CN1759175A

CN1759175A - 生产维生素b12的改进方法

Info

Publication number: CN1759175A
Application number: CNA2003801101442A
Authority: CN
Inventors: H·巴尔格; D·耶恩
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2003-01-11
Filing date: 2003-12-12
Publication date: 2006-04-12
Also published as: AU2003294837A1; DE10300719A1; WO2004063360A3; JP2006512913A; AU2003294837A8; WO2004063360A9; CA2512857A1; NO20053205D0; NO20053205L; IL169352A0; EP1592785A2; WO2004063360A2; US20060105432A1

Abstract

本发明涉及通过包含经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株的培养物产生维生素B12的方法，并涉及经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株，以及用于产生其的载体。

Description

生产维生素B12的改进方法

本发明涉及使用经遗传修饰的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株产生维生素B12的方法，并且本发明涉及用于制备芽孢杆菌属经遗传修饰的细菌的载体。

因为维生素B12对人体的效果，维生素B12早在本世纪二十年代就由George Minot和William Murphy间接发现(Stryer，L.，1988，Biochemie，第四版，pp.528-531，Spektrum Akademischer Verlag GmbH，海德尔堡，柏林，纽约)。维生素B12最初于1948年得到纯化和分离，短至八年后的1956年，Dorothy Hodgkin成功地阐明了其复合体的三维晶体结构(Hodgkin，D.C.等，1956，维生素B12的结构，Nature 176，325-328和Nature 178，64-70)。维生素B12生物合成的天然存在的终产物是5`-脱氧腺苷钴胺素(辅酶B₁₂)和甲基钴胺素(MeCbl)，而构成工业上最频繁生产和处理形式的维生素B12定义为氰基钴胺素(CNCbl)。在本发明中，除非特别限定，维生素B12都表示所有三种类似分子的名称。

早至100多年以前(1884年)，De Bary首先描述了巨大芽孢杆菌物种。虽然普遍描述为以土壤为住处的细菌，但是巨大芽孢杆菌也可在多种其它生境中检测到，如盐水、沉积物、水稻、干肉、牛奶或蜂蜜。细菌经常伴随有假单胞菌和放线菌。如同和其紧密相关的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillus)一样，巨大芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，并且尤其是通过其相对明确的大小2×5μm、约38％的G+C含量和高度明确的形成孢子的能力，可对其进行辨别，其中从所述的相对明确的大小获得其名称。甚至生长培养基中非常少量的锰，足够该物种进行完整的孢子形成，这种能力仅可与一些嗜热芽孢杆菌物种形成孢子的效率相比较。由于其大小和其高效形成孢子和萌芽，在巨大芽孢杆菌上对这些方法的分子基础进行了广泛的研究，所以至现在，与巨大芽孢杆菌孢子形成和萌芽相关的150多个基因得到了描述。对巨大芽孢杆菌的生理学研究(Priest，F.G.等，1988，芽孢杆菌属的数值分类(A Numerical Classification of the Genus Bacillus)，J.Gen.Microbiol.134，1847-1882)，将该物种归类为专性需氧、脲酶阳性和Voges-Proskauer阴性、并且不能还原硝酸盐的形成孢子的细菌。巨大芽孢杆菌一个最为显著的特征是其利用多种碳源的能力。因此，它可利用多种糖，并且已经在，例如玉米糖浆、肉类加工业的废弃物，并且甚至在石油化学废物中得到发现。考虑到代谢非常广谱的碳源的能力，巨大芽孢杆菌完全可与假单胞菌等同(Vary，P.S.，1994，Microbiology，40，1001-1013，研究巨大芽孢杆菌的全盛期(Prime time for Bacillus megaterium))。

在工业生产多种酶、维生素等中广泛使用巨大芽孢杆菌，具有多种优势。一个优势无疑是在芽孢杆菌属中仅被枯草芽孢杆菌所超过的相对高度发展的遗传学。第二，巨大芽孢杆菌无碱性蛋白酶，所以在生产异源蛋白质中实际上未观察到降解。而且，巨大芽孢杆菌可高效分泌商业目标产物是公知的，如同例如在产生α-和β-淀粉酶的情况下所使用的一样。而且，由于其大小，巨大芽孢杆菌可积聚高生物量，直至过度的高群体密度导致其死亡。在通过巨大芽孢杆菌的工业生产中，最为重要的是进一步有利的事实，其中所述的事实是该物种可从废物和次等物质中产生高价值和非常高质量的产物。代谢非常广泛的底物谱的可能性也在使用巨大芽孢杆菌作为土壤解毒生物中得到反映，其甚至可降解氰化物、除草剂和残留性农药。最后，巨大芽孢杆菌完全是非病原体，并且不产生任何毒素的事实是非常重要的，特别是在生产食物和化妆品中。因为这些多种的优势，巨大芽孢杆菌已经应用于多种工业应用，如生产α-和β-淀粉酶、青霉素酰胺酶、有毒废物的处理或需氧生产维生素B12(综述参见Vary，P.S.，1994，Microbiology，40，1001-1013，研究巨大芽孢杆菌的全盛期(Prime time forBacillus megaterium))。

因为其在生物技术生产多种工业目标产物的使用中的许多优势，使用巨大芽孢杆菌具有巨大的经济目的。遗传优化的细菌菌株日益得到应用，以增加经济目标产物的生产率。然而，经遗传修饰的细菌菌株通常存在关于它们所包含的游离复制质粒稳定性的问题。而且，细菌发酵期间，在代谢物流向维生素B12和染色体编码的基因表达的直接控制方面的进一步改进有利于优化控制产物量。

本发明的目的是提供允许产生进一步提高的维生素B12的经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株。

这进一步需要提供合适的载体，其中所述的载体可使自谷氨酰tRNA形成尿卟啉原-III的酶过量表达，并且有利的是，抑制hem生物合成途径和增加流向维生素B12的代谢物。同时，根据本发明的载体应可将目的遗传修饰稳定地整合进细菌菌株的染色体。而且，在发酵期间，染色体编码的hemAXCDBL操纵子基因表达的诱导和/或hem生物合成途径的抑制应以靶向的方式进行控制。

通过提供经遗传修饰的包含如SEQ ID No.4所示hemA[KK]基因和/或如SEQ ID No.1(hemZ)所示的部分核苷酸序列作为反义RNA(ashemZ)的巨大芽孢杆菌菌株，可实现本目的，其中所述的SEQ ID No.4编码反馈抗性的谷氨酰-tRNA还原酶。

本发明进一步的实施方案包含这样的经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株，其中所述经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株包含如SEQ ID No.4所示的编码反馈抗性谷氨酰-tRNA合酶的hemA[KK]基因和/或如SEQ ID No.3所示的反义RNA(ashemZ)，其中所述hemA[KK]基因组织于hemA[KK]XCDBL操纵子中。

本发明也包含如编码粪卟啉原-III氧化酶的如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。根据本发明的这种核苷酸序列具有的特征在于，它包含在编码粪卟啉原-III氧化酶的hemZ基因区域之前(5‘-或上游序列)和/或之后(3‘-或下游序列)具有调控功能的序列。

为了本发明的目的，具有调控功能的序列理解为可影响转录、RNA稳定性或RNA加工和翻译的序列。调控序列的实例尤其是启动子、增强子、操纵子、终止子或翻译增强子。然而，这种列举不用于限制本发明。

如SEQ ID No.1所示的根据本发明的核苷酸序列优选地来源于巨大芽孢杆菌。在本文中，本发明也涉及所称的分离核酸。根据本发明，分离的核酸或分离的核酸片段理解为是单链或双链RNA或DNA聚合物，并且其可任选地包含天然的、化学合成的、经修饰的或人工核苷酸。在本文中，术语“DNA聚合物”也包括基因组DNA、cDNA或它们的混合物。

另外，如SEQ ID No.2所示的粪卟啉原-III氧化酶也是本发明的主题。如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列优选地由如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码。然而，也包括于本发明的是如编码粪卟啉原-III氧化酶的SEQID No.1所示核苷酸序列的等位基因。根据本发明，等位基因理解为功能上等同的核苷酸序列，即基本上以相同意义发挥作用的核苷酸序列。功能上等同的序列是那些尽管存在偏离的核苷酸序列，例如因为遗传密码的简并性，但仍然保留目的功能的序列。因此，功能等同物包含天然存在的此处所述序列的变体，而且也包含人工核苷酸序列，例如通过化学合成获得的和任选地经改编以匹配宿主生物的密码子选择的那些序列。而且，功能等同的序列包含具有经修饰的例如赋予对酶的抑制剂脱敏或抗性的核苷酸序列。

原则上，所有适合于维生素B12生产的常见巨大芽孢杆菌菌株可用于本发明的目的，即用于产生经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株。

为本发明的目的，维生素B12生产菌株理解为巨大芽孢杆菌菌株或已经经常规和/或分子遗传方法修饰的同源微生物，其中所述的方法以这样的方式进行，即朝向维生素B12或其衍生物的生物合成的代谢物流量增加(代谢工程)。在这些生产菌株中，例如一个或多个基因和/或代谢途径中决定性关键位置(瓶颈)的相应酶在其调控或真正的解除调控方面受到改变，其中所述的代谢途径因此受到复杂的调控。在本文中，本发明包含所有公知的芽孢杆菌属维生素B12生产菌株或其同源生物。根据本发明具有优势的菌株尤其包括巨大芽孢杆菌DSMZ32、DSMZ 509和DSMZ 2894的菌株。

通过传统诱变和优选地通过定向分子生物学技术和合适的筛选方法可产生根据本发明的已经经遗传修饰的细菌菌株。感兴趣的定向重组操作方法尤其是导致维生素B12的生物合成途径的分支位点，通过所述方法可以以靶向的方式控制代谢物流向最大的维生素B12产生。与代谢物流量调控相关基因的特定修饰也包括对结构基因之前和之后的调控区域的研究和修饰，例如优化和/或替换启动子、增强子、终止子、核糖体结合位点等。根据本发明也包含的是提高DNA、mRNA或所编码蛋白质的稳定性，例如分别通过减少或阻止核酸酶或蛋白酶的降解。

在本发明的改变形式中，如SEQ ID No.4所示的hemA[KK]基因整合入经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株的细菌染色体中。

经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株的另一变体的特征在于部分hemZ基因作为胞质编码的反义RNA(ashemZ)在该细菌中以增加的拷贝数而存在。为本发明的目的，部分hemZ基因理解为从如SEQ ID No.1所示的hemZ基因的核苷酸序列开始，可制备多种反义RNA。制备反义RNA的方法，例如通过PCR，是技术人员和现在实验室实践所公知的。这种差异例如是由已产生的反义RNA的长度或对反义RNA所来源的hemZ核苷酸序列的区域选择而导致的。在本文中，反义RNA序列可在它们的长度方面有变化，例如长度在几个核苷酸和编码区完整序列片段之间。根据本发明优选的是如SEQ ID No.3所示的反义RNA(ashemZ)。

拷贝数的增加可以是合适载体复制增强的结果，其导致拷贝数增加。原则上，拷贝数增加也可通过多次将基因或其部分整合入细菌染色体而实现。根据本发明也包含的是这样的经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株，其中hemA[KK]基因整合入所述巨大芽孢杆菌的细菌染色体中，并且部分hemZ基因作为反义RNA(ashemZ)以增加的拷贝数存在。

本发明的另一个主题是经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株，在所述巨大芽孢杆菌中，位于hemA[KK]XCDBL操纵子中的hemA[KK]基因和/或编码反义RNA(ashemZ)的部分hemZ基因在诱导型启动子的控制下。诱导型启动子的实例是木糖诱导的XylA启动子或β-半乳糖苷酶诱导的启动子(Miller，J.H.，1972，Experiments in Molecular Genetics，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。根据本发明优选的木糖诱导型启动子是来自于pWH1520的木糖操纵子的XylA启动子(Rygus，T等，1991，Appl.Microbiol.Biotechnol.，35：594-599)。通过向培养基中加入木糖，在XylA启动子控制下的基因的转录启动，即在本文中，可增加hemA[KK]XCDBL和/或ashemZ的基因表达。

为制备上述经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株，根据本发明合适的载体同样是本发明的主题并得到构建。

因此，本发明包含含有如SEQ ID No.4所示编码反馈抗性的谷氨酰-tRNA还原酶的hemA[KK]基因和与其有效连接用于诱导基因表达、筛选、复制和/或整合入宿主细胞染色体的序列的整合型载体。

整合型载体理解为通过位点特异重组而在特定位点整合入宿主细胞染色体的载体，在宿主细胞中，载体和染色体一起复制。在根据本发明的一个改变形式中，位点特异重组通过hemA基因的同源序列而进行。

根据本发明，同源序列理解为与根据本发明的核苷酸序列互补和/或与其杂交的那些序列。根据本发明，术语“杂交序列”包括在本身公知的严谨条件下，与上述核苷酸序列特异地发生相互作用(结合)的基本上类似的DNA或RNA核苷酸序列。

从SEQ ID NO：4所述的DNA序列或这些序列的一部分开始，这类同源序列可从其它生物中分离，例如使用常规杂交方法或PCR技术。这些DNA序列在标准条件下与上述序列杂交。使用例如来自保守区的短寡核苷酸是有利的，通过与其它hemA基因比较，以技术人员所熟悉的方式确定所述的短寡核苷酸以实施杂交。然而，也可使用根据本发明用于杂交的较长核酸片段或完整序列。根据用于杂交所使用的核酸即寡核苷酸、较长的片段或完整序列、或根据核酸类型是DNA或RNA，这些标准条件发生变化。因此，例如DNA：DNA杂交体的熔点约比相同长度的DNA：RNA杂交体低10℃。

根据核酸的不同，标准条件理解为，例如具有浓度0.1-5×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，15mM枸橼酸钠，pH 7.2)或又存在50％甲酰胺的缓冲水溶液，温度42℃-58℃(如在5×SSC、50％甲酰胺中于42℃)。DNA：DNA杂交体的杂交条件有利的是0.1×SSC和温度约20℃-45℃，优选地约30℃-45℃。对于DNA：RNA杂交体，杂交条件有利的是0.1×SSC和温度约30℃-55℃，优选的约45℃-55℃。上述杂交温度是在不存在甲酰胺时，对具有长度约100个核苷酸且G+C含量50％的核酸的计算熔点值的例子。DNA杂交的实验条件在相关的遗传学教科书中得到了描述，如Sambrook等，″Molecular Cloning″，Cold Spring Harbor Laboratory，1989，并且可使用技术人员所熟悉的公式，例如根据核酸长度、杂交体类型或G+C含量的不同进行计算。从下述教科书：Ausubel等(编著)，1985，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York；Hames和Higgins(编著)，1985，Nucleic Acids Hybridization：A PracticalApproach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford；Brown(编著)，1991，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，IRL Press atOxford University Press，Oxford中，技术人员可获得关于杂交的进一步的信息。

此外，SEQ ID NO：14中所提及序列的同源序列理解为，例如在衍生的氨基酸水平，具有至少95％同源性，优选地至少96％的同源性，特别优选地至少97％或98％的同源性，非常特别优选地至少99％或99.9％同源性的变体。在全部的氨基酸区域计算其同源性。使用PileUp程序(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins等，CABIOS，51989：151-153)。为了本发明的目的，同源性理解为同一性。这两个术语是同义的。

有效的连接是指诸如启动子、编码序列、终止子和适当时进一步的调节元件的按序排列，这种排列使得在编码序列的表达过程中这些调节元件中的每一个都可以发挥其适当的功能。这些调节性核苷酸序列可以是天然来源的，或是通过化学合成获得的。

合适的启动子原则上是指能在适宜的宿主生物中控制基因表达的任何启动子。根据本发明，启动子也可能是化学诱导的启动子，该启动子能够控制受其调控的基因在宿主细胞特定时期表达。β-半乳糖苷酶-、阿拉伯糖-或木糖-诱导系统在此作为实例被提到。根据本发明优选的是木糖-诱导系统，并且在该系统中是来源于pWH1520的xylA启动子(Rygus，T.等，1991，Appl.Microbiol.Biotechnol.，35：594-599)。因此，本发明也包含上述类型的基因表达在xylA启动子控制之下的整合型载体。

用于筛选、复制和/或整合入宿主细胞染色体的序列的大量实例在文献中得到了描述。因此，例如赋予氨苄青霉素、四环素、卡那霉素或红霉素抗性的基因的多种筛选标志是公知的。然而，这种列举不是最终的或限制本发明。根据本发明有利的筛选序列是用于在大肠杆菌中筛选载体的氨苄青霉素抗性基因，或用于在巨大芽孢杆菌中筛选载体的红霉素抗性基因。

大肠杆菌中复制起点的有利变体是pBR322(Sutcliffe，J.G.，1979，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，43，Pt 1：77-90或巨大芽孢杆菌中的pE194ts或repF。巨大芽孢杆菌的温度敏感起点pE194ts仅允许在40℃以下复制，由此在该“允许”温度之上建立选择压力用于整合入染色体(Rygus等，1992)。repF基因产物描述为以反式发挥作用并且为质粒在革兰氏阳性细菌中复制所需的元件(Villafane等，1987)。本发明的其它整合型载体的变体的特点在于具有至少一个温度敏感的复制起点。包含温度敏感的复制起点pE194ts的整合型载体是优选的。

本发明的其它变体包含这样的独特整合型载体，该载体包含经遗传修饰的hemA基因的核苷酸序列(hemA[KK])，其编码氨基酸序列包含至少两个带正电荷氨基酸插入的反馈抗性谷氨酰-tRNA合酶。存在于整合型载体中的经遗传修饰的核苷酸序列优选地编码包含2-6个，优选地2-4个以及特别优选地2个额外的氨基酸的反馈抗性谷氨酰-tRNA合酶。通过插入两个或相应地多达6个三联体密码，使用技术人员所熟悉的方法，例如通过PCR，将这些额外的氨基酸在编码它们的核苷酸序列水平导入编码的核苷酸序列。

整合型载体的优选变体包含编码反馈抗性谷氨酰-tRNA合酶的经遗传修饰的hemA基因的核苷酸序列(hemA[KK])，其中所述酶的氨基酸序列在N末端的第3和4位包含两个带正电荷氨基酸的插入。带正电荷氨基酸优选地是赖氨酸残基。

酶的反馈抗性形式理解为活性不再被代谢途径(或代谢途径的支路)的终产物所抑制的蛋白质。根据本发明，这也包含具有SEQ ID No.5所示氨基酸序列的反馈抗性谷氨酰-tRNA还原酶，其中所述的SEQ ID No.5由巨大芽孢杆菌的hemA[KK]基因编码。

在本文中，经遗传修饰的hemA基因的核苷酸序列(hemA[KK])不但包含此处所述hemA序列的天然存在变体，而且包含人工核苷酸序列，例如通过化学合成获得的核苷酸序列，如果适当，将所述化学合成的核苷酸序列采用以匹配宿主生物的密码子选择。遗传修饰包含替换、添加、缺失、交换或插入一个或多个核苷酸残基。

此处也包括的是公知的有义突变(sense mutation)，在蛋白质水平，所述的有义突变，例如导致保守氨基酸的替换，但是所述的有义突变不导致蛋白质活性的任何根本变化，并且因此对其功能是中性的。此处，例如某些氨基酸可被具有类似物理-化学特征(空间分布、碱性、疏水性等)的氨基酸所替换。例如，用赖氨酸残基替换精氨酸残基、用异亮氨酸残基替换缬氨酸残基、或用谷氨酸残基替换天冬氨酸残基。这也包含在蛋白质水平上影响蛋白质N或C末端，并且在对蛋白质的催化功能没有明显不良影响的同时确实对其活性调控具有明显不良影响的核苷酸序列的修饰。当然，这些修饰对蛋白质结构具有稳定效果。优选地，在编码核苷酸序列中导入编码赖氨酸的6个核苷酸，同时根据巨大芽孢杆菌的密码子选择。这些修饰可通过本身公知的方法进行实施。

此外，本发明包含含有如SEQ ID No.1(hemZ)所示的作为反义RNA(ashemZ)的部分核苷酸序列以及与其有效连接的为诱导基因表达、筛选、复制和/或整合入宿主细胞染色体的序列的载体。

本发明载体的优选实施方案包含如SEQ ID No.3所示的反义RNA(ashemZ)以及与其有效连接的为诱导基因表达、筛选、复制和/或整合入宿主细胞染色体的序列。

优选的是：载体增强的复制导致hemZ基因作为反义RNA(ashemZ)部分的拷贝数增加，优选地如SEQ ID No.3所示的反义RNA(ashemZ)的拷贝数增加。

为获得增强的基因表达(过量表达)，可增加所探讨基因的拷贝数。此外，位于结构基因上游的启动子和/或调控区和/或核糖体结合位点相应地以表达速率增加的方式得到修饰。掺入结构基因上游的表达盒可类似地发挥作用。通过使用诱导型启动子，可在产生维生素B12期间增加表达。延长mRNA寿命的方法同样提高表达。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中或在染色体中整合和扩增。此外，也可提高酶活性自身，例如通过提高催化活性或解除抑制剂的调控或产生反馈脱敏(反馈抗性)活性，或通过酶蛋白质的降解得到阻止的事实而得到增加。然而，所探讨基因的过量表达此外可通过改变培养基组分和培养过程而得以实现。在包含部分hemZ基因作为反义RNA(ashemZ)的宿主细胞中，得到的(表达的)反义RNA与相应的(互补)编码粪卟啉原-III氧化酶的mRNA区退火。优选地，它因此阻断hemZ基因的核糖体结合位点，因此抑制与hem生物合成相关的关键酶的翻译和表达。这依次导致hem生物合成的下降，其优势是导致朝向维生素B12产生的代谢作用的代谢物的量增加。

本发明还涉及包含SEQ ID No.1中所示的部分核苷酸序列(hemZ)作为反义RNA(ashemZ)的载体，优选地是SEQ ID No.3所示的反义RNA(ashemZ)，其中基因表达在xylA启动子的控制之下。原则上，该载体此外也可整合入宿主细胞的染色体，例如当配备有温度敏感的复制起点时。该载体的一种变体包含至少一个温度敏感的复制起点。优选地，这种载体变体包含温度敏感的复制起点pE194ts。

使用例如Sambrook，J.等，1989，In Molecular cloning；a laboratorymanual.2^nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York所述的常规重组和克隆技术，根据本发明的载体通过融合上述组件如启动子、编码基因片段、复制起点、筛选基因等而得到制备。连接物或接头可加入片段，以将DNA片段互相连接。

本发明还涉及包含上述类型的hemA[KK]基因的整合型载体的用途，用于制备根据本发明的经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株。同样，本发明包含如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的用途，用于制备如SEQ ID No.3所示的反义RNA(ashemZ)，此外，本发明包含如SEQ ID No.3所示反义RNA(ashemZ)的用途，用于制备包含如SEQ ID No.1所示部分hemZ基因作为如SEQ ID No.3所示反义RNA(ashemZ)的上述类型的载体。本发明还涉及包含如SEQ ID No.1所示的部分hemZ基因作为SEQ ID No.3所示反义RNA(ashemZ)的载体的用途，用于制备本发明的经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株，根据本发明，可将包含hemA[KK]基因的整合型载体和包含反义RNA(ashemZ)的载体转移至合适的巨大芽孢杆菌菌株，并使用所得到的经遗传修饰的菌株生产维生素B12。

因此本发明也涉及所述经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株的用途，用于生产维生素B12。

本发明还涉及通过对包含所述经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株的培养，以及在需氧条件下实施发酵而生产维生素B12的方法。

在根据本发明方法的一种改变形式中，在需氧发酵细胞的指数生长期，进行从需氧至厌氧发酵条件的转换。通过称为转换的步骤，或通过两步发酵方法，维生素B12的产生甚至可得到进一步的增加。

本文中本发明的优势是，一旦需氧培养物达到最大的光密度就进行从需氧至厌氧发酵的转换的方法，但光密度至少要达到约2-3。通常，吸光度在570-600nm下测定。

为本发明的目的，厌氧条件理解为是指细菌首先在有氧下生长，然后转移至厌氧瓶中进行发酵的种种条件。转移进厌氧瓶内的时间，特别是在两阶段方法中，发生在需氧培养的细菌刚刚达到指数生长期。这表明，转移到厌氧瓶后，细菌只消耗瓶中存在的氧而不再额外供氧。这些条件也可以说成是半厌氧。相应的步骤是常规的实验室操作并且为技术人员所熟知。

起初将细菌在发酵罐里进行需氧发酵然后将氧的供应逐渐减少并最终建立起半厌氧条件也是一种流行的相似方法。作为备选，通过通入惰性气体如氮气也可积极地排出氧气。在本发明的一个特定改变形式中，例如通过向培养基中加入还原剂建立严格的厌氧条件也是可能的。

对于本发明在厌氧条件下(无论是半厌氧或严格的厌氧条件)的发酵，细菌一般不是绝对需要需氧培养(预培养)。这意味着细菌也可在厌氧条件下培养，随后进一步在半厌氧或严格厌氧条件下发酵。也可以想象到保存的菌株可以直接用于接种并用来在厌氧条件下制备维生素B12。根据本发明经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株也可以分批培养发酵。本发明也包括补料分批培养发酵或连续发酵的形式。

根据本发明的优势是这样的方法，所述的方法是hemA[KK]XCDBL操纵子的表达和/或编码hemZ基因的反义RNA(ashemZ)的核苷酸序列的表达是通过向发酵培养基中加入木糖而得到诱导的。

本发明也涉及上述生产维生素B12的方法的改变形式，其中如SEQ IDNo.4所示的hemA[KK]XCDBL操纵子的表达和/或编码hemZ基因的反义RNA的SEQ ID No.3所示核苷酸序列(ashemZ)的表达是通过向发酵培养基中加入木糖而得到诱导的。

在本发明生产维生素B12的方法中，证明木糖浓度约0.1-1％是有利的。向培养基中加入约0.2-0.5％木糖是优选的。在需氧发酵条件下，特别优选的是加入约0.20-0.25％，尤其是0.23％木糖，以及在厌氧发酵条件下加入0.4-0.5％，尤其是0.5％木糖。

本发明经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株中hemA[KK]XCDBL操纵子的过量表达导致维生素B12含量的增加，其中所述经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株(“整合型菌株”)包含整合入染色体的在xylA启动子诱导控制之下的hemA[KK]XCDBL操纵子，比较巨大芽孢杆菌菌株DSMZ509和“整合型”菌株的维生素B12含量(μg/l×OD)，后者增加了至少15-40倍，优选的20-35倍，特别优选的22倍。当以μg/l计算维生素B12产量的增加时，增加了至少15-40倍，优选的20-35倍，特别优选的30倍。

本发明经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株如DSMZ509中的ashemZ基因的过量表达是基于例如细胞中拷贝数的增加，并且可通过向培养基中加入木糖而额外得到诱导。在木糖诱导后约3小时的时间点导致维生素B12含量比比较菌株增加约15-40％倍，优选的20-35％倍，特别优选的22％倍，在用木糖诱导后约6小时的时间点，例如会出现维生素B12含量增加约16％(见上文，请指出上限和下限)。

比较菌株理解为是指同样含有载体但无ashemZ插入物的巨大芽孢杆菌菌株。

在根据本发明方法的一种改变形式中，至少向培养基中加入钴和/或5-氨基乙酰丙酸。

在需氧条件下，加入约250μM钴可有利地实施发酵；在厌氧条件下，加入不超过500μM钴是有利的。当加入5-氨基乙酰丙酸时，在需氧和厌氧条件下不超过300μM是有利的。在本发明方法的一种改变形式中，通过向每升培养基中加入约200-750μM、优选的250-500μM钴，可提高维生素B12的含量。

在含有钴和ALA的情况下，用木糖诱导后6小时，经遗传修饰的巨大芽孢杆菌DSMZ509-pHBasHemZ比比较菌株形成至少1-25％、优选的5-18％和特别优选的10％的更多维生素B12。这显示反义hemZ RNA的转录不但抑制hem的合成，而且同时导致维生素B12形成的增加。Hem合成的抑制渐增地指导四吡咯合成的代谢产物流向维生素B12的合成途径。

发酵后，已形成的维生素B12可从发酵培养基中处理。这种方法是常规的实验室工作，并且此处不再进一步详述。

通过下述构建的非限制性实施例较详细地阐述本发明。

菌株和质粒

使用下文表1和表2中所示的菌株和质粒。

表1：使用的菌株

菌株	描述	参考文献/来源
菌株	描述	参考文献/来源	大肠杆菌DH10B	F^-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 endA1araD139 Δ(ara，leu)7697 galU galKλ-rpsL nupG	GibcoBRL
			大肠杆菌DH10B
	巨大芽孢杆菌DSMZ509	维生素B12生产菌株	DSMZ^*

^*DSMZ：德意志微生物保藏中心[German Collection of Microorganisms]，Brunswick

表2：使用的质粒

质粒	描述	参考文献/来源
质粒	描述	参考文献/来源	pWH1520	用于芽孢杆菌的克隆和表达载体，Ap^r，Tc^r	Rygus等，1991
pHBasHemZ	在pWH1520中针对巨大芽孢杆菌hemZ基因的129bp反义RNA	本工作	pWH1520	用于芽孢杆菌的克隆和表达载体，Ap^r，Tc^r	Rygus等，1991
pHBasHemZ
pWH1967E				用于芽孢杆菌的克隆、表达和整合载体，Ap^r，Tc^r，Ery^r	Schmiedel，D.等，1997
pWH1967E	pMM1520	具有MCS的pWH1520	Malten，M.，2002	用于芽孢杆菌的克隆、表达和整合载体，Ap^r，Tc^r，Ery^r	Schmiedel，D.等，1997
pHBintE	pMM1520	具有MCS的pWH1520	Malten，M.，2002	用于芽孢杆菌的克隆、表达和整合载体，Ap^r，Ery^r，ori pE194 ts	本工作
pHBintE	pHBiHemAKK	具有HemA突变的芽孢杆菌的整合型载体，Ap^r，Ery^r，ori pE194 ts	本工作	用于芽孢杆菌的克隆、表达和整合载体，Ap^r，Ery^r，ori pE194 ts	本工作

缓冲液和溶液

基本培养基

Mopso基本培养基

Mopso(pH 7.0) 50.0mM

N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)(pH 7.0) 5.0mM

MgCl₂ 520.0μM

K₂SO₄ 276.0μM

FeSO₄ 50.0μM

CaCl₂ 1.0mM

MnCl₂ 100.0μM

NaCl 50.0mM

KCl 10.0mM

K₂HPO₄ 1.3mM

(NH₄)₆Mo₇O₂₄ 30.0pM

H₃BO₃ 4.0nM

CoCl₂ 300.0pM

CuSO₄ 100.0pM

ZnSO₄ 100.0pM

D-葡萄糖 20.2mM

NH₄Cl 37.4mM

滴定试剂是KOH溶液。

对于固相培养基，加入15g/l琼脂。

用于巨大芽孢杆菌原生质体转化的溶液

SMMP缓冲液

3号抗生素培养基(Difco) 17.5g/l

蔗糖 500.0mM

马来酸钠(pH 6.5) 20.0mM

MgCl₂ 20.0mM

滴定试剂是NaOH溶液。

PEG-P溶液

PEG 6000 40.0％(w/v)

蔗糖 500.0mM

马来酸钠(pH 6.5) 20.0mM

MgCl₂ 20.0mM

滴定试剂为NaOH溶液。

cR5上层琼脂

蔗糖 300.0mM

Mops(pH 7.3) 31.1mM

NaOH 15.0mM

L-脯氨酸 52.1mM

D-葡萄糖 50.5mM

K₂SO₄ 1.3mM

MgCl₂×6H₂O 45.3mM

KH₂PO₄ 313.0μM

CaCl₂ 13.8mM

琼脂 4.0g/l

酪蛋白氨基酸 0.2g/l

酵母提取物 10.0g/l

滴定试剂为NaOH溶液。

培养基和培养基添加剂

除非特别声明，均使用Sambrook J.等人(1989，分子克隆；实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)所述的Luria-Bertani肉汤(LB)完全培养基。对于固体培养基，另外加入15g琼脂。

添加剂

添加剂，诸如碳源、氨基酸、抗生素或盐，可以加入到培养基中一起高压灭菌，或者用水配成浓缩贮液灭菌，适当时通过过滤除菌。将这些物质加入到已高压灭菌并冷却到50℃以下的培养基中。若含有对光敏感的物质如四环素，要注意在暗处培养。通常使用的终浓度如下，但这并不意味着浓度变化是不可能的：

ALA 298μM

氨苄青霉素(对大肠杆菌) 296μM

CoCl₂(在需氧培养基中) 250μM

红霉素(对巨大芽孢杆菌) 0.55μM

102μM

葡萄糖 22mM

溶菌酶 1mg/ml

四环素(在固体培养基中) 23μM

四环素(在液体培养基中) 68μM

木糖 33mM

微生物学技术

灭菌

除非特别说明，所有的培养基和缓冲液均在120℃，1巴压力下，蒸汽灭菌20分钟。对热敏感物质需通过过滤除菌，玻璃器具在180℃高热灭菌至少3小时。

液体细菌培养物的一般生长条件

使用无菌环，将细菌从LB琼脂平板或甘油培养物中移出，并接种入根据需要包含抗生素的营养培养基。

在37℃，转速180转/分，于带挡板的摇瓶中对需氧细菌培养物进行孵育。根据细菌培养物的目的光密度改变孵育时间。

巨大芽孢杆菌的生长条件

为了尽可能给需氧培养物通气，巨大芽孢杆菌应培养于转速为250转/分钟，温度均为37℃的带挡板摇瓶中。厌氧培养在150毫升厌氧瓶中，以150毫升体积，37℃和100转/分进行生长。在这两种情况下，小心地从过夜培养物中按1∶100比例进行接种，并使用恒定的条件过夜培养。为在厌氧条件下获得更高细胞生物量的产量，将巨大芽孢杆菌培养物在需氧条件下预孵育，并且当其密度达到目的值时，转到厌氧生长条件下。为此，将巨大芽孢杆菌首先在带挡板的摇瓶中于250转/分和37℃孵育。在指数生长中期，或在稳定期之初，将所有培养物转移至150毫升的厌氧瓶中，并在37℃和100转/分进行生长。

细菌平板培养

使用无菌环，将细菌从甘油培养物中移出，并极小地在根据需要经合适的抗生素处理的LB琼脂平板上划线，以便在37℃过夜孵育后，单克隆可在平板上辨别出来。如果使用来自液体培养物的细菌，使用Drygalski铲在LB琼脂平板上划线，然后在37℃过夜孵育。

细胞密度的测定

通过测定578nm波长下的光密度来测定细菌培养物的细胞密度，假定1OD₅₇₈相当于1×10⁹个细胞。

细菌的贮藏

细菌的长期贮藏涉及公知的甘油培养物。为此，将850μl细菌的过夜培养物与150μl无菌的85％甘油充分混合，并且将混合物随后存储于-80℃。

分子生物学方法

用于上述分子生物学方法的标准操作是Sambrook等(1989)。

感受态细胞的制备

为制备感受态大肠杆菌细胞，将500毫升液体培养物用LB培养基生长至OD₅₇₈为0.5-1。将培养物在冰上冷却，然后离心(4000×g；15分钟；4℃)。将细胞沉淀充分重悬于无菌去离子水中、离心(4000×g、8分钟、4℃)、再次用无菌去离子水洗涤，并再次离心(4000×g、8分钟、4℃)。沉淀用10％(v/v)甘油溶液洗涤后，将混合物离心(4000×g、8分钟、4℃)，并将沉淀重悬于尽可能少的10％(v/v)甘油溶液中。将感受态大肠杆菌细胞立即用于转化，或冷冻于-80℃。

通过电穿孔转化细菌

通过配备有Pulse Controller的Gene Pulser(BioRad)进行电穿孔，实施转化。为此，在每种情况下，将40μl感受态大肠杆菌细胞和lμg质粒DNA转移至转化杯，并且在Gene Pulser中暴露于25uF，12kV/cm场强和200Ω并联阻抗。在已加入2μl以上质粒DNA的情况下，实施透析。

为随后的再生，转化后，将经转化细胞立即在1毫升LB培养基中于调温度摇床上在37℃孵育半小时。此后，将这些批次的不同体积涂布在含有合适抗生素添加物的LB平板上，并在37℃过夜孵育。

巨大芽孢杆菌的原生质体转化

原生质体制备

用1毫升巨大芽孢杆菌的过夜培养物接种50毫升LB培养基，并于37℃孵育。在OD₅₇₈为1时，将细胞离心(10000×g、15分钟、4℃)，并重悬于5毫升新鲜制备的SMMP缓冲液中。在SMMP缓冲液中加入溶菌酶后，将悬液于37℃孵育60分钟，并在显微镜下检测原生质体的形成。通过离心(3000×g、8分钟、室温)收获细胞，然后将细胞沉淀小心地重悬于5毫升SMMP缓冲液中、离心，并实施第二次洗涤步骤。然后，在加入10％(v/v)甘油后，将原生质体悬液分成小份，并冷冻于-80℃。

转化

在SMMP缓冲液中，将500μl原生质体悬液用0.5-1μg DNA处理，并加入1.5毫升PEG-P溶液。在室温孵育2分钟后，加入5毫升SMMP缓冲液、小心地混合，并离心(3000×g、5分钟、室温)悬液。此后立即移去上清，并将勉强可见的沉淀重悬于500μl SMMP缓冲液中。将悬液于37℃轻微振荡孵育90分钟。此后，将50-200μl转化细胞与2.5毫升cR5Top琼脂混合，并置于包含适于筛选的抗生素的LB-琼脂平板上。转化克隆于37℃孵育一天后可辨别出来。

对巨大芽孢杆菌hemZ基因的克隆和测序

为对巨大芽孢杆菌DSMZ509的hemZ基因测序，分离基因组DNA作为PCR反应中的模板，并使用下述引物：

PCR引物1：5‘-TTTATATTCATATTCCATTTTG-3‘

PCR引物2：5‘-GGTAATCCAAAAATAAAATC-3‘

扩增与枯草芽孢杆菌hemZ基因具有65.1％同一性的480bp PCR片段，其中所述的PCR片段构成了巨大芽孢杆菌hemZ基因的部分序列。为完备hemZ的部分序列，使用Sigma Geneosys的载体盒系统，实施单向PCR，即称为的载体盒PCR。载体盒PCR允许扩增毗连已知序列片段的未知DNA区。此处，第一引物以已知DNA序列为基础进行设计。为建立与所需要的第二PCR引物杂交的已知DNA序列，使用限制内切酶对基因组进行切割，并将所有得到的末端与已知的短DNA序列连接。合成主链后，将短序列(小载体)作为第二引物的靶序列。

所有与载体盒单元融合的限制性消化产物可作为一种基因库，即小载体库，借助于所述的库可扩增任何目的序列。由于小载体由部分没有配对的寡核苷酸双链组成，当第二个扩增循环的互补PCR引物特异于已知序列区时可进行杂交，并延伸产生互补序列。这确保仅目的DNA得到扩增。

成功的载体盒PCR需要可得到扩增的目的基因组DNA的片段大小。此处，片段大小不应超过6-7kb，以便特异的DNA聚合酶(Taq)可没有中断地合成该片段，直至其末端。通过初步的Southern印迹分析，确定消化基因组DNA的足够限制酶。为此目的，选择ClaI限制酶。已通过Southern印迹分析确定的片段大小允许计算预期PCR片段的大小，并因此便于其鉴定。

载体盒PCR导致分离巨大芽孢杆菌完整hemZ基因的的一条链。从该序列开始，使用反向PCR，对所有hemZ基因进行扩增和测序是可能的。序列如SEQ ID No.1所示。

载体构建

构建pHBintE

使用的起始质粒是pWH1967E(Schmiedel，D.等，1997，Appl.Microbiol.Biotechnol.，47(5)：543-546)和pMM1520(Malten，Marco，2002，Produktion und Sekretion einer Dextransucrase in Bacillus megaterium[Production and Secretion of a Dextran Sucrase in Bacillus megaterium]，博士论文，Institute of Microbiology(Prof.Dr D.Jahn)，TechnicalUniversity Brunswick)。首先，在每种情况下用PstI和HindIII切割这两种质粒。此后，将全部混合物各自应用于一个琼脂糖凝胶，并洗脱目的片段。pWH1967E(4198bp)的洗脱片段包含红霉素抗性、repF基因、温度敏感起点pE194ts和一半氨苄青霉素抗性。pMM1520片段(1485bp)包含巨大芽孢杆菌的xylA‘启动子和直接位于启动子上游的多克隆位点、pBR322的起点和补充氨苄青霉素抗性的第二部分的氨苄青霉素抗性基因。然后，将两个片段的粘端连接。将得到的质粒命名为pHBintE。克隆策略在图1中图示。

因此，经克隆质粒pHBintE(图1)具有下述特征。它具有筛选大肠杆菌转化子的氨苄青霉素抗性和筛选巨大芽孢杆菌转化子的红霉素抗性。存在在大肠杆菌中复制的重要元件(pBR322)和巨大芽孢杆菌中复制的重要元件(pE194ts和repF)。巨大芽孢杆菌的温度敏感起点pE194 ts仅允许在40℃以下复制，由此在该“允许”温度之上建立整合入染色体的筛选压力(Rygus等，1992)。将repF基因产物描述为以反式发挥作用和革兰氏阳性细菌中质粒复制所需要的元件(Villafane等，1987)。而且，质粒包含具有直接位于上游的多克隆位点的xylA‘启动子。通过木糖，该启动子使得诱导插入多克隆位点的基因成为可能。

构建pHBiHemA[KK]

图2显示具有“KK-去调控的HemA”的巨大芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌野生型以及鼠伤寒沙门氏菌的HemA前27个氨基酸的比对报告。该图再次清楚地显示实施插入的位点。

通过PCR克隆HemA[KK]突变体。使用的模板是巨大芽孢杆菌的染色体DNA。由于巨大芽孢杆菌的hemA基因序列是公知的，获得引物是可能的。引物序列如下：

正向	5‘GGGGACTAGTCAAATGCAT AAAAAAATTATAGCAGTCGG3‘
正向	5‘GGGGACTAGTCAAATGCAT AAAAAAATTATAGCAGTCGG3‘	反向	5‘CTGGGGTACCCCATATCAACCATTATTCAATCC3‘

获得的引物缺少与巨大芽孢杆菌序列的完全同源性。首先，为得到SpeI切割位点(斜体)，在正向引物中交换了6个碱基。第二，为克隆hemA[KK]突变体，通过长度为6个碱基并编码两个赖氨酸(下划线)的DNA序列替换另外的6个碱基。以“KK插入”位于氨基酸序列N末端的第三和第四位置的方式，选择插入位点。由于遗传密码子是简并性的，为确定最可能的序列，使用巨大芽孢杆菌的密码子选择。密码子选择表明了编码生物基因组的氨基酸的某些碱基三联体的概率。在巨大芽孢杆菌的情况下，选择百分比为76％的“AAA”是赖氨酸最频繁的三联体。将KpnI切割位点导入反向引物。通过MWG，Ebersbach合成引物。

使用Quiagen的PCR纯化试剂盒纯化通过PCR扩增的hemA[KK]突变体，用SpeI和KpnI切割，然后再次纯化。质粒pHBintE同样用SpeI和KpnI切割，并使用Quiagen的PCR纯化试剂盒纯化。测定其浓度后，将这两个片段以载体/插入物比为1∶4进行连接，以产生命名为pHBiHemAKK的整合型载体。质粒pHBiHemAKK的克隆策略图示于图3中。

因为pHBiHemAKK与pHBintE仅在hemA[KK]突变体的插入不同，它保留了pHBintE的特性。此外存在的分别是在大肠杆菌和巨大芽孢杆菌中用于筛选的氨苄青霉素抗性和红霉素抗性。起点pBR322用于在大肠杆菌中的复制，温度敏感起点pE194ts和repF用于在巨大芽孢杆菌中的复制，将Xyl A‘和hemA[KK]突变体连接以产生翻译融合，并在xyl启动子的控制之下。由于hemA[KK]插入，pHBiHemAKK具有与巨大芽孢杆菌染色体同源的片段，并因此另外具有通过单互换重组整合入染色体的可能性。

温度敏感起点pE194ts对于筛选这种整合情况非常重要。因为质粒在30℃复制，巨大芽孢杆菌转化子可在该温度用红霉素筛选。当温度增至42℃，质粒不再复制。这意味着仅那些已将质粒整合入染色体，并因此具有红霉素抗性的转化子可以生长。

pHBiHemA[KK]整合入巨大芽孢杆菌染色体因此可使木糖诱导所有hemAXCDBL操纵子过量表达。而且，由于HemA蛋白质的反馈去调控突变体，质粒包含改进的过量生产维生素B12的可能。具有整合型质粒pHBiHemA[KK]的巨大芽孢杆菌菌株DSMZ509在下文中称其为HBBm1。

构建pHBasHemZ

从分离自巨大芽孢杆菌DSMZ509的基因组DNA开始，PCR和下文中所描述的引物通过常规实验室实验，用于扩增反义RNA形式的hemZ基因mRNA 5’区的129bp BamHI/SpeI片段。

上游引物(ashemZ)：包含BamHI切割位点

5‘-GCGGGATCCCTTGAACTGAGCACCTTGACCGG-3‘

反向引物(ashemZ)：包含SpeI切割位点

5‘-TCGACTAGTCGGACGTAAAAAACGTTCATCTTCTATACC-3‘

PCR条件：

7分钟/95℃

30个循环：

1分钟/95℃

1分钟/64℃

1分钟/72℃

7分钟/72℃

此后，纯化扩增的BamHI/SpeI反义RNA片段，并克隆入之前已用限制内切酶SpeI和BamHI线性化的pWH1520载体(Rygus，T等，1991，Appl.Microbiol.Biotechnol.，35：594-599)。所得到的包含在xylA启动子控制之下的反义hemZ RNA的质粒pHBasHemZ显示在图4中。

如SEQ ID No.3所示插入的反义hemZ RNA长度为129bp，并起始于实际hemZ基因的起始密码子之前的82个核苷酸。反义hemZ RNA位置的概况如下：

→asRNA(129bp) -355’CGTTTGTTTCCTGTCCGCGCATTC CCTTGAACTGAGCACCTTGACCGGACATA-10 RBSCGTAGGTTTTGTAAACTGATTACTTAGATAGAATTGATTTGAAAGGTGATTATA起始hemZ ←TTGAACATTTATATAAAAGGTATAGAAGATGAACGTTTTTTACGTCCGCTTCACCGAATTTCAGATTTGTTTTTTGAAGAAAGCAACGTC-3`

因此，反义RNA和hemZ mRNA的转录形成了双链RNA，并因此阻断了hemZ基因用于核糖体的核糖体结合位点。

转化和pHBiHemAKK整合入巨大芽孢杆菌

为可将本整合型载体整合入染色体，通过原生质体转化，首先用pHBiHemAKK转化巨大芽孢杆菌DSMZ509。转化菌株在添加红霉素(1μg/ml和75μg/ml)的琼脂平板上生长。培养温度选择30℃，因为质粒可在该温度下复制。

生长24小时后，用所述的红霉素浓度鉴定克隆。同样，将一些克隆转移至添加红霉素(75μg/ml)的琼脂平板上，利用上述盛行的条件生长24小时。由此成功地将pHBiHemAKK转化进入巨大芽孢杆菌。

用这些转化子接种添加5μg/ml红霉素和0.23％木糖的110毫升LB培养基，并在需氧条件下(于250转/份振荡)于30℃孵育。约12小时后，将温度提高至42℃，以便质粒不再进一步复制，并建立整合压力。另外的12小时后，将每种情况下的培养物转移至新鲜的LB培养基，总共3天，并继续在42℃孵育。在这一时间之后，观察到LB培养基的良好克隆，这表明质粒已整合入染色体，因为具有游离可复制质粒的转化子不可能在这些条件下通过复制传递质粒。

经遗传修饰的巨大芽孢杆菌DSMZ509的生长行为

在需氧条件下具有整合的pHBiHemA(KK]的巨大芽孢杆菌DSMZ509

为验证新菌株的生长能力，记录在添加5μg/ml红霉素和0.23％木糖的LB培养基中，在需氧条件下于42℃的生长曲线。当少量木糖存在于培养基中时，pHBiHemAKK整合转化体的良好需氧生长得到显示。

转换实验(shift experiment)中具有pHBasHemZ的巨大芽孢杆菌 DSMZ509

在称为“转换实验”的实验中，为取得高细胞密度，巨大芽孢杆菌最初在需氧条件下生长。此后，在指数期的末期，将培养物转移至厌氧条件下，因为细菌在厌氧条件下达到相当高的维生素B12含量(Barg，H.，2000，Vitamin B12-Produktion durch Bacillus megaterium [巨大芽孢杆菌生产的维生素B12]，毕业论文，Albert Ludwig University，Freiburg)。

当在以葡萄糖为碳源的Mopso基本培养基中生长时，对未转化的菌株巨大芽孢杆菌DSMZ509和转化体DSMZ509-pWH1520和DSMZ509-pHBasHemZ进行比较。再次，将30μg/ml四环素加入转化体培养物中。生长9小时后，用0.5％(w/v)木糖诱导，这意味着从需氧转移至厌氧条件之前的1小时。

因为在形成反义hemZ RNA的转化体和比较转化体的生长中未发现显著的差别，实施添加CoCl₂和ALA的生长比较。添加ALA也导致增加的代谢产物流向hem合成途径。因此，反义hemZ RNA的抑制揭示了关于比较转化体生长中的显著差别。在该转换实验中，转化体的培养物再次接受添加30μg/ml四环素和另外添加250μM CoCl₂和298μM ALA。生长10小时后，用0.5％(w/v)木糖诱导(对应于转移前1小时)。

图5显示，随着添加298μM ALA和250μM CoCl₂，巨大芽孢杆菌DSMZ509-pHBasHemZ(-！-)在其整个过程中的生长显著地弱于在比较转化体DSMZ509-pWH1520(-+-)的情况下。这表示通过反义RNA减少hem形成已发生。添加ALA(所有四吡咯的前体分子)显然刺激四吡咯合成，达到通过反义hemZ RNA抑制粪卟啉原-III氧化酶(HemZ)而影响生长的程度。

添加ALA和CoCl₂而获得的细胞密度低于在没有这些添加物的生长的情况。在为转化体的情况下，对反义转化体，细胞密度的OD₅₇₈达到3.9，并且对比较转化体(无添加物：8.7和8.8)达到5.2。未转化菌株DSMZ509(-▲-)在其整个进程中显示最好的生长，并且在转移的时间点具有最高的细胞密度，OD₅₇₈为7.8(无添加物：10.8)。

与未转化菌株比较，转化体生长的不足之处是由质粒的额外复制和向培养基中添加抗生素而导致的。

在需氧条件下添加钴和ALA的巨大芽孢杆菌DSMZ509-pHBasHemZ

在上述转换实验中，在需氧条件下，仅发生1小时的诱导后生长。因为主要在需氧条件下需要hem，在以葡萄糖为碳源，并添加250μM CoCl₂和298μM ALA的Mopso基本培养基中，在需氧条件下实施两种巨大芽孢杆菌转化体DSMZ509-pWH1520和DSMZ509-pHBasHemZ的生长比较。在OD₅₇₈为2时用0.5％木糖(w/v)实施诱导。

图6证实形成的反义hemZ RNA是抑制生长的。此外，DSMZ509-pHBasHemZ (-！-)在每一时间点的生长弱于比较转化体(-+-)。因此，形成反义hemZ RNA的转化体的最大OD₅₇₈达到8.3，而比较转化体的最大OD₅₇₈是10.0。这表示粪卟啉原-III氧化酶的抑制已发生。

定量的维生素B12分析

使用两种不同的方法用于维生素B12的定量测定。首先，测定基于鼠伤寒沙门氏菌metE cysG双突变体的生长，第二，使用来自r-biopharm的RIDASCREEN^FAST维生素B12 ELISA试验，并结合Packard的Fusion Plate Reader。

使用鼠伤寒沙门氏菌metE cysG双突变体测定维生素B12

在不同的生长期，从巨大芽孢杆菌培养物中取样。测定其OD₅₇₈后，通过离心(4000×g、15分钟、4℃)从培养基分离细胞。随后将获得的细胞沉淀和移出的培养基冷冻干燥。鼠伤寒沙门氏菌metE cysG双突变体在包含甲硫氨酸和半胱氨酸的基本培养基上于37℃过夜孵育，从平板上刮去，并使用40毫升等渗NaCl溶液洗涤。离心后，将细胞沉淀重悬于等渗盐水中。将洗涤的细菌培养物仔细地与温度为47-48℃的400毫升包含半胱氨酸的基本培养基琼脂混合。

将10μl已重悬于去离子无菌水，并在水浴中煮沸15分钟的巨大芽孢杆菌样品放置于冷平板上，并在37℃孵育18小时。已生长的沙门氏菌克隆的直径与使用的巨大芽孢杆菌样品的维生素B12含量成比例。与以添加0.01、0.1、1、10和40pmol维生素B12而建立的校准曲线比较，获得试验样品中关于维生素B12含量的结论。使用该标准方法，可迅速地和高重复性地检测生物材料中少量的维生素B12。

用ELISA试验测定维生素B12

试验原理

该试验是基于抗原/抗体反应，其中微孔滴定板的孔用针对维生素B12的特异性抗体包被。加入酶标记的维生素B12(酶交联物)和样品溶液、或维生素B12标准溶液后，游离的和酶标记的维生素B12竞争维生素B12的抗体结合位点(竞争性酶免疫试验)。

随后在洗涤步骤中除去未结合的酶标记维生素B12。通过加入底物/色原溶液(四甲基联苯胺/尿素过氧化物)而进行检测。结合的酶交联物将色原转变成蓝色的终产物。加入终止试剂导致颜色从蓝色变成黄色。利用光度计在450nm进行测量。因此，溶液的吸光度与样品中的维生素B12浓度成反比。

步骤：

在欲测量的巨大芽孢杆菌液体培养物的不同生长时间移去2毫升样品，并测定其OD₅₇₈。通过随后的离心(4000×g、5分钟、4℃)，从培养基中分离细胞，弃上清，并将沉淀冷冻干燥。然后，将试剂盒中所需要的试剂(标准品、酶交联物和浓缩的洗涤缓冲液)放置于室温，并按所附带的方法进行制备和稀释。在实施试验之前，立即制备样品。为此，将冷冻干燥的细胞重悬于0.5毫升无菌去离子水中。通过加入50μl溶菌酶溶液(1mg/ml)、接着孵育(30分钟、37℃、在300转/分振荡)、超声(5分钟)和煮沸(3分钟、100℃)，实现定量的细胞破裂。然后将样品冰冷至室温，并离心(4000×g、5分钟、15℃)。将上清移去，并用样品稀释缓冲液按1∶5稀释。然后，在每种情况下，将50μl稀释样品和稀释的维生素B12标准品移入微孔滴定板的孔中。加入50μl稀释的酶交联物后，将样品混合(融合设备中的振荡器功能)，并孵育(15分钟，室温)。孵育后，通过轻敲微孔滴定板使孔倒空，并每孔用250μl洗涤缓冲液洗涤。此外，通过轻敲使孔倒空，并重复洗涤步骤2次。然后每孔加入两滴终止试剂，混合，并在室温于暗处孵育10分钟。每孔加入两滴终止试剂后，在Packard的融合设备中测量450nm的吸光度。为了评价，按下述计算吸光度的百分比：

标准品或样品的吸光度/空白标准的吸光度×100＝吸光度％

然后，通过按吸光度％对log(ppb)作图而建立校准线。此后，通过线性方程、稀释系数和已知的细胞密度(OD₅₇₈)，可以μg/(1×OD)显示样品中维生素B12含量。

测定具有pHBiHemAKK的巨大芽孢杆菌DSMZ509的维生素B12含量的ELISA试验

为验证具有木糖诱导的hemA[KK]XCDBL操纵子的培养物的维生素B12含量，将整合型菌株和作为比较菌株的DSMZ509和DSMZ509-pWH1520-cobA在需氧下生长。生长10小时和诱导5小时后(t＝5)，根据建立的ELISA维生素B12试验消化样品，并测量维生素B12含量。由于它们与微黄色的DSMZ509比较培养物相比显红褐色，离心的细胞沉淀已经表明四吡咯含量增加。

如图7和8中所示，这通过ELISA试验得到证实。

所察觉的hemA[KK]XCDBL操纵子的过量表达导致维生素B12含量从0.07(野生型菌株(DSMZ509)的OD₅₇₈，g/l)增加至1.59(整合型菌株的OD₅₇₈，g/l)。这相当于增加倍数为22。如果以g/l计算其增加，结果不少于增加倍数为30(从在DSMZ509情况下的0.26g/l至具有整合pHBiHemAKK的DSMZ509的情况下的8.51μg/l)。

巨大芽孢杆菌DSMZ509-pHBasHemZ的ELISA维生素B12试验

在转移试验中，巨大芽孢杆菌转化体DSMZ509-pWH1520和DSMZ509-pHBasHemZ的样品在用木糖诱导后3小时(T＝3)和6小时(T＝6)取出。借助R-Biopharm的ELISA试验分析这些样品的维生素B12，其在材料和方法部分有详细的描述。

在转换实验中，从需氧至厌氧条件的转移发生在诱导后1小时。

图9和图10显示，利用葡萄糖生长(1、2、5、6)和利用葡萄糖并加入298μM ALA和250μM CoCl₂(3、4、7、8)生长所测定维生素B12的结果。

图9显示基于所讨论的培养物细胞密度的维生素B12的浓度。可以看出，在四种情况下有三种情况(2、6和8号)，DSMZ509-pHBasHemZ比比较转化体形成更多维生素B12(1、5和7号)。因此，在无添加物在时间T＝3(2号)的生长情况下，形成反义hemZ RNA的转化体的维生素B12含量高21％，在T＝6(6号)的情况下比比较转化体的情况下高16％。在利用钴和ALA生长的情况下，在诱导后6小时(8号)，DSMZ509-pHBasHemZ比DSMZ509-pWH1520多形成10％维生素B12。在图10中，在未加入钴和ALA的培养物和有添加物的培养物之间，维生素B12浓度的差别更为显著。其原因是无添加物的生长可取得更高的细胞密度。

巨大芽孢杆菌DSMZ509-pHBasHemZ的维生素B12的生物测定

为测定维生素B12含量，在转换实验中通过生物测定，在三个不同时间点取样。取样发生在1)诱导时的时间点(T＝0)，2)诱导后3小时(T＝3)和在诱导后6小时的稳定期(T＝稳定期)。此处，从需氧转移至厌氧条件发生在诱导后1小时。测量巨大芽孢杆菌菌株DSMZ509、DSMZ509-pWH1520和DSMZ509-pHBasHemZ的维生素B12含量。首先，对于利用葡萄糖的生长，其次对于利用葡萄糖和加入250μM CoCl₂和298μM ALA的生长。使用鼠伤寒沙门氏菌metE cysG双突变体AR3612实施测定。维生素B12含量以pmol/OD₅₇₈和μg/l显示(图11-12)。

图11显示，在利用葡萄糖生长的情况下，对于DSMZ509-pHBasHemZ(3、6和9号)，在任一时间点基于细胞密度的维生素B12含量是最高的。此外，这显示hem合成的抑制导致增加的代谢产物流向维生素B12的合成。

再一次地，以μg/升细菌培养物所示的图(图12)显示转录的反义hemZ RNA转化体(3、6和9号)已产生总体上最高量的维生素B12，虽然用这种转化体获得低的细胞密度。

图13显示，随着向培养基中加入CoCl₂和ALA，在短至诱导后3小时，转录的反义hemZ RNA转化体取得最高的维生素B12含量(6号)。在最初尝试解释这种现象中，似乎诱导没有立即导致最大的质粒复制，而是需要启动期。考虑到每升细菌培养物的维生素B12含量，可以看到，由于其较好的生长，未转化菌株DSMZ509比其它两种转化菌株产生更多维生素B12(图14)。

Claims

1.经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株，其包含编码反馈抗性谷氨酰-tRNA还原酶的如SEQ ID No.4所示的基因hemA[KK]和/或包含作为反义RNA(ashemZ)的如SEQ ID No.1(hemZ)所示hemZ基因的部分核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株，其包含组织在hemA[KK]XCDBL操纵子中的如SEQ ID No.4所示的基因hemA[KK]和/或包含如SEQ ID No.3所示的反义RNA(ashemZ)。

3.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株，其中hemA[KK]基因整合入该细菌的染色体中。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株，其中部分hemZ基因以质粒编码的拷贝数增加的反义RNA(ashemZ)存在。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株，其中组织在hemA[KK]XCDBL操纵子中的hemA[KK]基因和/或作为反义RNA(ashemZ)的部分hemZ基因在诱导型启动子的控制之下。

6.根据权利要求5所述的经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株，其包含作为诱导型启动子的xylA启动子。

7.整合型载体，其包含编码反馈抗性谷氨酰-tRNA还原酶的如SEQ IDNo.4所示的基因hemA[KK]以及与其有效连接的用于诱导基因表达、筛选、复制和/或整合入宿主细胞染色体的序列。

8.根据权利要求7所述的整合型载体，其包含hemA基因的经遗传修饰的核苷酸序列(hemA[KK])，所述核苷酸序列编码氨基酸序列包含至少两个带正电荷氨基酸插入的反馈抗性谷氨酰-tRNA合酶。

9.根据权利要求8所述的整合型载体，其包含hemA基因的经遗传修饰的核苷酸序列(hemA[KK])，所述核苷酸序列编码氨基酸序列在其N末端的位置3和4包含两个带正电荷氨基酸插入的反馈抗性谷氨酰-tRNA合酶。

10.根据权利要求8所述的整合型载体，其中插入的带正电荷氨基酸是赖氨酸。

11.根据权利要求7-10中任意一项所述的整合型载体，其中基因表达在xylA启动子的控制之下。

12.根据权利要求7-11中任意一项所述的整合型载体，其包含至少一个温度敏感的复制起点。

13.根据权利要求7-12中任意一项所述的整合型载体，其包含温度敏感的复制起点pE194ts。

14.如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其编码粪卟啉原III氧化酶。

15.根据权利要求14所述的核苷酸序列，其包含位于编码粪卟啉原III氧化酶的hemZ基因区域上游和/或下游的具有调控功能的序列。

16.根据权利要求14或15所述的核苷酸序列，其来源于巨大芽孢杆菌。

17.具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的粪卟啉原III氧化酶。

18.根据权利要求17所述的粪卟啉原III氧化酶，其由权利要求14-16中任意一项所述的核苷酸序列编码。

19.载体，其包含作为反义RNA(ashemZ)的如SEQ ID No.1(hemZ)所示hemZ基因的部分核苷酸序列以及与其有效连接的用于诱导基因表达、筛选、复制和/或整合入宿主细胞染色体的序列。

20.根据权利要求19的载体，其包含如SEQ ID No.3所示的反义RNA(ashemZ)以及与其有效连接的用于诱导基因表达、筛选、复制和/或整合入宿主细胞染色体的序列。

21.根据权利要求19或20的载体，其中基因表达在xylA启动子的控制之下。

22.根据权利要求19-21中任意一项所述的载体，其包含至少一个温度敏感的复制起点。

23.根据权利要求19-22中任意一项所述的载体，其包含温度敏感的复制起点pE194ts。

24.通过包含根据权利要求1-6中任意一项所述的经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株的培养物而产生维生素B12的方法，其中发酵在需氧条件下实施。

25.根据权利要求24的方法，其中hemA[KK]XCDBL操纵子的基因表达和/或编码hemZ基因的反义RNA(ashemZ)的核苷酸序列的表达通过向发酵培养基中加入木糖而诱导。

26.根据权利要求25所述的方法，其中如SEQ ID No.4所示的hemA[KK]XCDBL操纵子的表达和/或编码如SEQ ID No.3所示的hemZ基因反义RNA(ashemZ)的核苷酸序列的表达是通过向发酵培养基中加入木糖而诱导的。

27.根据权利要求24-26中任意一项所述的方法，其中在需氧发酵细胞的指数生长期，实施从需氧向厌氧发酵条件的转换。

28.根据权利要求24-27中任意一项所述的方法，其中向培养基中至少加入钴和/或5-氨基乙酰丙酸。

29.根据权利要求14-16中任意一项所述核苷酸序列的用途，用于制备如SEQ ID No.3所示的反义RNA(ashemZ)。

30.如SEQ ID No.3所示的反义RNA(ashemZ)的用途，用于制备根据权利要求19-23中任意一项所述的载体。

31.根据权利要求19-23中任意一项所述的载体的用途，用于制备根据权利要求1-6中任意一项所述的经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株。

32.根据权利要求7-13中任意一项所述的整合型载体的用途，用于制备根据权利要求1-6中任意一项所述的经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株。

33.根据权利要求1-6中任意一项所述的经遗传修饰的巨大芽孢杆菌菌株的用途，用于产生维生素B12。