中のＨｂＡ１ｃを消化してフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを生成すること、フルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンを請求項１〜３のいずれか１項に定義されるフルクトシルペプチジルオキシダーゼと接触させること、および電子移動メディエーターの存在下で酸化されたフルクトシルバリンまたはフルクトシルバリルヒスチジンの量を測定することを含む方法であって、電子移動メディエーターが、ＮＡ ＢＭ３１＿１１４４（Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−３−メトキシ−ニトロソアニリン塩酸塩）、ＮＡ ＢＭ３１＿１００８（Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチル−４−ニトロソアニリン）またはＮ−Ｎ−４−ジメチル−ニトロソアニリンである方法。
6. 試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルヘキサペプチドまたはＨｂＡ１ｃをアッセイするための装置であって、請求項１〜３のいずれか１項に定義されるフルクトシルペプチジルオキシダーゼ、および電子移動メディエーターを含み、電子移動メディエーターが、ＮＡ ＢＭ３１＿１１４４（Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−３−メトキシ−ニトロソアニリン塩酸塩）、ＮＡ ＢＭ３１＿１００８（Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチル−４−ニトロソアニリン）またはＮ−Ｎ−４−ジメチル−ニトロソアニリンである装置。
7. 前記電子移動メディエーターが、Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチル−４−ニトロソアニリンである請求項６記載の装置。
8. さらに、サポニン、ビリルビンオキシダーゼおよびプロテイナーゼＮから選択される１つ以上の試薬を含む請求項６または７記載の装置。
9. 試料中のフルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルヘキサペプチドまたはＨｂＡ１ｃをアッセイするためのキットであって、請求項１〜３のいずれか１項に定義されるフルクトシルペプチジルオキシダーゼ、および電子移動メディエーターを含み、電子移動メディエーターが、ＮＡ ＢＭ３１＿１１４４（Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−３−メトキシ−ニトロソアニリン塩酸塩）、ＮＡ ＢＭ３１＿１００８（Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチル−４−ニトロソアニリン）またはＮ−Ｎ−４−ジメチル−ニトロソアニリンであるキット。
10. 前記電子移動メディエーターが、Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチル−４−ニトロソアニリンである請求項９記載のキット。
11. さらに、サポニン、ビリルビンオキシダーゼおよびプロテイナーゼＮから選択される１つ以上の試薬を含む請求項９または１０記載のキット。
12. 電極上に固定化されている請求項１〜３のいずれか１項に定義されるフルクトシルペプチジルオキシダーゼおよび電子移動メディエーターを有する酵素電極であって、電子移動メディエーターが、ＮＡ ＢＭ３１＿１１４４（Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−３−メトキシ−ニトロソアニリン塩酸塩）、ＮＡ ＢＭ３１＿１００８（Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチル−４−ニトロソアニリン）またはＮ−Ｎ−４−ジメチル−ニトロソアニリンである酵素電極。
13. 前記フルクトシルペプチジルオキシダーゼが、アジド基ペンダント水溶性感光性樹脂（ＡＷＰ）を用いて電極上に固定化される請求項１２記載の酵素電極。
14. 前記電子移動メディエーターが、Ｎ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチル−４−ニトロソアニリンである請求項１２または１３記載の酵素電極。
15. 作用電極として請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の酵素電極を含む、フルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルヘキサペプチドまたはＨｂＡ１ｃをアッセイするための酵素センサー。

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