PL205561B1 - Zmutowane białko zależnej od pirolochinolinochinonu rozpuszczalnej dehydrogenazy glukozowej, wyizolowany polinukleotyd kodujący to białko, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania wariantów s-GDH, sposób wykrywania, oznaczania lub pomiaru glukozy i urządzenie do wykrywania lub pomiaru glukozy - Google Patents
Zmutowane białko zależnej od pirolochinolinochinonu rozpuszczalnej dehydrogenazy glukozowej, wyizolowany polinukleotyd kodujący to białko, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania wariantów s-GDH, sposób wykrywania, oznaczania lub pomiaru glukozy i urządzenie do wykrywania lub pomiaru glukozyInfo
- Publication number
- PL205561B1 PL205561B1 PL362548A PL36254801A PL205561B1 PL 205561 B1 PL205561 B1 PL 205561B1 PL 362548 A PL362548 A PL 362548A PL 36254801 A PL36254801 A PL 36254801A PL 205561 B1 PL205561 B1 PL 205561B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- gdh
- glucose
- mutant
- amino acid
- variants
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zmutowane białko zależnej od pirolochinolinochinonu rozpuszczalnej dehydrogenazy glukozowej, wyizolowany polinukleotyd kodujący to białko, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania wariantów s-GDH, sposób wykrywania, oznaczania lub pomiaru glukozy i urządzenie do wykrywania lub pomiaru glukozy.
Scharakteryzowano dwa typy dehydrogenazy glukozowej zależnej od PQQ (EC 1.1.99.17): jeden jest związany z błoną (m-GDH), drugi zaś rozpuszczalny (s-GDH). Oba typy nie wykazują znaczącej homologii sekwencji względem siebie (Cleton-Jansen, A. M., i wsp., Mol Gen Genet 217 (1989) 430-6; Cleton-Jansen A.M., i wsp., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 73-9; Oubrie, A. i wsp., Proc Natl Acad Sci U S A 96 (1999) 11787-91). Różnią się one także pod względem właściwości kinetycznych i immunologicznych (Matsushita, K., i wsp., Bioscience Biotechnology & Biochemistry 59 (1995) 1548-1555).
Chinoproteiny wykorzystują chinon jako kofaktor dla utleniania alkoholi, amin i aldoz do ich odpowiednich laktonów, aldehydów i kwasów aldonowych (Duine, J.A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter w „The Biology of Acinetobacter” (1991) 295-312, New York, Plenum Press; Duine, J.A., Eur J Biochem 200 (1991) 271-84, Davidson, V.L. - w „Principles and applications of quinoproteins” (1993) - cała książka, New York, Marcel Dekker; Anthony, C, Biochem J 320 (1996) 697-711; Anthony, C, i Ghosh, M., Current Science 72 (1997) 716-727; Anthony, C. Biochem Soc Trans 26 (1998) 413-7; Anthony, C. i Ghosh, M., Prog Biophys Mol Biol 69 (1998) 1-21). Wśród chinoprotein najliczniejszą grupę stanowią te, które zawierają niekowalencyjnie związany kofaktor 2,7,9-trikarboksy-1H-pirolo[2,3-f]chinolino-4,5-dion (PQQ) (Duine 1991, powyżej). Wszystkie poznane dotychczas bakteryjne dehydrogenazy glukozowe należą do tej podgrupy, gdzie grupą prostetyczną jest PQQ (Anthony i Ghosh 1997, powyżej, Goodwin i Anthony 1998, powyżej). U bakterii występują dwa zupełnie różne typy zależnych od PQQ dehydrogenaz glukozowych (1.1.99.17): typ rozpuszczalny (s-GDH) i typ związany z błoną (m-GDH) (Duine i wsp., 1982; Matsushita i wsp., 1989a,b). m-GDH występują powszechnie u bakterii Gram-ujemnych, s-GDH znaleziono jednak jedynie w przestrzeni peryplazmatycznej szczepów Acinetobacter takich, jak A. calcoaceticus (Duine, 1991a; Cleton-Jansen i wsp., 1988; Matsushita i Adachi, 1993) i A. baumannii (JP 11243949).
Metodą przeszukiwania baz danych sekwencji zidentyfikowano dwie sekwencje homologiczne do pełnej długości s-GDH A. calcoaceticus w E. coli K-12 i Synechocystis sp.. Ponadto odnaleziono dwie niepełne sekwencje homologiczne do s-GDH A. calcoaceticus w genomie odpowiednio P. aeruginosa i Bordetella pertussis (Oubrie i wsp., 1999a). Przewidywane sekwencje aminokwasowe tych czterech nie scharakteryzowanych białek są bardzo zbliżone do s-GDH A. calcoaceticus, przy czym wiele reszt hipotetycznego miejsca aktywnego wykazuje absolutną konserwację. Te homologiczne białka mają prawdopodobnie podobną strukturę i katalizują podobne, zależne od PQQ reakcje (Oubrie i wsp., 1999a).
Stwierdzono, że bakteryjne s-GDH i m-GDH posiadają całkiem odmienne sekwencje i wykazują inną specyficzność substratową. Przykładowo, A. calcoaceticus zawiera dwie różne, zależne od PQQ, dehydrogenazy glukozowe, jedną m-GDH, która jest aktywna in vivo, zaś dla drugiej, oznaczonej s-GDH wykazano jedynie aktywność in vitro. Cleton-Jansen i wsp., (1988; 1989a,b) sklonowali geny kodujące oba enzymy GDH i wyznaczyli sekwencje DNA obu tych genów GDH. Brak jest oczywistej homologii między m-GDH i s-GDH, co potwierdza fakt, że m-GDH i s-GDH reprezentują dwie zupełnie odmienne cząsteczki.
Gen s-GDH z A. calcoaceticus sklonowano w E. coli za sekwencją sygnałową i silnym promotorem. Po syntezie w komórce, s-GDH jest przemieszczana przez błonę komórkową do przestrzeni peryplazmatycznej (Duine, J.A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter w „The Biology of Acinetobacter” (1991) 295-312, New York, Plenum Press; Matsushita, K. i Adachi, O. Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase w „Principles and applications of quinoproteins” (1993) - 47-63, New York, Marcel Dekker). Podobnie jak natywna s-GDH z A. calcoaceticus, s-GDH wyrażana w E. coli również jest homodimerem, z jedną cząsteczką PQQ i trzema jonami wapnia przypadającymi na monomer (Dokter i wsp., 1986 powyżej, 1987 powyżej, 1988 powyżej; Olsthoorn, A. i J. Duine, J.A. Arch Biochem Biophys 336 (1996) 42-8; Oubrie, A., i wsp., J Mol Biol 289 (1999) 319-33, Oubrie, A., i wsp., Proc Natl Acad Sci U S A 96 (1999) 11787-91; Oubrie, A., i wsp., Embo J 18 (1999) 5187-94). s-GDH utlenia szereg różnych jedno- i dwucukrów do odpowiednich ketonów, które następnie hydrolizują do kwasów aldonowych, jest też w stanie przekaPL 205 561 B1 zywać elektrony do PMS (metosiarczanu fenazyny), DCPIP (2,6-dichlorofenolindofenolu), WB (błękitu Wurstera) oraz krótkołańcuchowych ubichinonów takich, jak ubichinon Q1 i ubichinon Q2 (Matsushita, K., i wsp., Biochemistry 28 (1989) 6276-80; Matsushita, K., i wsp., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 63-72), kilku sztucznych akceptorów elektronów takich, jak metylosiarczan N-metylofenazoniowy (Olsthoorn, A. i J. Duine, J.A. Arch Biochem Biophys 336 (1996) 42-8) oraz polimerów przewodzących elektrony (Ye, L., i wsp., Anal Chem 65 (1993) 238-41).
Ze względu na wysoką aktywność właściwą s-GDH wobec glukozy (Olsthoorn, A. i J. Duine, J.A. Arch Biochem Biophys 336 (1996) 42-8) oraz jej szeroką specyficzność wobec sztucznych akceptorów elektronów enzym ten dobrze nadaje się do zastosowań analitycznych, zwłaszcza do zastosowania w (bio-)czujnikach oraz testach paskowych do oznaczeń glukozy w zastosowaniach diagnostycznych (Kaufmann i wsp., 1997, powyżej).
Utlenianie glukozy może być katalizowane przez co najmniej trzy całkiem odmienne grupy enzymów, tzn. przez zależne od NAD, połączone z barwnikiem dehydrogenazy glukozowe, przez flawoproteinową oksydazę glukozową lub przez chinoproteinowe GDH (Duine 1995). Zaobserwowano dosyć powolne samoutlenianie się zredukowanej s-GDH, wykazujące że tlen jest bardzo słabym akceptorem elektronów dla s-GDH (Olsthoorn i Duine 1996).
s-GDH może wydajnie przekazywać elektrony do PMS, DCPIP, WB i krótkołańcuchowych ubichinonów takich, jak Q1 i Q2, nie może jednak wydajnie przekazywać elektronów bezpośrednio do tlenu.
Tradycyjne paski testowe i czujniki do śledzenia poziomu glukozy we krwi, surowicy i moczu, np. u pacjentów z cukrzycą, wykorzystują oksydazę glukozową. Jednakże, ponieważ oksydaza glukozowa przekazuje swe elektrony do tlenu, wiadomo, że tlen może mieć negatywny wpływ na pomiary glukozy oparte na tym enzymie. Główną przewagą zależnych od PQQ dehydrogenaz glukozowych jest ich niezależność od tlenu. Ta istotna cecha jest omawiana np. w opisie patentowym USA 6,103,509, w którym badane są niektóre cechy związanej z błoną GDH.
Istotny wkład w dziedzinę stanowi zastosowanie s-GDH wraz z odpowiednimi substratami. Sposoby oznaczeń i paski testowe oparte na s-GDH są szczegółowo ujawnione w opisie patentowym USA 5,484,708. W tym opisie patentowym znajdują się również szczegółowe informacje dotyczące przygotowania oznaczeń i wytwarzania opartych na s-GDH pasków testowych do mierzenia glukozy. Inne opisy patentowe lub zgłoszenia patentowe dotyczące tej dziedziny i obejmujące szczegółowe informacje dotyczące różnych zastosowań dla enzymów o aktywności dehydrogenazy glukozowej obejmują opisy patentowe USA nr 5,997,817, USA nr 6,057,120; EP nr 620 283 i JP 11-243949-A.
Dostępnym handlowo systemem wykorzystującym s-GDH oraz wskaźnik zmieniający kolor gdy zachodzi reakcja (Kaufmann i wsp. 1997) jest system Glucotrend® rozprowadzany przez Roche Diagnostics GmbH.
Pomimo omówionych powyżej istotnych przewag, istnieje poważny problem związany z s-GDH. s-GDH wykazuje dosyć szeroki zakres rozpoznawanych substratów w porównaniu z m-GDH. To znaczy, s-GDH utlenia nie tylko glukozę, lecz także kilka innych cukrów, w tym maltozę, galaktozę, laktozę, mannozę, ksylozę i rybozę (Dokter i wsp. 1986a). Reaktywność wobec cukrów innych niż glukoza może w pewnych przypadkach negatywnie wpłynąć na dokładność wyznaczania poziomu glukozy we krwi u niektórych pacjentów z cukrzycą. W szczególności pacjenci poddawani dializie otrzewnowej leczeni ikodekstryną (polimerem glukozy) mogą posiadać w płynach ustrojowych, np. we krwi, wysokie poziomy innych cukrów, zwłaszcza maltozy (Wens, R., i wsp., Perit Dial Int 18 (1998) 603-9).
Zatem próbki kliniczne, np. pobrane od pacjentów z cukrzycą, zwłaszcza od pacjentów z powikłaniami nerkowymi, a zwłaszcza od pacjentów poddawanych dializie, mogą zawierać znaczące ilości innych cukrów, zwłaszcza maltozy. Oznaczanie zawartości glukozy w próbkach otrzymanych od takich pacjentów może być zakłócone przez maltozę.
W literaturze występują nieliczne doniesienia o próbach wytworzenia zmodyfikowanych s-GDH zależnych od PQQ, które wykazują zmienioną specyficzność substratową. Ze względu na negatywne wyniki większość tych starań nie została opublikowana. Igarashi, S., i wsp., (1999) donoszą, że wprowadzenie punktowej mutacji w pozycji Glu277 prowadzi do powstania mutantów o zmienionym profilu specyficzności substratowej. Żaden z tych mutantów nie daje jednak przynajmniej dwukrotnej poprawy specyficzności względem glukozy w porównaniu z np. ksylozą, galaktozą lub maltozą.
Można w podsumowaniu stwierdzić, że znane w stanie techniki próby mające na celu ulepszenie właściwości s-GDH, zwłaszcza jej specyficzności względem glukozy, nie zakończyły się sukcesem
PL 205 561 B1 w stopniu wymaganym do dokładnego śledzenia poziomu glukozy u pacjentów wykazujących także wysokie poziomy cukrów innych niż glukoza.
Istnieje zatem wyraźne zapotrzebowanie i potrzeba kliniczna na zmutowane formy s-GDH, które cechują się ulepszoną specyficznością względem glukozy jako substratu.
Celem niniejszego wynalazku było dostarczenie nowych mutantów s-GDH o znacząco ulepszonej specyficzności substratowej względem glukozy w porównaniu z innymi wybranymi cząsteczkami cukrów, np. takimi jak galaktoza czy maltoza.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że możliwe jest znaczące poprawienie specyficzności substratowej s-GDH wobec glukozy, w porównaniu z innymi cukrami i przynajmniej częściowe rozwiązanie opisanych powyżej znanych w tej dziedzinie problemów.
Zmutowane białko zależnej od pirolochinolinochinonu (PQQ-zależnej) rozpuszczalnej dehydrogenazy glukozowej (s-GDH) według wynalazku obejmuje podstawienie reszty aminokwasowej w pozycji aminokwasowej odpowiadającej pozycji 348 sekwencji s-GDH typu dzikiego znanej z Acinetobacter calcoaceticus (A. calcoaceticus) (SEKW. NR ID. 24), w którym treonina jest podstawiona alaniną, glicyną albo seryną.
Korzystnie obejmuje podstawienia reszt aminokwasowych w pozycji 428, w której asparagina jest podstawiona leucyną, proliną albo waliną.
Korzystniej obejmuje ponadto co najmniej jedno z następujących podstawień Y171G, H227F, P230H, E245D lub M341V.
W zakres wynalazku wchodzi również zmutowane biało PQQ-zależnej s-GDH obejmujące sekwencję aminokwasową WPGVAPS w pozycjach odpowiadających pozycji 346-352 s-GDH typu dzikiego z A. calcoaceticus.
Ponadto wynalazek dotyczy zmutowanego białka s-GDH obejmującego sekwencję aminokwasową TAGPVQK w pozycjach odpowiadających pozycjom 425-431 s-GDH typu dzikiego z A. calcoaceticus.
W zakres wynalazku wchodzi ponadto wyizolowany polinukleotyd kodują cy zmutowane bia ł ko s-GDH według wynalazku.
Wynalazek dotyczy też wektora ekspresyjnego obejmującego wyizolowany polinukleotyd według wynalazku funkcjonalnie połączony z sekwencją promotorową zdolną do kierowania ekspresją tego polinukleotydu.
W zakres wynalazku wchodzi również komórka gospodarza obejmują ca wektor ekspresyjny według wynalazku.
Ponadto wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania wariantów s-GDH obejmującego hodowlę komórki gospodarza według wynalazku w warunkach odpowiednich do wytwarzania wariantów enzymu.
W zakres wynalazku wchodzi też sposób wytwarzania wariantów s-GDH obejmujący uż ycie wektora według wynalazku w wolnym od komórek układzie syntezy peptydów w warunkach odpowiednich do wytwarzania tych wariantów enzymu.
Wynalazek dotyczy też sposobu wykrywania, oznaczania lub pomiaru glukozy w próbce obejmującego kontaktowanie się próbki z mutantem s-GDH według wynalazku.
Korzystnie, wykrywanie, oznaczanie lub pomiar glukozy przeprowadza się przy użyciu czujnika lub urządzenia z paskiem testowym.
W zakres wynalazku wchodzi też urzą dzenie do wykrywania lub pomiaru glukozy w próbce opartego na pomiarze prądu elektrycznego, powstającego w reakcji glukozy z odczynnikami na elektrodzie paska, w którym pasek zawiera mutanta s-GDH według wynalazku.
Ze względu na ulepszoną specyficzność substratową nowych form s-GDH możliwy jest znaczący postęp techniczny w oznaczaniu glukozy w różnych dziedzinach zastosowań.
Zmutowane cząsteczki s-GDH według wynalazku w porównaniu z enzymem typu dzikiego wykazują zasadniczo taką samą aktywność wobec glukozy jako substratu, lecz znacząco obniżoną aktywność wobec innych wybranych cząsteczek cukrów.
Takie porównanie aktywności właściwej specyficznej wobec jednego z szeregu innych substratów oparte jest na i obliczane w odniesieniu do oryginalnej aktywności enzymatycznej enzymu typu dzikiego, np. wyizolowanego z Acinetobacter calcoaceticus.
Stwierdzono, że mutanty s-GDH obejmujące przynajmniej jedno podstawienie aminokwasowe w pozycji aminokwasowej odpowiadającej pozycji w dzikiej sekwencji s-GDH znanej w A. calcoaceticus (SEKW. NR ID.: 24) wybranej z grupy obejmującej pozycje 348 i 428 dostarczają enzymów s-GDH o poprawionych właściwościach, zwłaszcza o poprawionej specyficzności wobec glukozy. WaPL 205 561 B1 rianty zawierające podstawienie w pozycji 348 wykazują uderzająco korzystny wpływ na specyficzność wobec glukozy.
Ulepszone mutanty s-GDH mogą być z wielką korzyścią zastosowane do specyficznego wykrywania lub pomiaru glukozy w próbkach biologicznych, zwłaszcza w urządzeniach opartych na paskach testowych lub w bioczujnikach.
Następujące przykłady, referencje, listy sekwencji i rysunki dostarczone są dla ułatwienia zrozumienia niniejszego wynalazku, którego właściwy zasięg jest przedstawiony w dołączonych zastrzeżeniach. Rozumie się, że w przedstawionych procedurach można wprowadzić modyfikacje bez odejścia od ducha wynalazku.
Opis rysunków
Figura 1: Sekwencja nukleotydowa (DNA) zależnej od PQQ rozpuszczalnej dehydrogenazy glukozowej Acinetobacter calcoaceticus i odpowiadająca jej sekwencja aminokwasowa (SEKW. NR ID.: 23).
Figura 2: Sekwencja białkowa zależnej od PQQ s-GDH A. calcoaceticus (góra) i s-GDH A. baumannii (dół) uliniowane zgodnie z homologią sekwencji.
Figura 3: Ilustracja wektora pACSGDH opisanego w Przykładzie 1 zawierającego zmutowane lub typu dzikiego sekwencje DNA rozpuszczalnej zależnej od PQQ dehydrogenazy glukozowej.
Figura 4: Sekwencja nukleotydowa (DNA) wektora pACSGDH opisanego w Przykładzie 1 zawierającego sekwencję DNA typu dzikiego rozpuszczalnej zależnej od PQQ dehydrogenazy glukozowej (SEKW. NR ID.: 25).
W pierwszym wykonaniu wynalazek dotyczy mutanta rozpuszczalnej formy EC1.1.99.17, znanej również jako zależna od PQQ rozpuszczalna dehydrogenaza glukozowa (s-GDH), który to mutant cechuje się tym, że w porównaniu z odpowiednim enzymem typu dzikiego i wobec przynajmniej jednego innego wybranego substratu cukrowego wykazuje przynajmniej dwukrotnie lepszą specyficzność substratową wobec glukozy.
Wskazówki zamieszczone w niniejszym opisie można łatwo zastosować wobec dowolnego znanego, lub nawet jeszcze nieznanego izolatu s-GDH. Takie dzikie izolaty mogą być następnie zastosowane do oceny względnego ulepszenia specyficzności wytworzonych z nich wariantów.
Enzym typu dzikiego szczepu LMD79.41 typu Acinetobacter calcoaceticus, który odpowiada SEKW. NR ID.: 24, jest dobrze poznany i scharakteryzowany. W razie gdyby inny badany enzym typu dzikiego nie był dobrze scharakteryzowany, korzystnym byłoby użycie s-GDH z szczepu LMD79.41 typu Acinetobacter calcoaceticus, jako odniesienia. W dalszym korzystnym wykonaniu właściwości ulepszonego wariantu s-GDH są porównywane z tym enzymem typu dzikiego. Wynalazek niniejszy odnosi się zatem również do mutanta s-GDH, który charakteryzuje się tym, że względem enzymu typu dzikiego o SEKW. NR ID.: 24 i w stosunku do przynajmniej jednego innego wybranego substratu cukrowego wykazuje przynajmniej dwukrotnie zwiększoną specyficzność substratową wobec glukozy.
Jak omówiono to powyżej, scharakteryzowano dotychczas dwie zupełnie różne rodziny enzymów o aktywności dehydrogenazy glukozowej, zgrupowane w kategorii EC1.1.99.17. Te dwie rodziny enzymów wydają się jednak niespokrewnione ze sobą.
Dla celów niniejszego wynalazku istotna jest tylko rozpuszczalna forma GDH (s-GDH) i jej ulepszone warianty omawiane są poniżej.
Ze stanu techniki wiadomo, że sekwencję DNA typu dzikiego rozpuszczalnej zależnej od PQQ dehydrogenazy glukozowej można wyizolować ze szczepów Acinetobacter. Najkorzystniejsza jest izolacja z szczepu LMD 79.41 typu Acinetobacter calcoaceticus. Sekwencja tej dzikiej s-GDH (dojrzałego białka) podana jest na Figurze 1 i w SEKW. NR ID.: 24. Inne szczepy LMD Acinetobacter mogą też być zastosowane jako źródło dzikiej s-GDH. Takie sekwencje mogą następnie być uliniowane z sekwencją uzyskaną z A. calcoaceticus i porównane (patrz Figura 2). Wydaje się też możliwym przeszukiwanie bibliotek DNA innych szczepów bakteryjnych, jak to przykładowo opisano powyżej dla E. coli K-12 (Oubrie, A., i wsp., J Mol Biol 289 (1999) 319-33) oraz identyfikacja w takich genomach sekwencji spokrewnionych z s-GDH. Takie sekwencje i niezidentyfikowane dotychczas sekwencje homologiczne mogą być zastosowane do wytworzenia mutantów s-GDH o poprawionej specyficzności substratowej wobec glukozy.
Termin „mutant” lub „wariant” w znaczeniu użytym w niniejszym wynalazku odnosi się do białka s-GDH, które w porównaniu z odpowiednią sekwencją typu dzikiego wykazuje przynajmniej jedno podstawienie aminokwasowe. Ekspert w tej dziedzinie zrozumie, że istnieją różne możliwości wytwarzania polinukleotydów kodujących sekwencję polipeptydową takiego zmutowanego s-GDH. Jest też
PL 205 561 B1 oczywiście możliwe wytworzenie mutantów zawierających jedną lub więcej addycji lub delecji aminokwasów.
Zmutowane białko według niniejszego wynalazku charakteryzuje się tym, że względem odpowiedniego enzymu typu dzikiego wykazuje przynajmniej dwukrotnie poprawioną specyficzność substratową wobec glukozy w porównaniu z przynajmniej jednym innym wybranym substratem cukrowym.
Jednym z łatwych sposobów obliczenia specyficzności substratowej lub reaktywności krzyżowej jest ustalenie aktywności zmierzonej dla glukozy jako substratu na 100% i porównanie aktywności zmierzonej z innym wybranym cukrem z wartością dla glukozy. Niekiedy, dla uniknięcia powtórzeń termin „specyficzność” jest używany bez specjalnego odniesienia do glukozy z jednej strony, a wybranego innego substratu cukrowego z drugiej.
Specjalista rozumie, że porównywanie (re-)aktywności najlepiej przeprowadzać dla równomolarnych stężeń cząsteczek badanych substratów przy użyciu dobrze określonych warunków oznaczenia. W przeciwnym razie należy wprowadzić poprawki na różnice stężeń.
Dla oceny (poprawień) specyficzności konieczny jest wybór wystandaryzowanych i dobrze określonych warunków oznaczenia. Aktywność enzymatyczna s-GDH wobec glukozy jako substratu, a także wobec innych wybranych substratów cukrowych, jest mierzona tak, jak to opisano w przykładzie 6.
Na podstawie tych pomiarów oznacza się reaktywność krzyżową i (poprawę) specyficzności.
Reaktywność (krzyżową) s-GDH wobec wybranego cukru w procentach oblicza się jako: Reaktywność krzyżowa [%] = (aktywność wobec wybranego cukru/aktywność wobec glukozy) x 100%.
Reaktywność (krzyżowa) wobec maltozy dla s-GDH typu dzikiego zgodnie z powyższym równaniem wyznaczono na około 105%. Reaktywność (krzyżowa) s-GDH typu dzikiego wobec galaktozy zmierzono na około 50% (por. Tabela 1).
(Poprawioną) specyficzność oblicza się według następującego równania specyficzność (poprawa) = aktywność mutanta wobec glukozy/aktywność typu dzikiego wobec glukozy X aktywność typu dzikiego wobec wybranego cukru/ aktywność mutanta wobec wybranego cukru
W porównaniu z enzymem typu dzikiego forma s-GDH o przynajmniej dwukrotnie poprawionej specyficzności wobec glukozy w porównaniu z maltozą (maltoza/glukoza) zgodnie z powyższym dla maltozy jako substratu wykazuje najwyżej 52,5% aktywności zmierzonej wobec glukozy jako substratu. Jeżeli, przykładowo, zmutowana s-GDH wykazuje reaktywność krzyżową wobec maltozy wynoszącą 20% (wyznaczoną i obliczoną tak, jak to opisano powyżej), wówczas mutant ten w porównaniu z typem dzikim s-GDH wykazuje 5,25-krotnie poprawioną specyficzność substratową (maltoza/glukoza).
Termin „aktywność właściwa” wobec substratu jest dobrze znany w stanie techniki, korzystnie stosowany jest dla opisania aktywności enzymatycznej na ilość białka. W stanie techniki znane są różne metody wyznaczania aktywności właściwej cząsteczek GDH przy użyciu glukozy lub innych cukrów jako substratów (Igarashi, S., i wsp., Biochem Biophys Res Commun 264 (1999) 820). Jeden z dostępnych sposobów takiego pomiaru szczegółowo opisano w przykładach.
Podczas gdy możliwy jest wybór wielu różnych cząsteczek cukru i badanie specyficzności glukozowej s-GDH w porównaniu z dowolnymi tak wybranymi cząsteczkami cukrów, korzystny jest do takich porównań wybór cząsteczki cukru istotnej klinicznie. Korzystnie cukry wybrane są z grupy obejmującej mannozę, allozę, galaktozę, ksylozę i maltozę. Korzystniej, wybiera się maltozę i galaktozę, zaś mutant s-GDH badany jest pod kątem poprawionej specyficzności substratowej wobec glukozy w porównaniu z galaktozą lub maltozą. W jeszcze korzystniejszym wykonaniu wybranym cukrem jest maltoza.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że poprawa specyficzności glukozowej zmutowanej s-GDH, np. dla maltozy w porównaniu z glukozą jest znaczna. Jeszcze korzystniej, by ta specyficzność substratowa wobec glukozy w porównaniu ze specyficznością substratową dla przynajmniej jednego z wybranych substratów cukrowych jest lepsza co najmniej trzykrotnie. Inne korzystne wykonania obejmują mutanty s-GDH charakteryzujące się poprawioną specyficznością substratową wobec glukozy przynajmniej pięciokrotnie wyższą, lub także korzystnie przynajmniej dziesięciokrotnie wyższą, w porównaniu z innymi wybranymi cząsteczkami cukrów.
Mutacje w s-GDH prowadzą w wielu przypadkach do powstania wariantów enzymu o drastycznie obniżonej aktywności właściwej wobec substratu - glukozy. Taki spadek (bezwzględnej lub ogólnej) aktywności właściwej wobec substratu - glukozy może jednak być krytyczny dla rutynowych zastosowań. Nieoczekiwanie stwierdzono, że poprawiona specyficzność wobec glukozy nie musi odbyPL 205 561 B1 wać się kosztem dramatycznie obniżonej ogólnej aktywności właściwej. Zatem korzystnie, s-GDH o poprawionej specyficznoś ci wobec substratu - glukozy wykazuje przynajmniej 10% aktywnoś ci wł aściwej wobec glukozy zmierzonej dla enzymu typu dzikiego. Oczywiście korzystniej taki zmutowany enzym wykazuje przynajmniej 20%, lub korzystniej przynajmniej 50% odpowiedniej aktywności wobec glukozy s-GDH typu dzikiego.
W dalszym korzystnym wykonaniu, wynalazek dotyczy mutanta rozpuszczalnej formy EC1.1.99.17, znanej również jako zależna od PQQ rozpuszczalna dehydrogenaza glukozowa (s-GDH), który to mutant charakteryzuje się tym, że
a) właściwa reaktywność wobec glukozy zasadniczo równa jest tej, która cechuje enzym typu dzikiego oraz
b) właściwa reaktywność wobec maltozy wynosi 30% lub mniej w porównaniu z enzymem typu dzikiego.
Reaktywność właściwa (zwana również aktywnością właściwą) wobec glukozy uznawana jest za zasadniczo równą tej, która cechuje enzym typu dzikiego wówczas, gdy utrzymywane jest przynajmniej 50% wyjściowej aktywności enzymatycznej wobec glukozy. Korzystne są również mutanty wykazujące przynajmniej 80%, lub korzystniej 90% aktywności właściwej wobec glukozy w porównaniu ze zmierzoną dla enzymu typu dzikiego.
Całkiem nieoczekiwanie okazało się, że możliwe jest uzyskanie takich mutantów, lub wariantów s-GDH, które w porównaniu z s-GDH typu dzikiego wykazują zasadniczo taką samą aktywność enzymatyczną wobec glukozy, lecz mimo to wykazują znacząco obniżoną specyficzną dla substratu reaktywność wobec innych wybranych cukrów, zwłaszcza wobec maltozy. Korzystne są mutanty charakteryzujące się tym, że specyficzna dla substratu reaktywność wobec glukozy jest zasadniczo równa tej, która charakteryzuje enzym typu dzikiego, zaś specyficzna dla substratu reaktywność wobec maltozy wynosi 20% lub mniej w porównaniu z enzymem typu dzikiego. Jeszcze korzystniejsze są takie mutanty, dla których aktywność właściwa specyficzna wobec maltozy wynosi 15% lub nawet 10% lub mniej aktywności właściwej specyficznej wobec maltozy zmierzonej w odpowiednim enzymie typu dzikiego, podczas gdy aktywność właściwa specyficzna wobec glukozy jest zasadniczo równa aktywności właściwej specyficznej wobec glukozy odpowiedniego enzymu typu dzikiego.
W przypadku gdy enzym typu dzikiego nie jest dobrze scharakteryzowany, korzystne jest uż ycie jako odniesienia s-GDH z Acinetobacter calcoaceticus szczepu typu LMD 79.41. W dalszym korzystnym wykonaniu właściwości ulepszonego wariantu s-GDH są porównywane z tym enzymem typu dzikiego, wynalazek niniejszy dotyczy zatem mutanta s-GDH, który charakteryzuje się tym, że w porównaniu z enzymem typu dzikiego według SEKW. NR ID.: 24 wykazuje zasadniczo jednakową aktywność enzymatyczną wobec glukozy, lecz znacząco obniżoną (przynajmniej 70% mniej) specyficzność substratową wobec przynajmniej jednego wybranego substratu cukrowego.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że możliwe jest wytworzenie mutantów s-GDH o poprawionej specyficzności wobec substratu, a jeszcze bardziej nieoczekiwanie, że jedynie kilka dobrze określonych pozycji aminokwasowych odgrywa znaczącą rolę w tym aspekcie.
Osiągnięcia niniejszego wynalazku są opisywane szczegółowo w odniesieniu do pozycji aminokwasowych znanych z SEKW. NR ID.: 24, sekwencji typu dzikiego s-GDH wyizolowanej z Acinetobacter calcoaceticus szczepu typu LMD 79.41. Pozycje aminokwasowe w różnych izolatach s-GDH odpowiadające pozycjom w SEKW. NR ID.: 24 łatwo zidentyfikować przez odpowiednie porównanie sekwencji. Korzystnie do oceny homologii lub identyczności między sekwencjami wykorzystywany jest program PileUp. Pozycje aminokwasowe podawane tu poniżej będą rozumiane jako pozycje aminokwasowe w SEKW. NR ID.: 24 lub pozycje odpowiadające im w innych cząsteczkach s-GDH, chyba że konkretnie wymieni się inny SEKW. NR ID. lub inny izolat s-GDH. W celu uniknięcia powtórzeń tylko w kilku przypadkach podana zostanie wzmianka, że odpowiednie pozycje w innych izolatach mogą być zmodyfikowane w ten sam sposób, dla wygody w większości przypadków użyte będą jedynie odpowiednie pozycje z SEKW. NR ID.: 24.
Stwierdzono, że mutanty zawierające podstawienie aminokwasowe w pozycji odpowiadającej pozycji 348 s-GDH wykazują uderzająco silny wpływ na specyficzność wobec glukozy. Jak wykazano to w Tabeli 1, szereg wariantów s-GDH o poprawionej specyficzności wobec glukozy można zidentyfikować i wytworzyć pod warunkiem, że aminokwas w pozycji treoniny 348 - odpowiadającej pozycji w sekwencji typu dzikiego s-GDH z A. calcoaceticus - zamieni się na inny odpowiedni aminokwas.
PL 205 561 B1
Stwierdzono również, że połączenie podstawień aminokwasów w pozycjach odpowiadających pozycji 348 i 428 SEKW. NR ID.: 24 jest korzystne przy wytwarzaniu mutantów lub wariantów s-GDH o znacząco poprawionej specyficzno ś ci wobec glukozy.
Dla pozycji 348 czy 428 s-GDH wyizolowanej z Acinetobacter calcoaceticus szczepu typu LMD 79.41 nie stwierdzono w dotychczasowym stanie techniki udziału w wiązaniu substratu przez s-GDH (Oubrie, A., i wsp., Embo J 18 (1999) 5187-94; Oubrie, A., i Dijkstra, B. W., Protein Sci 9 (2000) 126573). Nie jest znane chemiczne lub fizyczne wyjaśnienie, dlaczego podstawienie tych aminokwasów zmienia specyficzność substratową s-GDH wobec glukozy w porównaniu z innymi istotnymi cząsteczkami cukrów.
Stwierdzono ponadto, że podstawienie aminokwasu 76 ma również dodatni wpływ na specyficzność s-GDH względem glukozy.
W niniejszym wynalazku zmutowana s-GDH charakteryzuje się tym, ż e reszta aminokwasowa treoniny w pozycji 348 jest podstawiona resztą aminokwasową wybraną z grupy obejmującej alaninę, glicynę i serynę. W najkorzystniejszym wykonaniu wykorzystuje się glicynę do podstawienia treoniny w pozycji 348 .
W jeszcze dalszym wykonaniu zmutowane biał ko zależ nej od PQQ s-GDH obejmuje podstawienie aminokwasowe w pozycji 428 odpowiedniej sekwencji typu dzikiego z Acinetobacter calcoaceticus, gdzie asparagina sekwencji typu dzikiego zamieniona jest na inny odpowiedni aminokwas. Korzystnie, aminokwas ten jest wybrany z grupy obejmującej leucynę, prolinę i walinę. Korzystne jest zastąpienie asparaginy w pozycji 428 proliną.
Udowodniono ponadto, że aminokwas glutamina w pozycji 76 może być podstawiony w celu zmniejszenia problemów wynikających z reaktywności krzyżowej s-GDH wobec innych cząsteczek cukrów. Pozycje w sekwencji innych izolatów s-GDH odpowiadające tej pozycji w sekwencji są łatwe do zidentyfikowania przez wyszukiwanie homologii w oparciu o SEKW. NR ID.: 3.
Jak opisano to powyżej, podstawienie aminokwasu w pozycji 348 sekwencji s-GDH odpowiadającej sekwencji typu dzikiego z Acinetobacter calcoaceticus może być wykorzystane do znaczącego poprawienia specyficzności s-GDH wobec glukozy. Dalej ulepszone mutanty uzyskiwane są przez dostarczenie zmutowanego białka s-GDH obejmującego przynajmniej dwa podstawienia aminokwasowe, przy czym aminokwas odpowiadający pozycji aminokwasowej 348 SEKW. NR ID.: 24 jest podstawiony.
Dalszym wykonaniem niniejszego wynalazku jest zatem zmutowana s-GDH obejmująca przynajmniej dwa podstawienia aminokwasowe w pozycjach aminokwasowych odpowiadających pozycji sekwencji typu dzikiego s-GDH znanej z A. calcoaceticus (SEKW. NR ID.: 24), przy czym owe podstawione pozycje aminokwasowe są wybrane z grupy obejmującej pozycje 16, 22, 76, 116, 120, 127, 143, 168, 169, 171, 177, 227, 230, 231, 245, 255, 277, 295, 299, 308, 317, 341, 348, 349, 355, 422, 428 i 438, przy czym aminokwas T348 jest zastąpiony.
W korzystnym wykonaniu te przynajmniej dwie pozycje aminokwasowe, które są podstawione w zmutowanej s-GDH wybrane są z grupy obejmującej pozycje aminokwasowe 348 i/lub w 428.
Stwierdzono, że mutanty obejmujące podstawienia w aminokwasach odpowiadających pozycjom 348 i 428 są bardzo korzystne dla poprawienia specyficzności s-GDH wobec glukozy w porównaniu z innymi substratami cukrowymi. Jest szczególnie korzystne zaprojektowanie i wybór mutantów s-GDH, które obejmują podstawienie zarówno w pozycji 348, jak i 428. Najkorzystniejsze są mutanty obejmujące korzystne podstawienia opisane powyżej w obu tych pozycjach. Wariant s-GDH obejmujący T348G i N428P jest najkorzystniejszy.
Terminologia T348G i N428P jest znana w technice i oznacza, że treonina w pozycji 348 jest zastąpiona glicyną a glutamina w pozycji 428 jest zastąpiona proliną.
W jeszcze dalszym korzystnym wykonaniu, wariant s-GDH według niniejszego wynalazku obejmuje przynajmniej trzy podstawienia aminokwasowe, przy czym te przynajmniej trzy podstawienia aminokwasowe odpowiadają pozycjom aminokwasowym w sekwencji typu dzikiego znanej z A. calcoaceticus (SEKW. NR ID.: 24), które to podstawione pozycje aminokwasowe wybrane są z grupy obejmującej pozycje 171, 227, 230, 245, 341, 348 i 428, przy czym zarówno pozycje aminokwasowe T348 i N428 są podstawione. Korzystnie takie potrójne mutanty obejmuj ą przynajmniej jedno z nastę pujących podstawień Y171G, H227F, P230H, E245D lub M341V.
Korzystne warianty s-GDH o znacznie ulepszonej specyficzności wobec glukozy obejmują podstawienia w pozycjach 348 i 428 w połączeniu z podstawieniami w pozycjach 245 i 341, lub obiema.
PL 205 561 B1
Analiza sekwencji aminokwasowej ujawniła, że motywy sekwencyjne znalezione w s-GDH typu dzikiego z A. calcoaceticus z jednej strony, a A. baumannii z drugiej zdają się być wysoce konserwatywne wokół pozycji o istotnym znaczeniu dla poprawienia specyficzności względem glukozy zidentyfikowanych w niniejszym wynalazku, tzn. pozycji 76, 348 i 428, odpowiadającym s-GDH typu dzikiego z A. calcoaceticus (por. Figura 2).
Korzystnym wykonaniem według niniejszego wynalazku jest zatem zmutowane białko zależnej od PQQ s-GDH zawierające sekwencję aminokwasową WPXaaVAPS (SEKW. NR ID.: 1), przy czym Xaa jest to aminokwas inny niż treonina. SEKW. NR ID.: 1 odpowiada pozycjom 346-352 s-GDH typu dzikiego z A. calcoaceticus.
Korzystniejszy jest mutant s-GDH, w którym Xaa w SEKW. NR ID.: 1 przedstawia alaninę, glicynę lub serynę, najkorzystniej Xaa przedstawia glicynę.
Innym korzystnym wykonaniem wynalazku jest mutant zależnej od PQQ s-GDH zawierający sekwencję aminokwasową TAGXaaVQK (SEKW. NR Id.: 2), przy czym Xaa jest to aminokwas inny niż asparagina. SEKW. NR ID.: 2 odpowiada pozycjom 425-431 s-GDH typu dzikiego A. calcoaceticus.
Korzystnie, mutant s-GDH zawierający SEKW. NR ID.: 2 charakteryzuje się tym, że Xaa jest aminokwasem wybranym z grupy obejmującej leucynę, prolinę i walinę, najkorzystniej Xaa jest proliną.
W technice znane są liczne moż liwoś ci wytwarzania zmutowanych biał ek. Na podstawie istotnych informacji, które dostarcza niniejszy wynalazek, ujawniających krytyczne znaczenie pozycji aminokwasowych 348 i 428 oraz użyteczność pozycji 76, specjalista w dziedzinie może z łatwością wytworzyć dalsze odpowiednie warianty s-GDH. Warianty takie mogą być, na przykład, uzyskane sposobami znanymi jako mutageneza losowa (Leung, D.W., i wsp., Technique 1 (1989) 11-15) i/lub mutageneza ukierunkowana (Hill, D.E., i wsp., Methods Enzymol 155 (187) 558-68). Alternatywnym sposobem wytworzenia białka o pożądanych właściwościach jest dostarczenie konstruktów chimerycznych, które zawierają elementy sekwencji z przynajmniej dwóch różnych źródeł, lub całkowita synteza odpowiedniego genu s-GDH. Takie procedury znane w technice mogą być zastosowane w połączeniu z ujawnioną w niniejszym wynalazku informacją dla dostarczenia mutantów lub wariantów s-GDH obejmujących przynajmniej jedno podstawienie aminokwasowe w pozycji sekwencji odpowiadającej pozycjom 348 i/lub 428 SEKW. NR ID.: 24.
Wariant s-GDH według niniejszego wynalazku można np. wytworzyć wychodząc od genu s-GDH wyizolowanego z Acinetobacter calcoaceticus szczepu typu LMD 79.41, a także wychodząc od sekwencji homologicznej. W kontekście niniejszego zgłoszenia termin homologiczny oznacza s-GDH typu dzikiego wyizolowaną z innych mikroorganizmów, pod warunkiem, że homologia sekwencji w porównaniu z SEKW. NR ID.: 24 wynosi przynajmniej 90%. Innymi słowy, po odpowiednim uliniowaniu przy użyciu programu PileUp, przynajmniej 90% aminokwasów tej s-GDH jest identycznych z aminokwasami opisanymi w SEKW. NR ID.: 24.
Rozumie się, że zmienność sekwencji DNA i aminokwasów występuje naturalnie, lub może być celowo wprowadzona przy użyciu znanych w technice sposobów. Zmienność ta może doprowadzić do powstania do 10% różnic aminokwasowych w całej sekwencji na skutek delecji, podstawień, insercji, inwersji lub dodania jednego lub więcej aminokwasów w tej sekwencji w porównaniu z SEKW. NR ID.: 24. Takie podstawienia aminokwasowe mogą być, na przykład, dokonane na podstawie podobieństwa polarności, ładunku, rozpuszczalności, hydrofobowości, hydrofilowości i/lub charakteru amfipatycznego tych aminokwasów. Przykładowo, aminokwasy o ładunku ujemnym obejmują kwas asparaginowy i kwas glutaminowy, aminokwasy naładowane dodatnio obejmują lizynę i argininę, aminokwasy o nienaładowanych grupach polarnych lub grupach niepolarnych o podobnych wartościach hydrofilowości obejmują następujące: leucynę, izoleucynę, walinę, glicynę, alaninę, asparaginę, glutaminę, serynę, troninę, fenyloalaninę, tyrozynę. Inne rozważane warianty obejmują sole i estry wspomnianych polipeptydów, a także prekursory wspomnianych polipeptydów, przykładowo prekursory mające N-końcowe podstawienie takie jak, metioninę, N-formylometioninę użyte w charakterze sekwencji liderowych. Takich zmian można dokonać bez konieczności odejścia od zakresu i ducha niniejszego wynalazku.
Zgodnie ze znanymi w technice procedurami zgodnie z procedurami przedstawionymi w dziale przykładów możliwe jest uzyskanie sekwencji polinukleotydowych kodujących dowolne z omawianych powyżej mutantów s-GDH. Wynalazek obejmuje zatem także wyizolowane sekwencje polinukleotydowe kodujące zmutowane białka s-GDH opisane powyżej.
PL 205 561 B1
Niniejszy wynalazek obejmuje ponadto wektor ekspresyjny obejmujący sekwencję kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku funkcjonalnie połączoną z sekwencją promotora zdolna do kierowania jego ekspresją w komórce gospodarza.
Korzystnymi wektorami są plazmidy takie, jak pACSGDH przedstawiony na Figurach 3 i 4.
Wektory ekspresyjne według wynalazku zawierają zwykle miejsce startu replikacji, promotor zlokalizowany powyżej sekwencji DNA i następnie sekwencję DNA kodującą całość lub część wariantu s-GDH. Po sekwencji DNA kodującej całość lub część wariantu s-GDH następują sekwencje terminacji transkrypcji i pozostała część wektora. Wektory ekspresyjne mogą także zawierać inne znane w technice sekwencje DNA, przykł adowo sekwencje liderowe zapewniają ce stabilność wyraż anego produktu, sekwencje kierujące odpowiadające za wydzielanie wyrażanego produktu, sekwencje pozwalające na regulację ekspresji genu strukturalnego (np. przez obecność lub brak substancji pokarmowych lub innych induktorów w podłożu hodowlanym), sekwencje markerowe, które mogą dostarczyć selekcji fenotypowej stransformowanych komórek gospodarza oraz sekwencje dostarczające miejsc cięcia endonukleazami restrykcyjnymi.
Charakterystyka użytego w danej sytuacji wektora ekspresyjnego musi być kompatybilna z zastosowanymi komórkami gospodarza. Przykładowo, przy klonowaniu w systemie komórek E. coli, wektor ekspresyjny powinien zawierać promotory wyizolowane z genomu komórek E. coli (np. lac lub trp). Odpowiednie miejsca startu replikacji w różnych gospodarzach E. coli obejmują, przykładowo, miejsce startu replikacji plazmidu ColE1. odpowiednie promotory obejmują, przykładowo, lac i trp. Korzystnie wektor ekspresyjny zawiera także sekwencję kodującą marker selekcyjny. Markerem selekcyjnym korzystnie jest gen oporności na antybiotyk. Oporność na ampicylinę lub oporność na kanamycynę mogą być dogodnie wykorzystane jako markery selekcyjne. Wszystkie te materiały są znane w technice i są dostępne w handlu.
Odpowiednie wektory ekspresyjne zawierające żądane sekwencje kodujące i regulatorowe mogą być skonstruowane przy użyciu standardowych technik rekombinacji DNA in vitro znanych w technice, z których wiele opisanych jest w Sambrook i wsp. (1989).
Wynalazek niniejszy dotyczy ponadto komórek gospodarza zawierających wektor ekspresyjny obejmujący sekwencję DNA kodującą całość lub część zmutowanej s-GDH. Komórki gospodarza korzystnie zawierają wektor ekspresyjny obejmujący całość lub część sekwencji DNA mających jedną lub więcej mutacji przedstawionych w Tabeli 1. Korzystniejsze są komórki gospodarza zawierające wektor ekspresyjny obejmujący jedną lub więcej regulatorowych sekwencji DNA zdolnych do kierowania replikacja i/lub ekspresją i funkcjonalnie połączonych z sekwencją DNA kodującą całość lub część zmutowanej s-GDH.
Odpowiednie komórki gospodarza obejmują, przykładowo, E. coli HB101 (ATCC 33694) dostępne z firmy Promega (2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, USA), XL1-Blue MRF dostępne z firmy Stratagene (11011 North Torrey Pine Road, La Jolla, CA, USA) i tym podobne.
Wektory ekspresyjne mogą być wprowadzone do komórek gospodarza różnymi znanymi w technice sposobami. Przykł adowo, transformacja komórek gospodarza wektorami ekspresyjnymi może być przeprowadzona metodą transformacji protoplastów za pośrednictwem glikolu polietylenowego (Sambrook i wsp. 1989). Mogą jednak być też zastosowane inne sposoby wprowadzania wektorów ekspresyjnych do komórek gospodarza, przykładowo elektroporacja, transformacja biolistyczna lub fuzja protoplastów.
Gdy wektor ekspresyjny zawierający wariant s-GDH zostanie wprowadzony do odpowiedniej komórki gospodarza, komórka gospodarza może być hodowana w warunkach pozwalających na wyrażanie żądanych wariantów s-GDH. Komórki gospodarza zawierające wektor ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą całość lub część zmutowanej s-GDH są identyfikowane np. przy pomocy jednej lub więcej następujących ogólnych strategii: hybrydyzacji DNA, obecności lub nieobecności funkcji genów markerowych, oznaczenia poziomu transkrypcji mierzonego przez wytwarzanie transkryptu mRNA s-GDH w komórce gospodarza oraz immunologicznego wykrywania produktu genu. Korzystnie stransformowane komórki gospodarza są identyfikowane przez oznaczenie enzymu, np. detekcję kolorymetryczną.
Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto wytwarzania wariantów s-GDH. Mutageneza losowa i mutageneza wysycająca są przeprowadzane zgodnie z ujawnionymi w stanie techniki. Warianty analizuje się pod kątem specyficzności substratowej wobec glukozy, maltozy oraz innych cukrów. Wybrane warunki oznaczenia są przystosowane do zapewnienia możliwości zmierzenia oczekiwanych małych ulepszeń spowodowanych np. pojedynczymi podstawieniami aminokwasowymi. Osiągnięto to dostoPL 205 561 B1 sowując warunki oznaczenia tak, by aktywność enzymu typu dzikiego (czy wyjściowego) była bliska dolnej granicy wykrywalności. Jeden ze sposobów selekcji lub przeszukiwania odpowiednich mutantów przedstawiono w Przykładzie 3. Jakakolwiek zmiana lub ulepszenia w porównaniu z enzymem typu dzikiego są w ten sposób łatwe do wykrycia.
Należy oczywiście rozumieć, że nie wszystkie wektory ekspresyjne i regulatorowe sekwencje DNA będą działały jednakowo dobrze przy wyrażaniu sekwencji DNA według niniejszego wynalazku. Podobnie nie wszystkie komórki gospodarza będą działały jednakowo dobrze z tym samym systemem ekspresji. Jednakże osoba o normalnych umiejętnościach w technice może dokonać wyboru spośród wektorów ekspresyjnych, regulatorowych sekwencji DNA i komórek gospodarza przy użyciu dostarczonych tu wskazówek bez zbędnych eksperymentów i bez odejścia od zakresu niniejszego wynalazku.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania wariantów s-GDH według wynalazku obejmującego hodowlę komórki gospodarza według wynalazku w warunkach odpowiednich do wytworzenia zmutowanej s-GDH według wynalazku. Dla bakteryjnych komórek gospodarzy typowe warunki hodowli to podłoże płynne zawierające odpowiedni antybiotyk i czynnik indukujący. Typowo, odpowiednie antybiotyki obejmują ampicylinę, kanamycynę, chloramfenikol, tetracyklinę i im podobne. Typowe czynniki indukujące obejmują IPTG, glukozę, laktozę i im podobne.
Korzystnie zmutowane białka według niniejszego wynalazku są uzyskiwane przez wytwarzanie w komórkach gospodarza wyrażających sekwencję DNA kodującą zmutowaną s-GDH. Zmutowane białka według niniejszego wynalazku mogą też być uzyskane in vitro przez translację mRNA kodowanego przez sekwencję DNA kodującą zmutowaną s-GDH. Przykładowo, sekwencje DNA mogą być zsyntetyzowane tak, jak opisano powyżej i wstawione do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, który z kolei może zostać użyty w systemie transkrypcji/translacji in vitro.
Wektor ekspresyjny obejmujący wyizolowany polinukleotyd określony i opisany powyżej operacyjnie połączony z sekwencją promotora zdolną do kierowania jego ekspresji w pozakomórkowym układzie syntezy peptydów stanowi inne korzystne wykonanie tego wynalazku.
Polipeptydy wytworzone np. przez procedury opisane powyżej mogą następnie być izolowane i oczyszczane przy uż yciu róż nych rutynowych technik oczyszczania białka. Przykł adowo, mogą być zastosowane procedury chromatografii takie, jak chromatografia jonowymienna, filtracja żelowa i chromatografia powinowactwa.
Jednym z głównych zastosowań ulepszonych wariantów s-GDH według tego wynalazku jest użycie ich w paskach testowych do monitorowania poziomu glukozy we krwi u pacjentów z cukrzycą. Ze względu na niewrażliwość na tlen zależnej od PQQ dehydrogenazy glukozowej, system wykorzystujący ulepszone warianty s-GDH jest mniej podatny na zakłócenia spowodowane przez tlen niż systemy oparte na oksydazie glukozowej. Co ważniejsze, ponieważ warianty s-GDH wykazują ulepszoną specyficzność wobec glukozy i znacząco obniżoną względną aktywność enzymatyczną wobec innych cukrów, zakłócenia spowodowane przez maltozę, galaktozę i/lub inne podobne cukry, które mogą znajdować się w próbce, są istotnie zmniejszone. Oczywiście badanych może być wiele rodzajów próbek. Płyny ustrojowe takie, jak surowica, osocze, płyn jelitowy lub mocz są korzystnymi źródłami takich próbek.
Warianty s-GDH o poprawionej specyficzności substratowej według tego wynalazku mogą też być z dużą korzyścią użyte w bioczujnikach (D'Costa, E. J., i wsp., Biosensors 2 (1986) 71-87; Laurinavicius, V., i wsp., Analytical Letters 32 (1999) 299-316; Laurinavicius, V., i wsp., Monatshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281) do ciągłego monitorowania glukozy w próbce lub reaktorze. Do tego celu warianty s-GDH mogą być, przykładowo, użyte do pokrycia niewrażliwej na tlen szklanej elektrody z kompleksem osmu zawierającym układ redoks oparty na przewodzącej żywicy epoksydowej (Ye i wsp., 1993, powyż ej) dla dokładniejszego wyznaczania stężenia glukozy.
Istnieją również inne możliwe zastosowania wariantów s-GDH o ulepszonej specyficzności substratowej według wynalazku. Przykładowo, te warianty s-GDH mogą być zastosowane przy wytwarzaniu kwasu aldonowego. s-GDH typu dzikiego cechuje się wysokim obrotem utleniania substratu w procesie wytwarzania kwasu glukonowego i innych kwasów aldonowych. Przez użycie wariantów s-GDH, które są bardziej specyficzne wobec glukozy, produkcja kwasu glukonowego dałaby w efekcie znacznie mniej produktów ubocznych. Przy użyciu innych wariantów s-GDH o innej specyficzności substratowej, możliwe jest wytworzenie w miarę potrzeby innych kwasów aldonowych.
W nastę pują cych przykł adach wszystkie odczynniki, enzymy restrykcyjne i inne materiał y pozyskano od Roche Diagnostics Germany, jeżeli nie wymieniono innych źródeł handlowych, i zastosowano zgodnie z instrukcjami podanymi przez dostawców. Operacje i sposoby użyte do oczyszczania,
PL 205 561 B1 charakteryzacji i klonowania DNA są dobrze znane w technice (Ausubel, F., i wsp., w „Current protocols in molecular biology” (1994), Wiley Verlag) i mogą być w miarę potrzeby zaadaptowane przez specjalistę.
Następujące przykłady służą dalszej ilustracji niniejszego wynalazku. Przykłady te nie mają na celu ograniczenia zakresu tego wynalazku, lecz umożliwiają dalsze zrozumienie wynalazku.
P r z y k ł a d 1
Klonowanie i wyrażanie rozpuszczalnej zależnej od PQQ dehydrogenazy glukozowej typu dzikiego z A. calcoaceticus w E. coli
Gen s-GDH wyizolowano z Acinetobacter calcoaceticus szczepu LMD 79.41 zgodnie ze standardowymi procedurami. Gen s-GDH typu dzikiego subklonowano do plazmidu zawierającego promotor mgl dla regulowanej ekspresji (porównaj zgłoszenie patentowe WO 88/09373). Nowy konstrukt nazwano pACSGDH (patrz Rysunki 3 i 4). Zrekombinowane plazmidy wprowadzono do organizmu gospodarza wybranego z grupy E. coli. Organizmy te hodowano następnie w odpowiednich warunkach i wyselekcjonowano kolonie wykazujące aktywność s-GDH.
Plazmid pACSGDH wyizolowano z 200 ml całonocnej hodowli wspomnianego powyżej klonu przy użyciu zestawu QIAGEN Plazmid Maxi Kit (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta. Plazmid zawieszono w 1 ml podwójnie destylowanej wody. Stężenie plazmidu wyznaczono przy użyciu spektrofotometru Beckman DU 7400. Wydajność wyniosła 600 μg. Następnie oznaczono jakość plazmidu przez elektroforezę w żelu agarozowym.
P r z y k ł a d 2
PCR mutagenna
W celu wytworzenia losowych mutacji w genie s-GDH przeprowadzono mutagenną PCR (reakcję łańcuchową polimerazy). Plazmid pACSGDH i sekwencję DNA kodującą zmutowane enzymy (produkt PCR z PCR mutagennej) strawiono enzymami restrykcyjnymi SphI i Eco RI. Produkty oczyszczono z żelu. Strawione sekwencje DNA ligowano, zaś porcji mieszaniny ligacyjnej użyto do transformacji kompetentnych komórek E. coli. Transformanty następnie selekcjonowano na szalkach LB zawierających ampicylinę.
Do oznaczeń wybierano pojedyncze kolonie, hodowano przez noc w podłożu LB zawierającym ampicylinę i poddawano przeszukiwaniu (patrz Przykład 3).
Mieszanina reakcyjna do mutagennej PCR:
ng pACSGDH
1x bufor bez MgCl2 (Roche Diagnostics GmbH, nr kat. 1699 105) dCTP, dTTP 1 mM dATP, dGTP 0,2 mM (Roche Diagnostics GmbH, nr kat. 1969 064) 40 pmol startera GF23 (5'CGC GCA CGC GCA TGC CGC CGA TGT TC) (= SEKW. NR ID.: 4) pmol GR2 3 (5'-GAC GGC CAG TGA ATT CTT TTC TA) (= SEKW. NR ID.: 5) mM MgCl2
0,6 mM MnCl2
U polimerazy DNA Taq (Roche Diagnostics GmbH, nr kat. 1146 165)
Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer), 30 cykli 95°C 1 min, 45°C 2 min, 72°C 2 min
- Oczyszczanie produktów PCR przy użyciu zestawu High Pure PCR Product Purification Kit z Roche Diagnostics GmbH (nr kat. 1 732 676) zgodnie z instrukcjami producenta
- Trawienie fragmentów PCR 25 U SphI (Roche Diagnostics GmbH, nr kat. 606 120) w 1x buforze H (Roche Diagnostics GmbH, nr kat. 1 417 991) w temperaturze 37°C przez noc;
Dodanie 25 U EcoRI (Roche Diagnostics GmbH, nr kat. 703 737) i dalsze trawienie przez 3,5 godziny
- Trawienie 50 μg pACSGDH 180 U SphI i 180 U EcoRI w 1x buforze H przez 4 godziny w temperaturze 37°C
- Elektroforeza w żelu strawionego pACSGDH i strawionych fragmentów przy użyciu żelu agarozowego (0,8%)
- Ekstrakcja cząsteczek DNA przy użyciu zestawu QIAquick Gel Extraction Kit (Qagen, nr kat. 28706) zgodnie z instrukcjami producenta
- Oznaczanie stężenia fragmentów i strawionego wektora przy użyciu spektrofotometru Beckman DU 7400
- Oznaczenie jakości oczyszczonych produktów przez elektroforezę w żelu agarozowym
- Ligacja 100 ng strawionego wektora ze 140 ng fragmentów mPCR przy użyciu 1 U ligazy DNA T4 (Roche Diagnostics GmbH, nr kat. 481 220) w objętości 20 μl w temperaturze 16°C przez noc
PL 205 561 B1
- Elektroporacja elektrokompetentnych komórek XL1F (Stratagene) 1 μΐ mieszaniny ligacyjnej przy napięciu 2,5 KV w kuwetkach 0,2 cm przy użyciu elektroporatora BioRad E. coli Pulser (BioRad)
- Po hodowli w 1 ml LB w temperaturze 37°C przez jedną godzinę bakterie wysiano na szalki LB-agar z ampicyliną (100 μg/ml ampicyliny) i hodowano przez noc w temperaturze 37°C.
- 50% tych klonów wyrażających zmutowaną s-GDH było aktywnych przy użyciu następującego sposobu przeszukiwania.
P r z y k ł a d 3
Przeszukiwanie
Kolonie mutantów na szalkach agarowych opisane powyżej przeszczepiono do płytek mikrotitracyjnych (mtp) zawierających 200 μl LB-ampicylina na studzienkę i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C. Płytki te nazwano płytkami wzorcowymi.
Z każdej płytki wzorcowej przeniesiono 5 ul próbki/studzienkę do mtp zawierających 5 μl na studzienkę B (B = odczynnik do ekstrakcji białek bakteryjnych Bacterial Protein Extraction Reagent; Pierce nr kat. 78248) w celu rozerwania komórek i dodawano 240 μl na studzienkę 0,0556 mM pirolochinolinochinonu (PQQ); 50 mM Hepes; 15 mM CaCl2 pH 7,0 w celu aktywacji s-GDH. W celu zakończenia tworzenia holoenzymu mtp inkubowano w 25°C przez 2 godziny i w 10 °C przez noc. Płytkę tą nazwano płytką roboczą.
Z płytki roboczej przeniesiono 2 x 10 ul na studzienkę do dwóch pustych mtp. Następnie, jedną testowano z użyciem glukozy, zaś drugą z użyciem maltozy lub innej wybranej cząsteczki cukru jako substratu. Wszystkie cząsteczki cukrów stosowano w stężeniach równomolowych.
Obliczono dE/min i ustalono wartość uzyskaną dla glukozy jako 100% aktywności. Wartość uzyskaną dla innego cukru porównywano do wartości dla glukozy i wyliczano w procentach aktywności ((dE/min maltoza/dE glukoza) x 100). Odpowiada to reaktywności krzyżowej (zmutowanego) enzymu.
P r z y k ł a d 4
Sekwencjonowanie zmutowanego genu s-GDH po mutagennej PCR
Wyizolowano plazmid zawierający zmutowany gen s-GDH, który daje 50% aktywności maltoza/glukoza (zestaw High Pure Plasmid Isolation Kit, Roche Diagnostics GmbH, nr kat. 1754785) i zsekwencjonowano przy użyciu zestawu ABI Prism Dye Terminator Sequencing Kit oraz sekwencera ABI 3/73 i 3/77 (Amersham Pharmacia Biotech).
Użyto następujących starterów:
Nić sensowna:
GDH F2: 5' -TTA ACG TGC TGA ACA GCC GG-3' (=SEKW. NR ID.: 6)
GDH F3: 5' -GAT GCT GAT GGG CAG AAT GG-3' (=SEKW. NR ID.: 7)
GDH F4: 5' -ATA TGG GTA AAG TAC TAC GC-3' (=SEKW. NR ID.: 8)
GDH F5: 5' -ACG ATC CAA CTT GTG GAG AG-3' (=SEKW. NR ID.: 9)
Nić antysensowna:
GDH R1: 5' -CGA TTA AGT TGG GTA ACG CC-3' (=SEKW. NR ID.: 10)
GDH R2: 5' -ATA CGG AAA ATG ACA CCA CG-3' (=SEKW. NR ID.: 11)
GDH R3: 5' -GGG CCT TGT TCA GAC TGC AA-3' (=SEKW. NR ID.: 12)
GDH R4: 5' -CAA GAC GAC CTG ACT GAT GG-3' (=SEKW. NR ID.: 13)
GDH R5: 5' -CAT AAC AAC GCG TGC GGC TT-3' (=SEKW. NR ID.: 14)
Wyniki => 6 mutacji na poziomie sekwencji DNA => 4 mutacje na poziomie aminokwasów:
w pozycji 340 (dojrzałego enzymu) zmiana E na G w pozycji 348 (dojrzałego enzymu) zmiana T na S w pozycji 369 (dojrzałego enzymu) zmiana N na H w pozycji 413 (dojrzałego enzymu) zmiana S na N
P r z y k ł a d 5
Mutanty s-GDH uzyskane przez mutagenezę wysycającą
Zestawu do mutagenezy ukierunkowanej QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene nr kat. 200518) użyto do kolejnego podstawiania aminokwasów typu dzikiego w określonych pozycjach białka s-GDH lub mutantów s-GDH (preparaty plazmidowe jak opisano powyżej) innymi losowymi aminokwasami.
PL 205 561 B1
Startery 5' i 3' użyte do mutagenezy były do siebie komplementarne i zawierały NNN w środkowej pozycji. Nukleotydy te otoczone były przez 12 do 16 nukleotydów z każdej strony. Sekwencje nukleotydów były identyczne z nicią cDNA lub nicią komplementarną do nici cDNA w otoczeniu kodonu aminokwasu, który miał być zmieniony. Zamiast tego kodony starter zawierał NNN, oligonukleotydy kodują zatem dowolny kodon.
Dla każdej określonej pozycji przeprowadzono jedną reakcję PCR.
Reakcje PCR i trawienia DpnI przeprowadzono zgodnie z instrukcjami.
Następnie 1 μΐ z każdej reakcji użyto do elektroporacji komórek XL1F. Komórki hodowano i oznaczano aktywność s-GDH klonów tak, jak opisano powyżej.
Aby statystycznie zapewnić, że wszystkie spośród 20 wariantów aminokwasowych zostanie przeszukanych, dla każdej pozycji przetestowano 200 klonów.
Użyto następujących starterów:
Dla pozycji 340 nić sensowna EGF 5'-TCC AAC TTG TGG ANN NAT GAC CTA CAT TT-3' (=SEKW. NR ID.: 15) nić antysensowna EGR 5'-AAA TGT AGG TCA TNN NTC CAC AAG TTG GA-3' (=SEKW. NR ID.: 16)
Dla pozycji 348 nić sensowna TSF 5'-CAT TTG CTG GCC ANN NGT TGC ACC GTC AT-3' (=SEKW. NR ID.: 17) nić antysensowna TSR 5'-ATG ACG GTG CAA CNN NTG GCC AGC AAA TG-3' (=SEKW. NR ID.: 18)
Dla pozycji 369 nić sensowna NHF 5'-TAC TGG TTG GGA ANN NAC ATT ATT GGT TC-3' (=SEKW. NR ID.: 19) nić antysensowna NHR 5'-GAA CCA ATA ATG TNN NTT CCC AAC CAG TA-3' (=SEKW. NR ID.: 20)
Dla pozycji 413 nić sensowna SNF 5'-TGA TGT GAT TGC ANN NCC AGA TGG GAA TG-3' (=SEKW. NR ID.: 21) nić antysensowna SNR 5'-CAT TCC CAT CTG GNN NTG CAA TCA CAT CA-3' (=SEKW. NR ID.: 22)
Wyniki
Zmiany aminokwasów w pozycjach 340, 369 i 413 nie zmieniły specyficzności substratowej. Jedynie zmiany w pozycji 348 dały w wyniku klony o specyficzności substratowej 25-100% (maltoza/glukoza).
Przeprowadzono wiele rund mutagennej PCR i mutagenezy wysycającej. Stwierdzono i potwierdzono, że pozycje 348 i 428 mają zasadnicze znaczenie, i że wymiana innych aminokwasów może dalej poprawić specyficzność zmutowanej s-GDH wobec glukozy. Reprezentatywne dane i pozycje podano w Tabeli 1.
T a b e l a 1: Przykłady wariantów s-GDH o ulepszonej specyficzności wobec glukozy
Skróty: n.t. = nie testowano
SA = aktywność właściwa (U/mg białka) z glukozą jako substratem
| Zmieniony aminokwas z sekwencji typu dzikiego | Przemiana glukozy | Przemiana maltozy | Przemiana galaktozy | SA |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| typ dziki | 100% | 105% | 50% | 1000 |
| 340 E na G 348 T na S 369 N na H 413 S na N | 100% | 50% | 25% | 700% |
| 22 I na L 295 Q na L 422 L na I | 100% | 123% | 14% | 178 |
| 348 T na D | 100% | 80% | n.t. | n.t. |
| 348 T na A | 100% | 67% | n.t. | n.t. |
PL 205 561 B1 cd. tabeli 1
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 348 T na G | 100% | 22% | 20% | 910 |
| 428 N na P 348 T na G | 100% | 8% | 25% | n.t. |
| 428N na V 348 T na G | 100% | 22% | 22% | n.t. |
| 127 T na M 143 D na Q 348 T na G 428 N na P | 100% | 1% | 32% | n.t |
| 76 Q na A 348 T na G | 100% | 17% | n.t. | n.t. |
| 76 Q na M 348 T na G | 100% | 18% | n.t. | n.t. |
| 76 Q na D 348T na G | 100% | 17% | n.t. | n.t. |
| 76 Q na P 348 T na G | 100% | 17% | n.t. | n.t. |
| 76 Q na S 348 T na G | 100% | 17% | n.t. | n.t. |
| 76 Q na G 348 T na G | 100% | 20% | n.t. | n.t. |
| 76 Q na E 348 T na G | 100% | 17% | n.t. | n.t. |
| 143 D na E 348 T na G | 100% | 17% | n.t. | n.t. |
| 171 Y na H 348 T na G 308 K na N | 100% | 19% | n.t. | n.t. |
| 171 Y na H 348 T na G 317 F na V | 100% | 18% | n.t. | n.t. |
| 127 T na S 169 L na H 348 T na G 355 Y na H | 100% | 11% | n.t. | n.t. |
| 16 N na D 120 T na S 177 Q na R 277 Y na H 348 T na G | 100% | 22% | n.t. | n.t. |
| 116 I do T 255 N do T 299 K do R 348 T do G | 100% | 20% | n.t. | n.t. |
| 227 H do Y 348 T do G 438 N do S | 100% | 18% | n.t. | n.t. |
| 341 M o V 348 do G | 100% | 20% | n.t. | n.t. |
PL 205 561 B1 cd. tabeli 1
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 348T do G 349 V do G 428 N do P | 100% | 10% | n.t. | n.t. |
| 171 Y do G 230 P do H 348 T do G 428 N do P | 100% | 3% | n.t. | n.t. |
| 230 P do H 348 T do G 428 N do P | 100% | 10% | n.t. | 200 |
| 227 H do F 230 P do H 348 T do G 428 N do P | 100% | 6% | n.t. | n.t. |
| 143 D do E 348 T do G | 100% | 17% | n.t. | n.t. |
| 143 D do E 348 T do G 428 N do P | 100% | 1% | 32% | n.t. |
| 169 G do X 230 P do H 348 T do G 428 N do P | 100% | 2% | n.t. | n.t. |
P r z y k ł a d 6
Oczyszczanie zmutowanej s-GDH T348G
Wyhodowane komórki (LB-Amp, 37°C) zebrano i zawieszono w buforze-fosforanie potasu pH 7,0. Komórki rozbito przy użyciu prasy francuskiej (700-900 bar). Po odwirowaniu nadsącz nałożono na kolumnę S-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotec) zrównoważoną 10 mM fosforanem potasu jako buforem pH 7,0. Po przepłukaniu, s-GDH wyeluowano przy użyciu gradientu soli 0-1 M NaCl. Frakcje wykazujące aktywność s-GDH połączono, dializowano wobec fosforanu potasu jako buforu pH 7,0 i ponownie poddano chromatografii na ponownie zrównoważonej kolumnie S-Sepharose. Aktywne frakcje połączono i poddano filtracji żelowej przy użyciu kolumny Superdex® 200 (Amersham Pharmacia Biotec). Aktywne frakcje połączono i przechowywano w - 20°C.
Oznaczenie aktywności enzymu i ilości białka zmutowanej T348G i s-GDH typu dzikiego
Oznaczenie ilości białka przeprowadzono przy użyciu odczynnika Protein Assay Reagent nr 23225 firmy Pierce (krzywa kalibracyjna z BSA, 30 min. 37°C).
Próbki GDH rozcieńczono do stężenia 1 mg białka/ml w 0,0556 mM pirolochinolinochinonu (PQQ); 50 mM Hepes; 15 mM CaCl2 pH 7,0 i inkubowano w temperaturze 25°C przez 30 minut w celu rekonstytucji lub aktywacji.
Po aktywacji 50 μl próbki dodano do 1000 μl roztworu 0,2 M buforu cytrynianowego (pH 5,8; w temperaturze 25°C) zawierającego 0,315 mg/ml (4-(dimetylofosfinylometylo)-2-metylo-pirazolo-[1.5a]-imidazol-3-ilo)-(4-nitrozofenylo)-aminy (patrz opis patentowy USA 5,484,708) w charakterze związku pośredniczącego i 33 mM cukru.
Ekstynkcję przy długości fali 620 nm śledzi się przez pierwszych 5 minut w temperaturze 25°C.
Jedna jednostka enzymu odpowiada przemianie 1 mMola związku pośredniczącego/min w powyższych warunkach oznaczenia
Obliczenie: Aktywność = (całkowita objętość x dE/min [U/ml]):fe x objętość próbki x 1) (ε = współczynnik ekstynkcji, w tym przykładzie s&onm = 30 [1 x mmol-1 x cm-1]).
Oznaczenie przeprowadzono dla glukozy, maltozy i galaktozy (Merck, Niemcy).
PL 205 561 B1
Wyniki
| Próbka | Aktywność właściwa U/mg białka (glukoza jako substrat) | % przemiana maltoza/glukoza | % przemiana galaktoza/glukoza |
| typ dziki | 1000 | 105% | 50% |
| mutant T 348G | 910 | 22% | 20% |
P r z y k ł a d 7:
Oznaczanie glukozy w obecności lub nieobecności maltozy s-GDH typu dzikiego i zmutowaną T348G zastosowano do oznaczania glukozy. Próbki odniesienia zawierały 65 mg glukozy/dl. „Badana” próbka zawierała 65 mg glukozy/dl i 130 mg/dl maltozy. Do każdego oznaczenia użyto takich samych ilości aktywności GDH (U/ml; patrz oznaczanie enzymu). W kuwecie zmieszano:
ml 0,315 mg/ml (4-(dimetylofosfinylometylo)-2-metylo-pirazolo-[1.5a]-imidazol-3-ilo)-(4-nitrozofenylo)-aminy/0,2 M cytrynianu pH 5,8
0,015 próbki (glukoza lub glukoza + maltoza)
Oznaczenie rozpoczęto dodając 0,050 ml 90 U/ml s-GDH. Śledzono zmianę absorpcji przy długości fali 620 nm. Po 5 minutach obserwowano stałe wartości i obliczano dE/5 minut. Wartość uzyskana przy pomiarze próbki odniesienia z s-GDH typu dzikiego ustalono na 100%. Pozostałe wartości porównano z tą wartością odniesienia i wyrażono w %.
Wyniki:
| 65 mg/dl glukozy | 65 mg/dl glukozy i 130 mg/dl maltozy | |
| s-GDH typu dzikiego | 100% | 190% |
| zmutowana s-GDH T348G | 100% | 130% |
Jest widoczne, że zmierzona „wartość glukozy” jest znacząco mniej zakłócona, gdy do oznaczenia użyje się zmutowanej s-GDH.
Lista literatury
Anthony C, 1996. Qumoprotein-catalysed reactions. Biochem. J. 320(3):697-711
Anthony C, Ghosh M, 1997. The structure and function of PQQ-containing quinoproteins. Curr.
Sd. 72(10):716-727
Anthony, C, Biochem J 320 (1996) 697-711 Anthony, C. and Ghosh, M., Current Science 72 (1997) 716-727 Anthony, C. and Ghosh, M., Prog Biophys Mol Biol 69 (1998) 1-21 Anthony, G, Biochem Soc Trans 26 (1998) 413-7
Ausubel, F., et aL, in “Current protocols in molcular biology” (1994), Wiley Verlag Cleton-Jansen, A. M., et al., Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 73-9 Cleton-Jansen, A. M., et al., J Bacteriol 170 (1988) 2121-5 Cleton-Jansen, A. M., et al., Mol Gen Genet 217 (1989) 430-6
Davidson, V. L. in “Principles and applications of quinoproteins” (1993) the whole book, New York, Marcel Dekker
D'Costa, E. J., et al., Biosensors 2 (1986) 71-87
Dokter, P., et al., FEMS Microbiology Letters 43 (1987) 195-200
Dokter, P., et aL, Biochem J 239 (1986) 163-7
Dokter, P., et al., Biochem J 254 (1988) 131-8
Duine, J. A. Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter in “The Biology of Acinetobacter” (1991) 295-312, New York, Plenum Press Duine, J. A., Biosens. Bioelectronics 10 (1995) 17-23
Duine, J. A., et al., Arch Microbiol 131 (1982) 27-31
Duine, J. A., Eur J Biochem 200 (1991) 271-84
Goodwin, P. M. and Anthony, C, Adv Microb Physiol 40 (1998) 1-80
Hill, D. E„ et al, Methods Enzymol 155 (1987) 558-68
Igarashi, S., et al, Biochem Biophys Res Omunun 264 (1999) 820-4
PL 205 561 B1
Kaufmann, N., et aL Development and evaluation of a new system for determining glucose from fresh capillary blood and heparinised venous blood in “Glucotrend” (1997) 1-16, Mannheim, Boehringer Mannheim GmbH
Uurinavicius, V., et al., Analytical Letters 32 (1999) 299-316
Laurinavicius, V., et al, Monatshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281
Leung, D. W., et al, Technique 1 (1989) 11-15
Matsushita, K. and Adachi, O. Bacterial quinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase in “Principles and applications of Ouinoproteins” (1993) 47-63, New York, Marcel Dekker
Matsushita, K., et al, Antonie Van Leeuwenhoek 56 (1989) 63-72
Matsushita, K., et al, Biochemistry 28 (1989) 6276-80
Matsushita, K., et al, Bioscience Biotechnology & Biochemistry 59 (1995) 1548-1555
Oliphant, A. R, et al, Gene 44 (1986) 177-83
Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Arch Biochem Biophys 336 (1996) 42-8
Olsthoorn, A. J. and Duine, J. A., Biochemistry 37 (1998) 13854-61
Oubrie, A. and Dijkstra, B. W., Protein Sci 9 (2000) 1265-73
Oubrie, A., et al., Embo J18 (1999) 5187-94
Oubrie, A., et al, J Mol Biol 289 (1999) 319-33
Oubrie, A., etal., Proc Natl Acad Sci USA 96 (1999) 11787-91
Sambrook, J., et al - in “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (1989) -, Cold Spring Harbour, NY, Cold Spring Harbour Laboratory Press
Wens, R., et al, Perit Dial Int 18 (1998) 603-9
Ye, L., et al., Anal Chem. 65 (1993) 238-41
EP 0 620 283
JP 11243949
US 5,484,708
US 5,997,817
US 6,057,120
US 6,103,509
WO 92/07953
WO 99/30152
WO 88/09373
PL 205 561 B1
LISTA SEKWENCJI <11O> F. Hoffmann-La Roche AG Roche Diagnostics GmbH <120» Nowe formy rozpuszalnej dehydrogenazy glukozowej zależnej od pirolochinolinochinonu <130» 19139 WO <140» <141» ' <150» EP 00123512.S <151> 2000-10-27 <150» EP 00127294.7 <151> 2000-12-19 <160» 25 <170» Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211» 7 .
<212» PRT <213» Acinetobacter calcoaceticus <400» 1
Trp Pro Xaa Val Ala Pro Ser 1 5 <210» 2 <211> 7 <212» PRT <213» Acinetobacter calcoaceticus <400» 2
Thr Ala Gly Xaa Val Gin Lys 1 5 <210» 3 <211» 7 <212» PRT <213» Acinetobacter calcoaceticus <400» 3
Ala Asp Gly Xaa Asn Gly Leu 1 5 <210» 4 <211» 26
PL 205 561 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: sensowny starter GF23 <400> 4 cgcgcacgcg catgccgccg atgttc 26 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: antysensowny starter GR23 <400> 5 gacggccagt gaattctttt eta 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji:sensowny starter GDH F2 <400> 6 ttaacgtgct gaacagccgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: sensowny starter GDH F3 <400> 7 gatgctgatg ggcagaatgg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
PL 205 561 B1 <223» Opis sztucznej sekwencji! sensowny starter GDH F4 <400» 8 atatgggtaa agtactacgc 20 <210» 9 <211» 20 .
<212» DNA <213» Sztuczna sekwencja <220» <223» Opis sztucznej sekwencji: sensowny starter GDH F5 <400» 9 acgatccaac ttgtggagag 20 <210» 10 <211» 20 <212» DNA <213» Sztuczna sekwencja <220» ' <223» Opis sztucznej sekwencji; antysensowny starter GDH RI <400» 10 cgattaagtt gggtaacgcc 20 <210» 11 <211» 20 <212» DNA <213» Sztuczna sekwencja <220» <223» Opis sztucznej sekwencji: antysensowny starter GDH R2 <400» 11 atacggaaaa tgacaccacg 20 <210» 12 <211» 20 <212» DNA <213» Sztuczna sekwencja <220» <223» Opis sztucznej sekwencji: antysensowny starter GDH R3
PL 205 561 B1 <400» 12 gggccttgtt cagactgcaa 20 <210» 13 <211» 20 <212» DNA <213> Sekwencja sztuczna <220» <223» Opis sztucznej sekwencji: antysenowny starter GDH R4 <400» 13 caagacgacc tgactgatgg 20 <210» 14 <211> 20 <212» DNA <213» Sekwencja sztuczna <220» <223» Opis sztucznej sekwencji: antysensowny starter GDH R5 <400> 14 cataacaacg cgtgcggctt 20 <210» 15 <211» 29 <212» DNA <213» Sekwencja sztuczna <220» <223» Opis sztucznej sekwencji:sensowny starter EGF <400» 15 tccaacttgt ggannnatga cctacattt 29 <210» 16 <211» 29 <212» DNA <213» Sekwencja sztuczna <220» <223» Opis sztucznej sekwencji: antysensowny starter EGR <400» 16 aaatgtaggt catnnntcca caagttgga 29
PL 205 561 B1 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji:sensowny starter TSF <400> 17 catttgctgg ccannngttg caccgtcat 29 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji:antysensowny starter TSR <400> 18 atgacggtgc aacnnntggc cagcaaatg 29 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Seąuence <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: sensowny starter NHF <400> 19 tactggttgg gaannnacat tattggttc 29 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: antysensowny starter NHR <400> 20 gaaccaataa tgtnnnttcc caaccagta 29 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja
PL 205 561 B1 <220>
<223> Opis sztycznej sekwencji:sensowny starter SNF <400> 21 tgatgtgatt gcannnccag atgggaatg 29 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji:antysensowny starter primer SNR <400;» 22 cattcccatc tggnnntgca atcacatca 29 <210> 23 <211> 1362 <212 > DNA <213> Acinetobacter calcoaceticus <220>
<221> CDS <222> (1)..(1362) <400> 23
| gat gtt cct eta act cca tet | caa ttt get aaa gcg aaa tea gag aac | 48 | ||||||||||||||
| Asp Val Pro Leu Thr Pro | Ser | Gin | Phe | Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn | ||||||||||||
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||||
| ttt | gac | aag | aaa | gtt | att | eta | tet | aat | f»f a | aat | aag | ceg | cac | gcg | ttg | 96 |
| Phe | Asp | Lys | Lys | Val | ile | Leu | Ser | Asn | Leu | Asn | Lys | Pro | His | Ala | Leu | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| tta | tgg | gga | PPS, C*. | gat | aat | caa | att | tgg | tta | act | gag | ega | gca | aca | ggt | 144 |
| Leu | Trp | Gly | Pro | Asp | Asn | Gin | Ile | Trp | Leu | Thr | Glu | Arg | Ala | Thr | Gly | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| aag | att | eta | aga | gtt | aat | cca | gag | teg ggt | agt | gta | aaa | aca | gtt | ttt | 192 | |
| Lys | Ile | Leu | Arg | Val | Asn | Pro | Glu | Ser | Gly | Ser | Val | Lys | Thr | Val | Phe | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| cag | gta | cca | gag | att | gtc | aat | gat | get | gat | ggg | cag | aat | ggt | tta | tta | 240 |
| Gin | Vał | Pro | Glu | Ile | Val | Asn | Asp | Ala | Asp | Gly | Gin | Asn | Gly | Leu | Leu | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| ggt | ttt | gee | ttc | cat | cct | gat | ttt | aaa | aat | aat | cct | tat | atc | tat | att | 288 |
| Giy | Phe | Ala | Phe | His | Pro | Asp | Phe | Lys | Asn | Asn | Pro | Tyr | Ile | Tyr | Ile |
90 95
PL 205 561 B1
| tca Ser | ggt aca | ttt aaa aat | ccg Pro | aaa Lys | tct aca gat aaa gaa tta | ccg aac Pro Asn | 336 | |||||||
| Gly | Thr | Phe 100 | Lys | Asn | Ser 105 | Thr Asp | Lys | Glu | Leu 110 | |||||
| caa | acg | att | att | cgt | cgt | tat | acc | tat | aat aaa | tca | aca | gat | acg ctc | 384 |
| Gin | Thr | Ile 115 | Ile | Arg | Arg | Tyr | Thr 120 | Tyr | Asn Lys | Ser | Thr 125 | Asp | Thr Leu | |
| gag | aag | cca | gtc | gat | tta | tta | gca | gga | tta cct | tca | tca | aaa | gac cat | 432 |
| Glu | Lys 130 | Pro | Val | Asp | Leu | Leu 135 | Ala | Gly | Leu Pro | Ser 140 | Ser | Lys | Asp His | |
| cag | tca | ggt | cgt | ctt | gtc | att | ggg | cca | gat caa | aag | att | tat | tat acg | 480 |
| Gin 145 | Ser | Gly Arg | Leu | Val 150 | Ile | Gly | Pro | Asp Gin 155 | Lys | Ile | Tyr | Tyr Thr 160 | ||
| att | ggt | gac | caa | ggg | cgt | aac | cag | ctt | gct tat | ttg | ttc | ttg | cca aat | 528 |
| ile | Gly | Asp | Gin | Gly 165 | Arg | Asn | Gin | Leu | Ala Tyr 170 | Leu | Phe | Leu | Pro Asn 175 | |
| caa | gca | caa | cat | acg | cca | act | caa | caa | gaa ctg | aat | ggt | aaa | gac tat | 576 |
| Gin | Ala | Gin | His 180 | Thr | Pro | Thr | Gin | Gin 185 | Glu Leu | Asn | Gly | Lys 190 | Asp Tyr | |
| cac | acc | tat | atg | ggt | aaa | gta | eta | ege | tta aat | ctt | gat | gga | agt att | 624 |
| His | Thr | Tyr 195 | Met | Gly | Lys | Val | Leu 200 | Arg | Leu Asn | Leu | Asp 205 | Gly | Ser Ile | |
| cca | aag | gat | aat | cca | agt | ttt | aac | ggg | gtg gtt | age | cat | att | tat aca | 672 |
| Pro | Lys 210 | Asp | Asn | Pro | Ser | Phe 215 | Asn | Gly | Val Val | Ser 220 | His | Ile | Tyr Thr | |
| ctt | gga | cat | cgt | aat | ccg | cag | ggc | tta | gca ttc | act | cca | aat | ggt aaa | 720 |
| Len 225 | Gly | His | Arg | Asn | Pro 230 | Gin | Gly | Leu | Ala Phe 235 | Thr | Pro | Asn | Gly Lys 240 | |
| tta | ttg | cag | tct | gaa | caa | ggc | cca | aac | tct gac | gat | gaa | att | aac ctc | 768 |
| Leu | Leu | Gin | Ser | Glu 245 | Gin | Gly | Pro | Asn | Ser Asp 250 | Asp | Glu | Ile | Asn Leu 255 | |
| att | gtc | aaa | ggt | ggc | aat | tat | ggt | tgg | ccg aat | gta | gca | ggt | tat aaa | 816 |
| Ile | Val | Lys | Gly Gly 260 | Asn | Tyr | Gly | Trp 265 | Pro Asn | Val | Ala | Gly Tyr Lys 270 | |||
| gat | gat | agt | ggc | tat | gct | tat | gca | aat | tat tca | gca | gca | gee | aat aag | 864 |
| Asp | Asp | Ser 275 | Gly | Tyr | Ala | Tyr | Ala 280 | Asn | Tyr Ser | Ala | Ala 285 | Ala | Asn Lys | |
| tca | att | aag | gat | tta | gct | caa | aat | gga | gta aaa | gta | gee | gca | ggg gtc | 912 |
| Ser | Ile 290 | Lys | Asp | Leu | Ala | Gin 295 | Asn | Gly | Val Lys | Val 300 | Ala | Ala | Gly Val | |
| cct | gtg | acg | aaa | gaa | tct | gaa | tgg | act | ggt aaa | aac | ttt | gtc | cca cca | 960 |
| Pro | Val | Thr | Lys | Glu | Ser | Glu | Trp | Thr | Gly Lys | Asn | Phe | Val | Pro Pro |
PL 205 561 B1
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
| tta | aaa | act | tta | tat | acc | gtt | caa | gat | acc | tac | aac | tat | aac | gat | cca | 1008 |
| Leu | Łys | Thr | Łeu | Tyr 325 | Thr | Val | Gin | Asp | Thr 330 | Tyr | Asn | Tyr | Asn | Asp 335 | Pro | |
| act | tgt | gga | gag | atg | acc | tac | att | tgc | tgg | cca | aca | gtt | gca | ccg | tca | 1056 |
| Thr | Cys | Gly | Glu 340 | Met | Thr | Tyr | Ile | cys 345 | Trp | Pro | Thr | val | Ala 350 | Pro | Ser | |
| tct | gcc | tat | gtc | tat | aag | ggc | ggt | aaa | aaa | gca | att | act | ggt | tgg | gaa | 1104 |
| Ser | Ala | Tyr 355 | Val | Tyr Lys | Gly Gly Łys 360 | Łys | Ala | He | Thr 365 | Gly Trp | Glu | |||||
| aat | aca | tta | ttg | gtt | cca | tct | tta | aaa | cgt | ggt | gtc | att | ttc | cgt | att | 1152 |
| Asn | Thr 370 | Leu | Łeu | Yal | Pro | Ser 375 | Łeu | Łys Arg Gly | Yal 380 | Ile | Phe | Arg | Ile | |||
| aag | tta | gat | cca | act | tat | agc | act | act | tat | gat | gac | gct | gta | ccg | atg | 1200 |
| Łys 385 | Leu | Asp | Pro | Thr | Tyr 390 | Se r | Thr | Thr | Tyr Asp 395 | Asp | Ala | Val | Pro | Met 400 | ||
| tfct | aag | agc | aac | aac | cgt | tat | cgt | gat | gtg | att | gca | agt | cca | gat | ggg | 1248 |
| Phe | Łys | Ser | Asn | Asn 405 | Arg | Tyr Arg Asp | Val 410 | Ile | Ala | Ser | Pro | Asp 415 | Gly | |||
| aat | gtc | tta | tat | gta | tta | act | gat | act | gcc | gga | aat | gtc | caa | aaa | gat | 1296 |
| Asn | Yal | Leu | Tyr 420 | Yal | Leu | Thr | Asp | Thr 425 | Ala | Gly | Asn | Vał | Gin 430 | Lys | Asp | |
| gat | ggc | tca | gta | aca | aat | aca | tta | gaa | aac | cca | gga | tct | ctc | att | aag | 1344 |
| Asp Gly | Ser 435 | Yal | Thr | Asn | Thr | Leu 440 | GlU | Asn | Pro | Gly | Ser 445 | Leu | Ile | Lys |
ttc acc tafc aag gcfc aag 1362
Phe Thr Tyr Lys Ala Lys
450 <210> 24 <211> 454 <212> PRT
| <213> Acinetobacter calcoaceticus |
| <400> 24 |
| Asp Yal Pro Leu Thr Pro Ser Gin Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn |
| 15 10 15 |
| Phe Asp Lys Lys Val He Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu |
| 20 25 30 |
| Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gin He Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly |
| 35 40 45 |
| Lys He Leu Arg Yal Asn Pro Glu Ser Gly Ser Yal Lys Thr Yal Phe |
PL 205 561 B1
55 60
| Gin 65 | Val | Pro | Glu | Ile Val 70 | Asn | Asp | Ala | Asp | Gly 75 | Gin | Asn | Gly | Leu | Leu 80 |
| Gly | Phe | Ala | Phe | His Pro 85 | Asp | Phe | Lys | Asn 90 | Asn | Pro | Tyr | Ile | Tyr 95 | Ile |
| Ser | Gly | Thr | Phe 100 | Lys Asn | Pro | Lys | Ser 105 | Thr | Asp | Lys | Glu | Leu 110 | Pro | Asn |
| Gin | Thr | Ile 115 | Ile | Arg Arg | Tyr | Thr 120 | Tyr | Asn | Lys | Ser | Thr 125 | Asp | Thr | Leu |
| Glu | Lys 130 | Pro | Val | Asp Leu | Leu 135 | Ala | Gly | Leu | Pro | Ser 140 | Ser | Lys | Asp | His |
| Gin 145 | Ser | Gly Arg | Leu Val 150 | Ile | Gly | Pro | Asp | Gin 155 | Lys | Ile | Tyr | Tyr | Thr 160 | |
| Ile | Gly Asp | Gin | Gly Arg 165 | Asn | Gin | Leu | Ala 170 | Tyr | Leu | Phe | Leu | Pro 175 | Asn | |
| Gin | Ala | Gin | His 180 | Thr Pro | Thr | Gin | Gin 185 | Glu | Leu | Asn | Gly | Lys 190 | Asp | Tyr |
| His | Thr | Tyr 195 | Met | Gly Lys | Val | Leu 200 | Arg | Leu | Asn | Leu | Asp 205 | Gly | Ser | Ile |
| Pro | Lys 210 | Asp | Asn | Pro Ser | Phe 215 | Asn | Gly | Val | Val | Ser 220 | His | Ile | Tyr | Thr |
| Leu 225 | Gly | His | Arg | Asn Pro 230 | Gin | Gly | Leu | Ala | Phe 235 | Thr | Pro | Asn | Gly Lys 240 | |
| Leu | Leu | Gin | Ser | Glu Gin 245 | Gly | Pro | Asn | Ser 250 | Asp Asp | Glu | Ile | Asn 255 | Leu | |
| Ile | Val | Lys | Gly Gly Asn 260 | Tyr | Gly | Trp 265 | Pro | Asn | Val | Ala | Gly 270 | Tyr | Lys | |
| Asp | Asp | Ser 275 | Gly | Tyr Ala | Tyr | Ala 280 | Asn | Tyr | Ser | Ala | Ala 285 | Ala | Asn | Lys |
| Ser | Ile 290 | Lys | Asp | Leu Ala | Gin 295 | Asn | Gly | Val | Lys | Val 300 | Ala | Ala | Gly | Val |
| Pro 305 | Val | Thr | Lys | Glu Ser 310 | Glu | Trp | Thr | Gly | Lys 315 | Asn | Phe | Val | Pro | Pro 320 |
| Leu | Lys | Thr | Leu | Tyr Thr 325 | Val | Gin | Asp | Thr 330 | Tyr | Asn | Tyr | Asn | Asp 335 | Pro |
| Thr | Cys | Gly | Glu 340 | Met Thr | Tyr | Ile | Cys 345 | Trp | Pro | Thr | Val | Ala 350 | Pro | Ser |
PL 205 561 B1
| Ser | Ala | Tyr 355 | Val | Tyr | Lys | Gly Gly 360 | Lys | Lys Ala | Ile | Thr 365 | Gly | Trp | Glu | |
| Asn | Thr 370 | Leu | Leu | Val | Pro | Ser 375 | Leu | Lys | Arg Gly | Val 380 | Ile | Phe | Arg | Ile |
| Lys 385 | Leu | Asp | Pro | Thr | Tyr 390 | Ser | Thr | Thr | Tyr Asp 395 | Asp | Ala | Val | Pro | Met 400 |
| Phe | Lys | Ser | Asn | Asn 405 | Arg | Tyr Arg | Asp | Val Ile 410 | Ala | Ser | Pro | Asp 415 | Gly | |
| Asn | Val | Leu | Tyr 420 | Val | Leu | Thr | Asp | Thr 425 | Ala Gly | Asn | Val | Gin 430 | Lys | Asp |
| Asp | Gly | Ser 435 | val | Thr | Asn | Thr | Leu 440 | Glu | Asn Pro | Gly | Ser 445 | Leu | Ile | Lys |
| Phe | Thr 450 | Tyr | Lys | Ala | Lys |
<210> 25 <211> 4373 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji:wektor pACSGDH <400> 25 cactaactga ttacgcaccg catgtaaccg ttttcaatct gtgagtaaat tcacagttta 60 ttaacattgt gatagctatg atgacaacgt ttgtcgcact gtaactaacg tgtaacagtt 120 agttgtcagt tttgctgggg tatttcgctt ataaaaaccg ttatcacaat atcccgcgac 180 taccggacaa aaataaagag ttgaataaga gcttatccca ttagggctat tttacttgcc 240 attttggacc tgggcagtgc tcgccaaaac gcgttagcgt tttgaacgcg ctagcggcgg 300 cccgaagggc gagcgtagcg agtcaaacct cacgtactac gtgtacgctc cggtttttgc 360 gcgctgtccg tgtccaaact gctgcgccaa taacgcctgg tgggataggc tctaaatacg 420 cttcggcgtt cagtaacacg cgttaacgtg ctgaacagcc gggcattttt ttacgctata 480 ccctacataa taaaaccgga gctaccatga ataagaaggt actgaccctt tctgccgtga 540 tggcaagtct gttattcggc gcgcacgcgc atgccgccga tgttcctcta actccatctc 600 aatttgctaa agcgaaatca gagaactttg acaagaaagt tattctatct aatctaaata 660 agccgcacgc gttgttatgg ggaccagata atcaaatttg gttaactgag cgagcaacag 720 gtaagattct aagagttaat ccagagtcgg gtagtgtaaa aacagttttt caggtaccag 780 agattgtcaa tgatgctgat gggcagaatg gtttattagg ttttgccttc catcctgatt 840 ttaaaaataa tccttatatc tatatttcag gtacatttaa aaatccgaaa tctacagata 900 aagaattacc gaaccaaacg attattcgtc gttataccta taataaatca acagatacgc 960 tcgagaagcc agtcgattta ttagcaggat taccttcatc aaaagaccat cagtcaggtc 1020 gtcttgtcat tgggccagat caaaagattt attatacgat tggtgaccaa gggcgtaacc 1080 agcttgctta tttgttcttg ccaaatcaag cacaacatac gccaactcaa caagaactga 1140 atggtaaaga ctatcacacc tatatgggta aagtactacg cttaaatctt gatggaagta 1200 ttccaaagga taatccaagt tttaacgggg tggttagcca tatttataca cttggacatc 1260 gtaatccgca gggcttagca ttcactccaa atggtaaatt attgcagtct gaacaaggcc 1320
PL 205 561 B1 caaactctga cgatgaaatt aacctcattg tcaaaggtgg caattafcggt tggccgaatg 1380 tagcaggtta taaagatgat agtggctatg cttatgcaaa ttattcagca gcagccaata 1440 agtcaattaa ggatttagct caaaatggag taaaagtagc cgcaggggtc cctgtgacga 1500 aagaatctga atggactggt aaaaactttg tcccaccatt aaaaacttta tataccgttc 1560 aagataccta caactataac gatccaactt gtggagagat gacctacatt tgctggccaa 1620 cagttgcacc gtcatctgcc tatgtctata agggcggtaa aaaagcaatt actggttggg 1680 aaaatacatt attggttcca tctttaaaac gtggtgtcat tttccgfcatt aagttagatc 1740 caacttatag cactacttat gatgacgctg taccgatgtt taagagcaac aaccgttatc 1800 gtgatgtgat tgcaagtcca gatgggaatg tcttatatgt attaactgat actgccggaa 1860 atgtccaaaa agatgatggc tcagtaacaa atacafctaga aaacccagga tctctcatta 1920 agttcaccta taaggctaag taatacagtc gcattaaaaa accgatctat aaagatcggt 1980 ttttttagtt ttagaaaaga attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 2040 ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa 2100 tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg 2160 gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg 2220 cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac 2280 acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt 2340 gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag 2400 acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc 2460 ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt 2520 ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata 2580 atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt 2640 tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc 2700 tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat 2760 ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct 2820 atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca 2880 ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggafcgg 2940 catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa 3000 cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg 3060 ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga 3120 cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg 3180 cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt 3240 tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg 3300 agcęggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc 3360 ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca 3420 gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc 3480 atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 3540 cctttttgat aatcfccatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 3600 agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 3660 ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 3720 accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct 3780 tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 3840 cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 3900 gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 3960 gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 4020 gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 4080 cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttfca 4140 tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 4200 ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 4260 ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat 4320 taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgacggggc ccg 4373
Claims (13)
- Zastrzeżenia patentowe1. Zmutowane białko zależnej od pirolochinolinochinonu (PQQ-zależnej) rozpuszczalnej dehydrogenazy glukozowej (s-GDH) obejmujące podstawienie reszty aminokwasowej w pozycji aminokwasowej odpowiadającej pozycji 348 sekwencji s-GDH typu dzikiego znanej z Acinetobacter calcoaceticus (A. calcoaceticus) (SEKW. NR ID. 24), w którym treonina jest podstawiona alaniną, glicyną albo seryną.
- 2. Zmutowane białko według zastrz. 1, znamienne tym, że dalej obejmuje podstawienia reszt aminokwasowych w pozycji 428, w której asparagina jest podstawiona leucyną, proliną albo waliną.
- 3. Zmutowane białko według zastrz. 2, znamienne tym, że ponadto obejmuje co najmniej jedno z następujących podstawień Y171G, H227F, P230H, E245D lub M341V.
- 4. Zmutowane białko PQQ-zależnej s-GDH obejmujące sekwencję aminokwasową WPGVAPS w pozycjach odpowiadających pozycji 346-352 s-GDH typu dzikiego z A. calcoaceticus.
- 5. Zmutowane białko zależnej od PQQ s-GDH obejmujące sekwencję aminokwasową TAGPVQK w pozycjach odpowiadających pozycjom 425-431 s-GDH typu dzikiego z A. calcoaceticus.
- 6. Wyizolowany polinukleotyd kodujący zmutowane białko s-GDH określone w zastrz. 1-5.
- 7. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że obejmuje wyizolowany polinukleotyd określony w zastrz. 6 funkcjonalnie połączony z sekwencją promotorową zdolną do kierowania ekspresją tego polinukleotydu.
- 8. Komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje wektor ekspresyjny określony w zastrz. 7.
- 9. Sposób wytwarzania wariantów s-GDH, znamienny tym, że obejmuje hodowlę komórki gospodarza określonej w zastrz. 8 w warunkach odpowiednich do wytwarzania wariantów enzymu.
- 10. Sposób wytwarzania wariantów s-GDH, znamienny tym, że obejmuje użycie wektora określonego w zastrz. 7 w wolnym od komórek układzie syntezy peptydów w warunkach odpowiednich do wytwarzania tych wariantów enzymu.
- 11. Sposób wykrywania, oznaczania lub pomiaru glukozy w próbce przy użyciu mutanta s-GDH określonego w zastrz. 1-5, znamienny tym, że obejmuje kontaktowanie próbki z mutantem.
- 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że ponadto wykrywanie, oznaczanie lub pomiar glukozy przeprowadza się przy użyciu czujnika lub urządzenia z paskiem testowym.
- 13. Urządzenie do wykrywania lub pomiaru glukozy w próbce oparte na pomiarze prądu elektrycznego, powstającego w reakcji glukozy z odczynnikami na elektrodzie paska, znamienne tym, że pasek zawiera mutanta s-GDH określonego w zastrz. 1-5.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00123512 | 2000-10-27 | ||
| EP00127294 | 2000-12-19 | ||
| PCT/EP2001/012148 WO2002034919A1 (en) | 2000-10-27 | 2001-10-20 | Variants of soluble pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL362548A1 PL362548A1 (pl) | 2004-11-02 |
| PL205561B1 true PL205561B1 (pl) | 2010-05-31 |
Family
ID=26071553
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL362548A PL205561B1 (pl) | 2000-10-27 | 2001-10-20 | Zmutowane białko zależnej od pirolochinolinochinonu rozpuszczalnej dehydrogenazy glukozowej, wyizolowany polinukleotyd kodujący to białko, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania wariantów s-GDH, sposób wykrywania, oznaczania lub pomiaru glukozy i urządzenie do wykrywania lub pomiaru glukozy |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20030104595A1 (pl) |
| EP (1) | EP1332216B1 (pl) |
| JP (2) | JP3845618B2 (pl) |
| KR (1) | KR100519902B1 (pl) |
| CN (1) | CN1288246C (pl) |
| AT (1) | ATE520777T1 (pl) |
| AU (2) | AU1596602A (pl) |
| BR (1) | BRPI0114962B8 (pl) |
| CA (1) | CA2427029C (pl) |
| HK (1) | HK1074217A1 (pl) |
| PL (1) | PL205561B1 (pl) |
| WO (1) | WO2002034919A1 (pl) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2327815T3 (es) * | 2000-02-11 | 2009-11-04 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 18477, proteina quinasa humana y usos de la misma. |
| AU1596602A (en) * | 2000-10-27 | 2002-05-06 | Peter Kratzsch | Variants of soluble pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase |
| JP2003093071A (ja) * | 2001-09-26 | 2003-04-02 | Koji Hayade | グルコース脱水素酵素 |
| US6855556B2 (en) * | 2002-01-04 | 2005-02-15 | Becton, Dickinson And Company | Binding protein as biosensors |
| US7476525B2 (en) | 2002-05-27 | 2009-01-13 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase with superior substrate specificity and stability |
| DE60323650D1 (de) | 2002-07-04 | 2008-10-30 | Ultizyme Int Ltd | Glucosedehydrogenase |
| DE60322921D1 (de) * | 2002-09-27 | 2008-09-25 | Dsm Ip Assets Bv | Aldehyddehyrdrogenase-gen |
| DE60331477D1 (de) | 2002-12-24 | 2010-04-08 | Ikeda Food Res Co Ltd | Coenzymbindende glukosedehydrogenase |
| JP4415282B2 (ja) * | 2003-03-24 | 2010-02-17 | 東洋紡績株式会社 | 基質特異性または安定性に優れたピロロキノリンキノン（ｐｑｑ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体 |
| DE10320259A1 (de) * | 2003-05-07 | 2004-11-25 | Bayer Technology Services Gmbh | Neuartige Glukose Dehydrogenase und ihre Herstellung |
| EP1666586B1 (en) * | 2003-09-08 | 2009-10-21 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Pyrroloquinoline quinone (pqq)-dependent glucose dehydrogenase modification having excellent substrate specificity |
| JP2005328793A (ja) * | 2004-05-21 | 2005-12-02 | Toyobo Co Ltd | 基質特異性に優れたピロロキノリンキノン（ｐｑｑ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ改変体 |
| EP1600503A1 (en) * | 2004-05-14 | 2005-11-30 | Amano Enzyme Inc. | Modified pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase |
| US7037698B2 (en) | 2004-05-19 | 2006-05-02 | Amano Enzyme Inc. | Pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase |
| US20060003400A1 (en) * | 2004-06-30 | 2006-01-05 | Byrd Patricia A | Methods and compositions for characterizing a redox reagent system enzyme |
| NZ551870A (en) | 2004-07-20 | 2009-02-28 | Hoffmann La Roche | Genetically engineered pyrroloquinoline quinone dependent glucose dehydrogenase comprising an amino acid insertion |
| ATE511538T1 (de) | 2004-10-15 | 2011-06-15 | Hoffmann La Roche | Thermostabile mutanten pyrrolochinolin-chinon- abhängiger glucose-dehydrogenase |
| US7901921B2 (en) * | 2004-10-22 | 2011-03-08 | Oncolytics Biotech Inc. | Viral purification methods |
| WO2006085509A1 (ja) * | 2005-02-08 | 2006-08-17 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | 基質特異性に優れた改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼ |
| EP2365074A1 (en) | 2005-03-25 | 2011-09-14 | Ikeda Food Research Co. Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
| WO2006109578A1 (ja) * | 2005-04-05 | 2006-10-19 | Amano Enzyme Inc. | 改変型ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素、及びピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素の基質特異性改良法 |
| DE602006011858D1 (de) * | 2005-06-20 | 2010-03-11 | Arkray Inc | Mutante glucose-dehydrogenase |
| TW200706650A (en) * | 2005-08-11 | 2007-02-16 | Toyo Boseki | A substrate specificity improved composition for glucose measurement |
| JP2007043984A (ja) * | 2005-08-11 | 2007-02-22 | Toyobo Co Ltd | ピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素酵素の基質特異性を向上する方法 |
| US7955484B2 (en) | 2005-12-14 | 2011-06-07 | Nova Biomedical Corporation | Glucose biosensor and method |
| PL2010649T3 (pl) | 2006-04-13 | 2017-08-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Ulepszone mutanty rozpuszczalnej dehydrogenazy glukozowej zależnej od chinonu pirolochinoliny |
| KR100973992B1 (ko) * | 2006-05-25 | 2010-08-05 | 삼성전자주식회사 | 시분할 복신 무선통신시스템의 시분할 복신 스위치 |
| WO2008001903A1 (en) | 2006-06-29 | 2008-01-03 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Fad-conjugated glucose dehydrogenase gene |
| US8619038B2 (en) * | 2007-09-04 | 2013-12-31 | Apple Inc. | Editing interface |
| DE102008030435A1 (de) * | 2008-06-26 | 2010-01-07 | Bayer Technology Services Gmbh | Neuartige Varianten PQQ-abhängiger Glukosehydrogenase mit verbesserter Substratspezifität |
| FR2948680B1 (fr) * | 2009-07-28 | 2013-10-04 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux mutants de la pqq s-gdh |
| CN103003440B (zh) | 2010-07-23 | 2015-11-25 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 含两性离子缓冲液的组合物及其在电分析装置和方法中的用途 |
| JP6194251B2 (ja) | 2010-12-20 | 2017-09-06 | レツク・フアーマシユーテイカルズ・デー・デー | 医薬品有効成分およびこれの中間体の酵素的合成 |
| EP2465936A1 (en) | 2010-12-20 | 2012-06-20 | LEK Pharmaceuticals d.d. | Enzymatic synthesis of statins and intermediates thereof |
| WO2012084194A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Roche Diagnostics Gmbh | Systems and methods to compensate for sources of error during electrochemical testing |
| CN102559624B (zh) * | 2012-03-05 | 2013-10-16 | 浙江德清汇宁生物科技有限公司 | 一种吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶的热稳定性突变体及其高通量筛选方法 |
| EP2636750A1 (en) | 2012-03-06 | 2013-09-11 | Roche Diagniostics GmbH | Compatible solute ectoine as well as derivatives thereof for enzyme stabilization |
| EP2994536B1 (en) | 2013-05-08 | 2017-06-14 | Roche Diabetes Care GmbH | Stabilization of enzymes by nicotinic acid |
| EP3074524B1 (en) | 2013-11-27 | 2019-11-06 | Roche Diabetes Care GmbH | Composition comprising up-converting phosphors for detecting an analyte |
| EP2927319A1 (en) | 2014-03-31 | 2015-10-07 | Roche Diagnostics GmbH | High load enzyme immobilization by crosslinking |
| JP6522003B2 (ja) | 2014-04-14 | 2019-05-29 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | フェナジニウムメディエーター |
| WO2016026959A1 (en) | 2014-08-22 | 2016-02-25 | Roche Diagnostics Gmbh | Redoxindicators |
| CN105331591B (zh) | 2015-10-29 | 2020-02-28 | 英科隆生物技术（杭州）有限公司 | PQQ-sGDH突变体、聚核苷酸及葡萄糖检测装置 |
| CA3035874A1 (en) | 2016-10-05 | 2018-04-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Detection reagents and electrode arrangements for multi-analyte diagnostic test elements, as well as methods of using the same |
| CN113234697B (zh) * | 2021-04-28 | 2022-09-02 | 遵义医科大学珠海校区 | 一种葡萄糖脱氢酶变体及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6190906B1 (en) | 1987-05-20 | 2001-02-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Expression vector for the regulatable expression of foreign genes in prokaryotes |
| DE3716957A1 (de) | 1987-05-20 | 1988-12-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Expressionsvektor zur regulierbaren expression von fremdgenen in prokaryonten |
| FI905324A (fi) | 1990-10-29 | 1992-04-30 | Valtion Teknillinen | Enzymatiskt bestaemningsfoerfarande foer aldoser. |
| DE4311464A1 (de) * | 1993-04-08 | 1994-10-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mit einer PQQ-abhängigen Dehydrogenase |
| DE19639169A1 (de) * | 1996-09-24 | 1998-04-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Redoxaktive Verbindungen und deren Anwendung |
| JPH10243786A (ja) * | 1997-03-03 | 1998-09-14 | Koji Hayade | 改変型グルコース脱水素酵素 |
| CZ291059B6 (cs) * | 1997-03-12 | 2002-12-11 | Lonza Ag | Způsob výroby esterů 2,6-pyridindikarboxylových kyselin |
| US5997817A (en) * | 1997-12-05 | 1999-12-07 | Roche Diagnostics Corporation | Electrochemical biosensor test strip |
| JP2000350588A (ja) * | 1999-04-08 | 2000-12-19 | Koji Hayade | グルコース脱水素酵素 |
| TWI224136B (en) * | 1999-04-30 | 2004-11-21 | Koji Sode | Glucose dehydrogenase |
| AU1596602A (en) * | 2000-10-27 | 2002-05-06 | Peter Kratzsch | Variants of soluble pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase |
| JP2003093071A (ja) * | 2001-09-26 | 2003-04-02 | Koji Hayade | グルコース脱水素酵素 |
-
2001
- 2001-10-20 AU AU1596602A patent/AU1596602A/xx active Pending
- 2001-10-20 BR BRPI0114962A patent/BRPI0114962B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-10-20 CA CA002427029A patent/CA2427029C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-20 AU AU2002215966A patent/AU2002215966B2/en not_active Expired
- 2001-10-20 EP EP01988775A patent/EP1332216B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-20 KR KR10-2003-7005783A patent/KR100519902B1/ko active IP Right Grant
- 2001-10-20 PL PL362548A patent/PL205561B1/pl unknown
- 2001-10-20 JP JP2002537889A patent/JP3845618B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-20 CN CNB018212158A patent/CN1288246C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-20 WO PCT/EP2001/012148 patent/WO2002034919A1/en active IP Right Grant
- 2001-10-20 AT AT01988775T patent/ATE520777T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-10-29 US US10/082,627 patent/US20030104595A1/en not_active Abandoned
-
2002
- 2002-12-13 US US10/319,147 patent/US7132270B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-08-02 HK HK05106631A patent/HK1074217A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2005-12-09 US US11/298,778 patent/US7547535B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-06-05 JP JP2006156710A patent/JP3889434B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002034919A1 (en) | 2002-05-02 |
| JP3845618B2 (ja) | 2006-11-15 |
| PL362548A1 (pl) | 2004-11-02 |
| BRPI0114962B1 (pt) | 2016-07-12 |
| BR0114962A (pt) | 2003-10-28 |
| JP2006314322A (ja) | 2006-11-24 |
| US7132270B2 (en) | 2006-11-07 |
| CA2427029C (en) | 2010-02-02 |
| AU2002215966B2 (en) | 2006-05-04 |
| EP1332216A1 (en) | 2003-08-06 |
| US20060148056A1 (en) | 2006-07-06 |
| AU1596602A (en) | 2002-05-06 |
| JP3889434B2 (ja) | 2007-03-07 |
| HK1074217A1 (en) | 2005-11-04 |
| KR20030048447A (ko) | 2003-06-19 |
| BRPI0114962B8 (pt) | 2021-07-27 |
| ATE520777T1 (de) | 2011-09-15 |
| JP2004512047A (ja) | 2004-04-22 |
| US20030104595A1 (en) | 2003-06-05 |
| KR100519902B1 (ko) | 2005-10-10 |
| US7547535B2 (en) | 2009-06-16 |
| CN1288246C (zh) | 2006-12-06 |
| US20040005683A1 (en) | 2004-01-08 |
| EP1332216B1 (en) | 2011-08-17 |
| CA2427029A1 (en) | 2002-05-02 |
| CN1578836A (zh) | 2005-02-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2427029C (en) | Variants of soluble pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase | |
| KR101168623B1 (ko) | 피롤로퀴놀린 퀴논 의존 가용성 글루코오스 탈수소효소의 개선된 돌연변이체 | |
| CA2581226C (en) | Thermostable mutants of pyrroloquinoline quinone dependent glucose dehydrogenase | |
| AU2002215966A1 (en) | Variants of soluble pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase | |
| KR20150025898A (ko) | 효모에 내산성을 부여하는 폴리펩티드, 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그 양이 증가되어 있는 효모 세포, 상기 효모 세포를 이용한 산물의 생산 방법 및 내산성 효모 세포를 생산하는 방법 | |
| KR100879491B1 (ko) | 아미노산 삽입을 포함하는 유전자 엔지니어링된피롤로퀴놀린 퀴논 의존성 글루코오스 디히드로게나아제 | |
| KR101831121B1 (ko) | 피리피로펜 생합성 유전자 클러스터 및 표지 유전자를 포함하는 핵산 구성체 | |
| US6387683B1 (en) | Recombinant yeast PDI and process for production thereof | |
| CN115605589A (zh) | 改进的用于生产类异戊二烯的方法 | |
| CN113151130A (zh) | 一种基因工程菌及其在生物转化甲烷制备异丁醇中的应用 | |
| CN113462701B (zh) | 一种高温多酚氧化酶及其在含酚废水处理中的应用 | |
| JP2000014388A (ja) | 組換えｃｒｐおよびその製造方法 | |
| JP3013711B2 (ja) | 変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとその遺伝子及びアミノ酸の製造方法 | |
| AU2006201542A1 (en) | Variants of soluble pyrroloquinoline quinone-dependent glucose dehydrogenase |