JPH08205861A - 新規なピラノース・オキシダーゼ、ピラノース・オキシダーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びピラノース・オキシダーゼの製造法 - Google Patents

新規なピラノース・オキシダーゼ、ピラノース・オキシダーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びピラノース・オキシダーゼの製造法

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JPH08205861A
JPH08205861A JP7124835A JP12483595A JPH08205861A JP H08205861 A JPH08205861 A JP H08205861A JP 7124835 A JP7124835 A JP 7124835A JP 12483595 A JP12483595 A JP 12483595A JP H08205861 A JPH08205861 A JP H08205861A
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JP
Japan
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pyranose oxidase
dna
ser
asp
gac
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JP7124835A
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English (en)
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Ikuko Nishimura
郁子 西村
Kimiharu Okada
王春 岡田
Tomoyuki Nanbara
智之 南原
Genshiro Kawai
源四郎 川合
Taiji Koyama
泰二 小山
Masaru Suzuki
勝 鈴木
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Kikkoman Corp
Original Assignee
Kikkoman Corp
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/0301—Pyranose oxidase (1.1.3.10)

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Abstract

(57)【要約】 【構成】 新規ピラノース・オキシダーゼ、並びにピラ
ノース・オキシダーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組み換え
体ＤＮＡ及び該組み換え体ＤＮＡを含む微生物によるピ
ラノース・オキシダーゼの製造法。 【効果】 新規なピラノース・オキシダーゼを効率よく
生産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、グルコースや1,5-アン
ヒドロ-D-グルシトールの中性付近反応における酵素的
測定法に有用な新規ピラノースオキシダーゼに関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】ピラノースオキシダーゼはグルコースを
最適基質とし、該グルコースを酸化してグルコソンを生
成する反応を触媒する酵素であり、食品や体液等のグル
コースの酵素的測定法に用いることができる。また、1,
5-アンヒドロ-D-グルシトールに作用させることによ
り、糖尿病の診断用マーカーとして重要視されている1,
5-アンヒドロ-D-グルシトールの酵素的測定法にも用い
ることが可能である。
【０００３】ピラノースオキシダーゼの製造は、従来よ
り例えばコリオラス・ベルシカーラ(Coriolus versicol
or) を培地に接種、培養し培養物を採取する事により行
なわれていた。( 特公平2-12557号公報参照) 。しかし
ながら上記のピラノースオキシダーゼ製造法では収率が
不十分であるなどの問題点があり、また上記のピラノー
スオキシダーゼは至適pHが酸性側(pH6.2)にあるため、
中性付近で定量を行なうときは多くの酵素が必要であっ
た。
【０００４】また安定pH域が約５までである為、精製方
法が限られていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来技術の問題を解決すべくなされたものであり、その
目的とするところは、新規なピラノース・オキシダーゼ
及びその生産手段を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み種々検討
した結果、本発明者等は、コリオラス・ベルシカラー由
来のピラノース・オキシダーゼ遺伝子を単離及び構造決
定することに成功し、また、ピラノース・オキシダーゼ
をコードする遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換
え体ＤＮＡを得、この組み換え体をエッシェリシア（Es
cherichia)属に属する菌株に含ませたピラノース・オキ
シダーゼ生産能を有する菌株を培地に培養すると、効率
よくピラノース・オキシダーゼが生産されること等を見
出し、さらに、そのような方法により生産されたピラノ
ース・オキシダーゼが従来のピラノース・オキシダーゼ
とは基質に対する特異性が異なることを見出し、これら
の知見に基づき、本発明を完成した。
【０００７】即ち、本願の第１の発明は、下記の理化学
的性質を有する新規なピラノース・オキシダーゼ： (1) 作用：グルコースを酸化してグルコソンにする； (2) 安定pH：4.0〜8.0； (3) 至適pH：７〜7.5； (4）至適温度：50℃付近； (5) 温度安定性：約50℃まで安定； (6) 基質特異性：グルコースに特異的に作用するが、ガ
ラクトース、L-ソルボース、D-キシロース、1,5-アンヒ
ドロ-D-グルシトールにも作用する； (7) 分子量：約290,000(ゲル濾過法) であり、本願の第２の発明は、配列番号２記載のアミノ
酸配列を有する新規なピラノース・オキシダーゼであ
り、本願の第３の発明は、配列番号２記載のアミノ酸配
列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もし
くは置換されており、かつピラノース・オキシダーゼの
酵素活性をもたらすアミノ酸配列を有する新規なピラノ
ース・オキシダーゼであり、本願の第４の発明は、配列
番号２記載のアミノ酸配列をコードするピラノース・オ
キシダーゼ遺伝子であり、本願の第５の発明は、配列番
号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミ
ノ酸が付加、欠失もしくは置換されており、かつピラノ
ース・オキシダーゼの酵素活性をもたらすアミノ酸配列
をコードするピラノース・オキシダーゼ遺伝子であり、
本願の第６の発明は、上記記載のピラノース・オキシダ
ーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とす
る新規な組み換え体ＤＮＡであり、本願の第７の発明
は、上記記載の組み換え体ＤＮＡを含むエッシェリシア
属に属する微生物を培地に培養し、培養物からピラノー
ス・オキシダーゼを採取することを特徴とするピラノー
ス・オキシダーゼの製造法である。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
ピラノース・オキシダーゼ遺伝子は以下のようにして単
離することができる。先ず、コリオラス・ベルシカラー
ps4a（MAFF 420002；農林水産省農業生物試験研究所
ジーンバンクより入手可能）を、例えばAgric. Biol. C
hem., 48, p.2463-2470記載の方法等により培養し、得
られた菌株からｍＲＮＡを抽出する。菌体からのｍＲＮ
Ａの調製は、例えばMolecular Cloning (Cold Spring H
arborLaboratory Press, 1989) 7.19-7.22 記載の方法
等により行なうことができる。
【０００９】次いで、このｍＲＮＡから、例えば、Mol.
Cell. Biol., 2, p.161, 1982及びGene, 25, p.263, 1
983 記載の方法等によりｃＤＮＡを合成する。このよう
にして合成したｃＤＮＡに、EcoRIアダプターを、例え
ばcDNA rapid adaptor ligation module（アマシャム社
製）により連結する。一方、本発明において用いること
のできるベクターＤＮＡとしては、例えば、バクテリオ
ファージベクターＤＮＡ、プラスミドベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的にはpUC119（宝酒造社製）等が
好ましい。上記プラスミドベクターＤＮＡをEcoRＩ断片
取り込み可能な状態にするため、例えば、EcoRＩ（宝酒
造社製）を作用させて消化し、更に必要によりエタノー
ル沈殿処理等を行なうことにより、EcoRＩ断片取り込み
可能なプラスミドベクターＤＮＡを得る。
【００１０】次いで、上記のようにして得た、コリオラ
ス・ベルシカラー由来でピラノース・オキシダーゼをコ
ードする遺伝子を含有するとともにEcoRIアダプターを
連結したｃＤＮＡと、同じく上記のようにして得たEcoR
Ｉ断片取り込み可能なプラスミドベクターＤＮＡを混合
し、これに、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー
マンハイム社製）を作用させて組み換え体プラスミドＤ
ＮＡを得る。
【００１１】このようにして得られた組み換え体ＤＮＡ
を用いて、例えば大腸菌K12、好ましくは大腸菌JM109
（宝酒造社製）、XL1-Blue（フナコシ(株)製）等を形質
転換して、種々の遺伝子断片を保有する形質転換体のコ
ロニーを得ることができる。得られたコロニーの中よ
り、ピラノース・オキシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片
を保有する組み換え体ＤＮＡを検索するには、例えば、
実施例１の項目(3)に記載の方法に従って得られた遺伝
子断片の末端に対して［γ−32P］ATP(アマシャム・ジ
ャパン社製）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒
造社製）で標識したオリゴヌクレオチドをプローブとし
て、Current Protocols in MolecularBiology(WILEY In
terscience,1988) UNIT 6.4記載の方法によりコロニー
ハイブリダイゼーションを行なうことができる。
【００１２】得られた形質転換体（その中にピラノース
・オキシダーゼ遺伝子を含有している。）より、純化さ
れた組み換え体プラスミドＤＮＡを得るには、例えば超
遠心CsCl濃度勾配分離法等の方法を用いることができ
る。純化された組み換え体プラスミドＤＮＡを用いて、
実施例１の項目(4)に示すような方法によって、ピラノ
ース・オキシダーゼ遺伝子の全塩基配列の解析を行な
い、次いで前記塩基配列を有する遺伝子によって翻訳さ
れるポリペプチドのアミノ酸配列を確定する。このアミ
ノ酸配列は、配列番号２に示されるとおりである。この
ようにして確定されたアミノ酸配列をコードする遺伝子
が本発明のピラノース・オキシダーゼ遺伝子である。
【００１３】しかし、上記のようにして得られたピラノ
ース・オキシダーゼ遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡは、
大腸菌で発現するためのプロモーターを有しないので、
組み換え体ＤＮＡを保有する形質転換株はピラノース・
オキシダーゼを生産しない。そこで、以下の操作により
ピラノース・オキシダーゼ生産株を得る。先ず、上記の
操作で得られた塩基配列に基づき、ピラノース・オキシ
ダーゼ遺伝子のＮ末端あるいはＣ末端を含み、その前後
夫々約20塩基のオリゴヌクレオチド（計46塩基のオリゴ
ヌクレオチド、Ｃ末端側は相補鎖）を合成し、これをプ
ライマーとする。この合成プライマー中にNdeI部位を組
み込んでおき、ポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略
す）で増幅した産物を、NdeI（宝酒造社製）を作用させ
て消化することにより、コーディング領域のみが得られ
るようにしておく。すなわち、上記で得られた純化した
組み換え体プラスミドＤＮＡを鋳型とし、合成プライマ
ーを用いてＰＣＲを行ない、得られた産物をNdeIで消化
すれば、ピラノース・オキシダーゼをコードする領域の
ＤＮＡのみを得ることができる。
【００１４】配列番号２のアミノ酸配列において１もし
くは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換された配
列をコードするＤＮＡを得るには、多くの方法を用いる
ことができる。例えば、点変異又は欠失変異を生じさせ
るために遺伝子を変異源処理する方法；遺伝子を選択的
に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去又は付加
し、そして遺伝子を連結する方法；オリゴヌクレオチド
変異誘発法；実施例２に記載するようなＰＣＲを用いる
方法等が挙げられる。
【００１５】得られたＤＮＡを、大腸菌ラクトースオペ
ロン等に由来するプロモーター、オペレーター及びリボ
ゾーム結合部位等の発現領域を含むＤＮＡ配列（The Op
eron,p.227,Cold Spring Harbor Laboratory,1980を参
照）を保有するベクターＤＮＡに挿入する。用いられる
ベクターＤＮＡは、プラスミドＤＮＡでもバクテリオフ
ァージＤＮＡでもよい。例えば、実施例の項目(5)に示
されるベクターpUTE500K'ＤＮＡを用いることができ
る。得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌
K-12、好ましくは大腸菌JM109（宝酒造社製）、XL1-Blu
e（フナコシ(株)製）等を形質転換又は形質導入して夫
々の菌株を得る。
【００１６】形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方法
（Methods in Enzymology, 68, p.326-331, 1979）によ
り行なうことができる。また、形質導入は、例えば、B.
Hohnの方法（Methods in Enzymology, 68, p.299-309,
1979) により行うことができる。上記のようにして得ら
れたピラノース・オキシダーゼ生産能を有するエッシェ
リシア属に属する菌株を用いてピラノース・オキシダー
ゼを生産するには、下記のように培養して行なうことが
できる。
【００１７】上記微生物を培養するには、通常の固体培
養法で培養してもよいが、なるべく液体培養法を採用し
て培養するのが好ましい。また、上記微生物を培養する
培地としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキ
ス、コーンステイープリカーあるいは大豆もしくは小麦
麹の浸出液等の１種以上の窒素源に、リン酸２水素カリ
ウム，リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化
第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類
の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミ
ン等を適宜添加したものが用いられる。
【００１８】なお、培地の初発pHは７〜９に調整するの
が適当である。また培養は、20〜37℃、好ましくは30℃
前後で６〜24時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静
置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該
培養物よりピラノース・オキシダーゼを採取するには、
通常の酵素採取手段を用いることができる。培養物か
ら、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離
し、洗菌する。この菌体からピラノース・オキシダーゼ
を採取することが好ましい。この場合、菌体をそのまま
用いることもできるが、超音波破砕機、フレンチプレ
ス、ダイナミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊
する方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌
体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ-100等の界面活性
剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法等により、菌体
からピラノース・オキシダーゼを採取するのが好まし
い。
【００１９】得られた粗酵素液からピラノース・オキシ
ダーゼを単離するには、通常の酵素精製に用いられる方
法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱
法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグ
ラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法、等電点沈
殿法等を適宜組み合わせて行なうのが好ましい。このよ
うにして得られたピラノース・オキシダーゼの理化学的
性質は、以下の通りである。 (1) 作用 グルコースを酸化してグルコソンにする。 (2) 基質特異性 グルコースに特異的に作用するが、ガラクトース、L-ソ
ルボース、D-キシロース、1,5-アンヒドロ-D-グルシト
ールにも作用する。 (3) 安定pH pH4.0〜8.0の範囲で安定である。 (4) 至適pH 至適pHは７〜7.5である。 (5）至適温度 至適温度は50℃付近である。 (6) 温度安定性 約50℃まで安定である。 (7) 分子量 約290,000(ゲル濾過法) 以上の理化学的性質を公知のピラノース・オキシダーゼ
と比較検討した結果、本酵素のように1,5-アンヒドロ-D
-グルシトールに対して高い活性を示す酵素が知られて
いないことから、本酵素を新規酵素と認定した。
【００２０】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。 （実施例１） (1) コリオラス・ベルシカラーps4aＲＮＡの調製 コリオラス・ベルシカラーps4a（MAFF 420002；農林水
産省農業生物試験研究所 ジーンバンクより入手可能）
を酵素生産培地（２％グルコース、0.5％酵母エキス、
1.0％マルトエキス、0.1％K2HPO4、0.01％ Mg2SO4・7H2O
、0.001％FeCl 3・6H2O ）200mlに接種して、28℃で７日
間振とう培養し、ガーゼを用いてろ過することにより集
菌した。
【００２１】得られた菌体16ｇを直ちに液体窒素に浸漬
して凍結した後、すり鉢にうつし、液体窒素中で菌体を
粉砕した。液体窒素が蒸発するのを待ち、蒸発後直ちに
新しいすり鉢に移し、グアニジウム溶液〔5Mグアニジン
チオシアネート、50mM Tris・HCl(pH 7.5)、10mM EDTA
、５％(v/v) 2-メルカプトエタノール、４％(w/v) N-
ラウロイルザルコシネート〕45mlを添加した。
【００２２】粘度が下がるまですり鉢中で十分撹拌した
後、10000 r.p.m.、４℃で15分間遠心し、上清を採取し
てCsClを0.4g/mlになるまで添加し、15000r.p.m.、４℃
で10分間遠心した。再び上清を採取し、CsClクッション
（5.7M CsCl、100mM EDTA）に重層して密度勾配遠心（3
2000r.p.m.、15℃、24時間）を行なった。底に沈澱した
ＲＮＡをエタノールを用いて洗浄し、過剰のCsClを除去
した後、水に溶解し、エタノール沈澱を行なって精製し
た結果、1050μｇのトータルＲＮＡを得た。トータルＲ
ＮＡからｍＲＮＡの精製は、Oligotex-dT30<Super>（宝
酒造社製）を用いて行い、20μｇのｍＲＮＡを得た。
【００２３】(2) ｃＤＮＡライブラリーの作製 上述の如くして得られたｍＲＮＡ４μｇから、cDNA Syn
thesis Plus（アマシャム社製）を用いてｃＤＮＡを合
成し、該ｃＤＮＡにEcoRI adaptorをcDNArapid adaptor
ligation module（アマシャム社製）を用いて連結し
た。このＤＮＡと、プラスミドベクターＤＮＡ pUC119
（宝酒造社製）100ngのEcoRI消化物とをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）１ユニットで連結
し、得られた組み換え体プラスミドＤＮＡを用いてD.M.
Morrisonの方法（Methods inEnzymology, 68, p.326-33
1, 1979) に従って大腸菌XL1-Blue株（フナコシ(株)
製）を形質転換した結果、５×103 のコロニーを得、ア
マシャム社のプロトコールに従ってナイロンメンブレン
フィルターHybond-N+（アマシャム社製）へブロッティ
ングした。
【００２４】(3) コロニーハイブリダイゼーションによ
るピラノース・オキシダーゼ遺伝子の単離 コリオラス・ベルシカラーps4aの培養菌体から、硫安沈
澱、ポリエチレンイミンセルロース、ＱＡＥセファデッ
クス及びＨＰＬＣを使用してピラノース・オキシダーゼ
を精製し、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。該Ｎ末端ア
ミノ酸配列は、Lys Val Pro Gly Met Asp Ile Lys Tyr
Asp Val Val Ile Val Gly であった。また、精製したピ
ラノース・オキシダーゼ１mgを、リジルエンドペプチダ
ーゼ処理して、ペプチド断片化し、タンパク質内部のア
ミノ酸配列を決定した。
【００２５】得られたタンパク質内部のアミノ酸配列：
Met Asp Ile Lys Tyr Asp Val に対応するポリヌクレオ
チド：AC(A/G)TC(A/G)TA(T/C)TT(A/G/T)AT(A/G)TCCAT
（Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミ
ン、A/Gはアデニン又はグアニン、T/Cはチミン又はシト
シン、A/G/Tはアデニン、グアニン又はチミンを示
す。）をDNA Synthesizer Model 392（アプライドバイ
オシステムズ社製）を用いて合成した。
【００２６】この合成ＤＮＡ10pmolesを用いて［γ−32
P］ATP（アマシャム・ジャパン社製）とＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造社製）で末端標識し、コロニー
ハイブリダイゼーションのプローブとした。Current Pr
otocols in MolecularBiology(WILEY Interscience, 19
88) UNIT 6.4記載の方法に従い、コロニーハイブリダイ
ゼーションを行ない、ポジティブコロニー１株を得た。
単離したポジティブクローンよりピラノース・オキシダ
ーゼ遺伝子が含まれるプラスミドＤＮＡ（pPR343E0）を
超遠心法にて調製した。
【００２７】(4) ピラノース・オキシダーゼ遺伝子の解
析 得られたプラスミドＤＮＡ（pPR343E0）をEcoRIで切断
したところ、約2.1kbのｃＤＮＡ断片が挿入されている
ことが判った。そこで、このプラスミドＤＮＡについて
Kilo-Sequence用 Deletion Kit（宝酒造社製）及び373A
DNA SequencingSystem（アプライドバイオシステムズ
社製）を用いて塩基配列の決定を行なったところ、ピラ
ノース・オキシダーゼｃＤＮＡの全長を含んでいた。決
定したピラノース・オキシダーゼｃＤＮＡの塩基配列を
配列番号１に、また、該ＤＮＡ配列から翻訳されるポリ
ペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に夫々示した。ピ
ラノース・オキシダーゼｃＤＮＡのＯＲＦは、1869 b
p、623アミノ酸からなっていることが判明した。
【００２８】(5) 発現ベクターpUTE500K'の作製 プラスミドベクターpBR322ＤＮＡ（宝酒造社製）をNdeI
で消化後、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）で平滑末端
とし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム社
製）で環状に戻すことによりNdeI部位を消去した。次い
で、このベクターをEcoRI及びNruIで消化し、上記DNA B
lunting Kitで平滑末端とした後、常法に従ってアガロ
ースゲル電気泳動を行ない、GENECLEAN II KIT（フナコ
シ(株)製）により複製起点を含む約3.4kbのＤＮＡ断片
を取得した。得られたＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼによ
り環状にした後、EcoRI切断を行ない、直鎖にした。
【００２９】次いで、以下に示すような大腸菌ラクトー
スオペロン等に由来するプロモーター、オペレーター、
リボソーム結合部位及びターミネーター等の発現調節領
域並びにNdeI切断部位及びシークエンシング・プライマ
ー（-21M13 Forward Primer）結合部位を含むＤＮＡ配
列（The Operon,p.227,Cold Spring Harbor Laborator
y,1980 を参照）：
【００３０】
【外１】
【００３１】をDNA Synthesizer Model 392（アプライ
ドバイオシステムズ社製）を用いて合成し、上記で得ら
れたEcoRＩ断片と連結して発現ベクターpUTE500を作製
した。このpUTE500をSalIで切断消化し、これにSalI部
位で消化したカナマイシン耐性遺伝子（ファルマシア社
製）を連結して発現ベクターpUTE500K'を作製した。 (6) 大腸菌XL1-Blue(pPRME10)の作製 ピラノース・オキシダーゼ遺伝子のＮ末端を含む、その
前後約20塩基ずつのオリゴヌクレオチド（配列番号３）
及び遺伝子のＣ末端を含む、その前後約20塩基ずつのオ
リゴヌクレオチド（配列番号４）をDNA Synthesizer Mo
del 392（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて
合成し、プライマーとした。これらのプライマーは、そ
の配列中にNdeI部位が組み込んであり、ＰＣＲ法で増幅
した産物をNdeIで消化することにより、コーディング領
域のみが得られるようにデザインした。
【００３２】これらのプライマーを用い、上記で得られ
たプラスミドＤＮＡ（pPR343E0）のEcoRI消化物を鋳型
にして、GeneAmp DNA PCR Reagent Kit（宝酒造社製）
を用いたＰＣＲ法により、ピラノース・オキシダーゼを
コードする領域を含むＤＮＡを増幅した。このＤＮＡを
NdeIで消化後、上記発現プラスミドベクターpUTE500K'
ＤＮＡのNdeI部位に挿入し、組み換え体プラスミドpPRM
E10 ＤＮＡを得た。
【００３３】D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymol
ogy, 68, p.326-331, 1979) に従い、組み換え体プラス
ミドＤＮＡpPRME10を用いて大腸菌XLI-Blue（フナコシ
(株)製）を形質転換し、形質転換株、大腸菌XL1-Blue(p
PRME10)を得た。なお、大腸菌XL1-Blue(pPRME10)は工業
技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-4831として寄
託されている。
【００３４】得られた大腸菌XL1-Blue(pPRME10)を、１m
Mイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含
むTY培地（１％バクト・トリプトン、0.5％バクト・イ
ースト・エクストラクト、0.5％NaCl、pH7.0）にて16時
間振とう培養した後、ピラノース・オキシダーゼ活性を
過酸化水素の生成に基づいて測定したところ、0.1U/ml
であった。 （実施例２）配列番号５のオリゴヌクレオチド及び配列
番号４のオリゴヌクレオチドをDNASynthesizer Model 3
92（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて合成
し、プライマーとした。これらのプライマーを用い、実
施例１の項目(3)で得られたプラスミドＤＮＡ（pPR343E
0）のEcoRI消化物を鋳型にして、GeneAmp DNA PCR Reag
ent Kit（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを行なった。増
幅した産物をNdeIで消化したところ、配列番号２のアミ
ノ酸配列において２番目のSerから38番目のLysまでのア
ミノ酸が欠失したアミノ酸配列をコードするＤＮＡが得
られた。これを上記発現プラスミドベクターpUTE500K'
ＤＮＡのNdeI部位に挿入し、組み換え体プラスミドpPRM
E18 ＤＮＡを得た。
【００３５】D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymol
ogy, 68, p.326-331, 1979) に従い、組み換え体プラス
ミドpPRME18 を用いて大腸菌XLI-Blue（フナコシ(株)
製）を形質転換し、形質転換株、大腸菌XL1-Blue(pPRME
18)を得た。なお、大腸菌XL1-Blue(pPRME18)は工業技術
院生命工学工業技術研究所にFERM BP-4832として寄託さ
れている。
【００３６】得られた大腸菌XL1-Blue(pPRME18)を、１m
Mイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含
むTY培地（１％バクト・トリプトン、0.5％バクト・イ
ースト・エクストラクト、0.5％NaCl、pH7.0）にて16時
間振とう培養した後、ピラノース・オキシダーゼ活性を
過酸化水素の生成に基づいて測定したところ、0.01U/ml
であった。 （実施例３）TY培地(１％バクト・トリプトン、0.5％バ
クト・イースト・エクストラクト、0.5％塩化ナトリウ
ム、pH7.0)100mlを坂口コルベンに入れて、121℃で10分
間殺菌した。大腸菌XL-Blue(pPRME10)の保存スラントよ
り１白金耳接種し、これを振とう機にて14時間振とう培
養し、種培養とした次に１mM イソプロピル-β-D-チオ
ガラクトピラノシドを含む前記TY培地（殺菌条件同上）
20Lを含む30L容ジャーファメンターへ、前記種培養液10
0ml接種し、回転数300rpm、通気量10L/minで約16時間培
養した。培養終了後、ピラノース・オキシダーゼ活性を
過酸化水素の生成に基づいて測定したところ、0.3U/ml
であった。
【００３７】培養終了後、培養液40L(20L*２回分) から
旭化成限外膜(AHV-3010)を用いて菌体を集め、水道水に
て菌体を洗浄した後、菌体を約10Lに濃縮した。ステップ１（粗酵素液の調整） ：上記菌体濃縮液に、５
ｇ卵白リゾチーム、0.55M EDTA 2Na pH8.0 1L、0.11M燐
酸カリウムバッファー pH8.0 1L を添加、混合し、37℃
で24時間放置した後、凍結融解法にて溶菌した。溶菌液
に対し、５％プロタミン水溶液(pH8.0) を攪拌しながら
滴下して除核酸処理を行なった。この上澄液を限外濾過
膜を用いて50mM塩化カリウムを含む10mM燐酸カリウム緩
衝液(pH7.5) に対して透析、濃縮を行ない、約500mlの
粗酵素液を得た。ステップ２（熱処理） :前記透析液(約500ml)を湯浴中に
て47.5℃に加温、30分間保持し、夾雑タンパク質を熱変
性させた。熱処理後、冷却遠心分離器(日立CR22形機)を
用い、変性蛋白質を除去した。得られた上清液490mlに
ついて、限外濾過膜を用いて50mM塩化カリウムを含む10
mM燐酸カリウム緩衝液(pH7.0) に対する透析を行ない、
約500mlの酵素液を得た。ステップ３(DEAE-セルロース処理): 前記処理液(約500m
l)に、湿重量で約１KgのDEAE-セルロースを添加、混合
して、本酵素を吸着させた後、50mM塩化カリウムを含む
10mM燐酸カリウム緩衝液(pH7.0) にてDEAE-セルロース
を洗浄し、次に、0.5M塩化カリウムを含む10mM燐酸カリ
ウム緩衝液(pH7.0) にて本酵素を溶出した。得られた溶
出液について、限外濾過膜を用いて50mM塩化カリウムを
含む10mM燐酸カリウム緩衝液(pH7.0) に対する透析、濃
縮を行ない、約500mlの酵素液を得た。ステップ４(QAE-Sephadex A-50 カラムクロマトグラフ
ィー): 前記酵素液(500ml)を、QAE-Sephadex A-50 のカ
ラム(7.8×40cm)に吸着させ、0.26M 塩化カリウムを含
む10mM燐酸カリウム緩衝液(pH7.0) にてQAE-Sephadex A
-50 のカラムを洗浄し、次に、0.28M 塩化カリウムを含
む10mM燐酸カリウム緩衝液(pH7.0) にて本酵素を溶出し
た。 以上の精製操作により、精製純度90％以上の酵素標品15
0mg(約3000U、20U/mg蛋白質)を得た。 （実施例４）実施例３で得られた本発明の酵素について
以下の事項について調べた。
【００３８】(1) 力価の測定法 0.1M Tris-HCl 緩衝液(pH7.0)1.0ml、発色液〔４-アミ
ノアンチピリン及びフェノールを各10ml含む0.1M Tris-
HCl 緩衝液(pH7.0)にパーオキシダーゼを該溶液100mlあ
たり2000U含有させたもの〕0.2ml、1Mグルコース溶液0.
1ml、ピラノース・オキシダーゼ溶液0.1m１及び水1.6ml
から成る全量3.0mlの酵素含有液を37℃で反応させ、500
nmの吸光度の増加をU2000形ダブルビーム分光光度計(日
立製作所製)にて測定した。
【００３９】酵素活性の１単位は、37℃,pH7.0において
１分間に１μmolの過酸化水素を生成する酵素量と定義
し、また、力価の算出は、上記の条件下で生成するキノ
イミン色素の分子吸光係数を5.3×103とし、次式に従っ
て行なった。 酵素活性＝(△A500/5.3)×(3.0/0.1)×酵素の希釈率 なお、△A500は、単位時間(１分間)あたりの500nmの吸
光度増加量である。 (2) 安定pH及び至適pH範囲 安定pHは100mM酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液(pH3.5〜5.
5)、100mMメス−水酸化ナトリウム緩衝液(pH5.5〜7.
0）、100mMヘペス−水酸化ナトリウム緩衝液(pH7.0〜8.
0)、100mM タプス−水酸化ナトリウム緩衝液(pH8.0〜9.
0)、100mMチェス−水酸化ナトリウム緩衝液(pH9.0〜10.
0)、100mチャプス−水酸化ナトリウム緩衝液(pH10.0〜1
1.0)、100mMリン酸二カリウム−塩化カリウム緩衝液(pH
11.0〜12.0)、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5〜8.
0)、100mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5〜9.0)を用い、pH
3.5〜12.0において、50℃で30分間それぞれ処理した後
本酵素の残存活性を測定して求めた。その結果は、第１
図に示すとおりであり、本酵素の安定pHは4.0 〜8.0で
ある。
【００４０】至適pHは100mM酢酸ナトリウム−酢酸緩衝
液(pH3.5〜5.5)、100mMメス−水酸化ナトリウム緩衝液
(pH5.5〜7.0)、100mMヘペス−水酸化ナトリウム緩衝液
(pH7.0〜8.0)、100mMタプス−水酸化ナトリウム緩衝液
(pH8.0〜9.0)、100mMチェス−水酸化ナトリウム緩衝液
(pH9.0〜10.0)、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5〜8.
0)、100mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5〜9.0)を用い、各p
Hにおける本酵素の活性測定を行なって求めた。その結
果は、第２図に示すとおりであり、本酵素の至適pHは7.
0〜7.5付近である。 (3) 至適温度 0.1M Tris-HCl 緩衝液(pH7.0)1.0ml、上記と同様の発色
液0.2ml、1Mグルコース溶液0.1ml、1.0U/mlのピラノー
ス・オキシダーゼ溶液0.1ml及び水1.6mlから成る全量3.
0mlの酵素含有液を恒温槽を用い、各温度にて５分間反
応させ、500nmの吸光度のエンドポイントをU2000形ダブ
ルビーム分光光度計（日立製作所製）で測定し、酵素活
性を算出した。第３図より本酵素の至適温度は約50℃に
あった。
【００４１】(4) 温度安定性 100mM トリス緩衝液 pH8.0 に酵素標品(500U/ml)を９：
１の割合で混合し、これらの溶液を第４図で示す各温度
で30分間保持した。冷却後100mM Tris-HCl pH7.0で50倍
希釈し、10分間室温放置後、残存活性を測定した。第４
図より本酵素は約50℃まで安定であった。 (5) 基質特異性 上記の力価の測定法における反応液中のグルコースの代
わりに第１表に示した各種の糖溶液（0.1M）用いて、本
発明の酵素の基質特異性を調べた。なお、ピラノース・
オキシダーゼは反応液中に2.5 単位含まれるようにし
た。活性は、グルコースを100 ％としたときの相対活性
で表した。
【００４２】
【表１】
【００４３】第１表より本酵素はD-グルコースに対する
特異性が高く、他にガラクトース、D-キシロース、1,5-
アンヒドロ-D-グルシトールに作用した。また、D-グル
コースのＫｍ値を求めたところ、１．３７ｍＭであっ
た。 (6) 分子量 TSKgel G3000SWXL( 東ソー社製) によるゲル濾過法で、
分子量は約290,000であった。またアクリルアミドゲル4
〜20%(W/V)の濃度勾配を有するポリアクリルアミドゲ
ル（マルチゲル４−２０第１化学社製）を用いたSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるサブユニット
の分子量は約64,000であることから、本発明の酵素はこ
のサブユニットの４量体であると考えられる。
【００４４】
【発明の効果】本発明により、新規なピラノース・オキ
シダーゼを効率よく生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の酵素の安定ｐＨを示す図である。
【図２】 本発明の酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図３】 本発明の酵素の至適温度を示す図である。
【図４】 本発明の酵素の温度安定性を示す図である。
【００４５】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：1869 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：コリオラス・ベルシカラー 株名：ps4a 配列： 45 ATG TCT ACT AGC TCG AGC GAC CCG TTC TTC AAC TTC ACG AAG TCG 90 AGC TTT AGG AGC GCG GCG GCG CAG AAG GCC TCG GCG ACT TCT CTG 135 CCG CCG CTG CCT GGT CCC GAC AAG AAA GTC CCT GGA ATG GAC ATC 180 AAG TAC GAC GTT GTC ATA GTA GGC TCC GGA CCG ATT GGA TGC ACG 225 TAT GCC CGT GAG CTC GTC GAA GCC GGT TAC AAG GTC GCC ATG TTC 270 GAC ATC GGG GAA ATT GAC TCT GGC CTG AAG ATC GGT GCC CAC AAG 315 AAG AAC ACC GTC GAA TAC CAG AAG AAC ATT GAC AAG TTT GTG AAC 360 GTC ATT CAG GGC CAA TTG ATG TCT GTT TCC GTT CCC GTC AAT ACC 405 CTC GTG ATC GAC ACG CTC AGC CCG ACG TCT TGG CAA GCT TCA TCG 450 TTC TTC GTC CGC AAT GGC TCG AAC CCA GAG CAG GAC CCG CTT CGT 495 AAC CTC AGT GGT CAG GCG GTC ACG CGT GTC GTC GGA GGC ATG TCC 540 ACG CAC TGG ACA TGC GCG ACA CCG CGC TTT GAC CGC GAG CAG CGC 585 CCG TTG CTC GTG AAG GAC GAC CAG GAC GCT GAC GAC GCC GAG TGG 630 GAC CGG CTG TAC ACC AAG GCC GAG TCA TAC TTC AAG ACC GGG ACG 675 GAC CAG TTC AAG GAG TCG ATC CGC CAC AAC CTC GTG CTC AAC AAG 720 CTC GCG GAG GAA TAC AAA GGT CAG CGC GAC TTC CAG CAG ATC CCG 765 CTC GCG GCA ACG CGT CGC AGT CCG ACC TTC GTC GAG TGG AGC TCG 810 GCG AAC ACC GTG TTC GAC CTC CAG AAC AGG CCG AAC ACG GAC GCG 855 CCG AAT GAG CGC TTC AAC CTC TTC CCC GCG GTT GCA TGT GAG CGC 900 GTC GTG CGC AAC ACG TCG AAC TCC GAG ATC GAG AGT CTG CAC ATC 945 CAC GAC CTC ATC TCG GGC GAC CGC TTC GAA ATC AAA GCA GAC GTG 990 TTC GTT CTT ACA GCC GGG GCG GTC CAC AAC GCG CAG CTT CTC GTG 1035 AAC TCT GGC TTT GGA CAG CTG GGC CGG CCG GAC CCC GCG AAC CCG 1080 CCG CAG TTG CTG CCG TCC CTG GGA AGC TAC ATC ACC GAG CAG TCG 1125 CTC GTC TTC TGC CAG ACC GTG ATG AGC ACC GAG CTC ATC GAC AGC 1170 GTC AAG TCC GAC ATG ATC ATC AGG GGC AAC CCT GGC GAT CTG GGG 1215 TAC AGC GTC ACG TAC ACG CCC GGC GCG GAG ACC AAC AAG CAC CCG 1260 GAC TGG TGG AAC GAA AAG GTG AAG AAC CAC ATG ATG CAG CAC CAG 1305 GAG GAC CCG CTT CCA ATC CCG TTC GAG GAC CCC GAG CCG CAG GTC 1350 ACC ACC TTG TTC CAG CCA TCG CAC CCG TGG CAC ACT CAG ATT CAC 1395 CGC GAT GCG TTC AGT TAC GGC GCG GTG CAG CAA AGC ATC GAC TCA 1440 CGT CTC ATC GTC GAC TGG CGC TTC TTC GGC CGG ACG GAG CCA AAG 1485 GAG GAG AAC AAG CTC TGG TTC TCG GAC AAA ATT ACG GAC ACG TAC 1530 AAC ATG CCG CAG CCG ACG TTC GAC TTC CGC TTC CCG GCG GGC CGC 1575 ACG AGC AAG GAG GCG GAG GAC ATG ATG ACC GAT ATG TGC GTT ATG 1620 TCG GCG AAG ATT GGT GGC TTC CTG CCC GGC TCC CTC CCG CAA TTC 1665 ATG GAG CCC GGT CTT GTC CTT CAC CTC GGT GGT ACG CAC CGC ATG 1710 GGC TTC GAC GAG CAG GAG GAC AAG TGC TGC GTC AAC ACG GAC TCG 1755 CGC GTG TTT GGC TTC AAG AAC CTG TTC CTC GGT GGC TGC GGA AAC 1800 ATT CCC ACC GCG TAC GGC GCG AAC CCG ACG CTC ACC GCA ATG TCG 1845 CTC GCG ATC AAG AGT TGC GAG TAC ATC AAG AAC AAC TTC ACA CCG 1869 AGC CCT TTC ACA GAT CAG GCT GAG
【００４６】配列番号：２ 配列の長さ：623 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列： 15 Met Ser Thr Ser Ser Ser Asp Pro Phe Phe Asn Phe Thr Lys Ser 30 Ser Phe Arg Ser Ala Ala Ala Gln Lys Ala Ser Ala Thr Ser Leu 45 Pro Pro Leu Pro Gly Pro Asp Lys Lys Val Pro Gly Met Asp Ile 60 Lys Tyr Asp Val Val Ile Val Gly Ser Gly Pro Ile Gly Cys Thr 75 Tyr Ala Arg Glu Leu Val Glu Ala Gly Tyr Lys Val Ala Met Phe 90 Asp Ile Gly Glu Ile Asp Ser Gly Leu Lys Ile Gly Ala His Lys 105 Lys Asn Thr Val Glu Tyr Gln Lys Asn Ile Asp Lys Phe Val Asn 120 Val Ile Gln Gly Gln Leu Met Ser Val Ser Val Pro Val Asn Thr 135 Leu Val Ile Asp Thr Leu Ser Pro Thr Ser Trp Gln Ala Ser Ser 150 Phe Phe Val Arg Asn Gly Ser Asn Pro Glu Gln Asp Pro Leu Arg 165 Asn Leu Ser Gly Gln Ala Val Thr Arg Val Val Gly Gly Met Ser 180 Thr His Trp Thr Cys Ala Thr Pro Arg Phe Asp Arg Glu Gln Arg 195 Pro Leu Leu Val Lys Asp Asp Gln Asp Ala Asp Asp Ala Glu Trp 210 Asp Arg Leu Tyr Thr Lys Ala Glu Ser Tyr Phe Lys Thr Gly Thr 225 Asp Gln Phe Lys Glu Ser Ile Arg His Asn Leu Val Leu Asn Lys 240 Leu Ala Glu Glu Tyr Lys Gly Gln Arg Asp Phe Gln Gln Ile Pro 255 Leu Ala Ala Thr Arg Arg Ser Pro Thr Phe Val Glu Trp Ser Ser 270 Ala Asn Thr Val Phe Asp Leu Gln Asn Arg Pro Asn Thr Asp Ala 285 Pro Asn Glu Arg Phe Asn Leu Phe Pro Ala Val Ala Cys Glu Arg 300 Val Val Arg Asn Thr Ser Asn Ser Glu Ile Glu Ser Leu His Ile 315 His Asp Leu Ile Ser Gly Asp Arg Phe Glu Ile Lys Ala Asp Val 330 Phe Val Leu Thr Ala Gly Ala Val His Asn Ala Gln Leu Leu Val 345 Asn Ser Gly Phe Gly Gln Leu Gly Arg Pro Asp Pro Ala Asn Pro 360 Pro Gln Leu Leu Pro Ser Leu Gly Ser Tyr Ile Thr Glu Gln Ser 375 Leu Val Phe Cys Gln Thr Val Met Ser Thr Glu Leu Ile Asp Ser 390 Val Lys Ser Asp Met Ile Ile Arg Gly Asn Pro Gly Asp Leu Gly 405 Tyr Ser Val Thr Tyr Thr Pro Gly Ala Glu Thr Asn Lys His Pro 420 Asp Trp Trp Asn Glu Lys Val Lys Asn His Met Met Gln His Gln 435 Glu Asp Pro Leu Pro Ile Pro Phe Glu Asp Pro Glu Pro Gln Val 450 Thr Thr Leu Phe Gln Pro Ser His Pro Trp His Thr Gln Ile His 465 Arg Asp Ala Phe Ser Tyr Gly Ala Val Gln Gln Ser Ile Asp Ser 480 Arg Leu Ile Val Asp Trp Arg Phe Phe Gly Arg Thr Glu Pro Lys 495 Glu Glu Asn Lys Leu Trp Phe Ser Asp Lys Ile Thr Asp Thr Tyr 510 Asn Met Pro Gln Pro Thr Phe Asp Phe Arg Phe Pro Ala Gly Arg 525 Thr Ser Lys Glu Ala Glu Asp Met Met Thr Asp Met Cys Val Met 540 Ser Ala Lys Ile Gly Gly Phe Leu Pro Gly Ser Leu Pro Gln Phe 555 Met Glu Pro Gly Leu Val Leu His Leu Gly Gly Thr His Arg Met 570 Gly Phe Asp Glu Gln Glu Asp Lys Cys Cys Val Asn Thr Asp Ser 585 Arg Val Phe Gly Phe Lys Asn Leu Phe Leu Gly Gly Cys Gly Asn 600 Ile Pro Thr Ala Tyr Gly Ala Asn Pro Thr Leu Thr Ala Met Ser 615 Leu Ala Ile Lys Ser Cys Glu Tyr Ile Lys Asn Asn Phe Thr Pro 623 Ser Pro Phe Thr Asp Gln Ala Glu
【００４７】配列番号：３ 配列の長さ：46 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列の特徴：合成ＤＮＡプライマー 配列： TG TAG CTC TCA AAC AAC GCC CAT ATG TCT ACT AGC TCG AGC GAC CC
【００４８】配列番号：４ 配列の長さ：46 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列の特徴：合成ＤＮＡプライマー 配列： AC TAA GCA AGG TCA GCG AGC CAT ATG TCA CTC AGC CTG ATC TGT GA
【００４９】配列番号：５ 配列の長さ：46 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列の特徴：合成ＤＮＡプライマー 配列： TG CCG CCG CTG CCT GGT CCC CAT ATG AAA GTC CCT GGA ATG GAC AT
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年８月３０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、グルコースや1,5-アン
ヒドロ-D-グルシトールの中性付近反応における酵素的
測定法に有用な新規ピラノースオキシダーゼに関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】ピラノースオキシダーゼはグルコースを
最適基質とし、該グルコースを酸化してグルコソンを生
成する反応を触媒する酵素であり、食品や体液等のグル
コースの酵素的測定法に用いることができる。また、1,
5-アンヒドロ-D-グルシトールに作用させることによ
り、糖尿病の診断用マーカーとして重要視されている1,
5-アンヒドロ-D-グルシトールの酵素的測定法にも用い
ることが可能である。
【０００３】ピラノースオキシダーゼの製造は、従来よ
り例えばコリオラス・ベルシカーラ(Coriolus versicol
or) を培地に接種、培養し培養物を採取する事により行
なわれていた。( 特公平2-12557号公報参照) 。しかし
ながら上記のピラノースオキシダーゼ製造法では収率が
不十分であるなどの問題点があり、また上記のピラノー
スオキシダーゼは至適pHが酸性側(pH6.2)にあるため、
中性付近で定量を行なうときは多くの酵素が必要であっ
た。
【０００４】また安定pH域が約５までである為、精製方
法が限られていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来技術の問題を解決すべくなされたものであり、その
目的とするところは、新規なピラノース・オキシダーゼ
及びその生産手段を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み種々検討
した結果、本発明者等は、コリオラス・ベルシカラー由
来のピラノース・オキシダーゼ遺伝子を単離及び構造決
定することに成功し、また、ピラノース・オキシダーゼ
をコードする遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換
え体ＤＮＡを得、この組み換え体をエッシェリシア（Es
cherichia)属に属する菌株に含ませたピラノース・オキ
シダーゼ生産能を有する菌株を培地に培養すると、効率
よくピラノース・オキシダーゼが生産されること等を見
出し、さらに、そのような方法により生産されたピラノ
ース・オキシダーゼが従来のピラノース・オキシダーゼ
とは基質に対する特異性が異なることを見出し、これら
の知見に基づき、本発明を完成した。
【０００７】即ち、本願の第１の発明は、下記の理化学
的性質を有する新規なピラノース・オキシダーゼ： (1) 作用：グルコースを酸化してグルコソンにする； (2) 安定pH：4.0〜8.0； (3) 至適pH：７〜7.5； (4）至適温度：50℃付近； (5) 温度安定性：約50℃まで安定； (6) 基質特異性：グルコースに特異的に作用するが、ガ
ラクトース、L-ソルボース、D-キシロース、1,5-アンヒ
ドロ-D-グルシトールにも作用する； (7) 分子量：約290,000(ゲル濾過法) であり、本願の第２の発明は、配列番号２記載のアミノ
酸配列を有する新規なピラノース・オキシダーゼであ
り、本願の第３の発明は、配列番号２記載のアミノ酸配
列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もし
くは置換されており、かつピラノース・オキシダーゼの
酵素活性をもたらすアミノ酸配列を有する新規なピラノ
ース・オキシダーゼであり、本願の第４の発明は、配列
番号２記載のアミノ酸配列をコードするピラノース・オ
キシダーゼ遺伝子であり、本願の第５の発明は、配列番
号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミ
ノ酸が付加、欠失もしくは置換されており、かつピラノ
ース・オキシダーゼの酵素活性をもたらすアミノ酸配列
をコードするピラノース・オキシダーゼ遺伝子であり、
本願の第６の発明は、上記記載のピラノース・オキシダ
ーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とす
る新規な組み換え体ＤＮＡであり、本願の第７の発明
は、上記記載の組み換え体ＤＮＡを含むエッシェリシア
属に属する微生物を培地に培養し、培養物からピラノー
ス・オキシダーゼを採取することを特徴とするピラノー
ス・オキシダーゼの製造法である。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
ピラノース・オキシダーゼ遺伝子は以下のようにして単
離することができる。先ず、コリオラス・ベルシカラー
ps4a（MAFF 420002；農林水産省農業生物試験研究所
ジーンバンクより入手可能）を、例えばAgric. Biol. C
hem., 48, p.2463-2470記載の方法等により培養し、得
られた菌株からｍＲＮＡを抽出する。菌体からのｍＲＮ
Ａの調製は、例えばMolecular Cloning (Cold Spring H
arborLaboratory Press, 1989) 7.19-7.22 記載の方法
等により行なうことができる。
【０００９】次いで、このｍＲＮＡから、例えば、Mol.
Cell. Biol., 2, p.161, 1982及びGene, 25, p.263, 1
983 記載の方法等によりｃＤＮＡを合成する。このよう
にして合成したｃＤＮＡに、EcoRIアダプターを、例え
ばcDNA rapid adaptor ligation module（アマシャム社
製）により連結する。一方、本発明において用いること
のできるベクターＤＮＡとしては、例えば、バクテリオ
ファージベクターＤＮＡ、プラスミドベクターＤＮＡ等
が挙げられるが、具体的にはpUC119（宝酒造社製）等が
好ましい。上記プラスミドベクターＤＮＡをEcoRＩ断片
取り込み可能な状態にするため、例えば、EcoRＩ（宝酒
造社製）を作用させて消化し、更に必要によりエタノー
ル沈殿処理等を行なうことにより、EcoRＩ断片取り込み
可能なプラスミドベクターＤＮＡを得る。
【００１０】次いで、上記のようにして得た、コリオラ
ス・ベルシカラー由来でピラノース・オキシダーゼをコ
ードする遺伝子を含有するとともにEcoRIアダプターを
連結したｃＤＮＡと、同じく上記のようにして得たEcoR
Ｉ断片取り込み可能なプラスミドベクターＤＮＡを混合
し、これに、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー
マンハイム社製）を作用させて組み換え体プラスミドＤ
ＮＡを得る。
【００１１】このようにして得られた組み換え体ＤＮＡ
を用いて、例えば大腸菌K12、好ましくは大腸菌JM109
（宝酒造社製）、XL1-Blue（フナコシ(株)製）等を形質
転換して、種々の遺伝子断片を保有する形質転換体のコ
ロニーを得ることができる。得られたコロニーの中よ
り、ピラノース・オキシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片
を保有する組み換え体ＤＮＡを検索するには、例えば、
実施例１の項目(3)に記載の方法に従って得られた遺伝
子断片の末端に対して［γ−32P］ATP(アマシャム・ジ
ャパン社製）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒
造社製）で標識したオリゴヌクレオチドをプローブとし
て、Current Protocols in MolecularBiology(WILEY In
terscience,1988) UNIT 6.4記載の方法によりコロニー
ハイブリダイゼーションを行なうことができる。
【００１２】得られた形質転換体（その中にピラノース
・オキシダーゼ遺伝子を含有している。）より、純化さ
れた組み換え体プラスミドＤＮＡを得るには、例えば超
遠心CsCl濃度勾配分離法等の方法を用いることができ
る。純化された組み換え体プラスミドＤＮＡを用いて、
実施例１の項目(4)に示すような方法によって、ピラノ
ース・オキシダーゼ遺伝子の全塩基配列の解析を行な
い、次いで前記塩基配列を有する遺伝子によって翻訳さ
れるポリペプチドのアミノ酸配列を確定する。このアミ
ノ酸配列は、配列番号２に示されるとおりである。この
ようにして確定されたアミノ酸配列をコードする遺伝子
が本発明のピラノース・オキシダーゼ遺伝子である。
【００１３】しかし、上記のようにして得られたピラノ
ース・オキシダーゼ遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡは、
大腸菌で発現するためのプロモーターを有しないので、
組み換え体ＤＮＡを保有する形質転換株はピラノース・
オキシダーゼを生産しない。そこで、以下の操作により
ピラノース・オキシダーゼ生産株を得る。先ず、上記の
操作で得られた塩基配列に基づき、ピラノース・オキシ
ダーゼ遺伝子のＮ末端あるいはＣ末端を含み、その前後
夫々約20塩基のオリゴヌクレオチド（計46塩基のオリゴ
ヌクレオチド、Ｃ末端側は相補鎖）を合成し、これをプ
ライマーとする。この合成プライマー中にNdeI部位を組
み込んでおき、ポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略
す）で増幅した産物を、NdeI（宝酒造社製）を作用させ
て消化することにより、コーディング領域のみが得られ
るようにしておく。すなわち、上記で得られた純化した
組み換え体プラスミドＤＮＡを鋳型とし、合成プライマ
ーを用いてＰＣＲを行ない、得られた産物をNdeIで消化
すれば、ピラノース・オキシダーゼをコードする領域の
ＤＮＡのみを得ることができる。
【００１４】配列番号２のアミノ酸配列において１もし
くは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換された配
列をコードするＤＮＡを得るには、多くの方法を用いる
ことができる。例えば、点変異又は欠失変異を生じさせ
るために遺伝子を変異源処理する方法；遺伝子を選択的
に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去又は付加
し、そして遺伝子を連結する方法；オリゴヌクレオチド
変異誘発法；実施例２に記載するようなＰＣＲを用いる
方法等が挙げられる。
【００１５】得られたＤＮＡを、大腸菌ラクトースオペ
ロン等に由来するプロモーター、オペレーター及びリボ
ゾーム結合部位等の発現領域を含むＤＮＡ配列（The Op
eron,p.227,Cold Spring Harbor Laboratory,1980を参
照）を保有するベクターＤＮＡに挿入する。用いられる
ベクターＤＮＡは、プラスミドＤＮＡでもバクテリオフ
ァージＤＮＡでもよい。例えば、実施例の項目(5)に示
されるベクターpUTE500K'ＤＮＡを用いることができ
る。得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌
K-12、好ましくは大腸菌JM109（宝酒造社製）、XL1-Blu
e（フナコシ(株)製）等を形質転換又は形質導入して夫
々の菌株を得る。
【００１６】形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方法
（Methods in Enzymology, 68, p.326-331, 1979）によ
り行なうことができる。また、形質導入は、例えば、B.
Hohnの方法（Methods in Enzymology, 68, p.299-309,
1979) により行うことができる。上記のようにして得ら
れたピラノース・オキシダーゼ生産能を有するエッシェ
リシア属に属する菌株を用いてピラノース・オキシダー
ゼを生産するには、下記のように培養して行なうことが
できる。
【００１７】上記微生物を培養するには、通常の固体培
養法で培養してもよいが、なるべく液体培養法を採用し
て培養するのが好ましい。また、上記微生物を培養する
培地としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキ
ス、コーンステイープリカーあるいは大豆もしくは小麦
麹の浸出液等の１種以上の窒素源に、リン酸２水素カリ
ウム，リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化
第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類
の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミ
ン等を適宜添加したものが用いられる。
【００１８】なお、培地の初発pHは７〜９に調整するの
が適当である。また培養は、20〜37℃、好ましくは30℃
前後で６〜24時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静
置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該
培養物よりピラノース・オキシダーゼを採取するには、
通常の酵素採取手段を用いることができる。培養物か
ら、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離
し、洗菌する。この菌体からピラノース・オキシダーゼ
を採取することが好ましい。この場合、菌体をそのまま
用いることもできるが、超音波破砕機、フレンチプレ
ス、ダイナミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊
する方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌
体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ-100等の界面活性
剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法等により、菌体
からピラノース・オキシダーゼを採取するのが好まし
い。
【００１９】得られた粗酵素液からピラノース・オキシ
ダーゼを単離するには、通常の酵素精製に用いられる方
法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱
法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグ
ラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法、等電点沈
殿法等を適宜組み合わせて行なうのが好ましい。このよ
うにして得られたピラノース・オキシダーゼの理化学的
性質は、以下の通りである。 (1) 作用 グルコースを酸化してグルコソンにする。 (2) 基質特異性 グルコースに特異的に作用するが、ガラクトース、L-ソ
ルボース、D-キシロース、1,5-アンヒドロ-D-グルシト
ールにも作用する。 (3) 安定pH pH4.0〜8.0の範囲で安定である。 (4) 至適pH 至適pHは７〜7.5である。 (5）至適温度 至適温度は50℃付近である。 (6) 温度安定性 約50℃まで安定である。 (7) 分子量 約290,000(ゲル濾過法) 以上の理化学的性質を公知のピラノース・オキシダーゼ
と比較検討した結果、本酵素のように1,5-アンヒドロ-D
-グルシトールに対して高い活性を示す酵素が知られて
いないことから、本酵素を新規酵素と認定した。
【００２０】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。 （実施例１） (1) コリオラス・ベルシカラーps4aＲＮＡの調製 コリオラス・ベルシカラーps4a（MAFF 420002；農林水
産省農業生物試験研究所 ジーンバンクより入手可能）
を酵素生産培地（２％グルコース、0.5％酵母エキス、
1.0％マルトエキス、0.1％K2HPO4、0.01％ Mg2SO4・7H2O
、0.001％FeCl 3・6H2O ）200mlに接種して、28℃で７日
間振とう培養し、ガーゼを用いてろ過することにより集
菌した。
【００２１】得られた菌体16ｇを直ちに液体窒素に浸漬
して凍結した後、すり鉢にうつし、液体窒素中で菌体を
粉砕した。液体窒素が蒸発するのを待ち、蒸発後直ちに
新しいすり鉢に移し、グアニジウム溶液〔5Mグアニジン
チオシアネート、50mM Tris・HCl(pH 7.5)、10mM EDTA
、５％(v/v) 2-メルカプトエタノール、４％(w/v) N-
ラウロイルザルコシネート〕45mlを添加した。
【００２２】粘度が下がるまですり鉢中で十分撹拌した
後、10000 r.p.m.、４℃で15分間遠心し、上清を採取し
てCsClを0.4g/mlになるまで添加し、15000r.p.m.、４℃
で10分間遠心した。再び上清を採取し、CsClクッション
（5.7M CsCl、100mM EDTA）に重層して密度勾配遠心（3
2000r.p.m.、15℃、24時間）を行なった。底に沈澱した
ＲＮＡをエタノールを用いて洗浄し、過剰のCsClを除去
した後、水に溶解し、エタノール沈澱を行なって精製し
た結果、1050μｇのトータルＲＮＡを得た。トータルＲ
ＮＡからｍＲＮＡの精製は、Oligotex-dT30<Super>（宝
酒造社製）を用いて行い、20μｇのｍＲＮＡを得た。
【００２３】(2) ｃＤＮＡライブラリーの作製 上述の如くして得られたｍＲＮＡ４μｇから、cDNA Syn
thesis Plus（アマシャム社製）を用いてｃＤＮＡを合
成し、該ｃＤＮＡにEcoRI adaptorをcDNArapid adaptor
ligation module（アマシャム社製）を用いて連結し
た。このＤＮＡと、プラスミドベクターＤＮＡ pUC119
（宝酒造社製）100ngのEcoRI消化物とをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）１ユニットで連結
し、得られた組み換え体プラスミドＤＮＡを用いてD.M.
Morrisonの方法（Methods inEnzymology, 68, p.326-33
1, 1979) に従って大腸菌XL1-Blue株（フナコシ(株)
製）を形質転換した結果、５×103 のコロニーを得、ア
マシャム社のプロトコールに従ってナイロンメンブレン
フィルターHybond-N+（アマシャム社製）へブロッティ
ングした。
【００２４】(3) コロニーハイブリダイゼーションによ
るピラノース・オキシダーゼ遺伝子の単離 コリオラス・ベルシカラーps4aの培養菌体から、硫安沈
澱、ポリエチレンイミンセルロース、ＱＡＥセファデッ
クス及びＨＰＬＣを使用してピラノース・オキシダーゼ
を精製し、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。該Ｎ末端ア
ミノ酸配列は、Lys Val Pro Gly Met Asp Ile Lys Tyr
Asp Val Val Ile Val Gly であった。また、精製したピ
ラノース・オキシダーゼ１mgを、リジルエンドペプチダ
ーゼ処理して、ペプチド断片化し、タンパク質内部のア
ミノ酸配列を決定した。
【００２５】得られたタンパク質内部のアミノ酸配列：
Met Asp Ile Lys Tyr Asp Val に対応するポリヌクレオ
チド：AC(A/G)TC(A/G)TA(T/C)TT(A/G/T)AT(A/G)TCCAT
（Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミ
ン、A/Gはアデニン又はグアニン、T/Cはチミン又はシト
シン、A/G/Tはアデニン、グアニン又はチミンを示
す。）をDNA Synthesizer Model 392（アプライドバイ
オシステムズ社製）を用いて合成した。
【００２６】この合成ＤＮＡ10pmolesを用いて［γ−32
P］ATP（アマシャム・ジャパン社製）とＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造社製）で末端標識し、コロニー
ハイブリダイゼーションのプローブとした。Current Pr
otocols in MolecularBiology(WILEY Interscience, 19
88) UNIT 6.4記載の方法に従い、コロニーハイブリダイ
ゼーションを行ない、ポジティブコロニー１株を得た。
単離したポジティブクローンよりピラノース・オキシダ
ーゼ遺伝子が含まれるプラスミドＤＮＡ（pPR343E0）を
超遠心法にて調製した。
【００２７】(4) ピラノース・オキシダーゼ遺伝子の解
析 得られたプラスミドＤＮＡ（pPR343E0）をEcoRIで切断
したところ、約2.1kbのｃＤＮＡ断片が挿入されている
ことが判った。そこで、このプラスミドＤＮＡについて
Kilo-Sequence用 Deletion Kit（宝酒造社製）及び373A
DNA SequencingSystem（アプライドバイオシステムズ
社製）を用いて塩基配列の決定を行なったところ、ピラ
ノース・オキシダーゼｃＤＮＡの全長を含んでいた。決
定したピラノース・オキシダーゼｃＤＮＡの塩基配列を
配列番号１に、また、該ＤＮＡ配列から翻訳されるポリ
ペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に夫々示した。ピ
ラノース・オキシダーゼｃＤＮＡのＯＲＦは、1869 b
p、623アミノ酸からなっていることが判明した。
【００２８】(5) 発現ベクターpUTE500K'の作製 プラスミドベクターpBR322ＤＮＡ（宝酒造社製）をNdeI
で消化後、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）で平滑末端
とし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム社
製）で環状に戻すことによりNdeI部位を消去した。次い
で、このベクターをEcoRI及びNruIで消化し、上記DNA B
lunting Kitで平滑末端とした後、常法に従ってアガロ
ースゲル電気泳動を行ない、GENECLEAN II KIT（フナコ
シ(株)製）により複製起点を含む約3.4kbのＤＮＡ断片
を取得した。得られたＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼによ
り環状にした後、EcoRI切断を行ない、直鎖にした。
【００２９】次いで、以下に示すような大腸菌ラクトー
スオペロン等に由来するプロモーター、オペレーター、
リボソーム結合部位及びターミネーター等の発現調節領
域並びにNdeI切断部位及びシークエンシング・プライマ
ー（-21M13 Forward Primer）結合部位を含むＤＮＡ配
列（The Operon,p.227,Cold Spring Harbor Laborator
y,1980 を参照）：
【００３０】
【外１】
【００３１】をDNA Synthesizer Model 392（アプライ
ドバイオシステムズ社製）を用いて合成し、上記で得ら
れたEcoRＩ断片と連結して発現ベクターpUTE500を作製
した。このpUTE500をSalIで切断消化し、これにSalI部
位で消化したカナマイシン耐性遺伝子（ファルマシア社
製）を連結して発現ベクターpUTE500K'を作製した。 (6) 大腸菌XL1-Blue(pPRME10)の作製 ピラノース・オキシダーゼ遺伝子のＮ末端を含む、その
前後約20塩基ずつのオリゴヌクレオチド（配列番号３）
及び遺伝子のＣ末端を含む、その前後約20塩基ずつのオ
リゴヌクレオチド（配列番号４）をDNA Synthesizer Mo
del 392（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて
合成し、プライマーとした。これらのプライマーは、そ
の配列中にNdeI部位が組み込んであり、ＰＣＲ法で増幅
した産物をNdeIで消化することにより、コーディング領
域のみが得られるようにデザインした。
【００３２】これらのプライマーを用い、上記で得られ
たプラスミドＤＮＡ（pPR343E0）のEcoRI消化物を鋳型
にして、GeneAmp DNA PCR Reagent Kit（宝酒造社製）
を用いたＰＣＲ法により、ピラノース・オキシダーゼを
コードする領域を含むＤＮＡを増幅した。このＤＮＡを
NdeIで消化後、上記発現プラスミドベクターpUTE500K'
ＤＮＡのNdeI部位に挿入し、組み換え体プラスミドpPRM
E10 ＤＮＡを得た。
【００３３】D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymol
ogy, 68, p.326-331, 1979) に従い、組み換え体プラス
ミドＤＮＡpPRME10を用いて大腸菌XLI-Blue（フナコシ
(株)製）を形質転換し、形質転換株、大腸菌XL1-Blue(p
PRME10)を得た。なお、大腸菌XL1-Blue(pPRME10)は工業
技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-4831として寄
託されている。
【００３４】得られた大腸菌XL1-Blue(pPRME10)を、１m
Mイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含
むTY培地（１％バクト・トリプトン、0.5％バクト・イ
ースト・エクストラクト、0.5％NaCl、pH7.0）にて16時
間振とう培養した後、ピラノース・オキシダーゼ活性を
過酸化水素の生成に基づいて測定したところ、0.1U/ml
であった。 （実施例２）配列番号５のオリゴヌクレオチド及び配列
番号４のオリゴヌクレオチドをDNASynthesizer Model 3
92（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて合成
し、プライマーとした。これらのプライマーを用い、実
施例１の項目(3)で得られたプラスミドＤＮＡ（pPR343E
0）のEcoRI消化物を鋳型にして、GeneAmp DNA PCR Reag
ent Kit（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを行なった。増
幅した産物をNdeIで消化したところ、配列番号２のアミ
ノ酸配列において２番目のSerから38番目のLysまでのア
ミノ酸が欠失したアミノ酸配列をコードするＤＮＡが得
られた。これを上記発現プラスミドベクターpUTE500K'
ＤＮＡのNdeI部位に挿入し、組み換え体プラスミドpPRM
E18 ＤＮＡを得た。
【００３５】D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymol
ogy, 68, p.326-331, 1979) に従い、組み換え体プラス
ミドpPRME18 を用いて大腸菌XLI-Blue（フナコシ(株)
製）を形質転換し、形質転換株、大腸菌XL1-Blue(pPRME
18)を得た。なお、大腸菌XL1-Blue(pPRME18)は工業技術
院生命工学工業技術研究所にFERM BP-4832として寄託さ
れている。
【００３６】得られた大腸菌XL1-Blue(pPRME18)を、１m
Mイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含
むTY培地（１％バクト・トリプトン、0.5％バクト・イ
ースト・エクストラクト、0.5％NaCl、pH7.0）にて16時
間振とう培養した後、ピラノース・オキシダーゼ活性を
過酸化水素の生成に基づいて測定したところ、0.01U/ml
であった。 （実施例３）TY培地(１％バクト・トリプトン、0.5％バ
クト・イースト・エクストラクト、0.5％塩化ナトリウ
ム、pH7.0)100mlを坂口コルベンに入れて、121℃で10分
間殺菌した。大腸菌XL-Blue(pPRME10)の保存スラントよ
り１白金耳接種し、これを振とう機にて14時間振とう培
養し、種培養とした次に１mM イソプロピル-β-D-チオ
ガラクトピラノシドを含む前記TY培地（殺菌条件同上）
20Lを含む30L容ジャーファメンターへ、前記種培養液10
0ml接種し、回転数300rpm、通気量10L/minで約16時間培
養した。培養終了後、ピラノース・オキシダーゼ活性を
過酸化水素の生成に基づいて測定したところ、0.3U/ml
であった。
【００３７】培養終了後、培養液40L(20L*２回分) から
旭化成限外膜(AHV-3010)を用いて菌体を集め、水道水に
て菌体を洗浄した後、菌体を約10Lに濃縮した。ステップ１（粗酵素液の調整） ：上記菌体濃縮液に、５
ｇ卵白リゾチーム、0.55M EDTA 2Na pH8.0 1L、0.11M燐
酸カリウムバッファー pH8.0 1L を添加、混合し、37℃
で24時間放置した後、凍結融解法にて溶菌した。溶菌液
に対し、５％プロタミン水溶液(pH8.0) を攪拌しながら
滴下して除核酸処理を行なった。この上澄液を限外濾過
膜を用いて50mM塩化カリウムを含む10mM燐酸カリウム緩
衝液(pH7.5) に対して透析、濃縮を行ない、約500mlの
粗酵素液を得た。ステップ２（熱処理） :前記透析液(約500ml)を湯浴中に
て47.5℃に加温、30分間保持し、夾雑タンパク質を熱変
性させた。熱処理後、冷却遠心分離器(日立CR22形機)を
用い、変性蛋白質を除去した。得られた上清液490mlに
ついて、限外濾過膜を用いて50mM塩化カリウムを含む10
mM燐酸カリウム緩衝液(pH7.0) に対する透析を行ない、
約500mlの酵素液を得た。ステップ３(DEAE-セルロース処理): 前記処理液(約500m
l)に、湿重量で約１KgのDEAE-セルロースを添加、混合
して、本酵素を吸着させた後、50mM塩化カリウムを含む
10mM燐酸カリウム緩衝液(pH7.0) にてDEAE-セルロース
を洗浄し、次に、0.5M塩化カリウムを含む10mM燐酸カリ
ウム緩衝液(pH7.0) にて本酵素を溶出した。得られた溶
出液について、限外濾過膜を用いて50mM塩化カリウムを
含む10mM燐酸カリウム緩衝液(pH7.0) に対する透析、濃
縮を行ない、約500mlの酵素液を得た。ステップ４(QAE-Sephadex A-50 カラムクロマトグラフ
ィー): 前記酵素液(500ml)を、QAE-Sephadex A-50 のカ
ラム(7.8×40cm)に吸着させ、0.26M 塩化カリウムを含
む10mM燐酸カリウム緩衝液(pH7.0) にてQAE-Sephadex A
-50 のカラムを洗浄し、次に、0.28M 塩化カリウムを含
む10mM燐酸カリウム緩衝液(pH7.0) にて本酵素を溶出し
た。 以上の精製操作により、精製純度90％以上の酵素標品15
0mg(約3000U、20U/mg蛋白質)を得た。 （実施例４）実施例３で得られた本発明の酵素について
以下の事項について調べた。
【００３８】(1) 力価の測定法 0.1M Tris-HCl 緩衝液(pH7.0)1.0ml、発色液〔４-アミ
ノアンチピリン及びフェノールを各10ml含む0.1M Tris-
HCl 緩衝液(pH7.0)にパーオキシダーゼを該溶液100mlあ
たり2000U含有させたもの〕0.2ml、1Mグルコース溶液0.
1ml、ピラノース・オキシダーゼ溶液0.1m１及び水1.6ml
から成る全量3.0mlの酵素含有液を37℃で反応させ、500
nmの吸光度の増加をU2000形ダブルビーム分光光度計(日
立製作所製)にて測定した。
【００３９】酵素活性の１単位は、37℃,pH7.0において
１分間に１μmolの過酸化水素を生成する酵素量と定義
し、また、力価の算出は、上記の条件下で生成するキノ
イミン色素の分子吸光係数を5.3×103とし、次式に従っ
て行なった。 酵素活性＝(△A500/5.3)×(3.0/0.1)×酵素の希釈率 なお、△A500は、単位時間(１分間)あたりの500nmの吸
光度増加量である。 (2) 安定pH及び至適pH範囲 安定pHは100mM酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液(pH3.5〜5.
5)、100mMメス−水酸化ナトリウム緩衝液(pH5.5〜7.
0）、100mMヘペス−水酸化ナトリウム緩衝液(pH7.0〜8.
0)、100mM タプス−水酸化ナトリウム緩衝液(pH8.0〜9.
0)、100mMチェス−水酸化ナトリウム緩衝液(pH9.0〜10.
0)、100mチャプス−水酸化ナトリウム緩衝液(pH10.0〜1
1.0)、100mMリン酸二カリウム−塩化カリウム緩衝液(pH
11.0〜12.0)、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5〜8.
0)、100mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5〜9.0)を用い、pH
3.5〜12.0において、50℃で30分間それぞれ処理した後
本酵素の残存活性を測定して求めた。その結果は、第１
図に示すとおりであり、本酵素の安定pHは4.0 〜8.0で
ある。
【００４０】至適pHは100mM酢酸ナトリウム−酢酸緩衝
液(pH3.5〜5.5)、100mMメス−水酸化ナトリウム緩衝液
(pH5.5〜7.0)、100mMヘペス−水酸化ナトリウム緩衝液
(pH7.0〜8.0)、100mMタプス−水酸化ナトリウム緩衝液
(pH8.0〜9.0)、100mMチェス−水酸化ナトリウム緩衝液
(pH9.0〜10.0)、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5〜8.
0)、100mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5〜9.0)を用い、各p
Hにおける本酵素の活性測定を行なって求めた。その結
果は、第２図に示すとおりであり、本酵素の至適pHは7.
0〜7.5付近である。 (3) 至適温度 0.1M Tris-HCl 緩衝液(pH7.0)1.0ml、上記と同様の発色
液0.2ml、1Mグルコース溶液0.1ml、1.0U/mlのピラノー
ス・オキシダーゼ溶液0.1ml及び水1.6mlから成る全量3.
0mlの酵素含有液を恒温槽を用い、各温度にて５分間反
応させ、500nmの吸光度のエンドポイントをU2000形ダブ
ルビーム分光光度計（日立製作所製）で測定し、酵素活
性を算出した。第３図より本酵素の至適温度は約50℃に
あった。
【００４１】(4) 温度安定性 100mM トリス緩衝液 pH8.0 に酵素標品(500U/ml)を９：
１の割合で混合し、これらの溶液を第４図で示す各温度
で30分間保持した。冷却後100mM Tris-HCl pH7.0で50倍
希釈し、10分間室温放置後、残存活性を測定した。第４
図より本酵素は約50℃まで安定であった。 (5) 基質特異性 上記の力価の測定法における反応液中のグルコースの代
わりに第１表に示した各種の糖溶液（0.1M）用いて、本
発明の酵素の基質特異性を調べた。なお、ピラノース・
オキシダーゼは反応液中に2.5 単位含まれるようにし
た。活性は、グルコースを100 ％としたときの相対活性
で表した。
【００４２】
【表１】
【００４３】第１表より本酵素はD-グルコースに対する
特異性が高く、他にガラクトース、D-キシロース、1,5-
アンヒドロ-D-グルシトールに作用した。また、D-グル
コースのＫｍ値を求めたところ、１．３７ｍＭであっ
た。 (6) 分子量 TSKgel G3000SWXL( 東ソー社製) によるゲル濾過法で、
分子量は約290,000であった。またアクリルアミドゲル4
〜20%(W/V)の濃度勾配を有するポリアクリルアミドゲ
ル（マルチゲル４−２０第１化学社製）を用いたSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるサブユニット
の分子量は約64,000であることから、本発明の酵素はこ
のサブユニットの４量体であると考えられる。
【００４４】
【発明の効果】本発明により、新規なピラノース・オキ
シダーゼを効率よく生産することができる。
【００４５】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：1869 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：コリオラス・ベルシカラー 株名：ps4a 配列： 45 ATG TCT ACT AGC TCG AGC GAC CCG TTC TTC AAC TTC ACG AAG TCG 90 AGC TTT AGG AGC GCG GCG GCG CAG AAG GCC TCG GCG ACT TCT CTG 135 CCG CCG CTG CCT GGT CCC GAC AAG AAA GTC CCT GGA ATG GAC ATC 180 AAG TAC GAC GTT GTC ATA GTA GGC TCC GGA CCG ATT GGA TGC ACG 225 TAT GCC CGT GAG CTC GTC GAA GCC GGT TAC AAG GTC GCC ATG TTC 270 GAC ATC GGG GAA ATT GAC TCT GGC CTG AAG ATC GGT GCC CAC AAG 315 AAG AAC ACC GTC GAA TAC CAG AAG AAC ATT GAC AAG TTT GTG AAC 360 GTC ATT CAG GGC CAA TTG ATG TCT GTT TCC GTT CCC GTC AAT ACC 405 CTC GTG ATC GAC ACG CTC AGC CCG ACG TCT TGG CAA GCT TCA TCG 450 TTC TTC GTC CGC AAT GGC TCG AAC CCA GAG CAG GAC CCG CTT CGT 495 AAC CTC AGT GGT CAG GCG GTC ACG CGT GTC GTC GGA GGC ATG TCC 540 ACG CAC TGG ACA TGC GCG ACA CCG CGC TTT GAC CGC GAG CAG CGC 585 CCG TTG CTC GTG AAG GAC GAC CAG GAC GCT GAC GAC GCC GAG TGG 630 GAC CGG CTG TAC ACC AAG GCC GAG TCA TAC TTC AAG ACC GGG ACG 675 GAC CAG TTC AAG GAG TCG ATC CGC CAC AAC CTC GTG CTC AAC AAG 720 CTC GCG GAG GAA TAC AAA GGT CAG CGC GAC TTC CAG CAG ATC CCG 765 CTC GCG GCA ACG CGT CGC AGT CCG ACC TTC GTC GAG TGG AGC TCG 810 GCG AAC ACC GTG TTC GAC CTC CAG AAC AGG CCG AAC ACG GAC GCG 855 CCG AAT GAG CGC TTC AAC CTC TTC CCC GCG GTT GCA TGT GAG CGC 900 GTC GTG CGC AAC ACG TCG AAC TCC GAG ATC GAG AGT CTG CAC ATC 945 CAC GAC CTC ATC TCG GGC GAC CGC TTC GAA ATC AAA GCA GAC GTG 990 TTC GTT CTT ACA GCC GGG GCG GTC CAC AAC GCG CAG CTT CTC GTG 1035 AAC TCT GGC TTT GGA CAG CTG GGC CGG CCG GAC CCC GCG AAC CCG 1080 CCG CAG TTG CTG CCG TCC CTG GGA AGC TAC ATC ACC GAG CAG TCG 1125 CTC GTC TTC TGC CAG ACC GTG ATG AGC ACC GAG CTC ATC GAC AGC 1170 GTC AAG TCC GAC ATG ATC ATC AGG GGC AAC CCT GGC GAT CTG GGG 1215 TAC AGC GTC ACG TAC ACG CCC GGC GCG GAG ACC AAC AAG CAC CCG 1260 GAC TGG TGG AAC GAA AAG GTG AAG AAC CAC ATG ATG CAG CAC CAG 1305 GAG GAC CCG CTT CCA ATC CCG TTC GAG GAC CCC GAG CCG CAG GTC 1350 ACC ACC TTG TTC CAG CCA TCG CAC CCG TGG CAC ACT CAG ATT CAC 1395 CGC GAT GCG TTC AGT TAC GGC GCG GTG CAG CAA AGC ATC GAC TCA 1440 CGT CTC ATC GTC GAC TGG CGC TTC TTC GGC CGG ACG GAG CCA AAG 1485 GAG GAG AAC AAG CTC TGG TTC TCG GAC AAA ATT ACG GAC ACG TAC 1530 AAC ATG CCG CAG CCG ACG TTC GAC TTC CGC TTC CCG GCG GGC CGC 1575 ACG AGC AAG GAG GCG GAG GAC ATG ATG ACC GAT ATG TGC GTT ATG 1620 TCG GCG AAG ATT GGT GGC TTC CTG CCC GGC TCC CTC CCG CAA TTC 1665 ATG GAG CCC GGT CTT GTC CTT CAC CTC GGT GGT ACG CAC CGC ATG 1710 GGC TTC GAC GAG CAG GAG GAC AAG TGC TGC GTC AAC ACG GAC TCG 1755 CGC GTG TTT GGC TTC AAG AAC CTG TTC CTC GGT GGC TGC GGA AAC 1800 ATT CCC ACC GCG TAC GGC GCG AAC CCG ACG CTC ACC GCA ATG TCG 1845 CTC GCG ATC AAG AGT TGC GAG TAC ATC AAG AAC AAC TTC ACA CCG 1869 AGC CCT TTC ACA GAT CAG GCT GAG
【００４６】配列番号：２ 配列の長さ：623 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列： 15 Met Ser Thr Ser Ser Ser Asp Pro Phe Phe Asn Phe Thr Lys Ser 30 Ser Phe Arg Ser Ala Ala Ala Gln Lys Ala Ser Ala Thr Ser Leu 45 Pro Pro Leu Pro Gly Pro Asp Lys Lys Val Pro Gly Met Asp Ile 60 Lys Tyr Asp Val Val Ile Val Gly Ser Gly Pro Ile Gly Cys Thr 75 Tyr Ala Arg Glu Leu Val Glu Ala Gly Tyr Lys Val Ala Met Phe 90 Asp Ile Gly Glu Ile Asp Ser Gly Leu Lys Ile Gly Ala His Lys 105 Lys Asn Thr Val Glu Tyr Gln Lys Asn Ile Asp Lys Phe Val Asn 120 Val Ile Gln Gly Gln Leu Met Ser Val Ser Val Pro Val Asn Thr 135 Leu Val Ile Asp Thr Leu Ser Pro Thr Ser Trp Gln Ala Ser Ser 150 Phe Phe Val Arg Asn Gly Ser Asn Pro Glu Gln Asp Pro Leu Arg 165 Asn Leu Ser Gly Gln Ala Val Thr Arg Val Val Gly Gly Met Ser 180 Thr His Trp Thr Cys Ala Thr Pro Arg Phe Asp Arg Glu Gln Arg 195 Pro Leu Leu Val Lys Asp Asp Gln Asp Ala Asp Asp Ala Glu Trp 210 Asp Arg Leu Tyr Thr Lys Ala Glu Ser Tyr Phe Lys Thr Gly Thr 225 Asp Gln Phe Lys Glu Ser Ile Arg His Asn Leu Val Leu Asn Lys 240 Leu Ala Glu Glu Tyr Lys Gly Gln Arg Asp Phe Gln Gln Ile Pro 255 Leu Ala Ala Thr Arg Arg Ser Pro Thr Phe Val Glu Trp Ser Ser 270 Ala Asn Thr Val Phe Asp Leu Gln Asn Arg Pro Asn Thr Asp Ala 285 Pro Asn Glu Arg Phe Asn Leu Phe Pro Ala Val Ala Cys Glu Arg 300 Val Val Arg Asn Thr Ser Asn Ser Glu Ile Glu Ser Leu His Ile 315 His Asp Leu Ile Ser Gly Asp Arg Phe Glu Ile Lys Ala Asp Val 330 Phe Val Leu Thr Ala Gly Ala Val His Asn Ala Gln Leu Leu Val 345 Asn Ser Gly Phe Gly Gln Leu Gly Arg Pro Asp Pro Ala Asn Pro 360 Pro Gln Leu Leu Pro Ser Leu Gly Ser Tyr Ile Thr Glu Gln Ser 375 Leu Val Phe Cys Gln Thr Val Met Ser Thr Glu Leu Ile Asp Ser 390 Val Lys Ser Asp Met Ile Ile Arg Gly Asn Pro Gly Asp Leu Gly 405 Tyr Ser Val Thr Tyr Thr Pro Gly Ala Glu Thr Asn Lys His Pro 420 Asp Trp Trp Asn Glu Lys Val Lys Asn His Met Met Gln His Gln 435 Glu Asp Pro Leu Pro Ile Pro Phe Glu Asp Pro Glu Pro Gln Val 450 Thr Thr Leu Phe Gln Pro Ser His Pro Trp His Thr Gln Ile His 465 Arg Asp Ala Phe Ser Tyr Gly Ala Val Gln Gln Ser Ile Asp Ser 480 Arg Leu Ile Val Asp Trp Arg Phe Phe Gly Arg Thr Glu Pro Lys 495 Glu Glu Asn Lys Leu Trp Phe Ser Asp Lys Ile Thr Asp Thr Tyr 510 Asn Met Pro Gln Pro Thr Phe Asp Phe Arg Phe Pro Ala Gly Arg 525 Thr Ser Lys Glu Ala Glu Asp Met Met Thr Asp Met Cys Val Met 540 Ser Ala Lys Ile Gly Gly Phe Leu Pro Gly Ser Leu Pro Gln Phe 555 Met Glu Pro Gly Leu Val Leu His Leu Gly Gly Thr His Arg Met 570 Gly Phe Asp Glu Gln Glu Asp Lys Cys Cys Val Asn Thr Asp Ser 585 Arg Val Phe Gly Phe Lys Asn Leu Phe Leu Gly Gly Cys Gly Asn 600 Ile Pro Thr Ala Tyr Gly Ala Asn Pro Thr Leu Thr Ala Met Ser 615 Leu Ala Ile Lys Ser Cys Glu Tyr Ile Lys Asn Asn Phe Thr Pro 623 Ser Pro Phe Thr Asp Gln Ala Glu
【００４７】配列番号：３ 配列の長さ：46 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列の特徴：合成ＤＮＡプライマー 配列： TG TAG CTC TCA AAC AAC GCC CAT ATG TCT ACT AGC TCG AGC GAC CC
【００４８】配列番号：４ 配列の長さ：46 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列の特徴：合成ＤＮＡプライマー 配列： AC TAA GCA AGG TCA GCG AGC CAT ATG TCA CTC AGC CTG ATC TGT GA
【００４９】配列番号：５ 配列の長さ：46 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列の特徴：合成ＤＮＡプライマー 配列： TG CCG CCG CTG CCT GGT CCC CAT ATG AAA GTC CCT GGA ATG GAC AT
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の酵素の安定ｐＨを示す図である。
【図２】 本発明の酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図３】 本発明の酵素の至適温度を示す図である。
【図４】 本発明の酵素の温度安定性を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 川合 源四郎 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内 (72)発明者 小山 泰二 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内 (72)発明者 鈴木 勝 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する新規なピラ
    ノース・オキシダーゼ： (1) 作用：グルコースを酸化してグルコソンにする； (2) 安定pH：4.0〜8.0； (3) 至適pH：７〜7.5； (4）至適温度：約50℃付近； (5) 温度安定性：約50℃まで安定； (6) 基質特異性：グルコースに特異的に作用するが、ガ
    ラクトース、L-ソルボース、D-キシロース、1,5-アンヒ
    ドロ-D-グルシトールにも作用する； (7) 分子量：約290,000(ゲル濾過法)
  2. 【請求項２】 配列番号２記載のアミノ酸配列を有する
    新規なピラノース・オキシダーゼ。
  3. 【請求項３】 配列番号２記載のアミノ酸配列において
    １もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換さ
    れており、かつピラノース・オキシダーゼの酵素活性を
    もたらすアミノ酸配列を有する新規なピラノース・オキ
    シダーゼ。
  4. 【請求項４】 配列番号２記載のアミノ酸配列をコード
    するピラノース・オキシダーゼ遺伝子。
  5. 【請求項５】 配列番号２記載のアミノ酸配列において
    １もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換さ
    れており、かつピラノース・オキシダーゼの酵素活性を
    もたらすアミノ酸配列をコードするピラノース・オキシ
    ダーゼ遺伝子。
  6. 【請求項６】 請求項４又は５記載のピラノース・オキ
    シダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴
    とする新規な組み換え体ＤＮＡ。
  7. 【請求項７】 請求項６記載の組み換え体ＤＮＡを含む
    エッシェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養
    物からピラノース・オキシダーゼを採取することを特徴
    とするピラノース・オキシダーゼの製造法。
JP7124835A 1994-12-07 1995-05-24 新規なピラノース・オキシダーゼ、ピラノース・オキシダーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びピラノース・オキシダーゼの製造法 Pending JPH08205861A (ja)

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US08/734,925 US5712139A (en) 1994-12-07 1996-10-22 Pyranose oxidase, pyranose oxidase gene, novel recombinant DNA and process for producing pyranose oxidase

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