JP2003500058A - 同時糖化発酵に適した組換えホスト - Google Patents
同時糖化発酵に適した組換えホストInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、多糖分解酵素の発現を増加させることのできるサロゲート・プロモータの転写制御下にある多糖分解酵素をコードする少なくとも一つの異種のポリヌクレオチドを含有する組換えホスト細胞を提供する。加えて、さらに本発明は、発現した多糖分解酵素の分泌を促す分泌タンパク質をコードする遺伝子を持つこのようなホストも提供する。本発明の好適なホストはエタノール生成性であり、また同時糖化発酵を行うことで、複合セルロース基質からエタノールを生成することができる。
Description
【０００１】
関連情報
本出願は、この言及をもってその全文をここに編入することとする、１９９９
年５月２６日提出の標題「同時糖化発酵に適した組換えホスト」の米国暫定出願
６０／１３６，３７６号の優先権を主張するものである。この明細書を通じて引
用された全特許、特許出願、及び参考文献の内容全体を、言及をもってここに編
入する。
年５月２６日提出の標題「同時糖化発酵に適した組換えホスト」の米国暫定出願
６０／１３６，３７６号の優先権を主張するものである。この明細書を通じて引
用された全特許、特許出願、及び参考文献の内容全体を、言及をもってここに編
入する。
【０００２】
政府支援を受けた研究
本研究は、一部、米国農務省、ナショナル・リサーチ・イニシアチブ（95-373
08-1843；98-35504-6177）、及び米国エネルギー省（DE-FG02-96ER20222）から
助成金を受けたものである。
08-1843；98-35504-6177）、及び米国エネルギー省（DE-FG02-96ER20222）から
助成金を受けたものである。
【０００３】
発明の背景
石油を基にした自動車燃料を、植物材料から得られる再生可能燃料に代替でき
れば、環境面及び社会面で多くの利益が得られるであろう（Lynd et al., (1991
) Science 251:1318-1323; Olson et al., (1996) Enzyme Microb. Technol. 18
:1-17; Wyman et al., (1995) Amer. Chem. Soc. Symp. 618:272-290）。毎年、
米国では１２００億ガロンを越える自動車燃料が消費されるが、これは輸入され
る石油の合計量に匹敵する。再生可能な代替燃料としてのエタノールの開発によ
って、米国の輸入石油への依存を無くし、環境を向上させ、新しい雇用を創出で
きるという可能性がある（Sheehan, (1994) ACS Symposium Series No. 566, AC
S Press, pp1-53）。
れば、環境面及び社会面で多くの利益が得られるであろう（Lynd et al., (1991
) Science 251:1318-1323; Olson et al., (1996) Enzyme Microb. Technol. 18
:1-17; Wyman et al., (1995) Amer. Chem. Soc. Symp. 618:272-290）。毎年、
米国では１２００億ガロンを越える自動車燃料が消費されるが、これは輸入され
る石油の合計量に匹敵する。再生可能な代替燃料としてのエタノールの開発によ
って、米国の輸入石油への依存を無くし、環境を向上させ、新しい雇用を創出で
きるという可能性がある（Sheehan, (1994) ACS Symposium Series No. 566, AC
S Press, pp1-53）。
【０００４】
理論的には、自動車燃料用輸入石油の問題は大変容易に解決できると思われる
。有限の資源である石油を使う代わりに、エタノールを、植物材料という再生可
能資源を発酵させれば効率的に生成できる。実際、ブラジルでは、エタノール生
成や、主要な自動車燃料としてのエタノールの利用の実現性が、２０年以上もか
けて実証されてきた。同様に、米国では、１２億ガロンの燃料エタノールが毎年
生成されている。現在のところ、燃料エタノールはサッカロミセス−セレビジエ
（Saccharomyces cerevisiae）又はジモモナス−モビリス（Zymomonas mobilis
）（Z. mobilis）を用いてコーン・スターチ又はサトウキビから生成されている
。しかしながら、これらの糖原料のいずれも、石油を基にした自動車燃料の代替
を実現するのに必要な量を提供できていない。加えて、サトウキビ及びコーン・
スターチの両方ともが、比較的に高価な出発材料であり、食料品という競合する
用途がある。
。有限の資源である石油を使う代わりに、エタノールを、植物材料という再生可
能資源を発酵させれば効率的に生成できる。実際、ブラジルでは、エタノール生
成や、主要な自動車燃料としてのエタノールの利用の実現性が、２０年以上もか
けて実証されてきた。同様に、米国では、１２億ガロンの燃料エタノールが毎年
生成されている。現在のところ、燃料エタノールはサッカロミセス−セレビジエ
（Saccharomyces cerevisiae）又はジモモナス−モビリス（Zymomonas mobilis
）（Z. mobilis）を用いてコーン・スターチ又はサトウキビから生成されている
。しかしながら、これらの糖原料のいずれも、石油を基にした自動車燃料の代替
を実現するのに必要な量を提供できていない。加えて、サトウキビ及びコーン・
スターチの両方ともが、比較的に高価な出発材料であり、食料品という競合する
用途がある。
【０００５】
さらに、これらの糖基質は、植物中の全糖質のうちのごく僅かな割合に過ぎな
い。実際、植物中の糖質の大部分はリグノセルロースという、セルロース、ヘミ
セルロース、ペクチン及びリグニンを含有する複合構造の重合体である。リグノ
セルロースは、例えば植物の茎、葉、外皮、殻及び穂軸に見られる。これらの重
合体が加水分解すると、グルコース、キシロース、マンノース、ガラクトース及
びアラビノースを含む中性の糖の混合物が遊離する。天然の生物で、これらの糖
すべてを迅速かつ効率的に代謝してエタノールにできるものは未知である。
い。実際、植物中の糖質の大部分はリグノセルロースという、セルロース、ヘミ
セルロース、ペクチン及びリグニンを含有する複合構造の重合体である。リグノ
セルロースは、例えば植物の茎、葉、外皮、殻及び穂軸に見られる。これらの重
合体が加水分解すると、グルコース、キシロース、マンノース、ガラクトース及
びアラビノースを含む中性の糖の混合物が遊離する。天然の生物で、これらの糖
すべてを迅速かつ効率的に代謝してエタノールにできるものは未知である。
【０００６】
にもかかわらず、この基質源を開発しようとする試みとして、ガルフ・オイル
・カンパニー社は、同時糖化発酵法（ＳＳＦ）と呼ばれる、酵母を基にしたプロ
セスを用いてセルロースからエタノールを生成する方法を開発した（Gauss et a
l. (1976) 米国特許第3,990,944号）。真菌セルラーゼ製剤及び酵母が、一個の
容器に入ったセルロース基質のスラリに加えられた。セルロースの加水分解の際
にエタノールが同時に生成された。しかしながら、ガルフ社のＳＳＦ法にはいく
つかの欠点がある。例えば真菌セルラーゼは、これまでのところ、大規模なバイ
オエタノール法で用いるには高価であると考えられている（Himmel et al., (19
97) Amer. Chem. Soc. pp. 2-45; Ingram et al., (1997) Appl. Environ. Micr
obiol. 53:2420-2425; Okamoto et al., (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol.
42:563-568; Philippidis, G., (1994) Amer. Chem. Soc. pp. 188-217; Saito
et al., (1990) J. Ferment. Bioeng. 69:282-286; Sheehan, J., (1994) Amer
. Chem. Soc. pp1-52; Su et al., (1993) Biotechnol. Lett. 15:979-984）。
・カンパニー社は、同時糖化発酵法（ＳＳＦ）と呼ばれる、酵母を基にしたプロ
セスを用いてセルロースからエタノールを生成する方法を開発した（Gauss et a
l. (1976) 米国特許第3,990,944号）。真菌セルラーゼ製剤及び酵母が、一個の
容器に入ったセルロース基質のスラリに加えられた。セルロースの加水分解の際
にエタノールが同時に生成された。しかしながら、ガルフ社のＳＳＦ法にはいく
つかの欠点がある。例えば真菌セルラーゼは、これまでのところ、大規模なバイ
オエタノール法で用いるには高価であると考えられている（Himmel et al., (19
97) Amer. Chem. Soc. pp. 2-45; Ingram et al., (1997) Appl. Environ. Micr
obiol. 53:2420-2425; Okamoto et al., (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol.
42:563-568; Philippidis, G., (1994) Amer. Chem. Soc. pp. 188-217; Saito
et al., (1990) J. Ferment. Bioeng. 69:282-286; Sheehan, J., (1994) Amer
. Chem. Soc. pp1-52; Su et al., (1993) Biotechnol. Lett. 15:979-984）。
【０００７】
発明の概要
セルロースを加水分解するための安価な酵素法の開発は、基質資化の効率や、
糖化及び発酵法の経済効率を向上させる大きな可能性を孕んでいる。従って、複
合セルロース基質を効率的に脱重合させ、その後その基質を急速に発酵させてエ
タノールにするのに利用できる生体触媒を開発できれば、利点が大きいと考えら
れる。
糖化及び発酵法の経済効率を向上させる大きな可能性を孕んでいる。従って、複
合セルロース基質を効率的に脱重合させ、その後その基質を急速に発酵させてエ
タノールにするのに利用できる生体触媒を開発できれば、利点が大きいと考えら
れる。
【０００８】
本発明は、複合糖質を脱重合させるのに適した多糖分解酵素の発現及び分泌を
増加させるよう操作した組換えホスト細胞を提供するものである。具体的に例示
したのは、サロゲートプロモータの転写制御下で多糖分解酵素を高レベルで発現
する二つの組換え腸内細菌、エシェリヒア−コリ（Escherichia coli）及びクレ
ブシエラ−オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、である。本発明は、これらのホ
ストをさらに改変して、細胞中の多糖分解酵素の産生を増加させられるよう分泌
タンパク質を含めることを提案する。ある好適な実施例では、この多糖分解酵素
は、量が増加した状態で産生されるか、活性が向上した状態で産生されるか、又
は、これらの組合せで産生される。ある好適な実施例では、本発明は、これらの
ホストをさらに改変して、例えばジモモナス−モビリス（Zymomonas mobilis）
など、効率的なエタノール生成生物を由来とする外来のエタノール生成遺伝子を
含めることを提案する。従って、これらのホストは、高レベルのタンパク質を発
現することができ、複合糖質からエタノールを効率的に生成できるよう、このタ
ンパク質を単独で用いても、又は、他の酵素又は組換えホストと組み合わせて用
いてもよい。
増加させるよう操作した組換えホスト細胞を提供するものである。具体的に例示
したのは、サロゲートプロモータの転写制御下で多糖分解酵素を高レベルで発現
する二つの組換え腸内細菌、エシェリヒア−コリ（Escherichia coli）及びクレ
ブシエラ−オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、である。本発明は、これらのホ
ストをさらに改変して、細胞中の多糖分解酵素の産生を増加させられるよう分泌
タンパク質を含めることを提案する。ある好適な実施例では、この多糖分解酵素
は、量が増加した状態で産生されるか、活性が向上した状態で産生されるか、又
は、これらの組合せで産生される。ある好適な実施例では、本発明は、これらの
ホストをさらに改変して、例えばジモモナス−モビリス（Zymomonas mobilis）
など、効率的なエタノール生成生物を由来とする外来のエタノール生成遺伝子を
含めることを提案する。従って、これらのホストは、高レベルのタンパク質を発
現することができ、複合糖質からエタノールを効率的に生成できるよう、このタ
ンパク質を単独で用いても、又は、他の酵素又は組換えホストと組み合わせて用
いてもよい。
【０００９】
より具体的には、一番目の態様では、本発明は、多糖分解酵素産生の増加した
組換えホスト細胞を特徴とする。この態様のホスト細胞は、多糖分解酵素をコー
ドする配列を含有する異種のポリヌクレオチド部分を含有し、前記配列は、サロ
ゲートプロモータの転写制御下にあり、そしてこのプロモータは、多糖分解酵素
の産生増加を引き起こすことができる。加えて、この態様は、分泌ポリペプチド
をコードする配列を含有する第二の異種のポリヌクレオチド部分をさらに含有し
たホスト細胞を特徴とする。この第一及び第二の異種のポリヌクレオチド部分が
発現する結果、その組換えホスト細胞による多糖分解酵素の産生量が増加するか
、酵素活性が増加するか、又はこれらの組合せが起きる。
組換えホスト細胞を特徴とする。この態様のホスト細胞は、多糖分解酵素をコー
ドする配列を含有する異種のポリヌクレオチド部分を含有し、前記配列は、サロ
ゲートプロモータの転写制御下にあり、そしてこのプロモータは、多糖分解酵素
の産生増加を引き起こすことができる。加えて、この態様は、分泌ポリペプチド
をコードする配列を含有する第二の異種のポリヌクレオチド部分をさらに含有し
たホスト細胞を特徴とする。この第一及び第二の異種のポリヌクレオチド部分が
発現する結果、その組換えホスト細胞による多糖分解酵素の産生量が増加するか
、酵素活性が増加するか、又はこれらの組合せが起きる。
【００１０】
好適な実施例の一つでは、前記多糖分解酵素ポリペプチドは分泌される。
【００１１】
別の実施例では、前記ホスト細胞は細菌細胞であり、好ましくはグラム陰性通
性嫌気性菌であり、エンテロバクテリアセエ（Enterobacteriaceae）科である。
別の関連する実施例では、組換えホスト細胞は、エシェリヒア（Escherichia）
属又はクレブシエラ（Klebsiella）属のものであり、好ましくは株E. コリ（col
i）B、E. コリDH5α、 Ｅ．コリ KO4（ATCC 55123）、E. コリKO11（ATCC 55124
）、Ｅ．コリ KO12(ATCC 55125)、Ｅ．コリ LY01、K. オキシトカ（oxytoca） M
5A1、K. オキシトカP2(ATCC 55307）である。
性嫌気性菌であり、エンテロバクテリアセエ（Enterobacteriaceae）科である。
別の関連する実施例では、組換えホスト細胞は、エシェリヒア（Escherichia）
属又はクレブシエラ（Klebsiella）属のものであり、好ましくは株E. コリ（col
i）B、E. コリDH5α、 Ｅ．コリ KO4（ATCC 55123）、E. コリKO11（ATCC 55124
）、Ｅ．コリ KO12(ATCC 55125)、Ｅ．コリ LY01、K. オキシトカ（oxytoca） M
5A1、K. オキシトカP2(ATCC 55307）である。
【００１２】
別の実施例では、前記組換えホストは、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、
エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド-1,4
-β-キシラナーゼ、α-キシロシダーゼ、α-グルクロニダーゼ、α-L-アラビノ
フラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α-
アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β-グルカナー
ゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素
、ペクテート融解酵素であるか、又はこれらの多糖分解酵素の組合せであっても
よい多糖分解酵素をコードするポリヌクレオチド部分を含有する。関連する実施
例では、前記多糖分解酵素は好ましくはグルカナーゼであり、より好ましくは、
celZ遺伝子の発現産物であり、そして最も好ましくはエルウィニア−クリサンセ
ミ（Erwinia Chrysanthemi）由来のものである。
エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド-1,4
-β-キシラナーゼ、α-キシロシダーゼ、α-グルクロニダーゼ、α-L-アラビノ
フラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α-
アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β-グルカナー
ゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素
、ペクテート融解酵素であるか、又はこれらの多糖分解酵素の組合せであっても
よい多糖分解酵素をコードするポリヌクレオチド部分を含有する。関連する実施
例では、前記多糖分解酵素は好ましくはグルカナーゼであり、より好ましくは、
celZ遺伝子の発現産物であり、そして最も好ましくはエルウィニア−クリサンセ
ミ（Erwinia Chrysanthemi）由来のものである。
【００１３】
さらに別の実施例では、前記組換えホスト細胞は、好ましくはエンテロバクテ
リアセエ科、より好ましくはＫ．オキシトカ（oxytoca）、Ｅ．カロトボーラ（c
arotovora）、Ｅ．カロトボーラ亜種カロトボーラ、Ｅ．カロトボーラ亜種アト
ロセプティカ（atroseptica）又はＥ．クリサンセミ（chrysanthemi）から選択
される細菌細胞由来のpul又はout遺伝子にコードされた分泌ポリペプチドを発現
する。
リアセエ科、より好ましくはＫ．オキシトカ（oxytoca）、Ｅ．カロトボーラ（c
arotovora）、Ｅ．カロトボーラ亜種カロトボーラ、Ｅ．カロトボーラ亜種アト
ロセプティカ（atroseptica）又はＥ．クリサンセミ（chrysanthemi）から選択
される細菌細胞由来のpul又はout遺伝子にコードされた分泌ポリペプチドを発現
する。
【００１４】
更なる実施例では、前記組換えホスト細胞で遺伝子発現を作動させるサロゲー
ト・プロモータは、ジモモナス−モビリス（Zymomonas mobilis）由来のポリヌ
クレオチド断片を由来とし、より好ましくは、SEQ ID NO:1に示した配列、又は
、この配列の一断片、である。
ト・プロモータは、ジモモナス−モビリス（Zymomonas mobilis）由来のポリヌ
クレオチド断片を由来とし、より好ましくは、SEQ ID NO:1に示した配列、又は
、この配列の一断片、である。
【００１５】
さらに別の実施例では、上記の態様及び前述の実施例のホスト細胞は、エタノ
ール生成性である。
ール生成性である。
【００１６】
二番目の態様では、本発明は、多糖分解酵素をコードする異種のポリヌクレオ
チド部分を含有する組換えエタノール生成性ホスト細胞を提供し、この部分は、
外来のサロゲートプロモータの転写制御下にある。
チド部分を含有する組換えエタノール生成性ホスト細胞を提供し、この部分は、
外来のサロゲートプロモータの転写制御下にある。
【００１７】
一実施例では、前記ホスト細胞は細菌細胞であり、好ましくはグラム陰性通性
嫌気性菌であり、エンテロバクテリアセエ科由来である。関連する実施例では、
前記組換えエタノール生成性ホスト細胞は、エシェリヒア（Escherichia）属又
はクレブシエラ（Klebsiella）属のものであり、好ましくは株E. コリB、E. コ
リDH5α、 E. コリ KO4（ATCC 55123）、E. コリ KO11（ATCC 55124）、E. コリ
KO12(ATCC 55125)、E. コリ LY01、Ｋ．オキシトカ M5A1、Ｋ．オキシトカP2(A
TCC 55307）である。
嫌気性菌であり、エンテロバクテリアセエ科由来である。関連する実施例では、
前記組換えエタノール生成性ホスト細胞は、エシェリヒア（Escherichia）属又
はクレブシエラ（Klebsiella）属のものであり、好ましくは株E. コリB、E. コ
リDH5α、 E. コリ KO4（ATCC 55123）、E. コリ KO11（ATCC 55124）、E. コリ
KO12(ATCC 55125)、E. コリ LY01、Ｋ．オキシトカ M5A1、Ｋ．オキシトカP2(A
TCC 55307）である。
【００１８】
別の実施例では、前記組換えホスト細胞は、グルカナーゼ、エンドグルカナー
ゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、α−グルコシダーゼ、エンド
-1,4-α-キシラナーゼ、β-キシロシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-アラ
ビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、
α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β-グルカ
ナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解
酵素、ペクテート融解酵素、又はこれらの多糖分解酵素の組合せである多糖分解
酵素をコードするポリヌクレオチド部分を含有する。関連する実施例では、前記
多糖分解酵素はグルカナーゼであり、好ましくは、celZ遺伝子の発現産物であり
、そしてより好ましくはエルウィニア−クリサンセミ（Erwinia Chrysanthemi）
由来のものである。
ゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、α−グルコシダーゼ、エンド
-1,4-α-キシラナーゼ、β-キシロシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-アラ
ビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、
α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β-グルカ
ナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解
酵素、ペクテート融解酵素、又はこれらの多糖分解酵素の組合せである多糖分解
酵素をコードするポリヌクレオチド部分を含有する。関連する実施例では、前記
多糖分解酵素はグルカナーゼであり、好ましくは、celZ遺伝子の発現産物であり
、そしてより好ましくはエルウィニア−クリサンセミ（Erwinia Chrysanthemi）
由来のものである。
【００１９】
別の実施例では、前記組換えホスト細胞で遺伝子発現を作動させるサロゲート
・プロモータは、ジモモナス−モビリス（Zymomonas mobilis）由来のポリヌク
レオチド断片を由来とし、より好ましくは、SEQ ID NO:1に示した配列、又は、
この配列の一断片、である。
・プロモータは、ジモモナス−モビリス（Zymomonas mobilis）由来のポリヌク
レオチド断片を由来とし、より好ましくは、SEQ ID NO:1に示した配列、又は、
この配列の一断片、である。
【００２０】
別の好適な実施例では、上記の態様及び前述の実施例は、エタノール生成性の
ホスト細胞を特徴とする。
ホスト細胞を特徴とする。
【００２１】
三番目の態様では、本発明は、第一のポリペプチドをコードする配列を含有す
る第一の異種のポリヌクレオチド部分と、分泌ポリペプチドをコードする配列を
含有する第二の異種のポリヌクレオチド部分と、を含有する組換えエタノール生
成性グラム陰性細菌ホスト細胞を特徴とし、前記第一の異種の多糖は、サロゲー
ト・プロモータの転写制御下にあり、このホスト細胞による前記第一のポリペプ
チドの産生が増加させられる。
る第一の異種のポリヌクレオチド部分と、分泌ポリペプチドをコードする配列を
含有する第二の異種のポリヌクレオチド部分と、を含有する組換えエタノール生
成性グラム陰性細菌ホスト細胞を特徴とし、前記第一の異種の多糖は、サロゲー
ト・プロモータの転写制御下にあり、このホスト細胞による前記第一のポリペプ
チドの産生が増加させられる。
【００２２】
一実施例では、前記第一のポリペプチドが分泌される。
【００２３】
別の実施例では、前記組換えホスト細胞は通性嫌気性細菌細胞である。関連す
る実施例では、前記ホスト細胞は、エンテロバクテリアセエ科由来、好ましくは
エシェリヒア（Escherichia）属又はクレブシエラ（Klebsiella）属のものであ
り、より好ましくは株E. コリ B、E. コリ DH5α、 E. コリ KO4（ATCC 55123）
、E. コリ KO11（ATCC 55124）、E. コリ KO12(ATCC 55125)、又はE. コリ LY01
、K. オキシトカM5A1、K. オキシトカP2(ATCC 55307）である。
る実施例では、前記ホスト細胞は、エンテロバクテリアセエ科由来、好ましくは
エシェリヒア（Escherichia）属又はクレブシエラ（Klebsiella）属のものであ
り、より好ましくは株E. コリ B、E. コリ DH5α、 E. コリ KO4（ATCC 55123）
、E. コリ KO11（ATCC 55124）、E. コリ KO12(ATCC 55125)、又はE. コリ LY01
、K. オキシトカM5A1、K. オキシトカP2(ATCC 55307）である。
【００２４】
別の実施例では、前記組換えホストの第一のポリペプチドは多糖分解酵素であ
り、好ましくは前記ポリペプチドの活性は増加している。関連する実施例では、
前記多糖分解酵素は、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ
、セロビオヒドロラーゼ、α-グルコシダーゼ、エンド-1,4-α-キシラナーゼ、
β-キシロシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-アラビノフラノシダーゼ、ア
セチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α-アミラーゼ、β-アミ
ラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β-グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ
、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、ペクテート融解酵
素、又はこれらの多糖分解酵素の組合せである。
り、好ましくは前記ポリペプチドの活性は増加している。関連する実施例では、
前記多糖分解酵素は、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ
、セロビオヒドロラーゼ、α-グルコシダーゼ、エンド-1,4-α-キシラナーゼ、
β-キシロシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-アラビノフラノシダーゼ、ア
セチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α-アミラーゼ、β-アミ
ラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β-グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ
、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、ペクテート融解酵
素、又はこれらの多糖分解酵素の組合せである。
【００２５】
ある好適な実施例では、前記組換えホストの第一のポリペプチドは多糖分解酵
素グルカナーゼであり、好ましくは、celZ遺伝子の発現産物であり、そしてより
好ましくはエルウィニア−クリサンセミ（Erwinia Chrysanthemi）由来のもので
ある。
素グルカナーゼであり、好ましくは、celZ遺伝子の発現産物であり、そしてより
好ましくはエルウィニア−クリサンセミ（Erwinia Chrysanthemi）由来のもので
ある。
【００２６】
別の実施例では、前記組換えホスト細胞の第二の異種のポリヌクレオチド部分
は、少なくとも一個のpul遺伝子又はout遺伝子を含有し、好ましくはこのpul遺
伝子又はout遺伝子は、エンテロバクテリアセエ科の細菌細胞由来、より好まし
くはＫ．オキシトカ（oxytoca）、Ｅ．カロトボーラ（carotovora）、Ｅ．カロ
トボーラ亜種カロトボーラ、Ｅ．カロトボーラ亜種アトロセプティカ（atrosept
ica）又はＥ．クリサンセミ（chrysanthemi）由来であるとよい。
は、少なくとも一個のpul遺伝子又はout遺伝子を含有し、好ましくはこのpul遺
伝子又はout遺伝子は、エンテロバクテリアセエ科の細菌細胞由来、より好まし
くはＫ．オキシトカ（oxytoca）、Ｅ．カロトボーラ（carotovora）、Ｅ．カロ
トボーラ亜種カロトボーラ、Ｅ．カロトボーラ亜種アトロセプティカ（atrosept
ica）又はＥ．クリサンセミ（chrysanthemi）由来であるとよい。
【００２７】
四番目の態様では、本発明はオリゴ糖を酵素により分解させる方法を提供する
ものである。当該方法は、サロゲート・プロモータの転写制御下にある多糖分解
酵素をコードする配列を含有する第一の異種のポリヌクレオチド部分を含有する
ホスト細胞に、オリゴ糖を接触させるステップを含む。さらに、このサロゲート
・プロモータは、多糖分解酵素の産生増加を引き起こすことができる。加えて、
上記方法の組換えホスト細胞は、さらに、分泌ポリペプチドをコードする配列を
含有する第二の異種のポリヌクレオチド部分を含有する。この態様では、ホスト
細胞内の前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、増加した量
の多糖分解酵素活性が生じて、オリゴ糖が酵素により分解される。好適な実施例
の一つでは、この多糖分解酵素は分泌される。
ものである。当該方法は、サロゲート・プロモータの転写制御下にある多糖分解
酵素をコードする配列を含有する第一の異種のポリヌクレオチド部分を含有する
ホスト細胞に、オリゴ糖を接触させるステップを含む。さらに、このサロゲート
・プロモータは、多糖分解酵素の産生増加を引き起こすことができる。加えて、
上記方法の組換えホスト細胞は、さらに、分泌ポリペプチドをコードする配列を
含有する第二の異種のポリヌクレオチド部分を含有する。この態様では、ホスト
細胞内の前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、増加した量
の多糖分解酵素活性が生じて、オリゴ糖が酵素により分解される。好適な実施例
の一つでは、この多糖分解酵素は分泌される。
【００２８】
上記態様の一実施例では、前記ホスト細胞はエタノール生成性である。別の実
施例では、前記方法は、水溶液中で行われる。さらに別の実施例では、前記方法
は、同時糖化発酵に利用される。また別の実施例では、前記オリゴ糖は好ましく
はリグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、又はこれらのオ
リゴ糖の何らかの組合せ、である。
施例では、前記方法は、水溶液中で行われる。さらに別の実施例では、前記方法
は、同時糖化発酵に利用される。また別の実施例では、前記オリゴ糖は好ましく
はリグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、又はこれらのオ
リゴ糖の何らかの組合せ、である。
【００２９】
五番目の態様では、本発明は、ホスト細胞中の目的遺伝子の発現を増加させる
ことのできるサロゲート・プロモータを特定する方法を特徴とする。当該方法は
、一生物から採ったゲノムポリヌクレオチドを、一つ又はそれ以上の断片に断片
化するステップと、目的遺伝子を、これらの断片のうちの少なくとも一つの転写
制御下に置くステップと、を含む。当該方法は、さらに、このような断片及び目
的遺伝子をホスト細胞内に導入するステップと、目的遺伝子の産生が増加してお
り、従って、この発現増加により、当該断片がサロゲート・プロモータであるこ
とが示されたホスト細胞を特定するステップと、を含む。
ことのできるサロゲート・プロモータを特定する方法を特徴とする。当該方法は
、一生物から採ったゲノムポリヌクレオチドを、一つ又はそれ以上の断片に断片
化するステップと、目的遺伝子を、これらの断片のうちの少なくとも一つの転写
制御下に置くステップと、を含む。当該方法は、さらに、このような断片及び目
的遺伝子をホスト細胞内に導入するステップと、目的遺伝子の産生が増加してお
り、従って、この発現増加により、当該断片がサロゲート・プロモータであるこ
とが示されたホスト細胞を特定するステップと、を含む。
【００３０】
六番目の態様では、本発明は、同時糖化発酵に利用できる組換えホスト細胞を
作成する方法を提供するものである。具体的には、当該方法は、多糖分解酵素ポ
リペプチドをサロゲート・プロモータの転写制御下にコードする配列を含有する
第一の異種のポリヌクレオチド部分をホスト細胞に導入するステップを含み、前
記プロモータは、この多糖分解酵素ポリペプチドの発現増加を引き起こすことが
できる。加えて、当該方法は、さらに、分泌ポリペプチドをコードする配列を含
有する第二の異種のポリヌクレオチド部分をホスト細胞に導入するステップを含
み、それにより、第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、この組
換えホスト細胞による多糖分解酵素ポリペプチドの産生が増加する。好適な実施
例の一つでは、多糖分解酵素ポリペプチドの産生増加は、活性の増加、量の増加
、又はこれらの組合せである。別の好適な実施例では、当該多糖分解酵素ポリペ
プチドは分泌される。より好適な実施例では、ホスト細胞はエタノール生成性で
ある。
作成する方法を提供するものである。具体的には、当該方法は、多糖分解酵素ポ
リペプチドをサロゲート・プロモータの転写制御下にコードする配列を含有する
第一の異種のポリヌクレオチド部分をホスト細胞に導入するステップを含み、前
記プロモータは、この多糖分解酵素ポリペプチドの発現増加を引き起こすことが
できる。加えて、当該方法は、さらに、分泌ポリペプチドをコードする配列を含
有する第二の異種のポリヌクレオチド部分をホスト細胞に導入するステップを含
み、それにより、第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、この組
換えホスト細胞による多糖分解酵素ポリペプチドの産生が増加する。好適な実施
例の一つでは、多糖分解酵素ポリペプチドの産生増加は、活性の増加、量の増加
、又はこれらの組合せである。別の好適な実施例では、当該多糖分解酵素ポリペ
プチドは分泌される。より好適な実施例では、ホスト細胞はエタノール生成性で
ある。
【００３１】
七番目の態様では、本発明は、pLOI2306（SEQ ID NO:12）の配列を含んで成る
ベクタを特徴とする。
ベクタを特徴とする。
【００３２】
八番目の態様では、本発明は、前述のベクタを含んで成るホスト細胞を特徴と
する。
する。
【００３３】
九番目の態様では、本発明は、pLOI2306の配列を含んで成るベクタをホストに
導入するステップと、このベクタが安定に組み込まれたホスト細胞を特定するス
テップと、を含む、組換えホスト細胞組み込み体を作成する方法を特徴とする。
導入するステップと、このベクタが安定に組み込まれたホスト細胞を特定するス
テップと、を含む、組換えホスト細胞組み込み体を作成する方法を特徴とする。
【００３４】
十番目の態様では、本発明は、pLOI2306のポリヌクレオチド配列を含有するベ
クタをホスト細胞に導入するステップと、多糖分解酵素を発現しているホスト細
胞を特定するステップと、を包含する、多糖分解酵素をホスト細胞で発現させる
方法を特徴とする。ある好適な実施例では、上記態様の各々は、エタノール生成
性であるホスト細胞を特徴とする。
クタをホスト細胞に導入するステップと、多糖分解酵素を発現しているホスト細
胞を特定するステップと、を包含する、多糖分解酵素をホスト細胞で発現させる
方法を特徴とする。ある好適な実施例では、上記態様の各々は、エタノール生成
性であるホスト細胞を特徴とする。
【００３５】
十一番目の態様では、本発明は、多糖分解酵素をサロゲート・プロモータの転
写制御下にコードする配列を含んで成る第一の異種のポリヌクレオチド部分を含
有するエタノール生成性ホスト細胞にオリゴ糖源を接触させることにより、前記
オリゴ糖源からエタノールを生成する方法を提供するものである。さらに、前記
プロモータは、多糖分解酵素の発現増加を引き起こすことができる。加えて、前
記エタノール生成性ホストは、分泌ポリペプチドをコードする配列を含んで成る
第二の異種のポリヌクレオチド部分を含有する。このエタノール生成性ホスト細
胞内の前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、ホスト細胞に
より生成される多糖分解酵素活性が増加して、オリゴ糖源が酵素により分解され
、発酵してエタノールになる。
写制御下にコードする配列を含んで成る第一の異種のポリヌクレオチド部分を含
有するエタノール生成性ホスト細胞にオリゴ糖源を接触させることにより、前記
オリゴ糖源からエタノールを生成する方法を提供するものである。さらに、前記
プロモータは、多糖分解酵素の発現増加を引き起こすことができる。加えて、前
記エタノール生成性ホストは、分泌ポリペプチドをコードする配列を含んで成る
第二の異種のポリヌクレオチド部分を含有する。このエタノール生成性ホスト細
胞内の前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、ホスト細胞に
より生成される多糖分解酵素活性が増加して、オリゴ糖源が酵素により分解され
、発酵してエタノールになる。
【００３６】
一実施例では、前記組換えホストの第一のポリペプチドは多糖分解酵素であり
、そして好ましくは、このポリペプチドの活性が増加している。関連する一実施
例では、この多糖分解酵素はグルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカ
ナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、α-グルコシダーゼ、エンド-1,4-α-キシラナ
ーゼ、β-キシロシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-アラビノフラノシダー
ゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α-アミラーゼ、
β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β-グルカナーゼ、ヘミセル
ラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、ペクテート
融解酵素、又はこれらの多糖分解酵素の組合せである。
、そして好ましくは、このポリペプチドの活性が増加している。関連する一実施
例では、この多糖分解酵素はグルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカ
ナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、α-グルコシダーゼ、エンド-1,4-α-キシラナ
ーゼ、β-キシロシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-アラビノフラノシダー
ゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α-アミラーゼ、
β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β-グルカナーゼ、ヘミセル
ラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、ペクテート
融解酵素、又はこれらの多糖分解酵素の組合せである。
【００３７】
ある好適な実施例では、前記組換えホストの第一のポリペプチドは多糖分解酵
素グルカナーゼであり、好ましくは、celZ遺伝子の発現産物であり、そしてより
好ましくはエルウィニア−クリサンセミ（Erwinia Chrysanthemi）由来のもので
ある。
素グルカナーゼであり、好ましくは、celZ遺伝子の発現産物であり、そしてより
好ましくはエルウィニア−クリサンセミ（Erwinia Chrysanthemi）由来のもので
ある。
【００３８】
別の実施例では、前記組換えホスト細胞の第二の異種のポリヌクレオチド部分
は、少なくとも一個のpul遺伝子又はout遺伝子を含有し、好ましくはこのpul遺
伝子又はout遺伝子は、エンテロバクテリアセエ科の細菌細胞由来、より好まし
くはＫ．オキシトカ（oxytoca）、Ｅ．カロトボーラ（carotovora）、Ｅ．カロ
トボーラ亜種カロトボーラ、Ｅ．カロトボーラ亜種アトロセプティカ（atrosept
ica）又はＥ．クリサンセミ（chrysanthemi）由来であるとよい。
は、少なくとも一個のpul遺伝子又はout遺伝子を含有し、好ましくはこのpul遺
伝子又はout遺伝子は、エンテロバクテリアセエ科の細菌細胞由来、より好まし
くはＫ．オキシトカ（oxytoca）、Ｅ．カロトボーラ（carotovora）、Ｅ．カロ
トボーラ亜種カロトボーラ、Ｅ．カロトボーラ亜種アトロセプティカ（atrosept
ica）又はＥ．クリサンセミ（chrysanthemi）由来であるとよい。
【００３９】
別の実施例では、前記組換えホスト細胞は通性嫌気性細菌細胞である。関連す
る実施例では、前記ホスト細胞は、エンテロバクテリアセエ（Enterobacteriace
ae）科のものであり、好ましくはエシェリヒア（Escherichia）属又はクレブシ
エラ（Klebsiella）属のものであり、より好ましくは株E. コリ KO4（ATCC 5512
3）、E. コリ KO11（ATCC 55124）、E. コリ KO12(ATCC 55125)、K. オキシトカ
M5A1、又はK. オキシトカP2(ATCC 55307）である。
る実施例では、前記ホスト細胞は、エンテロバクテリアセエ（Enterobacteriace
ae）科のものであり、好ましくはエシェリヒア（Escherichia）属又はクレブシ
エラ（Klebsiella）属のものであり、より好ましくは株E. コリ KO4（ATCC 5512
3）、E. コリ KO11（ATCC 55124）、E. コリ KO12(ATCC 55125)、K. オキシトカ
M5A1、又はK. オキシトカP2(ATCC 55307）である。
【００４０】
別の実施例では、前記方法は、水溶液中で行われる。さらに別の実施例では、
前記方法は、同時糖化発酵に利用される。また別の実施例では、前記オリゴ糖は
好ましくはリグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、又はこ
れらのオリゴ糖の何らかの組合せ、である。
前記方法は、同時糖化発酵に利用される。また別の実施例では、前記オリゴ糖は
好ましくはリグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース、ペクチン、又はこ
れらのオリゴ糖の何らかの組合せ、である。
【００４１】
さらに別の実施例では、当該方法は、pLOI2306からなる群より選択されるプラ
スミドであるか、又は、pLOI2306からなる群より選択されるプラスミド由来であ
る、核酸作成物を用いる。
スミドであるか、又は、pLOI2306からなる群より選択されるプラスミド由来であ
る、核酸作成物を用いる。
【００４２】
本発明のその他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び請求の範囲から明白
であろう。
であろう。
【００４３】
発明の詳細な説明
発明の範囲全体が明確に理解されるよう、以下の定義を提供する。
【００４４】
Ｉ．定義
ここで用いられた用語「組換えホスト」は、例えば異種のポリヌクレオチド配
列を取り込ませることができるなど、また例えばこの異種のポリヌクレオチド配
列をトランスフェクトしてもよいような、遺伝子操作に適した細胞を包含するも
のとして意図されている。この細胞は微生物であっても、又はより高等な真核細
胞であってもよい。この用語は、最初にトランスフェクトした細胞の後代を包含
するものと意図されている。好適な実施例では、この細胞は、例えばグラム陰性
細菌細胞などの細菌細胞であり、この用語は、例えばエシェリヒア（Escherichi
a）、シゲラ（Shigella）、シトロバクター（Citrobacter）、サルモネラ（Salm
onella）、クレブシエラ（Klebsiella）、エンテロバクター（Enterobacter）、
エルウィニア（Erwinia）、クリュイベラ（Kluyvera）、セラチア（Serratia）
、セデセア（Cedecea）、モルガネラ（Morganella）、ハフニア（Hafnia）、エ
ドワージエラ（Edwardsiella）、プロビデンシア（Providencia）、プロテウス
（Proteus）、及びエルシニア（Yersinia）などのエンテロバクテリアセエ科の
あらゆる通性嫌気性グラム陰性細胞を包含するものとして意図されている。特に
好適な組換えホストは、エシェリヒア−コリ（Escherichia coli）又はクレブシ
エラ−オキシトカ（Klebsiella oxytoca）細胞である。
列を取り込ませることができるなど、また例えばこの異種のポリヌクレオチド配
列をトランスフェクトしてもよいような、遺伝子操作に適した細胞を包含するも
のとして意図されている。この細胞は微生物であっても、又はより高等な真核細
胞であってもよい。この用語は、最初にトランスフェクトした細胞の後代を包含
するものと意図されている。好適な実施例では、この細胞は、例えばグラム陰性
細菌細胞などの細菌細胞であり、この用語は、例えばエシェリヒア（Escherichi
a）、シゲラ（Shigella）、シトロバクター（Citrobacter）、サルモネラ（Salm
onella）、クレブシエラ（Klebsiella）、エンテロバクター（Enterobacter）、
エルウィニア（Erwinia）、クリュイベラ（Kluyvera）、セラチア（Serratia）
、セデセア（Cedecea）、モルガネラ（Morganella）、ハフニア（Hafnia）、エ
ドワージエラ（Edwardsiella）、プロビデンシア（Providencia）、プロテウス
（Proteus）、及びエルシニア（Yersinia）などのエンテロバクテリアセエ科の
あらゆる通性嫌気性グラム陰性細胞を包含するものとして意図されている。特に
好適な組換えホストは、エシェリヒア−コリ（Escherichia coli）又はクレブシ
エラ−オキシトカ（Klebsiella oxytoca）細胞である。
【００４５】
用語「異種のポリヌクレオチド部分」は、一つ又はそれ以上のポリペプチド、
又は、ポリペプチドの一部又はフラグメント、をコードするポリヌクレオチド部
分を包含するものと意図されている。異種のポリヌクレオチド部分は、例えば真
核生物、原核生物、ウィルス、又は合成のポリヌクレオチド断片など、いかなる
源を由来とするものでもよい。
又は、ポリペプチドの一部又はフラグメント、をコードするポリヌクレオチド部
分を包含するものと意図されている。異種のポリヌクレオチド部分は、例えば真
核生物、原核生物、ウィルス、又は合成のポリヌクレオチド断片など、いかなる
源を由来とするものでもよい。
【００４６】
用語「多糖分解酵素」又は「セルラーゼ」はここでは互換可能に用いられてお
り、セルロース、ヘミセルロース、及びペクチンを含んで成るリグノセルロース
などの複合糖質を含め、例えば二糖、三糖、オリゴ糖などのあらゆる結合した糖
部分の分解又は脱重合を触媒することのできるポリペプチドを包含するものと意
図されている。この用語は、エンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼの両方
を含むグルカナーゼや、β−グルコシダーゼなどのセルラーゼを包含するものと
意図されている。より具体的には、この用語は、例えばセロビオヒドロラーゼ、
エンド-1,4-β-キシラナーゼ、β-キシロシダーゼ、α-グルクロニダーゼ、α-L
-アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラ
ーゼ、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β-
グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加
水分解酵素、ペクテート融解酵素、又はこれらのセルラーゼのうちのいずれかの
組合せ、などを包含するものと意図されている。
り、セルロース、ヘミセルロース、及びペクチンを含んで成るリグノセルロース
などの複合糖質を含め、例えば二糖、三糖、オリゴ糖などのあらゆる結合した糖
部分の分解又は脱重合を触媒することのできるポリペプチドを包含するものと意
図されている。この用語は、エンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼの両方
を含むグルカナーゼや、β−グルコシダーゼなどのセルラーゼを包含するものと
意図されている。より具体的には、この用語は、例えばセロビオヒドロラーゼ、
エンド-1,4-β-キシラナーゼ、β-キシロシダーゼ、α-グルクロニダーゼ、α-L
-アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラ
ーゼ、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β-
グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加
水分解酵素、ペクテート融解酵素、又はこれらのセルラーゼのうちのいずれかの
組合せ、などを包含するものと意図されている。
【００４７】
用語「サロゲート・プロモータ」は、天然では転写上制御しない目的遺伝子を
転写上制御できるポリヌクレオチド部分を包含するものと意図されている。好適
な実施例の一つでは、サロゲート・プロモータによる転写制御の結果、目的遺伝
子の発現が増加する。好適な実施例の一つでは、サロゲート・プロモータは目的
遺伝子の５’末端側に位置する。サロゲート・プロモータを天然のプロモータの
代わりに用いてもよく、又は、天然のプロモータに加えて用いてもよい。サロゲ
ート・プロモータはそれが用いられるホスト細胞にとって内生のものでもよく、
又は、例えばそれが用いられるホスト細胞にとって外来であるなど、ホスト細胞
に導入される異種のポリヌクレオチド配列であってもよい。
転写上制御できるポリヌクレオチド部分を包含するものと意図されている。好適
な実施例の一つでは、サロゲート・プロモータによる転写制御の結果、目的遺伝
子の発現が増加する。好適な実施例の一つでは、サロゲート・プロモータは目的
遺伝子の５’末端側に位置する。サロゲート・プロモータを天然のプロモータの
代わりに用いてもよく、又は、天然のプロモータに加えて用いてもよい。サロゲ
ート・プロモータはそれが用いられるホスト細胞にとって内生のものでもよく、
又は、例えばそれが用いられるホスト細胞にとって外来であるなど、ホスト細胞
に導入される異種のポリヌクレオチド配列であってもよい。
【００４８】
用語「オリゴ糖源」、「オリゴ糖」、「複合セルロース」、「複合糖質」、及
び「多糖」は基本的には互換可能に用いられており、二つ以上の糖分子を含んで
成るあらゆる糖質源を包含するものと意図されている。これらの糖質は、未処理
の植物材料を由来としても、又は処理済みの植物材料を由来としていてもよい。
その例は、木材、紙、パルプ、植物由来繊維、又は、二つ以上の糖質部分が結合
したもの、即ち一個の糖残基、を含んで成る合成繊維である。オリゴ糖源の具体
的な例の一つは、大半の植物材料の乾燥重量のほぼ９０％を占めると共に、セル
ロース、ヘミセルロース、ペクチンなどの糖質と、リグニンなどの芳香族重合体
とを含有するリグノセルロースである。セルロースはリグノセルロースの乾燥重
量の３０から５０％を構成し、セロビオース（グルコースの二量体）のホモ重合
体である。同様に、ヘミセルロースはリグノセルロースの乾燥重量の２０から５
０％を構成し、アセチル及びグロクロニル側鎖を含有する、ペントース（キシロ
ース、アラビノース）及びヘキソース（グルコース、マンノース、ガラクトース
）糖の混合物を含有する複合重合体である。ペクチンはリグノセルロースの乾燥
重量の１から２０％を構成し、グルクロン酸のメチル化ホモ重合体である。上記
の糖質重合体のいずれか一つ又は組合せも、本発明の生成物及び方法に基づく脱
重合や、それに続く発酵によるエタノールへの生物変換反応を行わせる糖源候補
である。
び「多糖」は基本的には互換可能に用いられており、二つ以上の糖分子を含んで
成るあらゆる糖質源を包含するものと意図されている。これらの糖質は、未処理
の植物材料を由来としても、又は処理済みの植物材料を由来としていてもよい。
その例は、木材、紙、パルプ、植物由来繊維、又は、二つ以上の糖質部分が結合
したもの、即ち一個の糖残基、を含んで成る合成繊維である。オリゴ糖源の具体
的な例の一つは、大半の植物材料の乾燥重量のほぼ９０％を占めると共に、セル
ロース、ヘミセルロース、ペクチンなどの糖質と、リグニンなどの芳香族重合体
とを含有するリグノセルロースである。セルロースはリグノセルロースの乾燥重
量の３０から５０％を構成し、セロビオース（グルコースの二量体）のホモ重合
体である。同様に、ヘミセルロースはリグノセルロースの乾燥重量の２０から５
０％を構成し、アセチル及びグロクロニル側鎖を含有する、ペントース（キシロ
ース、アラビノース）及びヘキソース（グルコース、マンノース、ガラクトース
）糖の混合物を含有する複合重合体である。ペクチンはリグノセルロースの乾燥
重量の１から２０％を構成し、グルクロン酸のメチル化ホモ重合体である。上記
の糖質重合体のいずれか一つ又は組合せも、本発明の生成物及び方法に基づく脱
重合や、それに続く発酵によるエタノールへの生物変換反応を行わせる糖源候補
である。
【００４９】
用語「遺伝子」は、一つのポリペプチドをコードしている開放読み取り枠を含
むポリヌクレオチドなどの核酸分子を包含するものと意図されており、さらに非
コーディング調節配列やイントロンを含めることができる。加えて、遺伝子とい
う用語は、例えば分泌ポリペプチドなど、二つ以上の遺伝子産物をコードする、
例えばエルウィニア及びクレブシエラのそれぞれout又はpul遺伝子など、機能的
遺伝子座にマップされた一つ又はそれ以上の遺伝子を包含するものと、意図され
ている。
むポリヌクレオチドなどの核酸分子を包含するものと意図されており、さらに非
コーディング調節配列やイントロンを含めることができる。加えて、遺伝子とい
う用語は、例えば分泌ポリペプチドなど、二つ以上の遺伝子産物をコードする、
例えばエルウィニア及びクレブシエラのそれぞれout又はpul遺伝子など、機能的
遺伝子座にマップされた一つ又はそれ以上の遺伝子を包含するものと、意図され
ている。
【００５０】
用語「目的遺伝子」は、所定の目的に選択された特定の遺伝子を包含するもの
と意図されている。この遺伝子はホスト細胞にとって内生でもよく、又は、組換
えにより干すと細胞に導入されてもよい。好適な実施例の一つでは、目的遺伝子
は、糖質のエタノールへの生物変換反応中の少なくとも一つのステップに関与す
るものである。従って、この用語は、例えばアルコール脱水素酵素、ピルビン酸
デカルボキシラーゼ、分泌タンパク質や、又は多糖分解酵素、例えばエンドグル
カナーゼ又はエキソグルカナーゼなどのグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、
β−グルコシダーゼ、エンド-1,4-β-キシラナーゼ、β-キシロシダーゼ、α-グ
ルクロニダーゼ、α-L-アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセ
チルキシランエステラーゼ、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ
、プルラナーゼ、β-グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マン
ナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、ペクテート融解酵素、又はこれらの組合せ、
などのポリペプチドをコードするあらゆる遺伝子を包含するものと、意図されて
いる。
と意図されている。この遺伝子はホスト細胞にとって内生でもよく、又は、組換
えにより干すと細胞に導入されてもよい。好適な実施例の一つでは、目的遺伝子
は、糖質のエタノールへの生物変換反応中の少なくとも一つのステップに関与す
るものである。従って、この用語は、例えばアルコール脱水素酵素、ピルビン酸
デカルボキシラーゼ、分泌タンパク質や、又は多糖分解酵素、例えばエンドグル
カナーゼ又はエキソグルカナーゼなどのグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、
β−グルコシダーゼ、エンド-1,4-β-キシラナーゼ、β-キシロシダーゼ、α-グ
ルクロニダーゼ、α-L-アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセ
チルキシランエステラーゼ、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ
、プルラナーゼ、β-グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マン
ナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、ペクテート融解酵素、又はこれらの組合せ、
などのポリペプチドをコードするあらゆる遺伝子を包含するものと、意図されて
いる。
【００５１】
用語「一生物からのゲノムポリヌクレオチドを断片化する」は、例えば剪断、
音波破砕、研和などの機械的方法、又はヌクレアーゼなどの酵素法を用いて、あ
る一つの生物に帰属するゲノムポリヌクレオチドを一つ又はそれ以上の部分に破
壊することを包含するものと、意図されている。好ましくは、後で候補プロモー
タ因子と特定するために、テストベクタ内にゲノム断片をクローンするには、制
限酵素を用いるとよい。ゲノムポリヌクレオチドは、例えば真核生物、原核生物
、ウィルス、又は、合成ポリヌクレオチド断片など、いかなる源を由来としても
よい。
音波破砕、研和などの機械的方法、又はヌクレアーゼなどの酵素法を用いて、あ
る一つの生物に帰属するゲノムポリヌクレオチドを一つ又はそれ以上の部分に破
壊することを包含するものと、意図されている。好ましくは、後で候補プロモー
タ因子と特定するために、テストベクタ内にゲノム断片をクローンするには、制
限酵素を用いるとよい。ゲノムポリヌクレオチドは、例えば真核生物、原核生物
、ウィルス、又は、合成ポリヌクレオチド断片など、いかなる源を由来としても
よい。
【００５２】
用語「同時糖化発酵」又は「ＳＳＦ」は、複合糖の分解又は脱重合と、発酵に
よるその糖残基のエタノールへの生物変換反応とを同時に行うのに、一つ又はそ
れ以上の組換えホストを用いることを包含するものと、意図されている。
よるその糖残基のエタノールへの生物変換反応とを同時に行うのに、一つ又はそ
れ以上の組換えホストを用いることを包含するものと、意図されている。
【００５３】
用語「転写制御」は、遺伝子発現を転写のレベルで変調できる能力を包含する
ものと、意図されている。好適な実施例の一つでは、転写、従って遺伝子発現は
、目的遺伝子のコドン領域の５’末端側近傍のサロゲート・プロモータを置換す
る又は加えて、遺伝子発現を変化させることにより、変調される。
ものと、意図されている。好適な実施例の一つでは、転写、従って遺伝子発現は
、目的遺伝子のコドン領域の５’末端側近傍のサロゲート・プロモータを置換す
る又は加えて、遺伝子発現を変化させることにより、変調される。
【００５４】
用語「発現」は、少なくともＲＮＡ生成レベルでの遺伝子発現を包含するもの
と、意図されている。
と、意図されている。
【００５５】
用語「発現産物」は、例えばポリペプチドなど、遺伝子が発現した結果の産物
を包含するものと、意図されている。
を包含するものと、意図されている。
【００５６】
用語「増加した発現」は、少なくとも増加したＲＮＡ生成のレベルでの、そし
て好ましくはポリペプチド発現のレベルでの、遺伝子発現の変化を包含するもの
と、意図されている。
て好ましくはポリペプチド発現のレベルでの、遺伝子発現の変化を包含するもの
と、意図されている。
【００５７】
用語「増加した産生」は、発現するポリペプチド量の増加、ポリペプチドの酵
素活性のレベルの増加、又はこれらの組合せ、を包含するものと、意図されてい
る。
素活性のレベルの増加、又はこれらの組合せ、を包含するものと、意図されてい
る。
【００５８】
用語「活性」及び「酵素活性」は互換可能に用いられており、望ましい条件下
で生成した場合の所定のポリペプチドに通常帰するあらゆる機能的活性を包含す
るものと、意図されている。多糖分解酵素の活性は、例えば、このポリペプチド
が、複合糖を酵素的に脱重合させられる能力であろう。典型的には、所定のポリ
ペプチドの活性には、生成されたポリペプチドに関連する総酵素活性が包含され
る。ホスト細胞によって産生され、酵素活性を有するポリペプチドは、その細胞
の細胞内空間に位置していても、細胞に結び付いていても、細胞外ミリューに分
泌されても、又はこれらの組み合わせであってもよい。分泌された活性に比較し
た場合の総活性を調べる技術はここに解説されており、また当業で公知である。
で生成した場合の所定のポリペプチドに通常帰するあらゆる機能的活性を包含す
るものと、意図されている。多糖分解酵素の活性は、例えば、このポリペプチド
が、複合糖を酵素的に脱重合させられる能力であろう。典型的には、所定のポリ
ペプチドの活性には、生成されたポリペプチドに関連する総酵素活性が包含され
る。ホスト細胞によって産生され、酵素活性を有するポリペプチドは、その細胞
の細胞内空間に位置していても、細胞に結び付いていても、細胞外ミリューに分
泌されても、又はこれらの組み合わせであってもよい。分泌された活性に比較し
た場合の総活性を調べる技術はここに解説されており、また当業で公知である。
【００５９】
用語「分泌される」は、例えば異種のポリペプチドなどのポリペプチド、好ま
しくは多糖分解酵素、の分泌の増加を包含するものと、意図されている。典型的
には、当該ポリペプチドは、天然で起きる分泌量を越えた増加したレベルで、分
泌される。より好ましくは、用語「分泌される」とは、天然で起きる分泌レベル
に比較して少なくとも１０％、そしてより好ましくは少なくとも１００％、２０
０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００
％、１０００％、又はそれ以上である、任意のポリペプチドの分泌増加を言う。
しくは多糖分解酵素、の分泌の増加を包含するものと、意図されている。典型的
には、当該ポリペプチドは、天然で起きる分泌量を越えた増加したレベルで、分
泌される。より好ましくは、用語「分泌される」とは、天然で起きる分泌レベル
に比較して少なくとも１０％、そしてより好ましくは少なくとも１００％、２０
０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００
％、１０００％、又はそれ以上である、任意のポリペプチドの分泌増加を言う。
【００６０】
用語「分泌ポリペプチド」は、別のポリペプチドが細胞内空間から細胞外ミリ
ューへ輸送されるのを促す、単独の、又は、他のポリペプチドと組み合わされた
、あらゆるポリペプチドを包含するものと、意図されている。一実施例では、分
泌ポリペプチドは、分泌活性をグラム陰性ホスト細胞に与えるのに十分な、あら
ゆる必要な分泌ポリペプチドを包含する。典型的には、分泌タンパク質は、一個
の領域又は遺伝子座にコードされているが、この領域又は遺伝子座を一つのホス
ト細胞から取り出し、遺伝子操作を用いて別のホスト細胞に移してもよい。好適
な実施例の一つでは、分泌ポリペプチドは、分泌活性を有する何らかの細菌細胞
由来である。より好適な実施例では、分泌ポリペプチドは、タイプＩＩ分泌活性
を有するホスト細胞由来である。別のより好適な実施例では、ホスト細胞はエン
テロバクテリアセエ科から選択される。最も好適な実施例では、分泌ポリペプチ
ドは、それぞれエルウィニア又はクレブシエラ由来のout又はpul遺伝子の一つ又
はそれ以上の遺伝子産物である。さらに、当業者であれば、ここに解説したout
又はpul遺伝子に十分相同である関連するホストを由来とする何らかの分泌タン
パク質を用いてもよいことは理解されよう（Pugsley et al., (1993) Microbiol
ogical Reviews 57:50-108; Lindeberg et al., (1996) Mol. Micro. 20:175-19
0; Lindeberg et al., (1992) J. of Bacteriology 174:7385-7397; He et al.,
(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:1079-1083）。
ューへ輸送されるのを促す、単独の、又は、他のポリペプチドと組み合わされた
、あらゆるポリペプチドを包含するものと、意図されている。一実施例では、分
泌ポリペプチドは、分泌活性をグラム陰性ホスト細胞に与えるのに十分な、あら
ゆる必要な分泌ポリペプチドを包含する。典型的には、分泌タンパク質は、一個
の領域又は遺伝子座にコードされているが、この領域又は遺伝子座を一つのホス
ト細胞から取り出し、遺伝子操作を用いて別のホスト細胞に移してもよい。好適
な実施例の一つでは、分泌ポリペプチドは、分泌活性を有する何らかの細菌細胞
由来である。より好適な実施例では、分泌ポリペプチドは、タイプＩＩ分泌活性
を有するホスト細胞由来である。別のより好適な実施例では、ホスト細胞はエン
テロバクテリアセエ科から選択される。最も好適な実施例では、分泌ポリペプチ
ドは、それぞれエルウィニア又はクレブシエラ由来のout又はpul遺伝子の一つ又
はそれ以上の遺伝子産物である。さらに、当業者であれば、ここに解説したout
又はpul遺伝子に十分相同である関連するホストを由来とする何らかの分泌タン
パク質を用いてもよいことは理解されよう（Pugsley et al., (1993) Microbiol
ogical Reviews 57:50-108; Lindeberg et al., (1996) Mol. Micro. 20:175-19
0; Lindeberg et al., (1992) J. of Bacteriology 174:7385-7397; He et al.,
(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:1079-1083）。
【００６１】
用語「由来とする」は、提示した源からポリヌクレオチド部分を（全体的に又
は部分的に）単離したことを包含するものと、意図されている。この用語は、例
えば、直接的クローニング、ＰＣＲ増幅、又は、提示したポリヌクレオチド源に
関連する配列からの、又はこの配列に基づいた人工的な合成、を包含するものと
、意図されている。
は部分的に）単離したことを包含するものと、意図されている。この用語は、例
えば、直接的クローニング、ＰＣＲ増幅、又は、提示したポリヌクレオチド源に
関連する配列からの、又はこの配列に基づいた人工的な合成、を包含するものと
、意図されている。
【００６２】
用語「エタノール生成性」は、微生物が、一次的発酵生成物として糖質からエ
タノールを生成できる能力を包含するものと、意図されている。この用語は、天
然発生型のエタノール生成性生物や、天然発生型変異又は誘導された変異を持つ
エタノール生成性生物、及び、遺伝子改変されたエタノール生成性生物を包含す
るものと、意図されている。
タノールを生成できる能力を包含するものと、意図されている。この用語は、天
然発生型のエタノール生成性生物や、天然発生型変異又は誘導された変異を持つ
エタノール生成性生物、及び、遺伝子改変されたエタノール生成性生物を包含す
るものと、意図されている。
【００６３】
用語「グラム陰性細菌」は、この用語に対して当業で認められた定義を包含す
るものと、意図されている。典型的には、グラム陰性細菌には、例えば、他のも
のの中でもとりわけエシェリヒア及びクレブシエラ種を含むエンテロバクテリア
セエ科がある。
るものと、意図されている。典型的には、グラム陰性細菌には、例えば、他のも
のの中でもとりわけエシェリヒア及びクレブシエラ種を含むエンテロバクテリア
セエ科がある。
【００６４】
用語「十分に相同な」は、第一のアミノ酸又はヌクレオチド配列が、第二のア
ミノ酸又はヌクレオチド配列に対して、例えば同様な側鎖を有するアミノ酸残基
など、同一の又は同等なアミノ酸残基又はヌクレオチドを十分又は最小数含有し
、その結果、この第一及び第二のアミノ酸又はヌクレオチド配列が、共通の構造
ドメイン及び/又は共通の機能的活性を有するような、第一のアミノ酸又はヌク
レオチド配列を包含するものと、意図されている。例えば、当該ドメインのアミ
ノ酸配列にわたって、少なくとも約４０％のホモロジ、好ましくは５０％のホモ
ロジ、より好ましくは６０％、７０％、８０％、又は９０％のホモロジを有する
共通の構造ドメインを有し、少なくとも一つ、好ましくは二つ、より好ましくは
三つ、そしてさらにより好ましくは四つ、五つ、又は六つの構造ドメインを有す
るようなアミノ酸又はヌクレオチド配列を、ここでは十分に相同であると定義す
る。さらに、少なくとも４０％、好ましくは５０％、より好ましくは６０％、７
０％、８０％、又は９０％のホモロジを有し、かつ、共通の機能的活性を有する
アミノ酸又はヌクレオチド配列をここでは十分に相同であると定義する。
ミノ酸又はヌクレオチド配列に対して、例えば同様な側鎖を有するアミノ酸残基
など、同一の又は同等なアミノ酸残基又はヌクレオチドを十分又は最小数含有し
、その結果、この第一及び第二のアミノ酸又はヌクレオチド配列が、共通の構造
ドメイン及び/又は共通の機能的活性を有するような、第一のアミノ酸又はヌク
レオチド配列を包含するものと、意図されている。例えば、当該ドメインのアミ
ノ酸配列にわたって、少なくとも約４０％のホモロジ、好ましくは５０％のホモ
ロジ、より好ましくは６０％、７０％、８０％、又は９０％のホモロジを有する
共通の構造ドメインを有し、少なくとも一つ、好ましくは二つ、より好ましくは
三つ、そしてさらにより好ましくは四つ、五つ、又は六つの構造ドメインを有す
るようなアミノ酸又はヌクレオチド配列を、ここでは十分に相同であると定義す
る。さらに、少なくとも４０％、好ましくは５０％、より好ましくは６０％、７
０％、８０％、又は９０％のホモロジを有し、かつ、共通の機能的活性を有する
アミノ酸又はヌクレオチド配列をここでは十分に相同であると定義する。
【００６５】
一実施例では、例えばプロモータなど、二つのポリヌクレオチド部分は、略同
一なヌクレオチド配列を有する結果、略同じ調節効果を有していれば、「十分に
相同である」。典型的には、「十分に相同な」配列は、少なくとも所望の調節に
関与していると判明している領域において、少なくとも５０％、より好ましくは
少なくとも６０％、７０％、８０％、又は９０％同一なものである。より好まし
くは、塩基が５個を越えて異ならないとよい。最も好ましくは、連続した塩基が
５個を越えて異ならないとよい。
一なヌクレオチド配列を有する結果、略同じ調節効果を有していれば、「十分に
相同である」。典型的には、「十分に相同な」配列は、少なくとも所望の調節に
関与していると判明している領域において、少なくとも５０％、より好ましくは
少なくとも６０％、７０％、８０％、又は９０％同一なものである。より好まし
くは、塩基が５個を越えて異ならないとよい。最も好ましくは、連続した塩基が
５個を越えて異ならないとよい。
【００６６】
二つのポリヌクレオチド部分間、又は、二つのアミノ酸配列間のパーセント同
一性を調べるには、最適に比較ができるよう、配列をアライメントする（例えば
、最適にアラインメントするには、第一及び第二のアミノ酸又は核酸配列の一方
又は両方にギャップが導入される場合があり、非相同な配列は比較を目的にした
場合は無視できる）。好適な実施例の一つでは、比較を目的にアラインメントす
る基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくと
も４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも
６０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、又は９０％で
ある。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又
はヌクレオチドを比較する。第一の配列中のある一つの位置に、第二の配列中の
相当する位置にあるのと同じアミノ酸残基又はヌクレオチドが来ていれば、これ
ら分子はその位置で同一である（即ち、ここで用いられるアミノ酸又は核酸の「
同一性」は、アミノ酸又は核酸の「ホモロジ」と等しい）。二つの配列間のパー
セント同一性は、二つの配列を最適にアラインメントするのに導入する必要のあ
るギャップ数、及び各ギャップの長さを考慮に入れた、それら配列が共有する同
一の位置の数の関数である。
一性を調べるには、最適に比較ができるよう、配列をアライメントする（例えば
、最適にアラインメントするには、第一及び第二のアミノ酸又は核酸配列の一方
又は両方にギャップが導入される場合があり、非相同な配列は比較を目的にした
場合は無視できる）。好適な実施例の一つでは、比較を目的にアラインメントす
る基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくと
も４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも
６０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、又は９０％で
ある。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又
はヌクレオチドを比較する。第一の配列中のある一つの位置に、第二の配列中の
相当する位置にあるのと同じアミノ酸残基又はヌクレオチドが来ていれば、これ
ら分子はその位置で同一である（即ち、ここで用いられるアミノ酸又は核酸の「
同一性」は、アミノ酸又は核酸の「ホモロジ」と等しい）。二つの配列間のパー
セント同一性は、二つの配列を最適にアラインメントするのに導入する必要のあ
るギャップ数、及び各ギャップの長さを考慮に入れた、それら配列が共有する同
一の位置の数の関数である。
【００６７】
配列の比較、及び、二つの配列間のパーセント同一性の決定は数学的アルゴリ
ズムを用いて行うことができる。好適な一実施例では、二つのアミノ酸配列間の
パーセント同一性を、(http://www.gcg.comで入手できる)ＧＣＧソフトウェアパ
ッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれたニードルマン及びワンシュ（J. Mol
. Biol. (48):444-453 (1970)のアルゴリズムを用い、ブラッサム62行列又はPAM
250行列のいずれかと、16、 14、12、10、8、6、又は4 のギャップ・ウェイト、
及び、1、2、3、4、5、又は 6のレングス・ウェイトを用いて決定する。さらに
別の好適な実施例では、二つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、(htt
p://www.gcg.comで入手できる)ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラ
ムを用い、NWSgapdna.CMP 行列と、40、50、60、70、又は80のギャップ・ウェイ
ト及び 1、2、3、4、5、又は 6のレングス・ウェイトを用いて決定する。別の実
施例では、二つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間のパーセント同一性を、ALIG
Nプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE. マイヤース及び W. ミラー
(CABIOS, 4:11-17 (1989)のアルゴリズムを用い、PAM120ウェイト残基表、１２
のギャップ・レングス・ペナルティ及び４のギャップ・ペナルティを用いて決定
する。
ズムを用いて行うことができる。好適な一実施例では、二つのアミノ酸配列間の
パーセント同一性を、(http://www.gcg.comで入手できる)ＧＣＧソフトウェアパ
ッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれたニードルマン及びワンシュ（J. Mol
. Biol. (48):444-453 (1970)のアルゴリズムを用い、ブラッサム62行列又はPAM
250行列のいずれかと、16、 14、12、10、8、6、又は4 のギャップ・ウェイト、
及び、1、2、3、4、5、又は 6のレングス・ウェイトを用いて決定する。さらに
別の好適な実施例では、二つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、(htt
p://www.gcg.comで入手できる)ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラ
ムを用い、NWSgapdna.CMP 行列と、40、50、60、70、又は80のギャップ・ウェイ
ト及び 1、2、3、4、5、又は 6のレングス・ウェイトを用いて決定する。別の実
施例では、二つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間のパーセント同一性を、ALIG
Nプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE. マイヤース及び W. ミラー
(CABIOS, 4:11-17 (1989)のアルゴリズムを用い、PAM120ウェイト残基表、１２
のギャップ・レングス・ペナルティ及び４のギャップ・ペナルティを用いて決定
する。
【００６８】
本発明のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列は、さらに、例えばプロモータ配
列など、他のファミリー・メンバー又は関連する配列を同定するために公共のデ
ータベース検索を行う際の「クエリー配列」としても利用できる。このような検
索は、アッチャル氏 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLAST及びXBLASTプロ
グラム（バージョン２．０）を用いて行える。BLASTヌクレオチド検索では、NBL
ASTプログラムを用い、スコア = 100、ワード長= 12とすれば、本発明のポリヌ
クレオチド分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク
質検索では、XBLASTプログラムを用い、スコア= 50、ワード長=3とすれば、本発
明のポリペプチド分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的と
してギャップのあるアラインメントを行うには、ギャップドBLASTをアッチャル
氏らの (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に説かれたように利用で
きる。BLAST及びギャップドBLASTプログラムを用いる場合は、各プログラム（例
えばXBLAST 及びNBLAST)のデフォルトパラメータを利用できる。http://www.ncb
i.nlm.nih.govを参照されたい。
列など、他のファミリー・メンバー又は関連する配列を同定するために公共のデ
ータベース検索を行う際の「クエリー配列」としても利用できる。このような検
索は、アッチャル氏 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLAST及びXBLASTプロ
グラム（バージョン２．０）を用いて行える。BLASTヌクレオチド検索では、NBL
ASTプログラムを用い、スコア = 100、ワード長= 12とすれば、本発明のポリヌ
クレオチド分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク
質検索では、XBLASTプログラムを用い、スコア= 50、ワード長=3とすれば、本発
明のポリペプチド分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的と
してギャップのあるアラインメントを行うには、ギャップドBLASTをアッチャル
氏らの (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に説かれたように利用で
きる。BLAST及びギャップドBLASTプログラムを用いる場合は、各プログラム（例
えばXBLAST 及びNBLAST)のデフォルトパラメータを利用できる。http://www.ncb
i.nlm.nih.govを参照されたい。
【００６９】
ＩＩ．組換えホスト
本発明は、エタノール生成での利用に適した組換えホスト細胞に関するもので
ある。一実施例では、前記細胞は、一個のポリペプチドをサロゲート・プロモー
タの転写制御下にコードする異種のポリヌクレオチド部分を含んで成る。これら
の異種のポリヌクレオチド及びサロゲート・プロモータはプラスミドを基にした
ものでも、又は、（実施例の項で説明するように）その生物のゲノム中に組み込
まれてもよい。好適な一実施例では、このホスト細胞を、複合糖のエタノールへ
の生物変換反応で用いる、又はそのステップで用いる所望のポリペプチドの源と
して用いる。
ある。一実施例では、前記細胞は、一個のポリペプチドをサロゲート・プロモー
タの転写制御下にコードする異種のポリヌクレオチド部分を含んで成る。これら
の異種のポリヌクレオチド及びサロゲート・プロモータはプラスミドを基にした
ものでも、又は、（実施例の項で説明するように）その生物のゲノム中に組み込
まれてもよい。好適な一実施例では、このホスト細胞を、複合糖のエタノールへ
の生物変換反応で用いる、又はそのステップで用いる所望のポリペプチドの源と
して用いる。
【００７０】
好適な実施例の一つでは、前記異種のポリヌクレオチド部分は多糖分解酵素ポ
リペプチドをコードするが、この多糖分解酵素は、そのホストで天然に起きるよ
りも高レベルで発現する。この多糖分解酵素は、β−グルコシダーゼ、エンドグ
ルカナーゼ又はエキソグルカナーゼのいずれかのグルカナーゼ、セロビオヒドロ
ラーゼ、エンド-1,4-β-キシラナーゼ、β-キシロシダーゼ、α-グルクロニダー
ゼ、α-L-アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシラン
エステラーゼ、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナー
ゼ、β-グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペ
クチン加水分解酵素、ペクテート融解酵素、又はこれらの組合せ、であってよい
。
リペプチドをコードするが、この多糖分解酵素は、そのホストで天然に起きるよ
りも高レベルで発現する。この多糖分解酵素は、β−グルコシダーゼ、エンドグ
ルカナーゼ又はエキソグルカナーゼのいずれかのグルカナーゼ、セロビオヒドロ
ラーゼ、エンド-1,4-β-キシラナーゼ、β-キシロシダーゼ、α-グルクロニダー
ゼ、α-L-アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシラン
エステラーゼ、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナー
ゼ、β-グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペ
クチン加水分解酵素、ペクテート融解酵素、又はこれらの組合せ、であってよい
。
【００７１】
一実施例では、前記多糖分解酵素は、Ｅ．クリサンセミ（chrysanthemi）由来
であり、celZ遺伝子がコードするグルカナーゼ（ＥＧＺ）ポリペプチドである。
しかしながら、例えば celY (Guiseppi et al., (1991) Gene 106:109-114) 又
はbgxA (Vroeman et al., (1995) Mol. Gen. Genet. 246:465-477）がコードす
るグルコヒドロラーゼを含め、Ｅ．クリサンセミ（chrysanthemi）由来の他の多
糖分解酵素を用いてもよい。celY遺伝子産物（ＥＧＹ）はエンドグルカナーゼで
ある。bgxA遺伝子はβ−グルコシダーゼ及びβ−キシロシダーゼ活性をコードす
る(Vroeman et al., (1995) Mol. Gen. Genet. 246:465-477)。好ましくは、少
なくとも１０％、より好ましくは２０％、３０％、４０％、又は５０％の多糖分
解酵素活性の増加が観察されるとよい。最も好ましくは、例えば２００％、３０
０％、４００％、５００％、６００％、７００％、又は８００％など、多糖分解
酵素活性が数倍に増加するとよい。
であり、celZ遺伝子がコードするグルカナーゼ（ＥＧＺ）ポリペプチドである。
しかしながら、例えば celY (Guiseppi et al., (1991) Gene 106:109-114) 又
はbgxA (Vroeman et al., (1995) Mol. Gen. Genet. 246:465-477）がコードす
るグルコヒドロラーゼを含め、Ｅ．クリサンセミ（chrysanthemi）由来の他の多
糖分解酵素を用いてもよい。celY遺伝子産物（ＥＧＹ）はエンドグルカナーゼで
ある。bgxA遺伝子はβ−グルコシダーゼ及びβ−キシロシダーゼ活性をコードす
る(Vroeman et al., (1995) Mol. Gen. Genet. 246:465-477)。好ましくは、少
なくとも１０％、より好ましくは２０％、３０％、４０％、又は５０％の多糖分
解酵素活性の増加が観察されるとよい。最も好ましくは、例えば２００％、３０
０％、４００％、５００％、６００％、７００％、又は８００％など、多糖分解
酵素活性が数倍に増加するとよい。
【００７２】
代わりに、例えば酵母、昆虫、動物、又は植物など、他の種を由来とするポリ
ヌクレオチド部分によって所望の多糖分解酵素がコードされていてもよい。複合
糖の基質を脱重合させるのに適した多糖分解酵素レベルを上昇させるには、これ
らの遺伝子のうちのいずれの一つ又はそれ以上のものをホスト細胞に導入し、発
現させてもよい。これらの遺伝子のうちの一つを組換えホストに導入し、発現さ
せる技術を実施例の項で説明する。
ヌクレオチド部分によって所望の多糖分解酵素がコードされていてもよい。複合
糖の基質を脱重合させるのに適した多糖分解酵素レベルを上昇させるには、これ
らの遺伝子のうちのいずれの一つ又はそれ以上のものをホスト細胞に導入し、発
現させてもよい。これらの遺伝子のうちの一つを組換えホストに導入し、発現さ
せる技術を実施例の項で説明する。
【００７３】
本発明の別の実施例では、分泌タンパク質を発現するようホスト細胞を操作し
て、細胞からの所望のポリペプチドの輸出を促すようにしてある。実施例の一つ
では、この一個又は複数の分泌タンパク質は、例えばエンテロバクテリアセエ科
の細胞など、グラム陰性細菌細胞由来である。別の実施例では、この分泌タンパ
ク質は、エルウィニア由来であり、out遺伝子にコードされている。別の実施例
では、この分泌タンパク質はクレブシエラ由来のpul遺伝子である。ホスト細菌
が、例えば細胞壁を有するグラム陰性細菌など、腸内細菌である場合には、これ
らの分泌タンパク質のうちの一つ又はそれ以上を導入するのが特に望ましい。本
発明の代表的なグラム陰性ホスト細胞はエンテロバクテリアセエ科由来であり、
例えば、エシェリヒア及びクレブシエラなどがこれに含まれる。実施例の一つで
は、一つ又はそれ以上の分泌タンパク質をホストに導入することで、天然で起き
る分泌レベルに比較して、多糖分解酵素などの所定のタンパク質の分泌が増加す
る。好ましくは、分泌の増加が、天然で起きる分泌レベルに比較して、少なくと
も１０％であるとよく、より好ましくは、１００％、２００％、３００％、４０
０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、又は
それ以上であるとよい。好適な実施例では、分泌遺伝子を加えることで、多糖分
解酵素ポリペプチドの産生がより高レベルになる。好適な実施例の一つでは、分
泌遺伝子の追加により、より高い酵素活性を持った多糖分解酵素ポリペプチドの
産生が可能となる。最も好適な実施例では、多糖分解酵素はより高レベルで、か
つ、より高い酵素活性を伴って産生される。好ましくは、少なくとも１０％、よ
り好ましくは２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０
％、又は１００％といった多糖分解酵素活性の増加が観察されるとよい。最も好
ましくは、（例えば分泌遺伝子のない、又は、分泌遺伝子を充分なレベルで発現
しない細胞など）分泌遺伝子のない細胞に比較して、例えば２００％、３００％
、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、又は１００
０％など、多糖分解酵素活性が数倍に増加するとよい。このような遺伝子を導入
し、例えば多糖分解酵素などの所望のポリペプチドの増加した産生を測定する技
術及び方法を、実施例の項にさらに詳細に説明する。他の同等の方法は当業者に
公知である。
て、細胞からの所望のポリペプチドの輸出を促すようにしてある。実施例の一つ
では、この一個又は複数の分泌タンパク質は、例えばエンテロバクテリアセエ科
の細胞など、グラム陰性細菌細胞由来である。別の実施例では、この分泌タンパ
ク質は、エルウィニア由来であり、out遺伝子にコードされている。別の実施例
では、この分泌タンパク質はクレブシエラ由来のpul遺伝子である。ホスト細菌
が、例えば細胞壁を有するグラム陰性細菌など、腸内細菌である場合には、これ
らの分泌タンパク質のうちの一つ又はそれ以上を導入するのが特に望ましい。本
発明の代表的なグラム陰性ホスト細胞はエンテロバクテリアセエ科由来であり、
例えば、エシェリヒア及びクレブシエラなどがこれに含まれる。実施例の一つで
は、一つ又はそれ以上の分泌タンパク質をホストに導入することで、天然で起き
る分泌レベルに比較して、多糖分解酵素などの所定のタンパク質の分泌が増加す
る。好ましくは、分泌の増加が、天然で起きる分泌レベルに比較して、少なくと
も１０％であるとよく、より好ましくは、１００％、２００％、３００％、４０
０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、又は
それ以上であるとよい。好適な実施例では、分泌遺伝子を加えることで、多糖分
解酵素ポリペプチドの産生がより高レベルになる。好適な実施例の一つでは、分
泌遺伝子の追加により、より高い酵素活性を持った多糖分解酵素ポリペプチドの
産生が可能となる。最も好適な実施例では、多糖分解酵素はより高レベルで、か
つ、より高い酵素活性を伴って産生される。好ましくは、少なくとも１０％、よ
り好ましくは２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０
％、又は１００％といった多糖分解酵素活性の増加が観察されるとよい。最も好
ましくは、（例えば分泌遺伝子のない、又は、分泌遺伝子を充分なレベルで発現
しない細胞など）分泌遺伝子のない細胞に比較して、例えば２００％、３００％
、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、又は１００
０％など、多糖分解酵素活性が数倍に増加するとよい。このような遺伝子を導入
し、例えば多糖分解酵素などの所望のポリペプチドの増加した産生を測定する技
術及び方法を、実施例の項にさらに詳細に説明する。他の同等の方法は当業者に
公知である。
【００７４】
好適な実施例では、本発明は、エタノール生成性でもある組換えホストを利用
するものである。実施例の一つでは、この組換えホストはグラム陰性細菌である
。別の実施例では、この組換えホストはエンテロバクテリアセエ科由来である。
例えば、言及をもってここに編入する米国特許第5,821,093号のエタノール生成
性ホストが適したホストであり、具体的には、Ｅ．コリ株KO4 (ATCC 55123)、KO
11 (ATCC 55124)、及び KO12 (ATCC 55125)、及びクレブシエラ−オキシトカ（K
lebsiella oxytoca）株M5A1がある。その代わりに、例えば、ジモモナス−モビ
リス（Zymomonas mobilis）など、効率的なエタノール生成生物由来のエタノー
ル生成遺伝子を導入することで、本発明の非エタノール生成性ホストを（例えば
上記の株など（エタノール生成性ホストに変換してもよい。標準的な技術を用い
たこの種類の遺伝子操作の結果、糖をエタノールに効率的に発酵させることので
きる組換えホストが得られる。加えて、LY01エタノール耐性株（ATCC ）を
公開済みＰＣＴ国際出願ＷＯ９８／４５４２５号に説かれたように利用してもよ
く、この公開済み出願を言及をもってここに編入することとする（また、例えば
Yomano et al. (1998) J. of Ind. Micro. & Bio. 20:132-138を参照されたい）
。
するものである。実施例の一つでは、この組換えホストはグラム陰性細菌である
。別の実施例では、この組換えホストはエンテロバクテリアセエ科由来である。
例えば、言及をもってここに編入する米国特許第5,821,093号のエタノール生成
性ホストが適したホストであり、具体的には、Ｅ．コリ株KO4 (ATCC 55123)、KO
11 (ATCC 55124)、及び KO12 (ATCC 55125)、及びクレブシエラ−オキシトカ（K
lebsiella oxytoca）株M5A1がある。その代わりに、例えば、ジモモナス−モビ
リス（Zymomonas mobilis）など、効率的なエタノール生成生物由来のエタノー
ル生成遺伝子を導入することで、本発明の非エタノール生成性ホストを（例えば
上記の株など（エタノール生成性ホストに変換してもよい。標準的な技術を用い
たこの種類の遺伝子操作の結果、糖をエタノールに効率的に発酵させることので
きる組換えホストが得られる。加えて、LY01エタノール耐性株（ATCC ）を
公開済みＰＣＴ国際出願ＷＯ９８／４５４２５号に説かれたように利用してもよ
く、この公開済み出願を言及をもってここに編入することとする（また、例えば
Yomano et al. (1998) J. of Ind. Micro. & Bio. 20:132-138を参照されたい）
。
【００７５】
別の好適な実施例では、本発明は、例えばＥ．コリ株B、Ｅ．コリ株DH5α、又
はクレブシエラ−オキシトカ（Klebsiella oxytoca）株M5A1など、非エタノール
生成性組換えホストを利用するものである。これらの株は、例えばここに解説し
た技術を用いて多糖分解酵素を発現させるなど、所望のポリペプチドを発現させ
るのに用いてもよい。加えて、これらの組換えホストを、例えば異なる多糖分解
酵素など、さらに別の所望のポリペプチドを発現する別の組換えホストと組み合
わせて用いてもよい。さらに、この非エタノール生成性ホスト細胞を、エタノー
ル生成性ホスト細胞と組み合わせて用いてもよい。例えば、非エタノール生成性
ホストを利用して、例えば複合糖を脱重合させるなどし、その後、エタノール生
成性ホストを利用して、この脱重合した糖を発酵させてもよい。従って、非エタ
ノール生成性及びエタノール生成性の組換えホストの均質な又は混合培養物を利
用して、これらの反応を順番に行っても、又は、同時に行ってもよい。
はクレブシエラ−オキシトカ（Klebsiella oxytoca）株M5A1など、非エタノール
生成性組換えホストを利用するものである。これらの株は、例えばここに解説し
た技術を用いて多糖分解酵素を発現させるなど、所望のポリペプチドを発現させ
るのに用いてもよい。加えて、これらの組換えホストを、例えば異なる多糖分解
酵素など、さらに別の所望のポリペプチドを発現する別の組換えホストと組み合
わせて用いてもよい。さらに、この非エタノール生成性ホスト細胞を、エタノー
ル生成性ホスト細胞と組み合わせて用いてもよい。例えば、非エタノール生成性
ホストを利用して、例えば複合糖を脱重合させるなどし、その後、エタノール生
成性ホストを利用して、この脱重合した糖を発酵させてもよい。従って、非エタ
ノール生成性及びエタノール生成性の組換えホストの均質な又は混合培養物を利
用して、これらの反応を順番に行っても、又は、同時に行ってもよい。
【００７６】
好適な一実施例では、糖基質をエタノールに発酵させるのに必要な一つ又はそ
れ以上の遺伝子をプラスミド上に乗せて提供しても、又は、ホストの染色体に組
み込んでもよい。より好ましくは、例えばピルビン酸デカルボキシラーゼ（例え
ばpdc）及び／又はアルコール脱水素酵素（例えばadh）など、糖基質をエタノー
ルに発酵させるのに必須な遺伝子を、本発明のホストに、言及をもってここに編
入する米国特許第5,821,093号に説かれたようにPETオペロンなどの人工的なオペ
ロンを用いて導入するとよい。実際、本発明は、当業で公知の知見と組み合わせ
ると、複数の遺伝子を適したホストに導入するための技術及びベクタを提供する
ものであることが、理解されよう（例えば 言及をもってここに編入するCurrent
Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons
(1992), Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2n
d, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, Cold Spring Harbor, NY (1989), and Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology, Kreig et al., Williams and Wilkins (1984)を参照されたい）
。従って、本発明の方法を用いると、一個の遺伝子作製物に、同時糖化発酵（Ｓ
ＳＦ）を行わせるのに必要な遺伝子産物（例えばグルカナーゼ、エンドグルカナ
ーゼ、エキソグルカナーゼ、分泌タンパク質、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、
アルコール脱水素酵素など）のすべてをコードさせることができるかも知れない
。さらに、当業で公知の方法を用いてこのようなホストをさらに操作し、内生遺
伝子（例えばリコンビナーゼ遺伝子）に変異を持たせて、導入遺伝子の安定性、
発現、及び機能に干渉させてもよいことも理解されよう。さらに、ここに説明し
たものに充分相同である調節因子、遺伝子又は遺伝子産物、即ちポリペプチド、
も本発明に包含されると意図されていることも、理解されよう。
れ以上の遺伝子をプラスミド上に乗せて提供しても、又は、ホストの染色体に組
み込んでもよい。より好ましくは、例えばピルビン酸デカルボキシラーゼ（例え
ばpdc）及び／又はアルコール脱水素酵素（例えばadh）など、糖基質をエタノー
ルに発酵させるのに必須な遺伝子を、本発明のホストに、言及をもってここに編
入する米国特許第5,821,093号に説かれたようにPETオペロンなどの人工的なオペ
ロンを用いて導入するとよい。実際、本発明は、当業で公知の知見と組み合わせ
ると、複数の遺伝子を適したホストに導入するための技術及びベクタを提供する
ものであることが、理解されよう（例えば 言及をもってここに編入するCurrent
Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons
(1992), Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2n
d, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, Cold Spring Harbor, NY (1989), and Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology, Kreig et al., Williams and Wilkins (1984)を参照されたい）
。従って、本発明の方法を用いると、一個の遺伝子作製物に、同時糖化発酵（Ｓ
ＳＦ）を行わせるのに必要な遺伝子産物（例えばグルカナーゼ、エンドグルカナ
ーゼ、エキソグルカナーゼ、分泌タンパク質、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、
アルコール脱水素酵素など）のすべてをコードさせることができるかも知れない
。さらに、当業で公知の方法を用いてこのようなホストをさらに操作し、内生遺
伝子（例えばリコンビナーゼ遺伝子）に変異を持たせて、導入遺伝子の安定性、
発現、及び機能に干渉させてもよいことも理解されよう。さらに、ここに説明し
たものに充分相同である調節因子、遺伝子又は遺伝子産物、即ちポリペプチド、
も本発明に包含されると意図されていることも、理解されよう。
【００７７】
導入遺伝子を有する株をスクリーニングする方法は日常的な技術であり、アル
コール脱水素酵素（ＡＤＨ）又はグルカナーゼ（ＥＧＺ）遺伝子産物のいずれか
を発現している細胞を特定できる視覚的スクリーンがあると便利であろう。この
ＡＤＨ遺伝子産物はアセトアルデヒドを生ずるが、このアセトアルデヒドはｐ−
ロセアニリンのロイコスルホン酸誘導体と反応して赤みの強い生成物を生じる。
このように、ＡＤＨ陽性クローンを容易にスクリーニングして、血のように赤い
コロニであると特定できる。例えば多糖分解酵素活性など、ＥＧＺをスクリーニ
ングする方法でも、以下及び実施例の項に説明するように明確な視覚的表現型が
生ずる。
コール脱水素酵素（ＡＤＨ）又はグルカナーゼ（ＥＧＺ）遺伝子産物のいずれか
を発現している細胞を特定できる視覚的スクリーンがあると便利であろう。この
ＡＤＨ遺伝子産物はアセトアルデヒドを生ずるが、このアセトアルデヒドはｐ−
ロセアニリンのロイコスルホン酸誘導体と反応して赤みの強い生成物を生じる。
このように、ＡＤＨ陽性クローンを容易にスクリーニングして、血のように赤い
コロニであると特定できる。例えば多糖分解酵素活性など、ＥＧＺをスクリーニ
ングする方法でも、以下及び実施例の項に説明するように明確な視覚的表現型が
生ずる。
【００７８】
例えばＰＥＴオペロンを発現している組換え細菌は、酸性の発酵生成物ではな
く中性の発酵生成物を生ずるために、未改変の親生物よりも高い細胞密度に液体
培地中で成長することが多い（Ingram et al., (1988) Appl. Environ. Microbi
ol. 54:397-404）。プレート上では、エタノール生成性クローンは、酵母と大変
よく似た大型の盛り上がったコロニを生ずるため容易に眼に見える。これらの特
徴は新しい株の構築には大変有用であり、新しい作製物の実用性の予備的指標と
なる。また、アルデヒド・インジケータ・プレート上で赤い斑点が発生する速度
を調べても、エタノール生成の可能性を迅速に評価できる（Conway et al., (19
87) J. Bacteriol. 169:2591-2597）。典型的には、糖をエタノールに効率的に
転化すると判明した株は、移してから数分のうちに赤い斑点をアルデヒド・イン
ジケータ・プレート上に生ずることで認識が可能である。
く中性の発酵生成物を生ずるために、未改変の親生物よりも高い細胞密度に液体
培地中で成長することが多い（Ingram et al., (1988) Appl. Environ. Microbi
ol. 54:397-404）。プレート上では、エタノール生成性クローンは、酵母と大変
よく似た大型の盛り上がったコロニを生ずるため容易に眼に見える。これらの特
徴は新しい株の構築には大変有用であり、新しい作製物の実用性の予備的指標と
なる。また、アルデヒド・インジケータ・プレート上で赤い斑点が発生する速度
を調べても、エタノール生成の可能性を迅速に評価できる（Conway et al., (19
87) J. Bacteriol. 169:2591-2597）。典型的には、糖をエタノールに効率的に
転化すると判明した株は、移してから数分のうちに赤い斑点をアルデヒド・イン
ジケータ・プレート上に生ずることで認識が可能である。
【００７９】
本発明の最も好適な実施例では、一個のホスト細胞がエタノール生成性であり
、即ち、天然発生した、又は、人工的に導入された、又は（例えば異なる種又は
株由来のサロゲート・プロモータ及び／又は遺伝子を用いて）強化された、のい
ずれかである必要な遺伝子をすべて有しており、従って、このホスト細胞は多糖
分解酵素を産生及び分泌する能力、複合糖を分解する能力、及び、分解された糖
を発酵させてエタノールにする能力を有することになる。従って、このようなホ
ストは同時糖化発酵に適している。
、即ち、天然発生した、又は、人工的に導入された、又は（例えば異なる種又は
株由来のサロゲート・プロモータ及び／又は遺伝子を用いて）強化された、のい
ずれかである必要な遺伝子をすべて有しており、従って、このホスト細胞は多糖
分解酵素を産生及び分泌する能力、複合糖を分解する能力、及び、分解された糖
を発酵させてエタノールにする能力を有することになる。従って、このようなホ
ストは同時糖化発酵に適している。
【００８０】
さらに本発明は、天然Ｅ．コリ発酵経路で酸性及び中性の生成物（存在度の順
に）：乳酸、水素＋二酸化炭素（ギ酸塩から）、酢酸、エタノール、及びスクシ
ン酸塩、の混合物が生ずることを考慮に入れている。しかしながら、Ｚ．モビリ
ス（mobilis）ＰＤＣ（ピルビン酸デカルボキシラーゼ）は、ピルビン酸塩につ
いて、競合するＥ．コリ酵素のどれよりも低いミカエリス定数を有する。活性の
高いＰＤＣを発現させることにより、乳酸及びアセチル−ＣｏＡからアセチルア
ルデヒド及びエタノールへ、炭素の流れを効果的に方向修正することができる。
フマル酸還元酵素遺伝子（frd）を削除することで、少量のホスホエノールピル
ベートを消失させることができる（イングラム氏らの(1991) 米国特許第5,000,0
00号; Ohta et al., (l991) Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900)。（例え
ばpfl又はldh遺伝子などに）更なる変異を付け加えて、他の競合する経路を完全
に消失させてもよい（イングラム氏らの(1991) 米国特許第5,000,000号）。さら
に、（プラスミドを基にした、又は、ゲノム中に組み込まれた）導入遺伝子の安
定性を損なう可能性のある（例えばrecAなどのリコンビナーゼなど）酵素を除去
するために更なる変異を導入しても、特定のバックグラウンドについて選別して
も、又は特定のバックグラウンドから選択してもよい。
に）：乳酸、水素＋二酸化炭素（ギ酸塩から）、酢酸、エタノール、及びスクシ
ン酸塩、の混合物が生ずることを考慮に入れている。しかしながら、Ｚ．モビリ
ス（mobilis）ＰＤＣ（ピルビン酸デカルボキシラーゼ）は、ピルビン酸塩につ
いて、競合するＥ．コリ酵素のどれよりも低いミカエリス定数を有する。活性の
高いＰＤＣを発現させることにより、乳酸及びアセチル−ＣｏＡからアセチルア
ルデヒド及びエタノールへ、炭素の流れを効果的に方向修正することができる。
フマル酸還元酵素遺伝子（frd）を削除することで、少量のホスホエノールピル
ベートを消失させることができる（イングラム氏らの(1991) 米国特許第5,000,0
00号; Ohta et al., (l991) Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900)。（例え
ばpfl又はldh遺伝子などに）更なる変異を付け加えて、他の競合する経路を完全
に消失させてもよい（イングラム氏らの(1991) 米国特許第5,000,000号）。さら
に、（プラスミドを基にした、又は、ゲノム中に組み込まれた）導入遺伝子の安
定性を損なう可能性のある（例えばrecAなどのリコンビナーゼなど）酵素を除去
するために更なる変異を導入しても、特定のバックグラウンドについて選別して
も、又は特定のバックグラウンドから選択してもよい。
【００８１】
加えて、タンパク質又は代謝経路全体をコードする遺伝子を一個の操作可能な
作成物に導入できるという、本発明によってもたらされる能力は、非常に有用で
あることは当業者には容易に明白であろう。この関係で想到されるのは、例えば
、様々な遺伝子座の遺伝子を一つの染色体上に配置する多様な状況への、本発明
の応用である。これは、単一のプロモータの制御下に置く多シストロンカセット
としても、又は、別々のプロモータを用いてもよい。
作成物に導入できるという、本発明によってもたらされる能力は、非常に有用で
あることは当業者には容易に明白であろう。この関係で想到されるのは、例えば
、様々な遺伝子座の遺伝子を一つの染色体上に配置する多様な状況への、本発明
の応用である。これは、単一のプロモータの制御下に置く多シストロンカセット
としても、又は、別々のプロモータを用いてもよい。
【００８２】
エタノール生成性であり、本発明の方法に基づいてさらに改良するのに適した
Ｅ．コリ株の例には、例えばKO4、KO11、及びKO12株や、Ｅ．コリ株K011のエタ
ノール耐性変異株であるLY01株がある。理想的には、これらの株は、環境ストレ
スに強いＥ．コリ株ATCC 11303であるとよく、この株に操作を加えてエタノール
生成性で多糖分解酵素を分泌するようにすることができる。加えて、最近のＰＣ
Ｒ研究から、このATCC 11303株は、Ｅ．コリの病原性に関連していることが判明
している遺伝子を全て欠いていることが確認されている（Kuhnert et al., (199
7) Appl. Environ. Microbiol. 63:703-709)。
Ｅ．コリ株の例には、例えばKO4、KO11、及びKO12株や、Ｅ．コリ株K011のエタ
ノール耐性変異株であるLY01株がある。理想的には、これらの株は、環境ストレ
スに強いＥ．コリ株ATCC 11303であるとよく、この株に操作を加えてエタノール
生成性で多糖分解酵素を分泌するようにすることができる。加えて、最近のＰＣ
Ｒ研究から、このATCC 11303株は、Ｅ．コリの病原性に関連していることが判明
している遺伝子を全て欠いていることが確認されている（Kuhnert et al., (199
7) Appl. Environ. Microbiol. 63:703-709)。
【００８３】
本発明の方法に基づいて改良するのに好適なもう一つのエタノール生成性ホス
トは、数多くの様々なリグノセルロース材料及び他の基質から出るヘミセルロー
ス加水分解産物を発酵させることのできるＥ．コリKO11株である（Asghari et a
l., (1996) J. Ind. Microbiol. 16:42-47; Barbosa et al., (1992) Current M
icrobiol. 28:279-282; Beall et al., (1991) Biotechnol. Bioeng. 38:296-30
3; Beall et al., (1992) Biotechnol. Lett. 14:857-862; Hahn-Hagerdal et a
l., (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41:62-72; Moniruzzaman et al., (
1996) Biotechnol. Lett. 18:955-990; Moniruzzaman et al., (1998) Biotechn
ol. Lett. 20:943-947; Grohmann et al., (1994) Biotechnol. Lett. 16:281-2
86; Guimaraes et al., (1992) Biotechnol. Bioeng. 40:41-45; Guimaraes et
al., (1992) Biotechnol. Lett. 14:415-420; Moniruzzaman et al., (1997) J.
Bacteriol. 179:1880-1886)。図１に、この株の生物変換反応の動態を示す。具
体的には、この株は (58.5 g/L のペントース糖及び37 g/Lのヘキソース糖を含
有した)コメの外皮から出るヘミセルロース加水分解産物を急速に発酵させてエ
タノールにすることができる（Moniruzzaman et al., (1998) Biotechnol. Lett
. 20:943-947)。この株は、ヘミセルロース加水分解産物を４８から７２時間以
内に、そして理想条件では２４時間以内に完全に発酵させることができたことが
注目された。
トは、数多くの様々なリグノセルロース材料及び他の基質から出るヘミセルロー
ス加水分解産物を発酵させることのできるＥ．コリKO11株である（Asghari et a
l., (1996) J. Ind. Microbiol. 16:42-47; Barbosa et al., (1992) Current M
icrobiol. 28:279-282; Beall et al., (1991) Biotechnol. Bioeng. 38:296-30
3; Beall et al., (1992) Biotechnol. Lett. 14:857-862; Hahn-Hagerdal et a
l., (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41:62-72; Moniruzzaman et al., (
1996) Biotechnol. Lett. 18:955-990; Moniruzzaman et al., (1998) Biotechn
ol. Lett. 20:943-947; Grohmann et al., (1994) Biotechnol. Lett. 16:281-2
86; Guimaraes et al., (1992) Biotechnol. Bioeng. 40:41-45; Guimaraes et
al., (1992) Biotechnol. Lett. 14:415-420; Moniruzzaman et al., (1997) J.
Bacteriol. 179:1880-1886)。図１に、この株の生物変換反応の動態を示す。具
体的には、この株は (58.5 g/L のペントース糖及び37 g/Lのヘキソース糖を含
有した)コメの外皮から出るヘミセルロース加水分解産物を急速に発酵させてエ
タノールにすることができる（Moniruzzaman et al., (1998) Biotechnol. Lett
. 20:943-947)。この株は、ヘミセルロース加水分解産物を４８から７２時間以
内に、そして理想条件では２４時間以内に完全に発酵させることができたことが
注目された。
【００８４】
本発明で好適なもう一つのホスト細胞は細菌クレブシエラ（Klebsiella）であ
る。具体的には、クレブシエラ−オキシトカ（Klebsiella oxytoca）が好適であ
るが、それはなぜなら、Ｅ．コリと同様、この腸内細菌には、より複雑な糖の構
成要素である単量体糖を代謝する天然の能力があるからである。さらに、Ｋ．オ
キシトカは、セルロースの酵素による加水分解からできる可溶性の中間生成物で
あるセロビオース及びセロトリオースを輸送及び代謝できるという利点をさらに
有する(Lai et al., (1996) Appl. Environ. Microbiol. 63:355-363; Moniruzz
aman et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:4633-4637; Wood et al.,
(1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110)。本発明は、（本明細書や
、米国特許第5,821,093号; Wood et al., (1992) Appl. Environ. Microbiol. 5
8:2103-2110に説かれているように)PETオペロン内にコードされたZ. モビリスpd
c及びadhB遺伝子を有する株M5A1など、Ｋ．オキシトカの、遺伝子操作されたエ
タノール生成性類縁体を提供するものである。
る。具体的には、クレブシエラ−オキシトカ（Klebsiella oxytoca）が好適であ
るが、それはなぜなら、Ｅ．コリと同様、この腸内細菌には、より複雑な糖の構
成要素である単量体糖を代謝する天然の能力があるからである。さらに、Ｋ．オ
キシトカは、セルロースの酵素による加水分解からできる可溶性の中間生成物で
あるセロビオース及びセロトリオースを輸送及び代謝できるという利点をさらに
有する(Lai et al., (1996) Appl. Environ. Microbiol. 63:355-363; Moniruzz
aman et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:4633-4637; Wood et al.,
(1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110)。本発明は、（本明細書や
、米国特許第5,821,093号; Wood et al., (1992) Appl. Environ. Microbiol. 5
8:2103-2110に説かれているように)PETオペロン内にコードされたZ. モビリスpd
c及びadhB遺伝子を有する株M5A1など、Ｋ．オキシトカの、遺伝子操作されたエ
タノール生成性類縁体を提供するものである。
【００８５】
従って、その結果得られる生物株P2は、単量体の糖や、ラフィノース、スタキ
オース、スクロース、セロビオース、セロトリオース、キシロビオース、キシロ
トリオース、マルトース等々を含む多様な糖から、エタノールを効率的に生成す
る(Burchhardt et al., (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:1128-1133; Mon
iruzzaman et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:4633-4637; Moniruz
zaman et al., (1997) J. Bacteriol. 179:1880-1886; Wood et al., (1992) Ap
pl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110)。これらの株を本発明の方法に基づい
てさらに改変し、多糖分解酵素を発現及び分泌するようにしてもよい。従って、
この株は、ＳＳＦ法で複合糖を生物変換するために利用するのに適切である(Dor
an et al., (1993) Biotechnol. Progress. 9:533-538; Doran et al., (1994)
Biotechnol. Bioeng. 44:240-247; Wood et al., (1992) Appl. Environ. Micro
biol. 58:2103-2110)。具体的には、このエタノール生成性P2株を用いると、補
助的なセロビアーゼを添加する必要がなくなるが、これは、市販の真菌セルラー
ゼの中でも最も安定性の低い成分の一つである（Grohmann, (1994) Biotechnol.
Lett. 16:281-286)。
オース、スクロース、セロビオース、セロトリオース、キシロビオース、キシロ
トリオース、マルトース等々を含む多様な糖から、エタノールを効率的に生成す
る(Burchhardt et al., (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:1128-1133; Mon
iruzzaman et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:4633-4637; Moniruz
zaman et al., (1997) J. Bacteriol. 179:1880-1886; Wood et al., (1992) Ap
pl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110)。これらの株を本発明の方法に基づい
てさらに改変し、多糖分解酵素を発現及び分泌するようにしてもよい。従って、
この株は、ＳＳＦ法で複合糖を生物変換するために利用するのに適切である(Dor
an et al., (1993) Biotechnol. Progress. 9:533-538; Doran et al., (1994)
Biotechnol. Bioeng. 44:240-247; Wood et al., (1992) Appl. Environ. Micro
biol. 58:2103-2110)。具体的には、このエタノール生成性P2株を用いると、補
助的なセロビアーゼを添加する必要がなくなるが、これは、市販の真菌セルラー
ゼの中でも最も安定性の低い成分の一つである（Grohmann, (1994) Biotechnol.
Lett. 16:281-286)。
【００８６】
異種の遺伝子発現で利用するのに適したプロモータをスクリーニングする
一実施例では、例えば多糖分解酵素など、異種の遺伝子の発現を向上させるた
めに本発明のサロゲート・プロモータを用いているが、さらに本発明では、何ら
かの望ましい遺伝子産物の発現を高めるのに適したサロゲート・プロモータのス
クリーニングを可能とするものであることは、理解されよう。概略的には、この
スクリーニング法は、実施例１に説いた、図３に図示したクローニング・ベクタ
を利用するものであり、こうして候補プロモータ断片をレポータ遺伝子に適宜連
結及び機能可能に連鎖させることができる。一実施例では、グルカナーゼをコー
ドするcelZ遺伝子は便利なレポータ遺伝子として働くが、それはなぜなら、この
プラスミドを持つ細胞を特定の培地（ＣＭＣプレート）上で成長させると、この
酵素（グルカナーゼ）が発現する結果、強力な比色変化が起きるからである。従
って、例えば特定のプロモータ配列などの候補プロモータや、又は代替的には、
ベクタ内に「ショットガン」クローンして機能可能なよう連鎖させることのでき
るランダム配列をホスト細胞に導入し、その結果生ずるコロニを視覚的にスキャ
ンして、ＣＭＣプレート上に現れた、表現型であるグルカナーゼによって媒介さ
れる比色変化が証拠となる遺伝子発現の増加を調べることができる。こうして、
所望の表現型を有するコロニを処理して、形質転換を起こさせるＤＮＡを判別し
、適したプライマを用いてそのプロモータの配列決定を行う（詳細については実
施例１を参照されたい）。
めに本発明のサロゲート・プロモータを用いているが、さらに本発明では、何ら
かの望ましい遺伝子産物の発現を高めるのに適したサロゲート・プロモータのス
クリーニングを可能とするものであることは、理解されよう。概略的には、この
スクリーニング法は、実施例１に説いた、図３に図示したクローニング・ベクタ
を利用するものであり、こうして候補プロモータ断片をレポータ遺伝子に適宜連
結及び機能可能に連鎖させることができる。一実施例では、グルカナーゼをコー
ドするcelZ遺伝子は便利なレポータ遺伝子として働くが、それはなぜなら、この
プラスミドを持つ細胞を特定の培地（ＣＭＣプレート）上で成長させると、この
酵素（グルカナーゼ）が発現する結果、強力な比色変化が起きるからである。従
って、例えば特定のプロモータ配列などの候補プロモータや、又は代替的には、
ベクタ内に「ショットガン」クローンして機能可能なよう連鎖させることのでき
るランダム配列をホスト細胞に導入し、その結果生ずるコロニを視覚的にスキャ
ンして、ＣＭＣプレート上に現れた、表現型であるグルカナーゼによって媒介さ
れる比色変化が証拠となる遺伝子発現の増加を調べることができる。こうして、
所望の表現型を有するコロニを処理して、形質転換を起こさせるＤＮＡを判別し
、適したプライマを用いてそのプロモータの配列決定を行う（詳細については実
施例１を参照されたい）。
【００８７】
グルカナーゼが媒介する、ＣＭＣプレート上の比色変化と、酵素の発現レベル
との間の高い対応は、候補プロモータの強度の優れた指標となる（図４）。従っ
て、本発明の方法は、候補サロゲート・プロモータの強度を格付けする迅速な視
覚検査を提供するものである。よって、特定の遺伝子産物に必要な所望の発現レ
ベルに応じて、この検定を用いて、特定されたサロゲート・プロモータを選択す
ることができる。例えば、単に最も高い発現レベルが望ましいのであれば、最も
高い比色変化を生ずる候補プロモータを選択してもよい。例えば発現させようと
意図する産物が高レベルでは毒性であったり、又は、別の産物と同等のレベルで
発現させねばならない場合など、より低いレベルの発現が望ましいのであれば、
より弱いサロゲート・プロモータを、解説するように特定、選択及び利用するこ
とができる。
との間の高い対応は、候補プロモータの強度の優れた指標となる（図４）。従っ
て、本発明の方法は、候補サロゲート・プロモータの強度を格付けする迅速な視
覚検査を提供するものである。よって、特定の遺伝子産物に必要な所望の発現レ
ベルに応じて、この検定を用いて、特定されたサロゲート・プロモータを選択す
ることができる。例えば、単に最も高い発現レベルが望ましいのであれば、最も
高い比色変化を生ずる候補プロモータを選択してもよい。例えば発現させようと
意図する産物が高レベルでは毒性であったり、又は、別の産物と同等のレベルで
発現させねばならない場合など、より低いレベルの発現が望ましいのであれば、
より弱いサロゲート・プロモータを、解説するように特定、選択及び利用するこ
とができる。
【００８８】
ＩＩＩ． 利用法
複合糖を分解又は脱重合する
実施例の一つでは、本発明のホスト細胞を用いて、例えばリグノセルロース又
はオリゴ糖などの複合糖を、より小型の糖部分に分解又は脱重合する。これを行
うためには、本発明のホスト細胞は、好ましくは、例えばグルカナーゼなどの多
糖分解酵素を一つ又はそれ以上発現するとよく、これらの多糖分解酵素は、その
生成生物から天然で放出されるとよい。代替的には、当該細胞を物理的に破壊す
ることにより、その多糖分解酵素を生成細胞から放出させる。細胞を機械的（例
えばせん断、音波破砕）、酵素的（例えばリゾチーム）、又は化学的に破壊する
多様な方法が当業で公知であり、これらの方法のいずれを用いてもよい。所望の
ポリペプチドが内側の細胞空間から放出されさえすれば、それを用いて、複合糖
基質を小型の糖部分に分解し、さらにエタノールに生物変換してよい。放出され
たセルラーゼは、当業で公知の標準的生化学技術を用いて精製してもよい。その
代わりに、放出された多糖を精製したり又は他の細胞成分から単離する必要もな
く、糖基質に直接利用することもできる。
はオリゴ糖などの複合糖を、より小型の糖部分に分解又は脱重合する。これを行
うためには、本発明のホスト細胞は、好ましくは、例えばグルカナーゼなどの多
糖分解酵素を一つ又はそれ以上発現するとよく、これらの多糖分解酵素は、その
生成生物から天然で放出されるとよい。代替的には、当該細胞を物理的に破壊す
ることにより、その多糖分解酵素を生成細胞から放出させる。細胞を機械的（例
えばせん断、音波破砕）、酵素的（例えばリゾチーム）、又は化学的に破壊する
多様な方法が当業で公知であり、これらの方法のいずれを用いてもよい。所望の
ポリペプチドが内側の細胞空間から放出されさえすれば、それを用いて、複合糖
基質を小型の糖部分に分解し、さらにエタノールに生物変換してよい。放出され
たセルラーゼは、当業で公知の標準的生化学技術を用いて精製してもよい。その
代わりに、放出された多糖を精製したり又は他の細胞成分から単離する必要もな
く、糖基質に直接利用することもできる。
【００８９】
別の実施例では、多糖分解酵素が成長培地内に分泌されるよう、多糖分解酵素
及び分泌タンパク質を同時に発現するホスト細胞を利用する。これにより、ホス
ト細胞から多糖分解酵素を放出させなければならない上記のステップが不要とな
る。この種類のホストを利用する場合、複合糖を含有する水溶液中にホストを直
接用いてもよい。
及び分泌タンパク質を同時に発現するホスト細胞を利用する。これにより、ホス
ト細胞から多糖分解酵素を放出させなければならない上記のステップが不要とな
る。この種類のホストを利用する場合、複合糖を含有する水溶液中にホストを直
接用いてもよい。
【００９０】
別の実施例では、本発明のホスト細胞を、二種以上の多糖分解酵素を発現する
ようにデザインするか、又は、異なる多糖分解酵素を発現する別のホストと混合
する。例えば、一方のホスト細胞が異種のβ−グルコシダーゼを発現し、別のホ
スト細胞が、エンドグルカナーゼを発現し、さらに別のホスト細胞がエキソグル
カナーゼを発現し、これらの細胞を組み合わせて、複数の多糖分解酵素活性を有
する不均質な培養物を形成してもよいであろう。その代わりに、ある好適な実施
例では、単一のホスト株を操作して、上記の多糖分解酵素のすべてを産生するよ
うにする。いずれの場合も、糖基質に用いるべく、所望の多糖分解酵素の発現度
の高い組換えホストの培養物を作製する。必要に応じ、この混合物を、例えば真
菌セルラーゼなどの外生のセルラーゼなど、追加のセルラーゼと組み合わせても
よい。こうしてこの混合物を用いて複合糖を分解する。あるいはその代わりに、
複合糖基質の添加前に、多糖分解酵素を細胞及び／又は培地から標準的な生化学
技術を用いて精製し、糖基質を脱重合させる純粋な酵素源として利用する。
ようにデザインするか、又は、異なる多糖分解酵素を発現する別のホストと混合
する。例えば、一方のホスト細胞が異種のβ−グルコシダーゼを発現し、別のホ
スト細胞が、エンドグルカナーゼを発現し、さらに別のホスト細胞がエキソグル
カナーゼを発現し、これらの細胞を組み合わせて、複数の多糖分解酵素活性を有
する不均質な培養物を形成してもよいであろう。その代わりに、ある好適な実施
例では、単一のホスト株を操作して、上記の多糖分解酵素のすべてを産生するよ
うにする。いずれの場合も、糖基質に用いるべく、所望の多糖分解酵素の発現度
の高い組換えホストの培養物を作製する。必要に応じ、この混合物を、例えば真
菌セルラーゼなどの外生のセルラーゼなど、追加のセルラーゼと組み合わせても
よい。こうしてこの混合物を用いて複合糖を分解する。あるいはその代わりに、
複合糖基質の添加前に、多糖分解酵素を細胞及び／又は培地から標準的な生化学
技術を用いて精製し、糖基質を脱重合させる純粋な酵素源として利用する。
【００９１】
最後に、当業者であれば、本発明のエタノール生成細菌株は、組換えタンパク
質の産生については優れたホストであることを理解されよう。それはなぜなら、
（例えば酸素のない状態など）嫌気性条件下では、（例えばジスルフィド結合形
成が不適切に起きることが原因の）タンパク質の誤った折り畳みが起きる可能性
が小さくなるからである。このように、本発明のホスト及び培養条件は、生物学
的に活性な生成物をより大量に回収できる可能性を提供する。
質の産生については優れたホストであることを理解されよう。それはなぜなら、
（例えば酸素のない状態など）嫌気性条件下では、（例えばジスルフィド結合形
成が不適切に起きることが原因の）タンパク質の誤った折り畳みが起きる可能性
が小さくなるからである。このように、本発明のホスト及び培養条件は、生物学
的に活性な生成物をより大量に回収できる可能性を提供する。
【００９２】
複合糖を発酵させる
本発明のある好適な実施例では、上記の属性を有するホスト細胞はエタノール
生成性でもある。従って、このようなホスト細胞は、複合糖を単糖へ分解する又
は脱重合するのに利用できる。次にこの細胞は、この簡単な糖をエタノールに発
酵により異化することができる。複合糖の、より小型の糖残基への脱重合と、そ
れに続く発酵という、これらの同時のプロセスを同時糖化発酵と呼ぶ。
生成性でもある。従って、このようなホスト細胞は、複合糖を単糖へ分解する又
は脱重合するのに利用できる。次にこの細胞は、この簡単な糖をエタノールに発
酵により異化することができる。複合糖の、より小型の糖残基への脱重合と、そ
れに続く発酵という、これらの同時のプロセスを同時糖化発酵と呼ぶ。
【００９３】
典型的には、生成ホスト細胞株の最良な成長動態を促進する至適ｐＨ及び温度
と、培養物が生ずる酵素の触媒条件とを提供する発酵条件を選択する（Doran et
al., (1993) Biotechnol. Progress. 9:533-538)。例えば、P2株などのクレブ
シエラの場合、至適条件は３５から３７℃の間、pHは 5.0から pH 5.4であると
決定された。これらの条件下では、外から加えられた真菌エンドグルカナーゼ及
びエキソグルカナーゼですら、大変に安定であり、長時間、機能し続ける。他の
条件を実施例の項で述べる。さらに、当業者であれば、本発明の発酵反応を至適
化するには、当業で公知の技術を用いたごく日常的な実験が必要であることは理
解されよう。
と、培養物が生ずる酵素の触媒条件とを提供する発酵条件を選択する（Doran et
al., (1993) Biotechnol. Progress. 9:533-538)。例えば、P2株などのクレブ
シエラの場合、至適条件は３５から３７℃の間、pHは 5.0から pH 5.4であると
決定された。これらの条件下では、外から加えられた真菌エンドグルカナーゼ及
びエキソグルカナーゼですら、大変に安定であり、長時間、機能し続ける。他の
条件を実施例の項で述べる。さらに、当業者であれば、本発明の発酵反応を至適
化するには、当業で公知の技術を用いたごく日常的な実験が必要であることは理
解されよう。
【００９４】
現在のところ、リグノセルロースなどの複合糖の転化は、大変込み入った、多
段階のプロセスである。例えば、酸分解法を利用してリグノセルロースをまず分
解又は脱重合しなければならない。次に、固体から液体を分離した後、その生成
物を洗浄し、解毒し、さらに（追加のセルラーゼを用いて）脱重合の可能なセル
ロース及びヘミセルロースを生じさせ、最終的には、適したエタノール生成性ホ
スト細胞によって発酵させるといったステップが続く。対照的に、とうもろこし
の発酵はずっと簡単であり、アミラーゼを用いてとうもろこしでんぷんを分解し
、すぐにエタノール生成性ホストに生物変換させるという、基本的には一回のス
テップのプロセスで行える。従って、当業者であれば、本発明の組換えホスト及
び方法により、リグノセルロースを発酵させるのに、同様なより簡単、かつ、よ
り効率的なプロセスを利用可能となることは、理解されよう。例えば本発明の方
法は、酸分解を完全に避けた方法を包含するものと、意図されている。さらに本
発明のホストは異化の長所を有する。即ち、１）ペントース及びヘキソースの同
時発酵の効率、２）毒素に対する耐性、３）複合糖の脱重合のための酵素の産生
、及び４）環境への強さ、である。従って、リグノセルロースを脱重合させる際
の複雑さを、本発明の向上した生体触媒を用いて簡潔にすることができる。実際
、本発明の好適な実施例の一つでは、単一の反応容器で、かつ、酸分解のない状
態で、例えばＳＳＦ法などとして、反応を行わせることができる。
段階のプロセスである。例えば、酸分解法を利用してリグノセルロースをまず分
解又は脱重合しなければならない。次に、固体から液体を分離した後、その生成
物を洗浄し、解毒し、さらに（追加のセルラーゼを用いて）脱重合の可能なセル
ロース及びヘミセルロースを生じさせ、最終的には、適したエタノール生成性ホ
スト細胞によって発酵させるといったステップが続く。対照的に、とうもろこし
の発酵はずっと簡単であり、アミラーゼを用いてとうもろこしでんぷんを分解し
、すぐにエタノール生成性ホストに生物変換させるという、基本的には一回のス
テップのプロセスで行える。従って、当業者であれば、本発明の組換えホスト及
び方法により、リグノセルロースを発酵させるのに、同様なより簡単、かつ、よ
り効率的なプロセスを利用可能となることは、理解されよう。例えば本発明の方
法は、酸分解を完全に避けた方法を包含するものと、意図されている。さらに本
発明のホストは異化の長所を有する。即ち、１）ペントース及びヘキソースの同
時発酵の効率、２）毒素に対する耐性、３）複合糖の脱重合のための酵素の産生
、及び４）環境への強さ、である。従って、リグノセルロースを脱重合させる際
の複雑さを、本発明の向上した生体触媒を用いて簡潔にすることができる。実際
、本発明の好適な実施例の一つでは、単一の反応容器で、かつ、酸分解のない状
態で、例えばＳＳＦ法などとして、反応を行わせることができる。
【００９５】
エタノールへの生物変換のための潜在的な基質
本発明の長所の一つは、これまであまり利用されてこなかった糖源を利用でき
る能力である。
る能力である。
【００９６】
数多くの複合糖基質を、本発明のホスト細胞及び方法を用いた脱重合及びその
後の発酵の出発材料として利用してよい。理想的には、リサイクルの可能な資源
をＳＳＦ法で用いるとよい。混合廃棄事務用紙が好適な基質であり(Brooks et a
l., (1995) Biotechnol. Progress. 11:619-625; Ingram et al., (1995) 米国
特許第5,424,202号)、酸で予備処理したバガス(Doran et al., (1994) Biotech.
Bioeng. 44:240-247)又は高度に精製された結晶セルロース(Doran et al. (199
3) Biotechnol. Progress. 9:533-538)よりもはるかに容易に消化される。エン
ドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼの両方とも、グルカナーゼはセルロース
結合ドメインを含有するため、遠心分離によって未消化のセルロース残渣を回収
すれば、その後の発酵に向けてこれらの酵素を容易にリサイクルできる (Brooks
et al., (1995) Biotechnol. Progress. 11:619-625)。酵素を結合させた状態
で有するこの残渣を出発物として加えることにより、（単位基質当たりの）エタ
ノール収率は、理論収率の８０％を越えるところまで増加し、と同時に真菌の酵
素利用率は６０％減少した（図２）。リグニン含有率の高い基質ではリサイクル
回数が限られるであろうが、このような方法は精製セルロースでは成功する。本
発明の範囲内にある他の基質源には、例えば芝生の切りくず、外皮、穂軸、茎、
葉、繊維、パルプ、大麻、のこぎりくず、新聞紙、等々など、あらゆる種類の処
理済み又は未処理の植物材料がある。
後の発酵の出発材料として利用してよい。理想的には、リサイクルの可能な資源
をＳＳＦ法で用いるとよい。混合廃棄事務用紙が好適な基質であり(Brooks et a
l., (1995) Biotechnol. Progress. 11:619-625; Ingram et al., (1995) 米国
特許第5,424,202号)、酸で予備処理したバガス(Doran et al., (1994) Biotech.
Bioeng. 44:240-247)又は高度に精製された結晶セルロース(Doran et al. (199
3) Biotechnol. Progress. 9:533-538)よりもはるかに容易に消化される。エン
ドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼの両方とも、グルカナーゼはセルロース
結合ドメインを含有するため、遠心分離によって未消化のセルロース残渣を回収
すれば、その後の発酵に向けてこれらの酵素を容易にリサイクルできる (Brooks
et al., (1995) Biotechnol. Progress. 11:619-625)。酵素を結合させた状態
で有するこの残渣を出発物として加えることにより、（単位基質当たりの）エタ
ノール収率は、理論収率の８０％を越えるところまで増加し、と同時に真菌の酵
素利用率は６０％減少した（図２）。リグニン含有率の高い基質ではリサイクル
回数が限られるであろうが、このような方法は精製セルロースでは成功する。本
発明の範囲内にある他の基質源には、例えば芝生の切りくず、外皮、穂軸、茎、
葉、繊維、パルプ、大麻、のこぎりくず、新聞紙、等々など、あらゆる種類の処
理済み又は未処理の植物材料がある。
【００９７】
さらに本発明の実例を以下の実施例により挙げるが、以下の実施例を限定的な
ものと捉えられてはならない。
ものと捉えられてはならない。
【００９８】
実施例１
オリゴ糖をエタノールに発酵させるのに適した組換えエシェリヒアホストの作製
法 この実施例では、オリゴ糖をエタノールに発酵させるのに適したエシェリヒア
ホストを開発し利用する方法を解説する。具体的には、多糖分解酵素（例えばグ
ルカナーゼ）の発現を増加させるのに利用可能な強力なプロモータを特定する。
加えて、エルウィニア−クリサンセミ（Erwinia chrysanthemi ）由来の遺伝子
を用いて、多糖分解酵素の分泌を促し、それにより、所望の多糖分解酵素活性を
放出させるのに細胞を破壊する必要を無くす。この実施例を通じて、特に他に明
示しない場合は、以下の材料及び方法を用いる。
法 この実施例では、オリゴ糖をエタノールに発酵させるのに適したエシェリヒア
ホストを開発し利用する方法を解説する。具体的には、多糖分解酵素（例えばグ
ルカナーゼ）の発現を増加させるのに利用可能な強力なプロモータを特定する。
加えて、エルウィニア−クリサンセミ（Erwinia chrysanthemi ）由来の遺伝子
を用いて、多糖分解酵素の分泌を促し、それにより、所望の多糖分解酵素活性を
放出させるのに細胞を破壊する必要を無くす。この実施例を通じて、特に他に明
示しない場合は、以下の材料及び方法を用いる。
【００９９】
材料及び方法
生物及び培養条件
この実施例で用いた細菌株及びプラスミドを下の表１に挙げる。
【０１００】
プラスミド作製には、ホスト細胞Ｅ．コリDH5α を用いた。多糖分解酵素（例
えばグルカナーゼ）をコードする、利用した遺伝子は、具体的にはエルウィニア
−クリサンセミ（Erwinia chrysanthemi ） P86021 由来のcelZ遺伝子であった
（Beall, (1995) Ph.D. Dissertation, University of Florida; Wood et al.,
(1997) Biotech. Bioeng. 55:547-555)。分泌を向上させるのに利用した遺伝子
は、具体的にはＥ．クリサンセミ（chrysanthemi） EC16由来のout遺伝子であっ
た (He et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:1079-1083)。
えばグルカナーゼ）をコードする、利用した遺伝子は、具体的にはエルウィニア
−クリサンセミ（Erwinia chrysanthemi ） P86021 由来のcelZ遺伝子であった
（Beall, (1995) Ph.D. Dissertation, University of Florida; Wood et al.,
(1997) Biotech. Bioeng. 55:547-555)。分泌を向上させるのに利用した遺伝子
は、具体的にはＥ．クリサンセミ（chrysanthemi） EC16由来のout遺伝子であっ
た (He et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:1079-1083)。
【０１０１】
典型的には、ホスト細胞培養株を、ルリア−ベルタニブロス（ＬＢ）(10 g L- 1
ディフコ（Ｒ）トリプトン、5 g L-1ディフコ（Ｒ）酵母抽出物、 5 g L-1 塩
化ナトリウム)又はルリア寒天 (15 g L-1の寒天を補ったＬＢ)中で成長させた。
グルカナーゼcelZ活性（ＥＧＺ）を有するホスト細胞をスクリーニングするため
には、CMC−プレート（カルボキシメチルセルロース(3 g L-1)を含有するルリア
寒天プレート)を用いた(Wood et al., (1988) Methods in Enzymology 160:87-1
12)。適切な場合は、抗生物質アンピシリン(50 mg L-1)、スペクチノマイシン（
100 g L-1)、カナマイシン(50 g L-1) を培地に加えて、耐性マーカを含有する
組換え体又は組み込み体のホスト細胞を選別できるようにした。温度条件的pSC1
01レプリコン(Posfai et al., (1997) J. Bacteriol. 179:4426-4428)を持つプ
ラスミドを含有する作製物を３０℃で成長させ、特に他に明示しない場合は、pU
Cを基にしたプラスミドを持つ作製物を３７℃で成長させた。
化ナトリウム)又はルリア寒天 (15 g L-1の寒天を補ったＬＢ)中で成長させた。
グルカナーゼcelZ活性（ＥＧＺ）を有するホスト細胞をスクリーニングするため
には、CMC−プレート（カルボキシメチルセルロース(3 g L-1)を含有するルリア
寒天プレート)を用いた(Wood et al., (1988) Methods in Enzymology 160:87-1
12)。適切な場合は、抗生物質アンピシリン(50 mg L-1)、スペクチノマイシン（
100 g L-1)、カナマイシン(50 g L-1) を培地に加えて、耐性マーカを含有する
組換え体又は組み込み体のホスト細胞を選別できるようにした。温度条件的pSC1
01レプリコン(Posfai et al., (1997) J. Bacteriol. 179:4426-4428)を持つプ
ラスミドを含有する作製物を３０℃で成長させ、特に他に明示しない場合は、pU
Cを基にしたプラスミドを持つ作製物を３７℃で成長させた。
【０１０２】
【表１】
【０１０３】
標準的方法を全てのプラスミド作製に用いた（Ausubel et al., (1987) Curre
nt Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.; Sambrook et
al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual，2nd ed. C.S.H.L., C
old Spring Harbor, N.Y)。小規模プラスミド単離を行うためには、TELT法を行
った。大規模プラスミド単離を行うためには、プロメガ（Ｒ）ウィザード・キッ
トを用いた。ゲルからＤＮＡ断片を単離するには、キアゲン（Ｒ）社のキアクイ
ック（Ｒ）ゲル・エクストラクション・キットを用いた。染色体ＤＮＡをＥ．コ
リ及びＺ．モビリスから単離するには、カッティング及びヨマノ氏の方法を用い
た（Cutting et al., (1990), Genetic analysis, pp. 61-74, In, Molecular b
iological methods for Bacillus, John Wiley & Sons, Inc.; Yomano et al.,
(1993) J. Bacteriol. 175:3926-3933。
nt Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.; Sambrook et
al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual，2nd ed. C.S.H.L., C
old Spring Harbor, N.Y)。小規模プラスミド単離を行うためには、TELT法を行
った。大規模プラスミド単離を行うためには、プロメガ（Ｒ）ウィザード・キッ
トを用いた。ゲルからＤＮＡ断片を単離するには、キアゲン（Ｒ）社のキアクイ
ック（Ｒ）ゲル・エクストラクション・キットを用いた。染色体ＤＮＡをＥ．コ
リ及びＺ．モビリスから単離するには、カッティング及びヨマノ氏の方法を用い
た（Cutting et al., (1990), Genetic analysis, pp. 61-74, In, Molecular b
iological methods for Bacillus, John Wiley & Sons, Inc.; Yomano et al.,
(1993) J. Bacteriol. 175:3926-3933。
【０１０４】
ここに解説した二つの糖分解遺伝子プロモータ（例えば gap及びeno)を単離す
るために、Ｅ．コリDH5α由来の精製染色体ＤＮＡをテンプレートとして用い、
以下のプライマ対: gapプロモータ、5'-CGAATTCCTGCCGAAGTTTATTAGCCA-3' (SEQ
ID NO: 3)及び5'-AAGGATCCTTCCACCAGCTATTTGTTAGTGA-3' (SEQ ID NO: 4); eno
プロモータ、 5'-AGAATTCTGCCAGTTGGTTGACGATAG-3' (SEQ ID NO: 5) 及び5'-CAG
GATCCCCTCAAGTCACTAGTTAAACTG-3' (SEQ ID NO: 6)を用いてこれらの核酸をＰＣ
Ｒ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅した。Ｅ．クリサンセミ（chrysanthemi） (pC
PP2006)由来の分泌タンパク質をコードするout遺伝子をＥ．コリに、可動化のた
めにpRK2013を用いて接合した(Figurski et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA. 76: 1648-1652; Murata et al., (1990) J. Bacteriol. 172:2970-2978
）。
るために、Ｅ．コリDH5α由来の精製染色体ＤＮＡをテンプレートとして用い、
以下のプライマ対: gapプロモータ、5'-CGAATTCCTGCCGAAGTTTATTAGCCA-3' (SEQ
ID NO: 3)及び5'-AAGGATCCTTCCACCAGCTATTTGTTAGTGA-3' (SEQ ID NO: 4); eno
プロモータ、 5'-AGAATTCTGCCAGTTGGTTGACGATAG-3' (SEQ ID NO: 5) 及び5'-CAG
GATCCCCTCAAGTCACTAGTTAAACTG-3' (SEQ ID NO: 6)を用いてこれらの核酸をＰＣ
Ｒ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅した。Ｅ．クリサンセミ（chrysanthemi） (pC
PP2006)由来の分泌タンパク質をコードするout遺伝子をＥ．コリに、可動化のた
めにpRK2013を用いて接合した(Figurski et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA. 76: 1648-1652; Murata et al., (1990) J. Bacteriol. 172:2970-2978
）。
【０１０５】
目的の様々なＤＮＡの配列を決定するために、蛍光プライマを用いたジデオキ
シ配列決定法をLI-CORモデル4000-LＤＮＡシーケンサで行った。pST76-K-を基に
したプラスミドはT7プライマ(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (SEQ ID NO: 7))を
用いて一方向で配列決定した。pUC18- 及び pUCI9-を基にしたプラスミドは、正
方向プライマ (5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-3' (SEQ ID NO: 8))又は逆方向プライ
マ(5'TAACAATTTCACACAGGA-3' (SEQ ID NO: 9))のいずれかを用いて二方向で配列
決定した。この配列決定法の伸長反応は、パーキン・エルマGeneAmp（Ｒ）PCR 9
600及びSequiTherm ロング−リード・シーケンシング・キット-LC（Ｒ）を用い
て行わせた。次に、得られた配列をウィスコンシン・ジェネティック・コンピュ
ータ・グループ(GCG) ソフトウェアパッケージを用いて解析した (Devereux et
al., (1984) Nucleic Acids Rev. 12:387-395)。
シ配列決定法をLI-CORモデル4000-LＤＮＡシーケンサで行った。pST76-K-を基に
したプラスミドはT7プライマ(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (SEQ ID NO: 7))を
用いて一方向で配列決定した。pUC18- 及び pUCI9-を基にしたプラスミドは、正
方向プライマ (5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-3' (SEQ ID NO: 8))又は逆方向プライ
マ(5'TAACAATTTCACACAGGA-3' (SEQ ID NO: 9))のいずれかを用いて二方向で配列
決定した。この配列決定法の伸長反応は、パーキン・エルマGeneAmp（Ｒ）PCR 9
600及びSequiTherm ロング−リード・シーケンシング・キット-LC（Ｒ）を用い
て行わせた。次に、得られた配列をウィスコンシン・ジェネティック・コンピュ
ータ・グループ(GCG) ソフトウェアパッケージを用いて解析した (Devereux et
al., (1984) Nucleic Acids Rev. 12:387-395)。
【０１０６】
上記のプロモータ内の転写開始点を調べるために、標準的な技術を用いてプラ
イマ伸長解析を行った。具体的には、キアゲン社のRNeasy（Ｒ）キットを用い、
対数期後期にある細胞から単離したcelZ遺伝子ＲＮＡに一致のあるプライマを用
いて転写開始部位をマッピングすることで、プロモータ領域を特定した。簡単に
説明すると、0.2Mのスクロースを含有する、リゾチーム(400 mg/ml)の TE (Tris
-HCl、EDTA)溶液で細胞を処理し、２５℃で５分間インキュベートしてから溶解
させた。放出されたＲＮＡをエタノール沈殿させ、次に20μｌのプロメガ（Ｒ）
ＡＭＶ逆転写酵素緩衝液 (50 mM Tris-HCl、pH 8.3, 50 mM KCl、10 mM MgCl2、
0.5 mM スペルマジン、10 mM DTT)に溶解させた。次に、LI-Cor社のIRD41-で標
識したプライマ(5'GACTGGATGGTTATCCGAATAAGAGAGAGG-3' (SEQ ID NO: 10))を加
え、この試料を８０℃で５分間、変性させ、５５℃で１時間アニールさせてから
、アルコール沈殿により精製した。アニールした試料を、500 mMのdNTP及び10
単位のAMV逆転写酵素を含有する19μｌのAMV逆転写酵素緩衝液に溶解させ、イン
キュベートして伸長させた（４２℃で１時間）。生成物を0.5 mg/mlのDNaseフリ
ーRNase Aで処理し、沈殿させ、添加液に溶解させ、LI-CORモデル 4000-L DNAシ
ーケンサを用いて得たパラレルジデオキシプロモータの配列に比較した。
イマ伸長解析を行った。具体的には、キアゲン社のRNeasy（Ｒ）キットを用い、
対数期後期にある細胞から単離したcelZ遺伝子ＲＮＡに一致のあるプライマを用
いて転写開始部位をマッピングすることで、プロモータ領域を特定した。簡単に
説明すると、0.2Mのスクロースを含有する、リゾチーム(400 mg/ml)の TE (Tris
-HCl、EDTA)溶液で細胞を処理し、２５℃で５分間インキュベートしてから溶解
させた。放出されたＲＮＡをエタノール沈殿させ、次に20μｌのプロメガ（Ｒ）
ＡＭＶ逆転写酵素緩衝液 (50 mM Tris-HCl、pH 8.3, 50 mM KCl、10 mM MgCl2、
0.5 mM スペルマジン、10 mM DTT)に溶解させた。次に、LI-Cor社のIRD41-で標
識したプライマ(5'GACTGGATGGTTATCCGAATAAGAGAGAGG-3' (SEQ ID NO: 10))を加
え、この試料を８０℃で５分間、変性させ、５５℃で１時間アニールさせてから
、アルコール沈殿により精製した。アニールした試料を、500 mMのdNTP及び10
単位のAMV逆転写酵素を含有する19μｌのAMV逆転写酵素緩衝液に溶解させ、イン
キュベートして伸長させた（４２℃で１時間）。生成物を0.5 mg/mlのDNaseフリ
ーRNase Aで処理し、沈殿させ、添加液に溶解させ、LI-CORモデル 4000-L DNAシ
ーケンサを用いて得たパラレルジデオキシプロモータの配列に比較した。
【０１０７】
多糖分解酵素活性
celZ遺伝子の発現の結果生じた多糖分解酵素活性（例えばグルカナーゼ活性）
の量を調べるために、コンゴ・レッド法を用いた(Wood et al., (1988) Methods
in Enzymology 160:87-112)。具体的には、選択されたクローンをグリッデッド
（gridded）ＣＭＣプレートに移し、１８時間、３０℃でインキュベートした後
、染色すると、グルカナーゼを発現している組換えホスト細胞は赤いバックグラ
ウンド上に黄色の領域を形成した。従って、これらの着色領域の直径を、celZ発
現の相対的測定値として記録した。
の量を調べるために、コンゴ・レッド法を用いた(Wood et al., (1988) Methods
in Enzymology 160:87-112)。具体的には、選択されたクローンをグリッデッド
（gridded）ＣＭＣプレートに移し、１８時間、３０℃でインキュベートした後
、染色すると、グルカナーゼを発現している組換えホスト細胞は赤いバックグラ
ウンド上に黄色の領域を形成した。従って、これらの着色領域の直径を、celZ発
現の相対的測定値として記録した。
【０１０８】
さらに、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を基質として用いて、グルカ
ナーゼ活性（ＥＧＺ）を測定した。この検査では、無細胞培養ブロス（細胞外活
性）、又は、超音波で処理した細胞を含有するブロス（総活性）の適した希釈液
を、カルボキシメチルセルロース（20gL-1）を含有する50mMのクエン酸緩衝液（
ｐＨ５．２）中で３５℃で検定した。3から4mlの試料について至適酵素放出を起
こさせる条件は、細胞破砕機(ニューヨーク州プレインビュー、ヒート・システ
ム−ウルトラソニックス社製モデルW-220F）を用いると１秒ごとに全出力で４回
のパルスであると、決定された。この検定の酵素反応を停止させるために、試料
を沸騰水の水槽中で１０分間、加熱した。グルカナーゼにより酵素的に放出され
た還元糖を測定するために、グルコースを標準として用いて、ジニトロサリチル
酸試薬を用いた(Wood et al., (1988) Methods in Enzymology 160:87-112)。酵
素活性量（IU）を、１分間当たりに放出された還元糖のμモル数か、又は、二回
以上の検査値の平均から採った総活性のパーセンテージとして表した。
ナーゼ活性（ＥＧＺ）を測定した。この検査では、無細胞培養ブロス（細胞外活
性）、又は、超音波で処理した細胞を含有するブロス（総活性）の適した希釈液
を、カルボキシメチルセルロース（20gL-1）を含有する50mMのクエン酸緩衝液（
ｐＨ５．２）中で３５℃で検定した。3から4mlの試料について至適酵素放出を起
こさせる条件は、細胞破砕機(ニューヨーク州プレインビュー、ヒート・システ
ム−ウルトラソニックス社製モデルW-220F）を用いると１秒ごとに全出力で４回
のパルスであると、決定された。この検定の酵素反応を停止させるために、試料
を沸騰水の水槽中で１０分間、加熱した。グルカナーゼにより酵素的に放出され
た還元糖を測定するために、グルコースを標準として用いて、ジニトロサリチル
酸試薬を用いた(Wood et al., (1988) Methods in Enzymology 160:87-112)。酵
素活性量（IU）を、１分間当たりに放出された還元糖のμモル数か、又は、二回
以上の検査値の平均から採った総活性のパーセンテージとして表した。
【０１０９】
超微細構造解析
様々な組換えホスト細胞の超微細構造を調べるために、ルリア寒天プレートの
新鮮なコロニを2%のグルタルアルデヒドを溶かした0.2Mのカコジル酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７）内に固定し、１％の四酸化オスミウム中で、続いて１％の酢酸
ウラニルの蒸留水溶液中で、インキュベートして、分析用に調製した。試料をエ
タノールで脱水し、スパーズ（Spurr's）プラスチック内に包埋し、超薄切片を
調製し、ザイス（Ｒ）EM-IOCA電子顕微鏡 (Spur (1969) J. Ultrastruct. Res.
26:31)を用いて調べた。
新鮮なコロニを2%のグルタルアルデヒドを溶かした0.2Mのカコジル酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７）内に固定し、１％の四酸化オスミウム中で、続いて１％の酢酸
ウラニルの蒸留水溶液中で、インキュベートして、分析用に調製した。試料をエ
タノールで脱水し、スパーズ（Spurr's）プラスチック内に包埋し、超薄切片を
調製し、ザイス（Ｒ）EM-IOCA電子顕微鏡 (Spur (1969) J. Ultrastruct. Res.
26:31)を用いて調べた。
【０１１０】
celZをレポータ遺伝子として用いた、低コピー数のプロモータ・プローブ・ベク
タの作製 強力なプロモータの単離を容易に行うために、pSC101レプリコンと、プロモー
タのないcelZ遺伝子の直前に来たBamHI部位とを持つ低コピー数のベクタを作製
した（pLO12171）。従って、このプロモータのないプラスミドを陰性対照として
用いた。プラスミドpLOI1620をcelZの源として用いたが、連続したlac及びcelz
プロモータから発現するpUC18類縁体である。このプラスミドのBamHI部位を消化
及びクレノウ処理で抹消した（pLOI2164）。クレノウ処理後、celZ遺伝子を、プ
ロモータのないNdeI断片として単離した。その結果生じた平滑末端断片をHindII
Iで消化して下流のＤＮＡを除去し、pUC19（HindIIIからHincIIまで）に連結し
て、pLOI2170を作製した。このプラスミドでは、celZはlacZの転写方向とは反対
方向に向かっており、ごく僅かに発現した。次に、celZを含有するpLOI2170のBa
mHI（アミノ末端）−SphI（カルボキシル末端）断片を、温度感受性レプリコン
を持つ低コピー数のベクタであるpST76-Kの対応する部位にクローンして、pLOI2
171（図３）を作製した。このベクタでのcelZの発現は非常に低かったため、強
力なプロモータである候補を探す便利なプローブとして、これを利用することが
できる。
タの作製 強力なプロモータの単離を容易に行うために、pSC101レプリコンと、プロモー
タのないcelZ遺伝子の直前に来たBamHI部位とを持つ低コピー数のベクタを作製
した（pLO12171）。従って、このプロモータのないプラスミドを陰性対照として
用いた。プラスミドpLOI1620をcelZの源として用いたが、連続したlac及びcelz
プロモータから発現するpUC18類縁体である。このプラスミドのBamHI部位を消化
及びクレノウ処理で抹消した（pLOI2164）。クレノウ処理後、celZ遺伝子を、プ
ロモータのないNdeI断片として単離した。その結果生じた平滑末端断片をHindII
Iで消化して下流のＤＮＡを除去し、pUC19（HindIIIからHincIIまで）に連結し
て、pLOI2170を作製した。このプラスミドでは、celZはlacZの転写方向とは反対
方向に向かっており、ごく僅かに発現した。次に、celZを含有するpLOI2170のBa
mHI（アミノ末端）−SphI（カルボキシル末端）断片を、温度感受性レプリコン
を持つ低コピー数のベクタであるpST76-Kの対応する部位にクローンして、pLOI2
171（図３）を作製した。このベクタでのcelZの発現は非常に低かったため、強
力なプロモータである候補を探す便利なプローブとして、これを利用することが
できる。
【０１１１】
二つのＥ．コリ糖分解プロモータ（gap及びeno）からのcelZ発現の分析
Ｅ．コリで糖分解遺伝子を働かせるプロモータの二つの例（gap及びeno）を、
グルカナーゼをコードする異種のcelZ遺伝子の発現を開始させる上でのそれらの
能力について調べた。Ｅ．コリDH5α株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして用
いて、gap及びenoプロモータ領域をポリメラーゼ連鎖反応で増幅した。生成した
それぞれ約４００ｂｐの断片をEcoRI及びBamHIで消化し、pLOI2171のプロモータ
のないcelZ遺伝子の前の対応する部位にクローンして、pLOI2174（gapプロモー
タ）及び pLOI2175 （enoプロモータ）を作製した。対照として、完全なcelZ遺
伝子及び天然Ｅ．クリサンセミのプロモータを含有するpLOI2164から採ったEcoR
I-SphI断片をpST76-Kの対応する部位にクローンして、pLOI2173を作製した。こ
れら三つのプラスミドをＥ．コリ株B及びDH5α内に導入して、グルカナーゼ活性
（ＥＧＺ）を比較した。Ｅ．コリの両方の株で、グルカナーゼ活性は、Ｅ．コリ
の糖分解プロモータを持つＣＭＣプレートの方が、天然Ｅ．クリサンセミプロモ
ータを含有するpLOI2173のプレートよりも低かった（表２）。活性が各領域の半
径の二乗に関係すると想定すると（フィックの拡散の法則）、糖分解プロモータ
（pLOI2174 及びpLOI2175)によるＥＧＺ生成は、元の作製物よりも３３％から６
５％低いと推定された。従って、高レベルのcelZ遺伝子発現を働かせる他の候補
プロモータを調べた。
グルカナーゼをコードする異種のcelZ遺伝子の発現を開始させる上でのそれらの
能力について調べた。Ｅ．コリDH5α株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして用
いて、gap及びenoプロモータ領域をポリメラーゼ連鎖反応で増幅した。生成した
それぞれ約４００ｂｐの断片をEcoRI及びBamHIで消化し、pLOI2171のプロモータ
のないcelZ遺伝子の前の対応する部位にクローンして、pLOI2174（gapプロモー
タ）及び pLOI2175 （enoプロモータ）を作製した。対照として、完全なcelZ遺
伝子及び天然Ｅ．クリサンセミのプロモータを含有するpLOI2164から採ったEcoR
I-SphI断片をpST76-Kの対応する部位にクローンして、pLOI2173を作製した。こ
れら三つのプラスミドをＥ．コリ株B及びDH5α内に導入して、グルカナーゼ活性
（ＥＧＺ）を比較した。Ｅ．コリの両方の株で、グルカナーゼ活性は、Ｅ．コリ
の糖分解プロモータを持つＣＭＣプレートの方が、天然Ｅ．クリサンセミプロモ
ータを含有するpLOI2173のプレートよりも低かった（表２）。活性が各領域の半
径の二乗に関係すると想定すると（フィックの拡散の法則）、糖分解プロモータ
（pLOI2174 及びpLOI2175)によるＥＧＺ生成は、元の作製物よりも３３％から６
５％低いと推定された。従って、高レベルのcelZ遺伝子発現を働かせる他の候補
プロモータを調べた。
【０１１２】
異種の遺伝子発現のプロモータとして用いるのに適したランダムＤＮＡ断片を
特定及びクローンする Ｚ．モビリス由来のランダム断片は、Ｅ．コリ内で異種遺伝子を高レベルで発
現させるサロゲート・プロモータの効果的な供給源かも知れない（Conway et al
., (1987) J. Bacteriol. 169:2327-2335; Ingram et al., (1988) Appl. Envir
on. Micro. 54:397-404)。従って、エルウィニアのcelZ発現のためのサロゲート
・プロモータを特定するために、Ｚ．モビリス染色体ＤＮＡをSau3AIでよく消化
し、生成した断片をpLOI2171にBamHI部位で連結して、Ｅ．コリDH5α内に導入し
て、潜在的な候補プロモータのライブラリを作製した。celZ遺伝子発現をＥ．コ
リ内で起こさせることのできる、より優れた候補プロモータを迅速に特定するた
めに、以下の生物学的スクリーンを利用した。様々なランダム候補プロモータを
有するcelZプラスミドで形質転換させたコロニを、グリッデッド（gridded）Ｃ
ＭＣプレートに移し、インキュベート後、グルカナーゼ活性について染色した（
表２）。テストした18,000のクローンのうち約２０％が、ＣＭＣ陽性であった。
対照であるpLOI2173よりも大きな領域を生じた75のクローンを、さらに別の株、
Ｅ．コリBを用いて調べた。
特定及びクローンする Ｚ．モビリス由来のランダム断片は、Ｅ．コリ内で異種遺伝子を高レベルで発
現させるサロゲート・プロモータの効果的な供給源かも知れない（Conway et al
., (1987) J. Bacteriol. 169:2327-2335; Ingram et al., (1988) Appl. Envir
on. Micro. 54:397-404)。従って、エルウィニアのcelZ発現のためのサロゲート
・プロモータを特定するために、Ｚ．モビリス染色体ＤＮＡをSau3AIでよく消化
し、生成した断片をpLOI2171にBamHI部位で連結して、Ｅ．コリDH5α内に導入し
て、潜在的な候補プロモータのライブラリを作製した。celZ遺伝子発現をＥ．コ
リ内で起こさせることのできる、より優れた候補プロモータを迅速に特定するた
めに、以下の生物学的スクリーンを利用した。様々なランダム候補プロモータを
有するcelZプラスミドで形質転換させたコロニを、グリッデッド（gridded）Ｃ
ＭＣプレートに移し、インキュベート後、グルカナーゼ活性について染色した（
表２）。テストした18,000のクローンのうち約２０％が、ＣＭＣ陽性であった。
対照であるpLOI2173よりも大きな領域を生じた75のクローンを、さらに別の株、
Ｅ．コリBを用いて調べた。
【０１１３】
【表２】
【０１１４】ａ
活性の範囲を示したクローンの数ｂ
三つのＣＭＣ消化領域の直径の平均の大きさｃ
R2 xは、テストプラスミドのある浄化領域の半径の二乗である：R2 cは、対照
（pLOI2173）の浄化領域の半径の二乗である。
（pLOI2173）の浄化領域の半径の二乗である。
【０１１５】
このように、選択された候補プロモータのプロモータとしての強さは、二つの
異なる株で確認され、大まかに言うと、株Bの組換え体よりも大きな領域（例え
ばグルカナーゼがより多いなど）をDH5αの組換え体は生じた。しかしながら、
各ホストでの相対的なプロモータの強さは、大半のクローンについて同様であっ
た。ＣＭＣプレートを用いて領域の大きさで測定したグルカナーゼ産生に関する
これらの分析に基づくと、四つのクローンが、元のＥ．クリサンセミcelZ遺伝子
を持つ作製物（pLOI2173）よりも約６倍高いレベル、そしてＥ．コリ糖分解プロ
モータのいずれかよりも１０倍高いレベルで、celZを発現すると思われた。従っ
て、これらの、及び、同様に強い候補プロモータを更なる研究対象に選んだ。
異なる株で確認され、大まかに言うと、株Bの組換え体よりも大きな領域（例え
ばグルカナーゼがより多いなど）をDH5αの組換え体は生じた。しかしながら、
各ホストでの相対的なプロモータの強さは、大半のクローンについて同様であっ
た。ＣＭＣプレートを用いて領域の大きさで測定したグルカナーゼ産生に関する
これらの分析に基づくと、四つのクローンが、元のＥ．クリサンセミcelZ遺伝子
を持つ作製物（pLOI2173）よりも約６倍高いレベル、そしてＥ．コリ糖分解プロ
モータのいずれかよりも１０倍高いレベルで、celZを発現すると思われた。従っ
て、これらの、及び、同様に強い候補プロモータを更なる研究対象に選んだ。
【０１１６】
グルカナーゼの産生及び分泌
pST76-Kの八つのプラスミド類縁体(pLOI2177 からpLOI2184まで)を上記のスク
リーン（グループＩ及びグループＩＩ（表２）を参照されたい）から選択し、Ｅ
．コリ株B内での総グルカナーゼ活性について検定した（表３）。ＣＭＣプレー
ト上で最も大きな領域を形成した四つのプラスミドは、さらにグルカナーゼ活性
が最も高いことを確認した（ (pLOI2177、pLOI2180、pLOI2182、及びpLOI2183)
。これらの活性は、未改変のcelZ (pLOI2173)のそれよりも約６倍高く、ＣＭＣ
プレート上での浄化領域の半径の二乗に基づいた我々の予測と大変一致していた
。図４は、分泌タンパク質をコードするout遺伝子を加えた、又は、加えない状
態で行った、様々な別々のプロモータを含有する株Bについて調べた、ＣＭＣプ
レートで予測した活性及びインビトロ酵素検定の比較を示す。何らかの散らばり
はあるが、直接的な関係がはっきりと分かり、相対的活性を予測するこのプレー
ト法の有効性が裏付けられた。高コピー数のプラスミドであるpUC18を用いた最
初の作製物も、比較のために含めた（pLOI2164）。lac及びcelZプロモータを連
続して有するこの作製物が生じたＥＧＺ活性は、サロゲート・プロモータを持つ
三つの低コピー数のプラスミド(pLOI2177、pLOI2182、及びpLOI2183)よりも低か
った。このように、celZにによるグルカナーゼ発現をさらに増加させるために、
celZと、最も効果的なサロゲート・プロモータとを含有するＤＮＡ断片を(EcoRI
-SphI断片として)pLOI2183 から単離し、lacプロモータとは反対の転写方向でpU
Cl9 に挿入した(pLOI2307)。従って、上記の強力なサロゲート・プロモータを高
コピー数のプラスミドに導入すると、グルカナーゼ活性がさらに２倍に増加した
。
リーン（グループＩ及びグループＩＩ（表２）を参照されたい）から選択し、Ｅ
．コリ株B内での総グルカナーゼ活性について検定した（表３）。ＣＭＣプレー
ト上で最も大きな領域を形成した四つのプラスミドは、さらにグルカナーゼ活性
が最も高いことを確認した（ (pLOI2177、pLOI2180、pLOI2182、及びpLOI2183)
。これらの活性は、未改変のcelZ (pLOI2173)のそれよりも約６倍高く、ＣＭＣ
プレート上での浄化領域の半径の二乗に基づいた我々の予測と大変一致していた
。図４は、分泌タンパク質をコードするout遺伝子を加えた、又は、加えない状
態で行った、様々な別々のプロモータを含有する株Bについて調べた、ＣＭＣプ
レートで予測した活性及びインビトロ酵素検定の比較を示す。何らかの散らばり
はあるが、直接的な関係がはっきりと分かり、相対的活性を予測するこのプレー
ト法の有効性が裏付けられた。高コピー数のプラスミドであるpUC18を用いた最
初の作製物も、比較のために含めた（pLOI2164）。lac及びcelZプロモータを連
続して有するこの作製物が生じたＥＧＺ活性は、サロゲート・プロモータを持つ
三つの低コピー数のプラスミド(pLOI2177、pLOI2182、及びpLOI2183)よりも低か
った。このように、celZにによるグルカナーゼ発現をさらに増加させるために、
celZと、最も効果的なサロゲート・プロモータとを含有するＤＮＡ断片を(EcoRI
-SphI断片として)pLOI2183 から単離し、lacプロモータとは反対の転写方向でpU
Cl9 に挿入した(pLOI2307)。従って、上記の強力なサロゲート・プロモータを高
コピー数のプラスミドに導入すると、グルカナーゼ活性がさらに２倍に増加した
。
【０１１７】
グルカナーゼの分泌増加を操作する
上記の結果をさらに向上させてcelZにコードされたグルカナーゼの発現を高め
るべく、分泌が増加するように上記のホスト細胞を操作した。Ｅ．クリサンセミ
E16を由来とする分泌タンパク質をコードする遺伝子（例えばout遺伝子）を用い
て、out遺伝子を含有するヒー氏らの説いたプラスミド(pCPP2006)を用いてグル
カナーゼの輸出を高めようとした (He et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 88:1079-1083)。Ｅ．コリBでのＥＧＺの分泌増加を調べたが、その結果を
表３に示す。
るべく、分泌が増加するように上記のホスト細胞を操作した。Ｅ．クリサンセミ
E16を由来とする分泌タンパク質をコードする遺伝子（例えばout遺伝子）を用い
て、out遺伝子を含有するヒー氏らの説いたプラスミド(pCPP2006)を用いてグル
カナーゼの輸出を高めようとした (He et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 88:1079-1083)。Ｅ．コリBでのＥＧＺの分泌増加を調べたが、その結果を
表３に示す。
【０１１８】
【表３】
【０１１９】ａ
プラスミドpLOI2173 及びpLOI2164はcelZ天然プロモータを含有する；pLOI2
307 はpLOI2183由来の強力なプロモータを含有する。 プラスミドpLOI2164 及びpLOI2307はpUC-を基にしたプラスミド（高コピー数）
である。その他のプラスミドはすべて、pST76-Kの類縁体 (低コピー数)である。ｂ グルカナーゼ活性は、３０℃で１６時間成長させた後に調べた。ｃ 細胞外活性（分泌又は放出されたもの）。
307 はpLOI2183由来の強力なプロモータを含有する。 プラスミドpLOI2164 及びpLOI2307はpUC-を基にしたプラスミド（高コピー数）
である。その他のプラスミドはすべて、pST76-Kの類縁体 (低コピー数)である。ｂ グルカナーゼ活性は、３０℃で１６時間成長させた後に調べた。ｃ 細胞外活性（分泌又は放出されたもの）。
【０１２０】
低コピー数のプラスミドを持つ組換えホストは、（１６時間の成長後）、総Ｅ
ＧＺのうち、異種の分泌タンパク質（プラスミドpCPP2006がコードするoutタン
パク質)を持たない僅かに７から１７％を細胞外に生成した。高コピー数のpUC-
を基にしたプラスミドを持つホスト細胞の方が、同じプロモータを含有する低コ
ピー数のpST76-を基にしたプラスミドを持つものより、取り囲む細胞外ブロス中
に、より多量の（２０から２８％）ＥＧＺが見られた。しかしながら、いずれの
場合でも、分泌タンパク質をコードする(例えばpCPP2006)out遺伝子を加えると
、発現の合計レベルが最大で２倍に増加し、また細胞外酵素の割合（３８から７
４％）がほぼ４倍に増加した。最も高い活性は13,000IU/Lの総グルカナーゼであ
り、そのうちの7,800IU/Lは無細胞上清に見られたが、この最も高い活性は、強
力なサロゲート・プロモータで働くcelZをコードするpLOI2307と、out分泌タン
パク質をコードするpCPP2006の両方を有する株Bにより生成されたものだった。
ＧＺのうち、異種の分泌タンパク質（プラスミドpCPP2006がコードするoutタン
パク質)を持たない僅かに７から１７％を細胞外に生成した。高コピー数のpUC-
を基にしたプラスミドを持つホスト細胞の方が、同じプロモータを含有する低コ
ピー数のpST76-を基にしたプラスミドを持つものより、取り囲む細胞外ブロス中
に、より多量の（２０から２８％）ＥＧＺが見られた。しかしながら、いずれの
場合でも、分泌タンパク質をコードする(例えばpCPP2006)out遺伝子を加えると
、発現の合計レベルが最大で２倍に増加し、また細胞外酵素の割合（３８から７
４％）がほぼ４倍に増加した。最も高い活性は13,000IU/Lの総グルカナーゼであ
り、そのうちの7,800IU/Lは無細胞上清に見られたが、この最も高い活性は、強
力なサロゲート・プロモータで働くcelZをコードするpLOI2307と、out分泌タン
パク質をコードするpCPP2006の両方を有する株Bにより生成されたものだった。
【０１２１】
特定の条件（pH 7、３７℃）では、純粋なＥＧＺ酵素の特異的活性は 419 IU
であると報告されており (Py et al., (1991) Protein Engineering 4:325-333)
、これらの条件下で生成するＥＧＺは上記の条件（pH 5.2 のクエン酸緩衝液、
３５℃）下よりも２５％、活性が高いと判断された。従って、pH 5.2（３５℃）
での純粋な酵素の316IUという特異的活性を想定すると、(例えばグルカナーゼ及
び分泌タンパク質をコードするプラスミドなど、pLOI2307及びpCPP2006を含有す
る）Ｅ．コリBの培養物は、１リットル当たり又は、全ホスト細胞の４から６％
当たり、約４１ｍｇの活性ＥＧＺを生成したことになり、このタンパク質は活性
グルカナーゼである。
であると報告されており (Py et al., (1991) Protein Engineering 4:325-333)
、これらの条件下で生成するＥＧＺは上記の条件（pH 5.2 のクエン酸緩衝液、
３５℃）下よりも２５％、活性が高いと判断された。従って、pH 5.2（３５℃）
での純粋な酵素の316IUという特異的活性を想定すると、(例えばグルカナーゼ及
び分泌タンパク質をコードするプラスミドなど、pLOI2307及びpCPP2006を含有す
る）Ｅ．コリBの培養物は、１リットル当たり又は、全ホスト細胞の４から６％
当たり、約４１ｍｇの活性ＥＧＺを生成したことになり、このタンパク質は活性
グルカナーゼである。
【０１２２】
Ｚ．モビリスを由来とする最も強力なプロモータの配列解析
四つの最も強力なサロゲート・プロモータ（pLOI2177、pLOI2180、pLOI2182、
及びpLOI2183）の配列を調べた。このプロセスを簡単に行うために、それぞれを
pUC19にPstI 部位で接合した。その結果できたプラスミドpLOI2196、pLOI2197、
pLOI2198、及びpLOI2199を高コピー数（ColEIレプリコン）で生成し、M13及びT7
配列決定プライマを用いて両方向で配列決定することができた。四つのプラス
ミドはすべて、Ｚ．モビリス由来の全く同じのＤＮＡ断片を含有しており、同胞
であった。それぞれは1417塩基対長であり、４つのインターナルSau3AI部位を含
有していた。各断片のＤＮＡ配列及び翻訳後タンパク質の配列（６つの読み枠）
を現在のデータベースに比較した。一個の断片（281塩基対のインターナル断片
）のみが、ブラスト検索（ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー
・インフォメーション；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)で強いマッチを
示し、この断片は、Ｚ．モビリスhpnB遺伝子のうちで、細胞エンベロープの生合
成で働くと提案されている部分にＤＮＡ配列が９９％同一であった (Reipen et
al., (1995) Microbiology 141:155-161)。プライマ伸長解析の結果、一個の主
要な開始部位が、celZとのSau3AI/BamHI 接合部位から６７塩基上流に見つかり
、そして二番目のマイナーな開始部位がさらに上流に見つかった（図５）。-10
領域及び-35領域の配列を、Ｅ．コリシグマ因子について保存された配列に比較
した(Wang et al., (1989) J. Bacteriol. 180:5626-5631; Wise et al., (1996
) J. Bacteriol. 178:2785-2793)。この主要なプロモータ領域（全開始部位の約
８５％）は、シグマ７０プロモータと同様に思われたが、他方、二番目のプロモ
ータ部位はシグマ３８プロモータに似ていた。
及びpLOI2183）の配列を調べた。このプロセスを簡単に行うために、それぞれを
pUC19にPstI 部位で接合した。その結果できたプラスミドpLOI2196、pLOI2197、
pLOI2198、及びpLOI2199を高コピー数（ColEIレプリコン）で生成し、M13及びT7
配列決定プライマを用いて両方向で配列決定することができた。四つのプラス
ミドはすべて、Ｚ．モビリス由来の全く同じのＤＮＡ断片を含有しており、同胞
であった。それぞれは1417塩基対長であり、４つのインターナルSau3AI部位を含
有していた。各断片のＤＮＡ配列及び翻訳後タンパク質の配列（６つの読み枠）
を現在のデータベースに比較した。一個の断片（281塩基対のインターナル断片
）のみが、ブラスト検索（ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー
・インフォメーション；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)で強いマッチを
示し、この断片は、Ｚ．モビリスhpnB遺伝子のうちで、細胞エンベロープの生合
成で働くと提案されている部分にＤＮＡ配列が９９％同一であった (Reipen et
al., (1995) Microbiology 141:155-161)。プライマ伸長解析の結果、一個の主
要な開始部位が、celZとのSau3AI/BamHI 接合部位から６７塩基上流に見つかり
、そして二番目のマイナーな開始部位がさらに上流に見つかった（図５）。-10
領域及び-35領域の配列を、Ｅ．コリシグマ因子について保存された配列に比較
した(Wang et al., (1989) J. Bacteriol. 180:5626-5631; Wise et al., (1996
) J. Bacteriol. 178:2785-2793)。この主要なプロモータ領域（全開始部位の約
８５％）は、シグマ７０プロモータと同様に思われたが、他方、二番目のプロモ
ータ部位はシグマ３８プロモータに似ていた。
【０１２３】
グルカナーゼを産生する組換えホスト細胞の顕微鏡分析
光学顕微鏡では、組換え体と、親生物との間には、細胞形態ではほとんど違い
が観察されなかった。しかし電子顕微鏡では、多量のグルカナーゼを発現してい
る株B（pLOI2164）のペリプラスムに小型の極性封入体がはっきりと見え、これ
らの封入体は、ＥＧＺを含有していると予測された（図６）。活性が２倍高いグ
ルカナーゼを産生した株B（pLOI2307）では、封入体はさらに大きく、全細胞体
積の最大２０％を占めていた。これらの極体が大きいことは、グルカナーゼ活性
の測定値は総ＥＧＺ産生を過小評価する可能性があることを示唆している。多く
の場合、ペリプラスム間隙からのタンパク質分泌を増加させるout分泌タンパク
質をコードする作製物をさらに有するホスト細胞では、極性の封入体はより小型
であった。予測通り、グルカナーゼを産生しない陰性対照株B（pUC19）ではペリ
プラスムの封入体は見られなかった。
が観察されなかった。しかし電子顕微鏡では、多量のグルカナーゼを発現してい
る株B（pLOI2164）のペリプラスムに小型の極性封入体がはっきりと見え、これ
らの封入体は、ＥＧＺを含有していると予測された（図６）。活性が２倍高いグ
ルカナーゼを産生した株B（pLOI2307）では、封入体はさらに大きく、全細胞体
積の最大２０％を占めていた。これらの極体が大きいことは、グルカナーゼ活性
の測定値は総ＥＧＺ産生を過小評価する可能性があることを示唆している。多く
の場合、ペリプラスム間隙からのタンパク質分泌を増加させるout分泌タンパク
質をコードする作製物をさらに有するホスト細胞では、極性の封入体はより小型
であった。予測通り、グルカナーゼを産生しない陰性対照株B（pUC19）ではペリ
プラスムの封入体は見られなかった。
【０１２４】
実施例２
オリゴ糖を発酵させてエタノールにするのに適した組換えクレブシエラホスト
この実施例では、オリゴ糖を脱重合及び発酵させてエタノールにする生体触媒
として用いるのに適した組換えクレブシエラホストを解説する。
として用いるのに適した組換えクレブシエラホストを解説する。
【０１２５】
この実施例に用いた材料及び方法
他に特に明示する場合を除き、以下の材料及び方法を、下記の実施例で用いた
。
。
【０１２６】
細菌、プラスミド、及び培養条件
この実施例で用いた株及びプラスミドを、下の表４に要約する。
【０１２７】
【表４】
【０１２８】
Ｅ．コリ及びＫ．オキシトカM5A1を培養するのに用いた培養条件は、典型的に
は、１リットル当たり１０ｇのディフコ（Ｒ）トリプトン、５ｇの酵母抽出物、
及び５ｇの塩化ナトリウムを含有するルリア−ベルタニブロス（ＬＢ）か、又は
代替的に、ルリア寒天（１５ｇの寒天を補ったＬＢ）を用いるものであった (Sa
mbrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, C.S.H.L.,
Cold Spring Harbor, N.Y.)。
は、１リットル当たり１０ｇのディフコ（Ｒ）トリプトン、５ｇの酵母抽出物、
及び５ｇの塩化ナトリウムを含有するルリア−ベルタニブロス（ＬＢ）か、又は
代替的に、ルリア寒天（１５ｇの寒天を補ったＬＢ）を用いるものであった (Sa
mbrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, C.S.H.L.,
Cold Spring Harbor, N.Y.)。
【０１２９】
選択条件下で細菌コロニをスクリーニングするために、ＣＭＣプレート（３ｇ
L-1のカルボキシメチルセルロースを含有するルリア寒天プレート）を用いて、
所定の細菌株が発現したグルカナーゼ活性のレベルを調べた(Wood et al. (1988
) Enzymology, 160:87-112)。エタノール生成性株を培養するために、グルコー
スを固体培地（ 20 g L-1) 及びブロス (50 g L-1)に加えた。グルカナーゼ活性
を調べるときには、成長培地中のグルコースを非還元糖であるソルビトール (50
g L -1)に置き換えた。電気穿孔法で核酸を導入する前の様々な株又は培養物を
培養するには、改良ＳＯＣ培地を用いた（例えば20gL-1ディフコ（Ｒ）トリプト
ン、5gL-1ディフコ（Ｒ）酵母抽出物、10mM NaCl、 2.5 mM KCl、10 mM MgSO4、
10 mM MgCl2、及び50 gL-1グルコース)。抗生物質アンピシリン(50 mg L-1)、
スペクチノマイシン(100 mg L-1)、カナマイシン(50 mg L-1)、テトラサイクリ
ン(6 又は12 mg L-1)、及びクロラムフェニコール(40、200、又は600 mg L-1)
を、抗生物質耐性マーカを持つ組換えホストを選択するのに適当な場合に、加え
た。他に特に明示しない限り、培養物は３７℃で成長させた。エタノール生成性
株と、温度感受性pSC101レプリコンを持つプラスミドを含有する株は、３０℃で
成長させた。
L-1のカルボキシメチルセルロースを含有するルリア寒天プレート）を用いて、
所定の細菌株が発現したグルカナーゼ活性のレベルを調べた(Wood et al. (1988
) Enzymology, 160:87-112)。エタノール生成性株を培養するために、グルコー
スを固体培地（ 20 g L-1) 及びブロス (50 g L-1)に加えた。グルカナーゼ活性
を調べるときには、成長培地中のグルコースを非還元糖であるソルビトール (50
g L -1)に置き換えた。電気穿孔法で核酸を導入する前の様々な株又は培養物を
培養するには、改良ＳＯＣ培地を用いた（例えば20gL-1ディフコ（Ｒ）トリプト
ン、5gL-1ディフコ（Ｒ）酵母抽出物、10mM NaCl、 2.5 mM KCl、10 mM MgSO4、
10 mM MgCl2、及び50 gL-1グルコース)。抗生物質アンピシリン(50 mg L-1)、
スペクチノマイシン(100 mg L-1)、カナマイシン(50 mg L-1)、テトラサイクリ
ン(6 又は12 mg L-1)、及びクロラムフェニコール(40、200、又は600 mg L-1)
を、抗生物質耐性マーカを持つ組換えホストを選択するのに適当な場合に、加え
た。他に特に明示しない限り、培養物は３７℃で成長させた。エタノール生成性
株と、温度感受性pSC101レプリコンを持つプラスミドを含有する株は、３０℃で
成長させた。
【０１３０】
遺伝子法
プラスミド作製、クローニング及び形質転換のために、標準的方法及びＥ．コ
リDH5αホストを用いた (Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecu
lar Biology. John Wiley & Sons, Inc.; Sambrook et al., (1989) Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, C.S.H.L., Cold Spring Harbor, N.Y.)。 celz
組み込み体ベクタであるpLOI2306の作製は、図７に示すように行った。pLOI2306
由来のレプリコンを欠く環状ＤＮＡ断片（図７を参照されたい）をバイオ−ラド
・ジーン・パルサを用い、以下の条件を用いて、エタノール生成性Ｋ．オキシト
カP2に電気穿孔で入れた。即ち、この条件とは：3.8-4.0ミリ秒の測定された時
定数で2.5 kV and25μFである (Comaduran et al. (1998) Biotechnol. Lett. 2
0:489-493)。Ｅ．クリサンセミEC 16分泌系（pCPP2006)をＫ．オキシトカに、可
動化のためにpRK2013を用いて接合した (Murata et al. (1990) J. Bacteriol.
172:2970-2978)。小規模及び大規模なプラスミド単離をそれぞれTELT法及びプロ
メガ・ウィザード・キットを用いて行った。ＤＮＡ断片は、ゲルから、キアゲン
（Ｒ） (カリフォルニア州チャットワース、キアゲン社）のキアクイック（Ｒ）
ゲル・エクストラクション・キットを用いて単離した。Ｋ．オキシトカM5A1及び
Ｚ．モビリス CP4の染色体ＤＮＡはカッティング氏及びヨマノ氏らの説いたよう
に単離した（実施例１を参照されたい）。目的のＤＮＡを、 LI-COR モデル 400
0-L DNAシーケンサを用いて配列決定した (Wood et al. (1997) Biotech. Bioen
g. 55:547-555)。
リDH5αホストを用いた (Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecu
lar Biology. John Wiley & Sons, Inc.; Sambrook et al., (1989) Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, C.S.H.L., Cold Spring Harbor, N.Y.)。 celz
組み込み体ベクタであるpLOI2306の作製は、図７に示すように行った。pLOI2306
由来のレプリコンを欠く環状ＤＮＡ断片（図７を参照されたい）をバイオ−ラド
・ジーン・パルサを用い、以下の条件を用いて、エタノール生成性Ｋ．オキシト
カP2に電気穿孔で入れた。即ち、この条件とは：3.8-4.0ミリ秒の測定された時
定数で2.5 kV and25μFである (Comaduran et al. (1998) Biotechnol. Lett. 2
0:489-493)。Ｅ．クリサンセミEC 16分泌系（pCPP2006)をＫ．オキシトカに、可
動化のためにpRK2013を用いて接合した (Murata et al. (1990) J. Bacteriol.
172:2970-2978)。小規模及び大規模なプラスミド単離をそれぞれTELT法及びプロ
メガ・ウィザード・キットを用いて行った。ＤＮＡ断片は、ゲルから、キアゲン
（Ｒ） (カリフォルニア州チャットワース、キアゲン社）のキアクイック（Ｒ）
ゲル・エクストラクション・キットを用いて単離した。Ｋ．オキシトカM5A1及び
Ｚ．モビリス CP4の染色体ＤＮＡはカッティング氏及びヨマノ氏らの説いたよう
に単離した（実施例１を参照されたい）。目的のＤＮＡを、 LI-COR モデル 400
0-L DNAシーケンサを用いて配列決定した (Wood et al. (1997) Biotech. Bioen
g. 55:547-555)。
【０１３１】
celZの染色体組み込み
Ｅ．コリについて前に解説された手法を用いる温度条件的プラスミド(pLOI218
3)を用いた選択法 (Hamilton et al., (1989) J. Bacteriol. 171:4617-4622)と
、機能的レプリコンを持たない環状ＤＮＡ断片を直接組み込むという、二つの方
法を用いて、celZの染色体組み込みを行った。この同じ方法を、Ｅ．コリB(Ohta
K et al., (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900)及びＫ．オキシト
カM5A1 (Wood et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110)へ、エ
タノール経路をコードするＺ．モビリス遺伝子を染色体組み込みする際にも利用
した。典型的には、環状ＤＮＡを、P2に、バイオ−ラド・ジーン・パルサを用い
た電気穿孔法により形質転換させた。次に、形質転換体を、テトラサイクリン (
6 mg L-1) を含有する固体培地上で選別し、ＣＭＣプレート上で成長させて、グ
ルカナーゼ活性のレベルを調べた。
3)を用いた選択法 (Hamilton et al., (1989) J. Bacteriol. 171:4617-4622)と
、機能的レプリコンを持たない環状ＤＮＡ断片を直接組み込むという、二つの方
法を用いて、celZの染色体組み込みを行った。この同じ方法を、Ｅ．コリB(Ohta
K et al., (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900)及びＫ．オキシト
カM5A1 (Wood et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110)へ、エ
タノール経路をコードするＺ．モビリス遺伝子を染色体組み込みする際にも利用
した。典型的には、環状ＤＮＡを、P2に、バイオ−ラド・ジーン・パルサを用い
た電気穿孔法により形質転換させた。次に、形質転換体を、テトラサイクリン (
6 mg L-1) を含有する固体培地上で選別し、ＣＭＣプレート上で成長させて、グ
ルカナーゼ活性のレベルを調べた。
【０１３２】
グルカナーゼ活性
別々のテストプロモータの制御下でcelZ遺伝子産物（即ちグルカナーゼ）が発
現した結果生じたグルカナーゼ活性を、実施例１で説明したようにＣＭＣプレー
トを染色することで、評価した。この比色検定法により、グルカナーゼ活性の指
標となる黄色の領域が生じ、この領域の直径を、celZポリペプチド発現の相対的
測定値として用いた。最も大きな黄色領域を生じたクローンを、さらに、カルボ
キシメチルセルロース(20 g L-1 を50 mM のクエン酸緩衝液に溶解させたもの、
pH 5.2)を基質として用い、３５℃でグルカナーゼ活性を評価した (Wood et al.
(1988) Methods in Enzymology 160: 87-112)。細胞内グルカナーゼの量を測定
するために、超音波(ニューヨーク州プレインビュー、ヒート・システム−ウル
トラソニックス社製、モデルW-290F細胞破砕機）で４秒間処理して培養物から酵
素活性を放出させた。発現したグルカナーゼ活性量を測定し、ここでは１分間当
たりに放出された還元糖のμモル数（IU）で表す。還元糖はウッド氏が説いたよ
うに(Wood et al. (1988) Methods in Enzymology 160: 87-112) グルコース標
準を用いて測定した。
現した結果生じたグルカナーゼ活性を、実施例１で説明したようにＣＭＣプレー
トを染色することで、評価した。この比色検定法により、グルカナーゼ活性の指
標となる黄色の領域が生じ、この領域の直径を、celZポリペプチド発現の相対的
測定値として用いた。最も大きな黄色領域を生じたクローンを、さらに、カルボ
キシメチルセルロース(20 g L-1 を50 mM のクエン酸緩衝液に溶解させたもの、
pH 5.2)を基質として用い、３５℃でグルカナーゼ活性を評価した (Wood et al.
(1988) Methods in Enzymology 160: 87-112)。細胞内グルカナーゼの量を測定
するために、超音波(ニューヨーク州プレインビュー、ヒート・システム−ウル
トラソニックス社製、モデルW-290F細胞破砕機）で４秒間処理して培養物から酵
素活性を放出させた。発現したグルカナーゼ活性量を測定し、ここでは１分間当
たりに放出された還元糖のμモル数（IU）で表す。還元糖はウッド氏が説いたよ
うに(Wood et al. (1988) Methods in Enzymology 160: 87-112) グルコース標
準を用いて測定した。
【０１３３】
基質の脱重合
様々なホスト細胞が生じたグルカナーゼ活性の量をさらに調べるために、様々
な糖質基質を様々な細胞抽出物(20 g L-1 を50 mM のクエン酸緩衝液に溶解させ
たもの、pH 5.2)と一緒にインキュベートした。実施例の一つでは、酸で膨潤さ
せ、ボールミルしたセルロースを含んだテスト基質をウッド氏が説いた (Wood e
t al. (1988) Methods in Enzymology 160: 87-112)ように調製した。典型的な
多糖分解酵素抽出物（即ちＫ．オキシトカSZ6 (pCPP2006)の生成したＥＧＺ（グ
ルカナーゼ）)を、ホスト細胞を３０℃で１６時間、非還元糖のソルビトールを
補ったＬＢ中で培養することで、調製した。無細胞ブロスの希釈液を基質に加え
、３５℃で１６時間、インキュベートした。インキュベーション中に外因性の混
入物が成長するのを防ぐべく、数滴のクロロホルムを加えた。 インキュベーシ
ョン前及び後に試料を取り出して、還元糖をＤＮＳ法で測定した (Wood et al.
(1988) Methods in Enzymology 160: 87-112を参照されたい)。重合の程度（DP)
は、重合体中に存在する合計の糖残基を、還元後の数で割ったもので推定した。
な糖質基質を様々な細胞抽出物(20 g L-1 を50 mM のクエン酸緩衝液に溶解させ
たもの、pH 5.2)と一緒にインキュベートした。実施例の一つでは、酸で膨潤さ
せ、ボールミルしたセルロースを含んだテスト基質をウッド氏が説いた (Wood e
t al. (1988) Methods in Enzymology 160: 87-112)ように調製した。典型的な
多糖分解酵素抽出物（即ちＫ．オキシトカSZ6 (pCPP2006)の生成したＥＧＺ（グ
ルカナーゼ）)を、ホスト細胞を３０℃で１６時間、非還元糖のソルビトールを
補ったＬＢ中で培養することで、調製した。無細胞ブロスの希釈液を基質に加え
、３５℃で１６時間、インキュベートした。インキュベーション中に外因性の混
入物が成長するのを防ぐべく、数滴のクロロホルムを加えた。 インキュベーシ
ョン前及び後に試料を取り出して、還元糖をＤＮＳ法で測定した (Wood et al.
(1988) Methods in Enzymology 160: 87-112を参照されたい)。重合の程度（DP)
は、重合体中に存在する合計の糖残基を、還元後の数で割ったもので推定した。
【０１３４】
発酵条件
発酵は、50gL-1の糖質を補った100mlのルリア・ブロスを入れた250mlのフラス
コ中で行わせた。テスト糖質は別々に滅菌後に冷却してから加えた。基質の変化
を抑えるために、酸で膨潤させた、ボールミルしたセルロース及びキシランは、
オートクレーブしなかった。抗生物質クロラムフェニコール（200mgL-1）を加え
て、混入生物の成長を防いだ。フラスコに２４時間ブロス培養物（50gL-1グルコ
ース）を接種（10%v/v）し、攪拌しながら（100rpm）３５℃で２４から９６時間
、インキュベートした。培養物を観察するために、試料を毎日取り出して、ガス
クロマトグラフィでエタノール濃度を調べた (Dombek et al. (1986) Appl. Env
iron. Microbiol. 52:975-981）。
コ中で行わせた。テスト糖質は別々に滅菌後に冷却してから加えた。基質の変化
を抑えるために、酸で膨潤させた、ボールミルしたセルロース及びキシランは、
オートクレーブしなかった。抗生物質クロラムフェニコール（200mgL-1）を加え
て、混入生物の成長を防いだ。フラスコに２４時間ブロス培養物（50gL-1グルコ
ース）を接種（10%v/v）し、攪拌しながら（100rpm）３５℃で２４から９６時間
、インキュベートした。培養物を観察するために、試料を毎日取り出して、ガス
クロマトグラフィでエタノール濃度を調べた (Dombek et al. (1986) Appl. Env
iron. Microbiol. 52:975-981）。
【０１３５】
サロゲート・プロモータを単離及び特定する方法
異種の遺伝子をクレブシエラ及びその他のホスト細胞で発現させるサロゲート
・プロモータとして働くかも知れないＺ．モビリスのランダム断片を特定するた
めに、候補プロモータの効率的なクローニングを行うためのベクタを実施例１で
説明したように作製した（さらに Ingram et al. (1988) Appl. Environ. Micro
biol. 54:397-404を参照されたい）。
・プロモータとして働くかも知れないＺ．モビリスのランダム断片を特定するた
めに、候補プロモータの効率的なクローニングを行うためのベクタを実施例１で
説明したように作製した（さらに Ingram et al. (1988) Appl. Environ. Micro
biol. 54:397-404を参照されたい）。
【０１３６】
次に、Sau3AIで消化したＺ．モビリスDNA断片をpLOI2171のBamHI部位に連結し
て、潜在的プロモータのライブラリを作製した。これらのプラスミドをＥ．コリ
DH5αへ形質転換させて最初のスクリーニングを行った。ＣＭＣプレートで個別
に調べた18,000 個のコロニのうち、75個のクローンが、対照 (pLOI2173)よりも
大きな黄色の領域を生じた。次に、これら７５個のクローンのプラスミドをＫ．
オキシトカM5A1内に形質転換させ、再テストすると、この二番目のホストで高レ
ベルのcelzが発現していることが判明した。
て、潜在的プロモータのライブラリを作製した。これらのプラスミドをＥ．コリ
DH5αへ形質転換させて最初のスクリーニングを行った。ＣＭＣプレートで個別
に調べた18,000 個のコロニのうち、75個のクローンが、対照 (pLOI2173)よりも
大きな黄色の領域を生じた。次に、これら７５個のクローンのプラスミドをＫ．
オキシトカM5A1内に形質転換させ、再テストすると、この二番目のホストで高レ
ベルのcelzが発現していることが判明した。
【０１３７】
多糖分解酵素を産生する組換えクレブシエラホスト
celZ発現の指標である最も大きな領域をＣＭＣプレート上で形成した発現度の
高いクローン（pLOI2177 からpLOI2194まで)をＬＢブロスで成長させ、グルカナ
ーゼ活性について検定した（表５）。
高いクローン（pLOI2177 からpLOI2194まで)をＬＢブロスで成長させ、グルカナ
ーゼ活性について検定した（表５）。
【０１３８】
【表５】
【０１３９】ａ
pLOI2173は、元のプロモータと一緒にcelZ遺伝子を含有する。他のものはす
べて、サロゲート・プロモータとして働くＺ．モビリスＤＮＡ断片と一緒にcelZ
遺伝子を含有する。ｂ グルカナーゼ（ＣＭＣアーゼ）活性は、３０℃で１６時間成長させた後に調
べた。
べて、サロゲート・プロモータとして働くＺ．モビリスＤＮＡ断片と一緒にcelZ
遺伝子を含有する。ｂ グルカナーゼ（ＣＭＣアーゼ）活性は、３０℃で１６時間成長させた後に調
べた。
【０１４０】
これらのプラスミドによる活性は、天然のcelZプロモータを含有する対照プラ
スミド（pLOI2173）によるものよりも最大で８倍高かった。最も大きな領域を生
じた四つのプラスミド（pLOI2177、pLOI2180、pLOI2182及びpLOI2183）もまた、
ブロス中に放出された最も高い総グルカナーゼ活性（約20,000 IU L-1)を生じた
。これらのプラスミドのうちの一つ、pLOI2183を、染色体組み込みに選んだ。
スミド（pLOI2173）によるものよりも最大で８倍高かった。最も大きな領域を生
じた四つのプラスミド（pLOI2177、pLOI2180、pLOI2182及びpLOI2183）もまた、
ブロス中に放出された最も高い総グルカナーゼ活性（約20,000 IU L-1)を生じた
。これらのプラスミドのうちの一つ、pLOI2183を、染色体組み込みに選んだ。
【０１４１】
多糖分解酵素遺伝子の染色体組み込み
所望の多糖分解酵素遺伝子を適したホスト細胞、例えばクレブシエラP2株など
、に安定に取り込ませるために、複製機能を全て欠くが、celZ遺伝子、サロゲー
ト・プロモータ、選択マーカ、及び 組込用の相同のＤＮＡ断片、を含有したＤ
ＮＡ断片の単離を簡単にできるよう、新規なベクタ(pLOI2306)を作製した。ポリ
リンカ領域をフランクするクレノウ処理済みNdeI 及びSapI 部位内にリンカ (GG
CGCGCC; SEQ ID NO: 11)を挿入することで、二つのAscI部位をpUC19に加えて、p
LOI2302を作製した。 pBR322由来のtet耐性マーカ遺伝子を含有する平滑断片（E
coRI及びAvaIで切断した後、クレノウ処理を行ったもの）を、pLOI2302のPstI部
位（PstIで切断後、クレノウ処理したもの）にクローンして、pLOI2303を作製し
た。このプラスミド、pLOI2303のSmaI部位に、Ｋ．オキシトカM5A1染色体ＤＮＡ
の平滑断片（EcoRIで切断後、クレノウ処理で平滑にしたもの）を連結して（pLO
I2305)を作製した。サロゲートＺ．モビリス・プロモータと、pLOI2183由来のce
lZ遺伝子とを含有するEcoRI - SphI断片(クレノウ処理済み）を、pLOI2305のEco
RI部位(EcoRI、クレノウ処理済み）に連結して、pLOI2306を作製した。pLOI2306
をAscIで消化して二つの断片を作製したが、その二つの大きい方はサロゲート・
プロモータ付きのcelZ遺伝子、tet遺伝子、及び相同組換え用の染色体ＤＮＡ断
片を含有していた。この大きい方の断片（１０キロ塩基対）をアガロースゲル電
気泳動法で精製し、自己連結させて環状にし、クレブシエラ株P2内に電気穿孔で
入れた後、テトラサイクリン耐性について選択的な成長を行わせた。その結果生
じた21個のテトラサイクリン耐性コロニを精製し、ＣＭＣプレートでグルカナー
ゼ活性についてテストした。すべてが陽性で大型の領域を形成し、celZ遺伝子産
物が機能的に発現したことを示した。
、に安定に取り込ませるために、複製機能を全て欠くが、celZ遺伝子、サロゲー
ト・プロモータ、選択マーカ、及び 組込用の相同のＤＮＡ断片、を含有したＤ
ＮＡ断片の単離を簡単にできるよう、新規なベクタ(pLOI2306)を作製した。ポリ
リンカ領域をフランクするクレノウ処理済みNdeI 及びSapI 部位内にリンカ (GG
CGCGCC; SEQ ID NO: 11)を挿入することで、二つのAscI部位をpUC19に加えて、p
LOI2302を作製した。 pBR322由来のtet耐性マーカ遺伝子を含有する平滑断片（E
coRI及びAvaIで切断した後、クレノウ処理を行ったもの）を、pLOI2302のPstI部
位（PstIで切断後、クレノウ処理したもの）にクローンして、pLOI2303を作製し
た。このプラスミド、pLOI2303のSmaI部位に、Ｋ．オキシトカM5A1染色体ＤＮＡ
の平滑断片（EcoRIで切断後、クレノウ処理で平滑にしたもの）を連結して（pLO
I2305)を作製した。サロゲートＺ．モビリス・プロモータと、pLOI2183由来のce
lZ遺伝子とを含有するEcoRI - SphI断片(クレノウ処理済み）を、pLOI2305のEco
RI部位(EcoRI、クレノウ処理済み）に連結して、pLOI2306を作製した。pLOI2306
をAscIで消化して二つの断片を作製したが、その二つの大きい方はサロゲート・
プロモータ付きのcelZ遺伝子、tet遺伝子、及び相同組換え用の染色体ＤＮＡ断
片を含有していた。この大きい方の断片（１０キロ塩基対）をアガロースゲル電
気泳動法で精製し、自己連結させて環状にし、クレブシエラ株P2内に電気穿孔で
入れた後、テトラサイクリン耐性について選択的な成長を行わせた。その結果生
じた21個のテトラサイクリン耐性コロニを精製し、ＣＭＣプレートでグルカナー
ゼ活性についてテストした。すべてが陽性で大型の領域を形成し、celZ遺伝子産
物が機能的に発現したことを示した。
【０１４２】
DH5αをプラスミドＤＮＡのプレパラートで形質転換させゲル電気泳動法を行
って、組換え株を作製するのに用いたクローンに、不要なプラスミドが存在して
いないかを調べた。調べた12個のクローンでは、形質転換体は得られなかった。
しかしながら、これらの株のうち二つが、こうしてcelZを含有しているかも知れ
ない大きなプラスミドの帯を含有することが判明したため、これらを廃棄した。
大きなプラスミドを持った両方の株が含有していたＤＮＡを、T7及びM13プライ
マで配列決定すると、複数コピーのプラスミドの存在が確認された。残りの10個
の株ではcelZ遺伝子が組み込まれており、いずれのプライマでも配列決定できな
かった。
って、組換え株を作製するのに用いたクローンに、不要なプラスミドが存在して
いないかを調べた。調べた12個のクローンでは、形質転換体は得られなかった。
しかしながら、これらの株のうち二つが、こうしてcelZを含有しているかも知れ
ない大きなプラスミドの帯を含有することが判明したため、これらを廃棄した。
大きなプラスミドを持った両方の株が含有していたＤＮＡを、T7及びM13プライ
マで配列決定すると、複数コピーのプラスミドの存在が確認された。残りの10個
の株ではcelZ遺伝子が組み込まれており、いずれのプライマでも配列決定できな
かった。
【０１４３】
新規なベクタpLOI2306の構造上の特徴を図８に概略的に示し、様々なコドン領
域（即ち遺伝子celZ、bla、及びtetのコドン領域）を含めた、このベクタのヌク
レオチド配列を、配列表のSEQ ID NO: 12に示す。celZ遺伝子の下流にある（Ｅ
．クリサンセミ由来の）非コドン配列であるヌクレオチド塩基対3282-4281と、
Ｋ．オキシトカM5A1由来の非コドン標的配列の一部である塩基対9476-11544につ
いては、標準的技術（例えばSambrook, J. et al., T. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989); Current Protoco
ls in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)に
説かれたものなど)による配列決定をまだ行っていない。例えば、pLOI2306プラ
スミドの上記の配列決定を行っていない領域のいずれかの側に来る充分なフラン
キング配列を、これら既知の配列に対応する配列決定プライマを合成でき、この
配列決定プライマを用いてpLOI2306プラスミドをテンプレートとして用いた標準
的な配列決定反応を行えるよう、提供する。
域（即ち遺伝子celZ、bla、及びtetのコドン領域）を含めた、このベクタのヌク
レオチド配列を、配列表のSEQ ID NO: 12に示す。celZ遺伝子の下流にある（Ｅ
．クリサンセミ由来の）非コドン配列であるヌクレオチド塩基対3282-4281と、
Ｋ．オキシトカM5A1由来の非コドン標的配列の一部である塩基対9476-11544につ
いては、標準的技術（例えばSambrook, J. et al., T. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989); Current Protoco
ls in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)に
説かれたものなど)による配列決定をまだ行っていない。例えば、pLOI2306プラ
スミドの上記の配列決定を行っていない領域のいずれかの側に来る充分なフラン
キング配列を、これら既知の配列に対応する配列決定プライマを合成でき、この
配列決定プライマを用いてpLOI2306プラスミドをテンプレートとして用いた標準
的な配列決定反応を行えるよう、提供する。
【０１４４】
代替的には、当業者であれば、テンプレートとして用いるpLOI2306プラスミド
がない場合でも、これらの配列未決定の領域を調べられることは、理解されよう
。例えば、ここに提供した配列（例えばSEQ ID NO: 12のヌクレオチド1452-2735
)を利用すれば、残りのcelZ配列を決定でき、こうしてＥ．クリサンセミ配列を
含んで成るライブラリからcelZ含有クローンを単離するためのプローブや、そし
てこの単離されたクローンを標準的なＤＮＡ配列決定反応を用いて配列決定する
ためのプライマを合成できる。同様に、ここに提供した配列（例えばSEQ ID NO:
12のヌクレオチド8426-9475 ）を利用すれば、残りの標的配列を決定でき、こ
うして（例えば適当な大きさの）Ｋ．オキシトカM5A1 EcoRI断片を含んで成るラ
イブラリから、標的配列を含有するクローンを単離するためのプローブと、そし
てその単離されたクローンを、標準的なＤＮＡ配列決定反応を用いて配列決定す
るためのプライマを合成できる（ Ｋ．オキシトカM5A1の源は、例えば標準的な
技術を用いてあらゆるプラスミドを取り除いた ATCC 68564などであろう）。当
業者であればさらに、細菌のｃＤＮＡ又はゲノム配列を表すライブラリの作製法
や、このようなライブラリ（例えばｃＤＮＡライブラリ又はゲノムライブラリな
ど）からの所望の核酸断片の単離法は、当業で公知であり、典型的には例えばハ
イブリダイゼーション技術又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行われ
、これらの技術はすべて、当業で標準的なものであることは理解されよう（例え
ばSambrook, J. et al., T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd,
ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY, (1989); Current Protocols in Molecular Biology,
eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992); Oligonucleotide Synthesi
s (M.J. Gait, Ed. 1984); and PCR Handbook Current Protocols in Nucleic A
cid Chemistry, Beaucage, Ed. John Wiley & Sons (1999) (Editor)を参照され
たい)。
がない場合でも、これらの配列未決定の領域を調べられることは、理解されよう
。例えば、ここに提供した配列（例えばSEQ ID NO: 12のヌクレオチド1452-2735
)を利用すれば、残りのcelZ配列を決定でき、こうしてＥ．クリサンセミ配列を
含んで成るライブラリからcelZ含有クローンを単離するためのプローブや、そし
てこの単離されたクローンを標準的なＤＮＡ配列決定反応を用いて配列決定する
ためのプライマを合成できる。同様に、ここに提供した配列（例えばSEQ ID NO:
12のヌクレオチド8426-9475 ）を利用すれば、残りの標的配列を決定でき、こ
うして（例えば適当な大きさの）Ｋ．オキシトカM5A1 EcoRI断片を含んで成るラ
イブラリから、標的配列を含有するクローンを単離するためのプローブと、そし
てその単離されたクローンを、標準的なＤＮＡ配列決定反応を用いて配列決定す
るためのプライマを合成できる（ Ｋ．オキシトカM5A1の源は、例えば標準的な
技術を用いてあらゆるプラスミドを取り除いた ATCC 68564などであろう）。当
業者であればさらに、細菌のｃＤＮＡ又はゲノム配列を表すライブラリの作製法
や、このようなライブラリ（例えばｃＤＮＡライブラリ又はゲノムライブラリな
ど）からの所望の核酸断片の単離法は、当業で公知であり、典型的には例えばハ
イブリダイゼーション技術又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行われ
、これらの技術はすべて、当業で標準的なものであることは理解されよう（例え
ばSambrook, J. et al., T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd,
ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY, (1989); Current Protocols in Molecular Biology,
eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992); Oligonucleotide Synthesi
s (M.J. Gait, Ed. 1984); and PCR Handbook Current Protocols in Nucleic A
cid Chemistry, Beaucage, Ed. John Wiley & Sons (1999) (Editor)を参照され
たい)。
【０１４５】
サロゲート・プロモータと、組み込まれた又はプラスミドを基にした作製物とを
利用した異種遺伝子の発現 10個の組み込まれた株（SZ1-SZ10)を、ＬＢソルビトールブロス中でのグルカ
ナーゼ産生について調べた（表６）。すべてが、5,000-7,000 IUL-1の活性酵素
を産生した。 これは天然celZプロモータを含有するプラスミド pLOI2173が発現
した活性の二倍であるが、これら組み込まれた株は、同じサロゲートＺ．モビリ
ス・プロモータを含有するP2 (pLOI2183) が生じたグルカナーゼ活性の僅かに３
分の１を生じた。組み込みで起きたグルカナーゼ発現の減少は、コピー数の減少
に起因するかも知れない（即ち、複数コピーのプラスミド、対、単一の組み込ま
れたコピー）。
利用した異種遺伝子の発現 10個の組み込まれた株（SZ1-SZ10)を、ＬＢソルビトールブロス中でのグルカ
ナーゼ産生について調べた（表６）。すべてが、5,000-7,000 IUL-1の活性酵素
を産生した。 これは天然celZプロモータを含有するプラスミド pLOI2173が発現
した活性の二倍であるが、これら組み込まれた株は、同じサロゲートＺ．モビリ
ス・プロモータを含有するP2 (pLOI2183) が生じたグルカナーゼ活性の僅かに３
分の１を生じた。組み込みで起きたグルカナーゼ発現の減少は、コピー数の減少
に起因するかも知れない（即ち、複数コピーのプラスミド、対、単一の組み込ま
れたコピー）。
【０１４６】
グルカナーゼＥＧＺの分泌
Ｋ．オキシトカは、ペクテート融解酵素及びグルカナーゼ（ＥＧＺ）を分泌す
るエルウィニア−クリサンセミのout遺伝子がコードする分泌系と類似の天然の
タイプＩＩ分泌系をプルラナーゼ分泌(Pugsley (1993) Microbiol. Rev. 57:50-
108)のために含有している (Barras et al. (1994) Annu. Rev. Phytopathol. 3
2:201-234; He et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 1079- 1083)
。タイプＩＩ分泌系は、典型的には、特異性が大変高く、異種タンパク質ではあ
まり機能しない(He et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 1079- 10
83; Py et al. (1991) FEMS Microbiol. Lett. 79:315-322; Sauvonnet et al.
(1996) Mol. Microbiol. 22: 1-7)。このように、予測通り、組換えcelZはM5A1
(表５) 又はP2 (表６)のどちらかをホストとして細胞関連産物として発現した。
総組換えＥＧＺ活性のうちの約４分の１（１２から２６％）がブロス中に回収さ
れた。Ｅ．コリDH5αでは、総細胞外ＥＧＺの約８から１２％が存在した。この
ように、Ｋ．オキシトカの天然の分泌系は組換えＥＧＺの部分的な分泌を促すか
も知れない。
るエルウィニア−クリサンセミのout遺伝子がコードする分泌系と類似の天然の
タイプＩＩ分泌系をプルラナーゼ分泌(Pugsley (1993) Microbiol. Rev. 57:50-
108)のために含有している (Barras et al. (1994) Annu. Rev. Phytopathol. 3
2:201-234; He et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 1079- 1083)
。タイプＩＩ分泌系は、典型的には、特異性が大変高く、異種タンパク質ではあ
まり機能しない(He et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 1079- 10
83; Py et al. (1991) FEMS Microbiol. Lett. 79:315-322; Sauvonnet et al.
(1996) Mol. Microbiol. 22: 1-7)。このように、予測通り、組換えcelZはM5A1
(表５) 又はP2 (表６)のどちらかをホストとして細胞関連産物として発現した。
総組換えＥＧＺ活性のうちの約４分の１（１２から２６％）がブロス中に回収さ
れた。Ｅ．コリDH5αでは、総細胞外ＥＧＺの約８から１２％が存在した。この
ように、Ｋ．オキシトカの天然の分泌系は組換えＥＧＺの部分的な分泌を促すか
も知れない。
【０１４７】
所望の産物の分泌をさらに向上させるために、Ｅ．クリサンセミEC16由来のタ
イプＩＩ分泌遺伝子（out遺伝子）を、（例えばpCPP2006を用いて)導入して、株
P86021由来組換えＥＧＺのエタノール生成性Ｋ．オキシトカ株での分泌を促した
（表５及び表６）。celZを持つプラスミドを含有する大半の株で、out遺伝子を
加えた結果、細胞外ＥＧＺが５倍に増加し、総グルカナーゼ活性が２倍に増加し
た。celZが組み込まれた株では、out遺伝子を加えたことで、細胞外ＥＧＺが１
０倍に増加し、総グルカナーゼ活性が４倍に増加した。いずれの場合でも、out
遺伝子により、総グルカナーゼ活性のほぼ半分の分泌が促された。out遺伝子の
追加で起きたＥＧＺ活性の増加は、プラスミド及び組み込まれたcelZ作製物の両
方で分泌生成物の折り畳みが向上したことを反映していると考えられよう。pUC-
を基にした類縁体で観察された増加は小さかったが、このことは、プラスミドの
負荷と、この高コピー数のプラスミド上のbla遺伝子からのペリプラスムβ−ラ
クタマーゼの産生中に輸出機構をめぐって競合が起きたことが原因かも知れない
。
イプＩＩ分泌遺伝子（out遺伝子）を、（例えばpCPP2006を用いて)導入して、株
P86021由来組換えＥＧＺのエタノール生成性Ｋ．オキシトカ株での分泌を促した
（表５及び表６）。celZを持つプラスミドを含有する大半の株で、out遺伝子を
加えた結果、細胞外ＥＧＺが５倍に増加し、総グルカナーゼ活性が２倍に増加し
た。celZが組み込まれた株では、out遺伝子を加えたことで、細胞外ＥＧＺが１
０倍に増加し、総グルカナーゼ活性が４倍に増加した。いずれの場合でも、out
遺伝子により、総グルカナーゼ活性のほぼ半分の分泌が促された。out遺伝子の
追加で起きたＥＧＺ活性の増加は、プラスミド及び組み込まれたcelZ作製物の両
方で分泌生成物の折り畳みが向上したことを反映していると考えられよう。pUC-
を基にした類縁体で観察された増加は小さかったが、このことは、プラスミドの
負荷と、この高コピー数のプラスミド上のbla遺伝子からのペリプラスムβ−ラ
クタマーゼの産生中に輸出機構をめぐって競合が起きたことが原因かも知れない
。
【０１４８】
二つの基準を用いて、最も良好に組み込まれたP2株を特定し、高レベルのクロ
ラムフェニコール（上流のpdc遺伝子及びadhB遺伝子の高レベル発現のマーカ）
と、out遺伝子によるグルカナーゼの効果的分泌を含有する固体培地で成長させ
た。SZ2及びSZ6の二つの組換え株をその後の研究に選んだ。両方とも、総細胞タ
ンパク質の約５％に匹敵する24,000 IU L-1 のグルカナーゼ活性を生じた (Py e
t al. (1991) Protein Engin. 4:325-333)。
ラムフェニコール（上流のpdc遺伝子及びadhB遺伝子の高レベル発現のマーカ）
と、out遺伝子によるグルカナーゼの効果的分泌を含有する固体培地で成長させ
た。SZ2及びSZ6の二つの組換え株をその後の研究に選んだ。両方とも、総細胞タ
ンパク質の約５％に匹敵する24,000 IU L-1 のグルカナーゼ活性を生じた (Py e
t al. (1991) Protein Engin. 4:325-333)。
【０１４９】
基質の脱重合
ＣＭＣ源に用いた場合の組換えＥＧＺによる基質の脱重合は優れていることが
判明した（表７）。酸で膨潤したセルロースに用いた場合、グルカナーゼの活性
はＣＭＣでの活性で測定した活性の１０％未満であった。この多糖分解酵素をア
ビセル又はキシランに用いた場合は、ほとんど活性は認められなかった。しかし
、一晩消化させたとき、ＥＧＺ多糖分解酵素はすべての基質について平均重合長
を測定可能な程度に減少させていた。ＣＭＣ及び酸で膨潤させたセルロースを脱
重合させて、平均７糖残基の長さにした。これら７個の残基から成るセルロース
重合体はぎりぎりに可溶性であり、理想的には、効率的な代謝のためにはさらに
消化するとよいであろう(Wood et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2
103-2110)。ボールミルしたセルロース及びアビセルの平均の鎖長は元の長さの
３文の１に減少し、他方、キシラン重合体１個当たりでは一回未満の切断が観察
された。
判明した（表７）。酸で膨潤したセルロースに用いた場合、グルカナーゼの活性
はＣＭＣでの活性で測定した活性の１０％未満であった。この多糖分解酵素をア
ビセル又はキシランに用いた場合は、ほとんど活性は認められなかった。しかし
、一晩消化させたとき、ＥＧＺ多糖分解酵素はすべての基質について平均重合長
を測定可能な程度に減少させていた。ＣＭＣ及び酸で膨潤させたセルロースを脱
重合させて、平均７糖残基の長さにした。これら７個の残基から成るセルロース
重合体はぎりぎりに可溶性であり、理想的には、効率的な代謝のためにはさらに
消化するとよいであろう(Wood et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:2
103-2110)。ボールミルしたセルロース及びアビセルの平均の鎖長は元の長さの
３文の１に減少し、他方、キシラン重合体１個当たりでは一回未満の切断が観察
された。
【０１５０】
【表６】
【０１５１】
グルカナーゼ（ＣＭＣアーゼ）活性は、３０℃で１６時間成長させた後で調べた
。
。
【０１５２】
【表７】
【０１５３】
株SZ6 (pCPP2006)は分泌されたＥＧＺ源としてＬＢ−ソルビトールブロス中で１
６時間成長させた。
６時間成長させた。
【０１５４】
発酵
実用性のためには、celZ及びout遺伝子を株P2に加えた結果、その結果生ずる
生体触媒の発酵能力が落ちてはならない。グルコース及びセロビオースを用いて
比較を行った（表８）。全ての株は、これらの糖を発酵させる能力で同等であり
、celZの組み込み又はpCPP2006の追加が原因の悪影響がないことを示した。これ
らの株についてはさらに酸で膨潤したセルロースを直接エタノールに転化させる
能力についても調べた。最も活性な作製物SZ6 (pCPP2006) は少量のエタノール(
3.9 g L -1) を非結晶セルロースから生成した。約 1.5 g L-1 のエタノールが
、全ての株の接種時点で最初に存在した。SZ6 (pCPP2006)を除くすべての株でこ
のエタノールは時間と共に減少してゼロになった。このように、SZ6 (pCPP2006)
で観察された3.9 g L-1 のエタノールの生成は、総エタノール生成量を低く見積
もる数値かも知れない。しかしながら、よく言っても、これは存在する重合体の
ごく一部分の転化を表す数値である。低レベルのグルコース、セロビオース、及
びセロトリオースが、酸で膨潤したセルロースがＥＧＺによる加水分解と発酵の
結果生じた可能性がある。これらの化合物は、Ｋ．オキシトカの天然のホスホエ
ノールピルビン酸依存的リン酸転移酵素系で代謝させることができる（Ohta K e
t al., (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900; Wood et al. (1992) A
ppl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110)。
生体触媒の発酵能力が落ちてはならない。グルコース及びセロビオースを用いて
比較を行った（表８）。全ての株は、これらの糖を発酵させる能力で同等であり
、celZの組み込み又はpCPP2006の追加が原因の悪影響がないことを示した。これ
らの株についてはさらに酸で膨潤したセルロースを直接エタノールに転化させる
能力についても調べた。最も活性な作製物SZ6 (pCPP2006) は少量のエタノール(
3.9 g L -1) を非結晶セルロースから生成した。約 1.5 g L-1 のエタノールが
、全ての株の接種時点で最初に存在した。SZ6 (pCPP2006)を除くすべての株でこ
のエタノールは時間と共に減少してゼロになった。このように、SZ6 (pCPP2006)
で観察された3.9 g L-1 のエタノールの生成は、総エタノール生成量を低く見積
もる数値かも知れない。しかしながら、よく言っても、これは存在する重合体の
ごく一部分の転化を表す数値である。低レベルのグルコース、セロビオース、及
びセロトリオースが、酸で膨潤したセルロースがＥＧＺによる加水分解と発酵の
結果生じた可能性がある。これらの化合物は、Ｋ．オキシトカの天然のホスホエ
ノールピルビン酸依存的リン酸転移酵素系で代謝させることができる（Ohta K e
t al., (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57:893-900; Wood et al. (1992) A
ppl. Environ. Microbiol. 58:2103-2110)。
【０１５５】
【表８】
【０１５６】
接種時の当初のエタノール濃度はすべての株で約1.5gL-1であった。酸膨潤し
たセルロースを基質とした場合、これらのレベルはSZ6（pCP206）を除く全ての
株で接種後７２時間でゼロまで減少した。
たセルロースを基質とした場合、これらのレベルはSZ6（pCP206）を除く全ての
株で接種後７２時間でゼロまで減少した。
【０１５７】
等価物
当業者であれば、ごく日常的な実験を用いるのみで、ここに解説した本発明の
具体的実施例の等価物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このよ
うな等価物は、以下の請求の範囲の包含するところと意図されている。さらに、
米国特許第5,821,093号、第5,482,846号、第5,424,202号、第5,028,539号、第5,
000,000号、第5,487,989号、第5,554,520号、及び第5,162,516号に記載された遺
伝子作製物、ホスト細胞、及び方法のいくつを本発明を実施するのに利用しても
よく、それらを言及をもってここに編入することとする。
具体的実施例の等価物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このよ
うな等価物は、以下の請求の範囲の包含するところと意図されている。さらに、
米国特許第5,821,093号、第5,482,846号、第5,424,202号、第5,028,539号、第5,
000,000号、第5,487,989号、第5,554,520号、及び第5,162,516号に記載された遺
伝子作製物、ホスト細胞、及び方法のいくつを本発明を実施するのに利用しても
よく、それらを言及をもってここに編入することとする。
【配列表】
【図１】 希酸で予備処理し、二種の異なる培地を補ったコメ外皮基質を用い
たエタノール生成性組換えホストＥ．コリKO11の発酵率を示す。
たエタノール生成性組換えホストＥ．コリKO11の発酵率を示す。
【図２】 混合廃棄事務用紙を用いた、エタノール生成性組換えホスト株Ｋ．
オキシトカP2の同時糖化発酵（ＳＳＦ）率を示す。ＳＳＦで出た不溶性の残渣は
、セルラーゼ酵素及び基質が結合した供給源として次の発酵時でリサイクルした
。
オキシトカP2の同時糖化発酵（ＳＳＦ）率を示す。ＳＳＦで出た不溶性の残渣は
、セルラーゼ酵素及び基質が結合した供給源として次の発酵時でリサイクルした
。
【図３】 低コピー数のプロモータプローブベクタであるプラスミドpLOI2171
の構造を示し、選択のためのカナマイシン耐性遺伝子（kan）、プラスミドのエ
ピソーム維持のための温度感受性pSC101レプリコン（Rep(ts)）、及び、グルカ
ナーゼ（ＥＧＺ）をコードする、プロモータのない多糖分解酵素遺伝子celZの方
向を示す。
の構造を示し、選択のためのカナマイシン耐性遺伝子（kan）、プラスミドのエ
ピソーム維持のための温度感受性pSC101レプリコン（Rep(ts)）、及び、グルカ
ナーゼ（ＥＧＺ）をコードする、プロモータのない多糖分解酵素遺伝子celZの方
向を示す。
【図４】 形質転換した細菌コロニで測定したＣＭＣインジケータ・プレート
上の浄化領域の大きさ（ｘ軸）と、発現したグルカナーゼ活性量（ｙ軸）との間
の高い対応を示すグラフである。
上の浄化領域の大きさ（ｘ軸）と、発現したグルカナーゼ活性量（ｙ軸）との間
の高い対応を示すグラフである。
【図５】 pLOI2183内でサロゲート・プロモータとして機能するＺ．モビリス
（mobilis）ＤＮＡ断片の部分的なヌクレオチド配列（SEQ ID NO:1）を示す。そ
の完全な配列は、ジェンバンク受託番号AF109242（SEQ ID NO:2）を付与されて
いる。二つの転写開始部位（＃）、-35及び-10領域、シャイン-ダルガルノ部位
（太字）、ベクタ及びcelZの部分的な配列（小文字）、及びcelZ開始コドン（太
字で示したatg）を示してある。
（mobilis）ＤＮＡ断片の部分的なヌクレオチド配列（SEQ ID NO:1）を示す。そ
の完全な配列は、ジェンバンク受託番号AF109242（SEQ ID NO:2）を付与されて
いる。二つの転写開始部位（＃）、-35及び-10領域、シャイン-ダルガルノ部位
（太字）、ベクタ及びcelZの部分的な配列（小文字）、及びcelZ開始コドン（太
字で示したatg）を示してある。
【図６】 僅かなレベル（pUC19；パネルＡ）、中程度のレベル（pLOI2164；
パネルＢ）及び高レベル（pLOI2307；パネルＣ）のグルカナーゼを発現している
様々なプラスミドを、外側の細胞壁と内側の膜（im）との間に位置したペリプラ
スム封入体（pib）の形で持つＥ．コリＢ細胞の電子顕微鏡写真である。図示の
棒は０．１μmを表す。
パネルＢ）及び高レベル（pLOI2307；パネルＣ）のグルカナーゼを発現している
様々なプラスミドを、外側の細胞壁と内側の膜（im）との間に位置したペリプラ
スム封入体（pib）の形で持つＥ．コリＢ細胞の電子顕微鏡写真である。図示の
棒は０．１μmを表す。
【図７】 組換えホストのゲノムに導入させ、そのホストに安定なグルカナー
ゼ発現活性をもたらすことのできる遺伝子作成物であるcelZ組み込みベクタpLOI
2306を作成するのに用いるクローニング・ストラテジの概略詳細図である。
ゼ発現活性をもたらすことのできる遺伝子作成物であるcelZ組み込みベクタpLOI
2306を作成するのに用いるクローニング・ストラテジの概略詳細図である。
【図８】 Ｚ．モビリス（mobilis）由来のサロゲート・プロモータ、Ｅ．ク
リサンセミ（chrysanthemi）由来のcelZ遺伝子、耐性マーカ（bla及びtet）及び
Ｋ．オキシトカ（oxytoca）標的配列の位置を示した、celZ組み込みベクタpLOI2
306（SEQ ID NO:12）の概略図である。
リサンセミ（chrysanthemi）由来のcelZ遺伝子、耐性マーカ（bla及びtet）及び
Ｋ．オキシトカ（oxytoca）標的配列の位置を示した、celZ組み込みベクタpLOI2
306（SEQ ID NO:12）の概略図である。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｐ 19/12 Ｃ１２Ｑ 1/02
Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ｚ
1/68 Ｃ１２Ｒ 1:19
//(Ｃ１２Ｎ 1/21 1:22
Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:22）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ
Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ
，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，
ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ
Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ
，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，
ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ
Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ
，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，
ＺＷ
(71)出願人 223 Ｇｒｉｎｔｅｒ Ｈａｌｌ Ｐ．Ｏ．
Ｂｏｘ 115500 Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌ
ｅ， Ｆｌｏｒｉｄａ 32606 Ｕｎｉｔ
ｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃ
ａ
(72)発明者 イングラム ロニー オー
アメリカ合衆国 32606 フロリダ州 ゲ
インズビル フィフティセブンス テラス
エヌダブリュ 3132
(72)発明者 チョウ シェンデ
アメリカ合衆国 32607 フロリダ州 ゲ
インズビル アパートメント 46 サーテ
ィーフォース ストリート エスダブリュ
328
Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA12 BA80 CA03 CA20
DA05 DA06 EA04 FA02 FA10
FA18 GA11 GA19 GA27
4B050 CC03 DD02 EE01 LL02 LL05
4B063 QA08 QQ49 QR33 QR38 QR74
QR80 QS05 QS31 QX10
4B064 AC03 CA02 CA19 CC01 CC24
CD19 DA10 DA16
4B065 AA25Y AA26X AA29X AB01
AC14 BA02 BA03 BA25 BB01
BB16 BB18 BB37 BC03 BC26
CA06 CA42
Claims (76)
- 【請求項１】 多糖分解酵素ポリペプチドをサロゲート・プロモータの転写制
御下にコードする配列を含んで成り、前記プロモータが前記多糖分解酵素ポリペ
プチドの発現増加を引き起こすことができる、第一の異種のポリヌクレオチド部
分と、 分泌ポリペプチドをコードする配列を含んで成る第二の異種のポリヌクレオチ
ド部分と を含んで成る組換えホスト細胞であって、 前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、前記組換えホスト
細胞による多糖分解酵素の産生が増加する、組換えホスト細胞。 - 【請求項２】 産生が活性、量、及びこれらの組合せからなる群より選択され
る、請求項１に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項３】 前記多糖分解酵素ポリペプチドが分泌される、請求項２に記載
の組換えホスト細胞。 - 【請求項４】 前記ホスト細胞が細菌細胞である、請求項２に記載の組換えホ
スト細胞。 - 【請求項５】 前記ホスト細胞がグラム陰性細菌細胞である、請求項４に記載
の組換えホスト細胞。 - 【請求項６】 前記ホスト細胞が通性嫌気性細菌細胞である、請求項５に記載
の組換えホスト細胞。 - 【請求項７】 前記ホスト細胞がエンテロバクテリアセエ（Enterobacteriace
ae）科から選択される、請求項６に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項８】 前記ホストが、エシェリヒア（Escherichia）及びクレブシエ
ラ（Klebsiella）からなる群より選択される、請求項７に記載の組換えホスト細
胞。 - 【請求項９】 前記エシェリヒアが、 Ｅ．コリ（coli）B、Ｅ．コリ DH5α
、Ｅ．コリ KO4 (ATCC 55123)、Ｅ．コリ KO11 (ATCC 55124)、Ｅ．コリ KO12 (
ATCC 55125)及びＥ．コリ LY01、K. オキシトカ（oxytoca ）M5A1、及びK. オキ
シトカ P2 (ATCC 55307)からなる群より選択される、請求項８に記載の組換えホ
スト細胞。 - 【請求項１０】 前記多糖分解酵素が、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、
エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-グルコシダーゼ、エンド-1,4-
β-キシラナーゼ、α-キシロシダーゼ、α-グルクロニダーゼ、α-L-アラビノフ
ラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α-ア
ミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β-グルカナーゼ
、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、
ペクテート融解酵素、又はこれらの組合せ、からなる群より選択される、請求項
２に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項１１】 前記多糖分解酵素がグルカナーゼである、請求項１０に記載
の組換えホスト細胞。 - 【請求項１２】 前記多糖分解酵素がcelZ遺伝子の発現産物である、請求項１
０に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項１３】 前記celZ遺伝子がエルウィニア−クリサンセミ(Erwinia chr
ysanthemi）由来である、請求項１２に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項１４】 前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、少なくとも一つ
のpul遺伝子又はout遺伝子を含んで成る、請求項２に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項１５】 前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、エンテロバクテ
リアセエ科から選択される細菌細胞を由来とする、請求項２に記載の組換えホス
ト細胞。 - 【請求項１６】 前記細菌細胞が、Ｋ．オキシトカ、Ｅ．カロトボーラ（caro
tovora）、Ｅ．カロトボーラ亜種カロトボーラ、Ｅ．カロトボーラ亜種アトロセ
プティカ（atroseptica）、及びＥ．クリサンセミからなる群より選択される、
請求項１５に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項１７】 前記サロゲート・プロモータが、ジモモナス−モビリス（Zy
momonas mobilis）由来のポリヌクレオチド断片を含んで成る、請求項２に記載
の組換えホスト細胞。 - 【請求項１８】 前記サロゲート・プロモータが、SEQ ID NO:1に提供した配
列を有する核酸又はその一断片を含んで成る、請求項１７に記載の組換えホスト
細胞。 - 【請求項１９】 前記ホスト細胞がエタノール生成性である、請求項１乃至１
８のいずれかに記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項２０】 多糖分解酵素を外生のサロゲート・プロモータの転写制御下
にコードする異種のポリヌクレオチド部分を含んで成る、組換えエタノール生成
性ホスト細胞。 - 【請求項２１】 前記ホスト細胞が細菌細胞である、請求項２０に記載の組換
えホスト細胞。 - 【請求項２２】 前記ホスト細胞がグラム陰性細菌細胞である、請求項２１に
記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項２３】 前記ホスト細胞が通性嫌気性細菌細胞である、請求項２２に
記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項２４】 前記ホスト細胞がエンテロバクテリアセエ科から選択される
、請求項２３に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項２５】 前記ホストがエシェリヒア及びクレブシエラからなる群より
選択される、請求項２４に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項２６】 前記エシェリヒア及びクレブシエラが、Ｅ．コリ B、Ｅ．コ
リ DH5α、Ｅ．コリ KO4 (ATCC 55123)、Ｅ．コリ KO11 (ATCC 55124)、Ｅ．コ
リ KO12 (ATCC 55125)、Ｅ．コリ LY01、K. オキシトカM5A1及びK. オキシトカP
2 (ATCC 55307)からなる群より選択される、請求項２５に記載の組換えホスト細
胞。 - 【請求項２７】 前記多糖分解酵素が、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、
エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、α-グルコシダーゼ、エンド-1,4-
α-キシラナーゼ、β-キシロシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-アラビノフ
ラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α-ア
ミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β-グルカナーゼ
、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、
ペクテート融解酵素、又はこれらの組合せ、からなる群より選択される、請求項
２０に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項２８】 前記多糖分解酵素がグルカナーゼである、請求項２７に記載
の組換えホスト細胞。 - 【請求項２９】 前記多糖分解酵素がcelZ遺伝子の発現産物である、請求項２
８に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項３０】 前記celZ遺伝子がエルウィニア−クリサンセミ由来である、
請求項２９に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項３１】 前記サロゲート・プロモータが、ジモモナス−モビリス（Zy
momonas mobilis）由来のポリヌクレオチド断片を含んで成る、請求項２０に記
載の組換えホスト細胞。 - 【請求項３２】 前記サロゲート・プロモータが、SEQ ID NO:1に提供した配
列を有するポリヌクレオチド部分又はその一断片を含んで成る、請求項３１に記
載の組換えホスト細胞。 - 【請求項３３】 第一のポリペプチドをコードする配列を含んで成る第一の異
種のポリヌクレオチド部分と、 分泌ポリペプチドをコードする配列を含んで成る第二の異種のポリヌクレオチ
ド部分と を含んで成る組換えエタノール生成性グラム陰性細菌ホスト細胞であって、 前記ホスト細胞による第一のポリペプチド産生が増加されている、ホスト細胞
。 - 【請求項３４】 前記第一のポリペプチドが分泌される、請求項３３に記載の
組換えホスト細胞。 - 【請求項３５】 前記ホスト細胞が通性嫌気性細菌細胞である、請求項３３に
記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項３６】 前記ホスト細胞が、エンテロバクテリアセエ科から選択され
る、請求項３５に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項３７】 前記ホスト細胞が、エシェリヒア及びクレブシエラからなる
群より選択される、請求項３６に記載の組換え細菌ホスト細胞。 - 【請求項３８】 前記エシェリヒア及びクレブシエラが、Ｅ．コリ B、Ｅ．コ
リ DH5α、Ｅ．コリ KO4 (ATCC 55123)、Ｅ．コリ KO11 (ATCC 55124)、Ｅ．コ
リ KO12 (ATCC 55125)、Ｅ．コリ LY01、K. オキシトカM5A1及びK. オキシトカP
2 (ATCC 55307)からなる群より選択される、請求項３７に記載の組換え細菌ホス
ト細胞。 - 【請求項３９】 前記第一のポリペプチドが多糖分解酵素である、請求項３３
に記載の組換え細菌ホスト細胞。 - 【請求項４０】 前記多糖分解酵素の活性が増加されている、請求項３９に記
載の組換え細菌ホスト細胞。 - 【請求項４１】 前記多糖分解酵素が、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、
エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、α-グルコシダーゼ、エンド-1,4-
α-キシラナーゼ、β-キシロシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-アラビノフ
ラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α-ア
ミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β-グルカナーゼ
、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、
ペクテート融解酵素、又はこれらの組合せ、からなる群より選択される、請求項
３９に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項４２】 前記多糖分解酵素がグルカナーゼである、請求項４１に記載
の組換えホスト細胞。 - 【請求項４３】 前記グルカナーゼがcelZ遺伝子の発現産物である、請求項４
２に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項４４】 前記celZ遺伝子がエルウィニア−クリサンセミ(Erwinia chr
ysanthemi）由来である、請求項４３に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項４５】 前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、少なくとも一つ
のpul遺伝子又はout遺伝子を含んで成る、請求項３３に記載の組換えホスト細胞
。 - 【請求項４６】 前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、エンテロバクテ
リアセエ科から選択される細菌細胞を由来とする、請求項４５に記載の組換えホ
スト細胞。 - 【請求項４７】 前記細菌細胞が、Ｋ．オキシトカ、Ｅ．カロトボーラ（caro
tovora）、Ｅ．カロトボーラ亜種カロトボーラ、Ｅ．カロトボーラ亜種アトロセ
プティカ（atroseptica）、及びＥ．クリサンセミからなる群より選択される、
請求項４６に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項４８】 オリゴ糖を提供するステップと、 多糖分解酵素をサロゲート・プロモータの転写制御下にコードする配列を含ん
で成り、前記プロモータが前記多糖分解酵素の発現増加を引き起こすことができ
る、第一の異種のポリヌクレオチド部分と、 分泌ポリペプチドをコードする配列を含んで成る第二の異種のポリヌクレオチ
ド部分と を含んで成るホスト細胞に、前記オリゴ糖を接触させるステップと を含む、オリゴ糖を酵素分解する方法であって、 前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、前記オリゴ糖が酵
素分解されるよう、前記組換えホスト細胞による多糖分解酵素活性の生成が増加
する、方法。 - 【請求項４９】 前記多糖分解酵素が分泌される、請求項４８に記載の方法。
- 【請求項５０】 前記ホスト細胞がエタノール生成性である、請求項４８に記
載の方法。 - 【請求項５１】 前記方法が、水溶液中で行われる、請求項４８に記載の方法
。 - 【請求項５２】 前記方法が同時糖化発酵に用いられる、請求項４８に記載の
方法。 - 【請求項５３】 前記オリゴ糖が、リグノセルロース、ヘミセルロース、セル
ロース、ペクチン及びこれらの何らかの組合せからなる群より選択される、請求
項４８に記載の方法。 - 【請求項５４】 ホスト細胞中の目的遺伝子の発現を増加させることのできる
サロゲート・プロモータを特定する方法であって、 一生物のゲノムポリヌクレオチドを一つ又はそれ以上の断片に断片化するステ
ップと、 前記目的遺伝子を、少なくとも一つの断片の転写制御下に置くステップと、 前記断片及び目的遺伝子をホスト細胞内に導入するステップと、 前記目的遺伝子の発現が増加したことで、前記断片がサロゲート・プロモータ
であることが示されている、発現が増加したホスト細胞を特定するステップと を含む、方法。 - 【請求項５５】 同時糖化発酵に用いる組換えホスト細胞を作製する方法であ
って、 多糖分解酵素をサロゲート・プロモータの転写制御下にコードする配列を含ん
で成り、前記プロモータが前記多糖分解酵素の発現増加を引き起こすことができ
る、第一の異種のポリヌクレオチド部分を、前記ホスト細胞に導入するステップ
と、 分泌ポリペプチドをコードする配列を含んで成る第二の異種のポリヌクレオチ
ド部分を前記ホスト細胞に導入するステップと を含み、 前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、前記組換えホスト
細胞による多糖分解酵素の産生が増加する、方法。 - 【請求項５６】 産生が活性、量、及びこれらの組合せからなる群より選択さ
れる、請求項５５に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項５７】 前記多糖分解酵素ポリペプチドが分泌される、請求項５５又
は５６に記載の組換えホスト細胞。 - 【請求項５８】 前記ホスト細胞がエタノール生成性である、請求項５５、５
６又は５７に記載の方法。 - 【請求項５９】 pLOI2306（SEQ ID NO:12）のポリヌクレオチド配列を含んで
成るベクタ。 - 【請求項６０】 pLOI2306（SEQ ID NO:12）のポリヌクレオチド配列を含んで
成るベクタを有するホスト細胞。 - 【請求項６１】 pLOI2306（SEQ ID NO:12）のポリヌクレオチド配列を含んで
成るベクタをホスト細胞に導入するステップと、 前記ベクタが安定に組み込まれたホスト細胞を特定するステップと を含む、組換えホスト細胞組み込み体を作成する方法。 - 【請求項６２】 pLOI2306（SEQ ID NO:12）のポリヌクレオチド配列を含んで
成るベクタをホスト細胞に導入するステップと、 多糖分解酵素を発現しているホスト細胞を特定するステップと を含む、ホスト細胞で多糖分解酵素を発現させる方法。 - 【請求項６３】 前記ホスト細胞がエタノール生成性である、請求項６０乃至
６２のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６４】 オリゴ糖源からエタノールを生成する方法であって、 多糖分解酵素をサロゲート・プロモータの転写制御下にコードする配列を含ん
で成り、前記プロモータが前記多糖分解酵素の発現増加を引き起こすことができ
る、第一の異種のポリヌクレオチド部分と、 分泌ポリペプチドをコードする配列を含んで成る第二の異種のポリヌクレオチ
ド部分と を含んで成るエタノール生成性ホスト細胞に前記オリゴ糖源を接触させるステッ
プ を含み、 前記第一及び第二のポリヌクレオチド部分が発現する結果、前記オリゴ糖源が
酵素分解されて発酵してエタノールになるよう、前記エタノール生成性細胞によ
る多糖分解酵素活性の生成が増加する、方法。 - 【請求項６５】 前記多糖分解酵素が、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、
エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、α-グルコシダーゼ、エンド-1,4-
α-キシラナーゼ、β-キシロシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-アラビノフ
ラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α-ア
ミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β-グルカナーゼ
、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチン加水分解酵素、
ペクテート融解酵素、又はこれらの組合せ、からなる群より選択される、請求項
６４に記載のホスト細胞。 - 【請求項６６】 前記多糖分解酵素がグルカナーゼである、請求項６５に記載
のホスト細胞。 - 【請求項６７】 前記グルカナーゼがcelZ遺伝子の発現産物である、請求項６
６に記載のホスト細胞。 - 【請求項６８】 前記celZ遺伝子がエルウィニア−クリサンセミ(Erwinia chr
ysanthemi）由来である、請求項６７に記載のホスト細胞。 - 【請求項６９】 前記第二の異種のポリヌクレオチド部分が、少なくとも一つ
のpul遺伝子又はout遺伝子を含んで成る、請求項６４に記載のホスト細胞。 - 【請求項７０】 前記ホスト細胞がエンテロバクテリアセエ科から選択される
、請求項６４に記載のホスト細胞。 - 【請求項７１】 前記ホスト細胞が、エシェリヒア及びクレブシエラからなる
群より選択される、請求項６４に記載のホスト細胞。 - 【請求項７２】 前記ホスト細胞が、Ｅ．コリ KO4 (ATCC 55123)、Ｅ．コリ
KO11 (ATCC 55124)、Ｅ．コリ KO12 (ATCC 55125)、K. オキシトカ（oxytoca ）
M5A1、及びK. オキシトカ P2 (ATCC 55307)からなる群より選択される、請求項
６４に記載のホスト細胞。 - 【請求項７３】 前記多糖分解酵素の活性が増加している、請求項６４に記載
のホスト細胞。 - 【請求項７４】 前記方法が水溶液中で行われる、請求項６４に記載の方法。
- 【請求項７５】 前記オリゴ糖がリグノセルロース、ヘミセルロース、セルロ
ース、ペクチン及びこれらの何らかの組合せからなる群 より選択される、請求
項６４に記載の方法。 - 【請求項７６】 前記第一の異種のポリヌクレオチド部分が、pLOI2306（SEQ
ID NO:12）であるか、又は、pLOI2306（SEQ ID NO:12）由来である、請求項６４
に記載の方法。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008092910A (ja) * | 2006-10-16 | 2008-04-24 | Forestry & Forest Products Research Institute | エタノールの製造方法 |
| JP2010524473A (ja) * | 2007-04-19 | 2010-07-22 | マスコマ コーポレイション | リグノセルロースバイオマスの熱化学的前処理と精砕の組合せ |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ523192A (en) * | 2000-06-26 | 2005-03-24 | Univ Florida | Methods and compositions for simultaneous saccharification and fermentation |
| PT3219806T (pt) * | 2004-03-25 | 2020-06-30 | Novozymes Inc | Métodos para degradar ou converter polissacarídeos da parede celular de plantas |
| KR100950113B1 (ko) * | 2007-12-17 | 2010-03-30 | 건국대학교 산학협력단 | 섬유소 분해 및 리그닌 분해 활성을 가진 신균주 엔테로박터 루드위기 ｋｕ201-3(ｋａｃｃ91341ｐ) 및 그의 배양물을 함유하는 사료용 발효촉진제 |
| WO2011024065A1 (en) * | 2009-08-28 | 2011-03-03 | Avesthagent Limited | A method of developing stress tolerant plants exhibiting self-glucogenic properties for use in bioethanol production from lignocellulosic biomass |
| WO2011079048A2 (en) * | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Danisco Us Inc. | Methods for improving the efficiency of simultaneous saccharification and fermentation reactions |
| EP3168300A1 (en) | 2010-06-03 | 2017-05-17 | Lallemand Hungary Liquidity Management LLC | Yeast expressing saccharolytic enzymes for consolidated bioprocessing using starch and cellulose |
| BR112013025753A8 (pt) | 2011-04-05 | 2018-06-12 | Lallemand Hungary Liquidity Man Llc | Métodos para aprimoramento do rendimento de produto e produção em um micro-organismo através da adição de aceptores de elétrons alternativos |
| EP2890784A1 (en) | 2012-08-29 | 2015-07-08 | Lallemand Hungary Liquidity Management LLC | Expression of enzymes in yeast for lignocellulose derived oligomer cbp |
| FI3033413T4 (fi) | 2013-08-15 | 2023-08-31 | Menetelmiä tuotesaannon ja tuotannon parantamiseksi mikro-organismissa glyserolikierrätyksellä |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5839517B2 (ja) | 1974-09-20 | 1983-08-30 | カブシキガイシヤ バイオリサ−チセンタ− | セルロ−スカラ アルコ−ルオセイゾウスル ホウホウ |
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| US5821093A (en) | 1988-08-31 | 1998-10-13 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Recombinant cells that highly express chromosomally-integrated heterologous genes |
| US5482846A (en) | 1988-08-31 | 1996-01-09 | University Of Florida | Ethanol production in Gram-positive microbes |
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| US5028539A (en) | 1988-08-31 | 1991-07-02 | The University Of Florida | Ethanol production using engineered mutant E. coli |
| US5424202A (en) | 1988-08-31 | 1995-06-13 | The University Of Florida | Ethanol production by recombinant hosts |
| US5000000A (en) | 1988-08-31 | 1991-03-19 | University Of Florida | Ethanol production by Escherichia coli strains co-expressing Zymomonas PDC and ADH genes |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008092910A (ja) * | 2006-10-16 | 2008-04-24 | Forestry & Forest Products Research Institute | エタノールの製造方法 |
| JP2010524473A (ja) * | 2007-04-19 | 2010-07-22 | マスコマ コーポレイション | リグノセルロースバイオマスの熱化学的前処理と精砕の組合せ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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