JP5442432B2 - 糖化ヘキサペプチドの測定方法 - Google Patents
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Description
本発明における糖化蛋白質とは、蛋白質が非酵素的に糖化された蛋白質をいう。糖化蛋白質は、生体内にも生体外にも存在し得るが、生体内に存在する例としては、血液などの体液や、毛髪などがある。血液中に存在する糖化蛋白質の例としては、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどがあり、糖化ヘモグロビンの1種としてHbA1cがある。生体外に存在する例としては、蛋白質やペプチドと糖が共存する液状調味料等の飲食品や輸液などがある。
本発明においては、糖化蛋白質由来の糖化ヘキサペプチドを測定対象とする。具体的には、糖化蛋白質から何らかの手段によって遊離させた糖化ペプチド、より具体的には、α−ヘキサペプチド(N末端のα−アミノ基が糖化された6アミノ酸残基長からなるペプチド)である。すなわち、N末端のα−アミノ基が糖化された糖化蛋白質から、何らかの手段、例えば、プロテアーゼによる消化等によって、そのN末端のα−糖化アミノ基を含む6アミノ酸残基長からなるペプチドを予め遊離させ、そのヘキサペプチドを測定する。本発明の方法を用いて、HbA1cを測定したい場合、該当する糖化ヘキサペプチドは1−デオキシフルクトシル−Val−His−Leu−Thr−Pro−Gluである。
本発明の測定方法に使用する糖化ヘキサペプチドオキシダーゼの起源は、遺伝子組換えによる大量生産という利便を考慮すると、動植物よりも微生物がより好ましい。具体的な微生物の例としては、糸状菌が挙げられる。具体的には、例えば、アスペルギルス属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ペニシリウム(Penicillium)属、トリチュルス(Trichurus)属、又はカエトミウム(Chaetomium)属に属する微生物由来が挙げられ、より具体的な好ましい微生物としては、Aspergillus oryzae、Aspergillus niger、Aspergillus versicolor、Aspergillus usamii、Gelasinospora pseudoreticulata、Penicillium cyclopium、Trichurus cylindricus、Chaetomium sp. NISL9335が属するChaetomium sp.等が挙げられる。さらに具体的な好ましい菌株として、例えばAspergillus oryzae RIB40、Aspergillus oryzae RIB 83、Aspergillus oryzae IFO 4206、Aspergillus oryzae RIB 333、Aspergillus oryzae IFO 5239、Aspergillus niger IAM 2534、Aspergillus versicolor IAM 2399、Aspergillus usamii mut.shirousamii IAM 2876、Gelasinospora pseudoreticulata NISL9332、Penicillium cyclopium IFO5847、Trichurus cylindricus IMI96753、Chaetomium sp. NISL9335が挙げられる。これらの微生物を起源とする糖化ヘキサペプチドオキシダーゼは、大腸菌を用いた組換え生産が可能であり、産業的な利用にも非常に適している。
本発明の測定方法に使用する糖化ヘキサペプチドオキシダーゼは、各種公知の酵素生産方法を用いて製造することができる。例えば、前述の糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ生産微生物を培地中で培養して目的とする糖化ヘキサペプチドオキシダーゼを産生させ、培養物あるいは培養菌体内部より酵素を採取することができる。微生物の培養は、通常の固体培養法で培養してもよいが、可能なかぎり液体培養法を採用して培養するのが好ましい。培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適宜含有するものであればよく、また、合成培地、天然培地の何れでもよく、目的の酵素を効率よく製造することのできる培地であれば、如何なる培地でもよい。
試薬1(R1):1.0kUのパーオキシダーゼ(以下、PODと称する。キッコーマン社製)、100mgの4−アミノアンチピリン(以下、4AAと称する。東京化成社製)を0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)に溶解し、1Lに定容する。
2.7mLのR1に、100μLのR2を加え、さらに、100μLの測定用酵素液を加えて混和し、37℃で、5分間予備加温する。その後、100μLのR3を加えてよく混合したのち、分光光度計(U−2000A、日立社製)を用い、37℃、5分間の555nmにおける吸光度の変化を測定する。なお、対照液は、100μLのR3の代わりに、100μLのイオン交換水を加える以外は前記と同様に操作する。予め調製した過酸化水素の標準溶液を用いて、その生成する色素量(吸光度)との関係より得られたグラフから、吸光度の変化に相当する過酸化水素量を求め、この数値を酵素液中の活性単位とする。1分間に1μmolの過酸化水素を生成する酵素量を1Uとする。
本発明の測定法においては、糖化蛋白質由来の糖化ヘキサペプチドを含む試料に糖化ヘキサペプチドオキシダーゼを作用させ、その作用による生成物又は消費物を測定する。HbA1c等の糖化蛋白質の測定を目的として、測定対象の糖化蛋白質から糖化ヘキサペプチドを切り出すための好適な方法としては、プロテアーゼ消化が挙げられる。糖化ヘキサペプチドを遊離させるためのプロテアーゼとしては、臨床検査に使用が可能で、HbA1cから、少なくともα−糖化ヘキサペプチドを有効に切り出し得るものであれば、いかなるプロテアーゼを用いても良い。そのようなプロテアーゼの例としては、エンドプロテイナーゼGlu−C、V8プロテアーゼ、プロテイナーゼK、プロテイナーゼP、プロナーゼ、サーモリシン、サチライシン、カルボキシペプチダーゼ、キモトリプシン、ディスパーゼ、パパイン、フィシン、ブロメライン、アミノペプチダーゼ等のプロテアーゼあるいはペプチダーゼ等が挙げられ、特に好ましくは、エンドプロテイナーゼGlu−C、V8プロテアーゼが挙げられる。
上記の糖化ヘキサペプチドを含む試料に、本発明の測定法に使用する糖化ヘキサペプチドオキシダーゼを作用させる。糖化ヘキサペプチドの切り出しと糖化ヘキサペプチドオキシダーゼの作用の時期は連続的でも、同時でも、切り出しを終了してから糖化ヘキサペプチドオキシダーゼを作用させてもよい。糖化ヘキサペプチドに対する糖化ヘキサペプチドオキシダーゼの作用時間は例えば、120分間以下、好ましくは60分間以下、より好ましくは0.5〜60分間、最も好ましくは1〜30分間とすることができる。作用時間が短すぎる場合、試料中の糖化ヘキサペプチドを十分に測定しきれず、良好な測定が行えない。一方、作用時間が長すぎる場合には、測定時間が延長し、測定処理の効率が悪いという問題に加え、試料及び測定試薬が測定条件下に長くさらされる結果、試料中の基質あるいは試薬中の成分の分解、変性を招くという問題を生じる。さらに、特に微量測定系においては、長時間経過による乾燥に起因する試料容量の減少による濃度変化なども誤差の原因となり得る。糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ作用時間を60分間以下、より好ましくは0.5〜60分間、最も好ましくは1〜30分間とすることにより、迅速かつ良好に糖化ヘキサペプチドを測定することができる。作用温度は、例えば、20〜45℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択することができる。
(1)活性測定用試薬の調製
糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性の確認用に、以下の試薬を調製した。
試薬1:1.0kU POD (キッコーマン社製)
100mg 4−4AA(東京化成社製)
0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)に溶解し、1Lに定容
試薬2:500mg TOOS(同仁化学社製)
イオン交換水に溶解し、100mLに定容
試薬3:50mg 1−Deoxyfructosyl−Val−His
−Leu−Thr−Pro−Glu(ペプチド研究所社製)
イオン交換水に溶解し、2mLに定容
(2)各種糸状菌の培養と無細胞抽出液の調製
表1に記載の16株の糸状菌を20mLの培地(イーストエキス0.1%、マルツエキス0.1%、リン酸二水素カリウム0.1%、硫酸マグネシウム0.05%、pH7.3)に接種し、25℃、120rpmで4日間振とう培養した。この培養液から、遠心分離(15,000rpm、20分間、4℃)により菌体を回収し、50mMリン酸バッファー(pH8.0)に懸濁して、菌体をフレンチプレスにより破砕した。菌体破砕後、遠心分離(15,000rpm、20分間、4℃)して上清を回収し、無細胞抽出液とした。
上記の無細胞抽出液各10μLに対して、上述の試薬1を135μL、試薬2を5μL、及び試薬3を1μL加えて反応を開始し、25℃、4時間反応後の吸光度の上昇を確認することにより糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性の有無を確認した。結果を表1に示す。
Aspergillus oryzae RIB40を5Lの培地(イーストエキス0.1%、マルツエキス0.1%、リン酸二水素カリウム0.1%、硫酸マグネシウム0.05%、pH7.3)に接種し、25℃、120rpmで4日間振とう培養した。この培養液から、ブフナー漏斗を用いて菌体を回収した。得られた菌体は液体窒素で凍結した後、乳鉢で粉砕し、ISOGEN(和光純薬社製)で処理し、2,700rpmで5分間遠心することでRNA画分を得た。
実験例2で得られた糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ生産能を有する大腸菌DH5αをLB−amp培地(1%(w/v) バクトトリプトン、0.5%(w/v) ペプトン、0.5%(w/v) NaCl、50μg/ml Ampicilin)6Lに植菌し、32℃、20時間振とう培養した。得られた培養液を9,000rpmで15分間遠心分離し、集めた菌体を0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)に懸濁した。フレンチプレスにより菌体を破砕したのち、破砕液を10,000rpmで15分間遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とし、以下の方法で精製した。
以下の組成からなる、α−糖化ヘキサペプチド測定用の試薬を調製した。
100mg 4−4AA(東京化成社製)
0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)に溶解し、1Lに定容
試薬2:500mg TOOS(同仁化学社製)
イオン交換水に溶解し、100mLに定容
試薬3:実験例3で得られた糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ(本発明で利用)、あるいはFAOD−E、FAOX−TE(キッコーマン社製、比較例1及び2で利用)
25mg/mlのα−糖化ヘキサペプチド(1−Deoxyfructosyl−Val−His−Leu−Thr−Pro−Glu(ペプチド研究所社製))を、2、5、10、及び20μL分取し、それぞれに脱イオン水を加えて20μLに定容して、測定用糖化ヘキサペプチド含有試料とした。また、脱イオン水20μLを対照試料とした。各試料に、135μLの試薬1及び5μLの試薬2を添加し、37℃で5分間保温後、5μLの試薬3を添加し、37℃で20分間反応させて555nmにおける吸光度を測定し、反応20分後の吸光度の変化量(ΔOD)を求めた。各種濃度のα−糖化ヘキサペプチドの測定結果を図1に示す。
ヒト血液を遠心分離して得た血球を実験試料(以下、試料血球と称する)とし、本発明の測定方法を利用して試料血球中のHbA1c(HbA1c/全Hb=5.3%)を測定するために、以下の組成からなるα−糖化ヘキサペプチド測定用の試薬を調製した。
36mM MES緩衝液 (pH7.5)
11mM KCl
0.04% Triton X100 (和光純薬社製)
0.02% アジ化ナトリウム
15U/mL パーオキシダーゼ (キッコーマン社製)
0.2U/mL 糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ
0.012mM TPM−PS (同仁化学社製)
上記の試料血球を蒸留水によって溶血させ、その後8.4U/mlのGlu−Cプロテアーゼを加え、25℃で2時間反応させた。反応後、2μlの反応溶液に対し、100μlの試薬Aを添加、混合し、37℃で反応開始から5分間までの571nmにおける吸光度を測定した結果を図2に示す。
HbA1cにGlu−Cを作用させると、糖化ヘキサペプチドが切り出される。この糖化ヘキサペプチドに糖化ヘキサペプチドオキシダーゼを作用させて、HbA1cを測定することが可能かどうか確認した。まず、濃度の異なるHbA1c試料を測定するため、以下の組成からなる試薬を調製した。
50mM Tricine (pH8.0)
1.0mM WST−3 (同仁化学社製)
0.2U/L 糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ
20U/mL パーオキシダーゼ (キッコーマン社製)
R2試薬:
150mM MOPS (pH8.0)
0.25mM DA67 (和光純薬社製)
0.01% Glu−C(和光純薬社製)
HbA1c試料:
HbA1c測定用標準物質(福祉・医療技術振興会製、HbA1c%=5.27%,7.41%,10.40%)を生理食塩水で15倍希釈したものをHbA1c試料とした。
各HbA1c試料3μlにR1試薬90μlを添加、混合し、37℃で5分間インキュベートした後、30μlのR2試薬を添加し、37℃でプロテアーゼ処理および発色反応を行った。R1試薬を添加した時刻を0分とし、その後10分間の658nmにおける吸光度を測定した。対照として、Glu−Cを除いた試薬を作製し、その結果をR2試薬を用いた時の測定値より引いた値を図3に示した。図3から、HbA1c%が5.27%,7.41%,10.40%と上がるに従い、658nmにおける吸光度も上がっていくことが示された。このことから、Glu−Cプロテアーゼで切り出されたHbA1c由来の糖化ヘキサペプチドが、糖化ヘキサペプチドオキシダーゼによって、簡便かつ迅速に測定できることが示された。
Claims (8)
- 1−デオキシフルクトシル−Val−His−Leu−Thr−Pro−Gluを含む試料に、1−デオキシフルクトシル−Val−His−Leu−Thr−Pro−Gluを基質とする糖化ヘキサペプチドオキシダーゼを作用させ、その作用により生成する過酸化水素を測定することを特徴とする糖化ヘキサペプチドの測定方法、ここで前記糖化ヘキサペプチドオキシダーゼは、
作用として1−デオキシフルクトシル−Val−His−Leu−Thr−Pro−Gluを酸化して過酸化水素を生成し、
至適pH範囲をpH7〜9の範囲に有し、
作用pH範囲をpH5〜9の範囲に有し、
作用温度が20〜45℃であり、
SDS−PAGE上での分子量が約48KDaである、
前記測定方法。 - 1−デオキシフルクトシル−Val−His−Leu−Thr−Pro−Gluを含む試料に配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ又は配列番号3に示される配列において1若しくは数個の置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列からなりかつ1−デオキシフルクトシル−Val−His−Leu−Thr−Pro−Gluを基質とする糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを作用させ、その作用による生成物又は消費物を測定することを特徴とする糖化ヘキサペプチドの測定方法。
- 糖化ヘキサペプチドオキシダーゼが、アスペルギルス属、ゲラシノスポラ属、ペニシリウム属、トリチュルス属、又はカエトミウム属に属する微生物由来である、請求項1に記載の糖化ヘキサペプチドの測定方法。
- 前記糖化ヘキサペプチドオキシダーゼが、Aspergillus versicolor、Aspergillus oryzae、Aspergillus niger、及びAspergillus usamii mut.shirousamii、Gelasinospora pseudoreticulata、Penicillium cyclopium、Trichurus cylindricus及びChaetomium sp. NISL9335が属するChaetomium sp.からなる群より選択される微生物由来である、請求項3に記載の糖化ヘキサペプチドの測定方法。
- 前記糖化ヘキサペプチドオキシダーゼが、Aspergillus versicolor IAM 2399、Aspergillus oryzae IFO 5239、Aspergillus oryzae IFO 4206、Aspergillus oryzae RIB 83、Aspergillus niger IAM 2534、Aspergillus oryzae RIB 333、Aspergillus usamii mut.shirousamii IAM 2876、Aspergillus oryzae RIB40、Aspergillus oryzae RIB67、Aspergillus niger IAM 2106、Aspergillus oryzae RIB 609、Aspergillus oryzae IAM 2747、Aspergillus oryzae RIB 216、Aspergillus oryzae RIB 1048、Gelasinospora pseudoreticulata NISL 9332、Penicillium cyclopium IFO 5847、Trichurus cylindricus IMI 96753及びChaetomium sp. NISL 9335からなる群より選択される微生物由来である、請求項4に記載の糖化ヘキサペプチドの測定方法。
- 前記糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ又は糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドが、SDS−PAGE上での分子量が48KDaである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の糖化ヘキサペプチドの測定方法。
- 1−デオキシフルクトシル−Val−His−Leu−Thr−Pro−Gluに作用させたときに、測定可能な量の過酸化水素を生成する能力を有する1−デオキシフルクトシル−Val−His−Leu−Thr−Pro−Gluを基質とする糖化ヘキサペプチドオキシダーゼと、過酸化水素を測定するための試薬とを含む、糖化ヘキサペプチド測定用試薬、ここで前記糖化ヘキサペプチドオキシダーゼは、
作用として1−デオキシフルクトシル−Val−His−Leu−Thr−Pro−Gluを酸化して過酸化水素を生成し、
至適pH範囲をpH7〜9の範囲に有し、
作用pH範囲をpH5〜9の範囲に有し、
作用温度が20〜45℃であり、
SDS−PAGE上での分子量が約48KDaである、
前記糖化ヘキサペプチド測定用試薬。 - 1−デオキシフルクトシル−Val−His−Leu−Thr−Pro−Gluを測定する診断薬の製造における、1−デオキシフルクトシル−Val−His−Leu−Thr−Pro−Gluを基質とする糖化ヘキサペプチドオキシダーゼの使用、ここで前記糖化ヘキサペプチドオキシダーゼは、
作用として1−デオキシフルクトシル−Val−His−Leu−Thr−Pro−Gluを酸化して過酸化水素を生成し、
至適pH範囲をpH7〜9の範囲に有し、
作用pH範囲をpH5〜9の範囲に有し、
作用温度が20〜45℃であり、
SDS−PAGE上での分子量が約48KDaである、
前記使用。
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