CN112195190B - 来源于贝莱斯芽孢杆菌质粒的复制元件及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了来源于贝莱斯芽孢杆菌质粒的复制元件及其应用。本发明首先提供了从贝莱斯菌株内生性质粒中分离鉴定质粒的复制元件，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明进一步将从贝莱斯菌株内生性质粒中分离鉴定质粒的复制元件应用于构建芽孢杆菌表达系统，将外源基因在芽孢杆菌中进行高效表达；进一步的，本发明提供了一种芽孢杆菌表达载体，包括启动子、在芽孢杆菌中进行自主复制的复制元件、在大肠杆菌中进行自主复制的复制元件以及在芽孢杆菌中表达的外源基因。应用本发明提供的复制元件能够介导外源基因在芽孢杆菌中高拷贝复制并高强度表达。

Description

来源于贝莱斯芽孢杆菌质粒的复制元件及其应用

技术领域

本发明涉及构建芽孢杆菌高效表达系统的元件，尤其涉及来源于贝莱斯芽孢杆菌内生性质粒的用于构建芽孢杆菌高效表达系统的复制元件，属于芽孢杆菌表达系统的复制元件及其应用领域。

背景技术

芽孢杆菌属细菌因可形成抗逆性极强的内生孢子而在自然界中广泛分布，其中，杆菌枯草芽抱杆菌作为GARS（Generally Recognized as Safe）菌种之一，被广泛应用于食品、饲料等多个领域，有着巨大的经济、社会效益和生态效益（张慧等人，2019，热带植物学报，40：995–1001）。同时，枯草芽孢杆菌作为一个优良细胞工厂，能高效生产应用领域较广的酶蛋白（如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶）（余晓霞等人，2015，生物技术通报，31：35–44），以枯草芽孢杆菌为宿主的蛋白表达系统是目前应用最广泛的表达系统之一。在枯草芽孢杆菌乃至芽孢杆菌的表达系统优化主要集中于高强度启动子挖掘和分泌信号肽筛选，诸多性能优异的启动子如P₄₃、P_sacB、P_xyl等相继被挖掘（余晓霞等人，2015，生物技术通报，31：35–44）。相对于启动子的多样性而言，用于构建芽孢杆菌表达载体的复制元件较为匮乏。研究表明，大部分枯草芽孢杆菌不含有内源性质粒，目前枯草芽孢杆菌表达系统的表达载体主要由葡萄球菌和链球菌内源性质粒（包括pUB110、pC194、pE194和 pT181）改造而来（Yang等人，2006，Biotechnology Letters，28：1713–1718；Kunst等人，1997，Nature，390：249–256），因此，深入挖掘可在芽孢杆菌中行使复制功能的元件有着重要现实需求和应用前景。

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）为厚壁菌门、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、芽孢杆菌属，是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，具有抗菌谱广、生长迅速、易分离培养、抗逆性强和生物安全性高等优点，在众多行业中被广泛应用。贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌亲缘性很高，贝莱斯芽孢杆菌来源的质粒及其复制元件在枯草芽孢杆菌中往往具有生物学功能。据报道，80%贝莱斯菌株中不含有内生性质粒（Grady等人，2019，BMC Microbiology，19：5）。因此，如果能够从贝莱斯菌株中发现内生性质粒并一步分离鉴定质粒复制的元件对于构建贝莱斯芽孢杆菌乃至芽孢杆菌高效表达系统均具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一是从贝莱斯菌株中发现内生性质粒并一步分离鉴定质粒的复制元件；

本发明的目的之二是将从贝莱斯菌株中分离鉴定的质粒复制元件应用于芽孢杆菌表达载体的复制元件。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先提供了从贝莱斯菌株内生性质粒中分离鉴定质粒的复制元件，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明进一步将从贝莱斯菌株内生性质粒中分离鉴定质粒的复制元件应用于构建芽孢杆菌表达系统，将目的基因在芽孢杆菌中进行高效表达；其中，所述的芽孢杆菌可以是枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌（B.sphaericus）等芽孢杆菌，优选为枯草芽孢杆菌或贝莱斯芽孢杆菌。

进一步的，本发明提供了一种芽孢杆菌表达载体，包括启动子、在芽孢杆菌中进行自主复制的复制元件(或复制子)、在大肠杆菌中进行自主复制的复制元件(或复制子)以及在芽孢杆菌中表达的目的基因；其中，该复制元件的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；应用该芽孢杆菌表达载体能够将目的基因在芽孢杆菌中进行高效表达。

本领域技术人员采用SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为复制元件，采用芽孢杆菌表达载体的常规构建方法即可构建得到将目的基因在宿主菌芽孢杆菌中进行高效表达的芽孢杆菌表达载体，将所述的表达载体转化到宿主菌芽孢杆菌后进行诱导，在芽孢杆菌中高拷贝复制并介导目的基因高强度表达。

本发明技术方案详述

一、贝莱斯芽孢杆菌质粒提取、鉴定、序列测定及复制元件分析

本发明首先从本发明人实验室保存的一株贝莱斯芽孢菌株NSZ-YBGJ001中提取得到质粒（命名为pBV01），将提取的质粒pBV01进行全序列测定，其全序列为SEQ ID NO.1所示（7276 bp）。在此基础上对质粒pBV01进行复制元件分析，通过序列比对，预测质粒含有7个CDS，其中包含rapA（天冬氨酸磷酸酶A）、repA（复制的蛋白质）、racA（DNA结合蛋白），其余4个基因所编码基因功能未能确定。在repA的起始密码子上游160 bp发现pC194质粒家族DSO（双链复制起始位点）特征序列（5- TCTTG/ATA-3），是rep蛋白起始质粒复制的酶切位点。rapA上游区域对非编码序列进行二级结构的分析发现五个能够形成茎环结构的区域，是SSO（单链复制起始位点）典型特征。

二、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌穿梭质粒构建

本发明以贝莱斯芽孢杆菌质粒模板、以BV-oriF和BV-repR为引物扩增质粒pBV01的复制元件（复制起点ori和复制蛋白repA），该复制元件的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；

以pEASY-Blunt simple为模板，以Blunt-F和Blunt-R为引物扩增该质粒复制元件（pUC origin和f1 origin）：以pBOL01为模板、以kanF5和kanR5为引物扩增含有启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段；以腾冲嗜热厌氧杆菌基因组为模板、以kanTF和kanTR为引物扩增终止子；以上述两个PCR产物为模板、以kanF、kanTR为引物，经Overlap-PCR构建卡那霉素抗性表达盒。采用的One Step Cloning Kit对三个DNA片段进行重组连接。将以上连接体系放于50℃金属浴中反应15 min，取出置于冰上冷却5 min后转化大肠杆菌感受态。在含有50µg/ml卡那霉素的LB培养基上筛选转化子。挑取阳性转化子并扩增后提取其中的质粒，命名为pEB01，质粒pEB01的全核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。

三、质粒pEB01在枯草芽孢杆菌中复制和应用

通过电击方法将质粒pEB01导入B. subtilisWB600感受态。转化后细胞涂布于含有25 µg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养后出现菌落。挑取上述菌接种于含有25 µg/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养，提取其中质粒。以质粒为模板、以BV-oriF和BV-repR为引物进行PCR验证，PCR产物大小与预期结果一致；以质粒提取试剂盒提取其中的质粒，进一步经琼脂糖凝胶电泳鉴定。试验结果表明，来源于贝莱斯芽孢杆菌内源质粒的复制元件可在B. subtilis行使生物学功能，该复制元件可用于枯草芽孢杆菌中质粒的构建，扩展了枯草芽孢杆菌中复制元件。

四、质粒pEB01介导的绿色蛋白基因gfp在枯草芽孢杆菌表达

以质粒F4-G-P43-R-pUBC19为模板、采用PGF和PGR为引物应用PCR扩增绿色蛋白基因gfp：PCR产物经Asc I和Pac I酶切，与经相同内切酶处理的质粒pEB01相连，构建质粒pEB01-gfp。质粒经电击导入B. subtilis WB600，获得含有pEB01-gfp的枯草芽孢杆菌株B. subtilis WB-gfp。菌株B. subtilis WB-gfp在LB培养基上培养时形成带有明显绿色荧光的菌落，表明绿色荧光蛋白基因gfp在B. subtilis WB-gfp中得以高强度表达。

试验结果说明质粒pEB01可在B. subtilis中高拷贝复制并介导目的基因高强度表达。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka等人, J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985); 和Cassol等人, (1992); Rossolini等人, Mol Cell. Probes8:91-98 (1994)）。

术语“可操作地连接”指两个或更多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，启动子区可以相对于编码感兴趣表达产物的核酸序列如此安置，从而所述核酸序列的转录由该启动子区指导。因此，启动子区“与该核酸序列可操作地连接”。

术语“转化”在此指的是用于将异源DNA 引入到细胞、组织的过程。

术语“转化”、“转基因”和“重组体”在此指的是其中已经被引入异源核酸分子的宿主细胞或生物体例如细菌或细胞。核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中，或者核酸分子也可以以染色体外分子的形式存在。这样一种染色体外分子可以是自我复制的。转化细胞、组织或植物被理解为不仅包括转化过程的终末产物，还包括其转基因子代。“未转化”、“未转基因”、或“未重组的”宿主指的是野生型生物体例如细菌或植物，它不包含异源核酸分子。

术语“启动子”指下述的任何核酸序列（如DNA序列）：这种序列在转录起始期间被DNA依赖性RNA聚合酶识别并（直接或间接）结合，导致生成与转录的DNA互补的RNA分子；这种区域也可以称作“5 '调节区”。启动子通常位于在待转录的编码序列前方存在的5 '非翻译区（UTR）的上游并且具有多个区域，这些区域充当RNA聚合酶II和其他蛋白质如转录因子的结合位点以引发可操作地连接的基因的转录。启动子本身可以含有调节可操作地连接的基因的转录的子元件（即启动子基序）如顺式元件或增强子结构域。该启动子和连接的5 'UTR也称作“启动子区”。

附图说明

图1为质粒pBV01琼脂糖凝胶电泳结果；泳道M：8 kb DNA Marker，泳道1：质粒pBV01。

图2为pBV01图谱。

图3为穿梭质粒pEB01转化B. subtilis WB600。

图4 为PCR验证B. subtilis WB600转化子。

图5为质粒pEB01琼脂糖凝胶电泳结果。

图6 为菌株B. subtilis WB-gfp在LB培养基上培养时菌落形态。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1贝莱斯芽孢杆菌质粒提取、鉴定、序列确定及复制元件分析

、贝莱斯芽孢杆菌质粒提取、鉴定

挑取在LB培养基（1% 蛋白胨，0.5% 酵母膏，0.5% NaCl， 1.5%琼脂；将培养基pH调至7.0，121℃高压灭菌20min）上划线过夜培养的单菌落接种于20 毫升液体LB培养基（1%蛋白胨，0.5% 酵母膏，0.5% NaCl；将培养基pH调至7.0，121℃高压灭菌20min）中，于37℃培养12~18小时，离心（12000g、2分钟）收集3 ml菌体。

本发明人实验室保存的一株贝莱斯芽孢菌株NSZ-YBGJ001（保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CGMCC No.14384）进行质粒提取，质粒提取参照质粒小提试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）方法，并略有改动。先用200微升溶液P1重悬菌体，加入50微升溶菌酶溶液（100毫克/毫升），于37度温孵20分钟。其余步骤参考试剂盒方法。质粒（命名为pBV01）琼脂糖凝胶电泳见图1。

、贝莱斯芽孢杆菌质粒序列确定

将提取的质粒pBV01分别以DNA内切酶（Swa I、SnaBI）切割，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的片段后连接至pEASY-Blunt Simple Cloning Vector（北京全式金生物技术有限公司），转化大肠杆菌Top10感受态，筛选阳性转化子后提取其中质粒。以载体上引物（M13F：5-GTAAAACGACGGCCAGT-3、M13R：5- CAGGAAACAGCTATGAC-3）测定插入序列。以已测定的DNA序列为模板设计测序引物、以提取的质粒为模板由生工生物工程（上海）股份有限公司进行质粒全序列测定，将测定测序组装，完成质粒测序，全序列为SEQ IDNO.1所示（7276 bp）。

、质粒复制元件分析

通过序列比对，预测质粒含有7个CDS，其中包含rapA（天冬氨酸磷酸酶A）、repA（复制的蛋白质）、racA（DNA结合蛋白），其余4个基因所编码基因功能未能确定（图2）。在repA的起始密码子上游160 bp发现pC194质粒家族DSO（双链复制起始位点）特征序列（5- TCTTG/ATA-3），是rep蛋白起始质粒复制的酶切位点。rapA上游区域对非编码序列进行二级结构的分析发现五个能够形成茎环结构的区域，是SSO（单链复制起始位点）典型特征。

实施例2 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌穿梭质粒构建

⑴ 以贝莱斯芽孢杆菌质粒模板、以下述引物扩增质粒的复制元件（复制起点ori和复制蛋白repA）（该复制元件的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示）；

BV-oriF：

5-GGCGCGCCATGCTCTAGTTTAATTAATTGTATTCATCTGAAAACGATTATA -3；

BV-repR：

5-AGTAAACTTGGTCTGACAGGACTTCTGGAAACTATTAGATAGAGG-3；

⑵ 以pEASY-Blunt simple为模板，以下述引物扩增该质粒复制元件（pUC origin和f1 origin）：

Blunt-F：5-CTGTCAGACCAAGTTTACTCATATA-3；

Blunt-R：5-GCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTG-3；

⑶ 以pBOL01（Liu等人，2012，Journal of Genetics and Genomics，39：561-570）为模板、以下述引物扩增含有启动子和卡那霉素抗性基因的DNA片段；

kanF5-CAGGATGAGGATCGTTTCGCGGTCTCTCACTCATCACCGCTACCACG-3；

kanR5-TCAAAATGGTATGCGTTTTGACA-3；

以腾冲嗜热厌氧杆菌（Xue等人，2001，Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51：1335-1341）基因组为模板、以下述引物扩增终止子：

kanTF：

5-TGTCAAAACGCATACCATTTTGAAGCAAAAGACCCTGCTTTTTAAG-3；

kanTR：

5-CTAGAGCATGGCGCGCCCAAAGGAATCGTCCCCTTTGTCTG-3；

以上述两个PCR产物为模板、以kanF、kanTR为引物，经Overlap-PCR构建卡那霉素抗性表达盒。

⑷ 采用的One Step Cloning Kit（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）对上述（1）、（2）、（3）中三个DNA片段进行重组连接。体系如下表1：

将以上连接体系放于50℃金属浴中反应15 min，取出置于冰上冷却5 min后转化大肠杆菌感受态。在含有50 µg/ml卡那霉素的LB培养基上筛选转化子。挑取阳性转化子并扩增后提取其中的质粒，命名为pEB01，质粒pEB01的全核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。

实施例3 质粒pEB01在枯草芽孢杆菌中复制和应用

制备B. subtilis WB600感受态（张爽等人，2014，重庆理工大学学报，28：60-64），通过电击方法将质粒pEB01导入B. subtilisWB600感受态。转化后细胞涂布于含有25 µg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养后出现菌落（图3）。

挑取上述菌接种于含有25 µg/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养，提取其中质粒。以质粒为模板、以BV-oriF和BV-repR为引物进行PCR验证，PCR产物大小与预期结果一致（图4）；以质粒提取试剂盒提取其中的质粒，进一步经琼脂糖凝胶电泳鉴定（图5）。以上结果表明，来源于贝莱斯芽孢杆菌内源质粒的复制元件可在B. subtilis行使生物学功能，该复制元件可用于枯草芽孢杆菌中质粒的构建，扩展了枯草芽孢杆菌中复制元件。

实施例4 质粒pEB01介导的绿色蛋白基因gfp在枯草芽孢杆菌表达

以质粒F4-G-P43-R-pUBC19为模板、采用下述引物应用PCR扩增绿色蛋白基因gfp：

PGF：5-ATAGGCGCGCCATAACTTCTCAAAGATCCCATGTGCT-3；

PGR ：5-CTCTTAATTAACTGAGCAAAAAAAATCCTGCAT-3；

PCR产物经Asc I和Pac I酶切，与经相同内切酶处理的质粒pEB01相连，构建质粒pEB01-gfp。质粒经电击导入B. subtilis WB600，获得含有pEB01-gfp的枯草芽孢杆菌株B. subtilis WB-gfp。菌株B. subtilis WB-gfp在LB培养基上培养时形成带有明显绿色荧光的菌落（图6），表明绿色荧光蛋白基因gfp在B. subtilis WB-gfp中得以高强度表达。

上述结果说明质粒pEB01可在B. subtilis中高拷贝复制并介导目的基因高强度表达，质粒pEB01在外源基因高效表达中有重要意义。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 来源于贝莱斯芽孢杆菌质粒的复制元件及其应用

<130> BJ-2002-201007A-L

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7276

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 1

cataagaaaa gcgctggagc tgtcttatct ctaaatgggc agcgggcgct cttggcgtga 60

gtcaacggta accggaccgt agggaggatt aaggagttga ctcactcagc gccacccgaa 120

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cggagatgct acatggaaaa gaaaaaaatg gttgaataca ttttaaatgg gttcaaatct 3720

gaattcttta gtcaaaggaa tcaaaaaaaa ttgtaatgca aacttgctga aataaattat 3780

attcaattta gaataaattg gtgtgtataa gcatggttga tattaaataa caaaaacaga 3840

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aacgctatgt ttaaggccac tagaacttgc tctttttgat tccattatgt ttttgcaggc 4200

tgaatctttg catctatgag acataccgat atgtttatag tgagtaatgc ttgttggatt 4260

agcgaattgt acattcatat ctgattctgt tctgtattta ttggaaatag tggcgaaaga 4320

ccgattatct cctttaagat atccttttcc tcgtggatga ggatctttaa cgcttacgta 4380

aggaatgaac gttctataaa caaatgagta agcattatct tttggaatcc cttttgttga 4440

gaattttcct gtttgatctt cagtggttat taattcttca cttttattta actctgtttc 4500

agtgttattt ggtatcttta ctatagttga ggaggaaccg ttgatattaa acacttcgtt 4560

ttgttcttct gtatttaatt ttatgttgtt gtcatttaat tttttttgaa ttttttgctg 4620

ttcgatttga ggtaaagcgg tttgaacctt aattgtataa gtgtattctt ctcctggttt 4680

tacttcatta tcagtgaaag ttaaactctt tgtttccccg attttttcat tgtttttgta 4740

tatttcatat atcccatctt tatcagggag ttctccccaa cttagagtta cggatttgtc 4800

gtttgttata gattctatta tggaactgtt cactttttgc tccatttttg ctgcttcaag 4860

gttttttgtg gattttaaag aagcttttgt tgtttgtgtt tgttcttgtt gaggatttgc 4920

tacatttacc ttaagaatat ttttgagttt atcttcttgg aacactccaa ttttatactt 4980

ttgaatatct tcagttagtt catctttaaa ttcttttgaa gatcctttgt acaataattg 5040

gtcgtttttg taaaccttgt aatagtctcc attttctttt atattcaacg aaacagtttt 5100

ttcattggtt ttaatgtcta ctggtgattc ttgagcttct gctgaatttg aacaaacgaa 5160

tattaaagtg attgcgactg agaggaatgc aaaaaaatga ataatttttc tcaagtgaaa 5220

ccctccatat taagttaaaa taaacaaaat tctcaaaagc attacaagga aagggatatt 5280

atgaaaaaat taattttaac tattgtcttc tcaagtttat ctttaggttt tattcagtac 5340

ttgattgctg gagcttattc tggagtttat ttgattccta tatttgcttg ttattttttt 5400

gtgccttatt tgatatttgc acttccctta caatacttcc tcaataagaa tccgaagaga 5460

ttttcaattg tttattttat ttattatttg ctcttgtctt tagtagcgaa ctttttgatt 5520

ttttatgccc aaagtatccc ggaataccca ccattaatta caaggccgga aatatatttt 5580

tatagcttta taacagctat tggatattgg ttttgggatt caattttttc acaaaagaaa 5640

cgtttgtagc aggaaatatt tcttgctctt tttttttggg atcattactt attttttcac 5700

tccttttact tttctagttc caataaaccg tatcatatat catgggtttt tcaacaaaat 5760

tatacatatt tacaaataaa aagcaactaa atgcctattt ggcttttttt tgattgcgga 5820

ttttgcggat ataatcgaat atgaaaattt aacacataga acaaaaagtt catatataac 5880

agagaataat aatttgaagc ggctgacgct caaaaagaca atgaggtcaa aaagcacgcc 5940

gaaacgaaaa agaggagaga ggcaggtatg gtgagctgct gaacccaaga gcagaataag 6000

gagtttcagt cgctgaacga ggaaaataag acgctaagag agcggatggc cgtactagaa 6060

cagtggaaag acaaaatggt gcagtgggct aaagagaagt tgccaagggt gcggagatta 6120

gcggtttcat ttttcaatgc agcaggtatg cgtcgagaag cagctaaata taaggacaat 6180

gaattggaac gataaatgct tttcattaac tgcacccatt aactttacac catcaaaagc 6240

ttgaacttat tgatataacc aagttttaaa gggccaattt tgttttgttt tacagtttgt 6300

tttacaaatg ttttatcaga agaagaaata aagaaatata aaagaataag agagcgtggt 6360

gtgcatatca gttatccttt ccaaaattgc caccactttt tttgtttagt ggctgcgatc 6420

attctttgtg tctccagcga ctcccgtaat gcggcagtga gtgtctcgtg cctttcttgc 6480

tgtctttttt cgaattgttc catccgttct gccatccggc ggttgaattc ctcctgtcgc 6540

ttcatgaatt caaccaaagg attgtcctgt agcgatgtag cggtatccga tatggtcagt 6600

ttagaacgat ataagcttgc tatatgcttt accgtttcgt cgagtgagtg gccattgatt 6660

ttagtcattg tacatagata ctctaaagtc tttacgtcat cctcggtata gagtcgccat 6720

cctttcgaat ctttattgaa cgagtagcct tgttcttcaa gcatactggc atacttgcgg 6780

acagtcaccg gctctatacc gaggtgtttt gcgacgtcct tggacgataa tttgactccc 6840

atatccatca cgaatcacct cgtaaaatag gttcgctatg gcaaggccag acaccttcaa 6900

gtgttgcacc ctttattatg tttgagttgt tttgaaaagg gtgcatttca aaaggagcgc 6960

tgcataccta aacgagagga aaaatccagt catgacaagg gactgactgg gttcttttgt 7020

gtttgagttt gttttggaat ttaggagcgg tcacggagtg cccagttata cgcaccaaat 7080

aaattggggc gtactggcgg aaatgatccg caggggcttt tgataaagag gagggggtag 7140

taatgcaaaa gattgatttt gaaacaggga tgaaatatgt aagagcaacc cttggctttg 7200

agggtttagt gctgacagaa gaagaggaaa agcttttaga aaggcggttt catggagaaa 7260

tcacagaaga agaata 7276

<210> 2

<211> 2238

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 2

aaatggtgtg cgctcaaaga caaattcaga ggagtgattc tcattatgaa atttaaaagt 60

ctttttgctg ctgtcctcat tttgggtctg ttagccggcg gtgcaggtta ttctgtttct 120

catggggaaa tttcagttgc ttctcgaaat gcaacataag gaaaatttaa ggcctaaatg 180

gggcggactc ttagagtctg ctttttttat tgcaaaaatc gttttaaagc cttttaagac 240

gttttattgg gtttccttta taaaagggag cgttttttat ttaaagcccg cagaaacgaa 300

tctgagcatt ctgaggacgc ctttaggtat gcagattaac tgttcacctt tttttagtag 360

cgagtagcgg agtgcccact tacgacctta tcgaaaggtg ctcgtttttt cgcactggcg 420

aaataaataa tgctacgcat ttgaccatgg ctggatgtgc tgactgtgtg gaggttcatg 480

cgttggtcat gtggagacgt gcggtttttt aaagatattg aatatctaaa ataatgcgcg 540

gctgcagggt cgattttttt caaaaaatcg gcccctatgg ggggattggt tttgatctta 600

ggttttgggt tttaaaaaaa gaccggcaat tctgccggcc ttttttacga ttttgacgga 660

gtcgaaatcg ggtcttttct tatcttgata ctatatagaa acaacaagat tttaaaaaat 720

cacgttcagc ccttgtctgt caagggctga agttaatttt gacagataaa aactccctct 780

gctattattg agttaccaca cttaacaata gaatgctaga ttactagctc agaaggagtt 840

tttcattttg tattcatctg aaaacgatta tagcatcctt gaagacaaaa ccgcaacagg 900

taaaaagcgg gattggaaag ggaagaagag acggacgaat cttatggcag agcattacga 960

ggcgttgcag gagaaaatcg gagcacctta ctatggcaag aaagctgaaa agctaagtgg 1020

ttgtgcagag tgtctttcgt ttaaaagaga tccggagacg gacaaactaa agctgtacca 1080

agcccatttt tgcaaagtga ggttatgccc tatgtgtgcg tggcgccggt cgttaaaaat 1140

tgcttatcat aataaattga ttgtagaaga agctaaccgg cagtacggtt gtgggtggat 1200

ttttctcacg ttgactgtca gaaatgtagc aggagaagag ctaaagcctg cgatttctga 1260

catgatgaaa gggtttaatc ggctcatgaa atataaaagg gtcgatacag cggtacttgg 1320

ctattttaga gctttagaga ttactaaaaa tcatgaagaa gatacatatc atccgcattt 1380

tcatgtgtta ttgcctgtga agagaagtta tttcggcaaa aattatatca agcaggtgga 1440

atggacaagc ctttggaaaa gggcgatgaa actggattat acgccgattg ttgatattcg 1500

aagagtcaag ggaagagcta aaattgatgc tgagcagatt gagagcgatg tgcgggaagc 1560

catgatggag cacaaagctg ttctggagat ttcaaaatat ccagtcaagg atacggatgt 1620

gatgcgtggc agcaaggtga cggatgataa tttgaacaca gtgttttact tggatgatgc 1680

gctttctgcc cgcaggctca ttggatatgg cggtattttg aaagagattc ataaagaatt 1740

gaaccttgga gatgccgaag acggcgatct cgttaagatt gaggaagagg atgacgaggt 1800

cgcaaatgga gcatttgagg ttatggctta ttggcatcca ggaattaaaa attacataat 1860

caaataacaa agcaggccaa tgcctgcttt ttatttaata ttaaaaaaat tacagagata 1920

gatacttgaa aactgtgagc atagaaactt aagattgtga tagttatgat tttataagag 1980

cggagatgct acatggaaaa gaaaaaaatg gttgaataca ttttaaatgg gttcaaatct 2040

gaattcttta gtcaaaggaa tcaaaaaaaa ttgtaatgca aacttgctga aataaattat 2100

attcaattta gaataaattg gtgtgtataa gcatggttga tattaaataa caaaaacaga 2160

cctttaaagg tctgttttgt tttatatagt taaactccat ggatttaata atcctctatc 2220

taatagtttc cagaagtc 2238

<210> 3

<211> 5821

<212> DNA

<213> Artifial sequence

<400> 3

ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 60

aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 120

ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 180

ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 240

tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 300

cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 360

gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 420

gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 480

tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 540

ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 600

gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 660

ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 720

tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 780

ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct 840

gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga 900

acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg 960

cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg 1020

aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag 1080

gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 1140

cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctgc ccttaagggc agcttcaatt 1200

cgccctatag tgagtcgtat tacaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg 1260

aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc 1320

gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg 1380

aatggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt 1440

gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct 1500

cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg 1560

atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag 1620

tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa 1680

tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga 1740

tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa 1800

atttaacgcg aattttaaca aaattcaggg cgcaagggct gctaaaggaa gcggaacacg 1860

tagaaagcca gtccgcagaa acggtgctga ccccggatga atgtcagcta ctgggctatc 1920

tggacaaggg aaaacgcaag cgcaaagaga aagcaggtag cttgcagtgg gcttacatgg 1980

cgatagctag actgggcggt tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc agctggggcg 2040

ccctctggta aggttgggaa gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctt gccgccaagg 2100

atctgatggc gcaggggatc aagatctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcggt 2160

ctctcactca tcaccgctac cacgtattga cattttgtga gctttatcga ttcttcaaga 2220

tggtaaagat ggccattgtg caagggattg tattcgacaa taattcctaa cgcttccata 2280

ctatttgttt ttcccttcaa aaaaattttt aataacgtac ttattatttt acacgaaata 2340

tggtaaaatg taaaagggaa accgtgtata caatattacg aagaggagga gagattttaa 2400

aatgaatgga ccaataataa tgactagaga agaaagaatg aagattgttc atgaaattaa 2460

ggaacgaata ttggataaat atggggatga tgttaaggct attggtgttt atggctctct 2520

tggtcgtcag actgatgggc cctattcgga tattgagatg atgtgtgtca tgtcaacaga 2580

ggaagcagag ttcagccatg aatggacaac cggtgagtgg aaggtggaag tgaattttta 2640

tagcgaagag attctactag attatgcatc tcaggtggaa tcagattggc cgcttacaca 2700

tggtcaattt ttctctattt tgccgattta tgattcaggt ggatacttag agaaagtgta 2760

tcaaactgct aaatcggtag aagcccaaaa gttccacgat gcgatttgtg cccttatcgt 2820

agaagagctg tttgaatatg caggcaaatg gcgtaatatt cgtgtgcaag gaccgacaac 2880

atttctacca tccttgactg tacaggtagc aatggcaggt gccatgttga ttggtctgca 2940

tcatcgcatc tgttatacga cgagcgcttc ggtcttaact gaagcagtta agcaatcaga 3000

tcttcctttc aggttatgac catctgtgcc agttcgtaat gtctggtcaa ctttccgact 3060

ctgagaaact tctggaatcg ctagagaatt tctggaatgg gattcaggag tggacagaac 3120

gacacggata tatagtggat gtgtcaaaac gcataccatt ttgaagcaaa agaccctgct 3180

ttttaagcgg ggtcttttta tttataggct tatgcacttt cactggaggt gctatttttt 3240

gaatttacaa gccagttgac tataaaaaat acagccacta tgaggaggac aagccctgct 3300

atggcccaaa tgagatttta tatgttgaat ttaaacattt tttctccctc ctcgggaaga 3360

ggttaaaatt tattgttctt atcttcattg tacaagatat ttatgataat atcaactttt 3420

tttaaaatca gacaaagggg acgattcctc tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg 3480

tcttgagggg ttttttgggc gcgccatgct ctagtctcag gtcactgatc attaattaaa 3540

ctggcccgtt tgttgaaaaa tggtgtgcgc tcaaagacaa attcagagga gtgattctca 3600

ttatgaaatt taaaagtctt tttgctgctg tcctcatttt gggtctgtta gccggcggtg 3660

caggttattc tgtttctcat ggggaaattt cagttgcttc tcgaaatgca acataaggaa 3720

aatttaaggc ctaaatgggg cggactctta gagtctgctt tttttattgc aaaaatcgtt 3780

ttaaagcctt ttaagacgtt ttattgggtt tcctttataa aagggagcgt tttttattta 3840

aagcccgcag aaacgaatct gagcattctg aggacgcctt taggtatgca gattaactgt 3900

tcaccttttt ttagtagcga gtagcggagt gcccacttac gaccttatcg aaaggtgctc 3960

gttttttcgc actggcgaaa taaataatgc tacgcatttg accatggctg gatgtgctga 4020

ctgtgtggag gttcatgcgt tggtcatgtg gagacgtgcg gttttttaaa gatattgaat 4080

atctaaaata atgcgcggct gcagggtcga tttttttcaa aaaatcggcc cctatggggg 4140

gattggtttt gatcttaggt tttgggtttt aaaaaaagac cggcaattct gccggccttt 4200

tttacgattt tgacggagtc gaaatcgggt cttttcttat cttgatacta tatagaaaca 4260

acaagatttt aaaaaatcac gttcagccct tgtctgtcaa gggctgaagt taattttgac 4320

agataaaaac tccctctgct attattgagt taccacactt aacaatagaa tgctagatta 4380

ctagctcaga aggagttttt cattggcgcg ccatgctcta gtttaattaa ttgtattcat 4440

ctgaaaacga ttatagcatc cttgaagaca aaaccgcaac aggtaaaaag cgggattgga 4500

aagggaagaa gagacggacg aatcttatgg cagagcatta cgaggcgttg caggagaaaa 4560

tcggagcacc ttactatggc aagaaagctg aaaagctaag tggttgtgca gagtgtcttt 4620

cgtttaaaag agatccggag acggacaaac taaagctgta ccaagcccat ttttgcaaag 4680

tgaggttatg ccctatgtgt gcgtggcgcc ggtcgttaaa aattgcttat cataataaat 4740

tgattgtaga agaagctaac cggcagtacg gttgtgggtg gatttttctc acgttgactg 4800

tcagaaatgt agcaggagaa gagctaaagc ctgcgatttc tgacatgatg aaagggttta 4860

atcggctcat gaaatataaa agggtcgata cagcggtact tggctatttt agagctttag 4920

agattactaa aaatcatgaa gaagatacat atcatccgca ttttcatgtg ttattgcctg 4980

tgaagagaag ttatttcggc aaaaattata tcaagcaggt ggaatggaca agcctttgga 5040

aaagggcgat gaaactggat tatacgccga ttgttgatat tcgaagagtc aagggaagag 5100

ctaaaattga tgctgagcag attgagagcg atgtgcggga agccatgatg gagcacaaag 5160

ctgttctgga gatttcaaaa tatccagtca aggatacgga tgtgatgcgt ggcagcaagg 5220

tgacggatga taatttgaac acagtgtttt acttggatga tgcgctttct gcccgcaggc 5280

tcattggata tggcggtatt ttgaaagaga ttcataaaga attgaacctt ggagatgccg 5340

aagacggcga tctcgttaag attgaggaag aggatgacga ggtcgcaaat ggagcatttg 5400

aggttatggc ttattggcat ccaggaatta aaaattacat aatcaaataa caaagcaggc 5460

caatgcctgc tttttattta atattaaaaa aattacagag atagatactt gaaaactgtg 5520

agcatagaaa cttaagattg tgatagttat gattttataa gagcggagat gctacatgga 5580

aaagaaaaaa atggttgaat acattttaaa tgggttcaaa tctgaattct ttagtcaaag 5640

gaatcaaaaa aaattgtaat gcaaacttgc tgaaataaat tatattcaat ttagaataaa 5700

ttggtgtgta taagcatggt tgatattaaa taacaaaaac agacctttaa aggtctgttt 5760

tgttttatat agttaaactc catggattta ataatcctct atctaatagt ttccagaagt 5820

c 5821

Claims (4)

1.核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的复制元件在构建枯草芽孢杆菌表达系统中的应用，所述的应用是将复制元件作为枯草芽孢杆菌表达载体的复制子。

2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于，将复制元件与启动子、目的基因以及终止子可操作的连接得到枯草芽孢杆菌表达载体。

3.枯草芽孢杆菌表达载体在枯草芽孢杆菌中表达目的基因中的应用；所述枯草芽孢杆菌表达载体包括启动子、在枯草芽孢杆菌中进行自主复制的复制元件、在大肠杆菌中进行自主复制的复制元件以及在枯草芽孢杆菌中表达的目的基因；其中，所述在枯草芽孢杆菌中进行自主复制的复制元件的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，包括：将所述的枯草芽孢杆菌表达载体转化到枯草芽孢杆菌，诱导目的基因在枯草芽孢杆菌中表达。

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