JP2003093071A

JP2003093071A - グルコース脱水素酵素

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Publication number: JP2003093071A
Application number: JP2001294846A
Authority: JP
Inventors: Koji Hayade; 広司早出
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Priority date: 2001-09-26
Filing date: 2001-09-26
Publication date: 2003-04-02
Also published as: IL161060A0; CA2461755A1; EP1437411A1; US20040265828A1; CN1571841A; EP1437411A4; KR20040062945A; WO2003027294A1

Abstract

(57)【要約】【課題】組み換え生産されたＰＱＱＧＤＨの効率的
な回収を可能とする、改変型水溶性ＰＱＱＧＤＨを提供
すること。【解決手段】ピロロキノリンキノンを補酵素とする水
溶性グルコース脱水素酵素において、酵素分子表面上に
存在し、側鎖が分子表面上に露出しており他の残基と大
きな相互作用はしていないと考えられ、酵素活性部位ま
たは基質結合部位ではないと考えられる領域に存在する
アミノ酸残基、好ましくは、グルタミン、アスパラギ
ン、トレオニンからなる群より選択される１またはそれ
以上のアミノ酸残基がアルギニンで置換されている改変
型グルコース脱水素酵素。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はピロロキノリンキノ
ン（ＰＱＱ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（Ｇ
ＤＨ）の特定のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換
されている改変型グルコース脱水素酵素に関する。本発
明の改変型酵素は、臨床検査や食品分析などにおけるグ
ルコースの定量に有用である。

【０００２】

【従来の技術】血中グルコース濃度は、糖尿病の重要な
マーカーとして臨床診断上極めて重要な指標である。ま
た、微生物を用いる発酵生産におけるグルコース濃度の
定量がプロセスモニタリングにおいて重要な項目となっ
ている。従来、グルコースはグルコーｂスオキシダーゼ
（ＧＯＤ）あるいはグルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ
６ＰＤＨ）を用いる酵素法により定量されていた。最
近、新たな酵素としてピロロキノリンキノンを補酵素と
するグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）の応用が注
目されている。ＰＱＱＧＤＨはグルコースに対して高い
酸化活性を有していること、およびＰＱＱＧＤＨは補酵
素結合型の酵素であるため電子受容体として酸素を必要
としないことから、グルコースセンサーの認識素子をは
じめとして、アッセイ分野への応用が期待されている。

【０００３】ＰＱＱＧＤＨは、ピロロキノリンキノンを
補酵素とするグルコース脱水素酵素であり、グルコース
を酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触媒す
る。

【０００４】ＰＱＱＧＤＨには、膜結合性酵素と水溶性
酵素があることが知られている。膜結合性ＰＱＱＧＤＨ
は、分子量約８７ｋＤａのシングルペプチド蛋白質であ
り、種々のグラム陰性菌において広く見いだされてい
る。一方、水溶性ＰＱＱＧＤＨはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓのいくつかの株に
おいてその存在が確認されており（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５），５９
（８），１５４８−１５５５）、その構造遺伝子がクロ
ーニングされアミノ酸配列が明らかにされている（Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９），２１７：４３
０−４３６）。Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水
溶性ＰＱＱＧＤＨは、分子量約５０ｋＤａのサブユニッ
ト２つからなるホモダイマーを形成する水溶性酵素であ
り、活性を示すためにＰＱＱとＣａ²⁺を必要とし、２２
００Ｕ／ｍｇ〜７４００Ｕ／ｍｇという高い酵素活性を
示す。等電点が、ＰＱＱと結合していないアポ酵素で約
９．２、ホロ酵素で約１０．２である塩基性蛋白質であ
ることなどが知られている（Ｋ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｔ
ａ，ｅｔａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１５４８−１５５
５）。また、水溶性ＰＱＱＧＤＨのＸ線構造解析の結果
が発表されており（Ａ．Ｏｕｂｒｉｅ，ｅｔａｌ．
（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，２８９，３１９
-３３３およびＡ．Ｏｕｂｒｉｅ，ｅｔａｌ．（１９
９９）ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ，１８（１
９），５１８７-５１９４）、水溶性ＰＱＱＧＤＨの立
体構造やＰＱＱおよびＣａ²⁺の推定存在位置などが明ら
かにされている。

【０００５】水溶性ＰＱＱＧＤＨの精製に関しては、Ｄ
ｕｉｎｅらが、Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓから
水溶性ＰＱＱＧＤＨを完全精製し、１０％の回収率で６
４０Ｕ／ｍｇの比活性を得ている（Ｐ．Ｄｏｋｔｅｒ，
ｅｔａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３
９，１６３−１６７）。彼らは菌体（Ａ．ｃａｌｃｏ
ａｃｅｔｉｃｕｓ）から調製した水溶性画分に対し、陽
イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラ
フィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過ク
ロマトグラフィーの順で行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約５
０ｋＤａのシングルバンドを確認した。その後の研究で
４４％の回収率で２２１４Ｕ／ｍｇの比活性を得た
（Ｋ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，ｅｔａｌ．上掲）。さ
らに、彼らは水溶性ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子を大腸菌
に組み込んで組み換え生産し、陽イオン交換クロマトグ
ラフィー２回と疎水クロマトグラフィーを行って４１％
の回収率で７４００Ｕ／ｍｇの比活性を得ている（Ａ．
Ｊ．Ｊ．Ｏｌｓｔｈｏｏｒｎ，ａｎｄＪ．Ａ．Ｄｕｉ
ｎｅ（１９９６）ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３３６，４２−４８）。

【０００６】ＰＱＱＧＤＨを効率的に生産する方法とし
ては、大腸菌において組み換え生産する方法、および酵
母あるいは腸内性細菌群を宿主として組み換え生産する
方法が報告されている。水溶性ＰＱＱＧＤＨをこのよう
に組み換え発現させた場合、この酵素は水溶性蛋白質と
して発現され、その等電点が非常に高く塩基性であるた
め、精製には主として陽イオン交換クロマトグラフィー
が用いられる。しかし陽イオン交換クロマトグラフィー
だけで宿主に由来する他の塩基性蛋白質を取り除くこと
は難しい。

【０００７】一方、塩基性蛋白質の精製方法としては、
陽イオン交換カラムへの親和性を向上させる目的で、ア
フィニティーテールとしてＣ末端にアルギニンテールを
付加する方法が知られている（Ｈ．Ｍ．Ｓａｓｓｅｎｆ
ｅｌｄ，ａｎｄＳ．Ｊ．Ｂｒｅｗｅ（１９８４）
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２，７６−８１）。この
方法を塩基性蛋白質である水溶性ＰＱＱＧＤＨに応用す
れば、水溶性ＰＱＱＧＤＨの表面電荷が増加し、陽イオ
ン交換カラムに対する親和性を向上させることができる
と期待される。しかし、このようなアルギニンテールを
付加した蛋白質を大腸菌で生産させると、大腸菌の外膜
プロテアーゼによりアルギニン残基がＣ末端側から切断
されて、単一の酵素標品を得ることが困難であるという
問題点があった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、組み換え生産されたＰＱＱＧＤＨの効率的な回収を
可能とする、改変型水溶性ＰＱＱＧＤＨを提供すること
を目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は従来の水溶性
ＰＱＱＧＤＨを改良して、精製が容易にできる改変型Ｐ
ＱＱＧＤＨを開発すべく鋭意研究を行なった結果、水溶
性ＰＱＱＧＤＨの表面に存在する特定の残基をアルギニ
ンに置換することにより、陽イオン交換クロマトグラフ
ィーにより容易に精製することが可能な変異型酵素を得
ることに成功した。

【００１０】すなわち、本発明は、ピロロキノリンキノ
ンを補酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素におい
て、酵素分子表面上に存在する、グルタミン、アスパラ
ギン、トレオニンからなる群より選択される１またはそ
れ以上のアミノ酸残基がアルギニンで置換されている改
変型グルコース脱水素酵素を提供する。

【００１１】好ましくは、ピロロキノリンキノンを補酵
素とする水溶性グルコース脱水素酵素は、Ａｃｉｎｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来の水
溶性ＰＱＱＧＤＨである。

【００１２】本発明はまた、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来のピロロキノリン
キノンを補酵素とする水溶性グルコース脱水素酵素にお
いて、２０９番目のグルタミン残基、２４０番目のアス
パラギン残基および３８９番目のトレオニン残基からな
る群より選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基が
アルギニンで置換されている改変型グルコース脱水素酵
素を提供する。より好ましくは、２０９番目のグルタミ
ン残基、２４０番目のアスパラギン残基および３８９番
目のトレオニン残基がそれぞれアルギニンで置換されて
いる。

【００１３】本発明はまた、上述の改変型グルコース脱
水素酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター
および該遺伝子を含む形質転換体、ならびに本発明の改
変型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキ
ットおよびグルコースセンサーを提供する。

【００１４】

【発明の実施の形態】改変型ＰＱＱＧＤＨの設計本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを製造するためには、天然
の水溶性ＰＱＱＧＤＨの立体構造情報に基づいて、アミ
ノ酸置換により酵素活性および安定性などの諸性質を変
えることなく、表面電荷を増加させることができる部位
を選択する。選択は、以下の基準にしたがって行う：水
溶性ＰＱＱＧＤＨ蛋白質の表面上に存在すること、中性
の残基であること、極性の残基であること、側鎖が分子
表面上に露出しており他の残基と大きな相互作用はして
いないと考えられること、酵素活性部位または基質結合
部位ではないと考えられる領域に存在すること。このよ
うにして選択されたアミノ酸残基を、塩基性残基、特に
アルギニン残基に置換することにより、酵素活性に多大
な影響を及ぼすことなく、蛋白質の表面電荷を増大する
ことができる。好ましくは、変異すべきアミノ酸残基
は、グルタミン、アスパラギンおよびトレオニンからな
る群より選択される。

【００１５】このようにして得られる本発明の改変型Ｐ
ＱＱＧＤＨは、増大した表面電荷により陽イオン交換ク
ロマトグラフィーに強固に結合するため、陽イオン交換
クロマトグラフィーを用いて宿主由来の他の蛋白質から
容易に分離精製することができる。

【００１６】また、本発明の改変型グルコース脱水素酵
素においては、所望のグルコースデヒドロゲナーゼ活性
を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失ま
たは置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付
加されていてもよい。

【００１７】さらに、当業者は、他の細菌に由来する水
溶性ＰＱＱＧＤＨについても、本発明の教示にしたがっ
て分子表面に存在する中性の極性残基を選択し、そのア
ミノ酸残基をアルギニンに置換することにより、表面電
荷が増大したＰＱＱＧＤＨを容易に得ることができる。

【００１８】改変型ＰＱＱＧＤＨの製造方法Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃ
ｕｓ由来の天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝
子の配列は配列番号２で規定される。

【００１９】本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする
遺伝子は、天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝
子において、置換すべきアミノ酸残基をコードする塩基
配列を、アルギニンをコードする塩基配列に置換するこ
とにより構築することができる。このような部位特異的
塩基配列置換のための種々の方法が、当該技術分野にお
いて知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，”Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；ＡＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，第２版，１９８９，
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋに記載され
ている。

【００２０】このようにして得た変異遺伝子を遺伝子発
現用のベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを
適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋
白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該
技術分野において知られており、宿主としては例えば、
細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることが
できる。

【００２１】上述のようにして得られた、改変型ＰＱＱ
ＧＤＨを発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心
分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスな
どで破砕するか、またはオスモティックショックにより
ペリプラズム酵素を培地中に放出させる。これを超遠心
分離し、ＰＱＱＧＤＨを含む水溶性画分を得ることがで
きる。あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることに
より、発現したＰＱＱＧＤＨを培養液中に分泌させるこ
ともできる。

【００２２】次に、得られた水溶性画分を、陽イオン交
換クロマトグラフィーにより精製する。精製は、蛋白質
のクロマトグラフィー精製についての当該技術分野にお
いて一般に知られる教科書の記載にしたがって行うこと
ができる。蛋白質の精製に用いることができる種々の陽
イオン交換クロマトグラフィー用カラムが当該技術分野
において知られており、これらのいずれを用いてもよ
い。例えば、ＣＭ−５ＰＷ、ＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
６５０Ｍ、ＳＰ−５ＰＷ（以上、東ソー株式会社）、
Ｓ−セファロース、Ｍｏｎｏ−Ｓ、Ｓ−Ｒｅｓｏｒｃｅ
（以上ファルマシア社）を用いることができる。カラム
を適当なバッファーで平衡化し、試料をカラムに負荷
し、未吸着成分を洗い流す。バッファーとしては、例え
ばリン酸バッファー、ＭＯＰＳバッファー等を用いるこ
とができる。

【００２３】次に、塩濃度のより高いバッファーを用い
て、カラムに吸着された成分を溶出する。塩濃度は、塩
濃度の異なる複数のバッファーを用いて、段階的に、直
線勾配により、またはこれらの組み合わせにより変化さ
せることができる。試料の溶出は吸光度測定などにより
モニターし、適当な量ずつ分取する。各画分について酵
素活性を測定して、所望の画分を回収することにより、
本発明の改変型酵素を精製標品として得ることができ
る。

【００２４】さらに、陽イオンクロマトグラフィーの前
または後に、必要に応じて、濾過、透析、ゲル濾過クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等
の、蛋白質の精製に関して当該技術分野において知られ
る他の手法による精製を行ってもよい。

【００２５】蛋白質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰ
ＬＣ等の、当該技術分野において知られる方法を用いて
容易に確認することができる。

【００２６】酵素活性の測定方法本発明のＰＱＱＧＤＨは、ＰＱＱを補酵素として、グル
コースを酸化してグルコノラクトンを生成する反応を触
媒する作用を有する。酵素活性の測定は、ＰＱＱＧＤＨ
によるグルコースの酸化にともなって還元されるＰＱＱ
の量を酸化還元色素の呈色反応により定量することがで
きる。呈色試薬としては、例えば、ＰＭＳ（フェナジン
メトサルフェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェ
ノールインドフェノール）、フェリシアン化カリウム、
フェロセンなどを用いることができる。

【００２７】グルコースアッセイキット本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを含む
グルコースアッセイキットを特徴とする。本発明のグル
コースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＰＱＱＧ
ＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典
型的には、キットは、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨに加
えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャ
リブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶
液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う改変型Ｐ
ＱＱＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試
薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供す
ることができる。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤ
Ｈはホロ化した形態で提供されるが、アポ酵素の形態で
提供し、使用時にホロ化することもできる。

【００２８】グルコースセンサー本発明はまた、本発明に従う改変型ＰＱＱＧＤＨを用い
るグルコースセンサーを特徴とする。電極としては、カ
ーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上
に本発明の酵素を固定化する。固定化方法としては、架
橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する
方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電
性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはフ
ェロセンあるいはその誘導体に代表される電子メディエ
ーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着
固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよ
い。好ましくは本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨはホロ化し
た形態で電極上に固定化するが、アポ酵素の形態で固定
化し、ＰＱＱを別の層としてまたは溶液中で提供するこ
ともできる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて
本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨをカーボン電極上に固定化
した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアル
デヒドの遊離官能基をブロッキングする。

【００２９】グルコース濃度の測定は、以下のようにし
て行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、ＰＱＱ
およびＣａＣｌ₂、およびメディエーターを加えて一定
温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシア
ン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用い
ることができる。作用電極として本発明の改変型ＰＱＱ
ＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電
極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用
いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定
常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増
加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製し
たキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコー
ス濃度を計算することができる。

【００３０】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。

【００３１】実施例１改変型酵素ＰＱＱＧＤＨ遺伝子の構築配列番号２に示されるAcinetobacter calcoaceticus由
来ＰＱＱＧＤＨの構造遺伝子をもとに、変異の導入を行
った。プラスミドｐＧＢ２は、ベクターｐＴｒｃ９９Ａ
（ファルマシア社製）のマルチクローニング部位に、Ａ
ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕ
ｓ由来ＰＱＱＧＤＨをコードする構造遺伝子を挿入した
ものである（図１）。常法に従って部位特異的変異法に
より、グルタミン２０９、アスパラギン２４０およびト
レオニン３８９をコードする塩基配列をそれぞれアルギ
ニンをコードする塩基配列に置換した。部位特異的変異
はプラスミドｐＧＢ２を用いて、図２に示す方法により
行った。変異に用いた合成オリゴヌクレオチドターゲッ
トプライマーの配列を以下に示す。

【００３２】Q209R 5'- gCCAACTCAACgTgAACTgAATg -3' （配列番号３） D229R 5'- CTTAAATCTTCgTggAAgTATTC -3' （配列番号４） N240R 5'- CCAAgTTTTCgCggggTggTTAg -3' （配列番号５）ベクタープラスミドｐＫＦ１８ｋ（宝酒造（株））にAc
inetobacter calcoaceticus由来ＰＱＱＧＤＨをコード
する遺伝子の一部を含むKpn I-Hind III断片を組み込
み、これをテンプレートとした。このテンプレート５０
fmolと宝酒造（株）製Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｅｘｐ
ｒｅｓｓＫｍキットに付属のセレクションプライマー
５pmol、リン酸化したターゲットプライマー５０pmolを
全体（２０μｌ）の１／１０量の同キットのアニーリン
グバッファーとともに混合し、１００℃、３分間の熱処
理でプラスミドを変性させ、１本鎖にした。セレクショ
ンプライマーはｐＫＦ１８ｋのカナマイシン耐性遺伝子
上にある二重のアンバー変異を復帰させるためのもので
ある。これを５分間氷上に置き、プライマーをアニーリ
ングさせた。これに３μｌの同キットエクステンション
バッファー、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ、１μｌの
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよび５μｌの滅菌水を加え
て相補鎖を合成した。

【００３３】これをＤＮＡのミスマッチ修復能欠損株で
あるE.coli ＢＭＨ７１−１８mutSに形質転換し、一晩
振とう培養を行ってプラスミドを増幅させた。

【００３４】次に、ここから抽出したプラスミドをE.co
li ＭＶ１１８４に形質転換し、そのコロニーからプラ
スミドを抽出した。そしてこれらのプラスミドについて
シークエンスを行い、目的とした変異の導入を確認し
た。この断片を、プラスミドｐＧＢ２上の野生型ＰＱＱ
ＧＤＨをコードする遺伝子のKpn I-Hind III断片と入れ
替え、Ｑ２０９Ｒ，Ｄ２２９ＲならびにＮ２４０Ｒの３
箇所の変異を有する改変型ＰＱＱＧＤＨ（以下改変型Ｐ
ＱＱＧＤＨ）の遺伝子を構築した。

【００３５】実施例２改変型酵素の調製野生型または改変型ＰＱＱＧＤＨをコードする遺伝子
を、Ｅ．ｃｏｌｉ用の発現ベクターであるｐＴｒｃ９９
Ａ（ファルマシア社）のマルチクローニングサイトに挿
入し、構築されたプラスミドを大腸菌DH5α株に形質転
換した。これを４５０ｍｌのＬ培地（アンピシリン５０
μｇ／ｍｌ含有）で坂口フラスコを用いて３７℃で一晩
振とう培養し、１ｍＭＣａＣｌ₂、５００μＭＰＱＱ
を含む７ＬのＬ培地に植菌した。培養開始後約３時間で
イソプロピルチオガラクトシドを終濃度０．３ｍＭにな
るように添加し、その後１．５時間培養した。菌体を遠
心分離（５，０００×ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）で集菌し
た後、０．８５％ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。この
菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で懸濁し、
フレンチ・プレスで破砕（１１０ＭＰａ）した後、遠心
分離（１５，０００×ｇ，１５ｍｉｎ，４℃）を２回行
い、未破砕菌体を沈殿として除去した。この上清を超遠
心分離（４０，０００ｒ．ｐ．ｍ．，９０ｍｉｎ，４
℃）し、その上清を水溶液画分として得た。これをＡバ
ッファー（１０ｍＭＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ
７．０））で４℃にて一晩透析し、粗精製画分を得た。

【００３６】実施例３陽イオンクロマトグラフィーによる精製実施例２で調製した粗精製画分は、カラムに吸着させる
前に０．２μｍのフィルタでろ過した。カラムはＣＭ−
５ＰＷ（東ソー株式会社）を使用し、Ａバッファーとし
て１０ｍＭＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．
０）、Ｂバッファーとして０．８ＭＮａＣｌ＋１０ｍ
ＭＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）を用い
た。

【００３７】まずカラムをＡバッファーで平衡化させ、
サンプルを吸着させた後、カラム容量の５倍量のＡバッ
ファーで洗浄した。その後、Ｂバッファーを用いて０Ｍ
−０．６４ＭＮａＣｌ（１２０ｍｉｎ）の直線グラジ
エントをかけ、目的の酵素を溶出させた。なお、流速は
０．５ｍｌ／ｍｉｎで行い、２８０ｎｍの吸光波長で溶
出蛋白質を検出した。また、溶出液の分取は２ｍｉｎず
つ行った。野生型水溶性ＰＱＱＧＤＨは陽イオン交換ク
ロマトグラフィーにおいて約２０分、塩濃度８０ｍＭ付
近に溶出のピークを示し、改変型水溶性ＰＱＱＧＤＨは
約３８分、塩濃度１９０ｍＭ付近に溶出のピークを示し
た。

【００３８】溶出ピークの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
析した結果を図３に示す。改変型水溶性ＰＱＱＧＤＨに
ついては、目的の大きさである５０ｋＤａのシングルバ
ンドが得られ、この１回のクロマトグラフィーでほぼ完
全に精製することができた。これに対し、野生型水溶性
ＰＱＱＧＤＨでは夾雑物のバンドが見られた。

【００３９】実施例４酵素活性の測定酵素活性の測定は１０ｍＭＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ７．０）中においてＰＭＳ（フェナジンメトサル
フェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールイ
ンドフェノール）を用い、ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光
度変化を分光光度計を用いて追跡し、その吸光度の減少
速度を酵素の反応速度とした。このとき、１分間に１μ
ｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１ユニットと
した。また、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係
数は１６．３ｍＭ^-1とした。

【００４０】クロマトグラフィーの各画分についての酵
素活性を図４に示す。横軸は溶出時間、縦軸はＧＤＨ活
性である。

【００４１】実施例５酵素活性および基質特異性の評価クロマトグラフィーで得られた活性画分および未吸着画
分、粗精製画分を、１００倍量の１０ｍＭＭＯＰＳ-
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で４℃にて一晩透析し、
それぞれ１μＭＰＱＱ、１ｍＭＣａＣｌ₂存在下で１
時間以上ホロ化した。これを１８７μｌずつ分注し、３
μｌの活性試薬（６ｍＭＤＣＩＰ４８μｌ，６００ｍＭ
ＰＭＳ８μｌ，１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０１
６μｌ）および基質として、２０ｍＭのグルコース、２
−デオキシ−Ｄ−グルコース、マンノース、アロース、
３−ｏ−メチル−Ｄ−グルコース、ガラクトース、キシ
ロース、ラクトースまたはマルトース溶液１０μｌを加
え、実施例４に示す方法により室温で酵素活性を測定し
た。基質濃度対酵素活性のプロットから、ＫｍおよびＶ
ｍａｘを求めた。

【００４２】グルコースに対する活性は、野生型水溶性
ＰＱＱＧＤＨが約７１００Ｕ／ｍｇ、改変型水溶性ＰＱ
ＱＧＤＨが約７８００Ｕ／ｍｇであり、ほぼ同じ活性を
示した。また、グルコース以外の各基質に対するＫｍ値
とＶｍａｘ値は、野生型および改変型水溶性ＰＱＱＧＤ
Ｈのいずれもほぼ同様の値を示し、変異導入による基質
特異性の変化は見られなかった。

【００４３】実施例６グルコースのアッセイ改変型ＰＱＱＧＤＨを用いてグルコースをアッセイし
た。改変型酵素を、１μＭＰＱＱ、１ｍＭＣａＣｌ₂
存在下で１時間以上ホロ化し、各種濃度のグルコースお
よび５μＭＰＱＱ、１０ｍＭＣａＣｌ₂存在下で酵素
活性を測定した。方法は実施例４に記載の酵素活性の測
定法に準じ、ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度の変化を指
標とした。図５に示されるように、改変型ＰＱＱＧＤＨ
を用いて、５ｍＭ−５０ｍＭの範囲でグルコースの定量
を行うことができる。

【００４４】実施例７酵素センサーの作製および評価５Ｕの改変型酵素にカーボンペースト２０ｍｇを加えて
凍結乾燥させた。これをよく混合した後、既にカーボン
ペーストが約４０ｍｇ充填されたカーボンペースト電極
の表面だけに充填し、濾紙上で研磨した。この電極を１
％のグルタルアルデヒドを含む１０ｍＭＭＯＰＳ緩衝
液（ｐＨ７．０）中で室温で３０分間処理した後、２０
ｍＭリジンを含む１０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．
０）中で室温で２０分間処理してグルタルアルデヒドを
ブロッキングした。この電極を１０ｍＭＭＯＰＳ緩衝
液（ｐＨ７．０）中で室温で１時間以上平衡化させた。
電極は４℃で保存した。

【００４５】作製した酵素センサーを用いてグルコース
濃度の測定を行った。得られたキャリブレーションカー
ブを図６に示す。すなわち、本発明の改変型ＰＱＱＧＤ
Ｈを固定化した酵素センサーを用いて、１ｍＭ−１２ｍ
Ｍの範囲でグルコースの定量を行うことができた。

【００４６】

【配列表】 Sequence Listing <110> Sode, Koji <120> Glucose Dehydrogenase <130> psg0013 <160> 5 <210> 1 <211> 454 <212> PRT <213> Acinetobacter calcoaceticus <400> 1 Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn 1 5 10 15 Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu 20 25 30 Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly 35 40 45 Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe 50 55 60 Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu 65 70 75 80 Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile 85 90 95 Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn 100 105 110 Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu 115 120 125 Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His 130 135 140 Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr 145 150 155 160 Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn 165 170 175 Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr 180 185 190 His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile 195 200 205 Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr 210 215 220 Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys 225 230 235 240 Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu 245 250 255 Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys 260 265 270 Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys 275 280 285 Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val 290 295 300 Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro 305 310 315 320 Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro 325 330 335 Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser 340 345 350 Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu 355 360 365 Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile 370 375 380 Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met 385 390 395 400 Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly 405 410 415 Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp 420 425 430 Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys 435 440 445 Phe Thr Tyr Lys Ala Lys 450 <210> 2 <211> 1612 <212> DNA <213> Acinetobacter calcoaceticus <400> 2 agctactttt atgcaacaga gcctttcaga aatttagatt ttaatagatt cgttattcat 60 cataatacaa atcatataga gaactcgtac aaacccttta ttagaggttt aaaaattctc 120 ggaaaatttt gacaatttat aaggtggaca catgaataaa catttattgg ctaaaattgc 180 tttattaagc gctgttcagc tagttacact ctcagcattt gctgatgttc ctctaactcc 240 atctcaattt gctaaagcga aatcagagaa ctttgacaag aaagttattc tatctaatct 300 aaataagccg catgctttgt tatggggacc agataatcaa atttggttaa ctgagcgagc 360 aacaggtaag attctaagag ttaatccaga gtcgggtagt gtaaaaacag tttttcaggt 420 accagagatt gtcaatgatg ctgatgggca gaatggttta ttaggttttg ccttccatcc 480 tgattttaaa aataatcctt atatctatat ttcaggtaca tttaaaaatc cgaaatctac 540 agataaagaa ttaccgaacc aaacgattat tcgtcgttat acctataata aatcaacaga 600 tacgctcgag aagccagtcg atttattagc aggattacct tcatcaaaag accatcagtc 660 aggtcgtctt gtcattgggc cagatcaaaa gatttattat acgattggtg accaagggcg 720 taaccagctt gcttatttgt tcttgccaaa tcaagcacaa catacgccaa ctcaacaaga 780 actgaatggt aaagactatc acacctatat gggtaaagta ctacgcttaa atcttgatgg 840 aagtattcca aaggataatc caagttttaa cggggtggtt agccatattt atacacttgg 900 acatcgtaat ccgcagggct tagcattcac tccaaatggt aaattattgc agtctgaaca 960 aggcccaaac tctgacgatg aaattaacct cattgtcaaa ggtggcaatt atggttggcc 1020 gaatgtagca ggttataaag atgatagtgg ctatgcttat gcaaattatt cagcagcagc 1080 caataagtca attaaggatt tagctcaaaa tggagtaaaa gtagccgcag gggtccctgt 1140 gacgaaagaa tctgaatgga ctggtaaaaa ctttgtccca ccattaaaaa ctttatatac 1200 cgttcaagat acctacaact ataacgatcc aacttgtgga gagatgacct acatttgctg 1260 gccaacagtt gcaccgtcat ctgcctatgt ctataagggc ggtaaaaaag caattactgg 1320 ttgggaaaat acattattgg ttccatcttt aaaacgtggt gtcattttcc gtattaagtt 1380 agatccaact tatagcacta cttatgatga cgctgtaccg atgtttaaga gcaacaaccg 1440 ttatcgtgat gtgattgcaa gtccagatgg gaatgtctta tatgtattaa ctgatactgc 1500 cggaaatgtc caaaaagatg atggctcagt aacaaataca ttagaaaacc caggatctct 1560 cattaagttc acctataagg ctaagtaata cagtcgcatt aaaaaaccga tc 1612 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 3 gccaactcaa cgtgaactga atg <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 4 cttaaatctt cgtggaagta ttc <210> 5 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for point mutation <400> 5 ccaagttttc gcggggtggt tag

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の改変型酵素をコードする突
然変異遺伝子を作成する方法を示す。

【図２】図２は、本発明において用いたプラスミドｐ
ＧＢ２の構造を示す。

【図３】図３は、本発明の改変型酵素のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥを示す写真図面である。

【図４】図４は、本発明の改変型酵素のクロマトグラ
フィーの各画分についての酵素活性を示す。

【図５】図５は、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを用い
るグルコースのアッセイを示す。

【図６】図６は、本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを用い
る酵素センサーのキャリブレーションカーブを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:01 9/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｍ 1/34 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:01）Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA08 CA06 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA02 EA04 GA11 HA12 4B029 AA07 BB18 CC03 CC08 FA15 4B050 CC04 DD02 LL04 4B065 AA01X AA01Y AA57X AA72X AA90X AB01 BA02 CA28 CA44 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ピロロキノリンキノンを補酵素とする水
溶性グルコース脱水素酵素において、酵素分子表面上に
存在する、グルタミン、アスパラギン、トレオニンから
なる群より選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基
がアルギニンで置換されている改変型グルコース脱水素
酵素。
【請求項２】前記ピロロキノリンキノンを補酵素とす
る水溶性グルコース脱水素酵素がＡｃｉｎｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱ
ＧＤＨである、請求項１記載の改変型グルコース脱水素
酵素。
【請求項３】Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃ
ｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来のピロロキノリンキノンを補酵
素とする水溶性グルコース脱水素酵素において、２０９
番目のグルタミン残基、２４０番目のアスパラギン残基
および３８９番目のトレオニン残基からなる群より選択
される１またはそれ以上のアミノ酸残基がアルギニンで
置換されている改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項４】２０９番目のグルタミン残基、２４０番
目のアスパラギン残基および３８９番目のトレオニン残
基がそれぞれアルギニンで置換されている、請求項３記
載の改変型グルコース脱水素酵素。
【請求項５】請求項１−４のいずれかに記載の改変型
グルコース脱水素酵素をコードする遺伝子。
【請求項６】請求項５に記載の遺伝子を含むベクタ
ー。
【請求項７】請求項５に記載の遺伝子を含む形質転換
体。
【請求項８】請求項５に記載の遺伝子が主染色体に組
み込まれた生物。
【請求項９】請求項８記載の生物を用いることを特徴
とする、請求項１−４のいずれかに記載の改変型グルコ
ース脱水素酵素の製造方法。
【請求項１０】請求項１−４のいずれかに記載の改変
型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキッ
ト。
【請求項１１】請求項１−４のいずれかに記載の改変
型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサー。