JP4227820B2 - 新規な酵素 - Google Patents
新規な酵素 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4227820B2 JP4227820B2 JP2003067266A JP2003067266A JP4227820B2 JP 4227820 B2 JP4227820 B2 JP 4227820B2 JP 2003067266 A JP2003067266 A JP 2003067266A JP 2003067266 A JP2003067266 A JP 2003067266A JP 4227820 B2 JP4227820 B2 JP 4227820B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- fvh
- fvl
- valyl
- deoxyfructosyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い酵素、該酵素を用いた測定方法、試薬に関する。更に詳しくは臨床の現場で簡便、正確及び安価にヘモグロビンＡ１ｃを測定する為の酵素、該酵素を用いた測定方法及び試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖化蛋白はグルコースなどの還元糖が共存する場合、タンパク質のアミノ基とアルデヒド基が非酵素的かつ非可逆的に結合し、アマドリ転移することにより生成される。生体内では血液中のヘモグロビンが糖化されたグリコヘモグロビン、アルブミンが糖化されたグリコアルブミン、血液中のタンパク質が糖化されたフルクトサミンなどが知られている。これらの血中濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は糖尿病の病状の診断及び症状の管理の重要な指標となり得るために測定手段の確立は臨床上、極めて有用である。
【０００３】
その中でも、現在、糖尿病診断の指標となる最も一般的かつ臨床データのそろっているものは、血中ヘモグロビンＡ1ｃ濃度であり、特にその簡便、正確な測定手段の確立が求められている。また、醤油や味噌などの食品中のアマドリ化合物を定量することにより、その食品の製造後の保存状況や期間を知ることができ、品質管理に役立つと考えられる。
【０００４】
従来、アマドリ化合物の測定法としては、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法(非特許文献１)、ホウ酸を結合させた固体を詰めたカラムを用いる方法（非特許文献２）、抗原−抗体反応を利用する方法（非特許文献３）還元能をテトラゾリウム塩を用いて比色定量する方法（非特許文献４）、チオバリビツール酸を用いて比色定量する方法（非特許文献５）等が知られている。
【０００５】
しかしながらこれらの方法は、いずれも操作が煩雑であったり、高価な機器が必要であったり、必ずしも正確で迅速な方法ではなかった。現在、上記方法よりも操作が簡単で、安価に、短時間で精度良く糖蛋白質を測定する方法として、酵素的方法が提案されている。アマドリ化合物を定量する方法として、特許文献１）〜７）、糖尿病の診断のための糖化蛋白質の測定法として、特許文献８）〜１１）等が知られている。
【０００６】
上記方法で使用されている糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドに作用する酵素としては、これまでにコリネバクテリウム属（特許文献１２）、アスペルギルス属（特許文献１３）、ニシリウム属（特許文献１４）、フザリウム属（特許文献１５〜１７）、ギベレラ属（特許文献１８、１９）、カンジダ属（特許文献２０）、アスペルギルス属（特許文献２１、２２）由来のフルクトシルアミンオキシダーゼが報告されている。
【０００７】
ヘモグロビンはα鎖およびβ鎖の2本のポリペプチドからなる分子量６４，５００の４量体である。ヘモグロビンのα鎖のN末端アミノ酸配列はバリン−ロイシン−セリン−・・・、β鎖のN末端アミノ酸配列はバリン−ヒスチジン−ロイシン−・・・である。ヘモグロビンＡ１ｃはβ鎖のＮ末端バリンが糖化されたものと定義されており、ヘモグロビン中のどのアミノ酸が糖化されているかはわからない糖化ヘモグロビンとは区別されている。現在臨床現場では、その正確性からヘモグロビンＡ１ｃが多用されており、グリコヘモグロビンを測定することはほとんどなくなってきた。
【０００８】
糖化ヘモグロビンの酵素を用いた測定法として、ロイシンのＣ末端側を切断するプロテアーゼとジペプチジルカルボキシペプチダーゼを作用させてβ鎖のＮ末端糖化バリンのみを遊離させる方法が考案された（特許文献２３）が、この方法ではプロテアーゼにより多量のペプチドが遊離するため、目的とするフルクトシルバリルヒスチジルロイシンを完全に分解するためには高価なジペプチジルカルボキシペプチダーゼが多量に必要となる等の問題がある。
【０００９】
また、N末端の糖化バリルヒスチジンに作用するＦＡＯＤを用いた測定法（特許文献２４）が報告されたが、これには糖化ヘモグロビンのα鎖から遊離するペプチドに対する反応性については全く述べられていなかった。つまり、ヘモグロビンのβ鎖N末端バリンの糖化部位を特異的に認識して測定しているのではなくα鎖およびβ鎖の両方のN末端糖化バリンを測定するものであり、本来のヘモグロビンA１ｃ、すなわちβ鎖のＮ末端糖化バリンを測定しているものではなかった。
これまでにＨｂＡ１ｃを酵素を持いて簡便、安価、迅速に測定する方法はなかった。
【００１０】
【非特許文献１】
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ. Ｓｃｉ．, １０：６５９（１９７９）
【非特許文献２】
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２６：１５９８（１９８２）
【非特許文献３】
ＪＪＣＬＡ １８：６２０（１９９３）
【非特許文献４】
Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ 127：87（１９８２）
【非特許文献５】
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １１２：１９７（１９８１）
【特許文献１】
特公平０５−３３９９７号公報
【特許文献２】
特公平６−６５３００号公報
【特許文献３】
特開平０２−１９５９００号公報
【特許文献４】
特開平０３−１５５７８０号公報
【特許文献５】
特開平０４−４８７４号公報
【特許文献６】
特開平０５−１９２１９３号公報
【特許文献７】
特開平０６−４６８４６号公報
【特許文献８】
特開平０２−１９５８９９号公報
【特許文献９】
特開平０２−１９５９０号公報
【特許文献１０】
特開平０５−１９２１９３号公報
【特許文献１１】
特開平０６−４６８４６号公報
【特許文献１２】
特開昭６１−２６８１７８号公報
【特許文献１３】
特開平３−１５５７８０号公報
【特許文献１４】
特開平４−４８７４号公報
【特許文献１５】
特開平５−１９２１９３号公報
【特許文献１６】
特開平７−２８９２５３号公報
【特許文献１７】
特開平８−１５４６７２号公報
【特許文献１８】
特開平５−１９２１９３号公報
【特許文献１９】
特開平７−２８９２５３号公報
【特許文献２０】
特開平６−４６８４６号公報
【特許文献２１】
特開平１０−３３１７７号公報
【特許文献２２】
特開平１０−３３１８０号公報
【特許文献２３】
特開２０００−３００２９４号公報
【特許文献２４】
特開２００１−９５５９８号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い酵素、該酵素を用いた測定方法、試薬を提供することにあり、さらに詳しくはヘモグロビンＡ１ｃを酵素を用いて簡便、正確、安価に測定する酵素、測定方法及び試薬を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端にのみ作用する酵素を探索した。探索に当たってヘモグロビンα鎖の配列はＮ端よりＶＬＳであり、β鎖の配列はＮ端よりＶＨＬであることから、Ｎ端はα鎖もβ鎖も同じであり、Ｎ末端の糖化アミノ酸を遊離してヘモグロビンβ鎖Ｎ末端にのみ作用する酵素を探索することは不可能である。そこで本発明者らはヘモグロビンα鎖及びβ鎖Ｎ末端糖化物のモデル基質である１デオキシフルクトシルバリルロイシン（以下ＦＶＬと略す）及び１デオキシフルクトシルバリルヒスチジン（以下ＦＶＨと略す）をハシバらの方法（Hashiba H,J.Agric.Food Chem.24:70,1976）を用いて合成、精製した。
【００１３】
本発明者らは自然界に存在する酵素（各地の土壌等から単離した菌）や購入した保存菌を培養し、ＦＶＨに作用し、ＦＶＬに実質的に作用しないＦＡＯＤを生産する菌株をスクリーニングし、鋭意検討を重ねた結果、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ）ＮＢＲＣ７５９０、コニオケチジウム・サボリ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ ｓａｖｏｒｙｉ）ＡＴＣＣ３６５４７、アルスリニウム・エスピー（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．）ＴＯ６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１１）、アルスリニウム・ファエオスペルマム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｐｈａｅｏｓｐｅｒｍｕｍ）ＮＢＲＣ３１９５０、アルスリニウム・ファエオスペルマム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｐｈａｅｏｓｐｅｒｍｕｍ）ＮＢＲＣ６６２０、アルスリニウム・ジャポニカム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＮＢＲＣ３１０９８、ピレノケータ・エスピー（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．）ＹＨ８０７（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１０）、ピレノケータ・ゲンチアニコラ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｇｅｎｔｉａｎｉｃｏｌａ）ＭＡＦＦ４２５５３１、ピレノケータ・テレストリス（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）ＮＢＲＣ ３０９２９、レプトスフェリア・ノドラム（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）（分生子世代名フォーマ・ヘンネべルギー（Ｐｈｏｍａ ｈｅｎｎｅｂｅｒｇｉｉ））ＮＢＲＣ７４８０、レプトスフェリア・ドリオラム（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｄｏｌｉｏｌｕｍ）ＪＣＭ２７４２、レプトスフェリア・マクランス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｍａｃｕｌａｎｓ）（分生子世代名フォーマ・リンガム（Ｐｈｏｍａ ｌｉｎｇｕｍ））ＭＡＦＦ７
２６５２８、プレオスポラ・ハーブラム（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ ｈｅｒｂａｒｕｍ）ＮＢＲＣ３２０１２、プレオスポラ・ベタエ（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ ｂｅｔａｅ）（分生子世代名フォーマ・ベタエ（Ｐｈｏｍａ ｂｅｔａｅ））ＮＢＲＣ５９１８、オフィオボラス・ヘルポトリカス（Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｕｓ）ＮＢＲＣ６１５８、カーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ）ＹＨ９２３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２０９）などの微生物が糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い酵素を生産することを発見した。これらの生産性を下記表１に示し、それらの精製酵素の性質を下記表２および表３示した。
【００１４】
【表１】
【００１５】
【表２】
【００１６】
【表３】
【００１７】
さらに本酵素を用いてヘモグロビンＡ１ｃを正確、簡便、安価に測定できることを見出し本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は
１）糖化ヘモグロビン瘢スN端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異的に作用する酵素。
２）糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに作用し、糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドに実質的に作用しない酵素。
３）糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドが1-デオキシフルクトシル-L-バリル-L-ヒスチジンであり、ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドが、1-デオキシフルクトシル-L-バリル-L-ロイシンであることを特徴とする１）及び２）に記載の酵素。
４）酵素がフルクトシルアミンオキシダーゼである１）〜３）記載の酵素
５）酵素がネオコスモスポラ属、コニオケチジウム属、アルスリニウム属、ピレノケータ属、レプトスフェリア属、プレオスポラ属、オフィオボラス属、カーブラリア属、フォーマ属由来であることを特徴とする１）〜４）記載の酵素。
６）ネオコスモスポラ属、コニオケチジウム属、アルスリニウム属、ピレノケータ属、レプトスフェリア属、プレオスポラ属、オフィオボラス属、カーブラリア属、フォーマ属の培養物から糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異的に作用する酵素を製造する方法。
７）糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い酵素を用いることを特徴とする、アマドリ化合物の測定方法。
８）糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに作用し、糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドに実質的に作用しない酵素を用いることを特徴とするアマドリ化合物の測定方法。
９）アマドリ化合物がヘモグロビンＡ１ｃであることを特徴とする８）記載の方法。
１０）糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い酵素を含有する試薬。
１１）プロテアーゼ、糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い酵素を含有する試薬。に関する。
【００１８】
さらに詳しくは、ヘモグロビンA１ｃの本来の定義であるβ鎖のN末端バリンの糖化部位を特異的に認識し、測定するために必要な特異性を備えた酵素、該酵素を用いた測定方法及び試薬に関する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明について、以下具体的に説明する。
＜アマドリ化合物＞
本発明に於けるアマドリ化合物とは、タンパク質等のアミノ基をもつ化合物とグルコース等のアルデヒド基を持つ化合物がメイラード反応により、生じる下記の一般式（１）−（ＣＯ）−ＣＨＲ−ＮＨ−（Ｒは、水素原子か水酸基を示す）で表されるケトアミン構造を有する化合物のことを指す。アマドリ化合物には糖化ヘモグロビンや糖化アルブミンのような糖化タンパク質やペプチドが糖化された糖化ペプチド等が含まれる。
＜糖化ヘモグロビン＞
ヘモグロビンがメイラード反応により糖化されたアマドリ化合物のことを指し、α鎖及びβ鎖Ｎ末端のバリンや分子内のリジンが糖化されていると言われている。
＜ヘモグロビンＡ１ｃ＞
糖化ヘモグロビンのうちヘモグロビンβ鎖Ｎ末端のバリンが糖化された分子を指し、さらにアマドリ転移する前のシッフベースである不安定型ヘモグロビンとも区別される。
【００２０】
本発明に用いることが出来る酵素は、糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い、若しくは、ＦＶＬよりもＦＶＨに特異性の高い酵素であればいかなる酵素を用いても良いが、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに作用し、糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドに実質的に作用しないＦＡＯＤ、若しくは、ＦＶＨに作用し、ＦＶＬに実質的に作用しない酵素が好ましい。
【００２１】
特異性の高い酵素とは、通常、測定したい基質に対する活性を１００％とした時、測定対象でない基質に対する相対活性が例えば８０％以下であることをいい、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下である酵素をいう。また、実質的に作用しない酵素とは、通常、測定したい基質に対する活性を１００％とした時、測定対象でない基質に対する相対活性が例えば２０％以下であることをいい、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下である酵素をいう。
【００２２】
酵素の種類としてはでヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、キナーゼ等どのような酵素であっても糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い酵素であれば用いることが出来るが、オキシダーゼが最も良く研究されており、使いやすさの点でオキシダーゼが好ましい。
【００２３】
以下に本発明に使用できる酵素の具体例を示すが、これによりなんら限定されるものではない。また、本発明の酵素を生産する能力を有するその変異株であっても使用できることは言うまでもない。表1にまとめたように、本発明に使用することが出来るオキシダーゼとしてはネオコスモスポラ属、コニオケチジウム属、アルスリニウム属、ピレノケータ属、レプトスフェリア属、プレオスポラ属、オフィオボラス属、カーブラリア属、フォーマ属に属する菌株が挙げられる。また、表1中のレプトスフェリア・ノドラム、レプトスフェリア・マクランス、プレオスポラ・ベタエはいずれも分生子世代がフォーマ属であり、本発明の酵素はフォーマ属にも広く分布していることがわかる。
【００２４】
また、より好ましくはネオコスモスポラ・バシンフェクタ ＮＢＲＣ７５９０菌株、コニオケチジウム・サボリＡＴＣＣ３６５４７菌株、アルスリニウム・エスピーＴＯ６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１１）、アルスリニウム・ファエオスペルマムＮＢＲＣ３１９５０、アルスリニウム・ファエオスペルマムＮＢＲＣ６６２０、アルスリニウム・ジャポニカムＮＢＲＣ３１０９８、ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１０）、ピレノケータ・ゲンチアニコラＭＡＦＦ４２５５３１、ピレノケータ・テレストリスＮＢＲＣ３０９２９、レプトスフェリア・ノドラム（分生子世代名フォーマ・ヘンネレルギー）ＮＢＲＣ７４８０、レプトスフェリア・ドリオラムＪＣＭ２７４２、レプトスフェリア・マクランス（分生子世代名フォーマ・リンガム）ＭＡＦＦ７２６５２８、プレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２、プレオスポラ・ベタエ（分生子世代名フォーマ・ベタエ）ＮＢＲＣ５９１８、オフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２０９）などが挙げられる。
【００２５】
これらの菌株のうち、アルスリニウム・エスピーＴＯ６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１１）、ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１０）、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２０９）は本発明者等が新規に単離した菌株であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
【００２６】
寄託したこれらの菌学的性質を示すと次の通りであり、以下のように同定した。
１．アルスリニウム・エスピー（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．）ＴＯ６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１１）について、宇田川俊一ら訳の「カビの分離・培養と同定」（医歯薬出版株式会社 １９８３）、宇田川俊一ら著の「菌類図鑑」（講談社サイエンティフィク １９８６）、Ｍ． Ｂ． Ｅｌｌｉｓ著「Ｄｍａｔａｃｅｏｕｓ Ｈｙｒｈｏｍｙｃｅｔｅｓ」（ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｂｕｒｅａｕｘ １９８８）を参考とし、その菌学的特性を検討した結果、
（1） 分生子は１細胞である。
（2） 分生子は外生する。
（3） 分生子は暗褐色である。
（4） 分生子は丸く、レンズ型で無色の帯がみられる。
（5） 分生子は分生子柄と１つの連結部で接する。
（6） 菌糸は有隔壁である。
（7） 分生子の大きさは６〜９μｍ×２〜４μｍである。
（8） 分生子柄は厚さ１．２〜２．５μｍである。
【００２７】
以上の形態的な特徴から、本菌株はアルスリニウム・サッカリコラ（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ Ｓａｃｃｈａｒｉｃｏｌａ）（分生子の大きさは９〜１０μｍ、分生子柄の厚さは２〜４μｍ）、アルスリニウム・ファエオスペルマム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｐｈａｅｏｓｐｅｒｍｕｍ）（分生子の大きさは９〜１０μｍ、分生子柄の厚さは１〜１．５μｍ）、アルスリニウム・サッカリ（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｉ）（分生子の大きさは６〜８μｍ、分生子柄の厚さは１〜１．５μｍ）のいずれかに分類されると思われるが、これらの菌株とは分生子の大きさや分生子柄の厚みが若干異なることから、本菌株をアルスリニウム・エスピー（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．）と同定した。
【００２８】
培地における生育状況
（1）オートミール寒天培地、２５℃、６日間培養後、直径約８．５ｃｍもしくはそれ以上に達し、コロニー裏面は無色で、白色で羊毛状のコロニーの上に暗褐色の胞子（塊）がみられる。
（2）ポテトデキストロース寒天培地上、２５℃、６日間培養後、直径約８．５ｃｍもしくはそれ以上に達し、コロニー裏面は無色で、白色で羊毛状のコロニーになる。
２．ピレノケータ・エスピー（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．）ＹＨ８０７（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１０）について、宇田川俊一ら訳の「カビの分離・培養と同定」（医歯薬出版株式会社 １９８３）、宇田川俊一ら著の「菌類図鑑」（講談社サイエンティフィク １９８６）、Ｂｒａｉａｎ Ｃ． Ｓｕｔｔｏｎ著「Ｔｈｅ Ｃｏｅｌｏｍｙｃｅｔｅｓ」（ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｂｕｒｅａｕｘ １９８０）を参考とし、その菌学的特性を検討した結果、
（1）分生子は楕円形で平滑な１細胞で、５〜７×１．５〜３．０μｍ。
（2）コロニーは暗緑褐色であり、色素は生成しない。
（3）胞子は連鎖せず、子実体（分生子殻）内部に形成される。
（4）菌糸は有隔壁である。
（5）分生子殻は暗褐色の球形〜亜球形もしくは倒洋ナシ形で１つの孔口をもつ。分生子殻は直径２００〜３００μｍで開口部周辺に剛毛を形成する。
【００２９】
以上の形態的な特徴から、本菌株はピレノケータ・ルビ-イダエイ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｒｕｂｉ-ｉｄａｅｉ）（分生子＞３．５μｍ×２．０〜２．５μｍ）に分類されると思われるが、これとは分生子のサイズが若干異なることから、本菌株をピレノケータ・エスピー（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．）と同定した。
【００３０】
培地における生育状況
（1）オートミール寒天培地上、２５℃、６日間培養後、直径約２．３ｃｍもしくはそれ以上に達し、コロニー裏面は暗緑褐色で暗緑褐色のコロニーになる。培地中に色素は生産しない。気生菌糸は疎である。
（2）ポテトデキストロース寒天培地上、２５℃、６日間培養後、直径約２．０ｃｍもしくはそれ以上に達し、コロニー裏面は暗緑褐色で暗緑褐色のコロニーになる。オートミール寒天培地上よりも気生菌糸が認められる。
（3）ＹＭ寒天培地上、２５℃、６日間培養すると褐色〜黒色の子実体（分生子殻）が生じる。
３．カーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ）ＹＨ９２３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２０９）について、宇田川俊一ら訳の「カビの分離・培養と同定」（医歯薬出版株式会社 １９８３）、宇田川俊一ら著の「菌類図鑑」（講談社サイエンティフィク １９８６）、Ｍ． Ｂ． Ｅｌｌｉｓ著「Ｄｍａｔａｃｅｏｕｓ Ｈｙｒｈｏｍｙｃｅｔｅｓ」（ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｂｕｒｅａｕｘ １９８８）を参考とし、その菌学的特性を検討した結果、
（1）菌糸は有隔壁である。
（2）分生子はポロ型分生子で紡錘こん棒形、３つの隔壁を有し、ほとんど全てが下方より３番目の細胞がふくれている。基部にへそ（ｈｉｌｕｍ）があるが、顕著に突出していない。
（3）２番目の隔壁は正中にない。
（4）分生子の両端細胞はほとんど淡褐色、中間部細胞は褐色〜濃褐色、下方より３番目の細胞は最も濃色である。平坦でくびれなし、２６〜３４×１０〜１２μｍ。
（5）分生子柄は菌糸上に頂生または側生し、上方でしばしば湾曲し、ジグザグ状を呈する。
（6）分生子柄は無色〜淡褐色、平滑またはこぶ状、直径２．５〜４．０μｍ。
【００３１】
以上の形態的な特徴から、本菌株はカーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ）と同定した。
培地における生育状況
（1）オートミール寒天培地、２５℃、７日間培養後、直径約５．５ｃｍもしくはそれ以上に達し、コロニー裏面及びコロニーは暗緑褐色で、ビロード状の気生菌糸が認められる。
（2）ポテトデキストロース寒天培地上、２５℃、７日間培養後、直径約４．０ｃｍもしくはそれ以上に達し、コロニー裏面は黒色で、灰白色で羊毛状の気生菌糸を形成する。
【００３２】
次に本発明に使用しうるＦＡＯＤ生産菌の培養方法について述べる。本発明ＦＡＯＤ生産菌の培養手段としては固体培養でも液体培養でもよいが、好ましくはフラスコまたはジャーファーメンター等による通気培養である。培地としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としてはグルコース、グリセロール、ソルビトール、ラクトースまたはマンノースなど、窒素源としては酵母エキス、肉エキス、トリプトン、ペプトンなど、無機塩としては塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなどを用いればよい。ｐＨはｐＨ５．０〜８．０、培養温度２５〜３７℃で目的とする酵素が最高力価となる培養時間、例えば2〜１０日間にて目的とする酵素を採取すればよい。
【００３３】
次いで酵素を採取するに当たっては培養液から菌体を遠心分離等によって分離し、菌体をリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液に懸濁した後、リゾチーム処理、超音波処理、ガラスビーズ破砕などの各種菌体破砕方法によって破砕して遠心分離し、可溶性画分を粗酵素液として回収する。
【００３４】
このようにして得られた粗製のＦＡＯＤ含有液を公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を用いて処理することにより、精製されたＦＡＯＤを得ることができる。例えばアセトン、エタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫安などによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、ゲルろ過法などの一般的な酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精製ＦＡＯＤを得ることができ、適宜安定化剤、例えばショ糖、グリセロールまたはアミノ酸などを１〜５０％程度、補酵素などを０．０１〜０．１％程度として単独または２種以上適宜組み合わせて加えて凍結保存してもよい。
【００３５】
つぎに本発明で得られるＦＡＯＤの酵素作用および酵素活性測定法を述べる。酵素作用
酸素の存在化、ＦＶＨに作用し、過酸化水素、グルコソン、およびバリルヒスチジンを生成させる。
酵素活性測定方法
測定試薬
５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１ｍＭ フルクトシルバリルヒスチジン
０．０２％ ４−アミノアンチピリン
0． ０２％ ＴＯＯＳ
５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ（メルク社製）
（ＴＯＯＳ：Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン）
測定試薬１ｍｌを光路長１ｃｍのセルにいれ、３７℃で５分間予備加温した後、０．０５ｍｌの酵素液を添加して５分間反応させる。反応後、０．５％ＳＤＳ（ソディウムドデシルスルフェイト）２ｍｌを添加して反応を停止させ、波長５５５ｎｍにおける吸光度（Ａａ）を測定する。また、ブランクとしてＦＶＨを含まない測定試薬を用いて同様の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）。この吸光度（Ａａ）とブランクの吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａａ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成させる酵素量とした。
【００３６】
次に本発明の酵素を用いた測定法について述べる。
【００３７】
本発明に使用しうる測定方法については前記糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異的に作用する酵素を用いた測定方法であればいかなる測定方法を用いても良いが、現在糖化ヘモグロビンの１デオキシフルクトシル基に直接作用する酵素は知られておらず、一度ヘモグロビンを断片化し、そのフラグメントに本発明の酵素を作用させれば良い。
【００３８】
ヘモグロビンの断片化方法としては化学法、酵素法が挙げられるが、その正確さ、簡便さから酵素法が好ましい。これまでヘモグロビンＡ１ｃのβ鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸を切り出すプロテアーゼが報告されておりこれら公知のプロテアーゼを用いればよいが、ヘモグロビンＮ末端の糖化アミノ酸を切り出すとα鎖由来のものかβ鎖由来のものか見分けがつかなくなるのでヘモグロビンＡ１ｃのＮ末端の２アミノ酸以上からなる、糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼが好ましく、Ｎ末端の２アミノ酸を切り出すプロテアーゼが最も好ましい。
【００３９】
好ましいプロテアーゼの例を具体的に以下に挙げるが、これは１例に過ぎない。スミチームＰ（パパイン；新日本化学社製）、ビオプラーゼＳＰ-10、ビオプラーゼＡＬ１５ＦＧ（ナガセケムテックス社製）、オリエンターゼ１０Ｂ（阪急バイオインダストリー社製）、エンチロン（洛東化成工業）、プロテアーゼタイプＶＩＩＩ、プロテアーゼタイプＸＸＩＶ、プロテアーゼタイプＸＩＶ、 バチルスグロビギ（Bacillus globigii）由来プロテアーゼ、（以上シグマ社製）等。
【００４０】
本発明に於けるプロテアーゼの活性測定は、カゼイン−フォリン法で行った。活性の単位１Ｕは37℃、1分間に1ｇのチロシンに相当するフォリン試薬の発色を示す酵素量を1Ｕと定義した。
【００４１】
さらにプロテアーゼを用いたヘモグロビンの分解方法、試薬において、前記プロテアーゼを単独で使用することはもちろんであるが、加えてその反応前後若しくは同時に他のエンドプロテアーゼ、または他のエキソプロテアーゼを作用させても良い。
【００４２】
本発明の糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異的に作用する酵素を用いた測定方法に於ける酵素作用の検出は、例えばデヒドロゲナーゼを用いた場合には補酵素の変化量を、例えば補酵素としてＮＡＤを用いて生成される変化の量として還元型補酵素である還元型ＮＡＤをその極大吸収波長域である３４０ｎｍ付近の波長にて比色計で測定する等公知の技術を用い直接定量するか、若しくは生じた還元型補酵素を各種ジアフォラーゼ、またはフェナジンメトサルフェート等の電子キャリアー及びニトロテトラゾリウム、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８（以上同人化学研究所社製）に代表される各種テトラゾリウム塩等の還元系発色試薬を用い間接的に定量してもよく、またこれ以外の公知の方法により直接、間接的に測定してもよい。
【００４３】
また例えばオキシダーゼを用いた場合には、酸素の消費量または反応生成物の量を測定することが好ましい。反応生成物として、例えばケトアミンオキシダーゼを用いた場合には反応により過酸化水素及びグルコソンが生成し、過酸化水素及びグルコソン共に公知の方法により直接、間接的に測定する事が出来る。
【００４４】
上記過酸化水素の量は、例えばパーオキシダーゼ等を用いて色素等を生成し、発色、発光、蛍光等により定量しても良く、また電気化学的手法によって定量しても良く、カタラーゼ等を用いてアルコールからアルデヒドを生成せしめて、生じたアルデヒドの量を定量しても良い。
【００４５】
過酸化水素の発色系は、パーオキシダーゼの存在下で４−ＡＡ若しくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等のカップラーとフェノール等の色原体との酸化縮合により色素を生成するトリンダー試薬、パーオキシダーゼの存在下で直接酸化、呈色するロイコ型試薬（Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＤＡ６７）；以上和光純薬社製等）等を用いることが出来る。
【００４６】
また過酸化水素を電極を用いて測定する場合、電極には、過酸化水素との間で電子を授受する事の出来る材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金若しくは銀等が挙げられ、電極測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー等の公知の方法を用いることが出来、さらにオキシダーゼまたは基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を測定しても良い。電子伝達体としては電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成する過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電流またはその電気量を測定しても良い。
【００４７】
本発明の酵素を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定用試薬の液組成については、使用するプロテアーゼ及び糖化ヘモグロビン瘢スN端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異的に作用する酵素の至適ｐＨを考慮し、反応が効率よく進行するようにｐＨ及びプロテアーゼ濃度を決定すればよい。
【００４８】
例えばスミチームＰ（パパイヤ由来、新日本化学社製）をプロテアーゼとして用いる場合には、タンパク質分解活性がｐＨ５．５〜９．０付近で強いことから、反応のｐＨは５．５〜９．０を選択することができる。またプロテアーゼ濃度は実際に使用される反応時間中に被検液中のタンパク質を十分に分解し得る濃度で有れば良く0.01〜1000U/mlが好ましく、0.1 〜500U/ml がさらに好ましい。
【００４９】
また、例えば糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異的に作用する酵素としてフルクトシルアミンオキシダーゼ（Arthrinium sp. TO6由来）を用いる場合、至適ｐＨが７〜８であり、反応のpHは７〜８を選択できる。また酵素添加濃度は実際に使用される反応時間中に被検液から生成された糖化アミノ酸を十分に測定し得る濃度で有れば良く、0.01U〜1000U/mlが好ましく、0.1U〜500U/mlがより好ましく、0.5U〜100U/mlが最も好ましい。
【００５０】
本発明に於ける糖化タンパク質定量用試薬としては、糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異的に作用する酵素を含有するものとして調製すれば良く、好ましくはプロテアーゼ及び該糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異的に作用する酵素を含有するものとして調整すれば良く、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供できる。
【００５１】
さらに、本発明に基づく糖化蛋白質を定量する酵素反応組成には、例えば界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加しても良い。
【００５２】
かくして調整された本発明のヘモグロビンＡ１ｃ測定用試薬を用いて、被検液中の糖化ヘモグロビンを測定するには、測定用試薬０．０１〜５．０ｍｌに溶血された被検液０．００１〜０．５ｍｌを加え、３７℃の温度にて反応させ、レートアッセイを行う場合には、反応開始後の一定時間後の２点間の数分ないし数十分間、例えば３分後と４分後の１分間、または３分ごと８分後の５分間における変化した補酵素、溶存酸素、過酸化水素若しくはその他生成物の量を直接または間接的に前記の方法で測定すれば良く、エンドポイントアッセイの場合には反応開始後一定時間後の変化した補酵素、溶存酸素、過酸化水素若しくはその他生成物の量を同様に測定すれば良い。この場合既知濃度のヘモグロビンＡ１ｃを含む試料を用いて測定した場合の吸光度等の変化と比較すれば被検液中のヘモグロビンＡ１ｃの量を求めることができる。
【００５３】
ここで述べた溶血された披検液とは、溶血操作を行った後のヘモグロビンＡ１ｃを含有する被検液であり、さらに詳しくは、全血遠心分離された赤血球、洗浄赤血球等の溶血液が挙げられる。
【００５４】
【実施例】
本発明を実施例に基づいて説明する。
【００５５】
【実施例１】
ネオコスモスポラ・バシンフェクタＮＢＲＣ７５９０菌株由来のＦＡＯＤの培養方法、精製方法および理化学的性質
＜培養方法および精製方法＞
５００ｍｌの三角フラスコ３本に１００ｍｌの２％のマンノース、３％の酵母エキス、０．１％のＫＨ2ＰＯ4、０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含有する培地（ｐＨ６．０）をそれぞれ入れ、殺菌後、ネオコスモスポラ・バシンフェクタＮＢＲＣ７５９０菌株を植菌し、２８℃、４日間振とう培養した。
【００５６】
培養終了後、集菌し、３００ｍｌの１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁させ、超音波破砕により菌体の可溶化を行った（１０Ｕ）。この可溶化液を１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１晩透析させた後、Ｑ−セファロース・ビッグビーズ（１００ｍｌ）樹脂（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は０~１Ｍのリニアグラジエントにより行い、０．２〜０．３ＭのＮａＣｌの溶出画分（９Ｕ）を回収した。
【００５７】
この酵素液に１５％硫酸アンモニウムの濃度となるように硫酸アンモニウムを溶解し、フェニルセファロース・ファーストフロー（５０ｍｌ）（ファルマシア社製）の疎水クロマトグラフィーを行った。溶出は１５〜０Ｍの硫酸アンモニウムのリニアグラジエントにより行い、５〜２％の硫酸アンモニウムの溶出画分（７Ｕ）を回収した。ついで、この酵素液を１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて1晩透析し、ハイドロキシアパタイト（３０ｍｌ）（ペンタックス社製）クロマトグラフィーを行った。溶出は０~０．１Mのリン酸緩衝液（ｐH７．０）によるリニアグラジエントにより行い、０．０３~０．０４Mのリン酸緩衝液の溶出画分（３U）を回収し、精製ＦＡＯＤを得た。
【００５８】
＜理化学的性質＞
（１）基質特異性
本発明ネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ＦＡＯＤの各種基質に対する特異性は表 の通りである。ＦＶに対して最も高い反応性を示し、ＦＶＨに対してＦVの２９％反応し、ＦＶＬには全く作用しなかった。
（２）Ｋｍ値
本発明ネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ＦＡＯＤのＦＶＨに対するＫｍ値は３mMであった。
（３）至適ｐＨ
前記酵素活性測定法に従って至適ｐHを求めたもので、その結果を図１に示した。ｐH４．５〜５．５の範囲は100mMの酢酸緩衝液（図中、○）、ｐH５〜６の範囲は１００ｍＭのクエン酸緩衝液（図中、□）、ｐＨ６〜７．５の範囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液（図中、△）７．５〜９の範囲は１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（図中、●）、ｐＨ９．５〜１０の範囲は１００ｍＭのグリシン緩衝液（図中、黒四角）を使用した場合の活性値を示すもので、至適ｐＨは６．３〜６．７にあった。
（４）ｐＨ安定性
０．５Ｕ／ｍｌの本発明ステフィリウム・エスピー由来ＦＡＯＤを１００ｍＭの各種緩衝液中で３７℃、１時間処理し、その残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果を図２に示した。ｐH４．５〜５．５の範囲は100mMの酢酸緩衝液（図中、○）、ｐH５〜６の範囲は１００ｍＭのクエン酸緩衝液（図中、□）、ｐＨ６〜７．５の範囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液（図中、△）７．５〜９の範囲は１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（図中、●）、ｐＨ９．５〜１０の範囲は１００ｍＭのグリシン緩衝液（図中、黒四角）を使用した。ｐＨ５．７５〜７．３６の範囲で良好な安定性を示した。
（５）至適温度
前記酵素活性測定法に従って、温度３０〜６０℃の範囲で変化させて至適温度を求めた結果は図３に示す通りであり、至適温度は４５−５０℃であった。
（６）熱安定性
０．５Ｕ／ｍｌの本発明ステフィリウム・エスピー由来ＦＡＯＤを１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で各温度で１０分間加熱処理した後の残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果、図４に示す通り、少なくとも４５℃、１０分間加熱処理における残存活性が少なくとも８０％以上を示した。
（７）分子量
ＴＳＫ Ｇ−３０００ＳＷＸＬ（トーソー社製）を用いたHPLCにより分子量を測定した。その結果、分子量は３７，０００であった。
【００５９】
以上の結果を上記表２にまとめた。
【００６０】
【実施例２】
コニオケチジウム・サボリＡＴＣＣ菌株由来のＦＡＯＤの培養方法、精製方法および酵素学的性質
＜培養法および精製方法＞
実施例１で記載した培養方法により培養を行った。
【００６１】
培養終了後、集菌し、３００ｍｌの１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁させ、超音波破砕により菌体の可溶化を行った（１５Ｕ）。この可溶化液を１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１晩透析させた後、Ｑ−セファロース・ビッグビーズ（１００ｍｌ）樹脂（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は０~１Ｍのリニアグラジエントにより行い、０．１５〜０．２５ＭのＮａＣｌの溶出画分（１３Ｕ）を回収した。
【００６２】
この酵素液に１５％硫酸アンモニウムの濃度となるように硫酸アンモニウムを溶解し、フェニルセファロース・ファーストフロー（５０ｍｌ）（ファルマシア社製）の疎水クロマトグラフィーを行った。溶出は１５〜０Ｍの硫酸アンモニウムのリニアグラジエントにより行い、４〜０％の硫酸アンモニウムの溶出画分（８Ｕ）を回収した。ついで、この酵素液を１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて1晩透析し、ハイドロキシアパタイト（３０ｍｌ）（ペンタックス社製）クロマトグラフィーを行った。溶出は０~０．１Mのリン酸緩衝液（ｐH７．０）によるリニアグラジエントにより行い、０．０３~０．０４Mのリン酸緩衝液の溶出画分（４U）を回収し、精製ＦＡＯＤを得た。
【００６３】
＜理化学的性質＞
（１）基質特異性
本発明コニオケチジウム・サボリ由来ＦＡＯＤの各種基質に対する特異性は表の通りである。ＦＶに対して最も高い反応性を示し、ＦＶＨに対してはＦＶの２６％反応し、ＦＶＬには全く作用しなかった。
（２）Ｋｍ値
本発明コニオケチジウム・サボリ由来ＦＡＯＤのＦＶＨに対するＫｍ値は１．６mMであった。
（３）至適ｐＨ
実施例１と同様にして至適ｐHを求めたもので、至適ｐＨは６．３〜６．７にあった。
（４）ｐＨ安定性
実施例１と同様にしてｐＨ安定性を求めたもので、ｐＨ５．８〜７の範囲で良好な安定性を示した。
（５）至適温度
実施例１と同様にして至適温度を求めたもので、至適温度は３７℃であった。
（６）熱安定性
実施例１と同様にして至適温度を求めたもので、少なくとも３７℃、１０分間加熱処理における残存活性が少なくとも８０％以上を示した。
（７）分子量
ＴＳＫ Ｇ−３０００ＳＷＸＬ（トーソー社製）を用いたHPLCにより分子量を測定した。その結果、分子量は２７，０００であった。
【００６４】
以上の結果の結果は上記表２にまとめた。
【００６５】
【実施例３】
アルスレニウム・エスピーＴＯ６（ＦＥＲＭＰ−１９２１１）菌株由来のＦＡＯＤの培養方法、精製方法および酵素学的性質
＜培養方法＞
５００ｍｌ容坂口フラスコに１００ ｍｌのＹＭＧ培地（１．０％グルコース、１．０％ポリペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス、０．１％ KH2PO4、０．０５％ MgSO4・７H2O、pH ６．０）を入れ、殺菌後、アルスレニウム・エスピーＴＯ６を植菌し、３０℃、４日間振盪培養した。
＜精製方法＞
液体窒素で凍結した菌体を乳鉢で磨砕して菌体破砕を行い、４０ ｍｌの０．１Mトリス塩酸緩衝液(pH ７．３)を加えて、５℃で１晩放置した後、遠心分離して無細胞抽出液を得た。得られた無細胞抽出液に４０ ％ 飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、遠心分離した上清を４０％ 飽和硫酸アンモニウムを加えた ０．１ Mトリス塩酸緩衝液（pH ７．３）で平衡化した Ｂｕｔｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０M (１８f×１５０ ｍｍ, 東ソー製) のカラムに供与し、１０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加えた ０．１ M トリス塩酸緩衝液（pH７．３）で洗浄を行い、０．１ M トリス塩酸 緩衝液（pH ７．３）で溶出した。その溶出液の活性画分に４０ ％ 飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、４０％ 飽和硫酸アンモニウムを加えた０．１ Mトリス塩酸緩衝液（pH ７．３）で平衡化した Phenyl-５PW (８．０f×７．５ ｍｍ, 東ソー製) のHPLCカラムに供与し、４０％ から ０％ までの飽和硫酸アンモニウムのリニアグラジエントで溶出した。その活性画分を ５０ ｍＭ トリス塩酸 緩衝液（pH ７．３）で透析した後、同緩衝液で平衡化した Ｐｏｒｏｓ HQ／H (４．６f×５０ ｍｍ, アプライドバイオシステムズ製) のカラムに供与し、０ から ０．５ M までの ＮａＣｌ のリニアグラジエントで溶出した。活性画分を回収し、蒸留水に対して透析し、精製ＦＡＯＤを得た。精製の過程を下記表にまとめた。
【００６６】
【表４】
【００６７】
＜理化学的性質＞
（１）基質特異性
本発明のアルスレニウム・エスピーＴＯ６由来ＦＡＯＤの各種基質に対する特異性は表３の通りである。反応時の各基質濃度を １ｍＭ とした。その他の反応条件は活性測定法に準じた。アルスレニウム・エスピーＴＯ６由来ＦＡＯＤはＦＶに対して最も高い反応性を示し、かつ、ＦＶＨにも高く反応するが、ＦＶＬへの作用はＦＶＨと比較して約４０分の１であり、本酵素はＦＶＬへ実質的に作用しないといえる。
（２）Ｋｍ値
本発明のアルスレニウム・エスピーＴＯ６由来ＦＡＯＤのＦＶＨに対するＫｍ値は０．４２ｍＭであった。
（３）至適ｐＨ
ＦＶＨを1mMになるように溶解したｐＨ３．０〜１１．０の各種緩衝液（ｐＨ３〜５は１０ｍＭの酢酸緩衝液、ｐH５〜７は１０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ７〜９は１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液、ｐＨ９〜１１は１０ｍＭのホウ酸緩衝液）０．４５ｍｌを光路長１ｃｍのセルにいれ、３７℃で５分間予備加温した後、０．０５ｍｌの酵素液を添加して３０分間反応させた。反応後、測定試薬（０．０４％ ＴＯＯＳ、０．０４％ ４-アミノアンチピリン、パーオキシダーゼ５０Uを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．５））０．５ｍｌを加え、２分間発色させた後、０．５％ＳＤＳ２ｍｌを添加して反応を停止させ、波長５５５ｎｍにおける吸光度（Ａａ）を測定した。また、ブランクとして基質を含まない各種緩衝液を加え、同様の操作を行って吸光度を測定した（Ａｂ）。この吸光度（Ａａ）とブランクの吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａａ−Ａｂ）より酵素活性を求めた。
【００６８】
その結果、アルスレニウム・エスピーＴＯ６由来ＦＡＯＤの至適ｐＨは７〜８にあった。
（４）ｐＨ安定性
酵素液を１０ｍＭの各種緩衝液中で４℃、２４時間処理し、その残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果、本発明のアルスレニウム・エスピーＴＯ６由来ＦＡＯＤはｐＨ７〜１１の範囲で良好な安定性を示した。
（５）至適温度
ＦＶＨを1mMになるように溶解した１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．４５ｍｌを光路長１ｃｍのセルにいれ、１５〜６０℃で５分間予備加温した後、０．０５ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させた。反応後氷中で冷却した後、測定試薬（０．０４％ ＴＯＯＳ、０．０４％ ４-アミノアンチピリン、パーオキシダーゼ５０Uを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．５））０．５ｍｌを加え、２分間発色させた後、０．５％ＳＤＳ２ｍｌを添加して反応を停止させ、波長５５５ｎｍにおける吸光度（Ａａ）を測定した。また、ブランクとしてＦＶＨを含まない各種緩衝液を加え、同様の操作を行って吸光度を測定した（Ａｂ）。この吸光度（Ａａ）とブランクの吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａａ−Ａｂ）より酵素活性を求めた。
【００６９】
１５〜６０℃の範囲で変化させて至適温度を求めた結果、本発明のアルスレニウム・エスピーＴＯ６由来ＦＡＯＤの至適温度は３０〜４０℃であった。
（６）熱安定性
酵素液を１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で各温度３０分間加熱処理した後の残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果、本発明のアルスレニウム・エスピーＴＯ６由来ＦＡＯＤは４０℃・３０分間の加熱処理までは８０％以上の残存活性を示した。
（７）分子量
ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ-２００G（φ６．０×３００ ｍｍ、ワイエムシー製）によるゲル濾過から本酵素の分子量を求めた。標準蛋白質として牛血清アルブミン、オボアルブミン、大豆トリプシンインヒビター（全てシグマ製）を使用した。その結果、本酵素の分子量は約３４,０００であった。
【００７０】
Ｌａｅｍｍｌｉの方法での １０％ ｇｅｌ による ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）では、分子量は約 ５０,０００ であった。尚、標準蛋白質は SDS-PAGE スタンダード Ｌｏｗ (バイオラッド社製) を使用した。
【００７１】
以上の結果から、本発明のアルスレニウム・エスピーＴＯ６由来ＦＡＯＤは単量体であることが明らかである。
【００７２】
【実施例４】
ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７（ＦＥＲＭＰ−１９２１０菌株）菌株由来のＦＡＯＤの培養方法、精製方法および酵素学的性質
＜培養方法及び精製方法＞
実施例３で記載した製造及び精製法と同様の方法により活性画分を回収し、蒸留水に対して透析し、精製ＦＡＯＤを得た。精製の過程を下記表にまとめた。
【００７３】
【００７４】
【表５】
【００７５】
＜理化学的性質＞
（１）基質特異性
本発明のピレノケータ・エスピーＹＨ８０７由来ＦＡＯＤの各種基質に対する特異性は表３の通りである。反応時の各基質濃度を １ｍＭ とした。その他の反応条件は活性測定法に準じた。ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７由来ＦＡＯＤはＦＶに対して最も高い反応性を示し、かつ、ＦＶＨにも高く反応するが、ＦＶＬへの作用はＦＶＨと比較して約１６０分の１であり、本酵素はＦＶＬへ実質的に作用しないといえる。
（２）Ｋｍ値
本発明のピレノケータ・エスピーＹＨ８０７由来ＦＡＯＤのＦＶＨに対するＫｍ値は０．９９ｍＭであった。
（３）至適ｐＨ
実施例３の（３）で記載した方法により本酵素の至適ｐＨを調べた結果、至適ｐＨは７〜８にあった。
（４）ｐＨ安定性
実施例３の（４）で記載した方法によりピレノケータ・エスピーＹＨ８０７由来ＦＡＯＤのｐＨ安定性を調べた結果、ｐＨ７〜１１の範囲で良好な安定性を示した。
（５）至適温度
実施例３の（５）で記載した方法に従って至適温度を求めた結果、本発明のピレノケータ・エスピーＹＨ８０７由来ＦＡＯＤの至適温度は３０〜４０℃であった。
（６）熱安定性
実施例３の（６）で記載した方法に従って熱安定性を求めた結果、ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７由来ＦＡＯＤの熱安定性は、４０℃・３０分間の加熱処理までは８０％以上の残存活性を示した。
（７）分子量
実施例３の（７）で記載した方法に従ってゲル濾過ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量を求めた結果、ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７由来ＦＡＯＤの分子量はゲル濾過法で約３４,０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約５０,０００であった。この結果から、本発明のピレノケータ・エスピーＹＨ８０７由来ＦＡＯＤは単量体であることが明らかである。
【００７６】
【実施例５】
カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭＰ−１９２０９）菌株由来のＦＡＯＤの培養方法、精製方法および酵素学的性質について
＜培養方法および精製方法＞
実施例３で記載した製造及び精製法と同様の方法により活性画分を回収し、蒸留水に対して透析し、精製ＦＡＯＤを得た。精製の過程を下記表にまとめた。
【００７７】
【表６】
【００７８】
理化学的性質
（１）基質特異性
本発明のカーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ＦＡＯＤの各種基質に対する特異性は表３の通りである。反応時の各基質濃度を １ｍＭ とした。その他の反応条件は活性測定法に準じた。カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ＦＡＯＤはＦＶに対して最も高い反応性を示し、かつ、ＦＶＨにも高く反応するが、ＦＶＬへの作用はＦＶＨと比較して約３０分の１であり、本酵素はＦＶＬへ実質的に作用しないといえる。
（２）Ｋｍ値
本発明のカーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ＦＡＯＤのＦＶＨに対するＫｍ値は０．９５ｍＭであった。
（３）至適ｐＨ
実施例３の（３）で記載した方法により本酵素の至適ｐＨを調べた結果、至適ｐＨは７〜８にあった。
（４）ｐＨ安定性
実施例３の（４）で記載した方法によりカーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ＦＡＯＤのｐＨ安定性を調べた結果、ｐＨ７〜１１の範囲で良好な安定性を示した。
（５）至適温度
実施例３の（５）で記載した方法に従って至適温度を求めた結果、本発明のカーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ＦＡＯＤの至適温度は５０〜５５℃であった。
（６）熱安定性
実施例３の（６）で記載した方法に従って熱安定性を求めた結果、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ＦＡＯＤの熱安定性は、５０℃・３０分間の加熱処理までは８０％以上の残存活性を示した。
（７）分子量
実施例３の（７）で記載した方法に従ってゲル濾過ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量を求めた結果、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ＦＡＯＤの分子量はゲル濾過法で約３４,０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約５０,０００であった。この結果から、本発明のカーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ＦＡＯＤは単量体であることが明らかである。
【００７９】
【実施例６】
レプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０菌株由来ＦＡＯＤの製造及び精製
＜培養方法及び精製方法＞
実施例３で記載した製造及び精製法と同様の方法により活性画分を回収し、蒸留水に対して透析し、精製ＦＡＯＤを得た。精製の過程を下記表６にまとめた。
【００８０】
【表７】
【００８１】
理化学的性質
（１）基質特異性
本発明のレプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤの各種基質に対する特異性は表３の通りである。反応時の各基質濃度を １ｍＭ とした。その他の反応条件は活性測定法に準じた。レプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤはＦＶに対して最も高い反応性を示し、かつ、ＦＶＨにも高く反応するが、ＦＶＬへの作用はＦＶＨと比較して約５分の１であり、本酵素はＦＶＬへ実質的に作用しないといえる。
（２）Ｋｍ値
本発明のレプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤのＦＶＨに対するＫｍ値は０．８５ｍＭであった。
（３）至適ｐＨ
実施例３の（３）で記載した方法によりレプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤの至適ｐＨを調べた結果、至適ｐＨは７〜８にあった。
（４）ｐＨ安定性
実施例３の（４）で記載した方法によりレプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤのｐＨ安定性を調べた結果、ｐＨ７〜１１の範囲で良好な安定性を示した。
（５）至適温度
実施例３の（５）で記載した方法に従って至適温度を求めた結果、本発明のレプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤの至適温度は３０〜４０℃であった。
（６）熱安定性
実施例３の（６）で記載した方法に従って熱安定性を求めた結果、レプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤの熱安定性は、４０℃・３０分間の加熱処理までは８０％以上の残存活性を示した。
（７）分子量
実施例３の（７）で記載した方法に従ってゲル濾過ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量を求めた結果、レプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤの分子量はゲル濾過法で約３４,０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約５０,０００であった。この結果から、本発明のレプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤは単量体であることが明らかである。
【００８２】
【実施例７】
プレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２菌株由来のＦＡＯＤの培養方法、精製方法および酵素学的性質
＜培養方法及び精製方法＞
実施例３で記載した製造及び精製法と同様の方法により活性画分を回収し、蒸留水に対して透析し、精製ＦＡＯＤを得た。精製の過程を下記表７にまとめた。
【００８３】
【表８】
【００８４】
理化学的性質
（１）基質特異性
本発明のプレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２由来ＦＡＯＤの各種基質に対する特異性は表３の通りである。反応時の各基質濃度を１ｍＭ とした。その他の反応条件は活性測定法に準じた。プレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２由来ＦＡＯＤはＦＶに対して最も高い反応性を示し、かつ、ＦＶＨにも高く反応するが、ＦＶＬへの作用はＦＶＨと比較して約１５６分の１であり、本酵素はＦＶＬへ実質的に作用しないといえる。
（２）Ｋｍ値
本発明のプレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２由来ＦＡＯＤのＦＶＨに対するＫｍ値は０．８ｍＭであった。
（３）至適ｐＨ
実施例３の（３）で記載した方法により本酵素の至適ｐＨを調べた結果、至適ｐＨは７〜８にあった。
（４）ｐＨ安定性
実施例３の（４）で記載した方法によりプレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２由来ＦＡＯＤのｐＨ安定性を調べた結果、ｐＨ７〜１１の範囲で良好な安定性を示した。
（５）至適温度
実施例３の（５）で記載した方法に従って至適温度を求めた結果、プレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２由来ＦＡＯＤの至適温度は３０〜４０℃であった。
（６）熱安定性
実施例３の（６）で記載した方法に従って熱安定性を求めた結果、プレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２由来ＦＡＯＤの熱安定性は、４０℃・３０分間の加熱処理までは８０％以上の残存活性を示した。
（７）分子量
実施例３の（７）で記載した方法に従ってゲル濾過ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量を求めた結果、プレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２由来ＦＡＯＤの分子量はゲル濾過法で約３４,０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約５０,０００であった。この結果から、本発明のプレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２由来ＦＡＯＤは単量体であることが明らかである。
【００８５】
【実施例８】
オフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８菌株由来のＦＡＯＤの培養方法、精製方法および酵素学的性質
＜培養方法＞
５００ｍｌ容坂口フラスコに１００ ｍｌのＹＭＧ培地（１．０％グルコース、１．０％ポリペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス、０．１％ KH2PO4、０．０５％ MgSO4・７H2O、pH ６．０）を入れ、殺菌後、ＦＡＯＤ生産菌株を植菌し、３０℃、１０日間振盪培養した。
＜精製方法＞
実施例で記載した精製法と同様の方法により活性画分を回収し、蒸留水に対して透析し、精製ＦＡＯＤを得た。精製の過程を下記表にまとめた。
【００８６】
【表９】
【００８７】
理化学的性質
（１）基質特異性
本発明のオフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤの各種基質に対する特異性は表３の通りである。反応時の各基質濃度を １ｍＭ とした。その他の反応条件は活性測定法に準じた。オフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤはＦＶに対して最も高い反応性を示し、かつ、ＦＶＨにも高く反応するが、ＦＶＬへの作用はＦＶＨと比較して約１５６分の１であり、本酵素はＦＶＬへ実質的に作用しないといえる。
（２）Ｋｍ値
本発明のオフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤのＦＶＨに対するＫｍ値は０．８ｍＭであった。
（３）至適ｐＨ
実施例３の（３）で記載した方法によりオフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤの至適ｐＨを調べた結果、至適ｐＨは７〜８にあった。
（４）ｐＨ安定性
実施例３の（４）で記載した方法によりオフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤのｐＨ安定性を調べた結果、ｐＨ７〜１１の範囲で良好な安定性を示した。
（５）至適温度
実施例３の（５）で記載した方法に従って至適温度を求めた結果、本発明のオフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤの至適温度は３０〜４０℃であった。
（６）熱安定性
実施例３の（６）で記載した方法に従って熱安定性を求めた結果、オフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤの熱安定性は、４０℃・３０分間の加熱処理までは８０％以上の残存活性を示した。
（７）分子量
実施例３の（７）で記載した方法に従ってゲル濾過ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量を求めた結果、オフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤの分子量はゲル濾過法で約３４，０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約５０，０００であった。この結果から、本発明のオフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤは単量体であることが明らかである。
【００８８】
【実施例９】
ヘモグロビンＡ１ｃの測定
＜本発明のプロテアーゼを用いた糖化ヘモグロビンの測定＞
＜反応手順＞
上記溶血試薬０．９ｍｌに全血より分離した赤血球若しくは標準糖化ペプチド溶液０．１ｍｌを添加し、３７℃−１０分間インキュベーションし溶血試料とした。溶血試料はヘモグロビン濃度を求める目的でＡ５７０ｎｍを測定した。続いてＲ１試薬２４０μｌおよび溶血試料６μｌを混合し、３７℃５分反応を行い７５０ｎｍを測光した（Ａ０）。さらにＲ２試薬６０μlを添加し３７℃−５分間インキュベーションし７５０ｎｍを測光した（Ａ１）。ブランクの測定は、試料に蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔＡ＝Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）を測定した。また試料に検体及び糖化ヘモグロビン値既知の試料を用いて感度（感度ΔＡ＝（Ａ１-Ａ０）−ブランクΔＡ）を求め、糖化ヘモグロビン濃度を算出した。さらに糖化ヘモグロビン濃度をヘモグロビン濃度で除し、糖化ヘモグロビン値を算出した。
＜試料＞
健常者全血５検体、糖尿病患者全血５検体
１００μＭ、８０μＭ、６０μＭ、４０μＭ、２０μＭのＦＶＨ若しくはＦＶＬ
＜ヘモグロビンＡ１ｃのＨＰＬＣを用いた測定＞
ＨＰＬＣ法の測定はＨｂＡ１ｃ測定装置（アークレイ社製）にて測定した。
標準糖化ペプチド（ＦＶＨ，ＦＶＬ）の測定結果を図５に、検体の測定結果を表９に示す。
【００８９】
【表１０】
【００９０】
図５から分かるように、本発明の酵素を用いた測定試薬はＦＶＬには作用せず、ＦＶＨにのみ作用することから、正確にヘモグロビンβ鎖Ｎ末端の糖化ペプチドのみを検出できることが明らかであり、糖化ヘモグロビンではなくヘモグロビンＡ１ｃを正確に測定していることが明らかであった。
また表１０よりＨＰＬＣ法で測定したヘモグロビンＡ１ｃの測定値と酵素法の値が極めて良く一致することから、正確にヘモグロビンＡ１ｃを測定していることが明白であった。
【００９１】
【発明の効果】
本発明の糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い酵素、該酵素を用いた測定方法、試薬を用いろことにより、ヘモグロビンＡ１ｃをより簡便、正確、安価に測定することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来のＦＡＯＤの至適ｐＨ曲線を示す。
【図２】図２はネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来のＦＡＯＤのｐＨ安定性曲線を示す。
【図３】図３はネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来のＦＡＯＤの至適温度曲線を示す。
【図４】図４はネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来のＦＡＯＤの熱安定性曲線を示す。
【図５】図５は標準糖化ペプチド（ＦＶ、ＦＶＨ）の測定曲線を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い酵素、該酵素を用いた測定方法、試薬に関する。更に詳しくは臨床の現場で簡便、正確及び安価にヘモグロビンＡ１ｃを測定する為の酵素、該酵素を用いた測定方法及び試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖化蛋白はグルコースなどの還元糖が共存する場合、タンパク質のアミノ基とアルデヒド基が非酵素的かつ非可逆的に結合し、アマドリ転移することにより生成される。生体内では血液中のヘモグロビンが糖化されたグリコヘモグロビン、アルブミンが糖化されたグリコアルブミン、血液中のタンパク質が糖化されたフルクトサミンなどが知られている。これらの血中濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は糖尿病の病状の診断及び症状の管理の重要な指標となり得るために測定手段の確立は臨床上、極めて有用である。
【０００３】
その中でも、現在、糖尿病診断の指標となる最も一般的かつ臨床データのそろっているものは、血中ヘモグロビンＡ1ｃ濃度であり、特にその簡便、正確な測定手段の確立が求められている。また、醤油や味噌などの食品中のアマドリ化合物を定量することにより、その食品の製造後の保存状況や期間を知ることができ、品質管理に役立つと考えられる。
【０００４】
従来、アマドリ化合物の測定法としては、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法(非特許文献１)、ホウ酸を結合させた固体を詰めたカラムを用いる方法（非特許文献２）、抗原−抗体反応を利用する方法（非特許文献３）還元能をテトラゾリウム塩を用いて比色定量する方法（非特許文献４）、チオバリビツール酸を用いて比色定量する方法（非特許文献５）等が知られている。
【０００５】
しかしながらこれらの方法は、いずれも操作が煩雑であったり、高価な機器が必要であったり、必ずしも正確で迅速な方法ではなかった。現在、上記方法よりも操作が簡単で、安価に、短時間で精度良く糖蛋白質を測定する方法として、酵素的方法が提案されている。アマドリ化合物を定量する方法として、特許文献１）〜７）、糖尿病の診断のための糖化蛋白質の測定法として、特許文献８）〜１１）等が知られている。
【０００６】
上記方法で使用されている糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドに作用する酵素としては、これまでにコリネバクテリウム属（特許文献１２）、アスペルギルス属（特許文献１３）、ニシリウム属（特許文献１４）、フザリウム属（特許文献１５〜１７）、ギベレラ属（特許文献１８、１９）、カンジダ属（特許文献２０）、アスペルギルス属（特許文献２１、２２）由来のフルクトシルアミンオキシダーゼが報告されている。
【０００７】
ヘモグロビンはα鎖およびβ鎖の2本のポリペプチドからなる分子量６４，５００の４量体である。ヘモグロビンのα鎖のN末端アミノ酸配列はバリン−ロイシン−セリン−・・・、β鎖のN末端アミノ酸配列はバリン−ヒスチジン−ロイシン−・・・である。ヘモグロビンＡ１ｃはβ鎖のＮ末端バリンが糖化されたものと定義されており、ヘモグロビン中のどのアミノ酸が糖化されているかはわからない糖化ヘモグロビンとは区別されている。現在臨床現場では、その正確性からヘモグロビンＡ１ｃが多用されており、グリコヘモグロビンを測定することはほとんどなくなってきた。
【０００８】
糖化ヘモグロビンの酵素を用いた測定法として、ロイシンのＣ末端側を切断するプロテアーゼとジペプチジルカルボキシペプチダーゼを作用させてβ鎖のＮ末端糖化バリンのみを遊離させる方法が考案された（特許文献２３）が、この方法ではプロテアーゼにより多量のペプチドが遊離するため、目的とするフルクトシルバリルヒスチジルロイシンを完全に分解するためには高価なジペプチジルカルボキシペプチダーゼが多量に必要となる等の問題がある。
【０００９】
また、N末端の糖化バリルヒスチジンに作用するＦＡＯＤを用いた測定法（特許文献２４）が報告されたが、これには糖化ヘモグロビンのα鎖から遊離するペプチドに対する反応性については全く述べられていなかった。つまり、ヘモグロビンのβ鎖N末端バリンの糖化部位を特異的に認識して測定しているのではなくα鎖およびβ鎖の両方のN末端糖化バリンを測定するものであり、本来のヘモグロビンA１ｃ、すなわちβ鎖のＮ末端糖化バリンを測定しているものではなかった。
これまでにＨｂＡ１ｃを酵素を持いて簡便、安価、迅速に測定する方法はなかった。
【００１０】
【非特許文献１】
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ. Ｓｃｉ．, １０：６５９（１９７９）
【非特許文献２】
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２６：１５９８（１９８２）
【非特許文献３】
ＪＪＣＬＡ １８：６２０（１９９３）
【非特許文献４】
Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ 127：87（１９８２）
【非特許文献５】
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １１２：１９７（１９８１）
【特許文献１】
特公平０５−３３９９７号公報
【特許文献２】
特公平６−６５３００号公報
【特許文献３】
特開平０２−１９５９００号公報
【特許文献４】
特開平０３−１５５７８０号公報
【特許文献５】
特開平０４−４８７４号公報
【特許文献６】
特開平０５−１９２１９３号公報
【特許文献７】
特開平０６−４６８４６号公報
【特許文献８】
特開平０２−１９５８９９号公報
【特許文献９】
特開平０２−１９５９０号公報
【特許文献１０】
特開平０５−１９２１９３号公報
【特許文献１１】
特開平０６−４６８４６号公報
【特許文献１２】
特開昭６１−２６８１７８号公報
【特許文献１３】
特開平３−１５５７８０号公報
【特許文献１４】
特開平４−４８７４号公報
【特許文献１５】
特開平５−１９２１９３号公報
【特許文献１６】
特開平７−２８９２５３号公報
【特許文献１７】
特開平８−１５４６７２号公報
【特許文献１８】
特開平５−１９２１９３号公報
【特許文献１９】
特開平７−２８９２５３号公報
【特許文献２０】
特開平６−４６８４６号公報
【特許文献２１】
特開平１０−３３１７７号公報
【特許文献２２】
特開平１０−３３１８０号公報
【特許文献２３】
特開２０００−３００２９４号公報
【特許文献２４】
特開２００１−９５５９８号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い酵素、該酵素を用いた測定方法、試薬を提供することにあり、さらに詳しくはヘモグロビンＡ１ｃを酵素を用いて簡便、正確、安価に測定する酵素、測定方法及び試薬を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために、ヘモグロビンβ鎖Ｎ末端にのみ作用する酵素を探索した。探索に当たってヘモグロビンα鎖の配列はＮ端よりＶＬＳであり、β鎖の配列はＮ端よりＶＨＬであることから、Ｎ端はα鎖もβ鎖も同じであり、Ｎ末端の糖化アミノ酸を遊離してヘモグロビンβ鎖Ｎ末端にのみ作用する酵素を探索することは不可能である。そこで本発明者らはヘモグロビンα鎖及びβ鎖Ｎ末端糖化物のモデル基質である１デオキシフルクトシルバリルロイシン（以下ＦＶＬと略す）及び１デオキシフルクトシルバリルヒスチジン（以下ＦＶＨと略す）をハシバらの方法（Hashiba H,J.Agric.Food Chem.24:70,1976）を用いて合成、精製した。
【００１３】
本発明者らは自然界に存在する酵素（各地の土壌等から単離した菌）や購入した保存菌を培養し、ＦＶＨに作用し、ＦＶＬに実質的に作用しないＦＡＯＤを生産する菌株をスクリーニングし、鋭意検討を重ねた結果、ネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ）ＮＢＲＣ７５９０、コニオケチジウム・サボリ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ ｓａｖｏｒｙｉ）ＡＴＣＣ３６５４７、アルスリニウム・エスピー（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．）ＴＯ６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１１）、アルスリニウム・ファエオスペルマム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｐｈａｅｏｓｐｅｒｍｕｍ）ＮＢＲＣ３１９５０、アルスリニウム・ファエオスペルマム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｐｈａｅｏｓｐｅｒｍｕｍ）ＮＢＲＣ６６２０、アルスリニウム・ジャポニカム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＮＢＲＣ３１０９８、ピレノケータ・エスピー（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．）ＹＨ８０７（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１０）、ピレノケータ・ゲンチアニコラ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｇｅｎｔｉａｎｉｃｏｌａ）ＭＡＦＦ４２５５３１、ピレノケータ・テレストリス（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）ＮＢＲＣ ３０９２９、レプトスフェリア・ノドラム（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）（分生子世代名フォーマ・ヘンネべルギー（Ｐｈｏｍａ ｈｅｎｎｅｂｅｒｇｉｉ））ＮＢＲＣ７４８０、レプトスフェリア・ドリオラム（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｄｏｌｉｏｌｕｍ）ＪＣＭ２７４２、レプトスフェリア・マクランス（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｍａｃｕｌａｎｓ）（分生子世代名フォーマ・リンガム（Ｐｈｏｍａ ｌｉｎｇｕｍ））ＭＡＦＦ７
２６５２８、プレオスポラ・ハーブラム（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ ｈｅｒｂａｒｕｍ）ＮＢＲＣ３２０１２、プレオスポラ・ベタエ（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ ｂｅｔａｅ）（分生子世代名フォーマ・ベタエ（Ｐｈｏｍａ ｂｅｔａｅ））ＮＢＲＣ５９１８、オフィオボラス・ヘルポトリカス（Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｕｓ）ＮＢＲＣ６１５８、カーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ）ＹＨ９２３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２０９）などの微生物が糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い酵素を生産することを発見した。これらの生産性を下記表１に示し、それらの精製酵素の性質を下記表２および表３示した。
【００１４】
【表１】
【表２】
【表３】
さらに本酵素を用いてヘモグロビンＡ１ｃを正確、簡便、安価に測定できることを見出し本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は
１）糖化ヘモグロビン瘢スN端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異的に作用する酵素。
２）糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに作用し、糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドに実質的に作用しない酵素。
３）糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドが1-デオキシフルクトシル-L-バリル-L-ヒスチジンであり、ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドが、1-デオキシフルクトシル-L-バリル-L-ロイシンであることを特徴とする１）及び２）に記載の酵素。
４）酵素がフルクトシルアミンオキシダーゼである１）〜３）記載の酵素
５）酵素がネオコスモスポラ属、コニオケチジウム属、アルスリニウム属、ピレノケータ属、レプトスフェリア属、プレオスポラ属、オフィオボラス属、カーブラリア属、フォーマ属由来であることを特徴とする１）〜４）記載の酵素。
６）ネオコスモスポラ属、コニオケチジウム属、アルスリニウム属、ピレノケータ属、レプトスフェリア属、プレオスポラ属、オフィオボラス属、カーブラリア属、フォーマ属の培養物から糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異的に作用する酵素を製造する方法。
７）糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い酵素を用いることを特徴とする、アマドリ化合物の測定方法。
８）糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに作用し、糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドに実質的に作用しない酵素を用いることを特徴とするアマドリ化合物の測定方法。
９）アマドリ化合物がヘモグロビンＡ１ｃであることを特徴とする８）記載の方法。
１０）糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い酵素を含有する試薬。
１１）プロテアーゼ、糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い酵素を含有する試薬。に関する。
【００１８】
さらに詳しくは、ヘモグロビンA１ｃの本来の定義であるβ鎖のN末端バリンの糖化部位を特異的に認識し、測定するために必要な特異性を備えた酵素、該酵素を用いた測定方法及び試薬に関する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明について、以下具体的に説明する。
＜アマドリ化合物＞
本発明に於けるアマドリ化合物とは、タンパク質等のアミノ基をもつ化合物とグルコース等のアルデヒド基を持つ化合物がメイラード反応により、生じる下記の一般式（１）−（ＣＯ）−ＣＨＲ−ＮＨ−（Ｒは、水素原子か水酸基を示す）で表されるケトアミン構造を有する化合物のことを指す。アマドリ化合物には糖化ヘモグロビンや糖化アルブミンのような糖化タンパク質やペプチドが糖化された糖化ペプチド等が含まれる。
＜糖化ヘモグロビン＞
ヘモグロビンがメイラード反応により糖化されたアマドリ化合物のことを指し、α鎖及びβ鎖Ｎ末端のバリンや分子内のリジンが糖化されていると言われている。
＜ヘモグロビンＡ１ｃ＞
糖化ヘモグロビンのうちヘモグロビンβ鎖Ｎ末端のバリンが糖化された分子を指し、さらにアマドリ転移する前のシッフベースである不安定型ヘモグロビンとも区別される。
【００２０】
本発明に用いることが出来る酵素は、糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い、若しくは、ＦＶＬよりもＦＶＨに特異性の高い酵素であればいかなる酵素を用いても良いが、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに作用し、糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドに実質的に作用しないＦＡＯＤ、若しくは、ＦＶＨに作用し、ＦＶＬに実質的に作用しない酵素が好ましい。
【００２１】
特異性の高い酵素とは、通常、測定したい基質に対する活性を１００％とした時、測定対象でない基質に対する相対活性が例えば８０％以下であることをいい、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下である酵素をいう。また、実質的に作用しない酵素とは、通常、測定したい基質に対する活性を１００％とした時、測定対象でない基質に対する相対活性が例えば２０％以下であることをいい、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下である酵素をいう。
【００２２】
酵素の種類としてはでヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、キナーゼ等どのような酵素であっても糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い酵素であれば用いることが出来るが、オキシダーゼが最も良く研究されており、使いやすさの点でオキシダーゼが好ましい。
【００２３】
以下に本発明に使用できる酵素の具体例を示すが、これによりなんら限定されるものではない。また、本発明の酵素を生産する能力を有するその変異株であっても使用できることは言うまでもない。表1にまとめたように、本発明に使用することが出来るオキシダーゼとしてはネオコスモスポラ属、コニオケチジウム属、アルスリニウム属、ピレノケータ属、レプトスフェリア属、プレオスポラ属、オフィオボラス属、カーブラリア属、フォーマ属に属する菌株が挙げられる。また、表1中のレプトスフェリア・ノドラム、レプトスフェリア・マクランス、プレオスポラ・ベタエはいずれも分生子世代がフォーマ属であり、本発明の酵素はフォーマ属にも広く分布していることがわかる。
【００２４】
また、より好ましくはネオコスモスポラ・バシンフェクタ ＮＢＲＣ７５９０菌株、コニオケチジウム・サボリＡＴＣＣ３６５４７菌株、アルスリニウム・エスピーＴＯ６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１１）、アルスリニウム・ファエオスペルマムＮＢＲＣ３１９５０、アルスリニウム・ファエオスペルマムＮＢＲＣ６６２０、アルスリニウム・ジャポニカムＮＢＲＣ３１０９８、ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１０）、ピレノケータ・ゲンチアニコラＭＡＦＦ４２５５３１、ピレノケータ・テレストリスＮＢＲＣ３０９２９、レプトスフェリア・ノドラム（分生子世代名フォーマ・ヘンネレルギー）ＮＢＲＣ７４８０、レプトスフェリア・ドリオラムＪＣＭ２７４２、レプトスフェリア・マクランス（分生子世代名フォーマ・リンガム）ＭＡＦＦ７２６５２８、プレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２、プレオスポラ・ベタエ（分生子世代名フォーマ・ベタエ）ＮＢＲＣ５９１８、オフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２０９）などが挙げられる。
【００２５】
これらの菌株のうち、アルスリニウム・エスピーＴＯ６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１１）、ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１０）、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２０９）は本発明者等が新規に単離した菌株であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
【００２６】
寄託したこれらの菌学的性質を示すと次の通りであり、以下のように同定した。
１．アルスリニウム・エスピー（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．）ＴＯ６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１１）について、宇田川俊一ら訳の「カビの分離・培養と同定」（医歯薬出版株式会社 １９８３）、宇田川俊一ら著の「菌類図鑑」（講談社サイエンティフィク １９８６）、Ｍ． Ｂ． Ｅｌｌｉｓ著「Ｄｍａｔａｃｅｏｕｓ Ｈｙｒｈｏｍｙｃｅｔｅｓ」（ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｂｕｒｅａｕｘ １９８８）を参考とし、その菌学的特性を検討した結果、
（1） 分生子は１細胞である。
（2） 分生子は外生する。
（3） 分生子は暗褐色である。
（4） 分生子は丸く、レンズ型で無色の帯がみられる。
（5） 分生子は分生子柄と１つの連結部で接する。
（6） 菌糸は有隔壁である。
（7） 分生子の大きさは６〜９μｍ×２〜４μｍである。
（8） 分生子柄は厚さ１．２〜２．５μｍである。
【００２７】
以上の形態的な特徴から、本菌株はアルスリニウム・サッカリコラ（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ Ｓａｃｃｈａｒｉｃｏｌａ）（分生子の大きさは９〜１０μｍ、分生子柄の厚さは２〜４μｍ）、アルスリニウム・ファエオスペルマム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｐｈａｅｏｓｐｅｒｍｕｍ）（分生子の大きさは９〜１０μｍ、分生子柄の厚さは１〜１．５μｍ）、アルスリニウム・サッカリ（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｉ）（分生子の大きさは６〜８μｍ、分生子柄の厚さは１〜１．５μｍ）のいずれかに分類されると思われるが、これらの菌株とは分生子の大きさや分生子柄の厚みが若干異なることから、本菌株をアルスリニウム・エスピー（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ ｓｐ．）と同定した。
【００２８】
培地における生育状況
（1）オートミール寒天培地、２５℃、６日間培養後、直径約８．５ｃｍもしくはそれ以上に達し、コロニー裏面は無色で、白色で羊毛状のコロニーの上に暗褐色の胞子（塊）がみられる。
（2）ポテトデキストロース寒天培地上、２５℃、６日間培養後、直径約８．５ｃｍもしくはそれ以上に達し、コロニー裏面は無色で、白色で羊毛状のコロニーになる。
２．ピレノケータ・エスピー（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．）ＹＨ８０７（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２１０）について、宇田川俊一ら訳の「カビの分離・培養と同定」（医歯薬出版株式会社 １９８３）、宇田川俊一ら著の「菌類図鑑」（講談社サイエンティフィク １９８６）、Ｂｒａｉａｎ Ｃ． Ｓｕｔｔｏｎ著「Ｔｈｅ Ｃｏｅｌｏｍｙｃｅｔｅｓ」（ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｂｕｒｅａｕｘ １９８０）を参考とし、その菌学的特性を検討した結果、
（1）分生子は楕円形で平滑な１細胞で、５〜７×１．５〜３．０μｍ。
（2）コロニーは暗緑褐色であり、色素は生成しない。
（3）胞子は連鎖せず、子実体（分生子殻）内部に形成される。
（4）菌糸は有隔壁である。
（5）分生子殻は暗褐色の球形〜亜球形もしくは倒洋ナシ形で１つの孔口をもつ。分生子殻は直径２００〜３００μｍで開口部周辺に剛毛を形成する。
【００２９】
以上の形態的な特徴から、本菌株はピレノケータ・ルビ-イダエイ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｒｕｂｉ-ｉｄａｅｉ）（分生子＞３．５μｍ×２．０〜２．５μｍ）に分類されると思われるが、これとは分生子のサイズが若干異なることから、本菌株をピレノケータ・エスピー（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ ｓｐ．）と同定した。
【００３０】
培地における生育状況
（1）オートミール寒天培地上、２５℃、６日間培養後、直径約２．３ｃｍもしくはそれ以上に達し、コロニー裏面は暗緑褐色で暗緑褐色のコロニーになる。培地中に色素は生産しない。気生菌糸は疎である。
（2）ポテトデキストロース寒天培地上、２５℃、６日間培養後、直径約２．０ｃｍもしくはそれ以上に達し、コロニー裏面は暗緑褐色で暗緑褐色のコロニーになる。オートミール寒天培地上よりも気生菌糸が認められる。
（3）ＹＭ寒天培地上、２５℃、６日間培養すると褐色〜黒色の子実体（分生子殻）が生じる。
３．カーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ）ＹＨ９２３（ＦＥＲＭ Ｐ−１９２０９）について、宇田川俊一ら訳の「カビの分離・培養と同定」（医歯薬出版株式会社 １９８３）、宇田川俊一ら著の「菌類図鑑」（講談社サイエンティフィク １９８６）、Ｍ． Ｂ． Ｅｌｌｉｓ著「Ｄｍａｔａｃｅｏｕｓ Ｈｙｒｈｏｍｙｃｅｔｅｓ」（ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｂｕｒｅａｕｘ １９８８）を参考とし、その菌学的特性を検討した結果、
（1）菌糸は有隔壁である。
（2）分生子はポロ型分生子で紡錘こん棒形、３つの隔壁を有し、ほとんど全てが下方より３番目の細胞がふくれている。基部にへそ（ｈｉｌｕｍ）があるが、顕著に突出していない。
（3）２番目の隔壁は正中にない。
（4）分生子の両端細胞はほとんど淡褐色、中間部細胞は褐色〜濃褐色、下方より３番目の細胞は最も濃色である。平坦でくびれなし、２６〜３４×１０〜１２μｍ。
（5）分生子柄は菌糸上に頂生または側生し、上方でしばしば湾曲し、ジグザグ状を呈する。
（6）分生子柄は無色〜淡褐色、平滑またはこぶ状、直径２．５〜４．０μｍ。
【００３１】
以上の形態的な特徴から、本菌株はカーブラリア・クラベータ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｃｌａｖａｔａ）と同定した。
培地における生育状況
（1）オートミール寒天培地、２５℃、７日間培養後、直径約５．５ｃｍもしくはそれ以上に達し、コロニー裏面及びコロニーは暗緑褐色で、ビロード状の気生菌糸が認められる。
（2）ポテトデキストロース寒天培地上、２５℃、７日間培養後、直径約４．０ｃｍもしくはそれ以上に達し、コロニー裏面は黒色で、灰白色で羊毛状の気生菌糸を形成する。
【００３２】
次に本発明に使用しうるＦＡＯＤ生産菌の培養方法について述べる。本発明ＦＡＯＤ生産菌の培養手段としては固体培養でも液体培養でもよいが、好ましくはフラスコまたはジャーファーメンター等による通気培養である。培地としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としてはグルコース、グリセロール、ソルビトール、ラクトースまたはマンノースなど、窒素源としては酵母エキス、肉エキス、トリプトン、ペプトンなど、無機塩としては塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなどを用いればよい。ｐＨはｐＨ５．０〜８．０、培養温度２５〜３７℃で目的とする酵素が最高力価となる培養時間、例えば2〜１０日間にて目的とする酵素を採取すればよい。
【００３３】
次いで酵素を採取するに当たっては培養液から菌体を遠心分離等によって分離し、菌体をリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液に懸濁した後、リゾチーム処理、超音波処理、ガラスビーズ破砕などの各種菌体破砕方法によって破砕して遠心分離し、可溶性画分を粗酵素液として回収する。
【００３４】
このようにして得られた粗製のＦＡＯＤ含有液を公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を用いて処理することにより、精製されたＦＡＯＤを得ることができる。例えばアセトン、エタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫安などによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、ゲルろ過法などの一般的な酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精製ＦＡＯＤを得ることができ、適宜安定化剤、例えばショ糖、グリセロールまたはアミノ酸などを１〜５０％程度、補酵素などを０．０１〜０．１％程度として単独または２種以上適宜組み合わせて加えて凍結保存してもよい。
【００３５】
つぎに本発明で得られるＦＡＯＤの酵素作用および酵素活性測定法を述べる。酵素作用
酸素の存在化、ＦＶＨに作用し、過酸化水素、グルコソン、およびバリルヒスチジンを生成させる。
酵素活性測定方法
測定試薬
５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１ｍＭ フルクトシルバリルヒスチジン
０．０２％ ４−アミノアンチピリン
0． ０２％ ＴＯＯＳ
５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ（メルク社製）
（ＴＯＯＳ：Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン）
測定試薬１ｍｌを光路長１ｃｍのセルにいれ、３７℃で５分間予備加温した後、０．０５ｍｌの酵素液を添加して５分間反応させる。反応後、０．５％ＳＤＳ（ソディウムドデシルスルフェイト）２ｍｌを添加して反応を停止させ、波長５５５ｎｍにおける吸光度（Ａａ）を測定する。また、ブランクとしてＦＶＨを含まない測定試薬を用いて同様の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）。この吸光度（Ａａ）とブランクの吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａａ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成させる酵素量とした。
【００３６】
次に本発明の酵素を用いた測定法について述べる。
【００３７】
本発明に使用しうる測定方法については前記糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異的に作用する酵素を用いた測定方法であればいかなる測定方法を用いても良いが、現在糖化ヘモグロビンの１デオキシフルクトシル基に直接作用する酵素は知られておらず、一度ヘモグロビンを断片化し、そのフラグメントに本発明の酵素を作用させれば良い。
【００３８】
ヘモグロビンの断片化方法としては化学法、酵素法が挙げられるが、その正確さ、簡便さから酵素法が好ましい。これまでヘモグロビンＡ１ｃのβ鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸を切り出すプロテアーゼが報告されておりこれら公知のプロテアーゼを用いればよいが、ヘモグロビンＮ末端の糖化アミノ酸を切り出すとα鎖由来のものかβ鎖由来のものか見分けがつかなくなるのでヘモグロビンＡ１ｃのＮ末端の２アミノ酸以上からなる、糖化ペプチドを切り出すプロテアーゼが好ましく、Ｎ末端の２アミノ酸を切り出すプロテアーゼが最も好ましい。
【００３９】
好ましいプロテアーゼの例を具体的に以下に挙げるが、これは１例に過ぎない。スミチームＰ（パパイン；新日本化学社製）、ビオプラーゼＳＰ-10、ビオプラーゼＡＬ１５ＦＧ（ナガセケムテックス社製）、オリエンターゼ１０Ｂ（阪急バイオインダストリー社製）、エンチロン（洛東化成工業）、プロテアーゼタイプＶＩＩＩ、プロテアーゼタイプＸＸＩＶ、プロテアーゼタイプＸＩＶ、 バチルスグロビギ（Bacillus globigii）由来プロテアーゼ、（以上シグマ社製）等。
【００４０】
本発明に於けるプロテアーゼの活性測定は、カゼイン−フォリン法で行った。活性の単位１Ｕは37℃、1分間に1ｇのチロシンに相当するフォリン試薬の発色を示す酵素量を1Ｕと定義した。
【００４１】
さらにプロテアーゼを用いたヘモグロビンの分解方法、試薬において、前記プロテアーゼを単独で使用することはもちろんであるが、加えてその反応前後若しくは同時に他のエンドプロテアーゼ、または他のエキソプロテアーゼを作用させても良い。
【００４２】
本発明の糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異的に作用する酵素を用いた測定方法に於ける酵素作用の検出は、例えばデヒドロゲナーゼを用いた場合には補酵素の変化量を、例えば補酵素としてＮＡＤを用いて生成される変化の量として還元型補酵素である還元型ＮＡＤをその極大吸収波長域である３４０ｎｍ付近の波長にて比色計で測定する等公知の技術を用い直接定量するか、若しくは生じた還元型補酵素を各種ジアフォラーゼ、またはフェナジンメトサルフェート等の電子キャリアー及びニトロテトラゾリウム、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８（以上同人化学研究所社製）に代表される各種テトラゾリウム塩等の還元系発色試薬を用い間接的に定量してもよく、またこれ以外の公知の方法により直接、間接的に測定してもよい。
【００４３】
また例えばオキシダーゼを用いた場合には、酸素の消費量または反応生成物の量を測定することが好ましい。反応生成物として、例えばケトアミンオキシダーゼを用いた場合には反応により過酸化水素及びグルコソンが生成し、過酸化水素及びグルコソン共に公知の方法により直接、間接的に測定する事が出来る。
【００４４】
上記過酸化水素の量は、例えばパーオキシダーゼ等を用いて色素等を生成し、発色、発光、蛍光等により定量しても良く、また電気化学的手法によって定量しても良く、カタラーゼ等を用いてアルコールからアルデヒドを生成せしめて、生じたアルデヒドの量を定量しても良い。
【００４５】
過酸化水素の発色系は、パーオキシダーゼの存在下で４−ＡＡ若しくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等のカップラーとフェノール等の色原体との酸化縮合により色素を生成するトリンダー試薬、パーオキシダーゼの存在下で直接酸化、呈色するロイコ型試薬（Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＤＡ６７）；以上和光純薬社製等）等を用いることが出来る。
【００４６】
また過酸化水素を電極を用いて測定する場合、電極には、過酸化水素との間で電子を授受する事の出来る材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金若しくは銀等が挙げられ、電極測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー等の公知の方法を用いることが出来、さらにオキシダーゼまたは基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を測定しても良い。電子伝達体としては電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成する過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電流またはその電気量を測定しても良い。
【００４７】
本発明の酵素を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定用試薬の液組成については、使用するプロテアーゼ及び糖化ヘモグロビン瘢スN端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異的に作用する酵素の至適ｐＨを考慮し、反応が効率よく進行するようにｐＨ及びプロテアーゼ濃度を決定すればよい。
【００４８】
例えばスミチームＰ（パパイヤ由来、新日本化学社製）をプロテアーゼとして用いる場合には、タンパク質分解活性がｐＨ５．５〜９．０付近で強いことから、反応のｐＨは５．５〜９．０を選択することができる。またプロテアーゼ濃度は実際に使用される反応時間中に被検液中のタンパク質を十分に分解し得る濃度で有れば良く0.01〜1000U/mlが好ましく、0.1 〜500U/ml がさらに好ましい。
【００４９】
また、例えば糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異的に作用する酵素としてフルクトシルアミンオキシダーゼ（Arthrinium sp. TO6由来）を用いる場合、至適ｐＨが７〜８であり、反応のpHは７〜８を選択できる。また酵素添加濃度は実際に使用される反応時間中に被検液から生成された糖化アミノ酸を十分に測定し得る濃度で有れば良く、0.01U〜1000U/mlが好ましく、0.1U〜500U/mlがより好ましく、0.5U〜100U/mlが最も好ましい。
【００５０】
本発明に於ける糖化タンパク質定量用試薬としては、糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異的に作用する酵素を含有するものとして調製すれば良く、好ましくはプロテアーゼ及び該糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異的に作用する酵素を含有するものとして調整すれば良く、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供できる。
【００５１】
さらに、本発明に基づく糖化蛋白質を定量する酵素反応組成には、例えば界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加しても良い。
【００５２】
かくして調整された本発明のヘモグロビンＡ１ｃ測定用試薬を用いて、被検液中の糖化ヘモグロビンを測定するには、測定用試薬０．０１〜５．０ｍｌに溶血された被検液０．００１〜０．５ｍｌを加え、３７℃の温度にて反応させ、レートアッセイを行う場合には、反応開始後の一定時間後の２点間の数分ないし数十分間、例えば３分後と４分後の１分間、または３分ごと８分後の５分間における変化した補酵素、溶存酸素、過酸化水素若しくはその他生成物の量を直接または間接的に前記の方法で測定すれば良く、エンドポイントアッセイの場合には反応開始後一定時間後の変化した補酵素、溶存酸素、過酸化水素若しくはその他生成物の量を同様に測定すれば良い。この場合既知濃度のヘモグロビンＡ１ｃを含む試料を用いて測定した場合の吸光度等の変化と比較すれば被検液中のヘモグロビンＡ１ｃの量を求めることができる。
【００５３】
ここで述べた溶血された披検液とは、溶血操作を行った後のヘモグロビンＡ１ｃを含有する被検液であり、さらに詳しくは、全血遠心分離された赤血球、洗浄赤血球等の溶血液が挙げられる。
【００５４】
【実施例】
本発明を実施例に基づいて説明する。
【００５５】
【実施例１】
ネオコスモスポラ・バシンフェクタＮＢＲＣ７５９０菌株由来のＦＡＯＤの培養方法、精製方法および理化学的性質
＜培養方法および精製方法＞
５００ｍｌの三角フラスコ３本に１００ｍｌの２％のマンノース、３％の酵母エキス、０．１％のＫＨ2ＰＯ4、０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含有する培地（ｐＨ６．０）をそれぞれ入れ、殺菌後、ネオコスモスポラ・バシンフェクタＮＢＲＣ７５９０菌株を植菌し、２８℃、４日間振とう培養した。
【００５６】
培養終了後、集菌し、３００ｍｌの１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁させ、超音波破砕により菌体の可溶化を行った（１０Ｕ）。この可溶化液を１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１晩透析させた後、Ｑ−セファロース・ビッグビーズ（１００ｍｌ）樹脂（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は０~１Ｍのリニアグラジエントにより行い、０．２〜０．３ＭのＮａＣｌの溶出画分（９Ｕ）を回収した。
【００５７】
この酵素液に１５％硫酸アンモニウムの濃度となるように硫酸アンモニウムを溶解し、フェニルセファロース・ファーストフロー（５０ｍｌ）（ファルマシア社製）の疎水クロマトグラフィーを行った。溶出は１５〜０Ｍの硫酸アンモニウムのリニアグラジエントにより行い、５〜２％の硫酸アンモニウムの溶出画分（７Ｕ）を回収した。ついで、この酵素液を１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて1晩透析し、ハイドロキシアパタイト（３０ｍｌ）（ペンタックス社製）クロマトグラフィーを行った。溶出は０~０．１Mのリン酸緩衝液（ｐH７．０）によるリニアグラジエントにより行い、０．０３~０．０４Mのリン酸緩衝液の溶出画分（３U）を回収し、精製ＦＡＯＤを得た。
【００５８】
＜理化学的性質＞
（１）基質特異性
本発明ネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ＦＡＯＤの各種基質に対する特異性は表 の通りである。ＦＶに対して最も高い反応性を示し、ＦＶＨに対してＦVの２９％反応し、ＦＶＬには全く作用しなかった。
（２）Ｋｍ値
本発明ネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来ＦＡＯＤのＦＶＨに対するＫｍ値は３mMであった。
（３）至適ｐＨ
前記酵素活性測定法に従って至適ｐHを求めたもので、その結果を図１に示した。ｐH４．５〜５．５の範囲は100mMの酢酸緩衝液（図中、○）、ｐH５〜６の範囲は１００ｍＭのクエン酸緩衝液（図中、□）、ｐＨ６〜７．５の範囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液（図中、△）７．５〜９の範囲は１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（図中、●）、ｐＨ９．５〜１０の範囲は１００ｍＭのグリシン緩衝液（図中、黒四角）を使用した場合の活性値を示すもので、至適ｐＨは６．３〜６．７にあった。
（４）ｐＨ安定性
０．５Ｕ／ｍｌの本発明ステフィリウム・エスピー由来ＦＡＯＤを１００ｍＭの各種緩衝液中で３７℃、１時間処理し、その残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果を図２に示した。ｐH４．５〜５．５の範囲は100mMの酢酸緩衝液（図中、○）、ｐH５〜６の範囲は１００ｍＭのクエン酸緩衝液（図中、□）、ｐＨ６〜７．５の範囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液（図中、△）７．５〜９の範囲は１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（図中、●）、ｐＨ９．５〜１０の範囲は１００ｍＭのグリシン緩衝液（図中、黒四角）を使用した。ｐＨ５．７５〜７．３６の範囲で良好な安定性を示した。
（５）至適温度
前記酵素活性測定法に従って、温度３０〜６０℃の範囲で変化させて至適温度を求めた結果は図３に示す通りであり、至適温度は４５−５０℃であった。
（６）熱安定性
０．５Ｕ／ｍｌの本発明ステフィリウム・エスピー由来ＦＡＯＤを１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で各温度で１０分間加熱処理した後の残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果、図４に示す通り、少なくとも４５℃、１０分間加熱処理における残存活性が少なくとも８０％以上を示した。
（７）分子量
ＴＳＫ Ｇ−３０００ＳＷＸＬ（トーソー社製）を用いたHPLCにより分子量を測定した。その結果、分子量は３７，０００であった。
【００５９】
以上の結果を上記表２にまとめた。
【００６０】
【実施例２】
コニオケチジウム・サボリＡＴＣＣ菌株由来のＦＡＯＤの培養方法、精製方法および酵素学的性質
＜培養法および精製方法＞
実施例１で記載した培養方法により培養を行った。
【００６１】
培養終了後、集菌し、３００ｍｌの１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁させ、超音波破砕により菌体の可溶化を行った（１５Ｕ）。この可溶化液を１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１晩透析させた後、Ｑ−セファロース・ビッグビーズ（１００ｍｌ）樹脂（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は０~１Ｍのリニアグラジエントにより行い、０．１５〜０．２５ＭのＮａＣｌの溶出画分（１３Ｕ）を回収した。
【００６２】
この酵素液に１５％硫酸アンモニウムの濃度となるように硫酸アンモニウムを溶解し、フェニルセファロース・ファーストフロー（５０ｍｌ）（ファルマシア社製）の疎水クロマトグラフィーを行った。溶出は１５〜０Ｍの硫酸アンモニウムのリニアグラジエントにより行い、４〜０％の硫酸アンモニウムの溶出画分（８Ｕ）を回収した。ついで、この酵素液を１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて1晩透析し、ハイドロキシアパタイト（３０ｍｌ）（ペンタックス社製）クロマトグラフィーを行った。溶出は０~０．１Mのリン酸緩衝液（ｐH７．０）によるリニアグラジエントにより行い、０．０３~０．０４Mのリン酸緩衝液の溶出画分（４U）を回収し、精製ＦＡＯＤを得た。
【００６３】
＜理化学的性質＞
（１）基質特異性
本発明コニオケチジウム・サボリ由来ＦＡＯＤの各種基質に対する特異性は表の通りである。ＦＶに対して最も高い反応性を示し、ＦＶＨに対してはＦＶの２６％反応し、ＦＶＬには全く作用しなかった。
（２）Ｋｍ値
本発明コニオケチジウム・サボリ由来ＦＡＯＤのＦＶＨに対するＫｍ値は１．６mMであった。
（３）至適ｐＨ
実施例１と同様にして至適ｐHを求めたもので、至適ｐＨは６．３〜６．７にあった。
（４）ｐＨ安定性
実施例１と同様にしてｐＨ安定性を求めたもので、ｐＨ５．８〜７の範囲で良好な安定性を示した。
（５）至適温度
実施例１と同様にして至適温度を求めたもので、至適温度は３７℃であった。
（６）熱安定性
実施例１と同様にして至適温度を求めたもので、少なくとも３７℃、１０分間加熱処理における残存活性が少なくとも８０％以上を示した。
（７）分子量
ＴＳＫ Ｇ−３０００ＳＷＸＬ（トーソー社製）を用いたHPLCにより分子量を測定した。その結果、分子量は２７，０００であった。
【００６４】
以上の結果の結果は上記表２にまとめた。
【００６５】
【実施例３】
アルスレニウム・エスピーＴＯ６（ＦＥＲＭＰ−１９２１１）菌株由来のＦＡＯＤの培養方法、精製方法および酵素学的性質
＜培養方法＞
５００ｍｌ容坂口フラスコに１００ ｍｌのＹＭＧ培地（１．０％グルコース、１．０％ポリペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス、０．１％ KH2PO4、０．０５％ MgSO4・７H2O、pH ６．０）を入れ、殺菌後、アルスレニウム・エスピーＴＯ６を植菌し、３０℃、４日間振盪培養した。
＜精製方法＞
液体窒素で凍結した菌体を乳鉢で磨砕して菌体破砕を行い、４０ ｍｌの０．１Mトリス塩酸緩衝液(pH ７．３)を加えて、５℃で１晩放置した後、遠心分離して無細胞抽出液を得た。得られた無細胞抽出液に４０ ％ 飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、遠心分離した上清を４０％ 飽和硫酸アンモニウムを加えた ０．１ Mトリス塩酸緩衝液（pH ７．３）で平衡化した Ｂｕｔｙｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０M (１８f×１５０ ｍｍ, 東ソー製) のカラムに供与し、１０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加えた ０．１ M トリス塩酸緩衝液（pH７．３）で洗浄を行い、０．１ M トリス塩酸 緩衝液（pH ７．３）で溶出した。その溶出液の活性画分に４０ ％ 飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、４０％ 飽和硫酸アンモニウムを加えた０．１ Mトリス塩酸緩衝液（pH ７．３）で平衡化した Phenyl-５PW (８．０f×７．５ ｍｍ, 東ソー製) のHPLCカラムに供与し、４０％ から ０％ までの飽和硫酸アンモニウムのリニアグラジエントで溶出した。その活性画分を ５０ ｍＭ トリス塩酸 緩衝液（pH ７．３）で透析した後、同緩衝液で平衡化した Ｐｏｒｏｓ HQ／H (４．６f×５０ ｍｍ, アプライドバイオシステムズ製) のカラムに供与し、０ から ０．５ M までの ＮａＣｌ のリニアグラジエントで溶出した。活性画分を回収し、蒸留水に対して透析し、精製ＦＡＯＤを得た。精製の過程を下記表にまとめた。
【００６６】
【表４】
＜理化学的性質＞
（１）基質特異性
本発明のアルスレニウム・エスピーＴＯ６由来ＦＡＯＤの各種基質に対する特異性は表３の通りである。反応時の各基質濃度を １ｍＭ とした。その他の反応条件は活性測定法に準じた。アルスレニウム・エスピーＴＯ６由来ＦＡＯＤはＦＶに対して最も高い反応性を示し、かつ、ＦＶＨにも高く反応するが、ＦＶＬへの作用はＦＶＨと比較して約４０分の１であり、本酵素はＦＶＬへ実質的に作用しないといえる。
（２）Ｋｍ値
本発明のアルスレニウム・エスピーＴＯ６由来ＦＡＯＤのＦＶＨに対するＫｍ値は０．４２ｍＭであった。
（３）至適ｐＨ
ＦＶＨを1mMになるように溶解したｐＨ３．０〜１１．０の各種緩衝液（ｐＨ３〜５は１０ｍＭの酢酸緩衝液、ｐH５〜７は１０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ７〜９は１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液、ｐＨ９〜１１は１０ｍＭのホウ酸緩衝液）０．４５ｍｌを光路長１ｃｍのセルにいれ、３７℃で５分間予備加温した後、０．０５ｍｌの酵素液を添加して３０分間反応させた。反応後、測定試薬（０．０４％ ＴＯＯＳ、０．０４％ ４-アミノアンチピリン、パーオキシダーゼ５０Uを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．５））０．５ｍｌを加え、２分間発色させた後、０．５％ＳＤＳ２ｍｌを添加して反応を停止させ、波長５５５ｎｍにおける吸光度（Ａａ）を測定した。また、ブランクとして基質を含まない各種緩衝液を加え、同様の操作を行って吸光度を測定した（Ａｂ）。この吸光度（Ａａ）とブランクの吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａａ−Ａｂ）より酵素活性を求めた。
【００６８】
その結果、アルスレニウム・エスピーＴＯ６由来ＦＡＯＤの至適ｐＨは７〜８にあった。
（４）ｐＨ安定性
酵素液を１０ｍＭの各種緩衝液中で４℃、２４時間処理し、その残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果、本発明のアルスレニウム・エスピーＴＯ６由来ＦＡＯＤはｐＨ７〜１１の範囲で良好な安定性を示した。
（５）至適温度
ＦＶＨを1mMになるように溶解した１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．４５ｍｌを光路長１ｃｍのセルにいれ、１５〜６０℃で５分間予備加温した後、０．０５ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させた。反応後氷中で冷却した後、測定試薬（０．０４％ ＴＯＯＳ、０．０４％ ４-アミノアンチピリン、パーオキシダーゼ５０Uを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．５））０．５ｍｌを加え、２分間発色させた後、０．５％ＳＤＳ２ｍｌを添加して反応を停止させ、波長５５５ｎｍにおける吸光度（Ａａ）を測定した。また、ブランクとしてＦＶＨを含まない各種緩衝液を加え、同様の操作を行って吸光度を測定した（Ａｂ）。この吸光度（Ａａ）とブランクの吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａａ−Ａｂ）より酵素活性を求めた。
【００６９】
１５〜６０℃の範囲で変化させて至適温度を求めた結果、本発明のアルスレニウム・エスピーＴＯ６由来ＦＡＯＤの至適温度は３０〜４０℃であった。
（６）熱安定性
酵素液を１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で各温度３０分間加熱処理した後の残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果、本発明のアルスレニウム・エスピーＴＯ６由来ＦＡＯＤは４０℃・３０分間の加熱処理までは８０％以上の残存活性を示した。
（７）分子量
ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ-２００G（φ６．０×３００ ｍｍ、ワイエムシー製）によるゲル濾過から本酵素の分子量を求めた。標準蛋白質として牛血清アルブミン、オボアルブミン、大豆トリプシンインヒビター（全てシグマ製）を使用した。その結果、本酵素の分子量は約３４,０００であった。
【００７０】
Ｌａｅｍｍｌｉの方法での １０％ ｇｅｌ による ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）では、分子量は約 ５０,０００ であった。尚、標準蛋白質は SDS-PAGE スタンダード Ｌｏｗ (バイオラッド社製) を使用した。
【００７１】
以上の結果から、本発明のアルスレニウム・エスピーＴＯ６由来ＦＡＯＤは単量体であることが明らかである。
【００７２】
【実施例４】
ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７（ＦＥＲＭＰ−１９２１０菌株）菌株由来のＦＡＯＤの培養方法、精製方法および酵素学的性質
＜培養方法及び精製方法＞
実施例３で記載した製造及び精製法と同様の方法により活性画分を回収し、蒸留水に対して透析し、精製ＦＡＯＤを得た。精製の過程を下記表にまとめた。
【００７３】
【００７４】
【表５】
＜理化学的性質＞
（１）基質特異性
本発明のピレノケータ・エスピーＹＨ８０７由来ＦＡＯＤの各種基質に対する特異性は表３の通りである。反応時の各基質濃度を １ｍＭ とした。その他の反応条件は活性測定法に準じた。ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７由来ＦＡＯＤはＦＶに対して最も高い反応性を示し、かつ、ＦＶＨにも高く反応するが、ＦＶＬへの作用はＦＶＨと比較して約１６０分の１であり、本酵素はＦＶＬへ実質的に作用しないといえる。
（２）Ｋｍ値
本発明のピレノケータ・エスピーＹＨ８０７由来ＦＡＯＤのＦＶＨに対するＫｍ値は０．９９ｍＭであった。
（３）至適ｐＨ
実施例３の（３）で記載した方法により本酵素の至適ｐＨを調べた結果、至適ｐＨは７〜８にあった。
（４）ｐＨ安定性
実施例３の（４）で記載した方法によりピレノケータ・エスピーＹＨ８０７由来ＦＡＯＤのｐＨ安定性を調べた結果、ｐＨ７〜１１の範囲で良好な安定性を示した。
（５）至適温度
実施例３の（５）で記載した方法に従って至適温度を求めた結果、本発明のピレノケータ・エスピーＹＨ８０７由来ＦＡＯＤの至適温度は３０〜４０℃であった。
（６）熱安定性
実施例３の（６）で記載した方法に従って熱安定性を求めた結果、ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７由来ＦＡＯＤの熱安定性は、４０℃・３０分間の加熱処理までは８０％以上の残存活性を示した。
（７）分子量
実施例３の（７）で記載した方法に従ってゲル濾過ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量を求めた結果、ピレノケータ・エスピーＹＨ８０７由来ＦＡＯＤの分子量はゲル濾過法で約３４,０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約５０,０００であった。この結果から、本発明のピレノケータ・エスピーＹＨ８０７由来ＦＡＯＤは単量体であることが明らかである。
【００７６】
【実施例５】
カーブラリア・クラベータＹＨ９２３（ＦＥＲＭＰ−１９２０９）菌株由来のＦＡＯＤの培養方法、精製方法および酵素学的性質について
＜培養方法および精製方法＞
実施例３で記載した製造及び精製法と同様の方法により活性画分を回収し、蒸留水に対して透析し、精製ＦＡＯＤを得た。精製の過程を下記表にまとめた。
【００７７】
【表６】
理化学的性質
（１）基質特異性
本発明のカーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ＦＡＯＤの各種基質に対する特異性は表３の通りである。反応時の各基質濃度を １ｍＭ とした。その他の反応条件は活性測定法に準じた。カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ＦＡＯＤはＦＶに対して最も高い反応性を示し、かつ、ＦＶＨにも高く反応するが、ＦＶＬへの作用はＦＶＨと比較して約３０分の１であり、本酵素はＦＶＬへ実質的に作用しないといえる。
（２）Ｋｍ値
本発明のカーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ＦＡＯＤのＦＶＨに対するＫｍ値は０．９５ｍＭであった。
（３）至適ｐＨ
実施例３の（３）で記載した方法により本酵素の至適ｐＨを調べた結果、至適ｐＨは７〜８にあった。
（４）ｐＨ安定性
実施例３の（４）で記載した方法によりカーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ＦＡＯＤのｐＨ安定性を調べた結果、ｐＨ７〜１１の範囲で良好な安定性を示した。
（５）至適温度
実施例３の（５）で記載した方法に従って至適温度を求めた結果、本発明のカーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ＦＡＯＤの至適温度は５０〜５５℃であった。
（６）熱安定性
実施例３の（６）で記載した方法に従って熱安定性を求めた結果、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ＦＡＯＤの熱安定性は、５０℃・３０分間の加熱処理までは８０％以上の残存活性を示した。
（７）分子量
実施例３の（７）で記載した方法に従ってゲル濾過ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量を求めた結果、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ＦＡＯＤの分子量はゲル濾過法で約３４,０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約５０,０００であった。この結果から、本発明のカーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来ＦＡＯＤは単量体であることが明らかである。
【００７９】
【実施例６】
レプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０菌株由来ＦＡＯＤの製造及び精製
＜培養方法及び精製方法＞
実施例３で記載した製造及び精製法と同様の方法により活性画分を回収し、蒸留水に対して透析し、精製ＦＡＯＤを得た。精製の過程を下記表６にまとめた。
【００８０】
【表７】
理化学的性質
（１）基質特異性
本発明のレプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤの各種基質に対する特異性は表３の通りである。反応時の各基質濃度を １ｍＭ とした。その他の反応条件は活性測定法に準じた。レプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤはＦＶに対して最も高い反応性を示し、かつ、ＦＶＨにも高く反応するが、ＦＶＬへの作用はＦＶＨと比較して約５分の１であり、本酵素はＦＶＬへ実質的に作用しないといえる。
（２）Ｋｍ値
本発明のレプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤのＦＶＨに対するＫｍ値は０．８５ｍＭであった。
（３）至適ｐＨ
実施例３の（３）で記載した方法によりレプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤの至適ｐＨを調べた結果、至適ｐＨは７〜８にあった。
（４）ｐＨ安定性
実施例３の（４）で記載した方法によりレプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤのｐＨ安定性を調べた結果、ｐＨ７〜１１の範囲で良好な安定性を示した。
（５）至適温度
実施例３の（５）で記載した方法に従って至適温度を求めた結果、本発明のレプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤの至適温度は３０〜４０℃であった。
（６）熱安定性
実施例３の（６）で記載した方法に従って熱安定性を求めた結果、レプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤの熱安定性は、４０℃・３０分間の加熱処理までは８０％以上の残存活性を示した。
（７）分子量
実施例３の（７）で記載した方法に従ってゲル濾過ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量を求めた結果、レプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤの分子量はゲル濾過法で約３４,０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約５０,０００であった。この結果から、本発明のレプトスフェリア・ノドラムＮＢＲＣ７４８０由来ＦＡＯＤは単量体であることが明らかである。
【００８２】
【実施例７】
プレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２菌株由来のＦＡＯＤの培養方法、精製方法および酵素学的性質
＜培養方法及び精製方法＞
実施例３で記載した製造及び精製法と同様の方法により活性画分を回収し、蒸留水に対して透析し、精製ＦＡＯＤを得た。精製の過程を下記表７にまとめた。
【００８３】
【表８】
理化学的性質
（１）基質特異性
本発明のプレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２由来ＦＡＯＤの各種基質に対する特異性は表３の通りである。反応時の各基質濃度を１ｍＭ とした。その他の反応条件は活性測定法に準じた。プレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２由来ＦＡＯＤはＦＶに対して最も高い反応性を示し、かつ、ＦＶＨにも高く反応するが、ＦＶＬへの作用はＦＶＨと比較して約１５６分の１であり、本酵素はＦＶＬへ実質的に作用しないといえる。
（２）Ｋｍ値
本発明のプレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２由来ＦＡＯＤのＦＶＨに対するＫｍ値は０．８ｍＭであった。
（３）至適ｐＨ
実施例３の（３）で記載した方法により本酵素の至適ｐＨを調べた結果、至適ｐＨは７〜８にあった。
（４）ｐＨ安定性
実施例３の（４）で記載した方法によりプレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２由来ＦＡＯＤのｐＨ安定性を調べた結果、ｐＨ７〜１１の範囲で良好な安定性を示した。
（５）至適温度
実施例３の（５）で記載した方法に従って至適温度を求めた結果、プレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２由来ＦＡＯＤの至適温度は３０〜４０℃であった。
（６）熱安定性
実施例３の（６）で記載した方法に従って熱安定性を求めた結果、プレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２由来ＦＡＯＤの熱安定性は、４０℃・３０分間の加熱処理までは８０％以上の残存活性を示した。
（７）分子量
実施例３の（７）で記載した方法に従ってゲル濾過ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量を求めた結果、プレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２由来ＦＡＯＤの分子量はゲル濾過法で約３４,０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約５０,０００であった。この結果から、本発明のプレオスポラ・ハーブラムＮＢＲＣ３２０１２由来ＦＡＯＤは単量体であることが明らかである。
【００８５】
【実施例８】
オフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８菌株由来のＦＡＯＤの培養方法、精製方法および酵素学的性質
＜培養方法＞
５００ｍｌ容坂口フラスコに１００ ｍｌのＹＭＧ培地（１．０％グルコース、１．０％ポリペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％麦芽エキス、０．１％ KH2PO4、０．０５％ MgSO4・７H2O、pH ６．０）を入れ、殺菌後、ＦＡＯＤ生産菌株を植菌し、３０℃、１０日間振盪培養した。
＜精製方法＞
実施例で記載した精製法と同様の方法により活性画分を回収し、蒸留水に対して透析し、精製ＦＡＯＤを得た。精製の過程を下記表にまとめた。
【００８６】
【表９】
理化学的性質
（１）基質特異性
本発明のオフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤの各種基質に対する特異性は表３の通りである。反応時の各基質濃度を １ｍＭ とした。その他の反応条件は活性測定法に準じた。オフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤはＦＶに対して最も高い反応性を示し、かつ、ＦＶＨにも高く反応するが、ＦＶＬへの作用はＦＶＨと比較して約１５６分の１であり、本酵素はＦＶＬへ実質的に作用しないといえる。
（２）Ｋｍ値
本発明のオフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤのＦＶＨに対するＫｍ値は０．８ｍＭであった。
（３）至適ｐＨ
実施例３の（３）で記載した方法によりオフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤの至適ｐＨを調べた結果、至適ｐＨは７〜８にあった。
（４）ｐＨ安定性
実施例３の（４）で記載した方法によりオフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤのｐＨ安定性を調べた結果、ｐＨ７〜１１の範囲で良好な安定性を示した。
（５）至適温度
実施例３の（５）で記載した方法に従って至適温度を求めた結果、本発明のオフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤの至適温度は３０〜４０℃であった。
（６）熱安定性
実施例３の（６）で記載した方法に従って熱安定性を求めた結果、オフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤの熱安定性は、４０℃・３０分間の加熱処理までは８０％以上の残存活性を示した。
（７）分子量
実施例３の（７）で記載した方法に従ってゲル濾過ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量を求めた結果、オフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤの分子量はゲル濾過法で約３４，０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約５０，０００であった。この結果から、本発明のオフィオボラス・ヘルポトリカスＮＢＲＣ６１５８由来ＦＡＯＤは単量体であることが明らかである。
【００８８】
【実施例９】
ヘモグロビンＡ１ｃの測定
＜本発明のプロテアーゼを用いた糖化ヘモグロビンの測定＞
上記溶血試薬０．９ｍｌに全血より分離した赤血球若しくは標準糖化ペプチド溶液０．１ｍｌを添加し、３７℃−１０分間インキュベーションし溶血試料とした。溶血試料はヘモグロビン濃度を求める目的でＡ５７０ｎｍを測定した。続いてＲ１試薬２４０μｌおよび溶血試料６μｌを混合し、３７℃５分反応を行い７５０ｎｍを測光した（Ａ０）。さらにＲ２試薬６０μlを添加し３７℃−５分間インキュベーションし７５０ｎｍを測光した（Ａ１）。ブランクの測定は、試料に蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔＡ＝Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）を測定した。また試料に検体及び糖化ヘモグロビン値既知の試料を用いて感度（感度ΔＡ＝（Ａ１-Ａ０）−ブランクΔＡ）を求め、糖化ヘモグロビン濃度を算出した。さらに糖化ヘモグロビン濃度をヘモグロビン濃度で除し、糖化ヘモグロビン値を算出した。
＜試料＞
健常者全血５検体、糖尿病患者全血５検体
１００μＭ、８０μＭ、６０μＭ、４０μＭ、２０μＭのＦＶＨ若しくはＦＶＬ
＜ヘモグロビンＡ１ｃのＨＰＬＣを用いた測定＞
ＨＰＬＣ法の測定はＨｂＡ１ｃ測定装置（アークレイ社製）にて測定した。
標準糖化ペプチド（ＦＶＨ，ＦＶＬ）の測定結果を図５に、検体の測定結果を表９に示す。
【００８９】
【表１０】
図５から分かるように、本発明の酵素を用いた測定試薬はＦＶＬには作用せず、ＦＶＨにのみ作用することから、正確にヘモグロビンβ鎖Ｎ末端の糖化ペプチドのみを検出できることが明らかであり、糖化ヘモグロビンではなくヘモグロビンＡ１ｃを正確に測定していることが明らかであった。
また表１０よりＨＰＬＣ法で測定したヘモグロビンＡ１ｃの測定値と酵素法の値が極めて良く一致することから、正確にヘモグロビンＡ１ｃを測定していることが明白であった。
【００９１】
【発明の効果】
本発明の糖化ヘモグロビンα鎖N端の糖化ペプチドよりも、糖化ヘモグロビンβ鎖N端の糖化ペプチドに特異性の高い酵素、該酵素を用いた測定方法、試薬を用いろことにより、ヘモグロビンＡ１ｃをより簡便、正確、安価に測定することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来のＦＡＯＤの至適ｐＨ曲線を示す。
【図２】図２はネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来のＦＡＯＤのｐＨ安定性曲線を示す。
【図３】図３はネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来のＦＡＯＤの至適温度曲線を示す。
【図４】図４はネオコスモスポラ・バシンフェクタ由来のＦＡＯＤの熱安定性曲線を示す。
【図５】図５は標準糖化ペプチド（ＦＶ、ＦＶＨ）の測定曲線を示す。
Claims (20)
- １−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシン（FVL）よりも、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジン（FVH）に特異性の高い酵素（フルクトシルアミンオキシダーゼ）であって、以下の性質を有する酵素；
（１）分子量（Ｄａ）：３７，０００（ゲルろ過法）
（２）基質特異性：FVHに対する活性を２９とした場合のFVLに対する活性が０
（３）至適ｐH：６．３〜６．７
（４）至適温度：４５〜５０℃ - １−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシン（FVL）よりも、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジン（FVH）に特異性の高い酵素（フルクトシルアミンオキシダーゼ）であって、以下の性質を有する酵素；
（１）分子量（Ｄａ）：２７，０００（ゲルろ過法）
（２）基質特異性：FVHに対する活性を２６とした場合のFVLに対する活性が０
（３）至適ｐH：６．３〜６．７
（４）至適温度：３７℃ - １−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシン（FVL）よりも、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジン（FVH）に特異性の高い酵素（フルクトシルアミンオキシダーゼ）であって、以下の性質を有する酵素；
（１）分子量（Ｄａ）：５０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
（２）基質特異性：FVHに対する活性を１６．１とした場合のFVLに対する活性が０．４
（３）至適ｐH：７〜８
（４）至適温度：３０〜４０℃ - １−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシン（FVL）よりも、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジン（FVH）に特異性の高い酵素（フルクトシルアミンオキシダーゼ）であって、以下の性質を有する酵素；
（１）分子量（Ｄａ）：５０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
（２）基質特異性：FVHに対する活性を１８．０とした場合のFVLに対する活性が０．１
（３）至適ｐH：７〜８
（４）至適温度：３０〜４０℃ - １−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシン（FVL）よりも、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジン（FVH）に特異性の高い酵素（フルクトシルアミンオキシダーゼ）であって、以下の性質を有する酵素；
（１）分子量（Ｄａ）：５０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
（２）基質特異性：FVHに対する活性を２０．４とした場合のFVLに対する活性が０．７
（３）至適ｐH：７〜８
（４）至適温度：５０〜５５℃ - １−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシン（FVL）よりも、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジン（FVH）に特異性の高い酵素（フルクトシルアミンオキシダーゼ）であって、以下の性質を有する酵素；
（１）分子量（Ｄａ）：５０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
（２）基質特異性：FVHに対する活性を１１．８とした場合のFVLに対する活性が２．４
（３）至適ｐH：７〜８
（４）至適温度：３０〜４０℃ - １−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシン（FVL）よりも、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジン（FVH）に特異性の高い酵素（フルクトシルアミンオキシダーゼ）であって、以下の性質を有する酵素；
（１）分子量（Ｄａ）：５０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
（２）基質特異性：FVHに対する活性を２７．６とした場合のFVLに対する活性が０．２
（３）至適ｐH：７〜８
（４）至適温度：３０〜４０℃ - １−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロイシン（FVL）よりも、１−デオキシフルクトシル−Ｌ−バリル−Ｌ−ヒスチジン（FVH）に特異性の高い酵素（フルクトシルアミンオキシダーゼ）であって、以下の性質を有する酵素；
（１）分子量（Ｄａ）：５０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
（２）基質特異性：FVHに対する活性を１６．２とした場合のFVLに対する活性が０．６
（３）至適ｐH：７〜８
（４）至適温度：３０〜４０℃ - 請求項１に記載の酵素の製造方法であって、ネオコスモスポラ属の菌の培養物から製造する方法。
- 請求項２に記載の酵素の製造方法であって、コニオケチジウム属の菌の培養物から製造する方法。
- 請求項３に記載の酵素の製造方法であって、アルスリニウム属の菌の培養物から製造する方法。
- 請求項４に記載の酵素の製造方法であって、ピレノケータ属の菌の培養物から製造する方法。
- 請求項５に記載の酵素の製造方法であって、カーブラリア属の菌の培養物から製造する方法。
- 請求項６に記載の酵素の製造方法であって、レプトスフェリア属の菌の培養物から製造する方法。
- 請求項７に記載の酵素の製造方法であって、プレオスポラ属の菌の培養物から製造する方法。
- 請求項８に記載の酵素の製造方法であって、オフィオボラス属の菌の培養物から製造する方法。
- 請求項１〜８のいずれかに記載の酵素を用いることを特徴とする、アマドリ化合物の測定方法。
- アマドリ化合物がヘモグロビンＡ１ｃであることを特徴とする請求項１７に記載の測定方法。
- 請求項１〜８のいずれかに記載の酵素を含有する試薬。
- プロテアーゼを含有する請求項１９に記載の試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003067266A JP4227820B2 (ja) | 2003-03-12 | 2003-03-12 | 新規な酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003067266A JP4227820B2 (ja) | 2003-03-12 | 2003-03-12 | 新規な酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004275013A JP2004275013A (ja) | 2004-10-07 |
| JP4227820B2 true JP4227820B2 (ja) | 2009-02-18 |
Family
ID=33284927
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003067266A Expired - Fee Related JP4227820B2 (ja) | 2003-03-12 | 2003-03-12 | 新規な酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4227820B2 (ja) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8080423B2 (en) | 2004-08-05 | 2011-12-20 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Reagent containing protease reaction promoter and/or colorant stabilizer |
| DE602006021173D1 (de) | 2005-05-02 | 2011-05-19 | Oji Paper Co | Analysevorrichtung und analyseverfahren für glykosyliertes hämoglobin |
| JP4861986B2 (ja) | 2005-05-06 | 2012-01-25 | アークレイ株式会社 | タンパク質の切断方法およびその用途 |
| EP2520650A3 (en) | 2006-04-25 | 2012-11-21 | Kikkoman Corporation | Eukaryotic amadoriase having excellent thermal stability, gene and recombinant DNA for the eukaryotic amadoriase, and process for production of eukaryotic amadoriase having excellent thermal stability |
| CN101501502B (zh) | 2006-08-11 | 2014-12-10 | 爱科来株式会社 | 餐后高血糖指标、其测定方法及其用途 |
| JP5324918B2 (ja) | 2007-01-30 | 2013-10-23 | アークレイ株式会社 | ＨｂＡ１ｃ測定方法 |
| CN101595386B (zh) | 2007-01-30 | 2012-05-09 | 爱科来株式会社 | 吩噻嗪衍生物色素的检测方法及用于该方法的显色剂试剂 |
| JP4697809B2 (ja) | 2007-02-22 | 2011-06-08 | 旭化成ファーマ株式会社 | ロイコ色素の安定化方法 |
| WO2008108385A1 (ja) * | 2007-03-05 | 2008-09-12 | Kikkoman Corporation | 糖化ヘキサペプチドの測定方法 |
| US8758648B2 (en) | 2008-03-19 | 2014-06-24 | Arkray, Inc. | Stabilizer of color former and use thereof |
| US8993255B2 (en) | 2008-10-10 | 2015-03-31 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Protein having fructosyl valyl histidine oxidase activity, modified protein, and use of the protein or the modified protein |
| EP2281900A1 (en) * | 2009-08-03 | 2011-02-09 | Roche Diagnostics GmbH | Fructosyl peptidyl oxidase and sensor for assaying a glycated protein |
| JP5927771B2 (ja) * | 2010-04-09 | 2016-06-01 | 東洋紡株式会社 | ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法 |
| US9708586B2 (en) | 2010-08-06 | 2017-07-18 | Kikkoman Corporation | Amadoriase having altered substrate specificity |
| EP2602318B1 (en) | 2010-08-06 | 2015-09-30 | Kikkoman Corporation | Amadoriase having altered substrate specificity |
| US9701949B2 (en) | 2011-12-28 | 2017-07-11 | Kikkoman Corporation | Amadoriase with improved thermostability, gene and recombinant DNA for the amadoriase, and method for production of amadoriase with improved thermostability |
| WO2013162035A1 (ja) | 2012-04-27 | 2013-10-31 | キッコーマン株式会社 | フルクトシルヘキサペプチドに作用する改変型アマドリアーゼ |
| CN111398605B (zh) | 2013-08-09 | 2024-04-05 | 龟甲万株式会社 | 糖化血红蛋白测定用组合物 |
| US11078517B2 (en) | 2013-10-25 | 2021-08-03 | Kikkoman Corporation | Hemoglobin A1c measurement method and measurement kit |
| US10697979B2 (en) | 2013-10-25 | 2020-06-30 | Kikkoman Corporation | Method for measurement of HbA1c using amadoriase that reacts with glycated peptide |
| CN103695380B (zh) | 2013-12-27 | 2016-05-25 | 宁波美康生物科技股份有限公司 | 果糖氨基酸氧化酶、制备方法及含该酶的糖化白蛋白检测试剂盒 |
| CN107148475A (zh) | 2014-10-24 | 2017-09-08 | 龟甲万株式会社 | 脱氢酶活性提高的阿马多里酶 |
| EP3216865B1 (en) | 2014-11-07 | 2020-09-30 | Kikkoman Corporation | Amadoriase having enhanced anionic-surfactant tolerance |
| EP3279323B1 (en) | 2015-04-03 | 2023-03-08 | Kikkoman Corporation | Amadoriase having improved specific activity |
| CN109312312B (zh) | 2016-04-22 | 2023-06-02 | 龟甲万株式会社 | HbA1c脱氢酶 |
| EP3677681A4 (en) | 2017-08-31 | 2021-07-14 | Kikkoman Corporation | GLYCULATED HEMOGLOBIN OXIDASE VARIANT AND MEASUREMENT METHOD |
-
2003
- 2003-03-12 JP JP2003067266A patent/JP4227820B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2004275013A (ja) | 2004-10-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4227820B2 (ja) | 新規な酵素 | |
| EP2096173B1 (en) | Method of measuring glycolated hemoglobin A1C, enzyme to be used therefor and process for producing the same | |
| US8962271B2 (en) | Fructosyl peptidyl oxidase | |
| JP4231668B2 (ja) | 新規なフルクトシルペプチドオキシダーゼ | |
| JP5442432B2 (ja) | 糖化ヘキサペプチドの測定方法 | |
| JP2001095598A (ja) | 糖化蛋白質の測定方法 | |
| US5712138A (en) | Fructosyl amino acid oxidase | |
| JP4061348B2 (ja) | 糖化タンパク質の酵素的測定方法 | |
| WO1997013872A1 (fr) | Procede pour doser les composes d'amadori | |
| US6033867A (en) | Fructosyl amino acid oxidase, process for producing the same, and method of assaying amadori compounds using the enzyme | |
| JPH0646846A (ja) | フルクトシルアミンデグリカーゼ、その製造法及び該酵素を用いたアマドリ化合物の定量方法 | |
| JP3850904B2 (ja) | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びその製造方法 | |
| JP2923222B2 (ja) | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びその製造方法 | |
| JP4004081B2 (ja) | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびその製造方法 | |
| JP3668801B2 (ja) | 新規酵素 | |
| EP0737744B1 (en) | Fructosyl amino acid oxidase and process for producing the same | |
| DE69120489T2 (de) | Hochsensitives Testverfahren für Myo-Inositol und Komposition zur Ausführung davon | |
| JPH03155780A (ja) | フルクトシルアミン・オキシダーゼ、その製造法、該酵素を用いたアマドリ化合物の定量法及びその試薬 | |
| JP3416540B2 (ja) | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びその製造方法 | |
| WO2004029251A1 (ja) | フルクトシルアミンオキシダーゼ | |
| JP2000270855A (ja) | フルクトシルバリン酸化酵素 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051024 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080327 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080520 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20080520 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080630 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20080730 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20080806 |
|
| RD13 | Notification of appointment of power of sub attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7433 Effective date: 20080806 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080826 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20080826 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080806 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080918 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20081030 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20081125 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20081201 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111205 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4227820 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111205 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121205 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121205 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131205 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |