JP2003235585A

JP2003235585A - 新規なフルクトシルペプチドオキシダーゼ

Info

Publication number: JP2003235585A
Application number: JP2002228727A
Authority: JP
Inventors: Keiko Kurosawa; 恵子黒澤; Kozo Hirokawa; 浩三廣川; Naoki Kajiyama; 直樹梶山
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 2001-09-04
Filing date: 2002-08-06
Publication date: 2003-08-26
Anticipated expiration: 2022-08-06
Also published as: EP1291416B1; US20030157593A1; US20110003361A1; US7018823B2; JP4231668B2; EP1291416A1; US20050244926A1; US20090011467A1; US7419813B2

Abstract

(57)【要約】【課題】臨床診断用酵素として有用な安定性などの優
れた理化学的性質を有する新規なフルクトシルペプチド
オキシダーゼ、および該フルクトシルペプチドオキシダ
ーゼの製造方法を提供することにある。【解決手段】臨床診断用酵素として有用な理化学的性
質を有する新規なフルクトシルペプチドオキシダーゼ及
び該オキシダーゼ生産菌を培地に培養し、培養物から該
オキシダーゼを採取する新規なフルクトシルペプチドオ
キシダーゼの製造方法を提供する。さらに、新規なフル
クトシルペプチドオキシダーゼをコードするフルクトシ
ルペプチドオキシダーゼ遺伝子、該遺伝子をベクターDN
Aに挿入した組換え体DNA、該遺伝子を含む形質転換体又
は形質導入体を培地に培養し、培養物から新規なフルク
トシルペプチドオキシダーゼを採取する新規なフルクト
シルペプチドオキシダーゼの製造方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なフルクト
シルペプチドオキシダーゼ、それをコードするフルクト
シルペプチドオキシダーゼ遺伝子、及び新規なフルクト
シルペプチドオキシダーゼの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】糖化蛋白質は、蛋白質が非酵素的にグ
リコシル化された蛋白質であり、糖、すなわちアルドー
ス（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導
体）側のアルデヒド基と、蛋白質側のアミノ基が非酵素
的に共有結合した結果、生成したものである。蛋白質の
アミノ基としては、Ｎ末端αアミノ基、内部リジン残基
側鎖εアミノ基があげられる。これらの糖化蛋白質は、
反応中間体として生じたシッフ塩基がアマドリ転移を受
けて形成されることから、いわゆるアマドリ化合物とも
呼ばれる。

【０００３】糖化蛋白質は、生体内の血液などの体液
や、毛髪などの生体試料中に含有されている。血液中に
存在する糖化蛋白質の濃度は、血清中に溶解しているグ
ルコースなどの糖類の濃度に強く依存している。糖尿病
状態では糖化蛋白質の生成が亢進しており、赤血球に含
まれる糖化ヘモグロビンや血清中の糖化アルブミンの濃
度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映していること
から、それらの糖化蛋白質を測定することは、糖尿病の
症状の診断や症状管理に重要となっている。

【０００４】従来糖化蛋白質を定量する方法として、例
えば、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法（Chro
matogr. Sci., 10, 659（1979））、硼酸を結合させた
固体を詰めたカラムを用いる方法（Clin. Chem., 28, 2
088-2094（1982））、電気泳動を用いる方法（Clin. Ch
em., 26, 1598-1602（1980））、抗原抗体反応を利用す
る方法（JJCLA, 18, 620（1993））、還元能をテトラゾ
リウム塩を用いて比色定量する方法（Clin. Chim. Act
a, 127, 87-95（1982））、チオバルビツール酸を用い
て酸化後比色定量する方法（Clin. Chim. Acta, 112, 1
97-204（1981））、糖化アミノ酸オキシダーゼ等の酵素
を用いる方法（特公平０５−３３９９７、特開平１１−
１２７８９５、ＷＯ９７−１３８７２、特公平６−６５
３００、特開平２−１９５９００、特開平３−１５５７
８０、特開平４−４８７４、特開平５-１９２１９３、
特開平６−４６８４６、特開平１１−１５５５９６、特
開平１０−３１３８９３、特開平１１−５０４８０８、
特開２０００−３３３６９６、特開２００１−５４３９
８、特開２００１−２０４４９５、特開２００１−２０
４４９４）等が知られている。また最近、上記方法より
精度良く糖化蛋白質を測定する方法として、新しい糖化
蛋白質の測定法が開示された（特開２００１−９５５９
８）。この測定方法は、糖化蛋白質を含む試料をプロテ
アーゼで処理し、糖化蛋白質からフルクトシルペプチド
を遊離させ、遊離したフルクトシルペプチドにオキシダ
ーゼを作用させ、生成物を測定することにより糖化蛋白
質を測定する方法であり、短時間かつ簡単な操作で、精
度の良い測定方法として注目されている。

【０００５】従来の糖化アミノ酸オキシダーゼを用いる
方法は、糖化蛋白質をプロテアーゼで処理したのち、生
成した糖化アミノ酸を酵素的に測定する。詳しくは、糖
化蛋白質をプロテアーゼ等で処理することにより生成し
たフルクトシルアミノ酸に、フルクトシルアミノ酸オキ
シダーゼを作用させ、生成される過酸化水素を測定する
方法である。これらの測定方法に用いられているフルク
トシルアミノ酸オキシダーゼとしては、コリネバクテリ
ウム属菌の生産するオキシダーゼ（特公平５−３３９９
７、特公平６−６５３００）、アスペルギルス属菌の生
産するオキシダーゼ（特開平３−１５５７８０）、ギベ
レラ属菌の生産するオキシダーゼ（特開平７−２８９２
５３）、フサリウム属菌の生産するオキシダーゼ（特開
平７−２８９２５３、特開平８−１５４６７２）、ペニ
シリウム属菌の生産するオキシダーゼ（特開平８−３３
６３８６）、トリコスポロン属菌の生産するオキシダー
ゼ（特開２０００−２４５４５４）、ケトアミンオキシ
ダーゼ（特開平５−１９２１９３）などが知られてい
る。しかし、これらの酵素は、フルクトシルアミノ酸に
良く作用するが、フルクトシルペプチドに作用しない。
また、フルクトシルペプチドに作用する酵素として、特
開２００１−９５５９８に記載されている大腸菌ＤＨ５
α（ｐＦＰ１）（ＦＥＲＭＢＰ−７２７９）の生産す
るオキシダーゼが知られている。しかしこのオキシダー
ゼについては、酵素の基本的な理化学的性質は知られて
おらず、安定性が悪いなど、測定キットの調製上困難な
点があった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、新
規でかつ安定性に優れたフルクトシルペプチドオキシダ
ーゼ、それをコードするフルクトシルペプチドオキシダ
ーゼ遺伝子及び新規なフルクトシルペプチドオキシダー
ゼの製造方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課
題解決のために鋭意研究を重ねた結果、広く自然界より
探索して得られた、種々の微生物が安定性に優れた新規
なフルクトシルペプチドオキシダーゼを生産することを
見出した。そして本酵素の取得に成功し、このフルクト
シルペプチドオキシダーゼが糖化蛋白質の測定に有利な
種々の新規な理化学的性質を有していることを見出し、
さらに、フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子を単
離することに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、酸素存在下でフルク
トシルバリルヒスチジンに作用し、α−ケトアルデヒ
ド、バリルヒスチジン及び過酸化水素を生成する反応を
触媒するフルクトシルペプチドオキシダーゼである。
さらに、上記反応を触媒し、４５℃、１０分の熱処理で
８０％以上の活性が残存するフルクトシルペプチドオキ
シダーゼであり、そして、上記反応を触媒する、分子
量、約５２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のフルクトシ
ルペプチドオキシダーゼである。さらに、上記反応を触
媒し、４５℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性が残
存し、かつ分子量、約５２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）のフルクトシルペプチドオキシダーゼである。

【０００９】さらに、以下の理化学的性質を有するフル
クトシルペプチドオキシダーゼである。（ａ）作用及び基質特異性：酸素存在下でフルクトシル
バリルヒスチジンに作用し、α−ケトアルデヒド、バリ
ルヒスチジン及び過酸化水素を生成する反応を触媒す
る。（ｂ）至適ｐＨ：ｐＨ６．０〜８．０（ｃ）作用適温の範囲：２０〜４５℃ （ｄ）熱安定性：４５℃、１０分の熱処理で８０％以上
の活性が残存（ｅ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ６．０〜９．０（ｆ）分子量：約５２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）さらに本発明は、上記フルクトシルペプチドオキシダー
ゼ生産能を有する糸状菌、および上記フルクトシルペプ
チドオキシダーゼ生産能を有するアカエトミエラ属、ア
カエトミウム属、シエラビア属、カエトミウム属、ゲラ
シノスポラ属、ミクロアスカス属、コニオカエタ属、及
びユウペニシリウム属からなる群から選ばれた糸状菌を
培地に培養し、その培養物からフルクトシルペプチドオ
キシダーゼを採取することを特徴とするフルクトシルペ
プチドオキシダーゼの製造方法である。

【００１０】また、本発明は、フルクトシルバリルヒス
チジンに作用するが、ε−フルクトシルリジンに作用し
にくい前記反応を触媒するフルクトシルペプチドオキシ
ダーゼであり、さらに４５℃、１０分の熱処理で８０％
以上の活性が残存する該フルクトシルペプチドオキシダ
ーゼである。さらに、下記の理化学的性質を有する該フ
ルクトシルペプチドオキシダーゼである。（ａ）至適ｐＨ：ｐＨ６．０〜８．０（ｂ）作用適温の範囲：２０〜４０℃ （ｃ）熱安定性：４５℃、１０分の熱処理で８０％以上
の活性が残存（ｄ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ６．０〜９．０さらに本発明は、該フルクトシルペプチドオキシダーゼ
生産能を有する糸状菌、および該フルクトシルペプチド
オキシダーゼ生産能を有するユウペニシリウム属に属す
る糸状菌またはコニオカエタ属に属する糸状菌を培地に
培養し、その培養物からフルクトシルペプチドオキシダ
ーゼを採取することを特徴とするフルクトシルペプチド
オキシダーゼの製造方法である。

【００１１】また、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又
は（ｃ）のフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有
するタンパク質である。（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質。（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１
から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された
アミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキ
シダーゼ活性を有するタンパク質。（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上
の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつフルクトシ
ルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質。さらに、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の
フルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパ
ク質をコードする遺伝子である。（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質。（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１
から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された
アミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキ
シダーゼ活性を有するタンパク質。（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上
の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつフルクトシ
ルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質。

【００１２】さらに、本発明は以下の（ａ）、（ｂ）又
は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子である。（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの
全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と相補的な塩基
配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。（ｃ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの
全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と８０％以上の
相同性を示し、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。さらに、本発明は、上記の遺伝子をベクターＤＮＡに挿
入したことを特徴とする組換え体ＤＮＡである。さら
に、本発明は、上記組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又
は形質導入体である。

【００１３】さらに、本発明は、上記形質転換体又は形
質導入体を培地に培養し、培養物からフルクトシルペプ
チドオキシダーゼを採取することを特徴とするフルクト
シルペプチドオキシダーゼの製造方法である。また、本
発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のフルクトシ
ルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質であ
る。（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質。（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１
から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された
アミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキ
シダーゼ活性を有するタンパク質。（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上
の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつフルクトシ
ルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質。さらに、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の
フルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパ
ク質をコードする遺伝子である。（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質。（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１
から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された
アミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキ
シダーゼ活性を有するタンパク質。（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上
の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつフルクトシ
ルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質。

【００１４】さらに、本発明は以下の（ａ）、（ｂ）又
は（ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子である。（ａ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。（ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの
全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と相補的な塩基
配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。（ｃ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの
全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と８０％以上の
相同性を示し、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。さらに、本発明は、上記の遺伝子をベクターＤＮＡに挿
入したことを特徴とする組換え体ＤＮＡである。さら
に、本発明は、上記組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又
は形質導入体である。さらに、本発明は、上記形質転換
体又は形質導入体を培地に培養し、培養物からフルクト
シルペプチドオキシダーゼを採取することを特徴とする
フルクトシルペプチドオキシダーゼの製造方法である。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明す
る。本発明のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（以下
「本発明オキシダーゼ」という）とは、酸素存在下でフ
ルクトシルバリルヒスチジンに作用し、α−ケトアルデ
ヒド、バリルヒスチジン及び過酸化水素を生成する以下
の反応式を触媒するオキシダーゼであり、この作用を有
する酵素であれば、如何なるオキシダーゼでも本発明オ
キシダーゼに含まれる。

【反応式】フルクトシルバリルヒスチジン＋Ｈ_２Ｏ
＋Ｏ_２ →α−ケトアルデヒド＋バリルヒスチジン＋
Ｈ_２Ｏ_２例えば、ε−フルクトシルリジンやフルクトシルグリシ
ンなどの他のフルクトシルアミノ酸に作用するオキシダ
ーゼや種々のフルクトシルペプチドに作用するオキシダ
ーゼなどでも上記反応を触媒する作用を有するオキシダ
ーゼ（本発明オキシダーゼという）であれば全て本発明
に含まれる。一方、フルクトシルバリルヒスチジンに作
用するが、ε−フルクトシルリジンに作用しにくいフル
クトシルペプチドオキシダーゼ（フルクトシルリジンに
作用しにくい本発明オキシダーゼという）とは、上記反
応式を触媒するオキシダーゼで、かつ、フルクトシルバ
リルヒスチジンを基質として用いたときの活性に比べ
て、ε−フルクトシルリジンを基質として用いたときの
活性が低い本発明オキシダーゼをいい、ε−フルクトシ
ルリジンを含む測定用試料中のフルクトシルバリルヒス
チジンを精度良く測定することのできるオキシダーゼで
あればよい。さらにε−フルクトシルリジンに作用しな
い本発明オキシダーゼなども本発明に含まれる。これら
のε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシ
ダーゼは、ε−フルクトシルリジンを含む生体試料中の
フルクトシルバリルヒスチジンを測定する場合に、特に
好ましい。

【００１６】また、本発明オキシダーゼの一形態とし
て、例えば、上記反応を触媒する作用を有する分子量、
約５２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のフルクトシルペ
プチドオキシダーゼ、上記反応を触媒する作用を有し、
かつ４５℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性が残存
するフルクトシルペプチドオキシダーゼ、上記反応を触
媒する作用を有し、かつ４５℃、１０分の熱処理で８０
％以上の活性が残存する分子量、約５２，０００（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）のフルクトシルペプチドオキシダーゼ等
が挙げられる。さらには、上記反応を触媒する作用を有
すると同時に、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の理化学的
性質をそれぞれもしくはそれらを適宜併せて有するフル
クトシルペプチドオキシダーゼなども本発明オキシダー
ゼとして挙げられる。（ａ）至適ｐＨ：ｐＨ６．０〜８．０例えば、緩衝液として２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
３．０−６．０）、２００ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐ
Ｈ６．０−７．０）、２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
６．８−９．０）、２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ６．５−８．０）、２００ｍＭグリシン緩衝液
（ｐＨ８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおい
て、温度３０℃にて酵素反応を行ない、至適ｐＨを求め
る。例えば、至適ｐＨとしてｐＨ５．０〜９．０、好ま
しくはｐＨ６．０〜８．０の理化学的性質を有する本発
明オキシダーゼなどが挙げられる。（ｂ）作用適温の範囲：２０〜４５℃ 例えば、後述の活性測定法における反応液と同一組成よ
りなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定
を行ない作用適温の範囲を求める。例えば、作用適温の
範囲として２０〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃の理
化学的性質を有する本発明オキシダーゼなどが挙げられ
る。（ｃ）熱安定性：４５℃、１０分の熱処理で８０％以上
の活性が残存例えば、２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）を用いて、４５℃で１０分間処理した後、本酵素の
残存活性を測定する。理化学的性質のうち、特に高温域
で高い安定性を有する本発明オキシダーゼが産業利用上
特に好ましい。例えば、上記処理条件下で、５０％以
上、好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上
活性が残存している本発明オキシダーゼなどが挙げられ
る。（ｄ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ６．０〜９．０例えば、緩衝液として、２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
３．０−６．０）、２００ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐ
Ｈ６．０−７．０）、２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
６．８−９．０）、２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ６．５−８．０）、２００ｍＭグリシン緩衝液
（ｐＨ８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて
３０℃で１０分間処理した後、本発明オキシダーゼの残
存活性を測定する。例えば、安定ｐＨの範囲として、ｐ
Ｈ５．０〜１０．０、好ましくはｐＨ６．０〜９．０の
理化学的性質を有する本発明オキシダーゼなどが挙げら
れる。（ｅ）分子量：約５２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）例えば、マルチゲル１０／２０（第一化学薬品社製）を
用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量を求める。例え
ば、分子量として４５，０００〜６０，０００、好まし
くは、４７，０００〜５７，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）の分子量を有する本発明オキシダーゼなどが挙げら
れる。現在、蛋白質の分子量を測定する場合、一般にＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ法が多く用いられている。本測定法によ
り得られた分子量の測定誤差を考慮すると、分子量約５
２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の測定値は、４７，０
００〜５７，０００の範囲の分子量が含まれると考えら
れている。

【００１７】一方、ε−フルクトシルリジンに作用しに
くい本発明オキシダーゼとは、以下に示す酵素活性の測
定において、フルクトシルバリルヒスチジンを基質とし
て用いたときの活性に比べて、ε−フルクトシルリジン
を基質として用いたときの活性が低い本発明オキシダー
ゼをいい、ε−フルクトシルリジンを含む測定用試料中
のフルクトシルバリルヒスチジンを精度良く測定するこ
とのできるオキシダーゼであればよい。すなわち、フル
クトシルバリルヒスチジンを基質として用いたときの活
性を１００としたとき、ε−フルクトシルリジンを基質
として用いたときの活性が７０以下、好ましくは５０以
下、さらに好ましくは２０以下のε−フルクトシルリジ
ンに作用しにくい本発明オキシダーゼをいう。

【００１８】ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本
発明オキシダーゼの一形態として、例えば、上記反応を
触媒する作用を有し、かつフルクトシルバリルヒスチジ
ンに作用するが、ε−フルクトシルリジンに作用しにく
い性質を有する、４５℃、１０分の熱処理で８０％以上
の活性が残存するフルクトシルペプチドオキシダーゼ、
さらには、上記作用および性質を有すると同時に、以下
の（ａ）〜（ｄ）に記載の理化学的性質をそれぞれもし
くはそれらを適宜併せて有するフルクトシルペプチドオ
キシダーゼなどもε−フルクトシルリジンに作用しにく
い本発明オキシダーゼとして挙げられる。（ａ）至適ｐＨ：ｐＨ６．０〜８．０例えば、緩衝液として２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
３．０−６．０）、２００ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐ
Ｈ６．０−７．０）、２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
６．８−９．０）、２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ６．５−８．０）、２００ｍＭグリシン緩衝液
（ｐＨ８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおい
て、温度３０℃にて酵素反応を行ない、至適ｐＨを求め
る。例えば、至適ｐＨとしてｐＨ５．０〜９．０、好ま
しくはｐＨ６．０〜８．０の理化学的性質を有するε−
フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼ
などが挙げられる。（ｂ）作用適温の範囲：２０〜４０℃ 例えば、後述の活性測定法における反応液と同一組成よ
りなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定
を行ない、作用適温の範囲を求める。例えば、作用適温
の範囲として２０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃の
理化学的性質を有するε−フルクトシルリジンに作用し
にくい本発明オキシダーゼなどが挙げられる。（ｃ）熱安定性：４５℃、１０分の熱処理で８０％以上
の活性が残存例えば、２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）を用いて、４５℃で１０分間処理した後、本酵素の
残存活性を測定する。理化学的性質のうち、特に高温域
で高い安定性を有する本発明オキシダーゼが産業利用上
特に好ましい。例えば、上記処理条件下で、５０％以
上、好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上
活性が残存しているε−フルクトシルリジンに作用しに
くい本発明オキシダーゼなどが挙げられる。（ｄ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ６．０〜９．０例えば、緩衝液として、２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
３．０−６．０）、２００ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐ
Ｈ６．０−７．０）、２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
６．８−９．０）、２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ６．５−８．０）、２００ｍＭグリシン緩衝液
（ｐＨ８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて
３０℃で１０分間処理した後、本発明オキシダーゼの残
存活性を測定する。例えば、安定ｐＨの範囲として、ｐ
Ｈ５．０〜１０．０、好ましくはｐＨ６．０〜９．０の
理化学的性質を有するε−フルクトシルリジンに作用し
にくい本発明オキシダーゼなどが挙げられる。

【００１９】本発明オキシダーゼやε−フルクトシルリ
ジンに作用しにくい本発明オキシダーゼ(本発明オキシ
ダーゼ等という)の酵素活性の測定方法としては、酵素
の反応により生成するα−ケトアルデヒド、ペプチド、
過酸化水素などの量を測定する方法や酵素反応により消
費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として
挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定
する方法について示す。以下、本発明オキシダーゼ等の
活性測定には、ことわりのない限り、フルクトシルバリ
ルヒスチジンを基質として用いる。なお、酵素力価は、
フルクトシルバリルヒスチジンを基質として測定したと
き、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量
を１Ｕと定義する。

【００２０】Ａ．試薬の調製（１）試薬１：ＰＯＤ−４−ＡＡ溶液１．０ｋＵのパーオキシダーゼ（東洋紡社製、ＴＹＰＥ
ＩＩＩ）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（東
京化成社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
８．０）に溶解し、１Ｌに定容する。（２）試薬２：２，４−ジクロロフェノールサルフェー
ト溶液市販２％溶液（ナカライ社製）２５ｍｌをイオン交換水
に溶解し、１００ｍｌに定容する。（３）試薬３：基質溶液（１５０ｍＭ；終濃度５ｍ
Ｍ）フルクトシルバリルヒスチジン６２４ｍｇをイオン交換
水に溶解して１０ｍｌに定容する。フルクトシルグリシ
ンまたはε−フルクトシルリジンを基質として用いると
きはそれぞれ、３５７ｍｇ、４６２ｍｇをイオン交換水
に溶解して、１０ｍｌに定容した溶液を用いる。フルク
トシルバリンヒスチジンは特開２００１−９５５９８記
載の方法により調製した。フルクトシルグリシン、ε−
フルクトシルリジンは堀内らの方法により調製した（Ag
ric. Biol. Chem., 53, 103-110, 1989, Agric. Biol.
Chem., 55, 333-338, 1991）Ｂ．測定法２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１０
０μｌの酵素液を混和し、３０℃で５分間予備加温す
る。その後１００μｌの試薬３を加えて良く混ぜた後、
分光光度計（Ｕ−２０００Ａ、日立社製）により、５１
０ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値は、５１０ｎ
ｍにおける１分後から３分後の１分間あたりの吸光度変
化とする。なお対照液は、１００μｌの試薬３の代わり
に１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様
にしたものである。これをあらかじめ作製しておいた過
酸化水素の標準溶液を試薬３の代わりに、また酵素液の
代わりにイオン交換水を用い、その生成色素量との関係
を調べたグラフを用意する。このグラフを用いて、３０
℃、１分間当たりに生成される過酸化水素のマイクロモ
ルを計算し、この数値を酵素液中の活性単位とする。ε
−フルクトシルリジンに作用するか否かを測定する時
は、フルクトシルバリルヒスチジンの代わりに、ε−フ
ルクトシルリジンを基質として用いた試薬３（基質溶
液）を用いることにより、上記と同様の操作で測定する
ことができる。

【００２１】このように本発明オキシダーゼ等は、酸素
存在下でフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、α−
ケトアルデヒド、バリルヒスチジン及び過酸化水素を生
成する、前式に示した反応を触媒するオキシダーゼであ
り、例えば、前記作用を有し、前述した種々の理化学的
性質をそれぞれもしくは適宜組み合わせて、併せ持つ本
発明オキシダーゼ等も挙げることができる。そしてこれ
らの本発明オキシダーゼ等は、糖化ヘモグロビンなどの
糖化蛋白質を含む試料をプロテアーゼで処理し、遊離し
たフルクトシルバリルヒスチジンに効率よく作用するた
め、糖化蛋白質の測定用酵素として有効に用いられる。
さらに、理化学的性質のうち、高い熱安定性を有する本
発明酵素は、臨床診断用酵素として利用する上で、特に
好ましい本発明オキシダーゼ等として挙げられる。一
方、糖化蛋白質を含む試料をプロテアーゼで処理したと
き、用いる試料によっては、フルクトシルバリルヒスチ
ジンと同時にε−フルクトシルリジンが遊離される。こ
の場合、本発明オキシダーゼでフルクトシルバリルヒス
チジンの量を測定する時、本発明オキシダーゼがε−フ
ルクトシルリジンにもよく作用する性質を有している
と、精度の良い測定結果を得ることが困難となる場合が
ある。そのような場合には、ε−フルクトシルリジンに
作用しにくい本発明オキシダーゼはさらに好ましい。

【００２２】本発明オキシダーゼ等は、微生物や動物、
植物起源の酵素を探索して、自然界より取得することが
できる。例えば、本発明オキシダーゼを生産する能力を
有する微生物を探索する場合、フルクトシルバリルヒス
チジンなどの酵素生産誘導物質を加えた培地で微生物を
培養し、得られた微生物菌体を破砕し、フルクトシルバ
リルヒスチジンを基質として用い、フルクトシルペプチ
ドオキシダーゼ活性を調べることにより本発明オキシダ
ーゼ生産能を有する微生物を取得できる。ここで用いる
微生物は土壌から新たに分離してもよく、さらには、微
生物保存機関等より入手した微生物を用いることも出来
る。さらに、例えば、保存安定性に優れた本発明オキシ
ダーゼを得るには、上記のようにして得られた微生物菌
体破砕液を、例えば４５℃、１０分などの熱処理をした
のち活性を測定し、残存活性の高いものを選抜すること
で可能である。本発明オキシダーゼ生産能を有する生物
としては、取り扱いの容易さ、生産性等の点から、例え
ば、微生物の生産する本発明オキシダーゼが好ましく、
微生物でも、例えば、糸状菌などの生産する本発明オキ
シダーゼが好ましく、糸状菌としては、アカエトミエラ
属、アカエトミウム属、シエラビア属、カエトミウム
属、ゲラシノスポラ属、ミクロアスカス属、コニオカエ
タ属、ユウペニシリウム属などに属する糸状菌が挙げら
れる。それらの内でも、アカエトミエラ属、カエトミウ
ム属、コニオカエタ属、ユウペニシリウム属などに属す
る糸状菌等が好ましい微生物として挙げられる。さら
に、アカエトミエラ・ヴィレシェンスＡＴＣＣ３２
３９３（Achaetomiella virescensATCC 32393）、カエ
トミウムｓｐ．ＮＩＳＬ９３３５ (Chaetomium s
p. NISL 9335)（ＦＥＲＭＢＰ−７７９９）、コニオカ
エタｓｐ．ＮＩＳＬ９３３０ (Coniochaeta sp. NI
SL 9330)（ＦＥＲＭＢＰ−７７９８）、ユウペニシリ
ウム・テレナムＡＴＣＣ１８５４７（Eupenicilliu
m terrenum ATCC 18547）などが特に好ましい微生物と
して挙げられる。

【００２３】一方、フルクトシルバリルヒスチジンに作
用するが、ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発
明オキシダーゼを生産する能力を有する微生物を探索す
る場合は、上記探索により得られた本発明オキシダーゼ
を生産する能力を有する微生物のうち、ε−フルクトシ
ルリジンを基質として用いたときの活性が、フルクトシ
ルバリルヒスチジンを基質として用いたときの活性に比
べて低い本発明オキシダーゼを生産する能力を有する微
生物を選抜する。ε−フルクトシルリジンに作用しにく
い本発明オキシダーゼを生産する能力を有する微生物と
しては、例えば、糸状菌などの生産する本発明オキシダ
ーゼが好ましく、糸状菌としては、例えばユウペニシリ
ウム属に属する糸状菌やコニオカエタ属に属する糸状
菌、それらの内でも、例えば、ユウペニシリウム属に属
する糸状菌がユウペニシリウム・テレナムＡＴＣＣ
１８５４７（Eupenicillium terrenum ATCC 18547）、
ユウペニシリウム・センティコサムＩＦＯ９１５８
（Eupenicillium senticosumIFO 9158）、ユウペニシリ
ウム・アイダホーエンスＩＦＯ９５１０（Eupenici
llium idahoense IFO 9510）及びユウペニシリウム・ユ
ーグラウカムＩＦＯ３１７２９（Eupenicillium eu
glaucum IFO 31729）などやコニオカエタ属に属する糸
状菌がコニオカエタｓｐ．ＮＩＳＬ９３３０ (Conioc
haeta sp. NISL 9330)（ＦＥＲＭＢＰ−７７９８）な
どが好ましい糸状菌として挙げられる。

【００２４】さらに、本発明オキシダーゼとして、遺伝
子工学的技術や変異処理などの方法により、天然型の本
発明オキシダーゼを改変して得られる本発明オキシダー
ゼばかりでなく、従来公知の酵素遺伝子、例えばフルク
トシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子などを改変して得ら
れる本発明オキシダーゼなども挙げられる。改変する方
法としては、例えば、上記オキシダーゼを生産する生物
に、紫外線、Ｘ線、放射線などを照射したり、もしくは
エチルメタンサルフォネート、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸などの変異誘発剤
を接触させることにより、改変された本発明オキシダー
ゼを生産する微生物を得、得られた微生物から本発明オ
キシダーゼを得る方法などが挙げられる。一般的には、
遺伝子工学的な技術を用い、性質を異にするオキシダー
ゼなどをコードする遺伝子を改変することにより、本発
明オキシダーゼを得ることもできる。

【００２５】次に本発明オキシダーゼ等の製造方法につ
いて述べる。本発明では、本発明オキシダーゼ等の活性
を有する生物体より本発明オキシダーゼ等を、通常用い
られている種々の蛋白質分離方法を用いて、回収するこ
とにより製造することができる。例えば、前記した本発
明オキシダーゼ等の生産能を有する微生物を培地に培養
し、培養物からフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性
を有するタンパク質やフルクトシルペプチドオキシダー
ゼ活性を有し、ε−フルクトシルリジンに作用しにくい
タンパク質を回収することにより、本発明オキシダーゼ
等を製造する方法が好ましい方法として挙げられる。一
例として、本発明オキシダーゼ生産能を有する微生物を
用いる以下の方法が、具体的な製造方法として採用でき
る。まず、探索の結果、得られた本発明オキシダーゼを
生産する微生物（以下「微生物」と総称する）を培養す
る。この場合、固体培養法で培養してもよいが、液体培
養法を採用して培養するのがより好ましい。また、上記
微生物を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、
ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆も
しくは小麦麹の浸出液など１種以上の窒素源に、リン酸
二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄もしくは硫酸マンガンな
どの無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖
質原料、ビタミンなどを適宜添加したものが用いられ
る。酵素生産誘導基質として、フルクトシルグリシン、
フルクトシルバリルヒスチジン、ε−フルクトシルリジ
ンなどの酵素基質を適宜添加するのも生産量をあげるの
に有効である。

【００２６】なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調製す
るのが適当である。また培養は、２５〜４２℃、好まし
くは３０℃前後で１〜５日間、通気攪拌深部培養、振と
う培養、静置培養などにより実施するのが好ましい。培
養終了後、該培養物より本発明オキシダーゼを採取する
には、通常の酵素採取手段を用いることが出来る。

【００２７】次いで、培養液から、例えば、濾過、遠心
分離等の操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体
から本発明オキシダーゼを採取することが好ましい。こ
の場合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波
破砕機、フレンチプレス、ダイノミル等の種々の破壊手
段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチーム等の細胞壁
溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトン
Ｘ−１００等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出
する方法などにより、菌体から本発明オキシダーゼを採
取するのが好ましい。

【００２８】このようにして得られた粗酵素液から本発
明オキシダーゼを精製、単離するには、通常の酵素精製
に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、
有機溶媒沈殿法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾
過クロマトグラフ法、疎水クロマトグラフ法、吸着クロ
マトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行うの
が好ましい。このようにして、本発明オキシダーゼを、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でほぼ単一のバンドを示すまでに単
離することができる。また、上記精製方法を適宜組み合
わせて、用途に応じた精製度合いの異なる酵素標品を調
整することもできる。また、ε−フルクトシルリジンに
作用しにくい本発明オキシダーゼについても、該オキシ
ダーゼを生産する微生物を用いて、上述した本発明オキ
シダーゼの製造方法と同様の方法により製造することが
できる。

【００２９】このようにして得られた本発明オキシダー
ゼは、例えば、以下に述べる糖化蛋白質の測定などに有
効に用いられる。先ず、ＨｂＡ_１ｃなど糖化タンパク質
をモルシン、ＡＯプロテアーゼ、ペプチダーゼ（キッコ
ーマン販売）や、カルボキシペプチダーゼＹ、プロチ
ンＰ（大和化成販売）などのプロテアーゼにより消化
し、フルクトシルペプチドを遊離させる。次に遊離した
フルクトシルバリルヒスチジンを本発明オキシダーゼに
より測定する。その際、同時に遊離するε−フルクトシ
ルリジンが問題となる場合は、ε−フルクトシルリジン
に作用する酵素、例えば真菌由来のフルクトシルアミノ
酸オキシダーゼ（特開平７−２８９２５３、特開平８−
１５４６７２、特開平８−３３６３８６など）や、フル
クトシルアミンオキシダーゼ（特開平０３−１５５７８
０）などで消化した後、本発明オキシダーゼでフルクト
シルバリルヒスチジンを測定することもできる。また、
ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダ
ーゼを用いれば、遊離したε−フルクトシルリジンを消
化しなくともフルクトシルバリルヒスチジンを精度良く
測定することができる。

【００３０】さらに、本発明オキシダーゼとして、例え
ば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は
（ｆ）などの本発明オキシダーゼなどが挙げられる。（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むフルク
トシルペプチドオキシダーゼ。（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１
から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された
アミノ酸配列を含むフルクトシルペプチドオキシダー
ゼ。（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上
の相同性を示すアミノ酸配列を含むフルクトシルペプチ
ドオキシダーゼ。（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むフルク
トシルペプチドオキシダーゼ。（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１
から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された
アミノ酸配列を含むフルクトシルペプチドオキシダー
ゼ。（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上
の相同性を示すアミノ酸配列を含むフルクトシルペプチ
ドオキシダーゼ。ここで、「１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又
は付加された」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１
〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミ
ノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたことを意味す
る。また、「８０％以上の相同性を示す」とは、配列番
号１又は３で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％
以上であれば特に制限がなく、例えば８０％以上、好ま
しくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。

【００３１】上記本発明オキシダーゼとして、例えば、
コニオカエタｓｐ．ＮＩＳＬ９３３０ (Coniochaeta
sp. NISL 9330)（ＦＥＲＭＢＰ−７７９８）の染色体
ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の天然型フルクトシルペプチド
オキシダーゼ遺伝子をクローニングし、これを適当なベ
クター宿主系に導入して、発現させて得られるオキシダ
ーゼや、ユウペニシリウム・テレナムＡＴＣＣ１８
５４７（Eupenicillium terrenum ATCC 18547）の染色
体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の天然型フルクトシルペプチ
ドオキシダーゼ遺伝子をクローニングし、これを適当な
ベクター宿主系に導入して、発現させて得られるオキシ
ダーゼなどが挙げられる。さらに、自然界より取得され
た種々起源のフルクトシルペプチドオキシダーゼなどか
らも得られる。

【００３２】次に、本発明のフルクトシルペプチドオキ
シダーゼをコードするフルクトシルペプチドオキシダー
ゼ遺伝子（以下、「本発明遺伝子」という）としては、
例えば、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）
又は（ｆ）などの本発明オキシダーゼをコードする遺伝
子や、さらに以下の（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、
（ｋ）又は（ｌ）のＤＮＡを含む本発明オキシダーゼを
コードする遺伝子などが挙げられる。（ｇ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。（ｈ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの
全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と相補的な塩基
配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。（ｉ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの
全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と８０％以上の
相同性を示し、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。（ｊ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。（ｋ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの
全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と相補的な塩基
配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。（ｌ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの
全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と８０％以上の
相同性を示し、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【００３３】ここで、「ストリンジェントな条件」と
は、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・
ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロット・
ハイブリダイゼーション法等（Current Protocols in M
olecular Biology （WILEY Interscience，1989））を
行った際、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的
なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であ
り、この条件は使用するハイブリダイゼーションの系
と、プローブの種類、配列および長さによって異なる。
このような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変
えること、洗浄の温度および塩濃度を変えることにより
決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシ
グナルまで強く検出してしまう場合には、ハイブリダイ
ゼーションおよび洗浄の温度を上げるとともに、必要に
応じて洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げる
ことができる。また、特異的なハイブリッドのシグナル
も検出されない場合には、ハイブリダイゼーションおよ
び洗浄の温度を下げるとともに、必要に応じて洗浄の塩
濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させる
ことができる。より具体的には、ストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするＤＮＡは、プローブとして使
用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤ
ＮＡなどが挙げられる。本発明における、「全長又は塩
基配列の１５塩基以上の部分と８０％以上の相同性を示
す塩基配列を含むＤＮＡ」の相同性は、例えば８０％以
上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上
である。

【００３４】上記本発明オキシダーゼをコードする遺伝
子として、例えば、コニオカエタｓｐ．ＮＩＳＬ９３
３０ (Coniochaeta sp. NISL 9330)（ＦＥＲＭＢＰ−
７７９８）の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の天然型フ
ルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子をクローニング
し、これを適当なベクター宿主系に導入して、発現させ
て得られるオキシダーゼをコードする遺伝子やユウペニ
シリウム・テレナムＡＴＣＣ１８５４７（Eupenicill
ium terrenum ATCC 18547）の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮ
Ａ由来の天然型フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝
子をクローニングし、これを適当なベクター宿主系に導
入して、発現させて得られるオキシダーゼをコードする
遺伝子などが挙げられる。

【００３５】また、上記ＤＮＡとして、例えば、コニオ
カエタｓｐ．ＮＩＳＬ９３３０ (Coniochaeta sp. NI
SL 9330)（ＦＥＲＭＢＰ−７７９８）の染色体ＤＮＡ
又はｃＤＮＡ由来の天然型フルクトシルペプチドオキシ
ダーゼ遺伝子やユウペニシリウム・テレナムＡＴＣＣ
１８５４７（Eupenicillium terrenum ATCC 18547）
の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来の天然型フルクトシル
ペプチドオキシダーゼ遺伝子などが挙げられる。さら
に、自然界より取得された種々起源のフルクトシルペプ
チドオキシダーゼなどからも上記本発明オキシダーゼを
コードする遺伝子や上記ＤＮＡが得られる。さらに、天
然型のフルクトシルペプチドオキシダーゼから得られた
種々の変異型フルクトシルペプチドオキシダーゼから
も、上記本発明オキシダーゼ、上記本発明オキシダーゼ
をコードする遺伝子、そして上記ＤＮＡが得られる。次
に本発明遺伝子の取得方法について説明する。

【００３６】本発明遺伝子を得るには、通常一般的に用
いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。
例えば、前述した本発明オキシダーゼ生産能を有する微
生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Prot
ocols in Molecular Biology（WILEY Interscience，19
89）記載の方法により、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽
出する。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成す
ることができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ
又はｃＤＮＡのライブラリーを作製する。ついで、上記
本発明オキシダーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプ
ローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又
はｃＤＮＡのライブラリーからスクリーニングする方
法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプラ
イマーＤＮＡを作製して、５’-ＲＡＣＥ法や３’-ＲＡ
ＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）
により、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、こ
れらを連結させて全長の本発明遺伝子を含むＤＮＡを得
ることができる。さらに、上記プローブＤＮＡとのハイ
ブリダイゼーションを用いて、種々の生物から本発明オ
キシダーゼをコードする本発明遺伝子を得ることもでき
る。

【００３７】例えば、コニオカエタｓｐ．ＮＩＳＬ９
３３０ (Coniochaeta sp. NISL 9330)（ＦＥＲＭＢＰ
−７７９８）の本発明遺伝子やユウペニシリウム・テレ
ナムＡＴＣＣ１８５４７（Eupenicillium terrenum A
TCC 18547）の本発明遺伝子は以下のようにして得るこ
とができる。まず、上記微生物等を培養し、得られた菌
体を液体窒素中で凍結させた後、乳鉢などを用いて物理
的に磨砕することにより、細かい粉末状の菌体片とし、
該菌体片から、市販のＤＮＡ抽出キット等を用いて、通
常の方法により染色体ＤＮＡを抽出する。次いで、前記
菌体片から、市販のＲＮＡ抽出キットなどを用いて、通
常の方法により全ＲＮＡ画分を抽出し、この抽出液から
エタノール沈殿によりＲＮＡを回収する。さらに必要に
より、市販の Oligo dT カラムなどを用い、通常の方法
により、ポリＡ鎖を有するＲＮＡを分画しても良い。

【００３８】次いで、上記微生物等の生産する本発明オ
キシダーゼを精製、単離し、それらのＮ末端アミノ酸配
列を決定する。また、それをトリプシンやリジルエンド
ペプチダーゼで消化して得られたペプチド断片のアミノ
酸配列を決定することにより、内部のアミノ酸配列を決
定しても良い。次に、得られた部分アミノ酸配列の情
報、上記微生物のコドン使用頻度などを考慮して、ＰＣ
Ｒに用いるプライマーを合成する。これらのプライマー
と上記の得られた染色体ＤＮＡやＲＮＡを鋳型として、
ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲを行ない、本発明オキシダーゼの
一部をコードするＤＮＡ断片を得る。さらに適宜、得ら
れたＤＮＡ断片の塩基配列に基づきプライマーを合成す
る。

【００３９】次に、上記プライマーとＲＮＡを用い、
５’-ＲＡＣＥ法や３’-ＲＡＣＥ法などの適当なＲＴ−
ＰＣＲ法により、本発明遺伝子の断片を含むｃＤＮＡを
増幅させ、これらを連結させて、全長の本発明遺伝子を
含むｃＤＮＡを得ることができる。また、ＲＮＡを鋳型
として、５'末端配列、及び３'末端配列に相補的な合成
プライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行なうことによ
り、本発明遺伝子を含むｃＤＮＡを増幅することもでき
る。増幅されたＤＮＡは、通常の方法に準じてクローニ
ングできる。この増幅されたＤＮＡを適当なベクターに
挿入して組換え体ＤＮＡを得る。クローニングには、例
えば、ＴＡ Cloning Kit （Invitrogen 社）等の市販の
キットやベクターとしては、ｐUC１１９（寶酒造社
製）、ｐBR３２２（寶酒造社製）、ｐMAL−C2（NEWEngl
and Labs 社製）、ｐBluescript I I SK⁺（Stratagene
社製）、pKK223-3（アマシャム・バイオテク社）等のプ
ラスミドベクターDNA やλENBL3（Stratagene社製）、
λDASH I I （フナコシ社製）等のバクテリオファージ
ベクターDNA等を用いることが出来る。

【００４０】このようにして得られた組換え体ＤＮＡを
用いて、例えば、大腸菌Ｋ１２、好ましくは大腸菌ＪＭ
１０９、ＤＨ５α（共に東洋紡社製）、ＸＬ１−Ｂｌｕ
ｅ（フナコシ（株）製）等を形質転換又は形質導入し、
組換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体を得る
ことが出来る。形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方
法(Method in Enzymology,68,326-331,1979)により行な
うことができる。また、形質導入は、例えば、B.Hohnの
方法 (Method in Enzymology,68,299-309,1979)により
行なうことができる。宿主細胞としては、大腸菌のほ
か、適宜、他の細菌、酵母、糸状菌、放線菌などの微生
物や動物細胞など使用できる。

【００４１】上記増幅されたＤＮＡの全塩基配列は、例
えば、LI-COR MODEL 4200L シークエンサー（LI-COR社
製）、３７０ＡＤＮＡシークエンス・システム（パー
キンエルマー社製）などを用いて、解析することができ
る。塩基配列を部分アミノ酸配列の情報と比較すること
により、本発明遺伝子が取得できたか否かを確認するこ
ともできる。得られた本発明遺伝子の解析により、翻訳
されるポリペプチド、すなわち、本発明オキシダーゼの
アミノ酸配列が確定される。本発明遺伝子の一例とし
て、配列番号２又は４で表される塩基配列からなるＤＮ
Ａを含む遺伝子などが挙げられる。配列番号２で表され
る塩基配列からなるＤＮＡを含むプラスミドｐＫＫ２２
３−３−ＣＦＰは、独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センターにＦＥＲＭＢＰ−８１３２と
して寄託されており、配列番号４で表される塩基配列か
らなるＤＮＡを含むプラスミドｐｕｃ−ＥＦＰは、ＦＥ
ＲＭＢＰ−８１３１として寄託されている。さらに、
上記本発明遺伝子を改変することにより、種々の改変さ
れた本発明オキシダーゼを得ることができる。

【００４２】上記遺伝子を改変する方法としては、既知
の如何なる方法でも用いることができるが、例えば、前
記の組換え体ＤＮＡに、ハイドロキシルアミン、亜硝酸
などの化学変異剤を接触させる方法、またはＰＣＲ法を
用いてランダムに変換する等の点変異方法、市販のキッ
トを使用する部位特異的な置換または欠失変異を生じさ
せるための周知技術である部位特異的変異誘導法、この
組換え体ＤＮＡを選択的に開裂し、次いで選択されたオ
リゴヌクレオチドを除去又は付加し、連結する方法、す
なわちオリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。
次いで、上記処理後の組換え体ＤＮＡを脱塩カラム、Ｑ
ＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）等を用いて精製し、種々の
組換え体ＤＮＡを得ることができる。これらの改変によ
り、例えば、配列番号２又は４で表される塩基配列から
なるＤＮＡの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と
相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズし、かつフルクトシルペプチド
オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａや配列番号２又は４で表される塩基配列からなるＤＮ
Ａの全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と８０％以
上の相同性を示し、かつフルクトシルペプチドオキシダ
ーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからな
る本発明遺伝子が得られるさらに、本発明遺伝子を改変
することにより、例えば、配列番号１、又は３で表され
るアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠
失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、
かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタ
ンパク質や配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列と
８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ
フルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパ
ク質等の本発明オキシダーゼがえられる。次に、上記組
換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体を培地に
培養し、培養物からフルクトシルペプチドオキシダーゼ
を採取する。一般に、形質転換体又は形質導入体の培養
は、用いられた宿主の生育に適した培地を用いて培養さ
れる。例えば、宿主として大腸菌を用いた場合、形質転
換体をＬＢ培地１０Ｌに植菌し、ジャーファーメンタを
用いて、通気量１Ｌ／min 、攪拌速度６００rpmの条件
で、３０℃、２４時間培養した。得られた培養液１０Ｌ
を７０００rpm、１０分間遠心分離して集菌し、菌体を
得る。得られた菌体から、先に述べた方法により、本発
明酵素を取得することができる。

【００４３】

【実施例】以下、実験例、実施例により本発明をさらに
具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲は、それ
らの例により何ら限定されるものではない。

【００４４】（実験例１）本発明オキシダーゼ生産能を
有する微生物の検索検索には、土壌より分離した菌、および微生物保存機関
から分与された保存菌を用いた。土壌由来菌について
は、千葉県野田市、茨城県筑波付近の土壌を約１００箇
所採取し、それぞれ小スパーテル１さじを濃縮培地（イ
ーストエキス０．５％、リン酸二水素カリウム０．２
％、硫酸マグネシウム０．０５％、フルクトシルバリ
ルヒスチジン０．１％、ｐＨ６．５）を用いて、３０
℃、１日振とう培養したのち、平面培地（濃縮培地＋寒
天１．２％）で分離した。分離した菌株は約５０００
株で主にバクテリア、酵母であった。保存菌は酵母３８
０株、糸状菌４８０株、放線菌７００株を用いた。土壌
由来菌および酵母は上記濃縮培地、糸状菌は酵素誘導培
地１（イーストエキス０．１％、マルツエキス０．
１％、リン酸二水素カリウム０．１％、硫酸マグネシ
ウム０．０５％、フルクトシルバリルヒスチジン
０．１％、ｐＨ７．３）、放線菌は酵素誘導培地２（乾
燥酵母０．２％、大豆粉１．２５％、フルクトシル
バリルヒスチジン２％）３ｍｌにそれぞれ接種した。
土壌由来菌は２４時間、酵母、糸状菌および放線菌は３
〜５日、３０℃で振とう培養した。この培養液を３００
０ｒｐｍ、１０分遠心分離して菌体を得た。その後、溶
菌バッファー（１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ
８）、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、
０．５ｍＭＰＭＳＦ）に懸濁し、超音波処理（１〜３
分）またはヒストコロン（５０パワー、３０秒、２回、
（株）日音医理科器機社製）等により菌体を破砕し、ト
リトンＸ−１００を０．５％となるように添加後、４
℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分の遠心により上清を回
収し、粗酵素液とした。この粗酵素液について、上記活
性測定法にて、フルクトシルペプチドオキシダーゼ活性
の有無を調べたところ、同活性をもつものが糸状菌から
１９株得られた。すなわち、アカエトミエラ属の糸状菌
１株、アカエトミウム属の糸状菌８株、シエラビア属の
糸状菌１株、カエトミウム属の糸状菌２株、ゲラシノス
ポラ属の糸状菌１株、ミクロアスカス属の糸状菌１株、
コニオカエタ属の糸状菌１株、ユウペニシリウム属の糸
状菌４株であった。

【００４５】（実施例１）アカエトミエラ属に属する糸
状菌の生産する本発明オキシダーゼの製造アカエトミエラ・ヴィレシェンスＡＴＣＣ３２３９
３を０．１５Ｌ容三角フラスコに入れた培地（イースト
エキス０．４％、マルツエキス１％、グルコース２
％、トリプトン０．１％、リン酸二水素カリウム０．
１％、硫酸マグネシウム０．０５％、ｐＨ７）０．０
５Ｌに接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで３日間回転振
とう培養した。これを種培養として、５Ｌ三角フラスコ
に入れた上記培地１Ｌに１０ｍｌずつ接種し、３０℃、
９０ｒｐｍで４日間回転振とう培養した。この培養液よ
り、ろ紙を張ったブフナーろうとを用いて菌体を回収し
た。得られた菌体は−８０℃で凍結保存した。

【００４６】凍結菌体（６Ｌ培養液分）をバッファーＡ
（０．４Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸バッファ
ー、１ｍＭＥＤＴＡ、５％グリセロール、０．５ｍＭ
ＰＭＳＦ、ｐＨ８）１Ｌに懸濁し、フレンチプレスによ
り破砕した。破砕液は９,０００ｒｐｍで、１５分遠心
し、上清をあらかじめバッファーＡで平衡化したＤＥＡ
ＥセファロースＦＦ（アマシャムバイオテク社製）カラ
ム（５ｃｍ×１８ｃｍ）にかけた。さらに５００ｍｌの
バッファーＡを上から流し、溶出液すべてを回収した。
溶出液に硫酸アンモニウムを４０％飽和となるよう徐々
に添加し、余分な蛋白質を沈殿させた。一晩、４℃で放
置後、遠心（９,０００ｒｐｍ、４℃、１５分）し、上
清に硫酸アンモニウムを６５％飽和となるよう徐々に添
加し、目的の蛋白質を沈殿させた。一晩、４℃で放置
後、遠心（９,０００ｒｐｍ、４℃、１５分）し、沈殿
物を回収した。

【００４７】これに、３０ｍｌのバッファーＢ（１０ｍ
Ｍトリス、０．２ｍＭＥＤＴＡ、１％グリセロー
ル、ｐＨ８．６）を加え溶解し、ＰＤ−１０（アマシャ
ムバイオテク社製）により脱塩した後、あらかじめバッ
ファーＢで平衡化したＱセファロースＦＦ（アマシャム
バイオテク社製）カラム（２．５ｃｍ×１５ｃｍ）にか
けた。１５０ｍｌのバッファーＢで洗浄後、バッファー
ＢからバッファーＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５
０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、５％グリセロー
ル、ｐＨ８．６）のリニアグラジェントで溶出させた。
活性は約０．０８Ｍ塩化ナトリウムで溶出した。溶出さ
れた活性画分をセントリプレップ１０（アミコン社製）
で濃縮、透析し、ＴＳＫｇｅｌｓｕｐｅｒＱ（東ソー
社製）にかけた。溶出はバッファーＢ〜バッファーＣの
リニアグラジェントで行った。流速は１ｍｌ／ｍｉｎで
行い、２８０ｎｍでモニターした。活性は約０．０８Ｍ
塩化ナトリウムで溶出した。

【００４８】得られた活性画分はマイクロコン１０（ア
ミコン社製）で濃縮し、ＰＯＲＯＳＰＥ（パーセプテ
ィブ・バイオシステムズ社製）にかけた。溶出はバッフ
ァーＤ（２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭリン酸バッ
ファー、１ｍＭＥＤＴＡ、５％グリセロール、ｐＨ
７）〜バッファーＥ（２０ｍＭリン酸バッファー、１
ｍＭＥＤＴＡ、５％グリセロール、ｐＨ８）のリニア
グラジェントで行った。流速は２ｍｌ／ｍｉｎで行
い、２８０ｎｍでモニターした。活性は約１Ｍ硫酸アン
モニウムで溶出した。得られた活性画分をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分析したところ、単一なバンドが得られた（分子
量約５２，０００）。得られた活性画分を以下の理化学
的性質を決定するのに用いた。

【００４９】（実施例２）アカエトミエラ属に属する糸
状菌の生産する本発明オキシダーゼの理化学的性質実施例１により得られた本発明オキシダーゼの理化学的
性質は、下記の通りであった。（ａ）作用及び基質特異性前述した酵素活性の測定方法により、基質としてフルク
トシルバリルヒスチジン、フルクトシルグリシン、ε−
フルクトシルリジンを用いて、本発明オキシダーゼの活
性を測定した。本発明オキシダーゼは、ε−フルクトシ
ルリジンに対する活性を１００％とすると、フルクトシ
ルバリルヒスチジンは４２％、フルクトシルグリシンは
１８％であった。（ｂ）至適ｐＨ緩衝液として２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−
６．０）、２００ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０
−７．０）、２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．８−
９．０）、２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６．５−８．０）、２００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ
８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度
３０℃にて酵素反応を行った。結果を図１に示す。本発
明オキシダーゼは、ｐＨ８．０において最も高い活性を
示した。また、ｐＨ７．０−８．０でもｐＨ８．０付近
における活性値の７０％以上を示したことから、本発明
オキシダーゼの至適ｐＨはｐＨ７．０−８．０であり、
最も好ましい至適ｐＨはｐＨ８．０であると判断した。（ｃ）フルクトシルバリルヒスチジンに対するＫｍ値前記活性測定法において、基質フルクトシルバリルヒス
チジン濃度を変化させて活性測定を行ない、ラインウェ
ーバー・バークプロットから、ミカエリス定数（Ｋｍ）
を求めた。この結果、フルクトシルバリルヒスチジンに
対するＫｍ値は２．３ｍＭであることが判かった。（ｄ）至適温度の範囲上述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反
応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行っ
た。結果を図３に示す。最も高い活性を示した温度であ
る、４０℃付近での活性に対して５０％以上の活性を示
す温度範囲は、３０〜４５℃であった。以上から、本発
明オキシダーゼの至適温度の範囲は、３０〜４５℃であ
ると判断した。（ｅ）熱安定性２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用
いて、各温度で１０分間処理した時の熱安定性の結果
は、図４に示す通りであり、本発明オキシダーゼは、５
０℃付近まで安定であった。（ｆ）安定ｐＨの範囲緩衝液として、２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−
６．０）、２００ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０−
７．０）、２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．８−
９．０）、２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６．５−８．０）、２００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ
８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて３０℃
で１０分間処理した後、本発明オキシダーゼの残存活性
を測定した。結果を図２に示す。最も高い残存活性を示
したｐＨである、ｐＨ７．０付近での活性に対して７０
％以上の活性を示すｐＨ範囲はｐＨ６．０−９．０であ
った。

【００５０】以上から、本発明オキシダーゼの安定ｐＨ
範囲はｐＨ６．０−９．０であると判断した。（ｇ）分子量マルチゲル１０／２０（第一化学薬品社製）を用いるＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量を求めた。本発明オキシ
ダーゼの分子量は、約５２，０００であった。（ｈ）反応産物の特定反応産物を特定するために反応液をＨＰＬＣ解析した。
５０μｌの反応液（２ｍＭフルクトシルバリルヒスチ
ジン、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０）、本発
明オキシダーゼ０．００３Ｕ）を３７℃で２時間イン
キュベートし、１０倍希釈した後、ＴＳＫｇｅｌＡｍ
ｉｄｅ−８０カラム（東ソー社製）で反応産物を解析し
た。コントロールとして酵素のかわりにバッファーを添
加したものも同時に行った。その結果、コントロールで
はフルクトシルバリルヒスチジンのみがピークとして検
出されたが、酵素添加ではフルクトシルバリルヒスチジ
ンのピークは消失しており、バリルヒスチジンのピーク
のみが確認された。このことから、本発明オキシダーゼ
はフルクトシルバリルヒスチジンを分解してバリルヒス
チジンを生ずることが確かめられた。また、この反応は
糖化アミノ酸オキシダーゼの反応様式と同様に、αケト
アミン結合を切断することが示唆された。

【００５１】（実施例３）熱安定性の比較アカエトミエラ属に属する糸状菌の生産する本発明オキ
シダーゼと特開２００１−９５５９８記載のオキシダー
ゼの熱安定性について比較検討した。特開２００１−９
５５９８記載のオキシダーゼを生産する大腸菌ＤＨ５α
（ｐＦＰ１）（ＦＥＲＭＢＰ−７２９７）をＬＢ−ａ
ｍｐ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイ
ーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、５
０μｇ／ｍＬアンピシリン、ｐＨ７）１０ｍｌに植菌
し、３０℃で２０時間、１２０ｒｐｍで往復振とう培養
した。得られた培養液を１２，０００ｒｐｍで１０分遠
心することにより集菌したのち、溶菌バッファー（５０
ｍＭリン酸バッファー、１ｍＭＥＤＴＡ、５％グリ
セロール、０．５ｍＭＰＭＳＦ、ｐＨ８）１０ｍｌで
懸濁し、超音波破砕した。破砕液を１２，０００ｒｐｍ
で１０分遠心し、得られた上清を粗酵素液とした。粗酵
素液を２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）を用いて４５℃、１０分処理した後、フルクトシル
バリルヒスチジンを基質として、活性を測定したとこ
ろ、活性は得られなかった。この結果、特開２００１−
９５５９８記載のオキシダーゼは、耐熱性が低く、臨床
診断用酵素としてキット試薬中に処方する上で保存安定
性に問題があった。一方、先にも述べたとおり、本発明
オキシダーゼは、４５℃、１０分の処理で８０％以上の
活性を保持しており、熱安定性に非常に優れていた。

【００５２】（実施例４）糸状菌の生産する本発明オキ
シダーゼ実験例１の探索で得られた糸状菌のうち、アカエトミエ
ラ属の糸状菌１株、アカエトミウム属の糸状菌８株、シ
エラビア属の糸状菌１株、カエトミウム属の糸状菌２
株、ゲラシノスポラ属の糸状菌１株、ミクロアスカス属
の糸状菌１株、コニオカエタ属の糸状菌１株、ユウペニ
シリウム属の糸状菌１株の生産する本発明オキシダーゼ
を製造し、更に、得られたそれらのオキシダーゼの理化
学的性質を調べ、それらの結果を表１および２に示し
た。上記糸状菌１６株をそれぞれ３ｍｌの上記酵素誘導
培地１で３０℃、４日間培養し、菌体を回収した。得ら
れた菌体は、溶菌バッファー０．９ｍｌに懸濁し、ヒス
コトロン、および超音波処理により破砕し、トリトンＸ
−１００を０．５％となるように添加後、４℃、１５０
００ｒｐｍ、１０分の遠心により上清を回収し、粗酵素
標品とした。それぞれの粗酵素標品についてフルクトシ
ルバリンヒスチジン（ＦＶＨ）、フルクトシルグリシン
（ＦＧ）、ε−フルクトシルリジン（εＦＬ）に対する
活性を確認した。また、活性値はε−フルクトシルリジ
ンに対する活性を１００％として換算し、比較した。さ
らに、それぞれの粗酵素標品を熱処理（４５℃、１０
分）した後フルクトシルバリルヒスチジンに対する活性
を測定し、処理前の活性値と比較した。表１および２に
示したように、培地あたりの活性は菌株により差がある
ものの、全ての菌株の標品はフルクトシルバリルヒスチ
ジンに作用した。基質特異性は菌株により若干異なるも
のの、ユウペニシリウム・テレナムＡＴＣＣ１８５
４７（Eupenicillium terrenum ATCC 18547）やコニオ
カエタｓｐ．ＮＩＳＬ９３３０ (Coniochaeta sp. NIS
L 9330)（ＦＥＲＭＢＰ−７７９８）の本発明オキシダ
ーゼは、フルクトシルバリルヒスチジンに良く作用する
がε−フルクトシルリジンには非常に作用しにくく、特
に好ましい性質を有していた。アカエトミエラ・ヴィレ
シェンスＡＴＣＣ３２３９３ (Achaetomiella vire
scens ATCC32393)、カエトミウムｓｐ．ＮＩＳＬ９３
３５ (Chaetomium sp. NISL 9335)（ＦＥＲＭＢＰ−７
７９９）の本発明オキシダーゼは比較的フルクトシルバ
リルヒスチジンに強く作用することがわかった。また、
この熱処理条件では、１２株の本発明オキシダーゼ標品
が１００％以上の残存活性を示し、４株の標品が８０〜
１００％の残存活性を示し、非常に安定であることがわ
かった。

【００５３】

【表１】

【００５４】

【００５５】

【表２】

【００５６】（実施例５）カエトミウム属およびコニオ
カエタ属に属する糸状菌の生産する本発明オキシダーゼ
の製造カエトミウムｓｐ．ＮＩＳＬ９３３５（ＦＥＲＭＢＰ
−７７９９）、コニオカエタｓｐ．ＮＩＳＬ９３３０
（ＦＥＲＭＢＰ−７７９８）を培養して得られた菌体
から本発明オキシダーゼを精製した。二つの菌につい
て、同じ精製操作を用いた。ガラスチューブ（径１．６
ｃｍ×１２．５ｃｍ）に入れた培地（イーストエキス
０．４％、マルツエキス１％、グルコース２％、
トリプトン０．１％、リン酸二水素カリウム０．１
％、硫酸マグネシウム０．０５％、ｐＨ７）３ｍｌに
接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで１日間往復振とう培養
した。これを種培養として、１Ｌ容三角フラスコに入れ
た上記培地０．４Ｌに３ｍｌずつ接種し、３０℃、１３
０ｒｐｍで４日間回転振とう培養した。この培養液よ
り、ろ紙を張ったブフナーろうとを用いて、または遠心
分離（１２,０００ｒｐｍ、１０分）により菌体を回収
した。得られた菌体は−８０℃で凍結保存した。

【００５７】凍結菌体（０．４Ｌ培養液分）を０．０２
５ＬのバッファーＡに懸濁し、フレンチプレスにより破
砕した。破砕液は１２,０００ｒｐｍで、１０分遠心
し、上清に硫酸アンモニウムを６５％飽和となるよう徐
々に添加し、目的の蛋白質を沈殿させた。一晩、４℃で
放置後、遠心（１２，０００ｒｐｍ、１０分）し、沈殿
物を回収した。

【００５８】これに、５ｍｌのバッファーＤを加え溶解
し、遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分）した後、上清を
ＰＯＲＯＳＰＥにかけた。溶出はバッファーＤ〜バッ
ファーＥのリニアグラジェントで行った。流速は２ｍ
ｌ／ｍｉｎで行い、２８０ｎｍでモニターした。活性は
両酵素ともに約０．２５Ｍ硫酸アンモニウムで溶出し
た。得られた活性画分はマイクロコン１０（アミコン社
製）で濃縮脱塩し、以下の理化学的性質を決定するのに
用いた。

【００５９】（実施例６）カエトミウムｓｐ．の生産す
る本発明オキシダーゼの理化学的性質実施例５により得られたカエトミウムｓｐ．ＮＩＳＬ
９３３５（ＦＥＲＭＢＰ−７７９９）の生産する本発
明オキシダーゼの理化学的性質は、下記の通りであっ
た。（ａ）作用及び基質特異性前述した酵素活性の測定方法により、基質としてフルク
トシルバリルヒスチジン、フルクトシルグリシン、ε−
フルクトシルリジンを用いて、本発明オキシダーゼの活
性を測定した。本発明オキシダーゼは、ε−フルクトシ
ルリジンに対する活性を１００％とすると、フルクトシ
ルバリルヒスチジンは４０％、フルクトシルグリシンは
２８％であった。（ｂ）至適ｐＨ緩衝液として２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−
６．０）、２００ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０
−７．０）、２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．８−
９．０）、２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６．５−８．０）、２００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ
８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度
３０℃にて酵素反応を行った。結果を図５に示す。本発
明オキシダーゼは、ｐＨ８．０において最も高い活性を
示した。また、ｐＨ６．０−８．０でもｐＨ８．０付近
における活性値の７０％以上を示したことから、本発明
オキシダーゼの至適ｐＨはｐＨ６．０−８．０であり、
最も好ましい至適ｐＨはｐＨ８．０であると判断した。（ｃ）至適温度の範囲上述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反
応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行っ
た。結果を図７に示す。最も高い活性を示した温度であ
る、３７℃付近での活性に対して６０％以上の活性を示
す温度範囲は、２０〜４５℃であった。以上から、本発
明オキシダーゼの至適温度の範囲は、２０〜４５℃であ
ると判断した。（ｄ）熱安定性２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用
いて、各温度で１０分間処理した時の熱安定性の結果
は、図８に示す通りであり、本発明オキシダーゼは、５
５℃付近まで安定であった。（ｅ）安定ｐＨの範囲緩衝液として、２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−
６．０）、２００ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０−
７．０）、２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．８−
９．０）、２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６．５−８．０）、２００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ
８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて３０℃
で１０分間処理した後、本発明オキシダーゼの残存活性
を測定した。結果を図６に示す。最も高い残存活性を示
したｐＨである、ｐＨ７．０付近での活性に対して７０
％以上の活性を示すｐＨ範囲は、ｐＨ５．０−９．０で
あった。

【００６０】以上から、本発明オキシダーゼの安定ｐＨ
範囲はｐＨ５．０−９．０であると判断した。

【００６１】（実施例７）コニオカエタｓｐ．の生産す
るε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシ
ダーゼの理化学的性質実施例５により得られたコニオカエタｓｐ．ＮＩＳＬ
９３３０（ＦＥＲＭＢＰ−７７９８）の生産する本発
明オキシダーゼの理化学的性質は、下記の通りであっ
た。（ａ）作用及び基質特異性前述した酵素活性の測定方法により、基質としてフルク
トシルバリルヒスチジン、フルクトシルグリシン、ε−
フルクトシルリジンを用いて、本発明オキシダーゼの活
性を測定した。本発明オキシダーゼは、フルクトシルバ
リルヒスチジンに対する活性を１００％とするとε−フ
ルクトシルリジンに対する活性は６１％、フルクトシル
グリシンは３９％であり、ε−フルクトシルリジンに作
用しにくいことがわかった。（ｂ）至適ｐＨ緩衝液として２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−
６．０）、２００ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０
−７．０）、２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．８−
９．０）、２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６．５−８．０）、２００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ
８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度
３０℃にて酵素反応を行った。結果を図９に示す。本発
明オキシダーゼは、ｐＨ７．０において最も高い活性を
示した。また、ｐＨ６．０−８．０でもｐＨ７．０付近
における活性値の７０％以上を示したことから、本発明
オキシダーゼの至適ｐＨはｐＨ６．０−８．０であり、
最も好ましい至適ｐＨはｐＨ７．０であると判断した。（ｃ）至適温度の範囲上述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反
応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行っ
た。結果を図１１に示す。最も高い活性を示した温度で
ある、４０℃付近での活性に対して６０％以上の活性を
示す温度範囲は、２０〜４０℃であった。以上から、本
発明オキシダーゼの至適温度の範囲は、２０〜４０℃で
あると判断した。（ｄ）熱安定性２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用
いて、各温度で１０分間処理した時の熱安定性の結果
は、図１２に示す通りであり、本発明オキシダーゼは、
５０℃付近まで安定であった。（ｅ）安定ｐＨの範囲緩衝液として、２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−
６．０）、２００ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０−
７．０）、２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ６．８−
９．０）、２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６．５−８．０）、２００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ
８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて３０℃
で１０分間処理した後、本発明オキシダーゼの残存活性
を測定した。結果を図１０に示す。最も高い残存活性を
示したｐＨである、ｐＨ７．０付近での活性に対して７
０％以上の活性を示すｐＨ範囲は、ｐＨ５．０−９．０
であった。

【００６２】以上から、本発明オキシダーゼの安定ｐＨ
範囲はｐＨ５．０−９．０であると判断した。

【００６３】（実施例８）ユウペニシリウム・テレナム
の生産するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発
明オキシダーゼの製造ユウペニシリウム・テレナムＡＴＣＣ１８５４７
(Eupenicillium terrenumATCC 18547)を０．１５Ｌ容三
角フラスコに入れた培地（イーストエキス０．１
％、マルツエキス０．１％、リン酸二水素カリウム
０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、ｐＨ７．
３）０．０５Ｌに接種し、２５℃、１２０ｒｐｍで３日
間回転振とう培養した。これを種培養として、５Ｌ三角
フラスコに入れた上記培地１Ｌに１０ｍｌずつ接種し、
２５℃、１００ｒｐｍで４日間回転振とう培養した。こ
の培養液より、ろ紙を張ったブフナーろうとを用いて菌
体を回収した。得られた菌体は−８０℃で凍結保存し
た。

【００６４】凍結菌体（６Ｌ培養液分）をバッファーＦ
（１０ｍＭリン酸バッファー、１ｍＭＥＤＴＡ、５％
グリセロール、０．５ｍＭＰＭＳＦ、ｐＨ８）５００
ｍＬに懸濁し、フレンチプレスにより破砕した。破砕液
を９,０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清にバッファ
ーＦを加え、５００ｍＬの粗酵素液とした。粗酵素液に
硫酸アンモニウムを４０％飽和となるよう徐々に添加
し、余分な蛋白質を沈殿させた。４℃で一晩放置後、遠
心（９,０００ｒｐｍ、４℃、１５分）し、上清を回収
した。さらにこの上清に硫酸アンモニウムを６０％飽和
となるよう徐々に添加し、蛋白質を沈殿させた。４℃で
一晩放置後、遠心（９,０００ｒｐｍ、４℃、１５分）
し、沈殿物を回収した。

【００６５】沈殿物に１０ｍｌのバッファーＧ（１０ｍ
Ｍリン酸バッファー、１ｍＭＥＤＴＡ、５％グリセ
ロール、０．２ＭＮａＣｌ、ｐＨ８）を加え溶解し、
ＰＤ−１０（アマシャムバイオテク社製）によりバッフ
ァー置換した後、あらかじめバッファーＧで平衡化して
おいたＵｌｔｒｏｇｅｌＡｃＡ３４（ＩＢＦバイオテク
ニクス社製）カラム（２．８ｃｍ×８５ｃｍ）にアプラ
イした。こののち、１ＬのバッファーＧで溶出させ、活
性画分を回収した。得られた活性画分をセントリプレッ
プ１０（アミコン社製）で濃縮後、バッファーＦでバッ
ファー置換し、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（アマシ
ャムバイオテク社製）カラム（１．０ｃｍ×８ｃｍ）に
アプライした。溶出はバッファーＨ（１０ｍＭリン酸
バッファー、１ｍＭＥＤＴＡ、５％グリセロール、ｐ
Ｈ８）〜バッファーＩ（１０ｍＭリン酸バッファー、
１ｍＭＥＤＴＡ、５％グリセロール、０．５ＭＮａ
Ｃｌ、ｐＨ８）のリニアグラジエントで行った。得られ
た活性画分は、再度セントリプレップ１０（アミコン社
製）で濃縮し、ＰＯＲＯＳＰＥ（パーセプティブ・バ
イオシステムズ社製）にアプライした。溶出はバッファ
ーＤ〜バッファーＥのリニアグラジェントで行った。流
速は２ｍｌ／ｍｉｎで行い、ＯＤ２８０ｎｍによりタン
パク量をモニターした。活性は約０．０１Ｍ硫酸アン
モニウムで溶出した。得られた活性画分をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分析したところ、単一なバンドが確認できた（分
子量約５３ｋＤａ）。こうして得られた活性画分を用い
て以下の理化学的性質を決定した。

【００６６】（実施例９）ユウペニシリウム・テレナム
の生産するε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発
明オキシダーゼの理化学的性質ユウペニシリウム・テレナムＡＴＣＣ１８５４７
(Eupenicillium terrenum ATCC 18547)の生産するε−
フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼ
の理化学的性質は、下記の通りであった。（ａ）作用及び基質特異性前述した酵素活性の測定方法により、基質としてフルク
トシルバリルヒスチジン、フルクトシルグリシン、ε−
フルクトシルリジンを用いて、本発明オキシダーゼの活
性を測定した。ε−フルクトシルリジンに作用しにくい
本発明オキシダーゼは、フルクトシルバリルヒスチジン
に対する活性を１００％とすると、フルクトシルグリシ
ンは１８２％、ε−フルクトシルリジンは９．７８％で
あり、フルクトシルバリルヒスチジンとフルクトシルグ
リシンに高い特異性をもつことがわかった。（ｂ）至適ｐＨ緩衝液として２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０−
６．０）、２００ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０
−７．０）、２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０−
８．５）、２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６．０−８．０）、２００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ
８．０−９．０）を用い、夫々のｐＨにおいて、温度３
０℃にて酵素反応を行った。結果を図１３に示す。ε−
フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼ
は、リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０において最も高い
活性を示した。また、同緩衝液ｐＨ６．０−８．０にお
いてｐＨ８．０における活性値の７０％以上を示したこ
とから、ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明
オキシダーゼの至適ｐＨはｐＨ６．０−８．０であり、
最も好ましい至適ｐＨはｐＨ７．０であると判断した。（ｃ）フルクトシルバリルヒスチジンに対するＫｍ値前記活性測定法において、基質フルクトシルバリルヒス
チジン濃度を変化させて活性測定を行い、ラインウェー
バー・バークプロットから、ミカエリス定数（Ｋｍ）を
求めた。この結果、本酵素のフルクトシルバリルヒスチ
ジンに対するＫｍ値は４．２５ｍＭであることが判かっ
た。（ｄ）至適温度の範囲上述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反
応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行っ
た。結果を図１５に示す。最も高い活性を示した温度は
３５℃であり、その活性の６０％以上の活性を示す温度
範囲は、２５〜４０℃であった。以上から、ε−フルク
トシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの至適
温度の範囲は、２５〜４０℃であると判断した。（ｅ）熱安定性２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用
いて、各温度で１０分間処理した時の残存活性を図１６
に示す。ε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明
オキシダーゼは安定性に優れており、４５℃付近までほ
ぼ１００％の残存活性を示すことがわかった。（ｆ）安定ｐＨの範囲緩衝液として、２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０−
６．０）、２００ｍＭＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０−
７．０）、２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０−
８．５）、２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６．０−８．０）、２００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ
８．０−１２．０）を用い、夫々のｐＨにおいて３０℃
で１０分間処理した後、本オキシダーゼの残存活性を測
定した。結果を図１４に示す。リン酸カリウム緩衝液ｐ
Ｈ８．０において最も高い残存活性を示したが、その活
性に対し６０％以上の活性を示すｐＨ範囲は、ｐＨ６．
０−９．０であった。

【００６７】以上から、ε−フルクトシルリジンに作用
しにくい本発明オキシダーゼの安定ｐＨ範囲はｐＨ６．
０−９．０であると判断した。（ｇ）分子量マルチゲル１０／２０（第一化学薬品社製）を用いるＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量を求めた。ε−フルクト
シルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼの分子量
は、約５３，０００であった。（ｈ）反応産物の特定反応産物を特定するために反応液をＨＰＬＣ解析した。
５０μｌの反応液（２ｍＭフルクトシルバリルヒスチ
ジン、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０）、本酵
素０．００３Ｕ）を３７℃、２時間インキュベート
し、１０倍希釈後、ＴＳＫｇｅｌＡｍｉｄｅ−８０カ
ラム（東ソー社製）で反応産物を解析した。コントロー
ルとして酵素のかわりにバッファーを添加したものも同
時に行った。その結果、コントロールではフルクトシル
バリルヒスチジンのみがピークとして検出されたが、酵
素添加ではフルクトシルバリルヒスチジンのピークは消
失しており、バリルヒスチジンのピークのみが確認され
た。このことから、本酵素はフルクトシルバリルヒスチ
ジンを分解してバリルヒスチジンを生ずることが確かめ
られた。また、この反応は糖化アミノ酸オキシダーゼの
反応様式と同様に、αケトアミン結合を切断することが
示唆された。

【００６８】（実施例１０）ユウペニシリウム属に属す
る糸状菌の生産するε−フルクトシルリジンに作用しに
くい本発明オキシダーゼ実験例１の探索により得られた本発明糸状菌のうち、ε
−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダー
ゼを生産するユウペニシリウム属に属する糸状菌とし
て、ユウペニシリウム・テレナムＡＴＣＣ１８５４
７（Eupenicillium terrenum ATCC 18547）に加えて、
さらにユウペニシリウム属に属する糸状菌３株を得た。
そこで、これらのユウペニシリウム属に属する糸状菌、
ユウペニシリウム・テレナムＡＴＣＣ１８５４７
（Eupenicillium terrenum ATCC 18547）、ユウペニシ
リウム・センティコサムＩＦＯ９１５８（Eupenici
lliumsenticosum IFO 9158）、ユウペニシリウム・アイ
ダホーエンスＩＦＯ９５１０（Eupenicillium idah
oense IFO 9510）及びユウペニシリウム・ユーグラウカ
ムＩＦＯ３１７２９（Eupenicillium euglaucum IF
O 31729）の生産するε−フルクトシルリジンに作用し
にくい本発明オキシダーゼを製造し、更に、得られたそ
れらのオキシダーゼの理化学的性質を調べ、それらの結
果を表３に示した。

【００６９】上記糸状菌４株をそれぞれ３ｍｌの上記酵
素誘導培地１で３０℃、４日間培養し、菌体を回収し
た。得られた菌体は、溶菌バッファー０．９ｍｌに懸濁
し、ヒスコトロン、および超音波処理により破砕し、ト
リトンＸ−１００を０．５％となるように添加後、４
℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分の遠心により上清を回
収し、粗酵素標品とした。それぞれの粗酵素標品につい
てフルクトシルバリンヒスチジン（ＦＶＨ）、フルクト
シルグリシン（ＦＧ）、ε−フルクトシルリジン（εＦ
Ｌ）に対する活性を確認した。また、活性値はフルクト
シルバリンヒスチジンに対する活性を１００％として換
算し、比較した。さらに、それぞれの粗酵素標品を熱処
理（４５℃、１０分）した後フルクトシルバリルヒスチ
ジンに対する活性を測定し、処理前の活性値と比較し
た。表３に示したように、培地あたりの活性は菌株によ
り差があるものの、全ての菌株の標品はフルクトシルバ
リルヒスチジンおよびフルクトシルグリシンに作用し
た。特にフルクトシルバリルヒスチジンに対する活性
は、ε−フルクトシルリジンに対する活性に比べ、２株
は２倍以上、１株は３倍以上、１株は１０倍以上という
高い値であった。なお、この熱処理条件では、４株の本
発明オキシダーゼ標品はすべて９０％以上の残存活性を
示し、非常に安定であることがわかった。

【００７０】

【表３】

【００７１】（実施例１１）糖化ペプチドのプロテアー
ゼ処理生成物への本発明オキシダーゼの反応糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ_１ｃ）をエンドプロテイナー
ゼＧｌｕ−Ｃで処理することにより、糖化ヘモグロビン
β鎖よりα−糖化ヘキサペプチド（フルクトシルVal-Hi
s-Leu-Thr-Pro-Glu）が遊離する(Clin. Chem., 43; 10
1944-1951, 1997)。このα−糖化ヘキサペプチドと同一
物質である、ペプチド研究所製のフルクトシルVal-His-
Leu-Thr-Pro-Gluを用いて以下の実験を行った。（１）試薬の調製（Ａ）２０ｍＭ α−糖化ヘキサペプチド α−糖化ヘキサペプチド（フルクトシル Val-His-Leu-T
hr-Pro-Glu、ＭＷ＝８５６、ペプチド研究所製）３．４
３４ｍｇを０．２ｍｌの水に溶解させた。（Ｂ）プロテアーゼモルシン（キッコーマン製）１５ｍｇを０．２ｍｌのバ
ッファー（１０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ３．０）に
溶解した。（Ｃ）０．２Ｍ酢酸バッファー、ｐＨ３．０（Ｄ）反応基質（ａ）α−糖化ヘキサペプチドのプロテアーゼ消化物Ａ１００μｌ、Ｂ５μｌ、Ｃ５μｌをマイクロチュ
ーブ内で混和し、３７℃で１７時間インキュベートし
た。反応後、反応液をマイクロコン１０（アミコン社
製）でろ過し、プロテアーゼを除いた。（ｂ）２０ｍＭフルクトシルグリシン（コントロー
ル）４．５ｍｇのフルクトシルグリシンを１ｍｌの水に溶解
した。（E）発色液５μｌ１０ｍｇ／ｍｌ４−アミノアンチピリン７．５μｌ２％２，４−ジクロロフェノールスルフェート１μｌ３３００Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼ１００μｌ１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８）２８６．５μｌ水を混和した。（F）本発明オキシダーゼ（ａ）アカエトミエラ・ヴィレシェンスＡＴＣＣ３
２３９３由来精製酵素（ｂ）ユウペニシリウム・テレナムＡＴＣＣ１８５
４７由来精製酵素（ｃ）コニオカエタｓｐ．ＮＩＳＬ９３３０（ＦＥＲ
ＭＢＰ−７７９８）由来精製酵素（ｄ）２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ８．０（２）反応測定反応基質（Ｄ−ａ、ｂ）２０μｌ、発色液（E）２０μ
ｌ、および本発明オキシダーゼ（F−ａ〜ｄ）１０μｌ
を９６穴アッセイプレートで反応させ、波長５１０ｎｍ
でプレートリーダー（イムノミニＮＪ−２３００、日本
インターメッド社製）を用いて７０分間測定した。結果
はフルクトシルグリシンに対する活性を１００％として
相対活性で示した（表４）。Ｎ．Ｄ．は発色が検出限界
以下であったことを示す。いずれの本発明オキシダーゼ
ともにα−糖化ヘキサペプチドのプロテアーゼ消化物と
反応することが確認された。

【００７２】

【表４】

【００７３】（実施例１２）本発明遺伝子（Coniochaet
a sp.）のクローニングと形質転換体による発現（１）Coniochaeta sp. ｍＲＮＡの調製Coniochaeta sp.を０．１５Ｌ容三角フラスコに入れた
培地（イーストエキス０．４％、マルツエキス１％、
グルコース２％、トリプトン０．１％、リン酸二水
素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５
％、ｐＨ７）０．０５Ｌに接種し、３０℃、１２０ｒｐ
ｍで１日間回転振とう培養した。これを種培養として、
１Ｌ三角フラスコに入れた上記培地０．５Ｌに１ｍｌず
つ接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで２日間回転振とう培
養した。この培養液より、１２，０００ｒｐｍで１０分
遠心分離することで菌体を回収した。得られた菌体を液
体窒素の入った乳鉢と乳棒で粉砕し、ＲＮＡ抽出試薬Ｉ
ＳＯＧＥＮ（和光純薬社製）１０ｍｌに縣濁し、２，７
００ｒｐｍで５分遠心分離することによりＲＮＡ画分を
得た。これより、Current Protocols in Molecular Bio
logy(WILEY Interscience,1989)記載の方法に従い、ｍ
ＲＮＡ０．５１ｍｇを得た。

【００７４】（２）プライマーの合成実施例５に記載した方法により精製したフルクトシルペ
プチドオキシダーゼ約１０μｇをトリプシン消化し、Ｈ
ＰＬＣで分取したペプチド７個をＡＢＩ４７０Ａプロテ
インシークエンサー（パーキンエルマー社製）に供し、
内部アミノ酸配列を決定した。これらの情報により配列
番号５及び６に記載したプライマーをアマシャムバイオ
テク社のカスタム受託合成により合成した。

【００７５】（３）ＲＴ−ＰＣＲ反応液を以下の組成で調整し、４２℃、３０分逆転写反
応を行った後、９９℃、５分変性させ、５℃で保存し
た。

【００７６】（反応組成液）ＭｇＣｌ₂ ５ｍＭ *１０ｘＲＮＡＰＣＲバッファー２μｌＨ_２Ｏ８．５μｌｄＮＴＰs 各１ｍＭＲＮａｓｅインヒビター１Ｕ／μｌ *ＡＭＶ逆転写酵素ＸＬ０．２５Ｕ／μｌ *ｏｌｉｇｏｄＴアダプタープライマー０．１２５μＭｍＲＮＡ１μｇ *宝酒造社製次に下記の組成で調製した反応液８０μｌを逆転写を行
ったチューブに添加し、変性を９４℃、３０秒間、アニ
ールを６２℃、３０秒間、伸長反応を７２℃、１．５分
間で３０サイクルの反応条件でＰＣＲを行なった。

【００７７】（反応液組成）プライマー（配列番号５）０．２μＭプライマー（配列番号６）０．２μＭ *１０×ＲＮＡＰＣＲバッファー８μｌ塩化マグネシウム２．５ｍＭ *Ｔａｑポリメラーゼ２．５ＵＨ_２Ｏ最終容量８０μｌになるよう加える。

【００７８】*宝酒造社製ＰＣＲ終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し
たところ、約０．７７ｋｂに目的の断片と思われるバン
ドが確認されたので、そのバンドを切り出し、ＧＥＮＥ
ＣＬＥＡＮＩＩ（ＢＩＯ１０１社製）にて精製し
た。

【００７９】（４）精製ＤＮＡ断片の解析精製したＤＮＡ断片を３７０ＡＤＮＡシークエンシス
・システム（パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列
の決定及び解析を行なったところ、決定した塩基配列よ
り予想されるアミノ酸配列に前述のアミノ酸配列(Leu-S
er-Lys-Met-Pro-Leu-Leu-Gln-Arg)が確認された。この
ことより、上記のＲＴ−ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片に
はConiochaeta sp.由来フルクトシルペプチドオキシダ
ーゼをコードする遺伝子の一部の配列が存在しているこ
とが確認された。

【００８０】（５）３'-ＲＡＣＥによる下流領域の解析先ず、上記のＤＮＡ配列解析よりプライマーを設計し、
アマシャムバイオテク社により合成した（ＤＮＡ配列
７）。これと上記のｍＲＮＡと３'−ＦｕｌｌＲＡＣＥ
ＣｏｒｅＳｅｔ（宝酒造社製）用いてＲＴ−ＰＣＲを
行い、３'未知領域の増幅を行った。反応液をアガロー
ス電気泳動にかけ、約５００ｂｐのＤＮＡ断片をＲｅｃ
ｏＣｈｉｐ（宝酒造社製）で精製抽出し、ＤＮＡシーク
エンサーで塩基配列の決定および解析を行ったところ、
決定した塩基配列の５'領域に上記 Coniochaeta sp.由
来フルクトシルペプチドオキシダーゼをコードする遺伝
子の部分配列の３'配列と同じ配列を含むことが確認さ
れた。また、決定した塩基配列より予想されるアミノ酸
配列に前述のアミノ酸配列（Phe-Gln-Asp-Lys-Glu-Leu-
Phe-Asn-Arg）が確認された。

【００８１】（６）５'-ＲＡＣＥによる上流領域の解析先ず、上記のＤＮＡ配列解析よりプライマーを設計し、
アマシャムバイオテク社により合成した（ＤＮＡ配列８
〜１２）。これと上記のｍＲＮＡと５'−ＦｕｌｌＲ
ＡＣＥＣｏｒｅＳｅｔ（宝酒造社製）用いてＲＴ−Ｐ
ＣＲを行い、５'未知領域の増幅を行った。反応液をア
ガロース電気泳動にかけ、約４５０ｂｐのＤＮＡ断片を
ＲｅｃｏＣｈｉｐ（宝酒造社製）で精製抽出し、ＤＮＡ
シークエンサーで塩基配列の決定および解析を行ったと
ころ、決定した塩基配列の３'領域に上記 Coniochaeta
sp.由来フルクトシルペプチドオキシダーゼをコードす
る遺伝子の部分配列の５'配列と同じ配列を含むことが
確認された。また、決定した塩基配列より予想されるア
ミノ酸配列に前述のアミノ酸配列（Ser-Gly-Tyr-Ala-Pr
o-Ala-Asn-Ile-Thr）が確認された。

【００８２】（７）ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子断片の取
得上記３つの塩基配列より、翻訳開始コドンと終止コドン
を推定し、Ｎ末領域とＣ末領域のプライマーＤＮＡをア
マシャムバイオテク社により合成した（合成ＤＮＡ１
３，１４）。これらと上記ｍＲＮＡよりＲＴ−ＰＣＲを
行い、反応液をアガロース電気泳動で解析した。その結
果、約１．３ｋｂのバンドが確認された。このバンドに
含まれるＤＮＡ断片をＲｅｃｏＣｈｉｐ（宝酒造社製）
で精製抽出した。一方プラスミドｐＫＫ２２３−３（ア
マシャム社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、Ｂｌｕ
ｎｔｉｎｇＫｉｔ（宝酒造社製）で平滑化し、上記精製
抽出したＤＮＡ断片とライゲーション反応を行い、大腸
菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られたプラスミドｐＫ
Ｋ２２３−３−ＣＦＰは、工業技術院生命工学工業技術
研究所にＦＥＲＭＢＰ−８１３２として寄託されてい
る。

【００８３】（８）活性の確認大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ）菌体
を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＹ培地（１
％バクトトリプトン、０．５％バクトイースト・エ
クストラクト、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）１０
ｍｌにて３２℃でクレット１００まで振とう培養した
後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるよう添加し、さらに
３時間培養した。この培養液を氷上で冷却下、超音波破
砕器(Ultrasonicgenerator、Nissei社製)を用いて２０秒
間、４回処理した。これをエッペンドルフチューブに入
れ、微量遠心機を用い、１２，０００ｒｐｍで１０分間
遠心分離し、上清画分及び沈殿画分に分離し、上清を別
のエッペンドルフチューブに移しかえ、前述した酵素活
性測定法によりフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性
を測定したところ、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−Ｃ
ＦＰ）は４．７４Ｕ／ｍｌとフルクトシルペプチドオキ
シダーゼ活性を持っていた。

【００８４】（９）フルクトシルペプチドオキシダーゼ
をコードする遺伝子の解析大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ）のフル
クトシルペプチドオキシダーゼ活性が確認されたので、
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰの挿入断片がフルクトシルペ
プチドオキシダーゼの遺伝子を含むことが明らかとなっ
た。そこで、このプラスミドＤＮＡについて３７０Ａ
ＤＮＡシークエンス・システム（パーキンエルマー社
製）を用いて塩基配列の決定を行なった。決定した塩基
配列を配列番号２に、また、該ＤＮＡ配列から翻訳され
るポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１に夫々示し
た。フルクトシルペプチドオキシダーゼの遺伝子は、１
３１４ｂｐのコーディング領域を有し、４３７個のアミ
ノ酸をコードしていた。

【００８５】（実施例１３）本発明遺伝子（Eupenicill
ium terrenum）のクローニングと形質転換体による発現（１）Eupenicillium terrenum ｍＲＮＡの調製Eupenicillium terrenum ATCC 18547を０．１５Ｌ容三
角フラスコに入れた培地（イーストエキス０．１％、
マルツエキス０．１％、リン酸二水素カリウム０．
１％、硫酸マグネシウム０．０５％、ｐＨ７．３）
０．０５Ｌに接種し、２５℃、１２０ｒｐｍで３日間回
転振とう培養した。これを種培養として、１Ｌ三角フラ
スコに入れた上記培地０．５Ｌに１ｍｌずつ接種し、２
５℃、１２０ｒｐｍで４日間回転振とう培養した。この
培養液より、１２，０００ｒｐｍで１０分遠心分離する
ことで菌体を回収した。得られた菌体を液体窒素の入っ
た乳鉢と乳棒で粉砕し、ＲＮＡ抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ
（和光純薬社製）１０ｍｌに縣濁し、２，７００ｒｐｍ
で５分遠心分離することによりＲＮＡ画分を得た。これ
より、Current Protocols in Molecular Biology (WILE
Y Interscience,1989)記載の方法に従い、ｍＲＮＡを得
た。

【００８６】（２）プライマーの合成実施例８に記載した方法により精製したフルクトシルペ
プチドオキシダーゼ約１０μｇをトリプシン消化し、Ｈ
ＰＬＣで分取したペプチド６個をＡＢＩ４７０Ａプロテ
インシークエンサー（パーキンエルマー社製）に供し、
内部アミノ酸配列を決定した (Thr-Asn-Val-Trp-Leu-Gl
u-Ser-Glu, Asp-Leu-Ala-Glu-Met-Pro-Gly, Asn-Phe-Il
e-Leu-Ala, Leu-Pro-Asn-Ile-Gly, x-Pro-Thr-Asp-x-Ty
r-Pro, Leu-His-Gln-Pro-Tyr-Gly-Ala-x-x-Pro)。これ
らの情報により配列番号１５及び１６に記載したプライ
マーをアマシャムバイオテク社のカスタム受託合成によ
り合成した。

【００８７】（３）ＲＴ−ＰＣＲ反応液を以下の組成で調整し、４２℃、３０分逆転写反
応を行った後、９９℃、５分間変性させ、５℃で保存し
た。

【００８８】（反応組成液）ＭｇＣｌ₂ ５ｍＭ *１０ｘＲＮＡＰＣＲバッファー２μｌＨ_２Ｏ８．５μｌｄＮＴＰs 各１ｍＭＲＮａｓｅインヒビター１Ｕ／μｌ *ＡＭＶ逆転写酵素ＸＬ０．２５Ｕ／μｌ *ｏｌｉｇｏｄＴアダプタープライマー０．１２５μＭｍＲＮＡ１μｇ *宝酒造社製次に下記の組成で調製した反応液８０μｌを逆転写を行
ったチューブに添加し、変性を９４℃、３０秒間、アニ
ールを６２℃、３０秒間、伸長反応を７２℃、１．５分
間で３０サイクルの反応条件でＰＣＲを行なった。

【００８９】（反応液組成）プライマー（配列番号１５）０．２μＭプライマー（配列番号１６）０．２μＭ *１０×ＲＮＡＰＣＲバッファー８μｌ塩化マグネシウム２．５ｍＭ *Ｔａｑポリメラーゼ２．５ＵＨ_２Ｏ最終容量８０μｌになるよう加える。

【００９０】*宝酒造社製ＰＣＲ終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し
たところ、約０．９ｋｂに目的の断片と思われるバンド
が確認されたので、そのバンドを切り出し、ＧＥＮＥＣ
ＬＥＡＮＩＩ（ＢＩＯ１０１社製）にて精製した。

【００９１】（４）精製ＤＮＡ断片の解析精製したＤＮＡ断片を３７０ＡＤＮＡシークエンス・
システム（パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列の
決定及び解析を行なったところ、決定した塩基配列より
予想されるアミノ酸配列に前述のアミノ酸配列(Asn-Phe
-Ile-Leu-Ala, Leu-Pro-Asn-Ile-Gly, x-Pro-Thr-Asp-x
-Tyr-Pro, Leu-His-Gln-Pro-Tyr-Gly-Ala-x-x-Pro)が確
認された。このことより、上記のＲＴ−ＰＣＲで増幅し
たＤＮＡ断片には Eupenicillium terrenum 由来フルク
トシルペプチドオキシダーゼをコードする遺伝子の一部
の配列が存在していることが確認された。

【００９２】（５）３'-ＲＡＣＥによる下流領域の解析先ず、上記のＤＮＡ配列解析よりプライマーを設計し、
アマシャムバイオテク社により合成した（配列番号１
７）。これと上記のｍＲＮＡと３'−ＦｕｌｌＲＡＣＥ
ＣｏｒｅＳｅｔ（宝酒造社製）用いてＲＴ−ＰＣＲを
行い、３'未知領域の増幅を行った。反応液をアガロー
ス電気泳動にかけ、約４００ｂｐのＤＮＡ断片をＲｅｃ
ｏＣｈｉｐ（宝酒造社製）で精製抽出し、ＤＮＡシーク
エンサーで塩基配列の決定および解析を行ったところ、
決定した塩基配列の５'領域に上記 Eupenicillium terr
enum 由来フルクトシルペプチドオキシダーゼをコード
する遺伝子の部分配列の３'配列と同じ配列を含むこと
が確認された。

【００９３】（６）５'-ＲＡＣＥによる上流領域の解析先ず、上記のＤＮＡ配列解析よりプライマーを設計し、
アマシャムバイオテク社により合成した（ＤＮＡ配列１
８〜２２）。これと上記のｍＲＮＡと５'−Ｆｕｌｌ
ＲＡＣＥＣｏｒｅＳｅｔ（宝酒造社製）用いてＲＴ−
ＰＣＲを行い、５'未知領域の増幅を行った。反応液を
アガロース電気泳動にかけ、約６００ｂｐのＤＮＡ断片
をＲｅｃｏＣｈｉｐ（宝酒造社製）で精製抽出し、ＤＮ
Ａシークエンサーで塩基配列の決定および解析を行った
ところ、決定した塩基配列の３'領域に上記 Eupenicill
ium terrenum 由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ
をコードする遺伝子の部分配列の５'配列と同じ配列を
含むことが確認された。

【００９４】（７）ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子断片の取
得上記３つの塩基配列より、翻訳開始コドンと終止コドン
を推定し、Ｎ末領域とＣ末領域のプライマーＤＮＡをア
マシャムバイオテク社により合成した（配列番号２３，
２４）。これらと上記ｍＲＮＡよりＲＴ−ＰＣＲを行
い、反応液をアガロース電気泳動で解析した。その結
果、約１．３ｋｂのバンドが確認された。このバンドに
含まれるＤＮＡ断片をＲｅｃｏＣｈｉｐ（宝酒造社製）
で精製抽出した。一方プラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社
製）を制限酵素ＳｍａＩで消化後、上記精製抽出したＤ
ＮＡ断片とライゲーション反応を行い、大腸菌ＪＭ１０
９を形質転換した。得られたプラスミドｐｕｃ−ＥＦＰ
は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢ
Ｐ−８１３１として寄託されている。

【００９５】（８）活性の確認大腸菌ＪＭ１０９（ｐｕｃ−ＥＦＰ）菌体を、５０μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含むＴＹ培地（１％バクトト
リプトン、０．５％バクトイースト・エクストラク
ト、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）１０ｍｌにて３
０℃でクレット１００まで振とう培養した後、ＩＰＴＧ
を終濃度１ｍＭとなるよう添加し、さらに３時間培養し
た。この培養液を氷上で冷却下、超音波破砕器(Ultraso
nicgenerator、Nissei社製)を用いて２０秒間、４回処理
した。これをエッペンドルフチューブに入れ、微量遠心
機を用い、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、
上清画分及び沈殿画分に分離し、上清を別のエッペンド
ルフチューブに移しかえ、前述した酵素活性測定法によ
りフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を測定したと
ころ、ＪＭ１０９（ｐｕｃ−ＥＦＰ）は０．０１Ｕ／ｍ
ｌのフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を持ってい
た。

【００９６】（９）フルクトシルペプチドオキシダーゼ
をコードする遺伝子の解析大腸菌ＪＭ１０９（ｐｕｃ−ＥＦＰ）のフルクトシルペ
プチドオキシダーゼ活性が確認されたので、ｐｕｃ−Ｅ
ＦＰの挿入断片がフルクトシルペプチドオキシダーゼの
遺伝子を含むことが明らかとなった。そこで、このプラ
スミドＤＮＡについて３７０ＡＤＮＡシークエンス・
システム（パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列の
決定を行なった。決定した塩基配列を配列番号４に、ま
た、該ＤＮＡ配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ
酸配列を配列番号３に夫々示した。フルクトシルペプチ
ドオキシダーゼの遺伝子は、１３１４ｂｐのコーディン
グ領域を有し、４３７個のアミノ酸をコードしていた。

【００９７】

【発明の効果】本発明によれば、種々の理化学的性質
を有する新規なフルクトシルペプチドオキシダーゼ及び
それらの製造方法が提供され、診断用酵素として測定用
キットに容易に利用されると同時に、安価に大量に供給
されることにより産業上有用である。さらに、フルクト
シルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼは、特に
糖尿病の診断用酵素として有用であり、安定性に優れた
本発明オキシダーゼおよびその製造方法が提供され、保
存安定性に優れた臨床診断用キットの開発が可能にな
り、産業上より有用である。

【００９８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>Kikkoman Corporation <120>Novel fructosyl peptide oxidase <130>P2290 <150>JP 2001-266665 <151>2001-9-4 <150>JP 2001-378151 <151>2001-12-12 <160>24 <210>１ <211>437 <212>PRT <213>Coniochaeta sp. <400>1 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe Glu Ile Pro Ser Ala 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg 50 55 60 Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Lys 65 70 75 80 Glu Asp Glu Leu Phe Gln Pro Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Met Asp 85 90 95 Cys Glu His Thr Pro Glu Gly Ile Glu Asp Leu Lys Lys Gln Tyr Gln 100 105 110 Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala Trp Leu 115 120 125 Asp Asn Glu Asp Glu Ile Leu Ser Lys Met Pro Leu Leu Gln Arg Asp 130 135 140 Gln Ile Gln Gly Trp Lys Ala Ile Trp Ser Gln Asp Gly Gly Trp Leu 145 150 155 160 Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Gln Phe Leu Lys Glu Arg 165 170 175 Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Ser Phe Lys Gln Pro Leu 180 185 190 Phe Asp Asp Glu Gly Thr Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Ala Asp Gly 195 200 205 Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser 210 215 220 Pro Thr Leu Val Asp Leu Glu Asp Gln Cys Cys Ser Lys Ala Trp Val 225 230 235 240 Tyr Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Glu Glu Ala Ala Glu Tyr Lys Gly 245 250 255 Val Pro Val Val Tyr Asn Gly Glu Phe Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asn 260 265 270 Glu Phe Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Ser Arg 275 280 285 Phe Lys Glu His Gln Pro Tyr Gly Ala Pro Ser Pro Lys His Ile Ser 290 295 300 Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp Ala 305 310 315 320 Ser Glu Val Ser Ile Lys Lys Ala Ile Ala Thr Phe Leu Pro Arg Phe 325 330 335 Gln Asp Lys Glu Leu Phe Asn Arg Ala Leu Cys Trp Cys Thr Asp Thr 340 345 350 Ala Asp Ala Ala Leu Leu Met Cys Glu His Pro Lys Trp Lys Asn Phe 355 360 365 Ile Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Ile Leu Pro Asn 370 375 380 Val Gly Lys His Val Val Glu Leu Ile Glu Gly Arg Leu Pro Glu Glu 385 390 395 400 Met Ala Tyr Gln Trp Arg Trp Arg Pro Gly Gly Asp Ala Leu Lys Ser 405 410 415 Arg Arg Ala Ala Pro Pro Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp Lys 420 425 430 His Asp Pro Lys Leu 435 <210>2 <211>1314 <212>DNA <213>Coniochaeta sp. <400>2 atgacgtcga atcgtgcaga tacaagggtg attgtcgtcg gtggcggagg aacgattggt 60 tcctcgacag cgctgcatct tgtgaggagt ggttatgctc ccgcaaatat cacggtcttg 120 gacacatttg agattccatc ggctcaatca gccggccatg atctcaacaa gatcatggga 180 atacgactgc gcaacaaggt ggacctgcaa atgagtctag aggctagaca gatgtggaag 240 gaggatgagt tattccagcc cttctttcac aataccggca gaatggactg cgaacacacg 300 cctgagggta tcgaggacct gaaaaagcag taccaggcac tgcacgatgc cggtgcgggt 360 ctggagaaga ctcatgcctg gttggacaac gaggatgaga tcttatccaa gatgccgttg 420 cttcaacgtg accaaataca aggatggaaa gcaatatgga gtcaagatgg cggctggtta 480 gctgcggcaa aggccatcaa tgcgatcgga cagttcttga aagaacgtgg tgtaaagttc 540 ggattcggcg gcgctggatc cttcaagcaa ccccttttcg acgatgaagg cacaacttgc 600 attggcgttg agacggcaga tggtaccaaa tattacgctg acaaggtggt cttagcagct 660 ggcgcatgga gcccaaccct ggtggacctg gaagatcaat gttgctcgaa ggcttgggtg 720 tatgctcata ttcagttgac gcctgaagag gccgctgagt ataagggtgt cccagttgtg 780 tataatggcg aatttggctt cttctttgag cctaatgagt ttggtgtaat aaaggtgtgc 840 gacgaattcc caggattctc gcgcttcaag gaacatcaac cctatggcgc cccatctccg 900 aaacacatat cagtaccacg atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa acatgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210>3 <211>437 <212>PRT <213>Eupenicillium terrenum <400>3 Met Ala His Ser Arg Ala Ser Thr Lys Val Val Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Ile Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Val Tyr Lys Thr Pro Ser Leu 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg 50 55 60 Asn Gly Pro Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ser Leu Asp Met Trp Gln 65 70 75 80 Asn Asp Glu Leu Phe Lys Pro Phe Phe His Gln Val Gly Met Ile Asp 85 90 95 Cys Ser Ser Ser Lys Glu Gly Ile Glu Asn Leu Arg Arg Lys Tyr Gln 100 105 110 Thr Leu Leu Asp Ala Gly Ile Gly Leu Glu Lys Thr Asn Val Trp Leu 115 120 125 Glu Ser Glu Asp Glu Ile Leu Ala Lys Ala Pro Asn Phe Thr Arg Glu 130 135 140 Gln Val Lys Gly Trp Lys Gly Leu Phe Cys Thr Asp Gly Gly Trp Leu 145 150 155 160 Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Ile Phe Leu Gln Asp Lys 165 170 175 Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Thr Phe Gln Gln Pro Leu 180 185 190 Phe Ala Ala Asp Gly Lys Thr Cys Ile Gly Leu Glu Thr Thr Asp Gly 195 200 205 Thr Lys Tyr Phe Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser 210 215 220 Pro Thr Leu Val Asp Leu Glu Asp Gln Cys Val Ser Lys Ala Trp Val 225 230 235 240 Phe Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Lys Glu Ala Asp Ala Tyr Lys Asn 245 250 255 Val Pro Val Val Tyr Asp Gly Glu Tyr Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asn 260 265 270 Glu Tyr Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Ser Arg 275 280 285 Phe Lys Leu His Gln Pro Tyr Gly Ala Ala Ser Pro Lys Met Ile Ser 290 295 300 Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp Ala 305 310 315 320 Ser Glu Val Thr Ile Arg Lys Ala Ile Ala Arg Phe Leu Pro Glu Phe 325 330 335 Lys Asp Lys Glu Leu Phe Asn Arg Thr Met Cys Trp Cys Thr Asp Thr 340 345 350 Ala Asp Ala Asn Leu Leu Ile Cys Glu His Pro Lys Trp Lys Asn Phe 355 360 365 Ile Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Leu Leu Pro Asn 370 375 380 Ile Gly Lys His Val Val Glu Leu Leu Glu Gly Ser Leu Ser Gln Glu 385 390 395 400 Met Ala Gly Ala Trp Arg Trp Arg Pro Gly Gly Asp Ala Leu Arg Ser 405 410 415 Arg Arg Gly Ala Pro Ala Lys Asp Leu Ala Glu Met Pro Gly Trp Lys 420 425 430 His Asp Ala His Leu 435 <210>4 <211>1314 <212>DNA <213>Eupenicillium terrenum <400>4 atggctcatt cgcgtgcaag caccaaagtc gtcgtggttg ggggaggtgg tacgatcggg 60 tcttcgacgg ctctgcactt aatccgctct ggatataccc cctcaaatat caccgtgctt 120 gacgtataca agaccccttc attgcaatct gcaggacatg atttgaacaa gatcatgggc 180 attcgattgc gcaacgggcc tgacttgcag ctttcgctgg aatcactcga catgtggcaa 240 aacgatgagt tgttcaagcc attctttcac caagtgggca tgattgattg ttcgtcatcc 300 aaagagggta ttgaaaatct tcgacgaaaa taccagaccc tcctcgatgc gggcattggg 360 ctggagaaga cgaacgtttg gctggaatct gaagatgaga tcctcgccaa agcgccgaat 420 ttcacgcgtg aacaagtcaa ggggtggaaa ggcttatttt gcactgatgg aggctggctt 480 gctgcagcca aggctatcaa tgcgatcgga attttcctcc aggacaaagg tgtcaagttt 540 ggctttggag gtgctggaac atttcagcaa cctctgttcg ccgctgatgg aaaaacttgc 600 atcggacttg aaactacaga cggaaccaag tactttgctg acaaggttgt cttggctgct 660 ggtgcgtgga gtcccacctt ggtggatcta gaagatcagt gtgtttcaaa ggcctgggtt 720 ttcgctcata ttcaactcac acccaaagaa gcggacgcgt acaagaatgt gcctgtggtc 780 tatgatggtg aatatgggtt cttttttgag cccaacgagt atggggtgat caaagtctgt 840 gacgagttcc ctggtttctc tcgcttcaaa ctgcatcaac cgtacggggc tgcatctccc 900 aagatgatat ccgtaccgcg atcacacgcc aagcatccca cagataccta ccctgatgcc 960 tccgaagtca ccatacgcaa agcgatcgca aggttcctgc cagaatttaa agacaaggag 1020 ctcttcaacc gtaccatgtg ctggtgtaca gatacggccg atgctaactt attgatttgc 1080 gaacacccga agtggaagaa tttcattctg gccactggag atagcggaca ttccttcaag 1140 ctgttgccaa acatcgggaa acacgttgtt gagcttttag agggatctct atcgcaggaa 1200 atggctggtg cctggagatg gagacccgga ggtgatgctc ttagatctag acgcggtgct 1260 ccggcaaagg atcttgctga gatgccggga tggaagcatg atgcacattt gtga 1314 <210>5 <211>23 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>5 tgg ytn gay aay gar gay gar at 23 <210>6 <211>26 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>6 ttr aar ttr tgi ccr aar tci cci gt 26 <210>7 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>７ ccc aca gac act tat cca ga 20 <210>8 <211>15 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>8 act cag cgg cct ctt 15 <210>9 <211>28 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>9 aga tgg tac caa ata tta cgc tga caa g 28 <210>10 <211>27 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>10 ttt aca cca cgt tct ttc aag aac tgt 27 <210>11 <211>26 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>11 aag gct tgg gtg tat gct cat att ca 26 <210>12 <211>27 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>12 tcc ttg tat ttg gtc acg ttg aag caa 27 <210>13 <211>23 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>13 atg acg tcg aat cgt gca gat ac 23 <210>14 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>14 tta caa ttt cgg atc atg ttt cca t 25 <210>15 <211>22 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>15 acn aay gtn tgg ctn gar wsn g 22 <210>16 <211>19 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>16 kcc anc cng gca tyt cng c 19 <210>17 <211>21 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>17 cat ccc aca gat acc tac cct 21 <210>18 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>18 tcc cga tgt ttg gca aca gc 20 <210>19 <211>22 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>19 gtg cct gtg gtc tat gat ggt g 22 <210>20 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>20 atc aac cgt acg ggg ctg ca 20 <210>21 <211>21 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>21 gat cgc att gat agc ctt ggc 21 <210>22 <211>30 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>22 ctc cac gca cca gca gcc aag aca acc ttg 30 <210>23 <211>24 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>23 gac atg gct cat tcg cgt gca agc 24 <210>24 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Artificially Synthesized Primer Sequence <400>24 caa gaa tca caa atg tgc atc atg c 25

【図面の簡単な説明】

【図１】アカエトミエラ属に属する糸状菌の生産する本
発明オキシダーゼの至適ｐＨを示す図。

【図２】アカエトミエラ属に属する糸状菌の生産する本
発明オキシダーゼの安定ｐＨ範囲を示す図。

【図３】アカエトミエラ属に属する糸状菌の生産する本
発明オキシダーゼの至適温度の範囲を示す図。

【図４】アカエトミエラ属に属する糸状菌の生産する本
発明オキシダーゼの熱安定性を示す図。

【図５】カエトミウム属に属する糸状菌の生産する本発
明オキシダーゼの至適ｐＨを示す図。

【図６】カエトミウム属に属する糸状菌の生産する本発
明オキシダーゼの安定ｐＨ範囲を示す図。

【図７】カエトミウム属に属する糸状菌の生産する本発
明オキシダーゼの至適温度の範囲を示す図。

【図８】カエトミウム属に属する糸状菌の生産する本発
明オキシダーゼの熱安定性を示す図。

【図９】コニオカエタ属に属する糸状菌の生産するε−
フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダーゼ
の至適ｐＨを示す図。

【図１０】コニオカエタ属に属する糸状菌の生産するε
−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダー
ゼの安定ｐＨ範囲を示す図。

【図１１】コニオカエタ属に属する糸状菌の生産するε
−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダー
ゼの至適温度の範囲を示す図。

【図１２】コニオカエタ属に属する糸状菌の生産するε
−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシダー
ゼの熱安定性を示す図。

【図１３】ユウペニシリウム属に属する糸状菌の生産す
るε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシ
ダーゼの至適ｐＨを示す図。

【図１４】ユウペニシリウム属に属する糸状菌の生産す
るε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシ
ダーゼの安定ｐＨ範囲を示す図。

【図１５】ユウペニシリウム属に属する糸状菌の生産す
るε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシ
ダーゼの至適温度の範囲を示す図。

【図１６】ユウペニシリウム属に属する糸状菌の生産す
るε−フルクトシルリジンに作用しにくい本発明オキシ
ダーゼの熱安定性を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/04 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:645）Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA08 CA04 DA06 EA04 4B050 CC03 DD03 FF04E FF09E FF11E LL03 4B065 AA26X AA58Y AB01 BA02 BB03 BB15 BB19 BB29 BC02 BC03 BC09 BC13 BD01 BD04 BD16 CA28 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】酸素存在下でフルクトシルバリルヒスチ
ジンに作用し、α−ケトアルデヒド、バリルヒスチジン
及び過酸化水素を生成する反応を触媒するフルクトシル
ペプチドオキシダーゼ。
【請求項２】４５℃、１０分の熱処理で８０％以上の
活性が残存することを特徴とする請求項１記載のフルク
トシルペプチドオキシダーゼ。
【請求項３】分子量が約５２，０００（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）であることを特徴とする請求項１又は請求項２記
載のフルクトシルペプチドオキシダーゼ。
【請求項４】以下の理化学的性質を有するフルクトシ
ルペプチドオキシダーゼ（ａ）作用及び基質特異性：酸素存在下でフルクトシル
バリルヒスチジンに作用し、α−ケトアルデヒド、バリ
ルヒスチジン及び過酸化水素を生成する反応を触媒す
る。（ｂ）至適ｐＨ：ｐＨ６．０〜８．０（ｃ）作用適温の範囲：２０〜４５℃ （ｄ）熱安定性：４５℃、１０分の熱処理で８０％以上
の活性が残存（ｅ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ６．０〜９．０（ｆ）分子量：約５２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【請求項５】請求項１〜４いずれか１項記載のフルクト
シルペプチドオキシダーゼ生産能を有する糸状菌を培地
に培養し、その培養物からフルクトシルペプチドオキシ
ダーゼを採取することを特徴とするフルクトシルペプチ
ドオキシダーゼの製造方法。
【請求項６】糸状菌がアカエトミエラ属、アカエトミ
ウム属、シエラビア属、カエトミウム属、ゲラシノスポ
ラ属、ミクロアスカス属、コニオカエタ属、及びユウペ
ニシリウム属からなる群から選ばれた糸状菌である、請
求項５記載のフルクトシルペプチドオキシダーゼの製造
方法。
【請求項７】アカエトミエラ属に属する糸状菌がアカ
エトミエラ・ヴィレシェンスＡＴＣＣ３２３９３
(Achaetomiella virescens ATCC 32393)またはカエトミ
ウム属に属する糸状菌がカエトミウムｓｐ．ＮＩＳＬ
９３３５ (Chaetomium sp. NISL 9335)（ＦＥＲＭＢＰ
−７７９９）である請求項６記載のフルクトシルペプチ
ドオキシダーゼの製造方法。
【請求項８】酸素存在下でフルクトシルバリルヒスチ
ジンに作用し、α−ケトアルデヒド、バリルヒスチジン
及び過酸化水素を生成する反応を触媒し、かつ、ε−フ
ルクトシルリジンに作用しにくい、フルクトシルペプチ
ドオキシダーゼ。
【請求項９】４５℃、１０分の熱処理で８０％以上の
活性が残存することを特徴とする請求項８記載のフルク
トシルペプチドオキシダーゼ。
【請求項１０】以下の理化学的性質を有する請求項８
記載のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（ａ）至適ｐＨ：ｐＨ６．０〜８．０（ｂ）作用適温の範囲：２０〜４０℃ （ｃ）熱安定性：４５℃、１０分の熱処理で８０％以上
の活性が残存（ｄ）安定ｐＨの範囲：ｐＨ６．０〜９．０
【請求項１１】請求項８〜１０いずれか１項記載のフル
クトシルペプチドオキシダーゼ生産能を有する糸状菌を
培地に培養し、その培養物からフルクトシルペプチドオ
キシダーゼを採取することを特徴とするフルクトシルペ
プチドオキシダーゼの製造方法。
【請求項１２】糸状菌がユウペニシリウム属に属する
糸状菌またはコニオカエタ属に属する糸状菌である、請
求項１１記載のフルクトシルペプチドオキシダーゼの製
造方法。
【請求項１３】ユウペニシリウム属に属する糸状菌が
ユウペニシリウム・テレナムＡＴＣＣ１８５４７
（Eupenicillium terrenum ATCC 18547）、ユウペニシ
リウム・センティコサムＩＦＯ９１５８（Eupenici
llium senticosum IFO 9158）、ユウペニシリウム・ア
イダホーエンスＩＦＯ９５１０（Eupenicillium id
ahoense IFO 9510）及びユウペニシリウム・ユーグラウ
カムＩＦＯ３１７２９（Eupenicillium euglaucum IF
O 31729）からなる群から選ばれたユウペニシリウム属
に属する糸状菌、またはコニオカエタ属に属する糸状菌
がコニオカエタｓｐ．ＮＩＳＬ９３３０ (Coniochaeta
sp. NISL 9330)（ＦＥＲＭＢＰ−７７９８）である請
求項１２記載のフルクトシルペプチドオキシダーゼの製
造方法。
【請求項１４】以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のフ
ルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク
質。（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質。（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１
から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された
アミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキ
シダーゼ活性を有するタンパク質。（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上
の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつフルクトシ
ルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１５】以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のフ
ルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク
質をコードする遺伝子。（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質。（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１
から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された
アミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキ
シダーゼ活性を有するタンパク質。（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上
の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつフルクトシ
ルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１６】以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤ
ＮＡからなる遺伝子。（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの
全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と相補的な塩基
配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。（ｃ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの
全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と８０％以上の
相同性を示し、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１７】請求項１５又は１６記載の遺伝子をベ
クターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組換え体ＤＮ
Ａ。
【請求項１８】請求項１７記載の組換え体ＤＮＡを含
む形質転換体又は形質導入体。
【請求項１９】請求項１８記載の形質転換体又は形質
導入体を培地に培養し、培養物からフルクトシルペプチ
ドオキシダーゼを採取することを特徴とするフルクトシ
ルペプチドオキシダーゼの製造方法。
【請求項２０】以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のフ
ルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク
質。（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質。（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１
から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された
アミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキ
シダーゼ活性を有するタンパク質。（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上
の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつフルクトシ
ルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２１】以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のフ
ルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク
質をコードする遺伝子。（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタン
パク質。（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１
から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された
アミノ酸配列からなり、かつフルクトシルペプチドオキ
シダーゼ活性を有するタンパク質。（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上
の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつフルクトシ
ルペプチドオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２２】以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤ
ＮＡからなる遺伝子。（ａ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。（ｂ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの
全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と相補的な塩基
配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。（ｃ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの
全長又はそのうちの１５塩基以上の部分と８０％以上の
相同性を示し、かつフルクトシルペプチドオキシダーゼ
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２３】請求項２１又は２２記載の遺伝子をベ
クターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組換え体ＤＮ
Ａ。
【請求項２４】請求項２３記載の組換え体ＤＮＡを含
む形質転換体又は形質導入体。
【請求項２５】請求項２４記載の形質転換体又は形質
導入体を培地に培養し、培養物からフルクトシルペプチ
ドオキシダーゼを採取することを特徴とするフルクトシ
ルペプチドオキシダーゼの製造方法。