KR100830032B1 - 동시 당화 및 발효에 적합한 재조합 숙주 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리사카라제의 발현을 증가시킬 수 있는 대리 프로모터의 전사 제어 하에 폴리사카라제를 코딩하는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 또한 그러한 숙주에 분비성 단백질(들)을 코딩하는 유전자를 제공하여 발현된 폴리사카라제의 분비를 용이하게 한다. 본 발명의 바람직한 숙주는 에탄올을 생성하는 것이며 동시 당화 발효를 수행할 수 있어 복합 셀룰로오스 기질로부터의 에탄올 생산을 일어나게 한다.
폴리사카라제, 대리 프로모터, 분비 단백질, 에탄올, 당화, 발효

Description

동시 당화 및 발효에 적합한 재조합 숙주{Recombinant Hosts Suitable for Simultaneous Saccharification and Fermentation}
관련 정보
본 출원은 본원에 그의 전문이 참고로 인용된 미국 임시 출원 번호 제60/136,376호 ("RECOMBINANT HOSTS SUITABLE FOR SIMULTANEOUS SACCHARIFICATION AND FERMENTATION"이라는 발명의 명칭으로 1999년 5월 26일자로 출원됨)를 우선권 주장한다. 이 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 참고 문헌의 내용은 본원에 그의 전문이 참고로 인용되어 있다.
정부 지원된 연구
이 연구는 미국 농무부, 국립 연구소 (95-37308-1843; 98-35504-6177) 및 미국 에너지국 (DE-FG02-96ER20222)로부터 허가받아 일부 지원받았다.
석유 기재 자동차 연료를 식물 재료로부터 얻은 재생 연료로 대체함으로써 많은 환경 및 사회적 이점이 얻어질 것이다 (Lynd et al., (1991) Science 251:1318-1323; Olson et al., (1996) Enzyme Microb. Technol. 18:1-17; Wyman et al., (1995) Amer. Chem. Soc. Symp. 618:272-290). 매년, 미국에서는 거의 수입된 석유의 전체량에 해당하는 1200억 갤론의 자동차 연료가 소비된다. 재생성 대체 연료로서의 에탄올의 개발은 수입 오일에 대해 미국이 의존하지 않도록 하고, 환경을 개선시키고 또한 새로운 고용을 창출할 수 있다 (Sheehan, (1994) ACS Symposium Series No. 566, ACS Press, pp 1-53).
이론적으로, 자동차 연료에 대한 수입된 오일의 문제점에 대한 해결책은 아주 간단한 것으로 보인다. 한정된 자원인 석유를 사용하지 않고, 재생가능한 자원인 식물 재료의 발효에 의해 에탄올을 효율적으로 생산할 수 있다. 사실상, 브라질은 에탄올의 생산 가능성과 20년 이상 동안 주요 자동차 연료로서의 에탄올의 사용을 입증하였다. 마찬가지로, 미국은 매년 12억 갤론 이상의 연료 에탄올을 생산한다. 현재, 연료 에탄올은 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 지모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis)(제트. 모빌리스)를 이용하여 옥수수 전분 또는 사탕수수 시럽으로부터 생산된다. 그러나, 이들 당 공급원은 어느 것도 석유 기재 자동차 연료의 대체를 실현하는데 필요한 볼륨을 공급할 수 있다. 또한, 사탕수수 설탕 및 옥수수 전분 둘다는 식품으로서 경쟁적으로 사용되는 비교적 값비싼 출발 물질이다.
또한, 이들 당 기질은 식물 내의 전체 탄수화물의 일부 만을 나타낸다. 사실상, 식물 내의 탄수화물의 대부분은 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 펙틴 및 리그닌을 함유하는 복합 구조 중합체인 리그노셀룰로오스의 형태이다. 리그노셀룰로오스는 예를 들면 식물의 줄기, 잎, 껍질, 겉껍질 및 속에서 발견된다. 이들 중합체의 가수분해는 글루코오스, 크실로오스, 만노오스, 갈락토오스 및 아라비노오스를 비롯한 중성 당의 혼합물을 방출시킨다. 알려지지 않은 자연 생물체는 이들 모든 당을 에탄올로 신속하고 효율적으로 대사 변화시킬 수 있다.
그럼에도 불구하고, 이러한 기질 공급원을 개발하려는 노력으로 걸프 오일 캄파니 (Golf Oil Company)는 효모 기재 공정으로 불리우는 동시 당화 및 발효 (SSF)를 이용하여 셀룰로오스로부터 에탄올을 생산하는 방법을 개발하였다 (Gauss et al. (1976) U.S.P.N. 3,990,944호). 진균 셀룰라제 제제 및 효모는 단일 용기의 셀룰로오스 기질의 슬러리에 첨가되었다. 에탄올은 셀룰로오스 가수분해 중에 동시에 생산되었다. 그러나, 걸프의 SSF 방법은 몇가지 결점을 갖고 있다. 예를 들면, 진균 셀룰라제는 여태까지는 대규모 바이오에탄올 공정에 사용하기에 너무 비용이 많이 드는 것으로 고려되어 왔다 (Himmel et al., (1997) Amer. Chem. Soc. pp. 2-45; Ingram et al., (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53:2420-2425; Okamoto et al., (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 42:563-568; Philippidis, G., (1994) Amer. Chem. Soc. pp. 188-217; Saito et al., (1990) J. Ferment. Bioeng. 69:282-286; Sheehan, J., (1994) Amer. Chem. Soc. pp 1-52; Su et al., (1993) Biotechnol. Lett. 15:979-984).
발명의 요약
셀룰로오스 가수분해의 경제적인 효소적 방법의 개발은 기질 이용의 효능 및 당화 및 발효 방법의 경제성을 개선하는데 큰 가능성을 갖고 있다. 따라서, 복합 셀룰로오스 기질의 효율적인 해중합 및 이어지는 기질의 에탄올로의 신속한 발효에 이용될 수 있는 생체촉매를 개발하는 것이 아주 이로울 것이다.
본 발명은 복합 탄수화물을 해중합시키기에 적합한 폴리사카라제의 증가된 발현 및 분비를 위해 처리된 재조합 숙주 세포를 제공한다. 대리 프로모터의 전사 제어 하에 폴리사카라제를 고도로 발현시키는, 2가지의 재조합 장내 세균, 에세리히아 콜리 (Escherichia coli) 및 클레브시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca)가 특별하게 예시된다. 본 발명은 세포에서 폴리사카라제의 생산 증가를 가능하게 하는 분비성 단백질(들)을 포함하도록 하는 이들 숙주의 추가의 변형을 제공한다. 바람직한 양태에서, 폴리사카라제는 증가된 활성을 갖고 증가된 양으로 또는 그의 혼합으로 생산된다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 지모모나스 모빌리스와 같은 효율적인 에탄올 생산자로부터 유래되는 외생성 에탄올생성 유전자를 포함하도록 하는 이들 숙주의 추가의 변형을 제공한다. 따라서, 이들 숙주는 복합 탄수화물로부터의 에탄올의 효율적인 생산을 위해 단독으로 또는 다른 효소 또는 재조합 숙주와 함께 사용될 수 있는 단백질을 고도로 발현시킬 수 있다.
더욱 상세하게는, 첫번째 면에서 본 발명은 폴리사카라제의 생산 증가가 일어난 재조합 숙주 세포를 특징으로 한다. 이 면의 숙주 세포는 서열이 대리 프로모터의 전사 제어 하에 있고 이 프로모터가 폴리사카라제의 생산 증가를 야기시킬 수 있는 폴리사카라제를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 단편을 함유한다. 또한, 이 면은 분비성 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 단편을 함유하는 숙주 세포를 특징으로 한다. 제1 및 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 단편의 발현 결과 재조합 숙주 세포에 의해 폴리사카라제 양, 활성 또는 그들 혼합의 생산 증가가 일어나게 된다.
바람직한 양태에서, 폴리사카라제 폴리펩티드는 분비된다.
다른 양태에서, 숙주 세포는 세균 세포, 바람직하게는 그람 음성, 통성 혐기 성이며, 장내세균과로부터 유래된 것이다. 다른 관련 양태에서, 재조합 숙주 세포는 에세리히아 또는 클레브시엘라속의 것이며, 바람직하게는 이. 콜리 B, 이. 콜리 DH5α, 이. 콜리 KO4 (ATCC 55123), 이. 콜리 KO11 (ATCC 55124), 이. 콜리 KO12 (ATCC 55125), 이. 콜리 LY01, 케이. 옥시토카 (K. oxytoca) M5A1 또는 케이. 옥시토카 P2 (ATCC 55307) 균주이다.
다른 양태에서, 재조합 숙주는 글루카나제, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 셀로비오히드롤라제, β-글루코시다제, 엔도-1,4-β-크실라나제, α-크실로시다제, α-글루쿠로니다제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아세틸에스테라제, 아세틸크실란에스테라제, α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루라나제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 아라비노시다제, 만나나제, 펙틴 히드롤라제, 펙테이트 리아제 또는 이들 폴리사카라제의 혼합물일 수 있는 폴리사카라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 함유한다. 관련 양태에서, 폴리사카라제는 바람직하게는 글루카나제, 더욱 바람직하게는 celZ 유전자, 가장 바람직하게는 에르위니아 크리산테미 (Erwinia chrysanthemi)로부터 유래된 celZ 유전자의 발현 생성물이다.
또다른 양태에서, 재조합 숙주 세포는 바람직하게는 장내세균과로부터 분비된 세균 세포로부터, 더욱 바람직하게는 케이. 옥시토카, 이. 카로토보라, 이. 카로토보라 아종 카로토보라, 이. 카로토보라 아종 아트로셉티카 및 이. 크리산테미로부터 유래된 pul 또는 out 유전자에 의해 코딩되는 분비성 폴리펩티드를 발현한다.
또다른 양태에서, 재조합 숙주 세포에서의 유전자 발현을 유도하기 위한 대 리 프로모터는 지모모나스 모빌리스로부터의 폴리뉴클레오티드 단편으로부터 유래되며, 더욱 바람직하게는 서열 번호 1에 제공된 서열 또는 그 서열의 단편이다.
또다른 양태에서, 상기 면 및 상술한 양태의 숙주 세포는 에탄올을 생성하는 것이다.
두번째 면에서, 본 발명은 폴리사카라제를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드 단편을 함유하는 재조합 에탄올생성 숙주 세포를 제공하며 이 단편은 외생성 대리 프로모터의 전사 제어하에 있다.
한 양태에서, 숙주 세포는 세균 세포, 바람직하게는 그람 음성, 통성 혐기성이며, 장내세균과로부터 유래된 것이다. 관련 양태에서, 재조합 에탄올생성 숙주 세포는 에세리히아 또는 클레브시엘라속의 것이며, 바람직하게는 이. 콜리 B, 이. 콜리 DH5α, 이. 콜리 KO4 (ATCC 55123), 이. 콜리 KO11 (ATCC 55124), 이. 콜리 KO12 (ATCC 55125), 이. 콜리 LY01, 케이. 옥시토카 M5A1 또는 케이. 옥시토카 P2 (ATCC 55307) 균주이다.
다른 양태에서, 재조합 숙주 세포는 글루카나제, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 셀로비오히드롤라제, α-글루코시다제, 엔도-1,4-α-크실라나제, β-크실로시다제, β-글루쿠로니다제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아세틸에스테라제, 아세틸크실란에스테라제, α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루라나제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 아라비노시다제, 만나나제, 펙틴 히드롤라제, 펙테이트 리아제 또는 이들 폴리사카라제의 혼합물인 폴리사카라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 함유한다. 관련 양태에서, 폴리사카라제는 글루카나제, 바람직 하게는 celZ 유전자, 더욱 바람직하게는 에르위니아 크리산테미로부터 유래된 celZ 유전자의 발현 생성물이다.
또다른 양태에서, 재조합 숙주 세포에서의 유전자 발현을 유도하기 위한 대리 프로모터는 지모모나스 모빌리스로부터의 폴리뉴클레오티드 단편으로부터 유래되며, 더욱 바람직하게는 서열 번호 1에 제공된 서열 또는 그 서열의 단편이다.
또다른 양태에서, 상기 면 및 상술한 양태는 에탄올생성 숙주 세포를 특징으로 한다.
세번째 양태에서, 본 발명은 제1 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 단편 및 분비성 폴리펩티드(들)을 코딩하는 서열을 포함하는 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 단편을 함유하며, 제1 이종성 폴리뉴클레오티드가 대리 프로모터의 전사 제어 하에 있고 숙주 세포에 의한 제1 폴리펩티드의 생산이 증가되는, 재조합 에탄올생성 그람 음성 세균 숙주 세포를 특징으로 한다.
한 양태에서, 제1 폴리펩티드는 분비된다.
다른 양태에서, 재조합 숙주 세포는 통성 혐기성 세균 세포이다. 관련 양태에서, 숙주 세포는 장내 세균과, 바람직하게는 에세리히아 또는 클레브시엘라속으로부터 유래된 것이며, 더욱 바람직하게는 이. 콜리 B, 이. 콜리 DH5α, 이. 콜리 KO4 (ATCC 55123), 이. 콜리 KO11 (ATCC 55124), 이. 콜리 KO12 (ATCC 55125), 이. 콜리 LY01, 케이. 옥시토카 M5A1 또는 케이. 옥시토카 P2 (ATCC 55307) 균주이다.
또다른 양태에서, 재조합 숙주의 제1 폴리펩티드는 폴리사카라제이며, 바람직하게는 그 폴리펩티드는 증가된 활성을 갖는다. 관련 양태에서, 폴리사카라제는 글루카나제, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 셀로비오히드롤라제, α-글루코시다제, 엔도-1,4-α-크실라나제, β-크실로시다제, β-글루쿠로니다제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아세틸에스테라제, 아세틸크실란에스테라제, α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루라나제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 아라비노시다제, 만나나제, 펙틴 히드롤라제, 펙테이트 리아제 또는 이들 폴리사카라제의 혼합물이다.
바람직한 양태에서, 재조합 숙주의 제1 폴리펩티드는 폴리사카라제 글루카나제, 바람직하게는 celZ 유전자, 더욱 바람직하게는 에르위니아 크리산테미로부터 유래된 celZ 유전자의 발현 생성물이다.
또다른 양태에서, 재조합 숙주 세포의 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 단편은 바람직하게는 장내세균과로부터 분비된 세균 세포로부터, 더욱 바람직하게는 케이. 옥시토카, 이. 카로토보라, 이. 카로토보라 아종 카로토보라, 이. 카로토보라 아종 아트로셉티카 또는 이. 크리산테미로부터 유래된 하나 이상의 pul 또는 out 유전자를 함유한다.
네번째 면에서, 본 발명은 올리고사카라이드를 효소적으로 분해하는 방법을 제공한다. 그 방법은 올리고사카라이드를, 대리 프로모터의 전사 제어 하에 있는 폴리사카라제를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 단편을 함유하는 숙주 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 또한, 대리 프로모터는 폴리사카라제의 생산 증가를 야기시킬 수 있다. 또한, 상기 방법의 재조합 숙주 세포는 분비성 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 단편을 함유한다. 이러한 면의 숙주 세포의 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 단편의 발현 결과 폴리사카라제 활성의 양의 생산 증가가 일어나게 되어 올리고사카라이드가 효소적으로 분해된다. 바람직한 양태에서, 폴리사카라제는 분비된다.
상기 면의 한 양태에서, 숙주 세포는 에탄올을 생성하는 것이다. 다른 양태에서, 본 발명은 수용액에서 수행된다. 또다른 양태에서, 그 방법은 동시 당화 및 발효에 이용된다. 또다른 양태에서, 올리고사카라이드는 바람직하게는 리그노셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 셀룰로오스, 펙틴 또는 이들 올리고사카라이드의 혼합물이다.
다섯번째 면에서, 본 발명은 숙주 세포에서의 당해 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 대리 프로모터를 확인하는 방법을 특징으로 한다. 그 방법은 생물체로부터의 게놈 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 단편으로 세분화하는 단계 및 당해 유전자를 하나 이상의 단편의 전사 제어하에 두는 단계를 포함한다. 그 방법은 또한 그러한 단편 및 당해 유전자를 숙주 세포로 도입하는 단계 및 당해 유전자의 생산 증가가 일어난 숙주 세포를 확인하여 발현 증가가 그 단편이 대리 프로모터임을 나타내도록 하는 단계를 포함한다.
여섯번째 면에서, 본 발명은 동시 당화 및 발효에 사용하기 위한 재조합 숙주 세포의 제조 방법을 제공한다. 특히, 그 방법은 숙주 세포에 폴리사카라제 폴리펩티드의 발현 증가를 야기시킬 수 있는 대리 프로모터의 전사 제어 하에 폴리사카라제 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 단편을 도입하는 단계를 포함한다. 또한, 그 방법은 숙주 세포에 분비성 폴리펩티드( 들)을 코딩하는 서열을 포함하는 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 단편을 도입하여 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 단편을 발현하여 재조합 숙주 세포에 의한 폴리사카라제 폴리펩티드의 생산 증가를 일으키는 단계를 더 포함한다. 바람직한 양태에서, 폴리사카라제 폴리펩티드의 생산 증가는 활성, 양 또는 그의 혼합의 증가이다. 또다른 바람직한 양태에서, 폴리사카라제 폴리펩티드는 분비된다. 더욱 바람직한 양태에서, 숙주 세포는 에탄올을 생성하는 것이다.
일곱번째 면에서, 본 발명은 pLOI2306 (서열 번호 12)의 서열을 포함하는 벡터를 특징으로 한다.
여덟번째 면에서, 본 발명은 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포를 특징으로 한다.
아홉번째 면에서, 본 발명은 pLOI2306의 서열을 포함하는 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계 및 안정하게 통합된 벡터를 가진 숙주 세포를 확인하는 단계를 포함하는 재조합 숙주 세포 통합체의 제조 방법을 특징으로 한다.
열번째 면에서, 본 발명은 pLOI2306의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계 및 폴리사카라제를 발현하는 숙주 세포를 확인하는 단계를 포함하는 숙주 세포에서 폴리사카라제를 발현하는 방법을 특징으로 한다. 바람직한 양태에서, 상기 면의 각각은 에탄올생성 숙주 세포를 특징으로 한다.
열한번째 면에서, 본 발명은 올리고사카라이드 공급원을 대리 프로모터의 전사 제어 하에 폴리사카라제를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 이종성 폴리뉴클레오 티드 단편을 함유하는 에탄올생성 숙주 세포와 접촉시킴으로써 올리고사카라이드 공급원으로부터 에탄올을 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 프로모터는 폴리사카라제의 발현 증가를 야기시킬 수 있다. 또한, 에탄올생성 숙주는 분비성 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 단편을 함유한다. 에탄올생성 숙주 세포의 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 단편의 발현 결과 숙주 세포에 의한 폴리사카라제 활성의 생산 증가가 일어나게 되어 올리고사카라이드 공급원이 효소적으로 분해되고 에탄올로 발효된다.
한 양태에서, 재조합 숙주의 제1 폴리펩티드는 폴리사카라제이며, 바람직하게는 그 폴리펩티드는 증가된 활성을 갖는다. 관련 양태에서, 폴리사카라제는 글루카나제, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 셀로비오히드롤라제, α-글루코시다제, 엔도-1,4-α-크실라나제, β-크실로시다제, β-글루쿠로니다제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아세틸에스테라제, 아세틸크실란에스테라제, α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루라나제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 아라비노시다제, 만나나제, 펙틴 히드롤라제, 펙테이트 리아제 또는 이들 폴리사카라제의 혼합물이다.
바람직한 양태에서, 재조합 숙주의 제1 폴리펩티드는 폴리사카라제 글루카나제, 바람직하게는 celZ 유전자, 더욱 바람직하게는 에르위니아 크리산테미로부터 유래된 celZ 유전자의 발현 생성물이다.
또다른 양태에서, 재조합 숙주 세포의 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 단편은 바람직하게는 장내세균과로부터 유래된 세균 세포로부터, 더욱 바람직하게는 케이. 옥시토카, 이. 카로토보라, 이. 카로토보라 아종 카로토보라, 이. 카로토보라 아종 아트로셉티카 또는 이. 크리산테미로부터 유래된 하나 이상의 pul 또는 out 유전자를 함유한다.
또다른 양태에서, 재조합 숙주 세포는 통성 혐기성 세균 세포이다. 관련 양태에서, 숙주 세포는 장내 세균과, 바람직하게는 에세리히아 또는 클레브시엘라속로부터 얻은 것이며, 더욱 바람직하게는 이. 콜리 KO4 (ATCC 55123), 이. 콜리 KO11 (ATCC 55124), 이. 콜리 KO12 (ATCC 55125), 케이. 옥시토카 M5A1 또는 케이. 옥시토카 P2 (ATCC 55307) 균주이다.
또다른 양태에서, 그 방법은 수용액에서 수행된다. 또다른 양태에서, 그 방법은 동시 당화 및 발효에 이용된다. 또다른 양태에서, 올리고사카라이드는 바람직하게는 리그노셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 셀룰로오스, 펙틴 또는 이들 올리고사카라이드의 혼합물이다.
또다른 양태에서, 그 방법은 pLOI2306으로 이루어진 군에서 선택된 플라스미드이거나 또는 그로부터 유래된 핵산 작제물을 이용한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 명확해질 것이다.
도 1은 희석산으로 미리 처리되고 2가지의 다른 매질로 보충된 쌀겨 기질을 이용한 에탄올생성 재조합 숙주 이. 콜리 KO11에 대한 발효 속도를 나타낸다.
도 2는 혼합된 사무실 폐지를 이용한 에탄올생성 재조합 숙주 균주 케이. 옥 시토카 P2에 대한 동시 당화 및 발효 (SSF) 속도를 나타낸다. SSF로부터의 불용성 잔류물은 이어지는 발효 중에 결합된 셀룰라제 효소 및 기질의 공급원으로서 재순환된다.
도 3은 선택을 위한 카나마이신 내성 유전자 (kan), 플라스미드의 에피솜 유지를 위한 감온성 pSC101 레플리콘 (Rep(ts)) 및 글루카나제 (EGZ)를 코딩하는 프로모터없는 폴리사카라제 유전자 celZ의 배향을 나타내는 저카피 프로모터 프로브 벡터, 플라스미드 pLOI2171의 구조를 나타낸다.
도 4는 형질전환된 세균 콜로니에 대해 측정된 CMC 인디케이터 평판 상의 투명 대역의 크기 (x-축)과 발현된 글루카나제 활성의 양 (y-축) 사이의 높은 상관 관계를 나타내는 그래프이다.
도 5는 대리 프로모터로서 기능하는 pLOI2183 플라스미드 내의 제트. 모빌리스 DNA 단편의 부분 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 1)을 나타낸다. 그 완전 서열은 진뱅크 수탁 번호 AF109242 (서열 번호 2)가 정해졌다. 두 전사 출발 부위 (#), -35 및 -10 영역, 샤인-델가르노 부위 (굵은 글씨), 부분 벡터 및 celZ 서열 (소문자) 및 celZ 출발 코돈 (굵게 나타낸 atg)이 표시되어 있다.
도 6은 외부 세포벽과 내부 막 (im) 사이에 위치된 주변 세포질 포합체 (pib) 형태의 글루카나제를 거의 발현시키지 않는 (pUC19; 패널 A), 적당히 발현시키는 (pLOI2164; 패널 B) 및 고도로 발현시키는 (pLOI2307; 패널 C) 다른 플라스미드를 포함하는 이. 콜리 B 세포의 전자 현미경사진을 나타낸다.
도 7은 재조합 숙주의 게놈으로 도입될 수 있고 숙주에 안정한 글루카나제 발현 활성을 부여할 수 있는 유전자 작제물인 celZ 통합 벡터 pLOI2306을 작제하는데 사용되는 클로닝 방법의 개략도를 나타낸다.
도 8은 제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터, 이. 크리산테미로부터의 celZ 유전자, 내성 마커 (bla 및 tet) 및 케이. 옥시토카 표적 서열의 위치를 나타낸 celZ 통합 벡터 pLOI2306 (서열 번호 12)의 개략도를 나타낸다.
본 발명의 전체 영역을 명확하게 이해하기 위하여, 다음 정의가 제공된다.
I. 정의
본원에 사용된 용어 "재조합 숙주"는 유전자 조작에 적합한, 예를 들면 형질감염될 수 있는, 예를 들면 이종성 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는 세포를 포함한다. 그 세포는 미생물이거나 또는 고등 진핵 세포일 수 있다. 그 용어는 원래 형질감염된 세포의 후대를 포함한다. 바람직한 양태에서, 세포는 세균 세포, 예를 들면 그람-음성 세균 세포이며, 이 용어는 에세리히아, 쉬겔라, 시트로박터, 살모넬라, 클레브시엘라, 엔테로박터, 에르위니아, 클루위베라, 세라티아, 세데세아, 모르가넬라, 하프니아, 에드와르드시엘라, 프로비덴시아, 프로테우스 및 예르시니아와 같은 장내세균과의 모든 통성 혐기성 그람-음성 세포를 포함한다. 특히 바람직한 재조합 숙주는 에세리히아 콜리 또는 클레브시엘라 옥시토카 세포이다.
용어 "이종성 폴리뉴클레오티드 단편"은 하나 이상의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 일부 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 이종성 폴리뉴클레오티드 단편은 임의의 공급원, 예를 들면 진핵생물, 원핵생물, 바이러스 또는 합성 폴리뉴클레오티드 단편으로부터 유래될 수 있다.
용어 "폴리사카라제" 또는 "셀룰라제"는 본원에서 상호교환가능하게 이용되며 임의의 결합된 당 성분, 예를 들면 디사카라이드, 트리사카라이드, 올리고사카라이드, 예를 들면 복합 탄수화물, 예를 들면 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 펙틴을 포함하는 리그노셀룰로오스의 분해 또는 해중합을 촉매 작용할 수 있는 폴리펩티드를 포함한다. 그 용어는 엔도글루카나제 및 엑소글루카나제를 비롯한 글루카나제 및 β-글루코시다제와 같은 셀룰라제를 포함한다. 더욱 상세하게는, 그 용어는 예를 들면, 셀로비오히드롤라제, 엔도-1,4-β-크실라나제, β-크실로시다제, α-글루쿠로니다제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아세틸에스테라제, 아세틸크실란에스테라제, α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루라나제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 아라비노시다제, 만나나제, 펙틴 히드롤라제, 펙테이트 리아제 또는 이들 셀룰라제의 혼합물을 포함한다.
용어 "대리 프로모터"는 본질적으로는 전사 제어하지 않는 당해 유전자를 전사 제어할 수 있는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 바람직한 양태에서, 대리프로모터의 전사 제어 결과 당해 유전자의 발현 증가가 일어나게 된다. 바람직한 양태에서, 대리프로모터는 당해 유전자의 5'에 놓여진다. 대리 프로모터는 본래 프로모터를 대신하는데 이용되거나, 또는 본래 프로모터에 더하여 사용될 수 있다. 대리 프로모터는 그것이 사용되는 숙주 세포에 대하여 내생성일 수 있거나 또는 예를 들어, 그것이 사용되는 숙주 세포에 대하여 외생성인 숙주 세포로 도입되는 이 종성 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다.
용어 "올리고사카라이드 공급원", "올리고사카라이드", "복합 셀룰로오스", "복합 탄수화물" 및 "폴리사카라이드"는 본질적으로 상호교환가능하게 사용되며 하나 이상의 당 분자를 포함하는 임의의 탄수화물 공급원을 포함한다. 이들 탄수화물은 비가공된 식물 재료 또는 임의의 가공된 식물 재료로부터 유래될 수 있다. 그 예로는 나무, 종이, 펄프, 식물 유래된 섬유 또는 하나 이상의 결합된 탄수화물 성분, 즉 하나의 당 성분을 포함하는 합성 섬유가 있다. 특별한 올리고사카라이드 공급원 중의 하나는 대부분의 식물 재료의 건중량의 약 90%를 나타내는 리그노셀룰로오스이며 그것은 탄수화물, 예를 들면 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 펙틴 및 방향족 중합체, 예를 들면 리그닌을 포함한다. 셀룰로오스는 리그노셀룰로오스의 건중량의 30-50%를 구성하며 셀로비오스 (글루코오스의 다이머)의 단독중합체이다. 마찬가지로, 헤미셀룰로오스는 리그노셀룰로오스의 건중량의 20-50%를 구성하며 아세틸 및 글루쿠로닐 측쇄를 함유하는 펜토오스 (크실로오스, 아라비노오스) 및 헥소오스 (글루코오스, 만노오스, 갈락토오스) 당의 혼합물을 함유하는 복합 중합체이다. 펙틴은 리그노셀룰로오스의 건중량의 1-20%를 구성하며 글루쿠론산의 메틸화 단독중합체이다. 상기 탄수화물 중합체 중 어느 하나 또는 그의 혼합물은 본 발명의 생성물 및 방법에 따른 해중합 및 이어지는 발효에 의한 에탄올로의 생물전환을 위한 가능한 당의 공급원이다.
용어 "유전자(들)"은 핵산 분자, 예를 들면 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며 그것은 비코딩 조절 서열 및 인트론을 더 포함할 수 있다. 또한, 용어 유전자(들)은 기능적 좌위에 위치하는 하나 이상의 유전자, 예를 들면 하나 이상의 유전자 생성물, 예를 들면 분비성 폴리펩티드를 코딩하는 각각 에르위니아 및 클레브시엘라의 pul 또는 out 유전자를 포함한다.
용어 "당해 유전자"는 선택된 목적을 위한 특정 유전자를 포함한다. 그 유전자는 숙주 세포에 대해 내생성일 수 있거나 또는 숙주 세포에 재조합하여 도입될 수 있다. 바람직한 양태에서, 당해 유전자는 탄수화물의 에탄올로의 생물전환 시의 하나 이상의 단계에 포함된다. 따라서, 그 용어는 폴리펩티드, 예를 들면 알코올 데히드로게나제, 피루베이트 데카르복실라제, 분비성 단백질(들) 또는 폴리사카라제, 예를 들면 글루카나제, 예를 들면 엔도글루카나제 또는 엑소글루카나제, 셀로비오히드롤라제, β-글루코시다제, 엔도-1,4-β-크실라나제, β-크실로시다제, α-글루쿠로니다제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아세틸에스테라제, 아세틸크실란에스테라제, α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루라나제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 아라비노시다제, 만나나제, 펙틴 히드롤라제, 펙테이트 리아제 또는 그의 혼합물을 코딩하는 임의의 유전자를 포함한다.
용어 "생물체로부터의 게놈 폴리뉴클레오티드를 세분화하는"은 생물체의 것인 게놈 폴리뉴클레오티드를 기계적 수단, 예를 들면 전단, 초음파, 분쇄 또는 효소적 방법, 예를 들면 뉴클레아제를 이용하여 하나 이상의 단편으로 파괴시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 제한 효소는 후보 프로모터 인자로서의 계속적인 확인을 위해 게놈 단편을 시험 벡터로 클로닝하는 것을 용이하게 하기 위해 사용된 다. 게놈 폴리뉴클레오티드는 임의의 공급원, 예를 들면 진핵생물, 원핵생물, 바이러스 또는 합성 폴리뉴클레오티드 단편으로부터 유래될 수 있다.
용어 "동시 당화 및 발효" 또는 "SSF"는 복합 당의 동시성 분해 또는 해중합 및 그 당 성분의 발효에 의한 에탄올로의 생물전환을 위해 1종 이상의 재조합 숙주를 사용하는 것을 포함한다.
용어 "전사 제어"는 전사도로 유전자 발현을 조절하는 능력을 포함한다. 바람직한 양태에서, 전사, 따라서 유전자 발현은 당해 유전자의 코딩 영역의 5' 말단 부근의 대리 프로모터를 치환하거나 또는 첨가함으로써 조절되어 유전자 발현이 변화하게 된다.
용어 "발현"은 적어도 RNA 생산도에서의 유전자의 발현을 포함한다.
용어 "발현 생성물"은 발현된 유전자의 결과 생성물, 예를 들면 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "발현 증가"는 적어도 증가된 RNA 생산도 및 바람직하게는 폴리펩티드 발현도에서의 유전자의 발현의 변화를 포함한다.
용어 "생산 증가"는 발현된 폴리펩티드의 양, 폴리펩티드의 효소 활성도 또는 그의 혼합의 증가를 포함한다.
용어 "활성" 및 "효소 활성"은 상호 교환가능하게 사용되며 바람직한 조건 하에서 생산될 때 선택된 폴리펩티드에 자연적으로 존재하는 임의의 기능적 활성을 포함한다. 폴리사카라제의 활성은, 예를 들면 복합 사카라이드를 효소적으로 해중합시키는 폴리펩티드의 능력일 것이다. 전형적으로, 선택된 폴리펩티드의 활성은 생산된 폴리펩티드와 관련된 총 효소 활성을 포함한다. 숙주 세포에 의해 생산되며 효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 세포의 세포내 공간에 위치하거나, 세포 결합되거나, 세포외 주위로 분비되거나 또는 그의 혼합 상태일 수 있다. 총 활성을 분비된 활성에 비교하여 결정하는 기술은 본원에 기재되어 있으며 당 업계에 공지되어 있다.
용어 "분비된"은 폴리펩티드, 예를 들면 이종성 폴리펩티드, 바람직하게는 폴리사카라제의 분비의 증가를 포함한다. 전형적으로, 그 폴리펩티드는 자연 분비량을 넘는 증가된 정도로 분비된다. 더욱 바람직하게는, 용어 "분비된"은 자연 분비도에 비해 10% 이상, 더욱 바람직하게는 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 이상 또는 그 이상인 일정 폴리펩티드의 분비 증가를 의미한다.
용어 "분비성 폴리펩티드"는 단독으로 또는 다른 폴리펩티드와 함께, 또다른 폴리펩티드를 세포의 세포내 공간으로부터 세포외 주위로 운반하는 것을 용이하게 하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 한 양태에서, 분비성 폴리펩티드(들)은 그람-음성 숙주 세포에 분비촉진 활성을 부여하기에 충분한 필요한 모든 분비성 폴리펩티드를 포함한다. 전형적으로, 유전자 공학을 이용하여 한 숙주 세포로부터 단리되어 다른 숙주 세포로 전달될 수 있는 분비성 단백질은 단일 영역 또는 좌위에 코딩된다. 바람직한 양태에서, 분비성 폴리펩티드(들)은 분비촉진 활성을 가진 임의의 세균 세포로부터 유래된다. 더욱 바람직한 양태에서, 분비성 폴리펩티드(들)은 타입 II 분비촉진 활성을 가진 숙주 세포로부터 유래된다. 또다른 더욱 바 람직한 양태에서, 숙주 세포는 장내세균과로부터 선택된다. 가장 바람직한 양태에서, 분비성 폴리펩티드(들)은 각각 에르위니아 또는 클레브시엘라의 pul 또는 out 유전자의 하나 이상의 유전자 생성물이다. 또한, 숙련인은 본원에 기재된 pul 또는 out 유전자(들)에 충분히 상동성인 관련 숙주로부터 유래된 임의의 분비성 단백질(들)이 이용될 수도 있음을 이해할 것이다 (Pugsley et al., (1993) Microbiological Reviews 57:50-108; Lindeberg et al., (1996) Mol. Micro. 20:175-190; Lindeberg et al., (1992) J. of Bacteriology 174:7385-7397; He et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:1079-1083).
용어 "로부터 유래된"은 표시된 공급원으로부터의 폴리뉴클레오티드 단편의 단리 (전체 또는 부분)를 포함한다. 그 용어는 예를 들면 표시된 폴리뉴클레오티드 공급원과 관련된 서열로부터의 또는 그를 기초로 한 인공 합성, 직접 클로닝, PCR 증폭을 포함한다.
용어 "에탄올생성"은 미생물이 탄수화물로부터 에탄올을 1차 발효 생성물로서 생산하는 능력을 포함한다. 그 용어는 자연 에탄올생성 생물체, 자연 또는 유도 돌연변이된 에탄올생성 생물체 및 유전적으로 변형된 에탄올생성 생물체를 포함한다.
용어 "그람-음성 세균"은 이 용어의 업계 인정된 정의를 포함한다. 전형적으로, 그람-음성 세균은 예를 들면 특히 에세리히아 및 클레브시엘라종을 포함하는 장내세균과를 포함한다.
용어 "충분히 상동성"은 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 제2 아미노 산 또는 뉴클레오티드 서열과 충분한 또는 최소 수의 동일한 또는 동등한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드, 예를 들면 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 함유하여 제1 및 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 공통된 구조적 도메인 및(또는) 공통된 기능적 활성을 갖게 되는 것을 의미한다. 예를 들면, 공통된 구조적 도메인을 갖는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 도메인의 아미노산 서열에 대해 약 40% 이상의 상동성, 바람직하게는 50%의 상동성, 더욱 바람직하게는 60%, 70%, 80% 또는 90%의 상동성을 가지며 하나 이상, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개, 더더욱 바람직하게는 4개, 5개 또는 6개의 구조적 도메인을 함유하며, 그것은 본원에 충분하게 상동성인 것으로 정의된다. 또한, 40% 이상, 바람직하게는 50%, 더욱 바람직하게는 60%, 70%, 80% 또는 90%의 상동성을 가지며 공통된 기능적 활성을 갖는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 본원에 충분하게 상동성인 것으로 정의된다.
한 양태에서, 두 폴리뉴클레오티드 단편, 예를 들면 프로모터들은, 그들이 뉴클레오티드 서열 내의 실질적인 동일성의 결과로서 실질적으로 동일한 조절 효과를 갖는다면 "충분히 상동성"이다. 전형적으로, "충분히 상동성인" 서열은 적어도 원하는 조절과 관련된 것으로 알려진 영역에서 50% 이상, 더욱 바람직하게는 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상 동일하다. 더욱 바람직하게는, 5개 이하의 염기가 상이하다. 가장 바람직하게는, 5개 이하의 연속 염기가 상이하다.
두 폴리뉴클레오티드 단편 또는 두 아미노산 서열의 동일성 %를 확인하기 위해서는 서열들을 최적 비교 목적으로 정렬한다 (예를 들면, 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘다에 최적 정렬을 위해 간격을 도입할 수 있고 비상동성 서열은 비교 목적에 무시될 수 있다). 바람직한 양태에서, 비교 목적으로 정렬된 기준 서열의 길이는 그 기준 서열의 길이의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 더더욱 바람직하게는 60% 이상, 더더욱 바람직하게는 70%, 80% 또는 90% 이상이다. 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열 내의 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 그 위치에 있는 분자는 동일하다 (본원에 사용된 바와 같이 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동등하다). 두 서열 사이의 동일성 %는 간격의 수를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수 및 두 서열의 최적 배열을 위해 도입되어야 하는 각 간격의 길이의 함수이다.
서열의 비교 및 두 서열 사이의 동일성 %의 확인은 수학적 연산을 이용하여 이루어질 수 있다. 바람직한 양태에서, 두 아미노산 서열 사이의 동일성 %는 블로솜 (Blossom) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 간격 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용하여 GCG 소프트웨어 팩키지 안의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능함)으로 삽입되는 니들만과 운쉬 (Needleman and Wunsch)(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) 연산을 이용하여 확인된다. 또다른 바람직한 양태에서, 두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 %는 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 간격 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용하여 GCG 소프트웨어 팩키지 안의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능함)을 이용하여 확인된다. 또다른 양태에서, 두 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 %는 PAM120 가중치 유수 표, 12의 간격 길이 패널티 및 4의 간격 패널티를 이용하여 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0)으로 삽입된 메이어스와 밀러 (E. Meyers and W. Miller)(CABIOS, 4:11-17 (1989))의 연산을 이용하여 확인된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 또한 공공 데이타베이스에 대한 연구를 수행하기 위해, 예를 들면 다른 과의 일원 또는 관련 서열, 예를 들면 프로모터 서열을 확인하기 위해 "조회 서열"로서 사용될 수 있다. 그러한 연구는 알츌 등 (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버젼 2.0)을 이용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 연구는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어길이 = 12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 연구는 본 발명의 폴리펩티드 분자와 상동성인 아미노산 서열을 얻기 위해 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이 = 3으로 수행될 수 있다. 비교를 위한 간격이 있는 배열을 하기 위하여, 간격있는 BLAST가 문헌 (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402)에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 간격있는 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램 (예를 들면, XBLAST 및 NBLAST)의 생략성 파라메터를 이용할 수 있다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조).
II. 재조합 숙주
본 발명은 에탄올의 생산에 사용하기에 적합한 재조합 숙주 세포에 관한 것 이다. 한 양태에서, 세포는 대리 프로모터의 전사 제어 하에 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 이종성 폴리뉴클레오티드 및 대리 프로모터는 플라스미드를 기재로 할 수 있거나 또는 생물체의 게놈으로 통합될 수 있다 (실시예에 기재됨). 바람직한 양태에서, 숙주 세포는 복합 당을 에탄올로 생물전환시키는데, 또는 그의 단계에서 사용하기에 바람직한 폴리펩티드의 공급원으로서 사용된다.
바람직한 양태에서, 이종성 폴리뉴클레오티드 단편은 숙주에서 자연 발생되는 것 보다 더 고도로 발현되는 폴리사카라제 폴리펩티드를 코딩한다. 폴리사카라제는 β-글루코시다제, 글루카나제, 엔도글루카나제 또는 엑소글루카나제, 셀로비오히드롤라제, 엔도-1,4-β-크실라나제, β-크실로시다제, α-글루쿠로니다제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아세틸에스테라제, 아세틸크실란에스테라제, α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루라나제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 아라비노시다제, 만나나제, 펙틴 히드롤라제, 펙테이트 리아제 또는 그의 혼합물일 수 있다.
한 양태에서, 폴리사카라제는 이. 크리산테미로부터 유래되고 celZ 유전자에 의해 코딩되는 글루카나제 (EGZ) 폴리펩티드이다. 그러나, celY (Guiseppi et al., (1991) Gene 106:109-114) 또는 bgxA (Vroeman et al., (1995) Mol. Gen. Genet. 246:465-477)에 의해 코딩되는 글루코히드롤라제를 비롯한, 이. 크리산테미로부터 유래된 다른 폴리사카라제가 이용될 수도 있다. celY 유전자 생성물 (EGY)은 엔도글루카나제이다. bgxA 유전자는 β-글루코시다제 및 β-크실로시다제 활성 을 코딩한다 (Vroeman et al., (1995) Mol. Gen. Genet. 246:465-477). 바람직하게는, 10% 이상, 더욱 바람직하게는 20%, 30%, 40% 또는 50%의 폴리사카라제 활성의 증가가 관찰된다. 가장 바람직하게는, 몇배, 예를 들면 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700% 또는 800%의 폴리사카라제 활성의 증가가 얻어진다.
별법으로, 원하는 폴리사카라제는 다른 종, 예를 들면 효모, 곤충, 동물 또는 식물로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 단편에 의해 코딩될 수 있다. 이들 유전자 중의 하나 이상은 복합 당 기질을 해중합시키기에 적합한 폴리사카라제의 농도를 상승시키기 위해 본 발명의 숙주 세포에 도입되어 발현될 수 있다. 재조합 숙주에 이들 유전자 중의 하나를 도입하고 발현시키는 기술은 실시예에 제시되어 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 숙주 세포는 세포로부터의 원하는 폴리펩티드를 용이하게 얻기 위해 분비성 단백질(들)을 발현하도록 조작되었다. 한 양태에서, 분비성 단백질(들)은 그람 음성 세균 세포, 예를 들면 장내세균과로부터의 세포로부터 유래된다. 다른 양태에서, 분비성 단백질(들)은 에르위니아로부터 유래되며 out 유전자에 의해 코딩된다. 또다른 양태에서, 분비성 단백질은 클레브시엘라로부터 유래된 pul 유전자이다. 이들 하나 이상의 분비성 단백질을 도입하는 것은 숙주 세포가 장내 세균, 예를 들어 세포벽을 가진 그람 음성 세균인 경우 특히 바람직하다. 본 발명의 대표적인 그람 음성 숙주 세포는 장내세균과로부터 유래되며, 예를 들면 에세리히아 및 클레브시엘라를 포함한다. 한 양태에서, 숙주에 하나 이상의 분비성 단백질을 도입하면 분비되는 단백질, 예를 들면 폴리사카라제의 분비가 자연 분비도에 비해 증가된다. 바람직하게는, 분비의 증가는 자연 분비도에 비해 10% 이상, 더욱 바람직하게는 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 또는 그 이상이다. 바람직한 양태에서, 분비 유전자의 첨가는 폴리사카라제 폴리펩티드가 더 높은 정도로 생산되도록 한다. 바람직한 양태에서, 분비 유전자의 첨가는 폴리사카라제 폴리펩티드가 더 높은 효소 활성을 갖고 생산되도록 한다. 가장 바람직한 양태에서, 폴리사카라제는 더 높은 정도로 또한 더 높은 효소 활성을 갖고 생산된다. 바람직하게는, 10% 이상, 더욱 바람직하게는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 폴리사카라제 활성의 증가가 얻어진다. 가장 바람직하게는, 분비 유전자 없는 세포 (예를 들면, 분비 유전자가 결핍되어 있거나 또는 충분한 정도로 발현하지 않는 세포)에 비해, 몇배, 예를 들면 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 또는 1000%의 폴리사카라제 활성의 증가가 얻어진다. 그러한 유전자를 도입하고 원하는 폴리펩티드, 예를 들면 폴리사카라제의 증가된 생산을 측정하는 기술 및 방법은 실시예에 상세히 설명되어 있다. 다른 동등한 방법은 당 업계의 숙련인에게 공지되어 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 에탄올생성 재조합 숙주를 이용한다. 한 양태에서, 재조합 숙주는 그람-음성 세균이다. 다른 양태에서, 재조합 숙주는 장내세균과로부터 유래된다. 예를 들면 참고로 인용된 미국 특허 제5,821,093호의 에탄올생성 숙주는 적합한 숙주이며, 특히 이. 콜리 균주 KO4 (ATCC 55123), KO11 (ATCC 55124) 및 KO12 (ATCC 55125), 및 클레브시엘라 옥시토카 균주 M5A1을 포함한다. 또한, 본 발명의 비에탄올생성 숙주는 예를 들면 지모모나스 모빌리스와 같 은 효율적인 에탄올 생산자로부터 예를 들면 에탄올생성 유전자를 도입함으로써 에탄올생성 숙주 (예를 들면, 상기 균주)로 전환될 수 있다. 표준 기술을 이용하는 이러한 유형의 유전 공학의 결과 재조합 숙주가 당을 에탄올로 효율적으로 발효시킬 수 있게 된다. 또한, LY01 에탄올 내성 균주 (ATCC )는 공개된 PCT 국제 출원 WO 98/45425에 기재된 바와 같이 이용될 수 있고 이 공개된 출원은 본원에 참고로 인용되어 있다 (Yomano et al. (1998) J. of Ind. Micro & Bio. 20:132-138 참조).
다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 비에탄올생성 재조합 숙주, 예를 들면 이. 콜리 균주 B, 이. 콜리 균주 DH5α 또는 클레브시엘라 옥시토카 균주 M5A1을 사용한다. 이 균주는 본원에 기재된 기술을 이용하여 원하는 폴리펩티드, 예를 들어 폴리사카라제를 발현시키는데 이용될 수 있다. 또한, 이들 재조합 숙주는 또다른 원하는 폴리펩티드, 예를 들면 다른 폴리사카라제를 발현하는 다른 재조합 숙주와 함께 이용될 수 있다. 또한, 비에탄올생성 숙주 세포는 에탄올생성 숙주 세포와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 복합 당의 해중합을 실시하기 위해 비에탄올생성 숙주(들)을 사용하고, 이어서 해중합된 당의 발효를 위해 에탄올생성 숙주를 사용할 수 있다. 따라서, 이 반응은 예를 들어 비에탄올생성 및 에탄올생성 재조합 숙주의 균질 또는 혼합된 배양액을 이용하여 연속적으로 또는 동시에 수행될 수 있음을 이해할 것이다.
바람직한 양태에서, 당 기질을 에탄올로 발효시키는데 필요한 하나 이상의 유전자는 플라스미드 상에 제공되거나 또는 숙주 염색체로 통합된다. 더욱 바람직 하게는, 당 기질을 에탄올로 발효시키기 위한 필수 유전자, 예를 들어 피루베이트 데카르복실라제 (예를 들면, pdc) 및(또는) 알코올 데히드로게나제 (예를 들면, adh)는 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제5,821,093호에 기재된 PET 오페론과 같은 인공 오페론을 이용하여 본 발명의 숙주에 도입된다. 사실상, 본 발명은 당 업계에 공지된 바와 함께 다중 유전자를 적합한 숙주로 도입하기 위한 기술 및 벡터를 제공함을 이해할 것이다 (본원에 참고로 인용된, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992), Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), and Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Kreig et al., Williams and Wilkins (1984) 참조). 따라서, 본 발명의 방법을 이용하여 단일 유전자 작제물은 동시 당화 및 발효 (SSF)를 수행하는데 필요한 모든 유전자 생성물 (예를 들면, 글루카나제, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 분비성 단백질(들), 피루베이트 데카르복실라제, 알코올 데히드로게나제)을 코딩할 수 있다. 또한, 그러한 숙주는 당 업계에 공지된 방법을 이용하여 도입된 유전자의 안정성, 발현 및 기능을 저해할 임의의 내생성 유전자(들) (예를 들면, 리콤비나제 유전자)에 돌연변이를 갖도록 더 조작될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 발명은 본원에 기재된 것과 충분히 상동성인 임의의 조절 인자, 유전자(들) 또는 유전자 생성물, 즉 폴리펩티드를 포함함을 이해할 것이다.
도입된 유전자를 갖는 균주를 스크리닝하는 방법은 통상적이며 알코올 데히 드로게나제 (ADH) 또는 글루카나제 (EGZ) 유전자 생성물을 발현하는 세포를 확인할 수 있는 가시 스크린에 의해 실행될 수 있다. ADH 유전자 생성물은 p-로세아닐린의 류코술폰산 유도체와 반응하여 강한 적색 생성물을 생산하는 아세트알데히드를 생산한다. 따라서, ADH-양성 클론은 쉽게 스크리닝될 수 있고 혈액 적색 콜로니로서 확인된다. EGZ, 예를 들어 폴리사카라제 활성을 스크리닝하는 방법의 결과 또한 아래 및 실시예에 기재된 바와 같은 투명한 가시 페노형이 형성된다.
예를 들어 PET 오페론을 발현하는 재조합 세균은 전형적으로 산성이 아닌 중성 발효 생성물의 생산으로 인해 비변형된 모 생물체 보다 액체 배양액에서 더 높은 세포 밀도로 성장한다 (Ingram et al., (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:397-404). 에탄올생성 클론은 평판 상에서 효모와 같이 잘 보이는 도드라진 큰 콜로니로서 쉽게 보인다. 이러한 특징은 새로운 균주의 작제 동안에 아주 유용하며 새로운 작제물의 유용성의 예비 표시를 제공할 수 있다. 에탄올 생산 가능성의 신속한 평가는 알데히드 인디케이터 평판 상의 적색 반점 발생 속도를 시험함으로써 이루어질 수도 있다 (Conway et al., (1987) J. Bacteriol. 169:2591-2597). 전형적으로, 에탄올로의 당 전환에 효율적인 것으로 입증된 균주는 이입된 지 수 분 내에 알데히드 인디케이터 평판 상의 적색 반점의 형성에 의해 인식될 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 양태에서, 단일 숙주 세포는 에탄올을 생성하는 것이며, 즉 숙주 세포가 폴리사카라제(들)을 생산하고 분비하고, 복합 당을 분해하고 분해된 당을 에탄올로 발효시키는 능력을 갖도록 인공적으로 도입되거나 또는 강화된 (예를 들면, 다른 종 또는 균주로부터의 대리 프로모터 및(또는) 유전자를 이용 함) 또는 자연 발생된 필요한 모든 유전자를 갖는다. 따라서, 그러한 숙주는 동시 당화 및 발효에 적합하다.
또한, 본 발명은 본래의 이. 콜리 발효 경로가 산성 및 중성 생성물 (풍부한 순서): 락트산, 수소 + 이산화 탄소 (포르메이트로부터 얻음), 아세트산, 에탄올 및 숙시네이트의 혼합물을 생산한다는 것을 고려한다. 그러나, 제트. 모빌리스 PDC (피루베이트 데카르복실라제)는 임의의 경쟁 이. 콜리 효소 보다 피루베이트에 대해 더 낮은 Km을 갖는다. 고활성의 PDC를 발현시킴으로써 탄소 흐름은 락트산 및 아세틸-CoA로부터 아세틸알데히드 및 에탄올로 효과적으로 방향이 바뀐다. 소량의 포스포에놀피루베이트는 푸마레이트 리덕타제 유전자 (frd)를 삭제함으로써 제거될 수 있다 (Ingram et al., (1991) 미국 특허 제5,000,000호; Ohta et al., (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900). 다른 경쟁 경로를 완전히 제거하기 위해 추가의 돌연변이 (예를 들면, pfl 또는 ldh 유전자에서)가 이루어질 수 있다 (Ingram et al., (1991) 미국 특허 제5,000,000호). 도입된 유전자 (플라스미드를 기재로 하거나 또는 게놈으로 통합됨)의 안정성을 손상시킬 수 있는 효소 (예를 들면, recA와 같은 리콤비나제)를 제거하기 위한 추가의 돌연변이가 도입되거나, 특별한 배경으로부터 선택되거나 또는 선별될 수도 있다.
또한, 단백질 또는 전체 대사 경로를 코딩하는 유전자를 단일 조작가능한 작제물로 형질전환시키는, 본 발명에 의해 부여된 능력이 아주 유용함은 당 업계의 숙련인에게 쉽게 명확해져야 한다. 이러한 면에서, 예를 들면 다른 유전자좌로부터의 유전자가 염색체 상에 놓여진 각종 상황에 본 발명을 적용하는 것이 예상된 다. 이것은 단일 프로모터의 제어 하의 멀티-시스트론 카세트일 수 있거나 또는 분리 프로모터가 사용될 수 있다.
에탄올을 생성하며 본 발명의 방법에 따른 추가의 개선에 적합한 예시적인 이. 콜리 균주는 예를 들면 KO4, KO11 및 KO12 균주, 및 LY01 균주, 이. 콜리 균주 KO11의 에탄올 내성 돌연변이를 포함한다. 이상적으로, 환경적 스트레스에 견디고, 에탄올을 생산하고 폴리사카라제(들)을 분비하도록 조작될 수 있는 이들 균주는 이. 콜리 균주 ATCC 11303으로부터 유래될 수 있다. 또한, 최근의 PCR 연구는 ATCC 11303 균주가 이. 콜리의 병원성과 관련있는 것으로 알려진 모든 유전자가 결핍된 것임을 확인하였다 (Kuhnert et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:703-709).
본 발명에 따른 개선을 위한 다른 바람직한 에탄올생성 숙주는 많은 다른 리그노셀룰로오스 재료 및 다른 기질로부터 헤미셀룰로오스 가수분해물을 발효시킬 수 있는 이. 콜리 KO11 균주이다 (Asghari et al., (1996) J. Ind. Microbiol. 16:42-47; Barbosa et al., (1992) Current Microbiol. 28:279-282; Beall et al., (1991) Biotechnol. Bioeng. 38:296-303; Beall et al., (1992) Biotechnol. Lett. 14:857-862; Hahn-Hagerdal et al., (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41:62-72; Moniruzzaman et al., (1996) Biotechnol. Lett. 18:955-990; Moniruzzaman et al., (1998) Biotechnol. Lett. 20:943-947; Grohmann et al., (1994) Biotechnol. Lett. 16:281-286; Guimaraes et al., (1992) Biotechnol. Bioeng. 40:41-45; Guimaraes et al., (1992) Biotechnol. Lett. 14:415-420; Moniruzzaman et al., (1997) J. Bacteriol. 179:1880-1886). 도 1에는 이 균주에 대한 생물전환의 동력학이 나타나 있다. 특히, 이 균주는 쌀겨로부터 얻은 헤미셀룰로오스 가수분해물 (펜토오스 당 58.5 g/L 및 헥소오스 당 37 g/L을 함유함)을 에탄올로 신속하게 발효시킬 수 있다 (Moniruzzaman et al., (1998) Biotechnol. Lett. 20: 943-947). 이 균주는 48 내지 72 시간 내에 또한 이상적인 조건 하에서는 24시간 내에 완결하기 위해 헤미셀룰로오스 가수분해물을 발효시킬 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 숙주 세포는 클레브시엘라 세균이다. 특히, 클레브시엘라 옥시토카가 바람직한데, 그 이유는 이 장내 세균이 이. 콜리와 같이 더욱 복잡한 당의 구성성분인 단량체 당을 대사시키는 본래의 능력을 갖고 있기 때문이다. 또한, 케이. 옥시토카는 셀룰로오스의 효소적 가수분해로부터 얻은 가용성 중간체인 셀로비오스 및 셀로트리오스를 운반하고 대사할 수 있는 추가의 이점을 갖는다 (Lai et al., (1996) Appl. Environ. Microbiol. 63:355-363; Moniruzzaman et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:4633-4637; Wood et al., (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110). 본 발명은 PET 오페론 내에 코딩된 제트. 모빌리스 pdc 및 adhB 유전자를 갖는 케이. 옥시토카, 예를 들면 균주 M5A1의 유전자 조작된 에탄올생성 유도체를 제공한다 (본원 및 미국 특허 제5,821,093호; Wood et al., (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110에 기재됨).
따라서, 형성된 생물체 균주 P2는 단량체 당으로부터 또한 라피노오스, 스타키오스, 수크로오스, 셀로비오스, 셀로트리오스, 크실로비오스, 크실로트리오스, 말토오스 등을 비롯한 각종 사카라이드로부터 효율적으로 에탄올을 생산한다 (Burchhardt et al., (1992) Appl. Environ. Microl. 58:1128-1133; Moniruzzaman et al., (1997) Appl. Environ. Microl. 63:4633-4637; Moniruzzaman et al., (1997) J. Bacteriol. 179:1880-1886; Wood et al., (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110). 이 균주는 폴리사카라제를 발현하고 분비하도록 본 발명의 방법에 따라 더 변형될 수 있다. 따라서, 이 균주는 SSF 방법에서 복합 사카라이드의 생물전환에 사용하기에 적합하다 (Doran et al., (1993) Biotechnol. Progress. 9:533-538; Doran et al., (1994) Biotechnol. Bioeng. 44:240-247; Wood et al., (1992) Appl. Environ. Microl. 58:2103-2110). 특히, 이 에탄올생성 P2 균주를 사용하면 보충 셀로비아제를 추가시킬 필요가 없으며, 이것은 상업적 진균 셀룰라제의 적어도 안정한 성분 중의 하나이다 (Grohmann, (1994) Biotechnol. Lett. 16:281-286).
이종성 유전자 발현에 사용하기에 적합한 프로모터를 위한 스크린
한 양태에서, 본 발명의 대리 프로모터가 이종성 유전자, 예를 들면 폴리사카라제의 발현을 개선시키는데 이용되긴 하지만, 본 발명이 또한 임의의 원하는 유전자 생성물의 발현을 증강시키는데 적합한 대리 프로모터를 스크리닝할 수 있게 함을 이해할 것이다. 일반적으로, 그 스크리닝 방법은 실시예 1에 기재되고 도 3에 도시된, 후보 프로모터 단편이 리포터 유전자에 용이하게 연결되고 작동적으로 결합되도록 하는 클로닝 벡터를 사용한다. 한 양태에서, 글루카나제를 코딩하는 celZ 유전자는, 플라스미드를 가진 세포가 특정 배지 (CMC 평판) 상에서 성장될 때 이 효소 (글루카나제)의 발현으로 인해 강한 비색 변화가 일어나기 때문에 편리한 리포터 유전자로서 작용한다. 따라서, 후보 프로모터, 예를 들면 벡터에 "샷건 (shotgun)" 클로닝되고 작동적으로 결합될 수 있는 특정 프로모터 서열 또는 랜덤 서열이 숙주 세포에 도입될 수 있고 CMC 평판 상의 페노형 글루카나제-매개된 비색 변화에 의해 입증되는 바와 같은 증가된 유전자 발현에 대해 결과 콜로니가 가시적으로 주사된다. 그후에, 목적하는 페노형을 가진 콜로니는 형질전환 DNA를 생산하도록 가공되고 프로모터는 적절한 프라이머를 사용하여 서열화된다 (더 상세한 내용은 실시예 1 참조).
CMC 평판 상의 글루카나제-매개된 비색 변화와 효소의 발현도 사이의 높은 상관관계는 후보 프로모터의 강도의 우수한 지표이다 (도 4). 그러므로, 본 발명의 방법은 후보 대리 프로모터의 강도의 등급을 정하기 위한 신속한 육안 시험을 제공한다. 따라서, 특별한 확인된 대리 프로모터는 이 검정법을 이용하여 특정 유전자 생성물에 필요한 원하는 발현도에 따라서 선택될 수 있다. 예를 들면, 간단하게 최고 발현도가 요망된다면, 최대 비색 변화를 나타내는 후보 프로모터가 선택될 수 있다. 예를 들어 발현될 목적 생성물이 고농도에서 독성이거나 또는 다른 생성물과 동등한 농도에서 발현되어야 하는 이유로 더 낮은 정도의 발현이 요망되는 경우, 더 약한 대리 프로모터가 기재된 바와 같이 확인되고, 선택되고 사용될 수 있다.
III. 이용 방법
복합 사카라이드의 분해 또는 해중합
한 양태에서, 본 발명의 숙주 세포는 복합 당, 예를 들면 리그노셀룰로오스 또는 올리고사카라이드를 더 작은 당 성분으로 분해 또는 해중합시키는데 이용된다. 이를 위해, 본 발명의 숙주 세포는 바람직하게는 하나 이상의 폴리사카라제, 예를 들면 글루카나제를 발현시키며, 이들 폴리사카라제는 생산자 생물체로부터 자연적으로 유리될 수 있다. 또한, 폴리사카라제는 세포를 물리적으로 파괴시킴으로써 생산자 세포로부터 유리된다. 세포를 물리적으로 (예를 들면, 전단, 초음파), 효소적으로 (예를 들면, 리소자임) 또는 화학적으로 파괴시키는 각종 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 방법이 이용될 수 있다. 일단 원하는 폴리펩티드가 내부 세포 공간으로부터 유리되면, 그것은 에탄올로의 계속적인 생물전환을 위해 복합 사카라이드 기질을 더 작은 당 성분으로 분해시키는데 이용될 수 있다. 유리된 셀룰라제는 당 업계에 공지된 표준 생화학적 기술을 이용하여 정제될 수 있다. 또한, 유리된 폴리사카라이드는 다른 세포 성분으로부터 정제되거나 또는 단리될 필요가 없으며 당 기질에 직접 적용될 수 있다.
다른 양태에서, 폴리사카라제가 성장 배지로 분비되도록 폴리사카라제 및 분비성 단백질(들)을 동시 발현하는 숙주 세포가 이용된다. 이는 숙주 세포로부터 폴리사카라제를 유리하기 위해 갖는 상기 단계를 없앤다. 이러한 유형의 숙주를 이용할 때, 그 숙주는 복합 사카라이드를 함유하는 수용액에 직접 이용될 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명의 숙주 세포는 하나 이상의 폴리사카라제를 발현하도록 설계되거나 또는 다른 폴리사카라제를 발현하는 또다른 숙주와 혼합된다. 예를 들어, 한 숙주 세포가 이종성 β-글루코시다제를 발현할 수 있는 동안 다른 숙주 세포가 엔도글루카나제를 발현할 수 있고 또다른 숙주 세포가 엑소글루카나제 를 발현할 수 있으며, 이들 세포는 다중 폴리사카라제 활성을 가진 불균질 배양액을 형성하도록 혼합될 수 있다. 또한, 바람직한 양태에서, 단일 숙주 균주는 상기 모든 폴리사카라제를 생산하도록 조작된다. 어느 경우든, 당 기질에 적용하기 위한 원하는 폴리사카라제의 고도의 발현이 이루어지는 재조합 숙주(들)의 배양액이 생산된다. 필요시에, 이 혼합물은 추가의 셀룰라제, 예를 들어 진균 셀룰라제와 같은 외생성 셀룰라제와 혼합될 수 있다. 그후에, 이 혼합물은 복합 기질을 분해하는데 이용된다. 또한, 복합 당 기질을 첨가하기 전에, 폴리사카라제(들)은 표준 생화학적 기술을 이용하여 세포 및(또는) 배지로부터 정제되어 당 기질을 해중합시키기 위한 순수한 효소 원료로서 사용된다.
마지막으로, 본 발명의 에탄올 생산 세균 균주는 혐기성 조건 하에서 (예를 들면, 산소 부재 하에서) 단백질의 부적당한 폴딩 기회가 더 적기 때문에 (예를 들어, 부적절한 이황화 결합 형성으로 인해) 재조합 단백질의 생산을 위한 탁월한 숙주라는 것을 당 업계의 숙련인이라면 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 숙주 및 배양 조건은 잠재적으로 생물학적 활성 생성물을 더 많이 회수하게 한다.
복합 사카라이드의 발효
본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 특성을 가진 숙주 세포는 또한 에탄올을 생성하는 것이다. 따라서, 그러한 숙주 세포는 복합 사카라이드를 모노사카라이드로 분해 또는 해중합시키는데 적용될 수 있다. 이어서, 그 세포는 더 간단한 당을 발효에 의해 에탄올로 대사 분해시킬 수 있다. 복합 사카라이드의 더 작은 당 성분으로의 해중합에 이은 발효의 동시 과정은 동시 당화 및 발효로서 불리운다.
전형적으로, 생산자 숙주 세포 균주의 최상 성장 동력학 및 배양액에 의해 형성되는 효소에 대한 촉매 작용 조건을 촉진시키기 위한 최적 pH 및 온도를 제공하는 발효 조건이 선택된다 (Doran et al., (1993) Biotechnol. Progress. 9:533-538). 예를 들면, 클레브시엘라, 예를 들어 P2 균주의 경우, 최적의 조건은 35-37 ℃ 및 pH 5.0-pH 5.4인 것으로 확인되었다. 이러한 조건 하에서, 외생성으로 첨가된 진균 엔도글루카나제 및 엑소글루카나제는 장기간 동안 아주 안정하고 계속 기능한다. 다른 조건이 실시예에 논의된다. 또한, 본 발명의 정해진 발효 반응을 최적화하기 위해 당 업계에 공지된 기술을 이용하는 통상적인 실험 만이 필요하다는 것은 당 업계의 숙련인이라면 이해할 것이다.
현재, 리그노셀룰로오스와 같은 복합 사카라이드의 전환은 아주 관련있는 다단계 과정이다. 예를 들면, 리그노셀룰로오스는 먼저 산 가수분해를 이용하여 분해 또는 해중합되어야 한다. 이 다음에 고체로부터 액체를 분리시키는 단계가 이어지고, 이 생성물은 이어서 세척되고 해독되어 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스가 형성되고, 그것은 더 해중합될 수 있고 (첨가된 셀룰라제를 이용하여), 마지막으로 적합한 에탄올생성 숙주 세포에 의해 발효된다. 대조적으로, 옥수수의 발효는 아밀라제가 에탄올생성 숙주에 의한 본질적으로 1단계 과정의 즉각적인 생물전환을 위해 옥수수 전분을 분해시키는데 사용될 수 있다는 점에서 훨씬 더 간단하다. 따라서, 본 발명의 재조합 숙주 및 방법이 마찬가지로 더 간단하고 더 효율적인 리그노셀룰로오스의 발효 방법을 이용한다는 것은 당 업계의 숙련자라면 이해할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 산 가수분해를 전혀 이용하지 않는 방법을 포함 한다. 또한, 본 발명의 숙주는 다음의 이점을 갖는다: 1) 펜토오스 및 헥소오스 동시 발효의 효능; 2) 독소에 대한 내성; 3) 복합 사카라이드 해중합을 위한 효소의 생산; 및 4) 환경적 내구력. 따라서, 리그노셀룰로오스를 해중합시키는 복잡성은 본 발명의 개선된 생체촉매를 이용하여 단순화될 수 있다. 사실상, 본 발명의 바람직한 한 양태에서, 반응은 단일 반응 용기에서 산 가수분해의 부재하에, 예를 들면 SSF 방법으로서 수행될 수 있다.
에탄올로의 생물전환을 위한 잠재적 기질
본 발명의 한 이점은 지금까지 충분히 활용되지 않은 사카라이드 공급원을 사용하는 능력이다.
많은 복합 사카라이드 기질은 본 발명의 숙주 세포 및 방법을 이용하여 해중합 및 계속되는 발효를 위한 출발 원료로서 사용될 수 있다. 이상적으로, 재순환가능한 자원은 SSF 방법에 이용될 수 있다. 혼합된 사무실 폐지는 바람직한 기질이며 (Brooks et al., (1995) Biotechnol. Progress. 11:619-625; Ingram et al., (1995) 미국 특허 제5,424,202호), 산 예비처리된 사탕수수 찌끼 (Doran et al., (1994) Biotech. Bioeng. 44:240-247) 또는 고도로 정제된 결정성 셀룰로오스 (Doran et al., (1993) Biotechnol. Progress. 9:533-538) 보다 훨씬 더 쉽게 분해된다. 글루카나제는 엔도글루카나제 및 엑소글루카나제 둘다가 셀룰로오스 결합 도메인을 함유하기 때문에, 이들 효소는 원심분리를 이용하여 비분해된 셀룰로오스 성분을 수거함으로써 계속되는 발효를 위해 쉽게 재순환될 수 있다 (Brooks et al., (1995) Biotechnol. Progress. 11:619-625). 이 성분을 출발물질로서 결합 효소와 함께 첨가함으로써 에탄올 수율 (단위 기질 당)은 진균 효소 사용량이 60% 감소된 상태로 이론치 수율의 80% 이상으로 증가되었다 (도 2). 그러한 작업은 정제된 셀룰로오스로 잘 이루어지긴 하지만, 재순환 단계의 수는 더 높은 리그닌 함량을 가진 기질로 제한될 수 있다. 본 발명의 영역 내에 드는 다른 기질 공급원은 임의 유형의 가공 또는 비가공된 식물 재료, 예를 들면 베어낸 풀, 껍질, 속, 줄기, 잎, 섬유, 펄프, 삼, 톱밥, 신문지 등을 포함한다.
본 발명은 제한되는 것으로 간주되지 않아야 하는 다음 실시예에 의해 더 예시된다.
실시예 1
올리고사카라이드를 에탄올로 발효시키기에 적합한 재조합 에세리히아 숙주의 제조 방법
이 실시예에는, 올리고사카라이드를 에탄올로 발효시키기에 적합한 에세리히아 숙주를 개발하고 이용하는 방법이 기재되어 있다. 특히, 폴리사카라제 (예를 들면 글루카나제)의 발현을 증가시키는데 이용될 수 있는 강한 프로모터가 확인되었다. 또한, 에르위니아 크리산테미로부터의 유전자를 이용하여 폴리사카라제 분비를 용이하게 함으로써 원하는 폴리사카라제 활성을 방출시키기 위한 세포 파괴의 필요를 없애게 된다.
이 실시예 전반에 걸쳐, 달리 명시하지 않는 한 다음 재료 및 방법이 이용된다.
재료 및 방법
생물체 및 배양 조건
이 실시예에 이용된 세균 균주 및 플라스미드를 하기 표 1에 나타내었다.
플라스미드 작제의 경우, 숙주 세포 이. 콜리 DH5α를 이용하였다. 폴리사카라제 (예를 들면, 글루카나제)를 코딩하는 특정 유전자는 에르위니아 크리산테미 P86021로부터 유래된 celZ 유전자였다 (Beall, (1995) Ph.D. Dissertation, University of Florida; Wood et al., (1997) Biotech. Bioeng. 55:547-555). 분비를 개선시키는데 사용된 특정 유전자는 이. 크리산테미 EC16으로부터 유래된 out 유전자였다 (He et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1079-1083).
전형적으로, 숙주 세포 배양액을 루리아-베르타니 (Luria-Bertani) 브로쓰 (LB)(10 g L-1 디프코 (Difco)(등록상표) 트립톤, 5 g L-1 디프코 (등록상표) 효모 추출물, 5 g L-1 염화 나트륨)에서 또는 루리아 한천 (한천 15 g L-1로 보충된 LB) 상에서 성장시켰다. 글루카나제 celZ 활성 (EGZ)을 가진 숙주 세포를 스크리닝하기 위하여, CMC-평판 (카르복시메틸 셀룰로오스 (3 g L-1)를 함유하는 루리아 한천 평판)을 사용하였다 (Wood et al., (1988) Methods in Enzymology 160:87-112). 적절할 때, 항생물질 암피실린 (50 ㎎ L-1), 스펙티노마이신 (100 g L-1), 카나마이신 (50 g L-1)을 내성 마커를 함유하는 재조합 또는 통합 숙주 세포의 선택을 위해 배지에 첨가하였다. 온도 조절 pSC101 레플리콘을 가진 플라스미드를 함유하는 작 제물은 (Posfai et al., (1997) J. Bacteriol. 179:4426-4428) 30 ℃에서 성장시키고, 달리 명시하지 않으면 pUC 기재 플라스미드를 함유하는 작제물은 37 ℃에서 성장시켰다.
사용된 균주 및 플라스미드
균주/플라스미드 설명 공급원/참조문헌
균주
제트. 모빌리스 CP4 원영양균성 Osman et al., (1985) J. Bact. 164:173-180
이. 콜리 균주 DH5α lacZ M15 rec4 Bethesda Research Laboratory
이. 콜리 균주 B 원영양균성 ATCC 11303
이. 콜리 균주 HB 101 recA lacY recA ATCC 37159
플라스미드
pUC19 bla 클로닝 벡터 New England Biolabs
pST76-K kan 저카피수. 감온성
pRK2013 kan 이동 헬퍼 플라스미드 (mob-) ATCC
pCPP2006 이. 크리산테미 EC16으로부터의 완전 out 유전자를 갖는 Sp' 약 40 kbp 플라스미드 He et al., (1991) P.N.A.S. 88:1079-1083
pLOI1620 bla celZ Beall et al., (1995) Ph.D. Disseration, U. of Florida
pLOI2164 BamHI 부위가 제거된 pLOI1620 (클레나우) 본문 참조
pLOI2170 pUC19로 클로닝된 pLOI2164로부터의 NdeI- HindIII 단편 (프로모터없는 celZ) 본문 참조
pLOI2171 pST76-K로 클로닝된 pLOI2170으로부터의 BamHI-SphI 단편 (프로모터없는 celZ) 본문 참조
pLOI2173 pST76-K로 클로닝된 pLOI2164로부터의 EcoRI- SphI 단편 (본래 프로모터를 가진 celZ) 본문 참조
pLOI2174 pLOI2171로 클로닝된 EcoRI-BamHI 단편 (gap 프로모터) 본문 참조
pLOI2175 pLOI2171로 클로닝된 EcoRI-BamHI 단편 (eno 프로모터) 본문 참조
pLOI2177 pLOI2171로 클로닝된 랜덤 Sau3A1 제트. 모빌리스 DNA 단편 본문 참조
pLOI2178 pLOI2171로 클로닝된 랜덤 Sau3A1 제트. 모빌리스 DNA 단편 본문 참조
pLOI2179 pLOI2171로 클로닝된 랜덤 Sau3A1 제트. 모빌리스 DNA 단편 본문 참조
pLOI2180 pLOI2171로 클로닝된 랜덤 Sau3A1 제트. 모빌리스 DNA 단편 본문 참조
pLOI2181 pLOI2171로 클로닝된 랜덤 Sau3A1 제트. 모빌리스 DNA 단편 본문 참조
pLOI2182 pLOI2171로 클로닝된 랜덤 Sau3A1 제트. 모빌리스 DNA 단편 본문 참조
pLOI2183 pLOI2171로 클로닝된 랜덤 Sau3A1 제트. 모빌리스 DNA 단편 본문 참조
pLOI2184 pLOI2171로 클로닝된 랜덤 Sau3A1 제트. 모빌리스 DNA 단편 본문 참조
pLOI2196 PstI 부위에서 pUC19로 융합된 pLOI2177 본문 참조
pLOI2197 PstI 부위에서 pUC19로 융합된 pLOI2180 본문 참조
pLOI2198 PstI 부위에서 pUC19로 융합된 pLOI2182 본문 참조
pLOI2199 PstI 부위에서 pUC19로 융합된 pLOI2183 본문 참조
pLOI2307 pUC19로 클로닝된 pLOI2183으로부터의 EcoRI- SphI 단편 본문 참조

유전적 방법
모든 플라스미드 작제에 표준 기술을 이용하였다 (Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.; Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. C.S.H.L., Cold Spring Harbor, N.Y.). 소규모 플라스미드 단리를 수행하기 위하여, TELF 절차를 행하였다. 대규모 플라스미드 단리를 위하여, 프로메가 (등록상표) 위자드 키트 (Wizard Kit)를 사용하였다. 겔로부터 DNA 단편을 단리하기 위하여, 퀴아겐 (Qiagen)(등록상표)으로부터의 퀴아퀵 (Qiaquick)(등록상표) 겔 익스트랙션 키트 (Gel Extraction Kit)를 이용하였다. 이. 콜리 및 제트. 모빌리스로부터 염색체 DNA를 단리하기 위하여, 커팅과 요마노의 방법을 이용하였다 (Cutting et al., (1990) Genetic analysis, pp. 61-74, In, Molecular biological methods for Bacillus, John Wiley & Sons, Inc.; Yomano et al., (1993) J. Bacteriol. 175:3926-3933).
본원에 기재된 2가지의 당분해 유전자 프로모터 (예를 들면, gap 및 eno)를 단리하기 위해, 이. 콜리 DH5α로부터의 정제된 염색체 DNA를 다음 프라이머 쌍: gap 프로모터, 5'-CGAATTCCTGCCGAAGTTTATTAGCCA-3' (서열 번호 3) 및 5'-AAGGATCCTTCCACCAGCTATTTGTTAGTGA-3' (서열 번호 4); eno 프로모터, 5'-AGAATTCTGCCAGTTGGTTGACGATAG-3' (서열 번호 5) 및 5'-CAGGATCCCCTCAAGTCACTAGTTAAACTG-3' (서열 번호 6)을 이용한 이들 핵산의 PCR (폴 리머라제 연쇄 반응) 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다. 이. 크리산테미 (pCPP2006)로부터 유래된 분비성 단백질을 코딩하는 out 유전자를 가동성 부여를 위해 pRK2013을 이용하여 이. 콜리에 접합시켰다 (Figurski et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76:1648-1652; Murata et al., (1990) J. Bacteriol. 172:2970-2978).
각종 당해 DNA의 서열을 확인하기 위하여, 형광 프라이머를 이용한 디데옥시 서열화 방법을 LI-COR 모델 4000-L DNA 시퀀서 상에서 수행하였다. pST76-K 기재 플라스미드를 T7 프라이머 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (서열 번호 7))를 사용하여 한 방향으로 서열화하였다. pUC18- 및 pUC19 기재 플라스미드를 전진 프라이머 (5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-3' (서열 번호 8)) 또는 역 프로모터 (5'-TAACAATTTCACACAGGA-3' (서열 번호 9))를 사용하여 두 방향으로 서열화하였다. 서열화 방법의 연장 반응은 퍼킨 엘머 진앰프 (Perkin Elmer GeneAmp)(등록상표) PCR 9600 및 세퀴텀 롱-리드 시퀀싱 키트-LC (SequiTherm Long-Read Sequencing Kit-LC)(등록상표)를 이용하여 수행하였다. 결과 서열은 위스콘신 제니틱 컴퓨터 그룹 (Wisconsin Genetic Computer Group)(GCG) 소프트웨어 팩키지를 이용하여 계속하여 분석하였다 (Devereux et al., (1984) Nucleic Acids Rev. 12:387-395).
상기 프로모터에서의 전사 개시의 시작을 확인하기 위하여, 표준 기술을 이용하여 프라이머 연장 분석을 수행하였다. 특히, 프로모터 영역은 퀴아겐 (Qiagen) RNeasy (등록상표) 키트를 사용하여 후기 지수 상에서 세포로부터 단리된 celZ 유전자 RNA 내의 해당 프라이머를 이용하여 전사 출발 부위를 자리잡아 확인 하였다. 간단하게, 세포를 0.2M 수크로오스를 함유하는 TE (트리스-HCl, EDTA) 중의 리소자임 (400 ㎍/㎖)으로 처리하고 용균 전에 25 ℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 유리된 RNA를 에탄올 침전시키고 이어서 프로메가 (등록상표) AMV 역전사효소 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.5 mM 스퍼마딘, 10 mM DTT) 20 ㎕에 용해시켰다. 그후에, 엘아이-코르 인크. (LI-Cor Inc.)로부터 구입한 IRD41-표지된 프로모터 (5'-GACTGGATGGTTATCCGAATAAGAGAGAGG-3' (서열 번호 10))를 첨가하고, 샘플을 80 ℃에서 5분 동안 변성시키고, 55 ℃에서 1시간 동안 어닐링시키고 알코올 침전에 의해 정제하였다. 어닐링된 샘플을 500 μM dNTPs 및 10 유닛 AMV 역전사효소를 함유하는 AMV 역전사효소 완충액 19 ㎕에 용해시키고 연장을 위해 인큐베이션시켰다 (42 ℃에서 1시간). 생성물을 DNase 없는 RNase A 0.5 ㎍/㎖로 처리하고, 침전시키고, 부하 완충액에 용해시키고, LI-COR 모델 4000-L DNA 시퀀서를 이용하여 얻어진 평행 디데옥시 프로모터 서열과 비교하였다.
폴리사카라제 활성
celZ 유전자의 발현으로 얻은 폴리사카라제 활성 (예를 들면, 글루카나제 활성)의 양을 확인하기 위하여, 콩고 레드 (Congo Red) 절차를 이용하였다 (Wood et al., (1988) Methods in Enzymology 160:87-112). 특히, 선택된 클론을 그리드 설치된 CMC 평판에 이입하고, 30 ℃에서 18시간 동안 인큐베이션시키고, 그후에 염색하고 글루카나제를 발현하는 재조합 숙주 세포는 적색 배경 위에 황색 대역을 형성하였다. 따라서, 이들 비색 대역의 직경은 celZ 발현의 상대 척도로서 기록되었 다.
글루카나제 활성 (EGZ)은 기질로서 카르복시메틸 셀룰로오스를 이용하여 측정하였다. 이 시험에서, 무세포 배양액 브로쓰 (세포외 활성) 또는 초음파로 처리된 세포를 함유하는 브로쓰 (총 활성)의 적절한 희석액을 카르복시메틸 셀룰로오스 (20 g L-1)를 함유하는 50 mM 시트레이트 완충액 (pH 5.2) 중에서 35 ℃에서 효력 검정하였다. 3-4 ㎖ 샘플의 최적 효소 방출 조건은 세포 파괴기 (Model W-220F, Heat-System-Ultrasonics Inc.; Plainview, NY)를 이용하여 전체 출력으로 각 1초 동안 4 펄스인 것으로 확인되었다. 효력 검정의 효소 반응을 중지시키기 위해, 샘플을 비등수 조에서 10분 동안 가열하였다. 글루카나제에 의해 효소적으로 유리된 환원 당을 측정하기 위하여, 기준 물질로서 글루코오스를 사용하여 디니트로살리실산 시약을 이용하였다 (Wood et al., (1988) Methods in Enzymology 160:87-112). 효소 활성 (IU)의 양은 분 당 방출된 환원 당 μmols로서 또는 2회 이상 확인의 평균으로부터 얻은 총 활성의 백분율로서 표시하였다.
초미세구조 분석
각종 재조합 숙주 세포의 초미세구조를 확인하기 위하여, 루리아 한천 평판으로부터 얻은 새로운 콜로니를 0.2 M 소듐 카코딜레이트 완충액 (pH 7) 중의 2% 글루타르알데히드에 고정시키고, 이어서 1% 오스뮴 테트록시드에서 인큐베이션시키고 이어서 증류수 중의 1% 우라닐 아세테이트에 의해 분석을 위해 제조하였다. 샘플을 에탄올에서 탈수시키고, 스푸르 (Spurr's) 플라스틱에 포매시키고, 초박 단편 을 제조하고 차이스 (Zeiss)(등록상표) EM-IOCA 전자현미경을 이용하여 검사하였다 (Spur (1969) J. Ultrastruct. Res. 26:31).
리포터 유전자로서 celZ을 이용한 저 카피 프로모터 프로브 벡터의 작제
강한 프로모터의 단리를 촉진시키기 위해, 프로모터 없는 celZ 유전자 바로 앞의 BamHI 부위 및 pSC101 레플리콘을 갖도록 저카피 벡터를 작제하였다 (pLOI2171). 따라서, 이 프로모터 없는 플라스미드를 음성 대조군으로서 사용하였다. 플라스미드 pLOI1620이 celZ의 공급원으로서 사용되었고 그것은 연속 lac 및 celZ 프로모터로부터 발현이 이루어진 pUC18 유도체이다. 이 플라스미드 내의 BamHI 부위를 분해 및 클레나우 처리에 의해 제거하였다 (pLOI2164). celZ 유전자는 클레나우 처리 후에 프로모터 없는 NdeI 단편으로서 단리되었다. 결과의 평체 단편을 HindIII로 분해하여 다운스트림 DNA를 제거하고 pUC19 (HindIII에서 HincII)에 연결시켜 pLOI2170을 형성하였다. 이 플라스미드에서, celZ는 lacZ 전사 방향과 반대로 배향되고 약하게만 발현되었다. celZ를 함유하는 pLOI2170로부터의 BamHI (아미노 말단)-SphI (카르복실 말단) 단편을 감온성 레플리콘을 가진 저 카피 벡터인 pST76-K의 대응 부위로 클로닝시켜 pLOI2171을 형성하였다 (도 3). 이 벡터 내의 celZ의 발현은 아주 낮아서, 강한 후보 프로모터에 대한 프로브로서의 그의 사용을 쉽게 한다.
두가지의 이. 콜리 당분해 프로모터 (gap 및 eno)로부터의 celZ 발현의 분석
이. 콜리 내의 당 분해 유전자를 유도하는 2가지의 예시적인 프로모터 (gap 및 eno)를 글루카나제를 코딩하는 이종성 celZ 유전자의 발현을 유도하는 그의 능 력에 대해 검사하였다. 이. 콜리 DH5α균주로부터의 염색체 DNA를 gap 및 eno 프로모터 영역을 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭시키기 위해 주형으로서 사용하였다. 각각 약 400 bp의 결과 단편을 EcoRI 및 BamHI으로 분해시키고 pLOI2171 내의 프로모터 없는 celZ 유전자 앞의 대응 부위에 클로닝시켜 pLOI2174 (gap 프로모터) 및 pLOI2175 (eno 프로모터)를 생산하였다. 대조군으로서, 완전 celZ 유전자 및 천연 이. 크리산테미 프로모터를 함유하는 pLOI2164로부터의 EcoRI-SphI 단편을 pST76-K의 대응 부위에 클로닝시켜 pLOI2173을 생산하였다. 이들 세 플라스미드를 이. 콜리 균주 B 및 DH5α로 형질전환시키고 글루카나제 활성 (EGZ)을 비교하였다. 이. 콜리의 두 균주의 경우, CMC 평판 상에서의 글루카나제 활성은 본래의 이. 크리산테미 프로모터를 함유하는 pLOI2173에 의한 것 보다 이. 콜리 당분해 프로모터에 의한 것이 더 낮았다 (표 2). 추정 활성은 각 대역의 반경의 제곱과 관련있고 (Fick's Law of diffusion), 당 분해 프로모터 (pLOI2174 및 pLOI2175)에 의한 EGZ 생산은 원래 작제물에서 보다 33 내지 65% 더 낮은 것으로 평가되었다. 따라서, 고도의 celZ 유전자 발현을 유도하기 위한 다른 후보 프로모터를 연구하였다.
이종성 유전자 발현을 위한 프로모터로서 사용하기에 적합한 랜덤 DNA 단편의 확인 및 클로닝
제트. 모빌리스로부터 유래된 랜덤 단편은 이. 콜리에서의 이종성 유전자의 고도의 발현을 위한 대리 프로모터의 효과적인 공급원일 수 있다 (Conway et al., (1987) J. Bacteriol. 169:2327-2335; Ingram et al., (1988) Appl. Environ. Micro. 54:397-404). 따라서, 에르위니아 celZ 발현을 위한 대리 프로모터를 확인 하기 위하여, 제트. 모빌리스 염색체 DNA를 Sau3AI로 광범위하게 분해하고 결과 단편을 BamHI 부위에서 pLOI2171에 연결하고 이. 콜리 DH5α로 형질전환시켜 잠재적인 후보 프로모터의 라이브러리를 형성하였다. 이. 콜리에서 celZ 유전자 발현을 유도할 수 있는 탁월한 후보 프로모터를 신속히 확인하기 위하여, 다음 생물학적 스크린을 이용하였다. 다른 랜덤 후보 프로모터를 가진 celZ 플라스미드로 형질전환된 콜로니를 그리드 설치된 CMC 평판에 이입하고 인큐베이션 후에 글루카나제 활성에 대해 염색하였다 (표 2). 시험된 18,000 클론 중 약 20%는 CMC 양성이었다. 대조군 pLOI2173 보다 더 큰 대역을 형성한 75 클론을 또다른 균주 이. 콜리 B를 이용하여 더 검사하였다.
CMC 인디케이터 평판을 이용한 이. 콜리에서의celZ 발현에 대한 프로모터 강도의평가
이. 콜리 DH5α숙주 이. 콜리 B 숙주
플라스미드 플라스미드의 수a CMC 대역 직경 (㎜)b 본래 프로모터의 % (100*R2 x/R2 c)c 플라스미드의 수 CMC 대역 직경 (㎜) 본래 프로모터의 % (100*R2 x/R2 c)
pLOI2171 (프로모터없음) pLOI2173 (본래 프로모터) 1 1 0 5.0 -- 100 -- 1 -- 4.5 -- 100
pLOI2174 (gap 프로모터) pLOI2175 (eno 프로모터) 1 1 4.0 3.0 77 43 1 1 3.5 2.8 60 35
제트. 모빌리스 프로모터 I군 II군 III군 5 14 56 13.0 9.0-11.0 6.0-9.0 676 324-484 144-324 4 17 54 10.8-11.3 9.0-10.5 5.0-8.8 570-625 445-545 125-375
a 표시 범위의 활성을 나타내는 클론의 수 b 3개의 CMC 분해 대역으로부터의 직경의 평균 크기 c R2 x는 시험 플라스미드에 의한 투명 대역의 반경의 제곱: R2 c는 대조군 (pLOI2173)에 대한 투명 대역의 반경의 제곱
따라서, 선택된 후보 프로모터에 대한 프로모터 강도는 2가지의 다른 균주에서 확인하였으며, 이때 일반적으로 DH5α의 재조합체가 균주 B의 재조합체 보다 더 큰 대역 (예를 들면, 더 많은 글루카나제)를 형성하였다. 그러나, 각 숙주에서의 상대 프로모터 강도는 대부분의 클론에 대해 유사하였다. CMC 평판을 이용한 대역 크기에 의해 측정되는 이러한 글루카나제 생산의 분석을 기초로, 4개의 클론은 원래의 이. 크리산테미 celZ 유전자를 가진 작제물 (pLOI2173) 보다 약 6배 더 높은 정도로 또한 이. 콜리 당분해 프로모터 중 어느 것보다 10배 더 높은 정도로 celZ를 발현시키는 것으로 나타났다. 따라서, 이들 및 유사하게 강한 후보 프로모터는 추가의 연구를 위해 선택되었다.
글루카나제의 생산 및 분비
pST76-K의 8개의 플라스미드 유도체 (pLOI2177 내지 pLOI2184)를 상기 스크 린으로부터 선택하고 (그룹 I 및 그룹 II (표 2) 참조) 이. 콜리 균주 B에서의 총 글루카나제 활성에 대해 검정하였다 (표 3). CMC 평판 상에 최대 대역을 만드는 4개의 플라스미드는 최고 글루카나제 활성을 갖는 것으로 확인되었다 (pLOI2177, pLOI2180, pLOI2182 및 pLOI2183). 그 활성은 비변형된 celZ (pLOI2173)의 것 보다 약 6배 더 높았으며, 이는 CMC 평판 상의 투명 대역 반경의 제곱을 이용한 본 발명자의 평가와 아주 일치한다. 도 4는 분비성 단백질을 코딩하는 out 유전자를 첨가하고 또한 첨가하지 않고 각종의 다른 프로모터를 함유하는 균주 B에 대한 시험관내 효소 검정과 CMC 평판으로부터의 활성 평가의 비교를 나타낸다. 약간 분산되긴 하였지만, 상대 활성을 평가하기 위한 평판 방법을 확인하는 직접적인 관계를 분명하게 알 수 있다. 고 카피 플라스미드인 pUC18에서의 원래 작제물도 비교에 포함되었다 (pLOI2164). 연속 lac 및 celZ 프로모터에 의한 이 작제물은 대리 프로모터에 의한 저 카피 플라스미드 3가지 (pLOI2177, pLOI2182 및 pLOI2183) 보다 더 낮은 EGZ 활성을 나타내었다. 따라서, 글루카나제의 celZ 발현을 더더욱 증가시키기 위하여, celZ 및 대부분의 효과적인 대리 프로모터를 함유하는 DNA 단편을 pLOI2183으로부터 (EcoRI-SphI 단편으로서) 단리하고 lac 프로모터의 것 (pLOI2307)과 반대 방향으로 전사시키며 pUC19에 삽입하였다. 따라서, 상기의 강한 대리 프로모터는 고 카피 플라스미드에 혼입될 때 글루카나제 활성을 2배까지 더 증가시켰다.
글루카나제 분비 증가의 조작
celZ 코딩된 글루카나제의 발현을 증가시키는 상기 결과를 더 개선시키기 위 하여, 상기 숙주 세포를 분비 증가를 위해 조작하였다. 이. 크리산테미 EC16으로부터 유래된 분비성 단백질을 코딩하는 유전자 (예, out 유전자)를, out 유전자를 함유하는, 히 (He et al.)의 문헌에 기재된 바와 같은 플라스미드 (pCPP2006)를 이용하여 글루카나제의 방출을 개선시키는데 이용하였다 (He et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:1079-1083). 이. 콜리 B에서의 EGZ의 분비 증가를 연구하여 그 결과를 표 3에 나타내었다.
이. 콜리 B에서의 EGZ 생산 및 분비를 위한 프로모터의 비교
플라스미드a 분비 유전자 없음 분비 유전자 있음 (pCPP2006)
총 활성 (IU/L)b 세포외c(%) 총 활성 (IU/L) 세포외c(%)
pLOI2173 620 17 1,100 43
pLOI2177 3,700 10 5,500 44
pLOI2178 2,200 9 3,500 49
pLOI2179 2,000 10 3,000 50
pLOI2180 2,900 8 6,300 39
pLOI2181 1,800 11 4,100 46
pLOI2182 3,500 7 6,600 38
pLOI2183 3,400 7 6,900 39
pLOI2184 2,100 12 2,400 39
pLOI2164 3,200 20 6,900 74
pLOI2307 6,600 28 13,000 60
a 플라스미드 pLOI2173 및 pLOI2164는 celZ 본래 프로모터를 함유하며; pLOI2307은 pLOI2183으로부터의 강한 프로모터를 함유한다. 플라스미드 pLOI2164 및 pLOI2307은 pUC 기재 플라스미드 (고카피수)이다. 다른 모든 플라스미드는 pST76-K의 유도체이다 (저카피수). b 글루카나제 활성은 30 ℃에서 16시간의 성장 후에 확인되었다. c 세포외 활성 (분비 또는 방출됨)
저 카피 플라스미드를 가진 재조합 숙주는 추가의 이종 분비성 단백질 (플라스미드 pCPP2006에 의해 코딩되는 out 단백질) 없이 세포외적으로 (16시간의 성장 후) 총 EGZ의 7-17% 만을 생산하였다. 동일한 프로모터를 함유하는 저 카피 pST76 기재 플라스미드 보다 고 카피 pUC 기재 플라스미드를 갖는 세포외 브로쓰 주위 숙 주 세포에서 더 많은 비율 (20-28%)로 EGZ가 발견되었다. 그러나, 어느 경우에서든 분비성 단백질을 코딩하는 out 유전자의 첨가는 (예를 들면, pCPP2006) 총 발현도를 2배까지 증가시켰으며 세포외 효소의 비율을 약 4배까지 증가시켰다 (38-74%). 7,800 IU/L이 무세포 상등액에서 발견되는, 최고 활성 13,000 IU/L의 총 글루카나제는 강한 대리 프로모터에 의해 유래된 celZ를 코딩하는 pLOI2307 및 out 분비성 단백질을 코딩하는 pCPP2006 둘다를 가진 균주 B에 의해 생산되었다.
특정 조건 (pH 7, 37 ℃) 하에서 순수한 EGZ 효소에 대한 비활성은 419 IU라는 것으로 보고되었으며 (Py et al., (1991) Protein Engineering 4:325-333), 이러한 조건 하에서 생산된 EGZ는 상기 조건 (pH 5.2 시트레이트 완충액, 35 ℃) 하에서 보다 25% 이상 더 활성이 있는 것으로 확인되었다. 따라서, pH 5.2 (35 ℃)에서 순수한 효소에 대해 316 IU의 비활성을 추정할 때, 이. 콜리 B의 배양액 (pLOI2307 및 pCPP2006, 예를 들면 글루카나제 및 분비성 단백질을 코딩하는 플라스미드를 함유함)은 리터 당 활성 EGZ 약 41 ㎎을 생산하였거나 또는 총 숙주 세포 단백질의 4-6%가 활성 글루카나제였다.
제트. 모빌리스로부터 유래된 최강 프로모터의 서열 분석
4개의 최강 대리 프로모터 (pLOI2177, pLOI2180, pLOI2182 및 pLOI2183)의 서열을 확인하였다. 이 과정을 용이하게 하기 위하여, 각각을 PstI 부위에서 pUC19와 융합시켰다. 결과 플라스미드, pLOI2196, pLOI2197, pLOI2198 및 pLOI2199를 고 카피 수로 생산하였으며 (ColEI 레플리콘) M13 및 T7 서열화 프라이머를 사용하여 양 방향으로 서열화할 수 있었다. 4개의 모든 플라스미드는 제트. 모빌리스 DNA의 동일한 단편을 함유하였으며 자매 세포였다. 각각은 길이가 1417 bp였고 4개의 내부 Sau3AI 부위를 함유하였다. 각 단편의 DNA 및 해독된 단백질 서열 (6개의 리딩 프레임)을 현 데이타 베이스와 비교하였다. 하나의 단편 (281 bp 내부 단편) 만이 Blast 연구에서 강한 조화를 나타내었으며 (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), 이 단편은 세포 엔벨로프 생합성에서 기능하는 것으로 제안된 제트. 모빌리스 hpnB 유전자의 일부와 DNA 서열이 99% 동일하였다 (Reipen et al., (1995) Microbiology 141:155-161). 프라이머 연장 분석은 celZ와의 Sau3AI/BamHI 접합 부위로부터의 67 bp 업스트림에 있는 단일 메이저 출발 부위 및 다른 업스트림에 있는 제2 마이너 출발 부위를 나타내었다 (도 5). -10 및 -35 영역 내의 서열을 이. 콜리 시그마 인자에 대한 보존 서열과 비교하였다 (Wang et al., (1989) J. Bacteriol. 180:5626-5631; Wise et al., (1996) J. Bacteriol. 178:2785-2793). 우세 프로모터 영역 (총 출발 부위의 약 85%)은 시그마70 프로모터와 유사하고 제2 프로모터 부위는 시그마38 프로모터와 유사한 것으로 나타났다.
글루카나제를 생산하는 재조합 숙주 세포의 현미경 분석
재조합체 및 모 생물체 사이에서 세포 형태의 차이는 광학 현미경에 의해 거의 관찰되지 않았다. 그러나, 전자 현미경으로 작은 극성 봉입체가 다량의 글루카나제를 발현하는 균주 B (pLOI2164)의 주변 세포질에서 분명하게 보였으며 이 봉입체는 EGZ를 함유하는 것으로 추정되었다 (도 6). 2배 더 높은 글루카나제 활성을 생산한 균주 B (pLOI2307)에서 봉입체는 더욱 컸고 총 세포 부피의 20% 까지를 점유하였다. 이들 극성 봉입체의 큰 크기는 글루카나제 활성 측정치가 총 EGZ 생산을 과소 평가할 수 있음을 암시한다. 전형적으로, 극성 봉입체는 주변 세포질 공간으로부터의 단백질의 분비 증가를 가능하게 하는 out 분비성 단백질을 코딩하는 작제물을 또한 갖는 숙주 세포에서 더 작았다. 예상된 바와 같이, 주변 세포질 봉입체는 글루카나제를 생산하지 않는 음성 대조군 균주 B (pUC19)에서는 보이지 않았다.
실시예 2
올리고사카라이드를 에탄올로 발효시키기에 적합한 재조합 클레브시엘라 숙주
이 실시예에는, 올리고사카라이드를 해중합시키고 에탄올로 발효시키기 위한 생체 촉매로서 사용하기에 적합한 재조합 클레브시엘라 숙주를 기재하였다.
이 실시예에 사용된 재료 및 방법
달리 명시하지 않으면, 다음 재료 및 방법을 이어지는 실시예에 사용하였다.
세균, 플라스미드 및 배양 조건
이 예시에 사용된 균주 및 플라스미드를 하기 표 4에 요약하였다.
사용된 균주 및 플라스미드
균주/플라스미드 특성 공급원/참조문헌
균주
지모모나스 모빌리스 CP4 원영양균성 Ingram et al. (1988) Appl. Environ. Micro. 54:397-404
에세리히아 콜리
DH5α lacZ M15 recA Bethesda Research Laboratory
HB 101 recA lacY recA ATCC 37159
클레브시엘라 옥시토카
M5A1 원영양균성 Wood et al. (1992) Appl. Environ. Micro. 58:2103-2110
P2 pfl::pdc adhB cat Wood et al. (1992) Appl. Environ. Micro. 58:2103-2110
SZ1 pfl::pdc adhB cat; 통합된 celZ;tet 본문 참조
SZ2 pfl::pdc adhB cat; 통합된 celZ;tet 본문 참조
SZ3 pfl::pdc adhB cat; 통합된 celZ;tet 본문 참조
SZ4 pfl::pdc adhB cat; 통합된 celZ;tet 본문 참조
SZ5 pfl::pdc adhB cat; 통합된 celZ;tet 본문 참조
SZ6 pfl::pdc adhB cat; 통합된 celZ;tet 본문 참조
SZ7 pfl::pdc adhB cat; 통합된 celZ;tet 본문 참조
SZ8 pfl::pdc adhB cat; 통합된 celZ;tet 본문 참조
SZ9 pfl::pdc adhB cat; 통합된 celZ;tet 본문 참조
SZ10 pfl::pdc adhB cat; 통합된 celZ;tet 본문 참조
플라스미드
pUC19 bla 클로닝 벡터 New England Biolab
pBR322 bla tet 클로닝 벡터 New England Biolab
pLOI1620 bla celZ Wood et al. (1997) Biotech. Bioeng. 55:547-555
pRK2013 kan 이동 헬퍼 플라스미드 (mob-) ATCC
pCPP2006 이. 크리산테미 EC16으로부터의 out 유전자를 함유하는 Spr, 40 kbp 단편 He et al. (1991) P.N.A.S.88:1079-1083
pST76-K 감온성 pSC101 레플리콘을 함유하는 kan 저카피 벡터 Posfai et al. (1997) J. Bact. 179:4426- 4428
pLOI2164 bla celZ (pLOI1620으로부터 BamHI 제거됨) 본문 참조
pLOI2173 kan celZ (천연 celZ 프로모터 본문 참조
pLOI2177 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2178 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2179 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2180 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2181 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2182 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2183 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2184 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
균주/플라스미드 특성 공급원/참조문헌
pLOI2185 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2186 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2187 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2188 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2189 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2190 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2191 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2192 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2193 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2194 kan celZ (제트. 모빌리스로부터의 대리 프로모터) 본문 참조
pLOI2301 pUC19의 NdeI 부위에 삽입된 AscI 링커 본문 참조
pLOI2302 pLOI2301의 SapI 부위에 삽입된 AscI 링커 본문 참조
pLOI2303 클레나우 처리 후에 pLOI2302의 PstI 부위에 삽입된 pBR322로부터의 AvaI-EcoRI 단편 본문 참조
pLOI2305 pLOI2303의 SmaI 부위로 클로닝된 케이. 옥시토카 M5A1 게놈 DNA의 EcoRI DNA 단편 (약 2.5 kb) 본문 참조
pLOI2306 pLOI2305의 EcoRI 부위로 클로닝된 pLOI2183으로 부터의 EcoRI-SphI 단편 본문 참조
이. 콜리 및 케이. 옥시토카 M5A1을 배양하는데 사용되는 배양 조건은 전형적으로 리터 당 10 g 디프코 (Difco)(등록상표) 트립톤, 5 g 효모 추출물 및 5 g 염화 나트륨을 함유하는 루리아-베르타니 브로쓰 (LB) 또는 별법으로 루리아 한천 (한천 15 g으로 보충된 LB)을 이용하였다 (Sambrook, et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, C.S.H.L., Cold Spring Harbor, N.Y.).
선택 조건 하에서 세균 콜로니를 스크리닝하기 위하여, CMC-평판 (카르복시메틸 셀룰로오스 3 g L-1를 함유하는 루리아 한천 평판)을 이용하여 정해진 세균 균주에 의해 발현되는 글루카나제 활성도를 확인하였다 (Wood et al., (1988) Enzymology, 160:87-112). 에탄올생성 균주를 배양하기 위하여, 글루코오스를 고체 배지 (20 g L-1) 및 브로쓰 (50 g L-1)에 첨가하였다. 글루카나제 활성을 확인할 때 성장 배지 내의 글루코오스를 비환원당인 소르비톨 (50 g L-1)로 대체하였다. 전기천공에 의해 핵산을 도입하기 위한 제제에서 각종 균주 또는 배양액을 배양하기 위하여, 변형된 SOS 배지 (예를 들면, 20 g L-1 디프코 (등록상표) 트립톤, 5 g L-1 디프코 (등록상표) 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2 및 50 g L-1 글루코오스)를 사용하였다. 항생물질 내성 마커를 함유하는 재조합 숙주의 선택을 위해 적절할 때, 항생물질 암피실린 (50 ㎎ L-1), 스펙티노마이신 (100 ㎎ L-1), 카나마이신 (50 ㎎ L-1), 테트라사이클린 (6 또는 12 ㎎ L-1) 및 클로람페니콜 (40, 200 또는 600 ㎎ L-1)을 첨가하였다. 달리 명시하지 않으면, 배양액은 37 ℃에서 성장시켰다. 에탄올생성 균주 및 감온성 pSC101 레플리콘을 가진 플라스미드를 함유하는 균주는 30 ℃에서 성장시켰다.
유전적 방법
플라스미드 작제, 클로닝 및 형질전환을 위하여, 표준 방법 및 이. 콜리 DH5α 숙주를 이용하였다 (Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.; Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, C.S.H.L., Cold Spring Harbor, N.Y.). celZ 통합 벡터, pLOI2306의 작제를 도 7에 나타낸 바와 같이 행하였다. pLOI2306으로부터 얻은 레플리콘이 결핍된 환형 DNA 단편을 다음 조건: 3.8 - 4.0 msec의 측정된 시간 상수 로 2.5 kV 및 25 μF를 이용하여 바이오-래드 진 펄서를 사용하여 에탄올생성 케이. 옥시토카 P2로 전기천공시켰다 (Comaduran et al. (1998) Biotechnol. Lett. 20:489-493). 이. 크리산테미 EC16 분비계 (pCPP2006)를 가동성 부여를 위해 pRK2013을 이용하여 케이. 옥시토카에 접합시켰다 (Murata et al. (1990) J. Bacteriol. 172:2970-2978). 소규모 및 대규모 플라스미드 단리를 각각 TELT 절차 및 프로메가 위자드 키트를 이용하여 수행하였다. 퀴아겐 (Qiagen)(등록상표)으로부터의 퀴아퀵 (Qiaquick)(등록상표) 겔 익스트랙션 키트 (Gel Extraction Kit)를 이용하여 겔로부터 DNA 단편을 단리하였다. 케이. 옥시토카 M5A1 및 제트. 모빌리스 CP4로부터의 염색체 DNA를 커팅과 요마노의 문헌에 기재된 바와 같이 단리하였다 (실시예 1 참조). 당해 DNAs를 LI-COR 모델 4000-L DNA 시퀀서를 사용하여 서열화하였다 (Wood et al. (1997) Biotech. Bioeng. 55:547-555).
celZ의 염색체 통합
celZ의 염색체 통합을 위해 이. 콜리에 대해 이미 기재된 절차 (Hamilton et al., (1989) J. Bacteriol. 171:4617-4622)를 이용한 온도 조절 플라스미드 (pLOI2183)에 의한 선택 및 기능적 레플리콘이 결핍된 환형 DNA 단편의 직접 통합을 이용하는 2가지 방법을 이용하였다. 이 동일한 방법을 이. 콜리 B (Ohta K. et al., (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900) 및 케이. 옥시토카 M5A1 (Wood et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 57:2103-2110)에서의 에탄올 경로를 코딩하는 제트. 모빌리스 유전자의 염색체 통합에 이용하였다. 전형적으로, 환형 DNA를 바이오-래드 진 펄서를 이용하여 전기천공에 의해 P2로 형질전환시켰다. 다음에, 형질전환체를 테트라사이클린 (6 ㎎ L-1)을 함유하는 고체 배지 상에서 선택하고 CMC 평판 상에서 성장시켜 글루카나제 활성도를 확인하였다.
글루카나제 활성
다른 시험 프로모터의 제어 하에 celZ 유전자 생성물 (즉, 글루카나제)의 발현으로 생긴 글루카나제 활성을 실시예 1에 기재된 바와 같이 CMC 평판을 염색하여 평가하였다. 이 비색 검정 결과 글루카나제 활성을 나타내는 황색 대역이 형성되었고 대역의 직경을 celZ 폴리펩티드 발현의 상대적 척도로서 사용하였다. 황색의 최대 대역을 나타낸 클론을 기질로서 카르복시메틸 셀룰로오스 (50 mM 시트레이트 완충액, pH 5.2에 용해된 20 g L-1)를 사용하여 35 ℃에서의 글루카나제 활성에 대해 더 평가하였다 (Wood et al. (1988) Methods in Enzymology 160:87-112). 세포내 글루카나제의 양을 측정하기 위하여, 4초 동안 초음파 (모델 W-290F 세포 파괴기, Heat System-Ultrasonics.; Plainview, NY)로 처리하여 배양액으로부터 효소 활성을 방출시켰다. 발현된 글루카나제 활성의 양을 측정하고 여기서는 분 당 방출된 환원 당 μmol (IU)로서 나타내었다. 환원 당을 글루코오스 기준 물질을 이용하여 문헌 (Wood et al. (1988) Methods in Enzymology 160:87-112)에 기재된 바와 같이 측정하였다.
기질 해중합
각종 숙주 세포에 의해 생산된 글루카나제 활성의 양을 더 확인하기 위하여, 다른 탄수화물 기질을 각종 세포 추출물 (50 mM 시트레이트 완충액, pH 5.2에 현탁 된 20 g L-1)과 함께 인큐베이션시켰다. 한 예에서, 산 팽윤된 및 볼밀 분쇄된 셀룰로오스를 포함하는 시험 기질을 우드의 문헌 (Wood et al. (1998) Methods in Enzymology 160:87-112)에 의해 기재된 바와 같이 제조하였다. 전형적인 폴리사카라제 추출물 (즉, 케이. 옥시토카 SZ6 (pCPP2006)으로부터의 EGZ (글루카나제))은 비환원당인 소르비톨로 보충된 LB에서 30 ℃에서 16시간 동안 그 숙주 세포를 배양함으로써 제조되었다. 무세포 브로쓰의 희석액을 기질에 첨가하고 35 ℃에서 16시간 동안 인큐베이션시켰다. 몇 방울의 클로로포름을 첨가하여 인큐베이션 중에 우발 오염물의 성장을 억제하였다. 샘플을 인큐베이션 전과 후에 제거하여 DNS 방법에 의해 환원 당을 측정하였다 (Wood et al. (1988) Methods in Enzymology 160:87-112 참조). 중합도 (DP)는 중합체에 존재하는 총 계산된 당 잔기를 환원 말단의 수로 나눔으로써 평가되었다.
발효 조건
탄수화물 50 g L-1로 보충된 루리아 브로쓰 100 ㎖를 함유하는 250 ㎖ 플라스크에서 발효를 실시하였다. 시험 탄수화물을 분리하여 멸균시키고 냉각 후에 첨가하였다. 기질 변화를 최소화하기 위하여, 산 팽윤된 셀룰로오스, 볼밀 분쇄된 셀룰로오스 및 크실란을 오오토클레이빙시키지 않았다. 항생물질 클로람페니콜 (200 ㎎ L-1)을 첨가하여 오염 생물체의 성장을 억제하였다. 플라스크를 24시간 브로쓰 배양액 (50 g L-1 글루코오스)으로 접종시키고 (10% v/v) 24 내지 96시간 동안 교반 시키며 (100 rpm) 35 ℃에서 인큐베이션시켰다. 배양액을 모니터하기 위하여, 샘플을 날마다 제거하여 가스 크로마토그래피에 의해 에탄올 농도를 확인하였다 (Dombek et al. (1986) Appl. Environ. Microbiol. 52:975-981).
대리 프로모터의 단리 및 확인 방법
클레브시엘라 및 다른 숙주 세포에서 이종성 유전자의 발현을 위한 대리 프로모터로서 작용하는 제트. 모빌리스의 랜덤 단편을 확인하기 위하여, 후보 프로모터의 효율적인 클로닝을 위한 벡터를 실시예 1에 기재된 바와 같이 작제하였다 (Ingram et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:397-404 참조).
다음에, Sau3AI 분해된 제트. 모빌리스 DNA 단편을 pLOI2171의 BamHI 부위에 연결하여 잠재적 프로모터의 라이브러리를 형성시켰다. 이 플라스미드를 초기 스크리닝을 위해 이. 콜리 DH5α로 형질전환시켰다. CMC 평판 상에서 개개로 시험된 18,000 콜로니 중에서, 75 클론은 대조군 (pLOI2173)보다 더 큰 황색 대역을 형성하였다. 그후에, 이러한 75 클론으로부터의 플라스미드를 케이. 옥시토카 M5A1로 형질전환시키고, 다시 시험하여 두번째 숙주에서 celZ을 고도로 발현하는 것을 밝혀냈다.
폴리사카라제를 생산하기 위한 재조합 클레브시엘라 숙주
celZ 발현을 나타내는 CMC 평판 상의 최대 대역을 형성한 고발현 클론 (pLOI2177 내지 pLOI2194)을 LB 브로쓰에서 성장시키고 글루카나제 활성에 대해 검정하였다 (표 5).
케이. 옥시토카 M5A1에서의celZ 발현 및 분비를 위한 프로모터의 평가
플라스미드a 분비 유전자 없음 분비 유전자 있음 (pCPP2006)
총 활성(IU L-1)b 분비된 활성(IU L-1) 총 활성(IU L-1) 분비된 활성(IU L-1)
pLOI2173 2,450 465 3,190 1,530
pLOI2177 19,700 3,150 32,500 13,300
pLOI2178 15,500 2,320 21,300 11,500
pLOI2179 15,400 2,310 21,400 12,000
pLOI2180 21,400 3,210 30,800 13,600
pLOI2181 15,600 2,490 21,000 11,800
pLOI2182 19,600 3,130 31,100 14,000
pLOI2183 20,700 3,320 32,000 14,000
pLOI2184 15,500 2,480 21,200 11,900
pLOI2185 15,100 2,420 24,600 11,500
pLOI2186 17,000 2,380 25,700 13,400
pLOI2187 15,800 2,210 24,500 12,200
pLOI2188 18,200 2,180 25,600 12,000
pLOI2189 14,800 2,360 27,100 12,700
pLOI2190 16,100 2,410 26,500 12,500
pLOI2191 15,800 2,210 25,000 12,400
pLOI2192 15,100 1,810 24,900 12,500
pLOI2193 16,700 2,010 24,600 12,800
pLOI2194 15,400 2,770 21,500 11,900
a pLOI2173은 원래 프로모터가 있는 celZ 유전자를 함유하며, 다른 모든 것은 대리 프로모터로서 작용하는 제트. 모빌리스 DNA 단편이 있는 celZ 유전자를 함유한다. b 글루카나제 (CMCase) 활성은 30 ℃에서 16시간의 성장 후에 확인되었다.
이들 플라스미드에 의한 활성은 본래의 celZ 프로모터를 함유하는 대조군 플라스미드 (pLOI2173)에 의한 것 보다 8배 까지 더 높았다. 최대 대역을 형성한 4개의 플라스미드 (pLOI2177, pLOI2180, pLOI2182 및 pLOI2183)는 또한 브로쓰로 방출된 최고 총 글루카나제 활성 (약 20,000 IU L-1)을 나타내었다. 이들 플라스미드 중 하나 pLOI2183을 염색체 통합을 위해 선택하였다.
폴리사카라제 유전자의 염색체 통합
원하는 폴리사카라제 유전자를 적합한 숙주 세포, 예를 들면 클레브시엘라 P2 균주로 안정하게 혼입시키기 위하여, 모든 복제 기능은 결핍되었지만 통합을 위한 상동성 DNA 단편, 대리 프로모터가 있는 celZ 유전자 및 선택성 마커를 함유한 DNA 단편의 단리를 촉진시키도록 새로운 벡터 (pLOI2306)를 작제하였다 (도 7). 폴리링커 영역을 플랭킹시키는 클레나우 처리된 NdeI 및 SapI 부위에 링커 (GGCGCGCC; 서열 번호 11)를 삽입하여 두 AscI 부위를 Puc19에 첨가하여 pLOI2302를 생산하였다. pBR322로부터의 tet 내성 마커 유전자를 함유하는 평체 단편 (EcoRI 및 AvaI에 의한 제거에 이어서 클레나우 처리)을 pLOI2302의 PstI 부위 (PstI에 의한 절단에 이어서 클레나우 처리)에 클로닝하여 pLOI2303을 생산하였다. 이 플라스미드 pLOI2303의 SmaI 부위에 케이. 옥시토카 M5A1 염색체 DNA의 평체 단편 (EcoRI로 절단하고 클레나우 처리로 평체화됨)을 연결하여 pLOI2305를 생산하였다. pLOI2305의 EcoRI 부위 (EcoRI, 클레나우 처리)에 pLOI2183으로부터의 celZ 유전자 및 대리 제트. 모빌리스 프로모터를 함유하는 EcoRI-SphI 단편 (클레나우 처리됨)을 연결하여 pLOI2306을 생산하였다. AscI에 의한 pLOI2306의 분해는 두 단편을 생산하였으며, 그중 더 큰 것은 상동성 재조합을 위한 염색체 DNA 단편, 대리 프로모터가 있는 celZ 유전자 및 tet 유전자를 함유하였다. 더 큰 단편 (10 kbp)을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하고, 자기 연결에 의해 환형화하고, 클레브시엘라 균주 P2로 전기천공하고 이어서 테트라사이클린 내성에 대한 선택 하에 성장시켰다. 형성된 21개의 테트라사이클린 내성 콜로니를 정제하고 글루카나제 활성에 대해 CMC 평판 상에서 시험하였다. 모든 것은 양성이었으며, 그 중 큰 대역은 cel 유전자 생성물의 기능적 발현을 나타낸다.
DH5α를 플라스미드 DNA 제제로 형질전환시키고 겔 전기영동에 의해 재조합 균주를 생산하는데 사용되는 클론의 필요치 않는 플라스미드의 존재에 대해 시험하 였다. 시험된 12가지 클론으로 형질전환체는 얻어지지 않았다. 그러나, 이들 균주 중 2가지는 celZ를 함유할 수 있는 큰 플라스미드 밴드를 함유하는 것으로 발견되었으며 이들은 폐기되었다. 큰 플라스미드를 가진 균주는 둘다 T7 및 M13 프라이머로 서열화될 수 있는 DNA를 함유하였으며, 이는 다중카피 플라스미드의 존재를 확인시켜 주는 것이다. 남은 10가지 균주는 통합된 celZ 유전자를 함유하며 어느 프라이머로도 서열화될 수 없었다.
새로운 벡터 pLOI2306의 구조적 특징은 도 8에 개략적으로 나타나 있으며 각종 코딩 영역 (즉, 유전자 celZ, bla 및 tet의 코딩 영역)을 비롯한 벡터의 뉴클레오티드 서열은 서열 목록의 서열 번호 12에 나타나 있다. celZ 유전자 (이. 크리산테미로부터 얻음)의 비코딩 서열 다운스트림을 나타내는 뉴클레오티드 염기쌍 3282-4281 및 케이. 옥시토카 M5A1로부터 얻은 비코딩 표적 서열의 일부를 나타내는 염기쌍 9476-11544는 표준 기술을 이용하여 서열화되도록 남아있다 (Sambrook, J. et al., T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)). 예를 들면, pLOI2306 플라스미드의 상기 비서열화된 영역의 어느 쪽 위의 충분한 플랭킹 서열은 이들 공지된 서열에 상응하는 서열화 프라이머가 합성되어 주형으로서 pLOI2306 플라스미드를 사용하여 표준 서열화 반응을 수행하는데 이용될 수 있도록 제공된다.
별법으로, 이들 비서열화된 영역은 주형으로서 사용하기 위한 pLOI2306 플라 스미드의 부재하에서도 확인될 수 있음을 당 업계의 숙련인은 이해할 것이다. 예를 들어, 남아있는 celZ 서열은 각각 이. 크리산테미 서열을 포함하는 라이브러리로부터 celZ 함유 클론을 단리하고 단리된 클론을 표준 DNA 서열화 반응을 이용하여 서열화하기 위한 프로브 및 프라이머를 합성하기 위해 본원에 제공된 서열 (예를 들면, 서열 번호 12의 뉴클레오티드 1452-2735)을 이용하여 확인될 수 있다. 마찬가지로, 남아있는 표적 서열은 각각 케이. 옥시토카 M5A1 EcoRI 단편 (예를 들면, 적절한 크기의 것)을 포함하는 라이브러리로부터 표적 서열을 함유하는 클론을 단리하고 단리된 클론을 표준 DNA 서열화 반응을 이용하여 서열화하기 위한 프로브 및 프라이머를 합성하기 위해 본원에 제공된 서열 (예를 들면, 서열 번호 12의 뉴클레오티드 8426-9475)을 이용하여 확인될 수 있다 (케이. 옥시토카 M5A1의 공급원은 표준 기술을 이용하여 임의의 플라스미드 없이 퀴아 (cure)된 ATCC 68564일 것이다). 당 업계의 숙련인은 또한 세균의 cDNA 또는 게놈 서열을 표시하는 라이브러리의 제조 및 그러한 라이브러리 (예를 들면, cDNA 또는 게놈 라이브러리)로부터의 원하는 핵산 단편의 단리가 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 혼성화 기술 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 통상적으로 수행되며 이들 모든 기술이 당 업계에서 일반적이라는 것을 인식할 것이다 (Sambrook, J. et al., T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989); Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, Ed. 1984); and PCR Handbook Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, Ed. John Wiley & Sons (1999) (Editor) 참조).
대리 프로모터 및 통합된 또는 플라스미드 기재 작제물을 이용한 이종성 유전자 발현
10가지의 통합 균주 (SZ1-SZ10)를 LB 소르비톨 브로쓰에서의 글루카나제 생산에 대해 연구하였다 (표 6). 모두가 5,000-7,000 IUL-1의 활성 효소를 생산하였다. 이는 본래의 celZ 프로모터를 함유하는 플라스미드 pLOI2173으로부터 발현된 활성의 2배를 나타내지만, 통합된 균주는 동일한 대리 제트. 모빌리스 프로모터를 함유하는 P2 (pLOI2183)에 의해 얻어지는 글루카나제 활성의 ⅓만을 생산하였다 (표 5). 통합 시의 글루카나제 발현의 감소는 카피 수의 감소의 원인이 될 수 있다 (즉, 다중 카피 플라스미드 대 단일 통합된 카피).
글루카나제 EGZ의 분비
케이. 옥시토카는 에르위니아 크리산테미에서 펙테이트 리아제 및 글루카나제 (EGZ)를 분비하는 out 유전자에 의해 코딩된 분비계와 유사한, 플루라나제 분비를 위한 천연 타입 II 분비계 (Pugsley (1993) Microbiol. Rev. 57:50-108)를 함유한다 (Pugsley (1993) Microbiol. Rev. 57:50-108) (Barras et al. (1994) Annu. Rev. Phytopathol. 32:201-234; He et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 1079-1083). 타입 II 분비계는 전형적으로 매우 특이적이고 이종성 단백질에 의해 불량하게 기능한다 (He et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 1079-1083; Py et al. (1991) FEMS Microbiol. Lett. 79:315-322; Sauvonnet et al. (1996) Mol. Microbiol. 22:1-7). 이렇게 예상된 바와 같이, 재조합 celZ는 숙주로서 M5A1 (표 5) 또는 P2 (표 6)를 사용한 세포 결합 생성물로서 주로 발현되었다. 총 재조합 EGZ 활성의 약 1/4 (12-26%)가 브로쓰에서 회수되었다. 이. 콜리 DH5α의 경우, 총 세포외 EGZ의 약 8-12%가 존재하였다. 따라서, 케이. 옥시토카에서의 천연 분비계는 재조합 EGZ의 부분 분비를 용이하게 할 수 있다.
목적하는 생성물의 분비를 더 개선시키기 위하여, 이. 크리산테미 EC16으로부터의 타입 II 분비 유전자 (out 유전자)를 도입하여 (예를 들면, pCPP2006을 이용함) 케이. 옥시토카의 에탄올생성 균주에서 균주 P86021로부터의 재조합 EGZ의 분비를 촉진시켰다. celZ를 가진 플라스미드를 함유하는 대부분의 균주의 경우, out 유전자의 추가는 세포외 EGZ를 5배 증가시키고 총 글루카나제 활성을 2배 증가시켰다. 통합된 celZ를 가진 균주의 경우, out 유전자의 추가는 세포외 EGZ를 10배 증가시키고 총 글루카나제 활성을 4배 증가시켰다. 둘다의 경우에서, out 유전자는 총 글루카나제 활성의 약 ½의 분비를 촉진시켰다. out 유전자의 추가에 의해 이루어지는 EGZ 활성의 증가는 플라스미드 및 통합된 celZ 작제물에서 분비된 생성물의 폴딩 개선에 영향을 미칠 수 있다. pUC 기재 유도체로 관찰되는 더 작은 증가는 고카피 플라스미드 상의 bla 유전자로부터의 주변 세포질 β-락타마제의 생산 중 방출 기작을 위한 플라스미드 부담 및 경쟁으로부터 일어날 수 있다.
P2의 최상의 통합 균주를 확인하기 위해 두가지 기준, 즉 고농도의 클로람페니콜 (업스트림 pdc 및 adhB 유전자의 고도의 발현을 위한 마커)을 함유하는 고체 배지 상에서의 성장 및 out 유전자에 의한 글루카나제의 효과적인 분비를 이용하였다. 추가의 연구를 위해 2가지 재조합 균주, SZ2 및 SZ6을 선택하였다. 두가지 모두 총 세포 단백질의 약 5%와 등가량인 24,000 IU-1의 글루카나제 활성을 생산하였다 (Py et al. (1991) Protein Engin. 4:325-333).
기질 해중합
재조합 EGZ의 기질 해중합은 CMC 공급원에 적용될 때 우수한 것으로 확인되었다 (표 7). 산 팽윤된 셀룰로오스에 적용될 때, 글루카나제의 활성은 CMC 활성에 대해 측정된 활성의 10% 미만이었다. 폴리사카라제가 아비셀 또는 크실란에 적용될 때, 활성은 거의 관찰되지 않았다. 그러나, 밤새 분해되도록 두었을 때, EGZ 폴리사카라제는 모든 기질에 대해 평균 중합체 길이의 측정가능한 감소가 일어나게 하였다. CMC 및 산 팽윤된 셀룰로오스는 7가지 당 성분의 평균 길이로 해중합되었다. 이들 7가지 성분의 셀룰로오스 중합체는 약한 가용성이며 이상적으로는 효율적인 대사를 위해 더 분해될 수 있다 (Wood et al. (1992) Appl Environ. Microbiol. 58:2103-2110). 볼밀 분쇄된 셀룰로오스 및 아비셀의 평균 사슬 길이는 원래 길이의 ⅓로 감소되었고 크실란 중합체 당 단일 절단 미만이 관찰되었다.
통합된celZ를 함유하는 에탄올생성 케이. 옥시토카로부터의 배양액 성장, 글루카나제 생산 및 분비의 비교
균주 고체 배지 상에서의 성장 (600 ㎎ L-1 CM) 글루카나제 생산 및 분비 (IU L-1)
분비계 없음 분비계 추가 (pCPP2006)
총 활성 분비된 활성 총 활성 분비된 활성
P2 ++++ 0 0 0 0
SZ1 ++ 6,140 1,600 26,100 14,300
SZ2 ++++ 6,460 1,160 23,700 11,400
SZ3 +++ 5,260 1,320 18,400 8,440
SZ4 +++ 7,120 1,070 23,200 9,990
SZ5 + 6,000 1,080 29,300 15,500
SZ6 ++++ 7,620 1,520 24,300 11,900
SZ7 + 6,650 1,330 28,800 15,500
SZ8 +++ 7,120 854 28,700 14,900
SZ9 ++ 7,530 1,130 26,700 12,800
SZ10 +++ 4,940 939 17,000 6,600
글루카나제 (CMCase) 활성은 30 ℃에서 16시간의 성장 후에 확인되었다.
균주 SZ6 (pCPP2006)의 무세포 브로쓰로부터의 EGZ에 의한 각종 기질의 해중합
기질 효소 활성 (IU/L) 평가된 중합도
분해 전 분해 후
카르복시메틸 셀룰로오스 13,175 224 7
산 팽윤된 셀룰로오스 893 87 7
볼밀 분쇄된 셀룰로오스 200 97 28
아비셀 41 104 35
오트 스펠츠로부터의 크실란 157 110 78
균주 SZ6 (pCPP2006)은 분비된 EGZ의 공급원으로서 16시간 동안 LB-소르비톨 브로쓰에서 성장되었다.
발효
유용하게 하기 위하여 균주 P2에 첨가된 celZ 및 out 유전자는 형성된 생체 촉매의 발효 능력을 감소시키지 않아야 한다. 글루코오스 및 셀로비오스를 이용하여 비교가 이루어졌다 (표 8). 모든 균주는 이들 당을 발효시키는 능력 면에서 동등하였으며, 이는 celZ의 통합 또는 pCPP2006의 첨가가 해로운 효과를 나타내지 않음을 나타낸다. 또한, 이들 균주를 산 팽윤된 셀룰로오스를 에탄올로 직접 전환시키는 능력에 대해 검사하였다. 대부분의 활성 작제물 SZ6 (pCPP2006)은 비결정질 셀룰로오스로부터 소량 (3.9 g L-1)의 에탄올을 생산하였다. 모든 균주의 접종시에 초기에는 약 1.5 g L-1의 에탄올이 존재하였다. 이는 SZ6 (pCPP2006)을 제외하고는 모든 균주의 경우에 시간에 따라 0으로 감소되었다. 따라서, SZ6 (pCPP2006)으로 관찰된 3.9 g L-1의 에탄올의 생산은 총 에탄올 생산의 과소평가를 나타낼 수 있다. 그러나, 이는 고작 존재하는 중합체의 일부 만의 전환을 나타낸다. 산 팽윤된 셀룰로오스의 EGZ 가수분해에 의해 저농도의 글루코오스, 셀로비오스 및 셀로트리오스가 생산되고 발효되는 것으로 생각된다. 이 화합물은 케이. 옥시토카에서 본래의 포스포에놀피루베이트-의존성 포스포트랜스퍼라제 시스템에 의해 대사 변화될 수 있다 (Ohta K et al., (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900; Wood et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110).
각종 기질 (50 g L-1)을 이용한 통합된celZ 및out 유전자 (pCPP2006)를 함유하는 균주 SZ6에 의한 에탄올 생산
균주 에탄올 생산 (g L-1)
글루코오스 셀로비오스 산 팽윤된 셀룰로오스
P2 22.9 22.7 0
P2 (pCPP2006) 22.6 21.3 0
SZ6 21.5 19.7 0
SZ6 (pCPP2006) 22.7 21.2 3.9
접종 시의 초기 에탄올 농도는 모든 배양액의 경우 약 1.5 g L-1이었다. 기질로서 산 팽윤된 셀룰로오스를 사용한 경우, 이 농도는 SZ6 (pCPP2006)을 제외한 모든 균주에 대해 72시간의 접종 후에 0으로 감소하였다.
등가 사항
당 업계의 숙련인은 본원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 많은 등가 사항을 통상적인 실험을 이용하여 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가 사항은 다음 청구의 범위에 포함된다. 또한, 미국 특허 제5,821,093호, 5,482,846호, 5,424,202호, 5,028,539호, 5,000,000호, 5,487,989호, 5,554,520호 및 5,162,516호에 기재된 임의의 많은 유전자 작제물, 숙주 세포 및 방법은 본 발명을 수행하는데 이용될 수 있으며 본원에 참고로 인용된다.
<110> Ingram, L et al. <120> RECOMBINANT HOSTS SUITABLE FOR SIMULTANEOUS SACCHARIFICATION AND FERMENTATION <130> BCI-016CPPC <140> PCT/US00/14773 <141> 2000-05-26 <150> 60/136,376 <151> 1999-05-26 <160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 450 <212> DNA <213> Zymomonas mobilis <220> <223> promoter <400> 1 ctttttcggc atgagcaacc aacattttca aggtatcatc ctgatgcgca atatcggcat 60 cggttagcca taaccatttt acctgtccgg cggccttaat accttgatca gatggttcgt 120 ggtgttgtta ccttgccgaa gggcaccggt aaaaatgttc gcgtcggtgt tttcgcccgt 180 ggcccgaaag ctgaagaagc taaagctgct ggtgcagaag ttgtcggcgc agaagacctg 240 atggaagcca ttcagggcgg cagcattgat ttcgatcgtg atgcccttta tactgaaatt 300 gccttgcgct gccataatga agcagcctcc ggtgttttgg cagatttaag cgctgcctga 360 ttttcgtgat cctctagagt ctatgaaatg gagattcatt tatgcctctc tcttattcgg 420 ataaccatcc agtcatccgc aagcttggcc 450 <210> 2 <211> 1509 <212> DNA <213> Zymomonas mobilis <220> <223> expression vector <400> 2 gatcaaccgg caatttatcc acggcatcaa attcgatctg tcttttcccg tatcattggc 60 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ggccgtttta tgcttgggat tattgatatg ccgaaaagga tacaacatct 960 ggaagaaaaa gacgaaggcc ggaataagcg cccattctgc aaaattgtta caacttagtc 1020 gcgccatcag ggaatgaaaa atcaatccgt ctttttcggc atgagcaacc aacattttca 1080 aggtatcatc ctgatgcgca atatcggcat cggttagcca taaccatttt acctgtccgg 1140 cggccttaat accttgatca gatggttcgt ggtgttgtta ccttgccgaa gggcaccggt 1200 aaaaatgttc gcgtcggtgt tttcgcccgt ggcccgaaag ctgaagaagc taaagctgct 1260 ggtgcagaag ttgtcggcgc agaagacctg atggaagcca ttcagggcgg cagcattgat 1320 ttcgatcgtg atgcccttta tactgaaatt gccttgcgct gccataatga agcagcctcc 1380 ggtgttttgg cagatttaag cgctgcctga ttttcgtgat cctctagagt ctatgaaatg 1440 gagattcatt tatgcctctc tcttattcgg ataaccatcc agtcatccgc aagcttggcc 1500 gtaatccat 1509 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 cgaattcctg ccgaagttta ttagcca 27 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 aaggatcctt ccaccagcta 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gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 6416 gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 6476 acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 6536 acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 6596 tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg 6656 ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggcgc 6716 gccagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta 6776 atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa 6836 tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat 6896 gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta 6956 cgccaagctt gcatgccaat tctcatgttt gacagcttat catcgataag ctttaatgcg 7016 gtagtttatc acagttaaat tgctaacgca gtcaggcacc gtgt atg aaa tct aac 7072 Met Lys Ser Asn aat gcg ctc atc gtc atc ctc ggc acc gtc acc ctg gat gct gta ggc 7120 Asn Ala Leu Ile Val Ile Leu Gly Thr Val Thr Leu Asp Ala Val Gly 10 20 ata ggc ttg gtt atg ccg gta ctg ccg ggc ctc ttg cgg gat atc gtc 7168 Ile Gly Leu Val Met Pro Val Leu Pro Gly Leu Leu Arg Asp Ile Val 30 cat tcc gac agc atc gcc agt cac tat ggc gtg ctg cta gcg cta tat 7216 His Ser Asp Ser Ile Ala Ser His Tyr Gly Val Leu Leu Ala Leu Tyr 40 50 gcg ttg atg caa ttt cta tgc gca ccc gtt ctc gga gca ctg tcc gac 7264 Ala Leu Met Gln Phe Leu Cys Ala Pro Val Leu Gly Ala Leu Ser Asp 60 cgc ttt ggc cgc cgc cca gtc ctg ctc gct tcg cta ctt gga gcc act 7312 Arg Phe Gly Arg Arg Pro Val Leu Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Thr 70 80 atc gac tac gcg atc atg gcg acc aca ccc gtc ctg tgg atc ctc tac 7360 Ile Asp Tyr Ala Ile Met Ala Thr Thr Pro Val Leu Trp Ile Leu Tyr 90 100 gcc gga cgc atc gtg gcc ggc atc acc ggc gcc aca ggt gcg gtt gct 7408 Ala Gly Arg Ile Val Ala Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Ala Val Ala 110 ggc gcc tat atc gcc gac atc acc gat ggg gaa gat cgg gct cgc cac 7456 Gly Ala Tyr Ile Ala Asp Ile Thr Asp Gly Glu Asp Arg Ala Arg His 120 130 ttc ggg ctc atg agc gct tgt ttc ggc gtg ggt atg gtg gca ggc ccc 7504 Phe Gly Leu Met Ser Ala Cys Phe Gly Val Gly Met Val Ala Gly Pro 140 gtg gcc ggg gga ctg ttg ggc gcc atc tcc ttg cat gca cca ttc ctt 7552 Val Ala Gly Gly Leu Leu Gly Ala Ile Ser Leu His Ala Pro Phe Leu 150 160 gcg gcg gcg gtg ctc aac ggc ctc aac cta cta ctg ggc tgc ttc cta 7600 Ala Ala Ala Val Leu Asn Gly Leu Asn Leu Leu Leu Gly Cys Phe Leu 170 180 atg cag gag tcg cat aag gga gag cgt cga ccg atg ccc ttg aga gcc 7648 Met Gln Glu Ser His Lys Gly Glu Arg Arg Pro Met Pro Leu Arg Ala 190 ttc aac cca gtc agc tcc ttc cgg tgg gcg cgg ggc atg act atc gtc 7696 Phe Asn Pro Val Ser Ser Phe Arg Trp Ala Arg Gly Met Thr Ile Val 200 210 gcc gca ctt atg act gtc ttc ttt atc atg caa ctc gta gga cag gtg 7744 Ala Ala Leu Met Thr Val Phe Phe Ile Met Gln Leu Val Gly Gln Val 220 ccg gca gcg ctc tgg gtc att ttc ggc gag gac cgc ttt cgc tgg agc 7792 Pro Ala Ala Leu Trp Val Ile Phe Gly Glu Asp Arg Phe Arg Trp Ser 230 240 gcg acg atg atc ggc ctg tcg ctt gcg gta ttc gga atc ttg cac gcc 7840 Ala Thr Met Ile Gly Leu Ser Leu Ala Val Phe Gly Ile Leu His Ala 250 260 ctc gct caa gcc ttc gtc act ggt ccc gcc acc aaa cgt ttc ggc gag 7888 Leu Ala Gln Ala Phe Val Thr Gly Pro Ala Thr Lys Arg Phe Gly Glu 270 aag cag gcc att atc gcc ggc atg gcg gcc gac gcg ctg ggc tac gtc 7936 Lys Gln Ala Ile Ile Ala Gly Met Ala Ala Asp Ala Leu Gly Tyr Val 180 190 ttg ctg gcg ttc gcg acg cga ggc tgg atg gcc ttc ccc att atg att 7984 Leu Leu Ala Phe Ala Thr Arg Gly Trp Met Ala Phe Pro Ile Met Ile 200 ctt ctc gct tcc ggc ggc atc ggg atg ccc gcg ttg cag gcc atg ctg 8032 Leu Leu Ala Ser Gly Gly Ile Gly Met Pro Ala Leu Gln Ala Met Leu 210 220 tcc agg cag gta gat gac gac cat cag gga cag ctt caa gga tcg ctc 8080 Ser Arg Gln Val Asp Asp Asp His Gln Gly Gln Leu Gln Gly Ser Leu 230 240 gcg gct ctt acc agc cta act tcg atc act gga ccg ctg atc gtc acg 8128 Ala Ala Leu Thr Ser Leu Thr Ser Ile Thr Gly Pro Leu Ile Val Thr 250 gcg att tat gcc gcc tcg gcg agc aca tgg aac ggg ttg gca tgg att 8176 Ala Ile Tyr Ala Ala Ser Ala Ser Thr Trp Asn Gly Leu Ala Trp Ile 260 270 gta ggc gcc gcc cta tac ctt gtc tgc ctc ccc gcg ttg cgt cgc ggt 8224 Val Gly Ala Ala Leu Tyr Leu Val Cys Leu Pro Ala Leu Arg Arg Gly 280 gca tgg agc cgg gcc acc tcg acc tga atggaagccg gcggcacctc 8271 Ala Trp Ser Arg Ala Thr Ser Thr 290 gctaacggat tcaccactcc aagaattgga gccaatcaat tcttgcggag aactgtgaat 8331 gcgcaaacca acccttggca gaacatatcc atcgcgtccg ccatctccag cagccgcacg 8391 cggcgcatct cggggtcgac tctagaggat ccccgcaacg ctgtcagcgc tttccagtta 8451 aacggctcca acgtcgccat aggtaattcc tcgcccggcc atacgatcgg gcaggtgccg 8511 ttggctatcg ccgtcgcctg actcatcaca ctatcttccg ctgcatcgcg aagggttttg 8571 accacttctt ccatctctcc gtgcgccgga tgccatgctc acgtacgcgg cttatcagat 8631 agtcgggcag gccgtcgttc cagcccaatg aggggaagct ggcgtggagc gatgccagca 8691 cctgctcctc aacaccgtaa tggccggcgg cgaacaggca ttcggcggta agcgcttcca 8751 gccctttaat catcacgctg cggcacatct tgatagccga cacgctgcca acgtggttac 8811 caccatagcg ggcgttacat ccaagcgtgg tgagtaattc agcaattgcc tctgcctgtg 8871 gtccccccgt caacagcggc gttcggagtg cccctggggg gaccggcgcc atcaccgcta 8931 catcgacata agcgccgggc ttaaagcatt tggcagcctg acgcttggtc tgcggggcga 8991 cggagttaag gtcaagaaaa tactgcgtgt cggtcatcag cggtgcagct tgtgaggcga 9051 catccagggc ggatcccgcg gtgacggtgg aaaatatgag ttcggcacct gtcaacgcgt 9111 cagccaggga gattgccgcc cgcacgcctc cccgatgcgc cttcgttatc atcgcatcgc 9171 gctcaggacc ttgcagcttg caatcccaga cggtgactgg gttcactttt gccagtgcat 9231 ccgcaagaat gccacctgct tcaccataac ctataaacgt tattgtcgtc ataacagctc 9291 cttacgcggc cacacgtcgg ccggaatgca aacgtcgccc gcgaacagaa gtcgcgccgt 9351 acgcagcaga ccgcagcctg ccaactgccc attatcatca agccggagcg ccacgctgaa 9411 ttgggtaccg agctccgaat tgggtaccga gctcgaatta attcgagctc ggtacccggg 9471 gatcnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9531 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9591 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9651 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9711 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9771 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9831 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9891 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 9951 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10011 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10071 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10131 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10191 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10251 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10311 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10371 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10431 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10491 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10551 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10611 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10671 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10731 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10791 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10851 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10911 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 10971 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11031 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11091 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11151 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11211 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11271 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11331 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11391 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11451 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 11511 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnn 11544

Claims (77)

  1. 폴리사카라제 폴리펩티드의 발현 증가를 야기시킬 수 있으며 서열 1 또는 그의 상보체, 및 서열 2 또는 그의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 대리 프로모터의 전사 제어 하에 폴리사카라제 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 단편; 및
    분비성 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 단편
    을 포함하는 것으로, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 단편의 발현 결과 폴리사카라제의 생산 증가를 일어나게 하는 재조합 숙주 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생산 증가가 상기 폴리사카라제의 활성의 증가, 상기 폴리사카라제의 양의 증가, 또는 활성의 증가 및 양의 증가의 조합을 포함하는 것인 재조합 숙주 세포.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리사카라제 폴리펩티드가 분비되는 것인 재조합 숙주 세포.
  4. 제2항에 있어서, 상기 숙주 세포가 세균 세포인 재조합 숙주 세포.
  5. 제4항에 있어서, 상기 숙주 세포가 그람-음성 세균 세포인 재조합 숙주 세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 숙주 세포가 통성 혐기성 세균 세포인 재조합 숙주 세포.
  7. 제6항에 있어서, 상기 숙주 세포가 장내세균과 (Enterobacteriaceae)로부터 선택되는 재조합 숙주 세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 숙주가 에세리히아 (Escherichia) 및 클레브시엘라 (Klebsiella)로 이루어진 군에서 선택되는 재조합 숙주 세포.
  9. 제8항에 있어서, 상기 에세리히아가 이. 콜리 B (ATCC 11303), 이. 콜리 DH5α, 이. 콜리 KO4 (ATCC 55123), 이. 콜리 KO11 (ATCC 55124), 이. 콜리 KO12 (ATCC 55125), 이. 콜리 LY01 (ATCC PTA-3466), 케이. 옥시토카 M5A1 (ATCC 68564) 및 케이. 옥시토카 P2 (ATCC 55307)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 재조합 숙주 세포.
  10. 제1항에 있어서, 상기 폴리사카라제가 글루카나제, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 셀로비오히드롤라제, β-글루코시다제, 엔도-1,4-β-크실라나제, α-크실로시다제, α-글루쿠로니다제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아세틸에스테라제, 아세틸크실란에스테라제, α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루라나제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 아라비노시다제, 만나나제, 펙틴 히드롤라제, 펙테이트 리아제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 재조합 숙주 세포.
  11. 제10항에 있어서, 상기 폴리사카라제가 글루카나제인 재조합 숙주 세포.
  12. 제10항에 있어서, 상기 폴리사카라제가 celZ 유전자의 발현 생성물인 재조합 숙주 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 celZ 유전자가 에르위니아 크리산테미 (Erwinia chrysanthemi)로부터 유래된 것인 재조합 숙주 세포.
  14. 제2항에 있어서, 상기 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 단편이 하나 이상의 pul 유전자 또는 out 유전자를 포함하는 것인 재조합 숙주 세포.
  15. 제2항에 있어서, 상기 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 단편이 장내세균과로부터 선택된 세균 세포로부터 유래된 것인 재조합 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 상기 세균 세포가 케이. 옥시토카, 이. 카로토보라, 이. 카로토보라 아종 카로토보라, 이. 카로토보라 아종 아트로셉티카 및 이. 크리산테미로 이루어진 군에서 선택되는 재조합 숙주 세포.
  17. 제2항에 있어서, 상기 대리 프로모터가 지모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis)로부터 유래된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 재조합 숙주 세포.
  18. 삭제
  19. 제1항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 에탄올을 생성하는 것인 재조합 숙주 세포.
  20. 삭제
  21. 삭제
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  48. 올리고사카라이드를 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 재조합 숙주 세포와 접촉시켜 올리고사카라이드를 효소적으로 분해하는 것을 포함하는, 올리고사카라이드의 효소적 분해 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 올리고사카라이드를 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  50. 삭제
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  52. 제48항에 있어서, 상기 방법이 동시 당화 및 발효를 위해 이용되는 방법.
  53. 제48항에 있어서, 상기 올리고사카라이드가 리그노셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 셀룰로오스, 펙틴 및 그의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  54. 삭제
  55. 폴리사카라제 폴리펩티드의 발현 증가를 야기시킬 수 있으며 서열 1 또는 그의 상보체, 및 서열 2 또는 그의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 대리 프로모터의 전사 제어 하에 폴리사카라제 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 단편을 재조합 숙주 세포에 도입하는 단계; 및
    상기 숙주 세포에 분비성 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 단편을 도입하는 단계
    를 포함하며, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 단편을 발현하여 재조합 숙주 세포에 의한 폴리사카라제의 생산 증가를 일으키는, 동시 당화 및 발효에 사용하기 위한 재조합 숙주 세포의 제조 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 생산 증가가 상기 폴리사카라제의 활성의 증가, 상기 폴리사카라제의 양의 증가, 또는 활성의 증가 및 양의 증가의 조합을 포함하는 것인 방법.
  57. 제55항 또는 56항에 있어서, 상기 폴리사카라제 폴리펩티드가 분비되는 것인 방법.
  58. 제55항 또는 56항에 있어서, 상기 숙주 세포가 에탄올을 생성하는 것인 방법.
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 올리고사카라이드 공급원을 제19항에 따른 재조합 숙주 세포와 접촉시키는 것을 포함하며,
    제1 및 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 단편을 발현하여 에탄올생성 세포에 의한 폴리사카라제 활성의 생산 증가를 일으켜서 올리고사카라이드 공급원을 효소적으로 분해하고 에탄올로 발효시키는, 올리고사카라이드 공급원으로부터 에탄올을 생산하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 폴리사카라제가 글루카나제, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 셀로비오히드롤라제, α-글루코시다제, 엔도-1,4-α-크실라나제, β-크실로시다제, β-글루쿠로니다제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아세틸에스테라제, 아세틸크실란에스테라제, α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루라나제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 아라비노시다제, 만나나제, 펙틴 히드롤라제, 펙테이트 리아제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 폴리사카라제가 글루카나제인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 글루카나제가 celZ 유전자의 발현 생성물인 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 celZ 유전자가 에르위니아 크리산테미로부터 유래된 것인 방법.
  69. 제64항에 있어서, 상기 제2 이종성 폴리뉴클레오티드 단편이 하나 이상의 pul 유전자 또는 out 유전자를 포함하는 것인 방법.
  70. 제64항에 있어서, 상기 숙주 세포가 장내세균과로부터 선택되는 것인 방법.
  71. 제64항에 있어서, 상기 숙주 세포가 에세리히아 및 클레브시엘라로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  72. 제64항에 있어서, 상기 숙주 세포가 이. 콜리 B (ATCC 11303), 이. 콜리 DH5α, 이. 콜리 KO4 (ATCC 55123), 이. 콜리 KO11 (ATCC 55124), 이. 콜리 KO12 (ATCC 55125), 이. 콜리 LY01 (ATCC PTA-3466), 케이. 옥시토카 M5A1 (ATCC 68564) 및 케이. 옥시토카 P2 (ATCC 55307)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  73. 제64항에 있어서, 상기 폴리사카라제가 증가된 활성을 갖는 것인 방법.
  74. 삭제
  75. 제64항에 있어서, 상기 올리고사카라이드가 리그노셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 셀룰로오스, 펙틴 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  76. 제64항에 있어서, 상기 제1 이종성 폴리뉴클레오티드 단편이 pLOI2306 (서열 번호 12)인 방법.
  77. 제48항에 있어서, 상기 방법이 수용액에서 수행되는 방법.
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