CN100335639C - 适用于同时糖化和发酵的重组宿主 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了重组宿主细胞，该细胞含有受能够增强多糖酶表达的取代启动子转录控制的至少一种编码多糖酶的异源多核苷酸。另外，本发明还提供了具有编码分泌蛋白的基因的上述宿主，以便有利于所表达的多糖酶的分泌。本发明的优选宿主是产生乙醇的，并且能够同时进行糖化和发酵，导致由复杂的纤维素底物产生乙醇。

Description

适用于同时糖化和发酵的重组宿主
相关资料
本申请要求题为“适用于同时糖化和发酵的重组宿主”的美国临时专利申请60/136376的优先权，该临时申请的申请日为1999年5月26日，它被以全文形式收作本文参考。在本说明书中所引用的所有专利、专利申请、和参考文献的内容，以其全文形式收作本文参考。
政府资助的研究
该研究得到了美国农业部、国家研究创造会(95-37308-1843；98-35504-6177)，和美国能源部(DE-FG02-96-ER200222)的部分资助。
发明背景
用从植物材料中获得的、可再生的燃料取代基于石油的汽车燃料，可以带来很多环境的和社会的好处(Lynd等，1991，科学251：1318-1323；Olson等，1996，酶微生物技术18：1-17；Wyman等，1995，美国化学协会专题论文集618：272-290)。美国每年要烧掉超过1200亿加仑的汽车燃料，大致相当于进口石油的总量。乙醇作为可再生的替代燃料的开发，具有消除美国对进口石油依赖的潜力，能改善环境，并能提供新的就业机会(Sheehan，1994，ACS专题论文系列编号566，ACS出版社，1-53页)。
理论上讲，对于进口石油作为汽车燃料的问题的这种解决方案似乎十分简单。与使用石油不同，石油是一种有限的资源，而乙醇可以通过植物材料的发酵有效生产，它是一种可再生的资源。实际上，巴西已经证实了生产乙醇的可行性，并且用乙醇作为主要的汽车燃料使用了20年以上。类似地，美国每年生产超过12亿加仑的燃料乙醇。目前，燃料用乙醇是用酿酒酵母或运动发酵单胞菌，由玉米淀粉或甘蔗糖浆生产的。不过，这两种糖来源都不能满足实现取代基于石油的汽车燃料的需求。另外，糖和玉米淀粉是比较昂贵的原材料，它们还要被用作食品。
另外，上述糖底物仅占植物中总碳水化合物的一部分。实际上，植物中碳水化合物的主要部分是木质素纤维素形式的，它是含有纤维素、半纤维素、果胶和木质素的具有复杂结构的聚合物。例如，木质素纤维素存在于植物的茎、叶、谷壳、外皮、和玉米芯中。水解上述聚合物能够释放出包括葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖在内的中性糖的混合物。尚未有已知天然生物能够将所有这些糖迅速有效地代谢成乙醇。
然而，为了利用这种底物资源，海湾石油公司开发了一种用被称为同时糖化和发酵(SSF)的基于酵母的工艺，由纤维素生产乙醇的方法(Gauss等，1976，U.S.P.N.3990944)。将真菌纤维素酶制剂和酵母添加到一个容器中的纤维素底物的浆体中。在纤维素水解的同时产生了乙醇。不过，海湾石油公司的SSF工艺具有某些缺陷。例如，到目前为止，一直认为真菌纤维素酶在用于大规模生物乙醇工艺中时价格过于昂贵(Himmel等，(1997)Amer.Chem.Soc.pp.2-45；Ingram等，(1987)应用环境微生物学53：2420-2425；Okamoto等，(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.42：563-568；Philippidis，G.，(1994)Amer.Chem.Soc.pp.188-217；Saito等，(1990)J.Ferment.Bioeng.69：282-286；Sheehan，J.，(1994)Amer.Chem.Soc.pp 1-52；Su等，(1993)Biotechnol.Lett.15：979-984)。
发明概述
用于纤维素水解的廉价酶促方法的开发，具有改善底物利用效率和糖化和发酵工艺的经济性的巨大潜力。因此，开发一种可以用来对复杂的纤维素底物进行有效解聚，并随后将该底物快速发酵成乙醇的生物催化剂将具有巨大的效益。
本发明提供了一种工程生产的重组宿主细胞，以便增强适用于对复杂的碳水化合物进行解聚的多糖酶的表达和分泌。具体的例子是两种重组的肠道细菌：大肠杆菌和产酸克雷伯氏菌，它们能在一种取代启动子转录控制下高水平表达多糖酶。本发明提供了对上述宿主的进一步的改进，使它含有一种分泌蛋白，它能够提高细胞中多糖酶的产量。在一种优选实施方案中，所述多糖酶要么是以较大的量生产，要么具有较高的活性，或者是这两者的组合。在一种优选实施方案中，本发明提供了对上述宿主的进一步的改进，使其含有源于诸如运动发酵单胞菌的高效乙醇生产菌的外源产乙醇基因。因此，上述宿主能够表达高水平的蛋白，这种蛋白可以单独使用或者与其他酶或重组宿主组合使用，以便由复杂的碳水化合物产生乙醇。
更具体地讲，在第一方面，本发明的特征是一种具有提高了的多糖酶产量的重组宿主细胞。这一方面的宿主细胞含有一个异源多核苷酸片段，该片段含有编码多糖酶的序列，其中，该序列受一种取代启动子转录控制，并且该启动子能够导致所述多糖酶的产量增加。另外，这一方面的特征是还含有第二种异源多核苷酸片段的宿主细胞，该片段含有编码一种分泌多肽的序列。所述第一和第二种异源多核苷酸片段的表达会导致重组宿主细胞的多糖酶产量、活性或其组合的提高。
在一种优选实施方案中，所述多糖酶多肽是分泌型的。
在另一种实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞，优选为革兰氏阴性、兼性厌氧的，并且来自肠杆菌科。在另一种相关的实施方案中，所述重组宿主细胞是埃希氏菌属或克雷伯氏菌属的，并且优选是以下菌株：大肠杆菌B，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌KO4(ATCC55123)，大肠杆菌KO11(ATCC55124)，大肠杆菌KO12(ATCC55125)，大肠杆菌LY01，产酸克雷伯氏菌M5A1，或产酸克雷伯氏菌P2(ATCC55307)。
在另一种实施方案中，所述重组宿主细胞含有一种多核苷酸片段，该片段编码一种多糖酶，该多糖酶是葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维素生物水解酶、β-葡糖苷酶、内切-1，4-β-木聚糖酶、α-木糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂解酶、或上述多糖酶的组合。在一种相关实施方案中，所述多糖酶优选是葡聚糖酶，更优选是celZ基因的表达产物，最优选为源于菊欧文氏菌。
在另一种实施方案中，所述重组宿主细胞能表达由pul或out基因编码的分泌多肽，所述基因优选源于选自肠杆菌科的细菌细胞，更优选源于产酸克雷伯氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜黑腐亚种、或菊欧文氏菌。
在另一种实施方案中，在所述重组宿主细胞中操纵基因表达的取代启动子源于来自运动发酵单胞菌的多核苷酸片段，更优选是SEQ IDNO：1所提供的序列或该序列的片段。
在另一种实施方案中，上述方面和上述实施方案中的宿主细胞是能产乙醇的。
在第二方面，本发明提供了一种含有异源多核苷酸片段的重组产乙醇宿主细胞，所述多核苷酸片段编码一种多糖酶，并且，该片段是受外源取代启动子转录控制。
在一种实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞，优选为革兰氏阴性、兼性厌氧的，并且来自肠杆菌科。在另一种相关的实施方案中，所述重组产乙醇宿主细胞是埃希氏菌属或克雷伯氏菌属的，并且优选是以下菌株：大肠杆菌B，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌KO4(ATCC55123)，大肠杆菌KO11(ATCC55124)，大肠杆菌KO12(ATCC55125)，大肠杆菌LY01，产酸克雷伯氏菌M5A1，或产酸克雷伯氏菌P2(ATCC55307)。
在另一种实施方案中，所述重组宿主细胞含有一种多核苷酸片段，该片段编码一种多糖酶，该多糖酶是葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维素生物水解酶、α-葡糖苷酶、内切-1，4-α-木聚糖酶、β-木糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂解酶、或上述多糖酶的组合。在一个相关实施方案中，所述多糖酶是葡聚糖酶，优选是celZ基因的表达产物，更优选为源于菊欧文氏菌。
在另一种实施方案中，在所述重组宿主细胞中操纵基因表达的取代启动子源于来自运动发酵单胞菌的多核苷酸片段，更优选是SEQ IDNO：1所提供的序列或该序列的片段。
在另一种实施方案中，上述方面和上述实施方案的特征是一种产乙醇的宿主细胞。
在第三方面，本发明的特征是一种重组产乙醇革兰氏阴性细菌宿主细胞，该细胞含有包含编码第一种多肽的序列的第一种异源多核苷酸片段和包含编码一种分泌多肽的序列的第二种异源多核苷酸片段，其中，所述第一种异源多核苷酸受一种取代启动子转录控制，并且提高了所述宿主细胞的第一种多肽的产量。
在一种实施方案中，所述第一种多肽是分泌型的。
在另一种实施方案中，所述重组细胞是兼性厌氧的细菌细胞。在一种相关的实施方案中，所述宿主细胞来自肠杆菌科，优选埃希氏菌或克雷伯氏菌，更优选是以下菌株：大肠杆菌B，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌KO4(ATCC55123)，大肠杆菌KO11(ATCC55124)，大肠杆菌KO12(ATCC55125)，大肠杆菌LY01，产酸克雷伯氏菌M5A1，或产酸克雷伯氏菌P2(ATCC55307)。
在另一种实施方案中，所述重组宿主的第一种多肽是多糖酶，优选是具有增强了的活性的多肽。在一种相关实施方案中，所述多糖酶是葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维素生物水解酶、α-葡糖苷酶、内切-1，4-α-木聚糖酶、β-木糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、α-L-阿拉伯糖果糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂解酶、或上述多糖酶的组合。
在一种优选实施方案中，所述重组宿主细胞的第一种多肽是多糖酶——葡聚糖酶，优选是celZ基因的表达产物，最优选为源于菊欧文氏菌。
在另一种实施方案中，所述重组宿主细胞的第二种异源多核苷酸片段含有至少一个pul基因或out基因，所述基因源于选自肠杆菌科的杆菌细胞，更优选源于产酸克雷伯氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜黑腐亚种、或菊欧文氏菌。
在第四方面，本发明提供了一种酶促降解寡糖的方法，该方法包括让寡糖与一种宿主细胞接触，该宿主细胞含有包含受一种取代启动子控制的编码一种多糖酶的序列的第一种异源多核苷酸片段。另外，所述取代启动子能够导致所述多糖酶的产量提高。另外，上述方法的重组宿主细胞还含有包含编码一种分泌多肽的第二种异源多核苷酸片段。这一方面的宿主细胞的第一和第二种多核苷酸片段的表达，会导致产生多糖酶活性的提高，使所述寡糖得到酶促降解。在一种优选实施方案中，所述多糖酶是分泌型的。
在上述方面的一种实施方案中，所述宿主细胞是产乙醇的。在另一种实施方案中，所述方法是在水溶液中进行的。在另一种实施方案中，所述方法被用于同时糖化和发酵。在另一种实施方案中，所述寡糖优选是木质素纤维素、半纤维素、纤维素、果胶、或上述寡糖的任意组合。
在第五方面，本发明的特征是一种鉴定能够增强目标基因在宿主细胞中表达的取代启动子的方法。该方法包括将来自一种生物的基因组多核苷酸分解成一个或多个片段，并将目标基因置于至少一种上述片段的转录控制之下。该方法还包括将所述片段和目标基因导入宿主细胞，并鉴定具有目标基因的产量增加了的宿主细胞。这样，所述增强了的表达表明该片段是一种取代启动子。
在第六方面，本发明提供了一种制备用于同时糖化和发酵的重组宿主细胞的方法。具体地讲，该方法包括将含有受一种取代启动子转录控制的编码多糖酶的序列的第一种异源多核苷酸片段导入所述宿主细胞中，所述启动子能够导致所述多糖酶多肽的表达增强。另外，该方法还包括将含有编码分泌多肽的序列的第二种异源多核苷酸片段导入所述宿主细胞，以便所述第一和第二种多核苷酸片段的表达能导致所述重组宿主细胞的多糖酶多肽的产量增加。在一种优选实施方案中，所述多糖酶多肽的产量增加是活性、产量、或其组合的增加。在另一种优选实施方案中，所述多糖酶多肽是分泌型的。在一种更优选的实施方案中，所述宿主细胞是产乙醇的。
在第七方面，本发明的特征是一种含有pLOI2306的序列(SEQ IDNO：12)的载体。
在第八方面，本发明的特征是一种含有上述载体的宿主细胞。
在第九方面，本发明的特征是一种制备重组宿主细胞整合体的方法，包括以下步骤：将含有pLOI2306的序列的载体导入宿主细胞，并鉴定具有稳定整合的该载体的宿主细胞。
在第十方面，本发明的特征是一种在宿主细胞中表达一种多糖酶的方法，包括以下步骤：将含有pLOI2306的多核苷酸序列的载体导入宿主细胞，并鉴定能表达所述多糖酶的宿主细胞。在一种优选实施方案中，上述每一方面的特征是产乙醇的宿主细胞。
在第十一方面，本发明提供了一种用寡糖源生产乙醇的方法，该方法是这样实现的：让所述寡糖源与含有包含受一种取代启动子转录控制的编码一种多糖酶的序列的第一种异源多核苷酸片段的产乙醇宿主细胞接触。另外，所述启动子能够导致所述多糖酶表达的增强。另外，所述产乙醇的宿主含有包含编码一种分泌多肽的序列的第二种异源多核苷酸片段。所述产乙醇宿主细胞的所述第一和第二种多核苷酸片段的表达会导致所述宿主细胞的多糖酶活性产量的增加，以便所述寡糖源被酶促降解并发酵成乙醇。
在一种实施方案中，所述重组宿主的第一种多肽是一种多糖酶，并且，所述多肽优选具有增强了的活性。在一种相关实施方案中，所述多糖酶是该多糖酶是葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维素生物水解酶、α-葡糖苷酶、内切-1，4-α-木聚糖酶、β-木糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂解酶、或上述多糖酶的组合。
在一个优选实施方案中，所述重组宿主的第一种多肽是多糖酶葡聚糖酶、优选是celZ基因的表达产物，更优选为源于菊欧文氏菌。
在另一种实施方案中，所述重组宿主细胞的第二种异源多核苷酸片段至少含有pul基因或out基因中的一种，所述基因优选源于选自肠杆菌科的细菌细胞，更优选源于产酸克雷伯氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜黑腐亚种、或菊欧文氏菌。
在另一种实施方案中，所述宿主细胞是兼性厌氧的细菌细胞。在一种相关的实施方案中，所述重组宿主细胞来自肠杆菌科，优选是埃希氏菌或克雷伯氏菌，更优选是以下菌株：大肠杆菌KO4(ATCC55123)，大肠杆菌KO11(ATCC55124)，大肠杆菌KO12(ATCC55125)，产酸克雷伯氏菌M5A1，或产酸克雷伯氏菌P2(ATCC55307)。
在另一种实施方案中，所述方法是在水溶液中进行的。在另一种实施方案中，所述方法被同时用于糖化和发酵。在另一种实施方案中，所述寡糖优选是木质素纤维素、半纤维素、纤维素、果胶、或上述寡糖的任意组合。
在另一种实施方案中，所述方法使用一种核酸结构，该结构是或者源于选自由pLOI2306所构成的一组的质粒。
通过以下详细说明和权利要求书可以了解本发明的其他特征和优点。
附图简述
图1表示产乙醇重组宿主大肠杆菌KO11的发酵速度，使用用稀释过的酸预处理过的稻壳底物，并添加了两种不同的培养基。
图2表示产乙醇重组宿主菌株产酸克雷伯氏P2的同时糖化和发酵(SSF)速度，使用混合的办公室废纸。来自SSF的不溶性残余物在随后的发酵中被作为结合纤维素酶和底物的来源加以再利用。
图3表示一种低拷贝启动子探针载体质粒pLOI2171的结构，显示用于选择的卡那霉素抗性基因(kan)的方向，用于该质粒的附加型保持的温度敏感型pSC101复制子(Rep(ts))，以及编码葡聚糖酶的无启动子多糖酶基因celZ(EGZ)。
图4是表示在CMC指示平板上测定的转化细菌菌落的透明区的大小(x-轴)与所表达的葡聚糖酶量(y-轴)之间的高相关性的曲线图。
图5表示pLOI2183质粒上的起着取代启动子作用的运动发酵单胞菌DNA片段的部分核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。其完整序列的GenBank的保藏编号是AF109242(SEQ ID NO：2)。示出了两个转录起始位点(#)，-35和-10区，SD位点(加粗)，部分载体和celZ序列(小写)，和celZ起始密码子(atg用粗体表示)。
图6表示获得了不同质粒的大肠杆菌B细胞的电子显微照片，这些细胞以位于细胞外壁和内膜(im)之间的外周质包含体(pib)形式少量，如果有的话(pUC19；照片A)，中等水平(pLOI2164；照片B)，和高水平(pLOI2307；照片C)表达葡聚糖酶。线段表示0.1微米。
图7表示用于构建celZ整合载体pLOI2306的克隆方法的示意性详图，该载体是一种能够导入重组宿主的基因组中并使该宿主产生稳定的葡聚糖酶表达活性的遗传结构。
图8表示celZ整合载体pLOI2306的示意图(SEQ ID NO：12)，表示了来自运动发酵单胞菌的取代启动子、来自菊欧文氏菌的celZ基因，抗性标记(bla和tet)和产酸克雷伯氏菌靶序列的位置。
发明详述
为了清楚地了解本发明的整个范围，提供了以下定义。
I.定义
在本文中，术语“重组宿主”意在包括适合于遗产操作的细胞，例如能够整合异源多核苷酸序列的细胞，例如，能够转染的细胞。所述细胞可以是微生物或高等真核细胞，所述术语意在包括原始转染过的所述细胞的后代。在优选实施方案中，所述细胞是细菌细胞，例如，革兰氏阴性细菌细胞，并且该术语意在包括肠杆菌科的所有兼性厌氧革兰氏阴性细胞，如埃希氏菌属、志贺氏菌属、柠檬酸杆菌属、沙门氏菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、克吕沃尔氏菌属、沙雷氏菌属、西地西菌属、摩根氏菌属、哈夫尼菌属、爱德华氏菌属、普罗威登斯菌属、变形菌属和耶尔森氏菌属。特别优选的重组宿主是大肠杆菌或产酸克雷伯氏菌细胞。
术语“异源多核苷酸片段”意在包括编码一种或多种多肽或多肽的部分或片段的多核苷酸片段。异源多核苷酸片段可源于任何来源，例如，真核生物、原核生物、病毒、或合成的多核苷酸片段。
术语“多糖酶”或“纤维素酶”在本文中可以交互使用，并且意在包括能够催化任何交联的糖成分降解或解聚的多肽，例如，二糖、三糖、寡糖，包括复杂的碳水化合物，例如，木质素纤维素，它包括纤维素、半纤维素、和果胶。该术语意在包括诸如葡聚糖酶的纤维素酶，内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。更具体地讲，该术语意在包括，例如，纤维素水解酶、内切-1，4-β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂解酶、或上述纤维素酶的任意组合。
术语“取代启动子”意在包括可以对目标基因进行转录控制的多核苷酸片段，该基因在天然状态下是不受它的转录控制的。在一种优选实施方案中，取代启动子转录控制会控制所述目标基因的表达的增强。在一种优选实施方案中，取代启动子位于目标基因的5’末端。可以用取代启动子取代天然启动子，或者用于补充天然启动子。对于使用它的宿主细胞来说，取代启动子可以是内源的，或者它可以是导入该宿主细胞的异源多核苷酸序列，例如相对使用它的宿主细胞来说是外源的。
术语“寡糖源”、“寡糖”、“复杂的纤维素”、“复杂的碳水化合物”、和“多糖”基本上可以交互使用，并且意在包括含有一种以上糖分子的任何碳水化合物源。所述碳水化合物可以来自未任何加工过的植物材料或任何加工过的植物材料。其例子有木材、纸、纸浆、植物产生的纤维、或含有一种以上交联的碳水化合物组分，即一个糖残基的合成纤维。一种特定的寡糖源是木质素纤维素，它大约占大多数植物材料的干重量的90％，并且含有碳水化合物，例如，纤维素、半纤维素、果胶、和芳族聚合物，例如，木质素。纤维素占木质素纤维素干重量的30％-50％，并且是纤维二糖的同聚物(葡萄糖的二聚体)。类似地，半纤维素占木质素纤维素干重量的20％-50％，并且是含有戊糖(木糖、阿拉伯糖)和己糖(葡萄糖、甘露糖、半乳糖)的混合物的复杂的聚合物，所述糖含有酰基和葡糖醛酸基侧链。果胶占木质素纤维素干重量的1％-20％，并且是葡糖醛酸的甲基化的同聚物。上述碳水化合物聚合物的任一种或其组合，都是可以按照本发明的产品和方法进行发酵以便解聚，并随后生物转化成乙醇的潜在的糖类资源的。
术语“基因”意在包括核酸分子，例如多核苷酸，它包括一个编码一种多肽的开放读框，并且还可以包括非编码的调控序列和内含子。另外，术语基因意在包括作图在一个功能性基因座上的一个或多个基因，例如，欧文氏菌属和克雷伯氏菌属的out或pul基因，它们分别编码一种以上的基因产物，例如，分泌性多肽。
术语“目标基因”意在包括用于特定目的的特殊基因。该基因可以是宿主细胞内源的，或者是重组导入该宿主细胞的。在一种优选实施方案中，目标基因至少与将碳水化合物生物转化成乙醇的一个步骤相关。因此，该术语意在包括编码一种多肽的任何基因，如醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、分泌蛋白、或多糖酶，例如，葡聚糖酶，内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶、纤维素生物水解酶、β-葡糖苷酶、内切-1，4-β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂解、或其组合。
术语“分解来自一种生物的基因组多核苷酸”意在包括用机械方法，例如，剪接、超声处理、研磨或酶促方法，例如，核酸酶将属于一种生物的基因组多核苷酸分解成一个或多个片段。优选使用限制性酶，以便将基因组片段克隆到测试载体上，用于随后作为后选启动子因子鉴定。基因组多核苷酸可以来自任何来源，例如，真核生物、原核生物、病毒、或合成的多核苷酸片段。
术语“同时糖化和发酵”或“SSF”意在包括用一种或多种重组宿主同时降解或解聚一种复杂的糖，并通过发酵将糖残基生物转化乙醇。
术语“转录控制”意在包括在转录水平上调控基因表达的能力。在一种优选实施方案中，转录以及基因表达是通过取代靠近目标基因的编码区的5’末端或增加一个取代启动子来进行调控的，并导致基因表达的改变。
术语“表达”意在包括基因至少在RNA生产水平上的表达。
术语“表达产物”意在包括表达基因的产物，例如多肽。
术语“增强了的表达”意在包括至少在增加RNA产量的水平上的基因表达的改变，并且优选在多肽表达水平上的改变。
术语“增加了的产量”意在包括表达的多肽的量的增加，这种增加是在多肽的酶促活性水平上的或者是其组合。
术语“活性”或“酶促活性”可以交互使用，并且意在包括正常情况下属于在有利条件下产生的特定多肽的任何功能性活性。例如，一种多糖酶的活性可以是这种多肽酶促解聚一种复杂糖的能力。通常，特定多肽的活性包括与所产生的多肽相关的总的酶促活性。由宿主细胞所产生的并且具有酶促活性的所述多肽可以存在于所述细胞的、相关细胞的胞内间隙中，分泌到胞外环境中，或者是它的组合。在本文中披露了用于测定与分泌活性相比较的总活性的技术，并且该技术为本领域所公知。
术语“分泌的”意在包括一种多肽，例如异源多肽，优选多糖酶的分泌的增加。通常，所述多肽以超过正常存在的分泌量的较高水平分泌。更优选的是，术语“分泌的”是指一种特定多肽的分泌的增加，与天然存在的分泌水平相比，这种增加至少为10％，更优选至少为100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更高。
术语“分泌性多肽”意在包括任何多肽，它可以是单独的或者与其他多肽组合。它有利于另一种多肽从细胞的胞内空间转运到胞外环境中。在一种实施方案中，所述分泌性多肽包括足于赋予革兰氏阴性宿主细胞分泌活性的所有必需的分泌多肽。通常，分泌性蛋白是由一个片段或基因座编码的，所述片段或基因座可以用遗传工程方法从一种宿主细胞中分离，并转移到另一种宿主细胞中。在一种优选实施方案中，所述分泌性多肽源于具有分泌活性的任何细菌细胞。在一种更优选的实施方案中，所述分泌性多肽源于具有II型分泌活性的宿主细胞。在另一种更优选的实施方案中，所述宿主细胞选自肠杆菌科。在一种最优选的实施方案中，所述分泌性多肽是分别源于欧文氏菌属或克雷伯氏菌属的out或pul基因的一种或多种基因产物。另外，技术人员可以理解的是，源于相关宿主的，与本文所披露的out或pul基因具有足够的同源性的任何分泌性蛋白都可以使用(Pugsley等，1993，微生物学综述57：50-108；Lindeberg等，1996分子微生物学20：175-1750；Lindeberg等，1992细菌学杂志174“7385-7397；He等，1991美国科学院院报88：1079-1083)。
术语“源于”意在包括从特定的来源中分离(完整的或部分的)多核苷酸片段。例如，该术语意在包括直接克隆、PCR扩增、或人工合成、或基于与特定多核苷酸来源相关的序列。
术语“产乙醇的”意在包括一种微生物用碳水化合物作为主要的发酵产物产生乙醇的能力。该术语意在包括天然存在的产乙醇生物，具有天然出现的或诱导的突变的产乙醇生物，以及进行过遗传修饰的产乙醇生物。
术语“革兰氏阴性细菌”意在包括本领域所供认的该术语的定义。通常，革兰氏阴性细菌包括，例如肠杆菌科，其中包括埃希氏菌和克雷伯氏菌。
术语“足够高的同源性”意在包括第一种氨基酸或核苷酸序列含有足够的或最低数量的与第二种氨基酸或核苷酸序列相同或等同的氨基酸残基或核苷酸，例如，具有相似侧链的氨基酸残基，以便所述第一和第二种氨基酸或核苷酸序列具有相同的结构域和/或共同的功能性活性。例如，拥有共同的结构域，在该结构域的氨基酸序列上具有至少大约40％的同源性，优选50％的同源性，更优选60％、70％、80％或90％的同源性，并且含有至少一个、优选两个，更优选三个、更优选四个、五个或六个结构域的氨基酸或核苷酸序列在本文中被定义为足够高的同源性。另外，拥有至少40％、优选50％、更优选6)％、70％、80％、或90％同源性，并且拥有共同的功能活性的氨基酸或核苷酸序列在本文中被定义为具有足够高的同源性。在一种实施方案中，两个多核苷酸片段，例如启动子，如果由于在核苷酸序列上大体上相同而具有大体上相同的调控作用的话，它们就具有“足够高的同源”。通常，“足够高的同源性”序列至少在已知与所需调控相关的片段上至少50％、更优选至少60％、70％、80％、或90％相同。更优选的是，有不超过5个碱基的不同。最优选的是，没有5个以上连续的碱基不同。
为了测定两个多核苷酸序列或两个氨基酸序列之间的百分相同性，出于最佳比较的目的对所述序列进行排比(例如，可以向第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入缺口，以便进行最佳排比，并可以出于比较目的忽略非同源序列)。在一种优选实施方案中，用于比较目的的排比的参考序列的长度至少为该参考序列长度的至少30％，优选至少40％、更优选至少60％、更优选至少70％、80％、或90％。然后比较相应的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一种序列上的一个位置被第二种序列上的相应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸所占据时，所述分子在该位置上是相同的(本文所使用的氨基酸或核酸“相同性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两种序列之间的百分相同性是这两种序列所拥有的相同位点数量的函数，还要受缺口数量和每一个缺口长度的影响，为了对两个序列进行最佳排比需要引入这些缺口。
序列的比较以及两个序列之间百分相同性的测定可以用数学程序完成。在一种优选实施方案中，两个氨基酸序列之间的百分相同性是用Needleman和Wunsch(分子生物学杂志48：444-453，1970)程序测定的，该程序业已整合在GCG软件包的GAP程序之中(可以从http://www.gcc.com网址上获得)，使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一种优选实施方案中，两个核苷酸序列之间的百分相同性是用GCG软件中的GAP程序测定的(可以从 http://www.gcc.com网址上获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵，缺口权重为40、50、60、70或80，长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一种优选实施方案中，两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分相同性是用E.Meyers和W.Miller的程序测定的(CABIOS，4：11-17，1989)，该程序业已整合在ALIGN程序中(2.0版)，使用PAM120权重残基表，缺口长度补偿为12，缺口补偿为4。
本发明的多核苷酸和氨基酸序列还可以用作“查询序列”，以便对公共数据库进行检索，例如，鉴定其他家族成员或相关序列，例如，启动子序列。所述检索可以用Altschul等(1990，分子生物学杂志215：303-10)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序进行(得分＝100，字符长度＝12)，以便获得与本发明多核苷酸分子的核苷酸序列相同性。BLAST蛋白检索可以用XBLAST程序进行(得分＝50，字符长度＝3，以便获得与本发明多肽分子的氨基酸序列同源性。为了出于比较目的而进行有缺口的排比，可以使用披露于Altschul等的文献(1997，核酸研究25(17)：3389-3402)中的缺口BLAST程序。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，可以使用相应程序的预设参数(例如X BLAST和N BLAST)，参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov.。
II.重组宿主
本发明涉及适用于生产乙醇的重组宿主细胞。在一种实施方案中，所述细胞包括一个受一个取代启动子转录控制的编码一种多肽的异源多核苷酸片段。该异源多核苷酸和取代启动子可以是基于质粒的或整合到该生物的基因组中(如在实施例中所披露的)。在一种优选实施方案中，所述宿主细胞被用作用于将复杂的糖类生物转化成乙醇或该过程的一个步骤的所需多肽的来源。
在一种优选实施方案中，所述异源多核苷酸片段编码一种多糖酶多肽，这种多肽以高于该宿主中天然存在的水平表达。所述多糖酶可以是β-葡糖苷酶、葡聚糖酶，内切葡聚糖却酶或外切葡聚糖酶，纤维素生物水解酶，内切-1，4-β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂解酶、或其组合。在一种实施方案中，所述多糖酶源于菊欧文氏菌，并且是由celZ基因所编码的葡聚糖酶(EGZ)多肽。不过，可以使用的源于菊欧文氏菌的其他多糖酶包括，例如，由celY(Guiseppi等，1991，基因106：109-114)或bgxA(Vroeman等，1995，分子基因遗传学246：465-477)所编码的葡糖水解酶。CelY基因产物(EGY)是一种内切葡聚糖酶。BgxA基因编码β-葡糖苷酶和β-木糖苷酶活性(Vroeman等，1995，分子基因遗传学246：465-477)。优选的是，可以观察到多糖酶活性增加至少10％，更优选20％、30％、40％或50％。最优选的是，可以实现多糖酶活性增加若干倍，例如200％、300％、400％、500％、600％、700％或800％。
可将上述任一种或多种基因导入本发明的宿主细胞并表达，对复杂的糖类底物进行解聚的多糖酶。在实施例中提供了将上述基因之一导入一种重组宿主并表达的技术。
在本发明的另一种实施方案中，已对所述宿主细胞进行工程操作，以便表达一种分泌蛋白，促进需要的多肽从细胞中外排。在一种实施方案中，所述分泌蛋白原因革兰氏阴性细菌细胞，例如，源于肠杆菌科的细胞。在另一种实施方案中，所述分泌蛋白源于欧文氏菌属，并且是由out基因编码的。在另一种实施方案中，所述分泌蛋白是源于克雷伯氏菌属的pul基因。如果宿主细胞是诸如具有细胞壁的革兰氏阴性细菌的肠杆菌的话，导入一种或多种上述分泌蛋白是尤其必要的。本发明的代表性的革兰氏阴性宿主细胞来自肠杆菌科，并且包括，例如，埃希氏菌和克雷伯氏菌。在一种实施方案中，将一种或多种分泌蛋白导入宿主，会导致诸如多糖酶的特定蛋白的分泌相对天然存在的分泌水平的增强。与天然存在的分泌水平相比，分泌的增加优选至少为10％，更优选100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更高。在一种优选实施方案中，添加分泌基因可以使多糖酶多肽以较高的水平产生。在一种优选实施方案中，增加分泌基因，可以使生产的多糖酶多肽具有更高的酶促活性。在一种最优选的实施方案中，所述多糖酶是以较高的产量和较高的酶促活性产生的。所观察到的多糖酶活性的提高优选为至少10％，更优选20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或100％。最优选的是，与没有分泌基因的细胞(例如，缺乏分泌基因或者分泌基因的表达水平不足的细胞)相比，可以获得多糖酶活性的若干倍的增加，例如，200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、或1000％。在下面的实施例中更详细地披露了导入所述基因和测定诸如多糖酶的所需多肽的产量增加的基因和方法。其他等同的方法为本领域技术人员所公知。
在一种优选实施方案中，同样是产乙醇的重组宿主。在一种实施方案中，所述重组宿主是革兰氏阴性细菌。在另一种实施方案中，所述重组宿主来自肠杆菌科，例如，被收作本文参考的US5821093的产乙醇宿主是合适的宿主，并且特别包括大肠杆菌菌株KO4(ATCC55123)、KO11((ATCC55124)、KO12((ATCC55125)，和产酸克雷伯氏菌菌株M5A1。另外，可以通过导入诸如来自向运动发酵单胞菌那样的高效乙醇生产菌的产乙醇基因可以将本发明的非产乙醇宿主转化成产乙醇宿主(如上述菌株)。使用标准技术的这种类型的遗传工程，能产生能够将糖有效发酵成乙醇的重组宿主。另外，可以按照在公开的PCT国际申请WO98/45425中所披露的方法使用LY01耐受乙醇的菌株(ATCC＿＿＿)，并且该公开的申请被收作本文参考(例如，还可以参见Yomano等，1998，工业微生物学和生物学杂志20：132-138)。
在另一种优选实施方案中，本发明采用了非产乙醇的重组宿主，例如，大肠杆菌菌株B、大肠杆菌菌株DH5α、或产酸克雷伯氏菌菌株M5A1。可以用本文所披露的技术用上述菌株表达所需要的多肽，例如多糖酶。另外，所述重组宿主可以与能表达诸如不同的多糖酶的另一种所需多肽的另一种重组宿主组合使用。另外，所述非产乙醇的宿主细胞可以与产乙醇的宿主细胞组合使用。例如，利用非产乙醇的宿主实施对复杂糖类的解聚作用，然后用产乙醇的宿主对解聚的糖进行发酵。因此，可以理解的是，上述反应可以用非产乙醇的和产乙醇的重组宿主的均匀的或混合的培养物顺序进行或同时进行。
在一种优选实施方案中，在一个质粒上提供将糖类底物发酵成乙醇所必需的一个或多个基因，或者将其整合到宿主染色体上。用诸如披露于被收作本文参考的US5821093中的PET操纵子的人工操纵子将把糖底物发酵成乙醇所必需的基因，例如，丙酮酸脱羧酶(例如，ptc)和/或醇脱氢酶(例如，adh)导入本发明的宿主。实际上，可以理解的是，本发明与本领域已知技术组合提供了用于将多个基因导入合适宿主的技术和载体(例如，参见当代分子生物学方法，Ausubel等著，JohnWiley&Sons(1992)，Sambrook，J.等，分子克隆，试验室手册，第2版，冷泉港试验室，冷泉港试验室出版社，冷泉港，NY，1989，和Bergey’s决定细菌学手册，Kreig等，Williams和Wilkins，1984，被收作本文参考)。因此，采用本发明的方法，单一的遗传结构可以编码实施同时糖化和发酵(SSF)所必需的所有基因产物(例如，葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、分泌蛋白、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶)。另外，还可以理解的是，可以用本领域已知方法对所述宿主作进一步的操作，使任何内源基因(例如，重组酶基因)具有突变，从而影响所导入基因的稳定性、表达和功能。另外，还可以理解的是，本发明意在包括所有调控因子、基因和基因产物，即与本发明所披露的多肽具有足够高同源性的多肽。
用于筛选具有导入的基因的菌株的方法是常规方法，并且可以通过肉眼筛选来完成。肉眼筛选可以鉴定表达醇脱氢酶(ADH)或葡聚糖酶(EGZ)基因产物的细胞。ADH基因产物产生的乙醛能与p-苯胺红的无色磺酸衍生物起反应产生深红色产物。因此，ADH阳性克隆作为红色菌落可以方便地筛选和鉴定。筛选诸如多糖酶活性的EGZ的方法也会产生在下面和实施例中所披露的明确可见的表型。
表达诸如PET操纵子的重组细菌通常在液体培养基中能生长到比未修饰过的亲本生物更高的细胞密度，因为它能产生中性而不是酸性发酵产物(Ingram等，1988，应用环境微生物学54：397-404)。在平板上，产乙醇的克隆通常以大的、突出的菌落形式出现，看上去更像是酵母。这些形状在构建新的菌株方面一直是非常有用的，并且可以提供新结构的用途的初步信息。通过在乙醛指示平板上测试红色斑点的形成速度，可以快速评估乙醇生产的潜力(Conway等，1987，细菌学杂志，169：2591-2597)。通常，被证实为能将糖有效转化成乙醇的菌株可以通过在转移的数分钟时间内在乙醛指示平板上产生红色斑点来确认。
在本发明的一种最优选实施方案中，单一的宿主细胞是产乙醇的，就是说它具有所有必需的基因，这些基因是天然存在的或人工导入的或强化过的(例如，使用源于不同物种或菌株的取代启动子和/或基因)，以便该宿主细胞具有产生并分泌一种多糖酶、降解复杂的糖，并将所降解的糖发酵成乙醇的能力。因此，所述宿主适用于同时糖化和发酵。
另外，本发明考虑到了天然大肠杆菌发酵途径能产生一种酸性和中性产物的混合物(按含量顺序为)：乳酸、氢+二氧化碳(来自甲酸)、乙酸、乙醇、和琥珀酸。不过，运动发酵单胞菌PDC(丙酮酸脱羧酶)具有比任何竞争性大肠杆菌酶都低的对丙酮酸的Km。通过表达PDC的高的活性，碳流被从乳酸和乙酰CoA有效改向到乙醛和乙醇。通过缺失富马酸还原酶基因(FRD)可以消除少量的磷酸烯醇丙酮酸(Ingram等，1991，US5000000；Ohta等，1991应用环境微生物学57：893-900)。可以产生其他突变(例如，在pfl或idh基因上的突变)以便完全消除其他竞争途径(Ingram等，1991，US5000000)。用于消除酶(例如，重组酶，如recA)的有可能损害所导入的基因(以质粒为基础或整合到基因组中)的其他突变也可以导入、选择特定背景或从特定背景中选择。
另外，本领域技术人员很容易理解的是，将编码一种蛋白或一个完整代谢途径的基因转入单一的可操作的结构中是非常有用的。例如，就这一方面的构想而言，可将本发明应用于多种场合，其中，将来自不同遗传学座位上的基因放置到一个染色体上。它可以是受单一启动子控制的多顺反子框，或者可以使用分离的启动子。
例如，产乙醇的并且适用于按照本发明的方法作进一步改进的代表性大肠杆菌菌株包括KO4、KO11和KO12菌株，以及LY01菌株，它是大肠杆菌菌株KO11的耐受乙醇的突变体。理想的是，上述菌株可源于大肠杆菌菌株ATCC11303，它是能耐受环境胁迫的，并可以工程改造成产乙醇的并且分泌多糖酶。另外，最新的PCR研究已经证实，ATCC11303菌株缺乏已知与大肠杆菌的致病性相关的所有基因(Kuhnert等，1997，应用环境微生物学63：703-709)。
可以用本发明方法改良的另一种优选的产乙醇宿主是大肠杆菌KO11菌株，它能够对来自许多不同木质素纤维素材料和其他底物的半纤维素水解产物进行发酵(Asghari等，(1996)J.Ind.Microbiol.16：42-47；Barbosa等，(1992)Current Microbiol.28：279-282；Beall等，(1991)生物技术生物工程38：296-303；Beall等，(1992)Biotechnol.Lett.14：857-862；Hahn-Hagerdal等，(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.41：62-72；Moniruzzaman等，(1996)Biotechnol.Lett.18：955-990；Moniruzzaman等，(1998)Biotechnol.Lett.20：943-947；Grohmann等，(1994)Biotechnol.Lett.16：281-286；Guimaraes等，(1992)生物技术生物工程40：41-45；Guimaraes等，(1992)Biotechnol.Lett.14：415-420；Moniruzzaman等，(1997)J.Bacteriol.179：1880-1886)。在图1中，示出了该菌株的生物转化动力学。具体地讲，该菌株能够将来自稻壳的半纤维素水解产物(它含有58.5克/升戊糖和37克/升己糖)迅速发酵成乙醇(Moniruzzaman等，1998，生物技术通讯20：943-947)。已经注意到，该菌株能在48-72小时内将半纤维素水解产物完全发酵，并且在理想条件下可以在24小时内完成。
本发明的另一种优选的宿主细胞是克雷伯氏菌。具体地讲，优选产酸克雷伯氏菌是因为这种肠杆菌像大肠杆菌一样具有代谢单糖的天然能力，这种单糖是更复杂的糖类的成分。另外，产酸克雷伯氏菌具有能够转运并代谢来自纤维素酶促水解的可溶性中间产物纤维二糖和纤维三糖的额外优点(Lai等，(1996)应用环境微生物学63：355-363；Moniruzzaman等，(1997)应用环境微生物学63：4633-4637；Wood等，(1992)应用环境微生物学58：2103-2110)。本发明提供了遗传工程的产酸克雷伯氏菌的衍生物，例如，具有在PET操纵子中编码的运动发酵单胞菌pdc和adhB基因的菌株M5A1(如在本文中以及在以下文献中所披露的：U.S.P.N.5,821,093；Wood等，(1992)应用环境微生物学58：2103-2110)。
因此，所得到的生物菌株P2能从来自包括棉籽糖、水苏糖、蔗糖、纤维二糖、纤维三糖、木二糖、木三糖、麦芽糖等在内的多种糖的单体糖有效产生乙醇(Burchhardt等，(1992)应用环境微生物学58：1128-1133；Moniruzzaman等，(1997)应用环境微生物学63：4633-4637；Moniruzzaman等，(1997)J.Bacteriol.179：1880-1886；Wood等，(1992)应用环境微生物学58：2103-2110)。该菌株可以按照本发明的方法作进一步的修饰，以便表达并分泌多糖酶。因此，该菌株是由于在SSF工艺中对一种复杂的糖类进行生物转化(Doran等，(1993)生物技术进展9：533-538；Doran等，(1994)生物技术生物工程44：240-247；Wood等，(1992)应用环境微生物学58：2103-2110)。具体地讲，使用这种产乙醇P2菌株，消除了对添加补充纤维二糖酶的必要性，而这种酶是商业真菌纤维素酶的最不稳定的成分之一(Grohmann，1994生物技术通讯16：281-286)。
筛选适用于异源基因表达的启动子
尽管在一种实施方案中，本发明的取代启动子被用于改善诸如多糖酶的异源基因的表达，但应当理解的是，本发明还可以筛选适用于增强任何所需基因产物表达的取代启动子。一般，所述筛选方法利用披露于例1中并且示于图3中的克隆载体，该方法可以将候选启动子片段方便地连接并可操作地连接于报导基因上。在一种实施方案中，编码葡聚糖酶的celZ基因被用作方便地报导基因，因为当具有该质粒的细胞在特殊培养基(CMC平板)上生长时，这种酶(葡聚糖酶)的表达会导致强的颜色改变。因此，可以通过“鸟枪法”克隆并可操作地连接在所述载体上的诸如特定启动子序列的候选启动子或随机序列可以导入宿主细胞，并通过肉眼筛选所得到的菌落，并根据在CMC平板上表型葡聚糖酶介导的颜色变化证实基因表达的增强。然后对具有所需表型的菌落进行加工，以便得到转移DNA，并用合适的引物对启动子进行测序(更多的细节参见例1)。
在CMC平板上葡聚糖酶介导的颜色改变和酶的表达水平之间的高的相关性是候选启动子强度的良好的指标(图4)。因此，本发明的方法提供了一种对候选取代启动子的强度进行评估的快速目测方法。因此，根据所需要的特定基因产物的理想的表达水平，可以用该分析方法选择特定的取代启动子。例如，如果只是需要最高的表达水平的话，就可以选择能产生最大颜色变化的候选启动子。如果需要较低水平表达的话，例如，由于希望表达的产物在高含量下是有毒性的或者必须以与另一种产物相同的水平表达，就可以按所述方法鉴定、筛选并使用一种较弱的取代启动子。
III.使用方法
复杂糖的降解和解聚
在一种实施方案中，本发明的宿主细胞被用于将诸如木质素纤维素或寡糖的复杂糖类降解或解聚成较小的糖类成分。为了达到这一目的，本发明的宿主细胞优选能表达一种或多种多糖酶，例如，葡聚糖酶，并且这些多糖酶可以从所述生产生物中天然释放出来。或者，通过机械破坏所述细胞从所述生产细胞中释放所述多糖酶。用于机械(例如，剪切、超声波)、酶促(例如溶菌酶)或化学破坏细胞的各种方法为本领域所公知，并且上述方法中的任一种都可以使用。一旦所需要的多肽从细胞内部空间中释放出来，就可将其用于把复杂的糖底物降解成较小的糖成分，以便随后生物转化成乙醇。可以用本领域已知的标准生物化学技术纯化释放出的纤维素酶。或者，没有必要从其他细胞成分中纯化或分离释放出的多糖，并将其直接利用到所述糖底物上。
在另一种实施方案中，采用一种能同时表达多糖酶和分泌蛋白的宿主细胞，以便所述多糖酶被分泌到生长培养基中。这样消除了上述必须从宿主细胞中释放多糖酶的步骤。当采用这种类型的宿主时，该宿主可以直接应用于含有复杂糖类的水溶液中。
在另一种实施方案中，将本发明的宿主细胞设计成表达一种以上的多糖酶或者与表达不同多糖酶的另一种宿主混合。例如，一种宿主细胞可以表达一种异源β-葡糖苷酶，而另一种宿主细胞可以表达一种内切葡聚糖酶，而再一种宿主细胞可以表达一种外切葡聚糖酶，并且可以将这些细胞进行组合，以便形成具有多种多糖酶活性的异源培养物。或者，在一种优选实施方案中，将一种宿主菌株工程改造成能产生上述所有多糖酶。在任一种情况下，生产出具有所需多糖酶的高的表达的重组宿主的培养物，以便用于糖底物。如果需要，该培养物可以与另一种纤维素酶混合，例如，外源纤维素酶，如真菌纤维素酶。然后用该混合物降解一种复杂的底物。或者，在添加所述复杂糖底物之前，用标准生物化学技术从细胞和/或培养基中纯化所述多糖酶，并作为纯酶来源使用对糖底物进行解聚。
最后，本领域技术人员可以理解的是，本发明的产乙醇的细菌菌株是生产重组蛋白的优良宿主，因为在厌氧条件下(例如，在缺少氧气的条件下)，蛋白进行异常折叠的机会很少(例如，由于不适当的二硫键的形成)。因此，本发明的宿主和培养条件很有可能导致更多的回收具有生物学活性的产物。
对复杂的糖类进行发酵
在本发明的一种优选实施方案中，具有上述特征的宿主细胞还是产乙醇的。因此，所述宿主细胞可用于将复杂的糖类降解或解聚成单糖。然后，所述细胞通过发酵将较简单的糖分解成乙醇。这种同时进行的将复杂的糖类解聚成较小的糖残基然后进行发酵的过程被称为同时糖化和发酵。
通常，对发酵条件进行选择，以便提供能促进所述生产宿主细胞菌株的最佳生长动力学的最佳pH和温度，并提供由该培养物所产生的酶的催化条件(Doran等，1993，生产技术进展9：533-538)。例如，对于诸如P2菌株的克雷伯氏菌来说，所确定的最佳条件为33-37℃和pH5.0-5.4。在上述条件下，即使外源添加的真菌内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶也相当稳定，并且能持续长时间的起作用，其他条件在实施例中讨论。另外，技术人员可以理解的是，只需要常规实验用本领域公知的技术来优化本发明的特定发酵反应。
目前，诸如木质素纤维素的复杂糖类的转化是一个非常复杂的多步骤工艺。例如，首先必须通过酸水解将木质素纤维素降解或解聚。接下来的步骤是将液体与固体分离，然后对该产物进行洗涤和脱毒，以便得到可以进一步解聚(使用添加纤维素酶)的纤维素和半纤维素，最后，通过合适的产乙醇宿主细胞发酵。相反，玉米的发酵要简单的多，其中，可以用淀粉酶降解玉米淀粉以便通过产乙醇宿主直接进行生物转化，基本上是一种一个步骤的工艺。因此，技术人员可以理解的是，本发明的重组宿主和方法可以采用类似的较简单和更有效的工艺来对木质素纤维素进行发酵。例如，本发明的方法意在包括避免了同时进行酸水解的方法。而且，本发明的宿主具有以下优点，1)戊糖和己糖共发酵的效率；2)对毒素的抗性；3)生产用于对复杂糖类进行解聚的酶；和4)对环境的耐受性。因此，使用本发明的改进的生物催化剂可以简化对木质素纤维素解聚的复杂性。实际上，在本发明的一种优选实施方案中，所述反应可以在一个反应容器中完成，并且是在不进行酸水解的情况下进行，例如，SSF工艺。
可以生物转化成乙醇的潜在底物
本发明的一个优点是利用到目前为止还无法使用的糖类资源的能力。
多种复杂的糖类底物可以用作原始资源用本发明的宿主细胞和方法进行解聚和发酵。优选的是，可以在SSF工艺中使用可再生的资源。混合的办公室废纸是一种优选的底物(Brooks等，1995生物技术进展11：619-625；Ingram等，1995US5424202)，并且比酸预处理过的甘蔗渣(Doran等，1994，生物技术生物工程44：240-247)或高度纯化的结晶纤维素(Doran等，1993，生物技术进展9：533-538)更容易消化。由于葡聚糖酶(包括内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶)含有纤维素结合域，通过离心回收未消化的纤维素残基的方法可以方便地回收这种酶以便随后发酵使用(Brooks等，1995生物技术进展11：619-625)。通过添加这种具有结合酶的残余物作为原材料，乙醇产量(每单位底物)增加到超过理论产量的80％，同时使真菌酶的使用量降低60％(图2)。这种方法很适合纯化的纤维素，尽管回收步骤的次数可能受具有较高木质素含量的底物的限制。属于本发明范畴的其他底物来源包括任何类型的加工过的或未加工过的植物材料，例如碎麻布、外皮、玉米芯、茎、叶、纤维、纸浆、大麻、锯末、报纸等。
将通过以下实施例对本发明作进一步说明，这些实施例不应被理解成是对本发明的限定。
                      实施例1
制备适用于将寡糖发酵成乙醇的重组埃希氏菌属宿主的方法
在该实施例中，披露了开发并利用适用于将寡糖发酵成乙醇的埃希氏菌属宿主的方法。具体地讲，鉴定了一种可用于增强多糖酶(例如，葡聚糖酶)表达的强启动子。另外，利用源于菊欧文氏菌的基因促进多糖酶的分泌，从而消除破碎细胞以便释放所需要的多糖酶活性的必要性。在该实施例中，使用以下材料和方法，除非另有说明。
材料和方法
生物和培养条件
用于本实施例中的细菌菌株和质粒列在下面的表1中。
为了构建质粒，使用宿主细胞大肠杆菌DH5α。所使用的编码多糖酶(例如，葡聚糖酶)的具体基因是源于菊欧文氏菌P80021的celZ基因(Beall，1995，博士论文，佛罗里达大学；Wood等，1997，生物技术生物工程55：547-555)。用于改善分泌的具体基因是源于菊欧文氏菌的EC16的out基因(He等，1991，美国科学院院报88：1079-1083)。
通常，宿主细胞培养物生长在LB培养液(胰化10克/升Difco蛋白胨，5克/升Difco酵母提取物，5克/升氯化钠)或Luria琼脂(补充了15克/升琼脂的LB)上生长。为了筛选具有葡聚糖酶celZ活性(EGZ)的宿主细胞，使用CMC平板(含有3克/升羧甲基纤维素Luria琼脂平板(Wood等，1988，酶学方法160：87-112)。如果需要的话，将抗生素氨苄青霉素(50毫克/升、壮观霉素100克/升、卡那霉素50克/升)添加到所述培养基中，以便选择含有抗性标记的重组或整合的宿主细胞。在30℃下生长含有具有温度调节pSC101复制子(Posfai等，1997，细菌学杂志179：4426-4428)的结构，并且除非另有说明，具有基于pUC质粒的结构都是在37℃下生长。
表1.所使用的菌株和质粒
  菌株/质粒   描述   来源/参考文献
  菌株
  运动发酵单胞菌CP4   原养型   Osman等，(1985)J.Bact.164：173-180
  大肠杆菌菌株DH5α   lacZ M15 recA   Bethesda ResearchLaboratory
  大肠杆菌菌株B   原养型   ATCC 11303
  大肠杆菌菌株HB 101   recA lacY recA   ATCC 37159
  质粒
  pUC19   bla克隆载体   新英格兰生物实验室
  pST76-K   kan低拷贝数温度敏.
  pRK2013   kan运动辅助质粒(mob+)   ATCC
  pCPP2006   携带源于菊欧文氏菌EC16的完整基因的Spr，ca.40kbp质粒   He等，(1991)P.N.A.S.88：1079-1083
  pLOI1620   bla celZ   Beall等，(1995)Ph.D.Dissertation，U.of Florida
  pLOI2164   去掉了BamHI位点的(Klenow)pLOI1620   见正文
  pLOI2170   源于pLOI2164的NdeI-HindIII片段(无启动子celZ)克隆到pUC19上   见正文
  pLOI2171   源于pLOI2170的BamHI-SphI片段(无启动子celZ)克隆到pST76-K上   见正文
  pLOI2173   源于pLOI2164的EcoRI-SphI片段(celZ有天然启动子)克隆到pST76-   见正文
  K上
  pLOI2174   EcoRI-BamHI片段(gap启动子)克隆到pLOI2171上   见正文
  pLOI2175   EcoRI-BamHI片段(eno启动子)克隆到pLOI2171上   见正文
  pLOI2177   随机的Sau3A1运动发酵单胞菌DNA片段克隆到pLOI2171上   见正文
  pLOI2178   随机的Sau3A1运动发酵单胞菌DNA片段克隆到pLOI2171上   见正文
  pLOI2179   随机的Sau3A1运动发酵单胞菌DNA片段克隆到pLOI2171上   见正文
  pLOI2180   随机的Sau3A1运动发酵单胞菌DNA片段克隆到pLOI2171上   见正文
  pLOI2181   随机的Sau3A1运动发酵单胞菌DNA片段克隆到pLOI2171上   见正文
  pLOI2182   随机的Sau3A1运动发酵单胞菌DNA片段克隆到pLOI2171上   见正文
  pLOI2183   随机的Sau3A1运动发酵单胞菌DNA片段克隆到pLOI2171上   见正文
  pLOI2184   随机的Sau3A1运动发酵单胞菌DNA片段克隆到pLOI2171上   见正文
  pLOI2196   融合到pUC19的PstI位点的pLOI2177   见正文
  pLOI2197   融合到pUC19的PstI位点的pLOI2180   见正文
  pLOI2198   融合到pUC19的PstI位点的pLOI2182   见正文
  pLOI2199   融合到pUC19的PstI位点的pLOI2183   见正文
  pLO12307   源于pLOI2183的EcoRI-SphI片段克隆到pUC19上   见正文
遗传学方法
所有质粒的构建都使用标准技术(Ausubel等，1987，当代分子生物学方法，John Wiley&Sons公司；Sambrook等，1989，分子克隆：试验室手册，第2版，C.S.H.L，冷泉港，纽约)。为了进行小规模质粒分离，实施TELT方法。为了进行大规模质粒分离，使用PromegaWizard试剂盒。为了从凝胶中分离DNA片段，采用购自Qiagen的Qiaquick凝胶提取试剂盒。为了从大肠杆菌和运动发酵单胞菌中分离染色体DNA，使用Cutting和Yomano的方法(Cutting等，1990，遗传学分析，61-74页，参见芽孢杆菌的分子生物学方法，JohnWiley&Sohs公司；Yomano等，1993，细菌学杂志175：3926-3933)。
为了分离本文所披露的两个糖酵解基因启动子(例如，gap和eno)，将从大肠杆菌DH5α中纯化的染色体DNA用作PCR(聚合酶链式反应)的模板，用以下引物对扩增所述核酸：gap启动子，5’-CGAATTCCTGCCGAAGTTTATTAGCCA-3′(SEQ ID NO：3)和5’-AAGGATCCTTCCACCAGCTATTTGTTAGTGA-3’(SEQ  ID NO：4)；eno启动子，5’-AGAATTCTGCCAGTTGGTTGACGATAG-3′(SEQ IDNO：5)和5’-CAGGATCCCCTCAAGTCACTAGTTAAACTG-3′(SEQID NO：6)。。通过pRK2013移动将源于菊欧文氏(pCP2006)的编码分泌蛋白的out基因缀合到大肠杆菌中(Figurski等，1979美国科学院院报76：1648-1652；Murata等，1990，细菌学杂志172：2970-2978)。
为了测定各种目标DNA的序列，在LI-COR Mode14000-L DNA测序仪上用荧光引物实施双脱氧测序方法。用T7引物(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID NO：7))沿一个方向对基于pST76-K的质粒进行测序。用正向引物(5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’(SEQ ID NO：8))或反向引物(5’-TAACAATTTCACACAGGA-3’(SEQ ID NO：9))沿两个方向对基于pUC18和pUC19的质粒进行测序。所述测序方法的延伸反应是用Perkin Elmer GeneAmp PCR 9600和SequiTherm Long-ReadSequencing Kit-LC进行的。所得到的序列随后用威斯康逊遗传学计算机组(GCG)的软件包进行分析(Devereux等，1984，核酸研究12：387-395)。
为了确定上述启动子中转录启动的开始，用标准技术进行引物延伸分析。具体地讲，通过用存在于celZ基因RNA上的相应部位上的引物进行转录起始位点作图鉴定启动子区，所述RNA是用Qiagen Rneasy试剂盒从后指数期的细胞中分离的。简单地讲，在裂解之前，在含有0.2M蔗糖的TE(Tris-HCl，EDTA)中用溶菌酶(400微克/毫升)处理细胞，并在25℃下培养5分钟。对释放出的DNA进行乙醇沉淀，然后溶解在20微升PromegaAMV逆转录酶缓冲液中(50mM Tris-HCl，pH 8.3，50mM KCl，10mM MgCl2，0.5mM亚精胺，10mM DTT)然后添加购自LI-Cor公司的IRD41-标记的引物(5’-GACTGGATGGTTATCCGAATAAGAGAGAGG-3’(SEQ ID NO：10))，并在80℃下将样品变性5分钟，在55℃下退火1小时，并通过醇沉淀纯化。将退火样品溶解在19毫升含有500微摩尔dNTPs和10个单位AMV逆转录酶的AMV逆转录酶缓冲液中，并培养进行延伸(42℃1小时)。用0.5微克/毫升不含DNase的RNaseA处理产物，沉淀，溶解在加样缓冲液中，并与用LI-COR Model4000-L DNA测序仪获得的并列的双脱氧启动子序列进行比较。
多糖酶活性
为了测定由于celZ基因表达所产生的多糖酶活性量(例如，葡聚糖酶活性)，使用刚果红方法(Wood等，1988，酶学方法160：87-112)。具体地讲，将选择的克隆转移到方格化的CMC平板上，并在30℃下培养18小时，然后染色，表达葡聚糖酶的重组宿主细胞在红色背景上形成黄色区。因此，记录这些比色区的直径作为celZ表达的相对指标。
还要用羧甲基纤维素作底物测定葡聚糖酶活性(EGZ)。在该实验中，在35℃下，在含有羧甲基纤维素(20克/升)50mM柠檬酸缓冲液(pH5.2)中测定无细胞培养液(胞外活性)或含有用超声波处理过的细胞的培养液(总活性)的合适的稀释液。3-4毫升样品的最佳酶释放条件被确定为用细胞破碎仪(Model W-220F，Heat System-Ultrasonics公司，Plainview，纽约)以最大功率进行4次脉冲，每次1秒钟。为了终止该测定的酶反应，在煮沸的水浴中将样品加热10分钟。为了测定由葡聚糖酶酶促释放的还原糖，采用二硝基水杨酸试剂，用葡萄糖作标准物(Wood等，1988，酶学方法160：87-112)。酶活性量(IU)以每分钟所释放的还原糖的微摩尔数表示或者以总活性的百分比形式表示，它是两次或两次以上测定的平均值。
超微结构分析
为了测定各种重组宿主细胞的超微结构，制备来自Luria琼脂平板的新的菌落进行分析：在含有2％戊二醛的0.2M卡可酸钠缓冲液(pH7)中固定，然后在1％的四氧化锇中培养，接着在含有1％乙酸铀的蒸馏水中培养。在乙醇中对样品进行脱水，包埋在Spur’s塑料中，并制备超薄切片，并用ZeissEM-IOCA电子显微镜进行检查(Spur，1969，超微结构研究杂志26：31)。
用celZ作为报导基因构建低拷贝启动子探针载体
为了方便强启动子的分离，用pSC101复制子和紧靠着无启动子celZ基因前面的BamHI位点构建拷贝载体(pL012171)。因此，这种无启动子的质粒被用作负对照。质粒pLOI1620也被用作celZ的来源，并且是具有来自连续的lac和celZ启动子表达的pUC18衍生物。通过消化和Klenow处理消除该质粒上的BamHI位点(pLOI2164)。在Klenow处理之后，以无启动子的NdeI片段形式分离celZ基因。用HindIII消化所得到的平端片段，以便消除下游DNA，并且连接到pUC19(HindIII到HincII)，以便产生pLOI2170。在该质粒上，celZ的方向与lacZ转录的方向相反，并且只能进行微弱表达。然后将来自pLOI2170的含有celZ的BamHI(氨基末端)-SphI(羧基末端)片段克隆到pST76K的相应位点上，以便产生pLOI2171(图3)，pST76K是具有温度敏感型复制子的低拷贝载体。在该载体上celZ的表达极低，有利于将其用作候选强启动子的探针。
来自两个大肠杆菌糖酵解启动子(gap和eno)的celZ表达的分析
检查了在大肠杆菌控制糖酵解基因(gap和eno)的两个代表性启动子控制编码葡聚糖酶的异源celZ基因表达的能力。用来自大肠杆菌DH5α菌株的染色体DNA作模板通过聚合酶链式反应扩增gap和eno启动子区。分别用EcoRI和BamHI消化所得到的大约为400bp的片段，并克隆到pLOI2171上无启动子celZ基因前面的相应位点上，产生pLOI2174(gap)启动子和pLOI2175(eno)启动子。作为对照，将来自pLOI2164的含有完整celZ基因的EcoRI-SphI片段和天然菊欧文氏菌启动子克隆到pST76-K的相应位点上，产生pLOI2173。将这三种质粒转入大肠杆菌菌株B和DH5α，并比较葡聚糖酶活性(EGZ)。对大肠杆菌的这两种菌株来说，在CMC平板上大肠杆菌糖酵解启动子的葡聚糖酶活性低于含有天然菊欧文氏菌启动子的pLOI2173的活性(表2)。假定活性与每一个区的半径的平方相关(Fick’s扩散定律)，由糖酵解启动子(pLOI2174和pLOI2175)所产生的EGZ估计比原始结构低33％-65％。因此，研究了控制celZ基因高水平表达的其他候选启动子。
鉴定并克隆适合用作异源基因表达的启动子的随机DNA片段
源于运动发酵单胞菌的随机片段可能是用于在大肠杆菌中高水平表达异源基因取代启动子的有效来源(Conway等，1987，细菌学杂志169：2327-2335；Ingram等，1988，应用环境微生物学54：397-404)。因此，为了鉴定用于欧文氏菌属celZ表达的取代启动子，用Sau3AI对运动发酵假单胞菌DNA进行充分消化，并将所得到的片段连接到pLOI2171的BamHI位点上，将其转入大肠杆菌DH5α中，以便产生潜在候选启动子的文库。为了迅速鉴定能够在大肠杆菌中控制celZ基因表达的优良候选启动子，采用以下生物学筛选。将用celZ质粒转化过的具有不同的随机候选启动子的菌落转移到方格化的CMC平板上，并染色，以便确定培养以后的葡聚糖酶活性(表2)。在检测过的18000克隆中大约20％是CMC阳性的。用另一种菌株大肠杆菌B对能产生比对照pLOI2173大的区域的75个克隆作进一步检查。
表2.用CMC指示平板评估在大肠杆菌中控制celZ表达的启动子强度。
  大肠杆菌DH5α宿主   大肠杆菌B宿主
  质粒   质粒数a   CMC区域直径(mm)b   ％of天然启动子(100*R2 x/R2 c)c   质粒数  CMC区域直径(mm)   ％of天然启动子(100*R2 x/R2 c)
  pLOI2171(无启动子)pLOI2173(天然启动子)   11   05.0   --100   --1   --4.5   --100
  pLOI2174(gap启动子)pLOI2175(eno启动子)   11   4.03.0   7743   11   3.52.8   6035
  运动发酵单
胞菌启动子I组II组III组 51456 13.09.0-11.06.0-9.0 676324-484144-324 41754 10.8-11.39.0-10.55.0-8.8 570-625445-545125-375
a在所示活性范围内的克隆的数量
b三个CMC消化区直径的平均值
cR2 x是具有测试质粒的透明区的半径的平方；R2 c是对照(pLOI2173)的透明区半径平方。
因此，在两个不同菌株中证实了用于筛选候选启动子的启动子强度，一般，DH5α的重组体所产生的区域大于(例如，有更多的葡聚糖酶)菌株B的重组体的区域。不过，对大多数克隆来说，每一种宿主的相对启动子强度相似。基于用CMC平板测定区域大小对葡聚糖酶生产所作的分析，有4个克隆表达celZ的水平似乎比具有原始菊欧文氏菌celZ基因的结构(pLOI2173)高大约6倍，并且比大肠杆菌糖酵解启动子的表达水平高10倍。因此，选择上述启动子和类似的强的候选启动子作进一步研究。
葡聚糖酶的生产和分泌
通过从上述筛选中(参见表2的I组II组)选择pST76K的八种质粒衍生物(pLOI2177-pLOI2184)，并且在大肠杆菌菌株B中测定总的葡聚糖酶活性(表3)。在CMC平板上能产生最大区域的四种质粒又被证实具有最高的葡聚糖酶活性(pLOI2177、pLOI2182和pLOI2183)。其活性大约比未修饰过的celZ(pLOI2173)高6倍，与我们用在CMC平板上的透明的区域半径的平方所作的估算十分吻合。图4表示含有各种不同启动子，有和没有添加编码分泌蛋白的out基因的菌株B的CMC平板和体外酶测定的活性估算值比较。尽管有某些误差，但直接的关系是明确的，即证实了该平板方法用于估算相对活性的有效性。在比较时还包括在pUC18上的原始结构-一种高拷贝质粒(pLOI2164)。该结构具有连续的lac和celZ启动子，所产生的EGZ活性低于具有取代启动子的三种低拷贝质粒(pLOI2177、pLOI2182和pLOI2183)。因此，为了进一步增强葡聚糖酶的celZ表达，从pLOI2183上的分离含有celZ和最有效的启动子的DNA片段(为EcoRI-SphI片段)，并插入pUC19，其转录方向与lac启动子的相反(pLOI2307)。因此，上面所鉴定的强取代启动子在结合到高拷贝质粒中时，可再将葡聚糖酶的活性提高2倍。
工程提高葡聚糖酶的分泌
为了进一步改善上述增强celZ编码的葡聚糖酶表达的结果，对上述宿主细胞进行工程改造，以便增强分泌。用源于菊欧文氏菌EC16的编码分泌蛋白的基因(例如，out基因)改善葡聚糖酶的分泌，使用He等所披露的含有out基因的质粒(pCPP2006)(He等，1991，美国科学院院报88：1079-1083)。对大肠杆菌B中的EGZ的增强了的分泌进行研究，结果示于表3中。
表3.在大肠杆菌B中生产和分泌EGZ的启动子的比较
  质粒a            无分泌基因       有分泌基因(pCPP2006)
  总活性(IU/L)b   细胞外c(％)   总活性(IU/L)   细胞外c(％)
  pLOI2173   620   17   1,100   43
  pLOI2177   3,700   10   5,500   44
  pLOI2178   2,200   9   3,500   49
  pLOI2179   2,000   10   3,000   50
  pLOI2180   2,900   8   6,300   39
  pLOI2181   1,800   11   4,100   46
  pLOI2182   3,500   7   6,600   38
  pLOI2183   3,400   7   6,900   39
  pLOI2184   2,100   12   2,400   39
  pLOI2164   3,200   20   6,900   74
  pLOI2307   6,600   28   13,000   60
a质粒pLOI2173和pLOI2164含有celZ天然启动子；pLOI2307含有源于pLOI2183的强启动子。
质粒pLOI2164和pLOI2307是基于pUC的质粒(高拷贝数)。所有其他质粒是pST76-K的衍生物(低拷贝数)。
b葡聚糖酶活性是在30℃下生长16小时之后测定的。
c胞外活性(分泌的或释放的)。
具有低拷贝质粒的重组宿主仅产生总的EGZ胞外活性的7-17％(生长16小时之后)，没有额外的异源分泌蛋白(由质粒pCPP2006所编码的out蛋白)。在具有高拷贝pUC-基质粒的宿主细胞周围的胞外培养液中所含的EGZ高于(20％-80％)含有相同启动子的低拷贝pST76-基的质粒的宿主细胞。不过，在另一种情况下，增加编码分泌蛋白的out基因(例如，pCPP2006)都能提高总的表达水平2倍，并增加胞外酶级份(38-74％)大约4倍。总的葡聚糖酶的最大活性为13000IU/升，其中的7800IU/升存在于由菌株B所产生的无细胞上清液中，该菌株同时具有编码由强取代启动子控制的celZ的pLOI2307和编码out分泌蛋白的pCPP2006。
有报导说，在特定条件(pH7，37℃)下，纯的EGZ酶的比活性为419iu(Py等，1991蛋白质工程325-333)，并且业已证实在这种条件下产生的EGZ的活性比在上述条件(pH5.2柠檬酸缓冲液，35℃)下产生的活性高25％。因此，假定纯酶在pH5.2(35℃)下的比活性为316IU，每升大肠杆菌B培养物(含有pLOI2307和pCPP2006，例如编码葡聚糖酶和分泌蛋白的质粒)能产生大约41毫克活性EGZ，或者4％-6％的总的宿主细胞蛋白是活性葡聚糖酶。
源于运动发酵单胞菌的最强启动子的序列分析
测定了四种最强取代启动子(pLOI2177、pLOI2180、pLOI2182和pLOI2183)的序列。为了便于测定，将每一种启动子融合在pUC19的PstI位点上。所得到的质粒pLOI2196、pLOI2197、pLOI2198和pLOI2199以高拷贝数产生(ColEI复制子)，并可以用M13和T7测序引物从两个方向测序。所有四种质粒含有相同的运动发酵单胞菌DNA的片段，并且是同胞。各自的长度为1417bp，并且含有4个内部Sau3AI位点，将每一个片段的DNA序列和翻译的蛋白序列(6个读框)与当前的数据库进行比较。在Blast检索只有一个片段(281bp的内部片段)表现出高度的吻合性(国家生物技术信息中心；http://www.ncbi/nlm.nih.gov/BLAST/)，该片段的DNA序列与运动发酵单胞菌hpnB基因部分的相同性为99％，因此表明它在细胞外膜生物合成中起作用(Reipen等，1995，微生物学141：155-161)。引物延伸分析发现了一个位于celZ的Sau3AI/BamHI结合位点上游67bp的主要起始位点，和一个位于更上游的第二个次要起始位点(图5)。将-10和-35区间的序列与大肠杆菌ξ因子的保守序列进行比较(Wang等，1989细菌学杂志180：5626-5631；Wise等1996，细菌学杂志178：2785-2793)。显性启动子区(大约为起始位点的85％)似乎与ξ起始启动子相似，而次级启动子位点类似于ξ38启动子。
产生葡聚糖酶的重组宿主细胞的显微分析
通过光学显微镜观察到了重组体和亲本生物之间在细胞形态学方面的微小的差异。不过，在电子显微镜下，在表达大量葡聚糖酶的菌株B(pLOI2164)的外周质中小的极性包含体清晰可见，并且这些包含体被认为含有EGZ(图6)。在所产生的葡聚糖酶活性高出2倍的菌株B(p：OI2307)中，所述包含体更大，并且占总的细胞体积的20％。大的极性包含体的体积表明，葡聚糖酶活性测定可能过低的估计了总的EGZ产量。通常，在还具有编码out分泌蛋白的结构的宿主细胞中极性包含体较小，所述分泌蛋白能增强蛋白从外周质间隙中分泌。正如所预料的，在不产生葡聚糖酶的负对照菌株(pUC19)中没有发现外周质包含体。
                         实施例2
        适用于将寡糖发酵成乙醇的重组克雷伯氏菌属宿主
在该实施例中，披露了适于作为生物催化剂将寡糖解聚并发酵成乙醇的重组克雷伯氏菌属宿主。
用于本实施例的材料和方法
除非另有说明，在下面的实施例中使用以下材料和方法。
细菌、质粒、和培养条件
用于本实施例中的菌株和质粒归纳在下面的表4中。
表4.所使用的菌株和质粒
  菌株/质粒   特性   来源/参考文献
  菌株
  运动发酵单胞菌CP4   原养型   Ingram等(1988)Appl.Environ Micro 54：397-404
  大肠杆菌
  DH5α   lacZ M15 recA   Bethesda Research Laboratory
  HB101   recA lacY recA   ATCC 37159
  产酸克雷伯氏菌
  M5A1   原养型   Wood等(1992)Appl.Environ.Micro.58：2103-2110
  P2   Pfl∷pdc adhB cat   Wood等(1992)Appl.Environ.Micro.58：2103-2110
  SZ1   pfl∷pdc adhB cat；整合的celZ；tet   见正文
  SZ2   pfl∷pdc adhB cat；整合的celZ；tet   见正文
  SZ3   pfl∷pdc adhB cat；整合的celZ；tet   见正文
  SZ4   pfl∷pdc adhB cat；整合的celZ；tet   见正文
  SZ5   pfl∷pdc adhB cat；整合的celZ；tet   见正文
  SZ6   pfl∷pdc adhB cat；整合的celZ；tet   见正文
  SZ7   pfl∷pdc adhB cat；整合的celZ；tet   见正文
  SZ8   pfl∷pdc adhB cat；整合的celZ；tet   见正文
  SZ9   pfl∷pdc adhB cat；整合的celZ；tet   见正文
  SZ10   pfl∷pdc adhB cat；整合的celZ；tet   见正文
  质粒
  pUC19   bla克隆载体   新英格兰生物实验室
  pBR322   bla tet克隆载体   新英格兰生物实验室
  pLOI1620   bla celZ   Wood等(1997)BiotechBioeng.55：547-555
  pRK2013   kan运动辅助质粒(mob+)   ATCC
  pCPP2006   含有源于菊欧文氏菌EC16D的out基因的Spr，40kbp片段   He等(1991)P.N.A.S88：1079-1083
  pST76-K   含有温度敏感型pSC101复制子的kan低拷贝载体   Posfai等(1997)J.Bact.179：4426-4428
  pLOI2164   bla celZ(消除了pLOI1620上的BamHI)   见正文
  pLOI2173   kan celZ(天然celZ启动子)   见正文
  pLOI2177   kan celZ(源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
  pLOI2178   kan celZ(源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
  pLOI2179   kan celZ(源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
  pLOI2180   kan celZ(源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
  pLOI2181   kan celZ(源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
  pLOI2182   kan celZ(源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
  pLOI2183   kan celZ(源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
  pLOI2184   kan celZ (源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
表4.所使用的菌株和质粒(续)
  菌株/质粒   特性   来源/参考文献
  pLOI2185   kan celZ(源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
  pLOI2186   kan celZ(源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
  pLOI2187   kan celZ(源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
  pLOI2188   kan celZ(源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
  pLOI2189   kan celZ(源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
  pLOI2190   kan celZ(源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
  pLOI2191   kan celZ(源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
  pLOI2192   kan celZ(源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
  pLOI2193   kan celZ(源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
  pLOI2194   kan celZ(源于运动发酵单胞菌的取代启动子)   见正文
  pLOI2301   AscI接头插入pUC19的NdeI位点   见正文
  pLOI2302   AscI接头插入pLOI2301的SapI位点   见正文
  pLOI2303   在Klenow处理之后，源于pBR322的AvaI-EcoRI片段插入pLOI2302的PstI位点   见正文
  pLOI2305   产酸克雷伯氏菌M5A1基因组DNA(ca.2.5kb)的EcoRI DNA片段克隆到pLOI2303的SmaI位点   见正文
  pLOI2306   源于pLOI2183的EcoRI-SphI片段克隆到pLOI2305的EcoRI位点   见正文
用于培养大肠杆菌和产酸克雷伯氏菌M5A1的培养条件通常采用LB培养液，每升该培养液含有：10克Difco胰化蛋白胨，5克酵母提取物，和5克氯化钠，或者使用Luria琼脂(补充了15克琼脂的LB)(Sambrook等，1989，分子克隆：试验室手册，C.S.H.L.冷泉港，纽约)。
为了在选择条件下筛选细菌菌落，使用CMC平板(含有3克/升羧甲基纤维素的Luria琼脂平板，测定由特定细菌菌株所表达的葡聚糖酶活性水平(Wood等，1988酶学，160：87-112)。为了培养产乙醇的菌株，将葡萄糖添加到固体培养基(20克/升)和培养液(50克/升)中。在测定葡聚糖酶活性时，用一种非还原糖山梨醇(50克/升)取代上述生长培养基中的葡萄糖。为了培养用于通过电穿孔导入核酸的各种菌株或培养物制剂，使用改性的SOC培养基(例如，20克/升Difco胰化蛋白胨，5克/升Difco酵母提取物，10mM氯化钠，2.5mM氯化钾，10mM硫酸镁，10mM氯化镁和50克/升葡萄糖)。在需要时，添加抗生素氨苄青霉素(50毫克/升)、壮观霉素(100毫克/升)、卡那霉素(50毫克/升)、四环素(6或12毫克/升)、氯霉素(40、200、或600毫克/升)，以便选择具有抗生素抗性标记的重组宿主。除非另有说明，培养物是在37℃下生长。产乙醇的菌株和含有具有温度敏感型pSC101复制子的质粒的菌株在30℃下生长。
遗传学方法
在质粒构建、克隆和转化时使用标准方法和大肠杆菌DH5α宿主(Ausubel等，1987，当代分子生物学，John Wiley&Sons；Sambrook等，1989，分子克隆：试验室手册，C.S.H.L.冷泉港，纽约)。按图7所示方法构建celZ整合载体pLOI2306。用Bio-Rad基因脉冲仪，用以下条件将缺少来自pLOI2306的复制子的环状DNA(参见图7)电穿孔到产乙醇的产酸克雷伯氏菌B2中：2.5kV，25μF，测定时间常数为3.8-4.0毫秒(Comaduran等，1998，生物技术通讯20：489-493)。用pRK2031将菊欧文氏菌EC16分泌系统(pCPP2006)结合到产酸克雷伯氏菌上，以便转移(Murata等，1990，细菌学杂志172：2970-2978)。小规模和大规模质粒分别用TELT方法和Promega Wizard试剂盒进行。用构建Qiagen(Qiagen公司，Chatsworth，CA)的Qiaquick凝胶提取试剂盒从凝胶中分离DNA片段。按照Cutting和Yomano所披露的方法从产酸克雷伯氏菌M5A1和运动发酵单胞菌CP4中分离染色体DNA。用LI-COR Model4000-L DNA测序仪对目标DNA进行测序(Wood等，1997，生物技术生物工程55：547-555)。
CelZ的染色体整合
用两种方法进行celZ的染色体整合，用早先在大肠杆菌上所披露的方法(Hamilton等，1989，细菌学杂志171：4617-4622)用温度调节的质粒(pLOI2183)选择，和直接整合缺乏功能性复制子的环状DNA片段。用相同的方法在大肠杆菌P中进行编码乙醇途径的运动发酵单胞菌基因的染色体整合(Ohta K等，1991，应用环境微生物学57：893-900)。并在产酸克雷氏菌M5A1上进行整合(Wood等，1992，应用环境微生物学58：2103-2110)。通常，用Bio-Rad基因脉冲仪通过电穿孔将环状DNA转入P2中。然后，在含有四环素(6毫克。/升)的固体培养基上选择转化体，并在CMC平板上生长，以便测定葡聚糖酶活性水平。
葡聚糖酶活性
按照例1所述的对CMC平板进行染色的方法评估由受不同测试启动子控制的celZ基因所表达的产物(即葡聚糖酶)所产生的葡聚糖酶活性。这种比色测定得到了表示葡聚糖酶活性的黄色区域，并将该区域的直径用作celZ多肽表达的相对指标。在35℃下用羧甲基纤维素作底物(20克/升，溶解在50mM柠檬酸缓冲液中，pH5.0)进一步评估具有最大黄色区域的克隆的葡聚糖酶活性(Wood等，1988，酶学方法160：87-112)。为了测定胞内葡聚糖酶的量，通过用超声波处理4秒钟从培养物中释放酶促活性(Model W-290F细胞破碎仪，HeatSystem-Ultasonics公司，Plainview，纽约)测定所表达的葡聚糖酶的量，并且在这里以每分钟所释放的还原糖的微摩尔数表示(IU)。按照Wood所披露的方法使用葡萄糖标准物测定还原糖(Wood等，1988，酶学方法160：87-112)。
底物解聚
为了进一步测定由各种宿主细胞所产生的葡聚糖酶活性量，将不同的碳水化合物底物与各种细胞提取物一起培养(20克/升，悬浮在50mM柠檬酸缓冲液中，pH5.2)。在一种例子中，按照Wood所披露的方法制备含有酸膨胀的并且用球磨磨碎的纤维素的测试底物(Wood等，1988，酶学方法160：87-112)。通过在添加了一种非还原糖山梨醇的LB中在30℃下培养宿主细胞16小时制备一种典型的多糖酶提取物(pCPP2006，即来自产酸克雷伯氏菌的EGZ(葡聚糖酶)。将无细胞稀释液添加到底物中，并在35℃下培养16小时。添加几滴氯仿，以避免在培养期间意外污染物的生长。在培养之前和之后取出样品通过DNS方法测定还原糖(参见，Wood等，1988，酶学方法160：87-112)。通过用存在于该聚合物中的总的计算糖残基数除以还原末端的数量估算解聚程度(DP)。
发酵条件
发酵是在装有100毫升添加了50克/升碳水化合物的LB的250毫升烧瓶中进行的。对测试碳水化合物进行单独消毒，并在冷却之后添加。为了减少底物的变化，不对酸膨胀的纤维素、球磨磨碎的纤维素和木聚糖进行高压灭菌。添加抗生素氯霉素(200毫克/升)，以便抑制污染生物的生长。用24小时的培养液(50克/升葡萄糖)接种烧瓶(10％v/v)，并在35℃下震荡培养(100rpm)24-96小时。为了监测培养物，每天取出样品通过气相层析测定乙醇浓度(Dombek等，1986，应用环境微生物学52：975-981)。
分离和鉴定取代启动子的方法
为了鉴定可以用作在克雷伯氏菌属或其他宿主细胞中表达异源基因的取代启动子的运动发酵单胞菌的随机片段，按例1所述方法构建一种能有效克隆候选启动子的载体(还可参见Ingram等，1988，应用环境微生物学54：397-404)。
然后，将Sau3AI消化过的运动发酵单胞菌DNA片段连接到pLOI2171的BamHI位点上，以便产生潜在启动子的文库。将这些质粒转入大肠杆菌DH5α进行初步筛选。在CMC平板上单独测试的18000克隆中有75个克隆产生比对照(pLOI2173)大的黄色区。将来自这75个克隆的质粒转入产酸克雷伯氏菌M5A1，再进行测定，并发现能在这第二种宿主中高水平表达celZ。
生产多糖酶的重组克雷伯氏菌属宿主
将在CMC平板上具有表示有celZ表达的最大区域的高表达克隆(pLOI2177-pLOI2194)生长在LB培养液上，并测定葡聚糖酶活性(表5)。
表5.在产酸克雷伯氏菌M5A1中评估celZ表达和分泌的启动子
质粒a   无分泌基因   有分泌基因(pCPP2006)
  总活性(IUL-1)b   分泌活性(IUL-1)   总活性(IUL-1)   分泌活性(IU L-1)
  pLOI2173   2,450   465   3,190   1,530
  pLOI2177   19,700   3,150   32,500   13,300
  pLOI2178   15,500   2,320   21,300   11,500
  pLOI2179   15,400   2,310   21,400   12,000
  pLOI2180   21,400   3,210   30,800   13,600
  pLOI2181   15,600   2,490   21,000   11,800
  pLOI2182   19,600   3,130   31,100   14,000
  pLOI2183   20,700   3,320   32,000   14,000
  pLOI2184   15,500   2,480   21,200   11,900
  pLOI2185   15,100   2,420   24,600   11,500
  pLOI2186   17,000   2,380   25,700   13,400
  pLOI2187   15,800   2,210   24,500   12,200
  pLOI2188   18,200   2,180   25,600   12,000
  pLOI2189   14,800   2,360   27,100   12,700
  pLOI2190   16,100   2,410   26,500   12,500
  pLOI2191   15,800   2,210   25,000   12,400
  pLOI2192   15,100   1,810   24,900   12,500
  pLOI2193   16,700   2,010   24,600   12,800
  pLOI2194   15,400   2,770   21,500   11,900
apLOI2173含有具有原始启动子的celZ基因，所有其他质粒含有具有用作取代启动子的运动发酵单胞菌DNA片段的celZ基因。
b葡聚糖酶(CMCase)活性是在30℃下生长16小时之后测定的。
具有上述质粒的活性比具有含有天然celZ启动子(pLOI2173)的对照质粒8倍。能产生最大区域的四种质粒(pLOI2177、pLOI2180、pLOI2182和pLOI2183也能产生释放到培养液中最大的总的葡聚糖酶活性(大约20000IU/升)。选择这些质粒中的一种pLOI2183进行染色体整合。
多糖酶基因的染色体整合
为了将所需要的多糖酶基因稳定地整合到诸如克雷伯氏菌属P2菌株的合适宿主细胞中，构建一种新的载体(pLOI2106)，以便分离缺乏所有复制功能但含有具有取代启动子的celZ基因、一种选择标记的DNA片段和同源DNA片段用于整合。通过将一个接头(GGCGCGCC；SEQ ID NO：11)插入位于多接头区两侧的用Klenow处理过的NdeI和SapI位点上在pUC19上增加两个AscI位点，以便产生pLOI2302。将含有来自pBR322的tet抗性标记基因的平端片段(用EcoRI和AvaI裂解，然后用Klenow处理)克隆到pLOI2302(用PstI裂解，然后通过Klenow处理)的PstI位点上，以便产生pLOI2303。将克雷伯氏平端片段(用EcoRI裂解，并通过Klenow处理形成平端)连接到pLOI2303的SmaI位点上，以便产生pLOI2305。将来自pLOI2183的含有取代的运动发酵单胞菌启动子和celZ基因的EcoRI和SphI片段(Klenow处理过的)连接到pLOI2305的EcoRI位点上(EcoRI，Klenow处理)，以便产生pLOI2306。用AscI消化pLOI2306产生了两个片段，较大的片段含有celZ基因和取代启动子、tet基因以及染色体DNA片段，将其用于同源重组。通过琼脂糖凝胶电泳纯化该较大片段(10kb)，通过自身连接环化，并通过电穿孔转入克雷伯氏菌属菌株P2，然后在四环素抗性筛选条件下生长。纯化所得到的21个四环素抗性菌落，并在CMC平板上测定葡聚糖酶活性。所有菌落都是阳性的具有大的区域，表明有celZ基因产物的功能表达。
通过用质粒DNA制剂转化DH5α和凝胶电泳测试用于生产所述重组菌株的克隆中是否有不需要的质粒存在。在12个测试的克隆中没有获得转化体。不过，随后发现这些菌株中的两个含有大的质粒带，它有可能含有celZ，放弃这两个菌株。具有含有大的质粒的DNA的菌株可以用T7和M13引物测试，证实多拷贝质粒的存在。其余的10个菌株含有整合的celZ基因，并且不能用任一种引物测序。
在图8中示意性地示出了新型载体pLOI2306的结构特征，而在序列表的SEQ ID NO：12中示出了该载体的核苷酸序列，包括各种编码区(即基因celZ、bla和tet)。用标准技术(例如，可以参见Sambrook，J.等，分子克隆，试验室手册，第2版，冷泉港试验室，冷泉港试验室出版社，冷泉港，组约，1989；当代分子生物学方法，Ausubel等著，John Wiley&Sons，1992)对表示celZ基因下游的非编码序列的核苷酸碱基对3282-4281(获自菊欧文氏菌)和表示获自产酸克雷伯氏菌M5A1的非编码靶序列的一部分的碱基对9476-11544进行测序。例如，提供了pLOI2306质粒的上述非测序区域任一侧的足够的旁侧序列，以便可以合成相应于这些已知序列的测序引物，并用于用pLOI2306质粒作模板进行标准测序反应。
或者，本领域技术人员可以理解的是即使是在缺少被用作模板的pLOI2306质粒的情况下也可以测定上述未测序的区域。例如，其余的celZ序列可以用本文所提供的序列(例如，SEQ ID NO：12的1452-2735号核苷酸测定，用该序列合成探针和引物，分别用于从含有菊欧文氏菌序列的文库中分离含有celZ的克隆，并用标准DNA测序反应对所分离的克隆进行测序。类似的，可以用本文所提供的序列(例如，SEQ IDNO：12的8426-9475号核苷酸)测定其余的靶序列，用该序列合成探针和引物，分别用于从含有产酸克雷伯氏菌M5A1EcoRI片段的文库中分离含有靶序列的克隆(例如，具有适当大小)，并用标准DNA测序反应对所分离的克隆进行测序(产酸克雷伯氏菌M5A1的一种来源可以是，例如，用标准技术清除了所有质粒的ATCC 68564)。技术人员可以进一步理解的是，代表一种细菌的cDNA或基因组序列的文库的制备以及从该文库中分离所需的核酸片段(例如cDNA或基因组文库)在本领域中是众所周知的，并且通常用诸如杂交技术或聚合酶链式反应的技术完成，上述所有技术在本领域中都是标准化的(Sambrook，J.等，分子克隆，试验室手册，第2版，冷泉港试验室，冷泉港试验室出版社，冷泉港，纽约，1989；当代分子生物学方法，Ausubel等著，John Wiley&Sons，1992；寡核苷酸合成，M.J.Gait著，1984；和PCR手册：当代核酸化学方法，Beaucage著，John Wiley&Sons，1999，(作者))。
用取代启动子和整合的或基于质粒的结构表达异源基因
在LB山梨醇培养液中研究了十种整合菌株(SZ1-SZ10)的葡聚糖酶生产。这些菌株都能产生5000-7000IU/升的活性酶(表6)。尽管这一活性相当于由含有天然celZ启动子的质粒pLOI2173所表达的活性的两倍，但所述整合菌株所产生的葡聚糖酶活性仅占由含有相同的取代运动发酵单胞菌启动子的P2(pLOI2183)所产生活性的1/3(表5)。在整合以后葡聚糖酶表达的减弱可能是由于拷贝数量的减少(即多拷贝质粒与单一的整合的拷贝)。
葡聚糖酶EGZ的分泌
产酸克雷伯氏菌含有用于支链淀粉分泌的天然II型分泌系统(Pugsley，1993，微生物学综述57：50-108)，该系统类似于由菊欧文氏菌的out基因所编码的分泌系统，后者能分泌果酸裂解酶和葡聚糖酶(EGZ)(Barras等，1994，植物病理学年度综述32：201-234；He等，1991，美国科学院院报88：1079-1083)。II型分泌系统通常是非常专一的，并且在异源蛋白上的作用很差(He等，1991，美国科学院院报88：1079-1083；Py等，1991，FEMS微生物学通讯79：315-322；Sauvonnet等，1996，分子微生物学22：1-7)。因此，正如所预料的，重组celZ以M5A1(表5)或P2(表6)为宿主主要以与细胞结合的产物形式表达。总的重组EGZ活性的大约1/4(12-26％)是从培养液中回收的。对于大肠杆菌DH5α来说，有大约8-12％的总的胞外EGZ。因此，产酸克雷伯菌中的天然分泌系统可能有利于重组EGZ的部分分泌。
为了进一步改善所需产物的分泌，导入了源于菊欧文氏菌EC16(例如，使用pCPP2006)II型分泌基因(out基因)，以便促进从产酸克雷伯菌的产乙醇菌株的P86021菌株中分泌重组EGZ(表5和表6)。对于大多数含有具有celZ质粒的菌株来说，添加out基因，会导致胞外EGZ增加5倍，以及总的葡聚糖酶活性增加2倍。对于具有整合的celZ菌株来说，增加out基因会导致胞外EGZ增加10倍，并使总的葡聚糖酶活性增加4倍。在这两种情况下，out基因都能促进总的葡聚糖酶活性的大约一半分泌。由于添加out基因所导致EGZ活性的增加可以反映在质粒和整合的celZ结构的分泌产物的改善了的折叠方面。在pUC基衍生物上所观察到的减少的增加可能是由于质粒负担和在由该高拷贝质粒上的bla基因产生外周质β-内酰胺酶期间竞争分泌机制所致。
用两种指标鉴定P2的最佳整合菌株，在含有高水平氯霉素的固体培养基上生长(上游pdc和adhB基因高水平表达的标记)以及由out基因有效分泌葡聚糖酶。选择两种重组菌株SZ2和SZ6作进一步研究。这两种菌株都产生24000IU/升的葡聚糖酶活性，相当于总的细胞蛋白的5％(Py等，1991，蛋白质工程4：325-333)。
底物解聚
在应用于CMC来源时，所测定的重组EGZ的底物解聚作用是良好的。当应用于酸膨胀的纤维素时，葡聚糖酶的活性低于用CMC活性测定的活性的10％。当所述多糖酶应用于Avicel或木聚糖时发现其活性很小。不过，如果消化过夜的话，EGZ多糖酶可导致所有底物的平均聚合物长度有可检测的降低。CMC和酸膨胀的纤维素被解聚到平均长度为7个糖残基。这些有7个残基的纤维素聚合物可溶性很低，并且优选作进一步的消化，以便有效代谢(Wood等，1992，应用环境微生物学58：2103-2110)。球磨研磨过的纤维素和Avicel的平均链长被降低到原始长度的1/3，而在每一个木聚糖聚合物上只出现了低于1次的裂解。
表6.含有整合的celZ的产乙醇的产酸克雷伯菌菌株的培养物生长、葡聚糖酶生产、和分泌的比较
  葡聚糖酶产量和分泌(IUL-1)
菌株   在固体培养基上生长(600mg L-1CM)   无分泌系统   添加分泌系统(pCPP2006)
  总活性   分泌活性   总活性   分泌活性
  P2   ++++   0   0   0   0
  SZ1   ++   6,140   1,600   26,100   14,300
  SZ2   ++++   6,460   1,160   23,700   11,400
  SZ3   +++   5,260   1,320   18,400   8,440
  SZ4   +++   7,120   1,070   23,200   9,990
  SZ5   +   6,000   1,080   29,300   15,500
  SZ6   ++++   7,620   1,520   24,300   11,900
  SZ7   +   6,650   1,330   28,800   15,500
  SZ8   +++   7,120   854   28,700   14,900
  SZ9   ++   7,530   1,130   26,700   12,800
  SZ10   +++   4,940   939   17,000   6,600
葡聚糖酶(CMCase)活性是在30℃下生长16小时之后测定的。
表7.来自菌株SZ6(pCPP2006)的无细胞培养液的EGZ对各种底物的解聚作用
  底物   酶活性(IU/L)   估计的聚合度
  消化前   消化后
  羧甲基纤维素   13,175   224   7
  酸膨胀的纤维素   893   87   7
  球磨磨碎的纤维素   200   97   28
  Avicel   41   104   35
  来自spelts燕麦的木聚糖   157   110   78
让菌株SZ6(pCPP2006)在LB-山梨醇培养液中生长16小时作为分泌的EGZ的来源。
发酵
为了实用，在菌株P2上增加celZ和out基因一定不能降低所得到的生物催化剂的发酵能力。用葡萄糖和纤维二糖进行了比较(表8)。所有菌株在对这些糖发酵的能力方面相同，这表明celZ的整合或pCPP2006的增加不会产生有害作用。还检验了这些菌株将酸膨胀的纤维素直接转化成乙醇的能力。活性最高的结构SZ6(pCPP2006)能由非晶纤维素产生少量的乙醇(3.9克/升)。开始，在接种所有菌株时存在于大约1.5克/升的乙醇，除了SZ6(pCPP2006)之外，所有菌株的乙醇含量都随着时间推移降低到0。因此，在SZ6(pCPP2006)上所观察到的3.9克/升的乙醇产量可能表示对总的乙醇产量的过低的估计。不过，至多这仅代表了所存在的一部分聚合物的转化。可能通过EGZ水解酸膨胀的纤维素和发酵只产生了少量的葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖。这些化合物可以被产酸克雷伯氏菌中的天然磷酸烯醇丙酮酸依赖型磷酸转移酶系统所代谢(Ohta K等，1991，应用环境微生物学57：893-900；Wood等，1992，应用环境微生物学58：2103-2110)。
表8.由含有out基因(pCPP2006)和整合的celZ的菌株SZ6用各种底物(50克/升)生产乙醇
  菌株   乙醇产量(gL-1)
  葡萄糖   纤维二糖   酸膨胀的纤维素
  P2   22.9   22.7   0
  P2(pCPP2006)   22.6   21.3   0
  SZ6   21.5   19.7   0
  SZ6(pCPP2006)   22.7   21.2   3.9
在接种时所有培养物的起始乙醇浓度大约为1.5克/升。在用酸膨胀的纤维素作底物时，除了SZ6(pCPP206)之外，所有菌株在培养72小时之后该浓度降低到0。
等同方案
本领域技术人员可以理解，或者仅用常规实验就可以确定本文所披露的本发明的具体实施方案的等同方案。这些等同方案包括在下面的权利要求书的范围内。另外，在美国专利US5821093；5482846；5424202；5028539；5000000；5487989；5554520和5162516中所披露的任何数量的遗传结构，所述细胞和方法都可用于实施本发明，以上专利文献被收作本文参考。
                       序列表
<110>L.因格拉姆等(Ingram，L et al.)
<120>适用于同时糖化和发酵的重组宿主
<130>BCI-016CPPC
<140>PCT/US00/14773
<141>2000-05-26
<150>60/136,376
<151>1999-05-26
<160>12
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>450
<212>DNA
<213>运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)
<220>
<223>启动子
<400>1
ctttttcggc atgagcaacc aacattttca aggtatcatc ctgatgcgca atatcggcat   60
cggttagcca taaccatttt acctgtccgg cggccttaat accttgatca gatggttcgt   120
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ggcccgaaag ctgaagaagc taaagctgct ggtgcagaag ttgtcggcgc agaagacctg   240
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ttttcgtgat cctctagagt ctatgaaatg gagattcatt tatgcctctc tcttattcgg   420
ataaccatcc agtcatccgc aagcttggcc                                    450
<210>2
<211>1509
<212>DNA
<213>运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)
<220>
<223>表达载体
<400>2
gatcaaccgg caatttatcc acggcatcaa attcgatctg tcttttcccg tatcattggc   60
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ccgctttaaa ctggtcacta tttatgagtt tattacgacc tgcgtcagaa ccggaggttg    540
tggcattggt tattggcttc atatgccttt ggggtatttt ttgtttatat ggtgcctgac    600
gcaattcacg ctttttgtca cctgtagtta cgctggcatt tatctctttc accaatatac    660
ggagcgagca tttccgataa gaaaaatatt tcagagaaaa acgcccgttg aagggatgtg    720
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cacccttgct attggtagct cactgggggc tggggaagcc gctgtctatc gggtcgcgcg    840
ccagattagt aacggtttat ccaaaccagc acagatgatg atcggctaac atgcatccac    900
cggcagcacc ggccgtttta tgcttgggat tattgatatg ccgaaaagga tacaacatct    960
ggaagaaaaa gacgaaggcc ggaataagcg cccattctgc aaaattgtta caacttagtc    1020
gcgccatcag ggaatgaaaa atcaatccgt ctttttcggc atgagcaacc aacattttca    1080
aggtatcatc ctgatgcgca atatcggcat cggttagcca taaccatttt acctgtccgg    1140
cggccttaat accttgatca gatggttcgt ggtgttgtta ccttgccgaa gggcaccggt    1200
aaaaatgttc gcgtcggtgt tttcgcccgt ggcccgaaag ctgaagaagc taaagctgct    1260
ggtgcagaag ttgtcggcgc agaagacctg atggaagcca ttcagggcgg cagcattgat    1320
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gagattcatt tatgcctctc tcttattcgg ataaccatcc agtcatccgc aagcttggcc    1500
gtaatccat                                                            1509
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>3
cgaattcctg ccgaagttta ttagcca                                        27
<210>4
<211>31
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>4
aaggatcctt ccaccagcta tttgttagtg a                                   31
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>5
agaattctgc cagttggttg acgatag                                        27
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>6
caggatcccc tcaagtcact agttaaactg                                     30
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>7
taatacgact cactataggg                                                20
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>8
taacaatttc acacagga                                                  18
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>9
cacgacgttg taaaacgac                                                 19
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>10
gactggatgg ttatccgaat aagagagagg                                     30
<210>11
<211>8
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>11
ggcgcgcc                                                             8
<210>12
<211>11544
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：载体
<220>
<223>所有n为待测序
<220>
<223>1-1451位核苷酸编码启动子
<220>
<223>1452-2735位核苷酸编码celZ基因
<220>
<223>4916-5776位核苷酸编码bla基因
<220>
<223>7061-8251位核苷酸编码tet基因
<220>
<223>9476-11544位核苷酸编码产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)靶序列
<220>
<221>CDS
<222>(1452)..(2735)
<220>
<221>CDS
<222>(4916)..(5776)
<220>
<221>CDS
<222>(7061)..(8251)
<400>12
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attttaggca cttcaagatt gggatggcct gccgaggtca agccagatgc cttgctttgt    420
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gagattcatt t atg cct ctc tct tat tcg gat aac cat cca gtc atc gat    1490
             Met Pro Leu Ser Tyr Ser Asp Asn His Pro Val Ile Asp
               1               5                  10
agc caa aaa cac gcc cca cgt aaa aaa ctg ttt cta tct tgt gcc tgt     1538
Ser Gln Lys His Ala Pro Arg Lys Lys Leu Phe Leu Ser Cys Ala Cys
     15                  20                  25
tta gga tta agc ctt gcc tgc ctt tcc agt aat gcc tgg gcg agt gtt     1586
Leu Gly Leu Ser Leu Ala Cys Leu Ser Ser Asn Ala Trp Ala Ser Val
 30                  35                  40                  45
gag ccg tta tcc gtt agc ggc aat aaa atc tac gca ggt gaa aaa gcc     1634
Glu Pro Leu Ser Val Ser Gly Asn Lys Ile Tyr Ala Gly Glu Lys Ala
                 50                  55                  60
aaa agt ttt gcc ggc aac agc tta ttc tgg agt aat aat ggt tgg ggt     1682
Lys Ser Phe Ala Gly Asn Ser Leu Phe Trp Ser Asn Asn Gly Trp Gly
             65                  70                  75
ggg gaa aaa ttc tac aca gcc gat acc gtt gcg tcg ctg aaa aaa gac     1730
Gly Glu Lys Phe Tyr Thr Ala Asp Thr Val Ala Ser Leu Lys Lys Asp
         80                  85                  90
tgg aaa tcc agc att gtt cgc gcc gct atg ggc gtt cag gaa agc ggt     1778
Trp Lys Ser Ser Ile Val Arg Ala Ala Met Gly Val Gln Glu Ser Gly
     95                 100                 105
ggt tat ctg cag gac ccg gct ggc aac aag gcc aaa gtt gaa aga gtg     1826
Gly Tyr Leu Gln Asp Pro Ala Gly Asn Lys Ala Lys Val Glu Arg Val
110                 115                 120                 125
gtg gat gcc gca atc gcc aac gat atg tat gtg att att gac tgg cac     1874
Val Asp Ala Ala Ile Ala Asn Asp Met Tyr Val Ile Ile Asp Trp His
                130                 135                 140
tca cat tct gca gaa aac aat cgc agt gaa gcc att cgc ttc ttc cag     1922
Ser His Ser Ala Glu Asn Asn Arg Ser Glu Ala Ile Arg Phe Phe Gln
            145                 150                 155
gaa atg gcg cgc aaa tat ggc aac aag ccg aat gtc att tat gaa atc     1970
Glu Met Ala Arg Lys Tyr Gly Asn Lys Pro Asn Val Ile Tyr Glu Ile
       160                  165                 170
tac aac gag ccg ctt cag gtt tca tgg agc aat acc att aaa cct tat     2018
Tyr Asn Glu Pro Leu Gln Val Ser Trp Ser Asn Thr Ile Lys Pro Tyr
    175                 180                 185
gcc gaa gcc gtg att tcc gcc att cgc gcc att gac ccg gat aac ctg     2066
Ala Glu Ala Val Ile Ser Ala Ile Arg Ala Ile Asp Pro Asp Asn Leu
190                 195                 200                 205
att att gtc ggt acg ccc agt tgg tcg caa aac gtt gat gaa gcg tcg     2114
Ile Ile Val Gly Thr Pro Ser Trp Ser Gln Asn Val Asp Glu Ala Ser
                210                 215                 220
cgc gat cca atc aac gcc aag aat atc gcc tat acg ctg cat ttc tac     2162
Arg Asp Pro Ile Asn Ala Lys Asn Ile Ala Tyr Thr Leu His Phe Tyr
            225                 230                 235
gcg gga acc cat ggt gag tca tta cgc act aaa gcc cgc cag gcg tta     2210
Ala Gly Thr His Gly Glu Ser Leu Arg Thr Lys Ala Arg Gln Ala Leu
        240                 245                 250
aat aac ggt att gcg ctt ttc gtc acc gag tgg ggc gcc gtt aac gcg    2258
Asn Asn Gly Ile Ala Leu Phe Val Thr Glu Trp Gly Ala Val Asn Ala
    255                 260                 265
gac ggc aat ggc gga gtg aac cag aca gat acc gac gcc tgg gta acg    2306
Asp Gly Asn Gly Gly Val Asn Gln Thr Asp Thr Asp Ala Trp Val Thr
270                 275                 280                 285
ttc atg cgt gac aac aac atc agc aac gca aac tgg gcg tta aat gat    2354
Phe Met Arg Asp Asn Asn Ile Ser Asn Ala Asn Trp Ala Leu Asn Asp
                290                 295                 300
aaa agc gaa ggg gca tca acc tat tat ccg gac tct aaa aac ctg acc    2402
Lys Ser Glu Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Lys Asn Leu Thr
            305                 310                 315
gag tcg ggt aaa ata gta aaa tcg atc att caa agc tgg cca tat aaa    2450
Glu Ser Gly Lys Ile Val Lys Ser Ile Ile Gln Ser Trp Pro Tyr Lys
        320                 325                 330
gcg ggc agc gcc gcc agt aca aca acc gat cag tca acc gat acc acc    2498
Ala Gly Ser Ala Ala Ser Thr Thr Thr Asp Gln Ser Thr Asp Thr Thr
    335                 340                 345
atg gca cca ccg ttg acg aac cga cca caa ccg aca cac cgg caa acc    2546
Met Ala Pro Pro Leu Thr Asn Arg Pro Gln Pro Thr His Arg Gln Thr
350                 355                 360                 365
gct gat tgc tgc aat gcc aac gtt tac ccc aac tgg gtt agc aaa gac    2594
Ala Asp Cys Cys Asn Ala Asn Val Tyr Pro Asn Trp Val Ser Lys Asp
                370                 375                 380
tgg gcg ggc cgg cag cga ctc ata acg aag cag gcc aat cga tcg tct    2642
Trp Ala Gly Arg Gln Arg Leu Ile Thr Lys Gln Ala Asn Arg Ser Ser
            385                 390                 395
aca aag gga acc tgt ata ccg caa act ggt aca ctt cat ccg ttc cgg    2690
Thr Lys Gly Thr Cys Ile Pro Gln Thr Gly Thr Leu His Pro Phe Arg
        400                 405                 410
gca gcg att cct cct ggg cac agg ttg gta gct gta act aat tga        2735
Ala Ala Ile Pro Pro Gly His Arg Leu Val Ala Val Thr Asn
    415                 420                 425
ttaatctttt cacccccaaa ataacagggc tgcgattgca gcctgatacg caacattcca  2795
ttacttaatt gcgttcaaaa gcgcccaaat ccggtgcgct gccttgtaac taatatgatt  2855
tctctttcgt acccgcgtta atcagctttg agttagccga cagacggaac agcgaggttg  2915
ccggcaacgt gccgtcatta tcacgagata cggtagccag cgaggtgtcc aggctgacga  2975
atcggacgcg gaagccgctg tccgtatcca tgagttgact cgcatccgca ttactgaccg  3035
ttgcagaagc agacagagac acgttgttgc ggaagtaatg tttctgtcct gactggacgt  3095
tgctcccgaa agcataatta atgccgtttt tatatgacgt gttatttatt accgtacgcc  3155
gccgcgttat tgttctggtc aaaacctttg ctcacgttgc caaacgcgac gcaacgggta   3215
atgcgatgat tgccgaccgc tggttcctcc cagtttgaac ccgttggcat tgccggcgaa   3275
cgcgctnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn   3335
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn   3395
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn   3455
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn   3515
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn   3575
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn   3635
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn   3695
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn   3755
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn   3815
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn   3875
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn   3935
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn   3995
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn   4055
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn   4115
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn   4175
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn   4235
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnngatc ctctagagtc   4295
gacctgcagg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt   4355
tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga   4415
ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat ggcgcctgat   4475
gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcataggcg cgcctatggt   4535
gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa   4595
cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg   4655
tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga   4715
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt   4775
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt   4835
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat   4895
aatattgaaa aaggaagagt atg agt att caa cat ttc cgt gtc gcc ctt att   4948
                      Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile
                       1                                   10
ccc ttt ttt gcg gca ttt tgc ctt cct gtt ttt gct cac cca gaa acg    4996
Pro Phe Phe Ala Ala Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His Pro Glu Thr
                                 20
ctg gtg aaa gta aaa gat gct gaa gat cag ttg ggt gca cga gtg ggt    5044
Leu Val Lys Val Lys Asp Ala Glu Asp Gln Leu Gly Ala Arg Val Gly
        30                                       40
tac atc gaa ctg gat ctc aac agc ggt aag atc ctt gag agt ttt cgc    5092
Tyr Ile Glu Leu Asp Leu Asn Ser Gly Lys Ile Leu Glu Ser Phe Arg
                        50
ccc gaa gaa cgt ttt cca atg atg agc act ttt aaa gtt ctg cta tgt    5140
Pro Glu Glu Arg Phe Pro Met Met Ser Thr Phe Lys Val Leu Leu Cys
 60                                      70
ggc gcg gta tta tcc cgt att gac gcc ggg caa gag caa ctc ggt cgc    5188
Gly Ala Val Leu Ser Arg Ile Asp Ala Gly Gln Glu Gln Leu Gly Arg
                 80                                      90
cgc ata cac tat tct cag aat gac ttg gtt gag tac tca cca gtc aca    5236
Arg Ile His Tyr Ser Gln Asn Asp Leu Val Glu Tyr Ser Pro Val Thr
                                100
gaa aag cat ctt acg gat ggc atg aca gta aga gaa tta tgc agt gct    5284
Glu Lys His Leu Thr Asp Gly Met Thr Val Arg Glu Leu Cys Ser Ala
        110                                     120
gcc ata acc atg agt gat aac act gcg gcc aac tta ctt ctg aca acg    5332
Ala Ile Thr Met Ser Asp Asn Thr Ala Ala Asn Leu Leu Leu Thr Thr
                        130
atc gga gga ccg aag gag cta acc gct ttt ttg cac aac atg ggg gat    5380
Ile Gly Gly Pro Lys Glu Leu Thr Ala Phe Leu His Asn Met Gly Asp
140                                     150
cat gta act cgc ctt gat cgt tgg gaa ccg gag ctg aat gaa gcc ata    5428
His Val Thr Arg Leu Asp Arg Trp Glu Pro Glu Leu Asn Glu Ala Ile
                160                                     170
cca aac gac gag cgt gac acc acg atg cct gta gca atg gca aca acg    5476
Pro Asn Asp Glu Arg Asp Thr Thr Met Pro Val Ala Met Ala Thr Thr
                                180
ttg cgc aaa cta tta act ggc gaa cta ctt act cta gct tcc cgg caa    5524
Leu Arg Lys Leu Leu Thr Gly Glu Leu Leu Thr Leu Ala Ser Arg Gln
       190                                      100
caa tta ata gac tgg atg gag gcg gat aaa gtt gca gga cca ctt ctg    5572
Gln Leu Ile Asp Trp Met Glu Ala Asp Lys Val Ala Gly Pro Leu Leu
                        110
cgc tcg gcc ctt ccg gct ggc tgg ttt att gct gat aaa tct gga gcc    5620
Arg Ser Ala Leu Pro Ala Gly Trp Phe Ile Ala Asp Lys Ser Gly Ala
120                                     130
ggt gag cgt ggg tct cgc ggt atc att gca gca ctg ggg cca gat ggt    5668
Gly Glu Arg Gly Ser Arg Gly Ile Ile Ala Ala Leu Gly Pro Asp Gly
               140                                      150
aag ccc tcc cgt atc gta gtt atc tac acg acg ggg agt cag gca act    5716
Lys Pro Ser Arg Ile Val Val Ile Tyr Thr Thr Gly Ser Gln Ala Thr
                                160
atg gat gaa cga aat aga cag atc gct gag ata ggt gcc tca ctg att    5764
Met Asp Glu Arg Asn Arg Gln Ile Ala Glu Ile Gly Ala Ser Leu Ile
        170                                     180
aag cat tgg taa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt        5816
Lys His Trp
    185
taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga  5876
ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca  5936
aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac  5996
caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg  6056
taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag  6116
gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac  6176
cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt  6236
taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg  6296
agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc  6356
ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc  6416
gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc  6476
acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa  6536
acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt  6596
tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg  6656
ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggcgc  6716
gccagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta  6776
atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa  6836
tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat  6896
gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta  6956
cgccaagctt gcatgccaat tctcatgttt gacagcttat catcgataag ctttaatgcg  7016
gtagtttatc acagttaaat tgctaacgca gtcaggcacc gtgt atg aaa tct aac   7072
                                                 Met Lys Ser Asn
aat gcg ctc atc gtc atc ctc ggc acc gtc acc ctg gat gct gta ggc    7120
Asn Ala Leu Ile Val Ile Leu Gly Thr Val Thr Leu Asp Ala Val Gly
                     10                                      20
ata ggc ttg gtt atg ccg gta ctg ccg ggc ctc ttg cgg gat atc gtc    7168
Ile Gly Leu Val Met Pro Val Leu Pro Gly Leu Leu Arg Asp Ile Val
                                     30
cat tcc gac agc atc gcc agt cac tat ggc gtg ctg cta gcg cta tat    7216
His Ser Asp Ser Ile Ala Ser His Tyr Gly Val Leu Leu Ala Leu Tyr
             40                                      50
gcg ttg atg caa ttt cta tgc gca ccc gtt ctc gga gca ctg tcc gac    7264
Ala Leu Met Gln Phe Leu Cys Ala Pro Val Leu Gly Ala Leu Ser Asp
                             60
cgc ttt ggc cgc cgc cca gtc ctg ctc gct tcg cta ctt gga gcc act    7312
Arg Phe Gly Arg Arg Pro Val Leu Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Thr
    70                                       80
atc gac tac gcg atc atg gcg acc aca ccc gtc ctg tgg atc ctc tac    7360
Ile Asp Tyr Ala Ile Met Ala Thr Thr Pro Val Leu Trp Ile Leu Tyr
                     90                                     100
gcc gga cgc atc gtg gcc ggc atc acc ggc gcc aca ggt gcg gtt gct    7408
Ala Gly Arg Ile Val Ala Gly Ile Thr Gly Ala Thr Gly Ala Val Ala
                                    110
ggc gcc tat atc gcc gac atc acc gat ggg gaa gat cgg gct cgc cac    7456
Gly Ala Tyr Ile Ala Asp Ile Thr Asp Gly Glu Asp Arg Ala Arg His
            120                                     130
ttc ggg ctc atg agc gct tgt ttc ggc gtg ggt atg gtg gca ggc ccc    7504
Phe Gly Leu Met Ser Ala Cys Phe Gly Val Gly Met Val Ala Gly Pro
                            140
gtg gcc ggg gga ctg ttg ggc gcc atc tcc ttg cat gca cca ttc ctt    7552
Val Ala Gly Gly Leu Leu Gly Ala Ile Ser Leu His Ala Pro Phe Leu
    150                                     160
gcg gcg gcg gtg ctc aac ggc ctc aac cta cta ctg ggc tgc ttc cta    7600
Ala Ala Ala Val Leu Asn Gly Leu Asn Leu Leu Leu Gly Cys Phe Leu
                    170                                     180
atg cag gag tcg cat aag gga gag cgt cga ccg atg ccc ttg aga gcc    7648
Met Gln Glu Ser His Lys Gly Glu Arg Arg Pro Met Pro Leu Arg Ala
                                    190
ttc aac cca gtc agc tcc ttc cgg tgg gcg cgg ggc atg act atc gtc    7696
Phe Asn Pro Val Ser Ser Phe Arg Trp Ala Arg Gly Met Thr Ile Val
            200                                     210
gcc gca ctt atg act gtc ttc ttt atc atg caa ctc gta gga cag gtg    7744
Ala Ala Leu Met Thr Val Phe Phe Ile Met Gln Leu Val Gly Gln Val
                            220
ccg gca gcg ctc tgg gtc att ttc ggc gag gac cgc ttt cgc tgg agc    7792
Pro Ala Ala Leu Trp Val Ile Phe Gly Glu Asp Arg Phe Arg Trp Ser
     230                                    240
gcg acg atg atc ggc ctg tcg ctt gcg gta ttc gga atc ttg cac gcc    7840
Ala Thr Met Ile Gly Leu Ser Leu Ala Val Phe Gly Ile Leu His Ala
                    250                                     260
ctc gct caa gcc ttc gtc act ggt ccc gcc acc aaa cgt ttc ggc gag    7888
Leu Ala Gln Ala Phe Val Thr Gly Pro Ala Thr Lys Arg Phe Gly Glu
                                    270
aag cag gcc att atc gcc ggc atg gcg gcc gac gcg ctg ggc tac gtc    7936
Lys Gln Ala Ile Ile Ala Gly Met Ala Ala Asp Ala Leu Gly Tyr Val
            180                                     190
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Leu Leu Ala Phe Ala Thr Arg Gly Trp Met Ala Phe Pro Ile Met Ile
                            200
ctt ctc gct tcc ggc ggc atc ggg atg ccc gcg ttg cag gcc atg ctg    8032
Leu Leu Ala Ser Gly Gly Ile Gly Met Pro Ala Leu Gln Ala Met Leu
    210                                     220
tcc agg cag gta gat gac gac cat cag gga cag ctt caa gga tcg ctc    8080
Ser Arg Gln Val Asp Asp Asp His Gln Gly Gln Leu Gln Gly Ser Leu
                    230                                     240
gcg gct ctt acc agc cta act tcg atc act gga ccg ctg atc gtc acg    8128
Ala Ala Leu Thr Ser Leu Thr Ser Ile Thr Gly Pro Leu Ile Val Thr
                                    250
gcg att tat gcc gcc tcg gcg agc aca tgg aac ggg ttg gca tgg att    8176
Ala Ile Tyr Ala Ala Ser Ala Ser Thr Trp Asn Gly Leu Ala Trp Ile
            260                                     270
gta ggc gcc gcc cta tac ctt gtc tgc ctc ccc gcg ttg cgt cgc ggt    8224
Val Gly Ala Ala Leu Tyr Leu Val Cys Leu Pro Ala Leu Arg Arg Gly
                            280
gca tgg agc cgg gcc acc tcg acc tga atggaagccg gcggcacctc          8271
Ala Trp Ser Arg Ala Thr Ser Thr
    290
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnn                               11544

Claims (38)

1.一种重组宿主细胞，包括：
主要由受一种取代启动子转录控制的编码多糖酶多肽的序列组成的第一种异源多核苷酸片段，其中所述取代启动子主要由一段核苷酸序列组成，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；和
主要由编码一种分泌多肽的序列组成的第二种异源多核苷酸片段，
其中，所述第一和第二种多核苷酸片段的表达，会导致所述重组宿主细胞多糖酶产量的增加。
2.如权利要求1的重组宿主细胞，其中，产量的增加包括多糖酶活性的增加、多糖酶数量的增加，或多糖酶活性和数量的增加的组合。
3.如权利要求2的重组宿主细胞，其中，所述多糖酶多肽是分泌型的。
4.如权利要求2的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞是细菌细胞。
5.如权利要求4的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞。
6.如权利要求5的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞是兼性厌氧细菌细胞。
7.如权利要求6的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞选自肠杆菌科。
8.如权利要求7的重组宿主细胞，其中，所述宿主选自埃希氏菌和克雷伯氏菌。
9.如权利要求8的重组宿主细胞，其中，所述埃希氏菌选自下列一组：保藏号为ATCC11303的大肠杆菌B，大肠杆菌DH5α，保藏号为ATCC55123的大肠杆菌KO4，保藏号为ATCC55124的大肠杆菌KO11，保藏号为ATCC55125的大肠杆菌KO12，保藏号为ATCC PTA-3466的大肠杆菌LY01，保藏号为ATCC 68564的产酸克雷伯氏菌M5A1，或保藏号为ATCC55307的产酸克雷伯氏菌P2。
10.如权利要求1的重组宿主细胞，其中，所述多糖酶选自下列一组：葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维素生物水解酶、β-葡糖苷酶、内切-1，4-β-木聚糖酶、α-木糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂解酶、及其组合。
11.如权利要求10的重组宿主细胞，其中，所述多糖酶是葡聚糖酶。
12.如权利要求10的重组宿主细胞，其中，所述多糖酶是celZ基因的表达产物。
13.如权利要求12的重组宿主细胞，其中，所述celZ基因源于菊欧文氏菌。
14.如权利要求2的重组宿主细胞，其中，所述第二种异源多肽片段至少包括一个pul基因或out基因。
15.如权利要求2的重组宿主细胞，其中，所述第二种异源多肽片段源于选自肠杆菌科的细菌细胞。
16.如权利要求15的重组宿主细胞，其中，所述细菌细胞选自下列一组：产酸克雷伯氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜黑腐亚种和菊欧文氏菌。
17.如权利要求2的重组宿主细胞，其中，所述取代启动子含有源于运动发酵单胞菌的多核苷酸。
18.如权利要求17的重组宿主细胞，其中，所述取代启动子含有具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示序列的核酸。
19.如权利要求1-18中任一项的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞是产乙醇的。
20.一种酶促降解寡糖的方法，包括以下步骤：提供一种寡糖；和
让所述寡糖与一种宿主细胞接触，该宿主细胞含有包含受一种取代启动子转录控制的编码多糖酶的序列的第一种异源多核苷酸片段，其中所述取代启动子含有一段核苷酸序列，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、与SEQ ID NO：1相差不超过5个碱基的序列和与SEQID NO：2相差不超过5个碱基的序列；和
含有编码一种分泌多肽的序列的第二种异源多核苷酸片段，
其中，所述第一和第二种多核苷酸片段的表达，会导致所述重组宿主细胞所产生的多糖酶活性的增加，使得所述寡糖被酶促降解。
21.如权利要求20的方法，其中，所述多糖酶是分泌型的。
22.如权利要求20的方法，其中，所述宿主细胞是产乙醇的。
23.如权利要求20的方法，其中，所述方法是在水溶液中进行的。
24.如权利要求20的方法，其中，所述方法被用于同时糖化和发酵。
25.如权利要求20的方法，其中，所述寡糖选自下列一组：木质素纤维素、半纤维素、纤维素、果胶及其任意组合。
26.一种用寡糖源生产乙醇的方法，包括：
让所述寡糖源与产乙醇的宿主细胞接触，该细胞含有包含受一种取代启动子转录控制的编码多糖酶的序列的第一种异源多核苷酸片段，其中所述取代启动子含有一段核苷酸序列，所述核苷酸序列选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、与SEQ ID NO：1相差不超过5个碱基的序列和与SEQ ID NO：2相差不超过5个碱基的序列；和
含有编码一种分泌多肽的序列的第二种异源多核苷酸片段，
其中，所述第一和第二种多核苷酸片段的表达，会导致所述产乙醇细胞的多糖酶活性的生产增加，使得所述寡糖被酶促降解，并发酵成乙醇。
27.如权利要求26的方法，其中，所述多糖酶选自下列一组：葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维素生物水解酶、α-葡糖苷酶、内切-1，4-α-木聚糖酶、β-木糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、乙酰木聚糖酯酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶水解酶、果胶酸裂解酶、或其组合。
28.如权利要求27的方法，其中，所述多糖酶是葡聚糖酶。
29.如权利要求28的方法，其中，所述葡聚糖酶是celZ基因的表达产物。
30.如权利要求29的方法，其中，所述celZ基因源于菊欧文氏菌。
31.如权利要求26的方法，其中，所述第二种异源多肽片段至少包括一个pul基因或out基因。
32.如权利要求26的方法，其中，所述宿主细胞选自肠杆菌科。
33.如权利要求26的方法，其中，所述宿主细胞选自埃希氏菌和克雷伯氏菌。
34.如权利要求26的方法，其中，所述宿主细胞选自下列一组：保藏号为ATCC55123的大肠杆菌KO4，保藏号为ATCC55124的大肠杆菌KO11，保藏号为ATCC55125的大肠杆菌KO12，保藏号为ATCC68564的产酸克雷伯氏菌M5A1，或保藏号为ATCC55307的产酸克雷伯氏菌P2。
35.如权利要求26的方法，其中，所述多糖酶具有增强了的活性。
36.如权利要求26的方法，其中，所述方法是在水溶液中进行的。
37.如权利要求26的方法，其中，所述寡糖选自下列一组：木质素纤维素、半纤维素、纤维素、果胶及其任意组合。
38.如权利要求26的方法，其中，所述第一种异源多核苷酸片段是SEQ ID NO：12或选自：从SEQ ID NO：12直接克隆的异源多核苷酸、通过PCR扩增从SEQ ID NO：12获得的异源多核苷酸、从SEQ ID NO：12人工合成的异源多核苷酸、与SEQ ID NO：12相差不超过5个碱基的异源多核苷酸。
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