CN113462701B

CN113462701B - 一种高温多酚氧化酶及其在含酚废水处理中的应用

Info

Publication number: CN113462701B
Application number: CN202111029242.XA
Authority: CN
Inventors: 邱建贺; 翁雯; 梁锡伟; 周国彪; 易旭超
Original assignee: Foshan City Yuhuang Ecological Environment Science And Technology Co ltd
Current assignee: Yuhuang Ecological Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2021-09-03
Filing date: 2021-09-03
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2041-09-03
Also published as: CN113462701A

Abstract

本发明公开了一种多酚氧化酶YHL21的基因及多肽序列，该多酚氧化酶由基因拼接和酶性能的高通量筛选后确认，具有耐温域广，高温催化性能强，功能酶由单一肽段构建，易于膜固定化等优点。本发明还公布了多酚氧化酶YHL21在枯草芽孢杆菌菌株168中开展重组表达及分泌生产的方法，以及一种利用聚偏氟乙烯（PVDF）膜进行膜表面固定化重组多酚氧化酶的方法，该膜酶复合体系可稳定高效地降解水溶液中的苯酚、对氯苯酚等有机物。本发明通过基因拼接开展酶工程优化，得到了一种高效的酚类污染物降解的多酚氧化酶，利用枯草芽孢杆菌进行了重组分泌表达，并利用PVDF进行了酶的固定化，提升了酶的催化效率。

Description

一种高温多酚氧化酶及其在含酚废水处理中的应用

技术领域

本发明属于环境生物技术应用领域，具体涉及一种高温多酚氧化酶及其在含酚类污染物的废水处理中的应用。

背景技术

多酚氧化酶，是一种含铜离子的氧化酶，它首先是从生多酚氧化固化的活性物质中分离出来，因此也称为多酚氧化酶 ( Laccase)。多酚氧化酶可由各种细胞合成，植物、动物、细菌及其真菌均可产生多酚氧化酶，其氧化的底物对象十分广谱，可超过数百种不同结构或类型的复杂有机物，因此被广泛用于食品、造纸、纺织、工业催化、污染物处理等领域。

食品工业中，多酚氧化酶可用于处理酒类果汁中芳胺及酚类物质的致浑现象，提高这些饮品的口感和透明度；在造纸行业，多酚氧化酶通过降解木质素的结构域，可大大减少传统工艺的造纸废水及制浆漂白后纸张的拉伸强度；在印染纺织行业，多酚氧化酶主要用于染色织物的生物酶洗、印染废水中苯胺类物质的降解脱除和棉织物的仿旧整理，以酶洗工艺替代传统的皂洗工艺，从而提高纺织品的湿处理牢度，降低残液的色度。此外，印刷行业、农业有机农药、化学合成等行业产生的大量结构不一的酚类污染物也是多酚氧化物的降解对象，这些化合物结构稳定，毒性极强，极低浓度就可产生极大的生物危害，且污染物收集并集中处理的成本很高。而多酚氧化酶可以对多种染料进行脱色降解，对包括苯酚、二氯酚、氯酚等有机物进行高效地降解，其广谱的降解功能备受关注。

真菌来源的多酚氧化酶因发现早、表达量大，前期成为工业应用的热点研究对象。但是真菌来源的酶相比细菌同源酶，存在几处主要的应用缺陷。1）其蛋白易被糖基化修饰，不利于利用基因工程细菌开展发酵生产；2）真菌酶的催化最适pH值偏向酸性，而细菌来源酶则更为广谱，中性和碱性环境下催化效果更佳，适合工业污染物的处理；3）极端细菌的分布更广，容易发现一些耐性能较佳的工业应用酶，而真菌酶的耐温性较差，目前应用中的多酚氧化酶多为常温酶类。此外，自然存在的多酚氧化酶表达量低，催化性能通常为了微生物自身的应激反应或营养需求，酶活较低，因此，为了能够提升多酚氧化酶的应用价值，需要从环境中发掘基因资源，并进行随机或定向的酶工程优化，从而开发出易于固定化，加强了催化性能的工业级重组多酚氧化酶。

发明内容

为了获得耐温性好、pH域值宽、底物种类广、催化效率高的多酶氧化酶，用于水体中酚类及其它污染物的降解，本发明基于宏基因组资源，获取了一种含有古菌多酚氧化酶编码DNA的突变蛋白，利用枯草芽孢杆菌开展了重组生产，并提供了酶的膜表面固定化和污染物降解应用的方法，可以极大地提升多酚氧化酶对水体中污染物的降解效率。

为了实现上述目的以及其它相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，公布一种多酚氧化酶YHL21的基因及多肽序列。

所述YHL21的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基酸序列为SEQ IDNO.4所示。该多酚氧化酶由基因拼接和酶突变株的高通量筛选后确认，具有耐温域广，高温催化性能强，功能酶由单一肽段构建，易于膜固定化等优点。

本发明的第二方面提供了所述多酚氧化酶YHL21在枯草芽孢杆菌菌株168中开展重组表达及分泌生产的方法。

具体的，采用芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌菌种Bacillu subtilis 168生产重组多酚氧化酶时，包括步骤：将枯草芽孢杆菌菌种Bacillu subtilis 168作为宿主细胞，进行转化、发酵培养，收集细胞培养上清，并分离获得游离的多酚氧化酶。

进一步地，将质粒pMK-YHL21转化至枯草芽孢杆菌菌种Bacillu subtilis 168的细胞中，获得含有质粒的重组枯草芽孢杆菌，将该重组枯草芽孢杆菌用于表达多酚氧化酶。

进一步地，将含有表达质粒pMK-YHL21的枯草芽孢杆菌菌种Bacillu subtilis 168质粒进行摇瓶或发酵罐培养，在培养结束时，收集上清分泌物，获得游离的多酚氧化酶。

进一步地，将分离的含有多酚氧化酶的上清用于含苯酚及对氯苯酚的污染物的降解，重组表达生产的YHL21可高效地降解相应的有机污染物。

所述质粒pMK-YHL21的序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明的第三方面提供了一种利用聚偏氟乙烯（以下简称为PVDF）膜进行膜表面固定化重组多酚氧化酶的方法，该膜酶复合体系可稳定高效地降解水溶液中的苯酚、对氯苯酚等有机物。

所述的重组多酚氧化酶为表达于枯草芽孢杆菌菌种Bacillu subtilis 168的YHL21。

进一步地，所述方法包括：测定重组表达的YHL21的浓度后，以10毫克重组蛋白YHL21每平方分米的PVDF膜的比例进行酶-膜的固定化，常温下完成酶-膜的结合与固定化。

进一步地，所述方法包括：将结合了10毫克重组蛋白YHL21的PVDF膜置于含有有机污染物的水体中，开展污染物的降解、固定化酶的降解性能及稳定的测定。

进一步地，所述的污染物种类包括苯酚、对氯苯酚。

进一步地，所述的测定溶液的反应温度为30℃-80℃。

进一步地，所述的苯酚或对氯苯酚的浓度为5 mg/L-200 mg/L。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过基因拼接开展酶工程优化，得到了一种高效的酚类污染物降解的多酚氧化酶，利用枯草芽孢杆菌进行了重组分泌表达，并利用PVDF进行了酶的固定化，提升了酶的催化效率。为水体酚类化合物的降解进行了提供了酶来源的生产方法，也提供了多酚氧化酶的催化应用方法。

本发明中所用的枯草芽孢杆菌菌种Bacillu subtilis 168的来源信息如下：

菌株名称：Bacillu subtilis 168

原始来源： ATCC ® Catalog No. 23857™。

附图说明

图1为质粒pMK-YHL21的结构示意图。

图2为酶工程操作后发现的5株具有酶活的突变体的活性测定结果。

图3为多酚氧化酶重组表达后的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。

图4为膜固定化及游离YHL21对苯酚及对氯苯酚的降解。

具体实施方式

本发明具体实施方式有以下理解，即，本发明的保护范围不局限于下列所述特定的具体实施方案；本发明实施例中所用术语是为了描述特定的具体实施方案，而非为了限制本发明的保护范围；下列所述实施例中未注明的其它试验方法或实验条件，按照各制造商所建议的实施方法。

实施例中给出相应的数值范围时，应理解为，除非另有所述的说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。进一步，除非另有定义，本发明中使用的相应的技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。此外，除了实施例中公开的具体方法、设备、材料及使用条件外，根据本技术领域的技术人员对相应技术的掌握及本发明公开的记载，还可以使用与以下发明实施例中所述的方法、设备、材料及使用条件类同或等同的涉及本技术的其它方法、设备和材料来实现本发明。

除非另有说明，本发明中所公开的实验方法、条件、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、微生物学、生物化学、分析化学、蛋白质研究、发酵培养、重组表达等技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING ：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989 and Third edition，2001 ；METHODS IN ENZYMO- LOGY，Vol.304，Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，SanDiego，1999；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley &Sons，New York，1987 and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego ；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Thirdedition，Academic Press，San Diego，1998 ；METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols (P.B.Becker，ed.) Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 多酚氧化酶的拼接突变及多酚氧化酶突变株的筛选

1）多酚氧化酶基因的拼接

以来自环境土壤样品宏基因组为DNA模板，利用设计的多酚氧化酶引物进行扩增，所述引物分别为SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2， PCR扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳，将条带大小为1200-2000 bp之间的DNA产物切胶，并利用试剂盒进行DNA回收，再利用分子生物学技术将截取的PCR产物池（DNA pool）连接到Thermo Fisher pET101 Topo质粒系统中，然后转化到大肠杆菌BL21-DE3中，涂板，过夜生长，得到具有抗性的阳性克隆；挑取20个左右的大肠杆菌单克隆，接种到3毫升液体培养基中，利用过夜培养的大肠杆菌细胞进行质粒提取。提取的质粒通过XmaI酶切鉴定出阳性克隆。再将得到的阳性克隆混合，加入XmaI 和BamH I进行DNA酶切，同时加入0.01 U的Tsp509I (NEB内切酶)，37℃酶切约1小时，然后65℃灭活 20 min，再加入T4 DNA 连接酶，常温处理1小时，将连接液转化到大肠杆菌BL21-DE3中，涂板，过夜生长，得到具有抗性的阳性克隆。

2）多酚氧化酶拼接基因的表达及酶活测定

挑取288个得到的阳性克隆，分别接种到LB液体培养基（每升含有10 克NaCl，10克胰蛋白胨，5克酵母提取物）中，细胞密度在1.0左右时，加入１mM IPTG进行蛋白表达的诱导，16℃, 24小时，细胞破碎取上清进行多酚氧化酶性能的鉴定。活性的测定以ABTS为底物，多酚氧化酶和2,2′-连氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）发生反应时生成的阳性自由基在420nm处有最大吸收峰，利用酶标仪检测多酚氧化酶与底物反应 3min 前后的吸光度来计算多酚氧化酶酶活。以下2,2′-连氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）取其英文简称，即ABTS，取100 μl 含酶的裂解上清，100 μl 1.0mol/L ABTS以及200 μl 0.1 M 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；酶活（U/L) 计算公式为：酶活=10⁶ ×V_总×Δ_OD/(ε×V_酶×Δt×d），ε为ABTS吸光系数 36000 L/(mol·cm)， V总代表多酚氧化酶酶活测定反应体系的总体积，V酶代表添加酶液的体积，d 为检测液体光径， t 为反应时间，将每分钟催化 1.0 μmol/L 底物氧化所需的酶量定义为一个酶活力单位。从挑取的30个克隆中，约有5株阳性克隆菌中产生的多酚氧化酶突变体具有明显的多酚氧化酶活性，由图2可见，其中1株的产生的多酚氧化酶突变体的酶学活性为其余4株的酶的催化活性的10倍以上，来自该株的多酚氧化酶突变体被定义为YHL21。

３）YHL21的DNA序列鉴定

提取表达质粒，对插入的DNA片断进行序列测定，拼接完成后的序列如SEQ IDNO.3所示。

其所编码的多肽序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：

Mkkllvgtilagvvaigaacsnstshssmqghdmsnmniekenttkysskqlplatktkvlsgkefyltakeallqindkvklpvytyngsvpgpqirvkqgdrviihfkndlpepttihwhgypvpnsqdgypeawfskdfeqtgpyfkrevyhypnqqrgailwyhdhamaltrlnvyaglvgayiihdpkekrlklpsdeydvpllitdrainedgslfypsapenpspslpnpsivpafcgetiltingkaypdtaplfvrygervrirlgnvsmdshpmhfhghdfivtavdgnpipmmarlkrntinvapgetwnieflannpgnwvfhchkphhttnahamggmggmltviryarlfs。

实施例2 多酚氧化酶的枯草芽孢杆菌的重组表达

为了降低多酚氧化酶的表达和纯化成本，通常可以将外源蛋白导入微生物宿主细胞进行分泌表达，常用的分泌型细菌表达宿主主要有枯草芽孢杆菌。为此，对编码多酚氧化酶YHL21的DNA序列SEQ ID NO.3进行密码子优化，得到优化后的YHL21基因序列如SEQ IDNO.5所示。该DNA片段与用于枯草芽孢杆菌重组表达的PxylA启动子片段进行融合，得到完整的表达阅读框（SEQ ID NO.6）。SEQ ID NO.6所示的序列经基因合成，再通过Eco RI酶切后插入质粒pMK4中，得到表达质粒pMK-YHL21，其序列SEQ ID NO.7。构建的重组表达质粒转化到枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168中，筛选得到重组菌株168/pMK-YHL21。质粒pMK-YHL21示意图如图1所示。

实施例3 重组多酚氧化酶的重组生产、固定化及人工含酚废水的降解

以重组菌株168/pMK-YHL21，开展摇瓶培养：用接种环挑取枯草芽孢杆菌菌株168/pMK-YHL21，接种到装3 ml LB的试管，37 ℃，200 r/min 摇床过夜培养。将过夜培养的生产菌以1%的接种量接种到装有100 mL液体LB培养基的500 mL摇瓶中，培养基中加1 g/L的木糖、50 ul的100 μg/ml 的氨苄抗生素以及终浓度为0.1 mM 的CuSO₄ 溶液，保持微耗氧过程 220 r/min 振荡培养 72 h进行发酵培养。培养后期补加10 g/L (NH₄)₂PO₄以及 10 g/L甘油。发酵后离心分离细胞和上清，发酵过程中每12 h取样进行酶活测定，测定方法见实施例1。发酵上清取5 μl 作为样品开展聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图3中（A）所示，相比没有木糖诱导的发酵培养，木糖高效地诱导表达了多酚氧化酶的合成，并分泌到胞外，而由于YHL21的肽段缺乏明显的分泌信号肽，因此可能是枯草芽孢杆菌的非经典分泌方式介导了重组蛋白的分泌生产。

为了有效地将YHL21固定到PVDF膜表面，并用于污染物的降解，首先将膜内置于聚丙烯四通组件中，该组件内置约1平方分米的PVDF膜，连接蠕动泵后，将10 mg左右的含有YHL21的液体样品（约50毫升）以10毫升/分钟的速度循环通过自制组件，如图3中（B）所示，约20分钟后，检测流出液中的蛋白浓度和酶活，确认绝大多数的多酚氧化酶已结合至组件内的膜上。利用完成的膜-酶组件和含有10毫克的游离的重组酶组份，对1升分别含有或对氯苯酚的模拟污水进行降解性能检测，检测中以20毫升/分钟的速度循环通过自制组件，结果如图4所示，膜结合的四通组件能够在4小时内持续稳定的降解苯酚，如图4所示，在4 h左右，固定化的酶可以将50 mg/L的苯酚经循环处理，降解至8.4 mg/L；而50 mg/L的对氯苯酚经循环处理，降解至4.4 mg/L，降解率超过90%；相比之下，游离酶只在初始的1.0-1.5小时内可以有效地催化，之后便基本失去降解功能。因此，PVDF膜对多酚氧化酶的固定化可以大大提高酶的稳定性和降解效率。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 佛山市玉凰生态环境科技有限公司

<120> 一种高温多酚氧化酶及其在含酚废水处理中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaanaaat tvcyggttgg aacaattt 28

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttangavaat aawcgggcat aac 23

<210> 3

<211> 1098

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaaaaaac tgctggttgg tactatcctg gctggcgttg ttgctatcgg tgcggcatgc 60

agcaacagca cctctcacag ctccatgcag ggccacgata tgagcaacat gaacattgaa 120

aaagaaaaca ccaccaaata ttcttctaaa caactgccgc tggcgactaa gaccaaagtt 180

ctgtccggta aagaattcta cctgaccgcg aaagaggcgc tgctgcagat caacgacaaa 240

gttaagctgc cggtttacac ttataacggc tctgttccag gcccgcagat ccgcgttaaa 300

caaggtgatc gcgtgattat ccatttcaaa aacgacctgc cggaaccgac gaccattcac 360

tggcacggtt acccagtccc gaactcccag gatggttacc cggaagcgtg gttctctaaa 420

gacttcgaac agaccggtcc gtacttcaaa cgtgaggttt accactaccc gaaccagcag 480

cgtggtgcca tcctgtggta ccacgatcac gccatggcac tgacccgtct gaacgtctac 540

gctggtctgg taggtgcgta tattattcac gacccgaaag aaaaacgcct gaaactgccg 600

tccgatgaat acgacgtgcc actgctgatt actgatcgtg ctatcaatga agacggctct 660

ctgttctacc cgagcgcccc agaaaacccg tccccttctc tgccgaaccc gagcatcgtt 720

ccggcattct gtggtgaaac cattctgacc atcaacggca aagcgtaccc ggatactgct 780

ccgctgtttg tccgttacgg tgaacgtgtg cgtattcgtc tgggtaacgt ttccatggat 840

agccacccga tgcacttcca cggtcacgat ttcattgtaa ctgctgttga tggcaacccg 900

atcccgatga tggctcgcct gaaacgtaac accattaacg tggcgccagg cgaaacctgg 960

aatattgagt tcctggcgaa caacccgggc aactgggtgt tccattgtca caaaccgcac 1020

cataccacca acgcacacgc gatgggtggt atgggtggta tgctgaccgt catccgttac 1080

gcccgtctgt tttcttaa 1098

<210> 4

<211> 365

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Lys Lys Leu Leu Val Gly Thr Ile Leu Ala Gly Val Val Ala Ile

1 5 10 15

Gly Ala Ala Cys Ser Asn Ser Thr Ser His Ser Ser Met Gln Gly His

20 25 30

Asp Met Ser Asn Met Asn Ile Glu Lys Glu Asn Thr Thr Lys Tyr Ser

35 40 45

Ser Lys Gln Leu Pro Leu Ala Thr Lys Thr Lys Val Leu Ser Gly Lys

50 55 60

Glu Phe Tyr Leu Thr Ala Lys Glu Ala Leu Leu Gln Ile Asn Asp Lys

65 70 75 80

Val Lys Leu Pro Val Tyr Thr Tyr Asn Gly Ser Val Pro Gly Pro Gln

85 90 95

Ile Arg Val Lys Gln Gly Asp Arg Val Ile Ile His Phe Lys Asn Asp

100 105 110

Leu Pro Glu Pro Thr Thr Ile His Trp His Gly Tyr Pro Val Pro Asn

115 120 125

Ser Gln Asp Gly Tyr Pro Glu Ala Trp Phe Ser Lys Asp Phe Glu Gln

130 135 140

Thr Gly Pro Tyr Phe Lys Arg Glu Val Tyr His Tyr Pro Asn Gln Gln

145 150 155 160

Arg Gly Ala Ile Leu Trp Tyr His Asp His Ala Met Ala Leu Thr Arg

165 170 175

Leu Asn Val Tyr Ala Gly Leu Val Gly Ala Tyr Ile Ile His Asp Pro

180 185 190

Lys Glu Lys Arg Leu Lys Leu Pro Ser Asp Glu Tyr Asp Val Pro Leu

195 200 205

Leu Ile Thr Asp Arg Ala Ile Asn Glu Asp Gly Ser Leu Phe Tyr Pro

210 215 220

Ser Ala Pro Glu Asn Pro Ser Pro Ser Leu Pro Asn Pro Ser Ile Val

225 230 235 240

Pro Ala Phe Cys Gly Glu Thr Ile Leu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Tyr

245 250 255

Pro Asp Thr Ala Pro Leu Phe Val Arg Tyr Gly Glu Arg Val Arg Ile

260 265 270

Arg Leu Gly Asn Val Ser Met Asp Ser His Pro Met His Phe His Gly

275 280 285

His Asp Phe Ile Val Thr Ala Val Asp Gly Asn Pro Ile Pro Met Met

290 295 300

Ala Arg Leu Lys Arg Asn Thr Ile Asn Val Ala Pro Gly Glu Thr Trp

305 310 315 320

Asn Ile Glu Phe Leu Ala Asn Asn Pro Gly Asn Trp Val Phe His Cys

325 330 335

His Lys Pro His His Thr Thr Asn Ala His Ala Met Gly Gly Met Gly

340 345 350

Gly Met Leu Thr Val Ile Arg Tyr Ala Arg Leu Phe Ser

355 360 365

<210> 5

<211> 1098

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaaaaaat tgctggttgg aacaatttta gctggcgtgg tggcaattgg cgcagcatgt 60

tcaaatagca caagccatag ctctatgcag ggccacgata tgtccaatat gaatatcgaa 120

aaagaaaata caacaaagta cagcagtaaa caactcccgt tagctacgaa aacaaaagtt 180

ttatcgggaa aagatttcta tttaaccgct aaagaagccc tcctgcagat caatgataag 240

gtcaagttac ctgtttatac gtataatggc tcagtccctg ggcctcagat tcgggtaaag 300

caaggcgacc gtgttattat ccacttcaaa aacgatcttc cggaaccgac gacaatccat 360

tggcacggat atccagtacc aaattcacaa gatggatatc ctgaagcttg gttctctaaa 420

gactttgaac aaacaggtcc atattttaaa cgcgaagtct atcactatcc gaatcagcaa 480

agaggtgcga tcttatggta ccacgatcat gctatggcac ttacccgcct taatgtgtac 540

gcgggattgg tgggagcgta tataatacat gatccgaaag aaaagagatt gaaactgcca 600

agcgatgaat acgatgtgcc gcttcttatt acggaccgcg caattaacga agatggctct 660

ctcttttatc cgtcagcacc ggaaaatcct agcccttcat tgccgaaccc atcaatagtt 720

ccagcctttt gtggagaaac aatcttaacc attaatggca aagcctatcc ggatacggca 780

cctctcttcg tgcgatatgg agaaagagtc cgtatccggt taggaaatgt cagcatggat 840

tcacatccga tgcatttcca tggccatgat tttattgtta ctgccgtgga tggcaacccg 900

atccctatga tggcgcggtt gaagcggaac acgattaatg ttgctcctgg agaaacgtgg 960

aatattgaat ttctggccaa taatccgggg aactgggttt ttcattgcca taagccgcat 1020

catacgacta atgcccatgc gatgggtggg atggggggaa tgttgacagt gattcgttat 1080

gcccggttat tttcttaa 1098

<210> 6

<211> 1282

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaattctaga atctaatatt ataactaaat tttctaaaaa aaacattgga atagacattt 60

attttgtata tgatgaaata aagttagttt attggataaa caaactaact ttattaaggt 120

agttgatgga taaacttgtt cacttaaatc aacccgggaa caaggaggaa taaaaaatga 180

aaaaattgct ggttggaaca attttagctg gcgtggtggc aattggcgca gcatgttcaa 240

atagcacaag ccatagctct atgcagggcc acgatatgtc caatatgaat atcgaaaaag 300

aaaatacaac aaagtacagc agtaaacaac tcccgttagc tacgaaaaca aaagttttat 360

cgggaaaaga attctattta accgctaaag aagccctcct gcagatcaat gataaggtca 420

agttacctgt ttatacgtat aatggctcag tccctgggcc tcagattcgg gtaaagcaag 480

gcgaccgtgt tattatccac ttcaaaaacg atcttccgga accgacgaca atccattggc 540

acggatatcc agtaccaaat tcacaagatg gatatcctga agcttggttc tctaaagact 600

ttgaacaaac aggtccatat tttaaacgcg aagtctatca ctatccgaat cagcaaagag 660

gtgcgatctt atggtaccac gatcatgcta tggcacttac ccgccttaat gtgtacgcgg 720

gattggtggg agcgtatata atacatgatc cgaaagaaaa gagattgaaa ctgccaagcg 780

atgaatacga tgtgccgctt cttattacgg accgcgcaat taacgaagat ggctctctct 840

tttatccgtc agcaccggaa aatcctagcc cttcattgcc gaacccatca atagttccag 900

ccttttgtgg agaaacaatc ttaaccatta atggcaaagc ctatccggat acggcacctc 960

tcttcgtgcg atatggagaa agagtccgta tccggttagg aaatgtcagc atggattcac 1020

atccgatgca tttccatggc catgatttta ttgttactgc cgtggatggc aacccgatcc 1080

ctatgatggc gcggttgaag cggaacacga ttaatgttgc tcctggagaa acgtggaata 1140

ttgaatttct ggccaataat ccggggaact gggtttttca ttgccataag ccgcatcata 1200

cgactaatgc ccatgcgatg ggtgggatgg ggggaatgtt gacagtgatt cgttatgccc 1260

ggttattttc ttaaatgaat tc 1282

<210> 7

<211> 6861

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcttgg 240

ctgcaggtcg acggatcccc gggaattcta gaatctaata ttataactaa attttctaaa 300

aaaaacattg gaatagacat ttattttgta tatgatgaaa taaagttagt ttattggata 360

aacaaactaa ctttattaag gtagttgatg gataaacttg ttcacttaaa tcaacccggg 420

aacaaggagg aataaaaaat gaaaaaattg ctggttggaa caattttagc tggcgtggtg 480

gcaattggcg cagcatgttc aaatagcaca agccatagct ctatgcaggg ccacgatatg 540

tccaatatga atatcgaaaa agaaaataca acaaagtaca gcagtaaaca actcccgtta 600

gctacgaaaa caaaagtttt atcgggaaaa gaattctatt taaccgctaa agaagccctc 660

ctgcagatca atgataaggt caagttacct gtttatacgt ataatggctc agtccctggg 720

cctcagattc gggtaaagca aggcgaccgt gttattatcc acttcaaaaa cgatcttccg 780

gaaccgacga caatccattg gcacggatat ccagtaccaa attcacaaga tggatatcct 840

gaagcttggt tctctaaaga ctttgaacaa acaggtccat attttaaacg cgaagtctat 900

cactatccga atcagcaaag aggtgcgatc ttatggtacc acgatcatgc tatggcactt 960

acccgcctta atgtgtacgc gggattggtg ggagcgtata taatacatga tccgaaagaa 1020

aagagattga aactgccaag cgatgaatac gatgtgccgc ttcttattac ggaccgcgca 1080

attaacgaag atggctctct cttttatccg tcagcaccgg aaaatcctag cccttcattg 1140

ccgaacccat caatagttcc agccttttgt ggagaaacaa tcttaaccat taatggcaaa 1200

gcctatccgg atacggcacc tctcttcgtg cgatatggag aaagagtccg tatccggtta 1260

ggaaatgtca gcatggattc acatccgatg catttccatg gccatgattt tattgttact 1320

gccgtggatg gcaacccgat ccctatgatg gcgcggttga agcggaacac gattaatgtt 1380

gctcctggag aaacgtggaa tattgaattt ctggccaata atccggggaa ctgggttttt 1440

cattgccata agccgcatca tacgactaat gcccatgcga tgggtgggat ggggggaatg 1500

ttgacagtga ttcgttatgc ccggttattt tcttaaatga attcactggc cgtcgtttta 1560

caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc 1620

cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg 1680

cgcagcctga atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 1740

atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc 1800

cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca 1860

tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg 1920

tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat 1980

gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga 2040

acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 2100

ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt 2160

gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg 2220

ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg 2280

gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg 2340

agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag 2400

caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca 2460

gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg 2520

agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc 2580

gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg 2640

aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg 2700

ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac 2760

tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg 2820

tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg 2880

gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact 2940

atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa 3000

ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 3060

aaaaggatct aggtgaagat ccatatcctt ctttttctga accgacttct cctttttcgc 3120

ttctttattc caattgcttt attgacgttg agcctcggaa cccttaacaa tcccaaaact 3180

tgtcgaatgg tcggcttaat agctcacgct atgccgacat tcgtctgcaa gtttagttaa 3240

gggttcttct caacgcacaa taaattttct cggcataaat gcgtggtcta atttttattt 3300

ttaataacct tgatagcaaa aaatgccatt ccaatacaaa accacatacc tataatcgat 3360

aaccacataa cagtcataaa accactcctt tttaacaaac tttatcacaa gaaatattta 3420

aattttaaat gcctttattt tgaattttaa ggggcatttt aaagatttag gggtaaatca 3480

tatagtttta tgcctaaaaa cctacagaag cttttaaaaa gcaaatatga gccaaataaa 3540

tatattctaa ttctacaaac aaaaatttga gcaaattcag tgtcgatttt ttaagacact 3600

gcccagttac atgcaaatta aaattttcat gattttttat agttcctaac agggttaaaa 3660

tttgtataac gaaagtataa tgtttatata acgttagtat aataaagcat tttaacatta 3720

tacttttgat aatcgtttat cgtcgtcatc acaataactt ttaaaatact cgtgcataat 3780

tcaacagctg acctcccaat aactacatgg tgttatcggg aggtcagctg ttagcactta 3840

tattttgtta ttgttcttcc tcgatttcgt ctatcatttt gtgattaatt tctctttttt 3900

cttgttctgt taagtcataa agttcactag ctaaatactc tttttgtttc caaatataaa 3960

aaatttgata gatatattcg gttggatcaa tttcttttaa gtaatctaaa tccccatttt 4020

ttaatttctt tttagcctct ttaaataatc ctgaataaac taatacctgt ttacctttaa 4080

gtgatttata aaatgcatca aagacttttt gatttattaa ataatcacta tctttaccag 4140

aatacttagc catttcatat aattctttat tattattttg tcttattttt tgaacttgaa 4200

cttgtgttat ttctgaaatg cccgttacat cacgccataa atctaaccat tcttgttggc 4260

taatataata tcttttatct gtgaaatacg atttatttac tgcaattaac acatgaaaat 4320

gaggattata atcatctctt tttttattat atgtaatctc taacttacga acatatccct 4380

ttataacact acctactttt tttctcttta taagttttct aaaagaatta ttataacgtt 4440

ttatttcatt ttctaattca tcactcatta cattaggtgt agtcaaagtt aaaaagataa 4500

actccttttt ctcttgctgc ttaatatatt gcatcatcaa agataaaccc aatgcatctt 4560

ttctagcttt tctccaagca cagacaggac aaaatcgatt tttacaagaa ttagctttat 4620

ataatttctg tttttctaaa gttttatcag ctacaaaaga cagaaatgta ttgcaatctt 4680

caactaaatc catttgattc tctccaatat gacgtttaat aaatttctga aatacttgat 4740

ttctttgttt tttctcagta tacttttcca tgttataaca cataaaaaca acttagtttt 4800

cacaaactat gacaataaaa aaagttgctt tttccccttt ctatgtatgt tttttactag 4860

tcatttaaaa cgatacatta ataggtacga aaaagcaact ttttttgcgc ttaaaaccag 4920

tcataccaat aacttaaggg taactagcct cgccggcaat agttaccctt attatcaaga 4980

taagaaagaa aaggattttt cgctacgctc aaatccttta aaaaaacaca aaagaccaca 5040

ttttttaatg tggtctttta ttcttcaact aaagcaccca ttagttcaac aaacgaaaat 5100

tggataaagt gggatatttt taaaatatat atttatgtta cagtaatatt gacttttaaa 5160

aaaggattga ttctaatgaa gaaagcagac aagtaagcct cctaaattca ctttagataa 5220

aaatttagga ggcatatcaa atgaacttta ataaaattga tttagacaat tggaagagaa 5280

aagagatatt taatcattat ttgaaccaac aaacgacttt tagtataacc acagaaattg 5340

atattagtgt tttataccga aacataaaac aagaaggata taaattttac cctgcattta 5400

ttttcttagt gacaagggtg ataaactcaa atacagcttt tagaactggt tacaatagcg 5460

acggagagtt aggttattgg gataagttag agccacttta tacaattttt gatggtgtat 5520

ctaaaacatt ctctggtatt tggactcctg taaagaatga cttcaaagag ttttatgatt 5580

tatacctttc tgatgtagag aaatataatg gttcggggaa attgtttccc aaaacaccta 5640

tacctgaaaa tgctttttct ctttctatta ttccatggac ttcatttact gggtttaact 5700

taaatatcaa taataatagt aattaccttc tacccattat tacagcagga aaattcatta 5760

ataaaggtaa ttcaatatat ttaccgctat ctttacaggt acatcattct gtttgtgatg 5820

gttatcatgc aggattgttt atgaactcta ttcaggaatt gtcagatagg cctaatgact 5880

ggcttttata atatgagata atgccgactg tactttttac agtcggtttt ctaatgtcac 5940

taacctgccc cgttagttga agaaggtttt tatattacag ctccagatct aggtgaagat 6000

cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 6060

agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 6120

ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 6180

accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct 6240

tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 6300

cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 6360

gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 6420

gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 6480

gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 6540

cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 6600

tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 6660

ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 6720

ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat 6780

taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc 6840

agtgagcgag gaagcggaag a 6861

Claims

1.一种经基因拼接改造获得的用于表达多酚氧化酶YHL21的核苷酸，其特征在于，多酚氧化酶YHL21的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。

2.多酚氧化酶YHL21，其特征在于，所述多酚氧化酶YHL21的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.权利要求1所述的多酚氧化酶YHL21的核苷酸的用途，其特征在于，所述用途是将SEQID NO.5所示的核苷酸与启动子序列经基因合成构成如SEQ ID NO.6所示的表达序列，并构建到表达质粒中形成重组表达质粒转入宿主菌中表达。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述重组表达质粒为pMK-YHL21，重组表达质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，将重组表达质粒转入宿主菌枯草芽孢杆菌中以构建生产多酚氧化酶YHL21的重组菌株。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述宿主菌枯草芽孢杆菌为Bacillussubtilis 168。

7.如权利要求5所述的多酚氧化酶YHL21的重组菌株的发酵生产方法，其特征在于，在基础培养基中加入10g/L的木糖及10g/L甘油，及0.1mM的CuSO₄溶液，保持微耗氧发酵培养，培养后期补加10g/L(NH₄)₂PO₄。

8.一种固定化权利要求1所述的多酚氧化酶YHL21的方法，其特征在于，所述方法利用聚偏氟乙烯(PVDF)膜与重组多酚氧化酶YHL21的天然结合能力在膜表面进行酶的固定化。

9.重组多酚氧化酶在苯酚或对氯苯酚生物降解中的用途，其特征在于，所述重组多酚氧化酶为多酚氧化酶YHL21，编码所述多酚氧化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.5所示。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述多酚氧化酶按照权利要求8所述方法固定化。