DE10300719A1 - Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 mittels einer Kultur, enthaltend einen genetisch veränderten Bacillus megaterium Stamm, einen genetisch veränderten Bacillus megaterium Stamm, sowie Vektoren zu dessen Herstellung.

Description

  • Die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 unter Einsatz eines genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes sowie Vektoren zur Herstellung genetisch veränderter Bakterien der Gattung Bacillus.
  • Bereits in den zwanziger Jahren unseres Jahrhunderts wurde Vitamin B12 indirekt durch seine Wirkung auf den menschlichen Körper durch George Minot und William Murphy entdeckt (Stryer, L., 1988, In Biochemie, vierte Auflage, pp. 528-531, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin, New York). Im Jahre 1948 konnte Vitamin B12 erstmals gereinigt und isoliert werden, so daß bereits acht Jahre später, im Jahre 1956, die Aufklärung seiner komplexen dreidimensionalen Kristallstruktur durch Dorothy Hodgkin gelang (Hodgkin, D. C. et al., 1956, Structure of Vitamin B12. Nature 176, 325-328 und Nature 178, 64-70). Die in der Natur vorkommenden Endprodukte der Vitamin B12-Biosynthese sind 5'-Desoxyadenosylcobalamin (Coenzym B12) und Methylcobalamin (MeCbI), während Vitamin B12 per Definition für Cyanocobalamin (CNCbl) steht, das die hauptsächlich von der Industrie hergestellte und gehandelte Form darstellt. In der vorliegenden Erfindung steht, wenn nicht speziell angegeben, Vitamin B12 einheitlich für die Bezeichnung aller drei analogen Moleküle.
  • Die Spezies B. megaterium wurde bereits vor über 100 Jahren (1884) das erste mal durch De Bary beschrieben. Obwohl generell als ein Bodenbakterium klassifiziert, läßt sich B. megaterium auch in diversen anderen Habitaten wie Seewasser, Sedimenten, Reis, getrocknetem Fleisch, Milch oder Bienenhonig nachweisen. Er tritt dabei oft in Begleitung von Pseudomonaden und Actinomyceten auf. B. megaterium ist, wie sein naher Verwandter Bacillus subtilis, ein Gram-postives Bakterium und zeichnet sich unter anderem aus durch seine relativ ausgeprägte, namengebende Größe von 2 × 5 μm, einem G + C-Gehalt von ca. 38 % und einer sehr ausgeprägten Fähigkeit zur Sporulation. Bereits geringste Mengen an Mangan im Wachstumsmedium genügen dieser Spezies, um eine vollständige Sporulation durchzuführen, eine Fähigkeit die nur noch vergleichbar ist mit der Sporulationseffizienz einiger thermophiler Bacillen. Aufgrund seiner Größe und seiner sehr effizienten Sporulation und Germination wurden vielfältige Untersuchungen der molekularen Grundtagen dieser Vorgänge an B. megaterium durchgeführt, so daß mittlerweile mehr als 150 Gene in B. megaterium beschrieben sind, die an seiner Sporulation und Germination beteiligt sind. Physiologische Untersuchungen an B. megaterium (Priest, F. G. et al., 1988, A Numerical Classification of the Genus Bacillus, J. Gen. Microbiol. 134, 1847-1882) klassifizierten diese Spezies als obligat aerobes, Sporen-bildendes Bakterium, das Urease-positiv und Voges-Proskauer-negativ ist und kein Nitrat reduzieren kann. Eine der herausragendsten Eigenschaften von B. megaterium ist seine Fähigkeit, eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen für sich zu nutzen. So verwertet er eine sehr große Zahl von Zuckern und wurde z.B. in Korn-Sirup, Abfällen aus der Fleischindustrie und sogar in petrochemischen Abfällen gefunden. In Hinsicht auf diese Fähigkeit zur Metabolisierung eines äußerst breiten Spektrums von Kohlenstoffquellen, kann B. megaterium ohne Einschränkung mit den Pseudomonaden gleichgesetzt werden (Vary, P. S., 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium).
  • Die Vorteile der breiten Anwendung von B. megaterium bei der industriellen Produktion verschiedenster Enzyme, Vitamine etc. sind vielfältig. Ein Vorteil ist sicherlich in einer relativ gut entwickelten Genetik zu sehen, die innerhalb des Bacillus-Genus nur von B. subtilis übertroffen wird. Zweitens weist B. megaterium keine alkalischen Proteasen auf, so daß bei der Produktion heterologer Proteine kaum eine Degradation beobachtet wurde. Zudem ist bekannt, daß B. megaterium Produkte von kommerziellem Interesse effekiv sezerniert, wie dies z. B. bei der Produktion von α- und β-Amylase ausgenutzt wird. Außerdem ist es mit B. megaterium durch seine Größe möglich, eine hohe Biomasse anzusammeln, bis eine zu hohe Populationsdichte zum Absterben führt. Von größter Bedeutung bei der industriellen Produktion mittels B. megaterium erweist sich weiterhin der günstige Umstand, daß diese Spezies in der Lage ist, aus Abfällen und minderwertigen Stoffen Produkte hohen Wertes und höchster Qualität herzustellen. Diese Möglichkeit der Metabolisierung eines enorm breiten Substratspektrums spiegelt sich auch wieder in der Anwendung von B. megaterium als Bodendetoxifizierer, der selbst Cyanide, Herbizide und persistente Pestizide abzubauen vermag. Schließlich ist die Tatsache, daß B. megaterium vollkommen apathogen ist und auch keine Toxine produziert, insbesondere in der Lebensmittel- und Kosmetikproduktion von größter Wichtigkeit. Wegen dieser mannigfaltigen Vorzüge wird B. megaterium bereits heute in einer Vielzahl von industriellen Anwendungen eingesetzt, wie der Produktion von α- und β-Amylase, Penicillin-Amidase, dem Aufbereiten toxischer Abfälle oder der aeroben Vitamin B12-Produktion (zusammengefaßt in Vary, P. S., 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium).
  • Aufgrund seiner vielfältigen Vorteile zum Einsatz in der biotechnologischen Herstellung verschiedener, industriell interessanter Produkte ist der Einsatz von Bacillus megaterium wirtschaftlich sehr interessant. Zur Steigerung der Produktivität wirtschaftlich interessanter Produkte erfolgt zunehmend der Einsatz genetisch optimierter Bakterienstämme. Allerdings treten mit genetisch veränderten Bakterienstämmen regelmäßig Probleme hinsichtlich der Stabilität der in ihnen enthaltenen frei replizierbaren Plasmide auf. Ferner ist eine weitere Verbesserung des Stoffwechselflusses in Richtung Vitamin B12 sowie die gezielte Steuerung der Expression chromosomal kodierter Gene im Verlauf der Bakterien-Fermentation zur optimalen Steuerung der Produktausbeute wünschenswert.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, genetisch veränderte Bacillus megaterium Stämme zur Verfügung zu stellen, mit denen die Herstellung von Vitamin B12 weiter verbessert werden kann.
  • Dies erfordert ferner die Bereitstellung geeigneter Vektoren, die eine Überexpression der Enzyme zur Bildung von Uroporphyinogen-III aus Glutamyl-tRNA sowie in vorteilhafter Weise eine Repression des Häm-Biosyntheseweges verbunden mit einem gesteigerten Stoffwechselfluß in Richtung Vitamin B12 ermöglichen. Gleichzeitig sollten die erfindungsgemäßen Vektoren es ermöglichen, die gewünschten genetischen Veränderungen stabil in das Chromosom des Bakterienstammes zu integrieren. Ferner sollte eine Induktion der Genexpression des chromosomal kodierte hemAXCDBL-Operons und/oder die Repression des Häm-Biosyntheseweges im Verlauf der Fermentation gezielt steuerbar sein.
  • Die Aufgabe wird gelöst, durch die Bereitstellung eines genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes enthaltend ein Gen hemA[KK] gemäß SEQ ID No. 4 kodierend für eine feedback-resistente Glutamyl-tRNA-Reduktase und/oder einen Teil der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 (hemZ) als antisense-RNA (ashemZ).
  • In einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist ein genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm umfaßt, der ein Gen hemA[KK) gemäß SEQ ID No. 4 kodierend für eine feedback-resistente Glutamyl-tRNA-Synthase, organisiert in einem hemA[KK]XCDBL-Operon und/oder eine antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 enthält.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 kodierend für eine Coproporphyrinogen-III-Oxidase.
  • Diese erfindungsgemäße Nukleotidsequenz zeichnet sich ferner dadurch aus, daß sie zu dem für eine Coproporphyrinogen-III-Oxidase kodierenden Bereich des hemZ-Gens vorgeschaltete (5'- oder upstream) und/oder nachgeschaltete (3'- oder downstream) Sequenzen mit regulatorischer Funktion enthält.
  • Unter Sequenzen mit regulatorischer Funktion sind im Sinne der Erfindung solche Sequenzen zu verstehen, welche die Transkription, die RNA-Stabilität oder das RNA processing sowie die Translation beeinflussen können. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Terminatoren oder Translationsverstärker. Diese Aufzählung ist jedoch nicht limitierend für die vorliegende Erfindung.
  • Bevorzugt stammt die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 aus Bacillus megaterium. Die vorliegende Erfindung betrifft dabei auch sogenannte isolierte Nukleinsäuren. Unter einer isolierten Nukleinsäure oder einem isolierten Nukleinsäurefragment ist erfindungsgemäß ein Polymer aus RNA oder DNA zu verstehen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und optional natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder artifizielle Nukleotide enthalten kann. Der Begriff DNA-Polymer schließt hierbei auch genomische DNA, cDNA oder Mischungen davon ein.
  • Ferner ist eine Coproporphyrinogen-III-Oxidase gemäß SEQ ID No. 2 Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Bevorzugt wird die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 kodiert. Es sind jedoch auch Allele der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 kodierend für eine Coproporphyrinogen-III-Oxidase in der vorliegenden Erfindung umfaßt.
  • Unter Allelen sind erfindungsgemäß funktionell äquivalente, d. h. im wesentlichen gleichwirkende Nukleotidsequenzen zu verstehen. Funktionell äquivalente Sequenzen sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz, beispielsweise durch die Degeneriertheit des genetischen Codes noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene und gegebenenfalls an den Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus angepaßte Nukleotid-Sequenzen. Darüber hinaus umfassen funktionell äquivalente Sequenzen solche, die eine veränderte Nukleotidsequenz aufweisen, welche dem Enzym beispielsweise eine Desensitivität oder Resistenz gegenüber Inhibitoren verleiht.
  • Grundsätzlich können für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, d.h. für die Herstellung der genetisch veränderten Bacillus megaterium Stämme alle üblichen B. megaterium-Stämme eingesetzt werden, die als Vitamin B12-Produktionsstämme geeignet sind.
  • Unter Vitamin B12-Produktionsstämmen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung Bacillus megaterium-Stämme oder homologe Mikroorganismen zu verstehen, die durch klassische und/oder molekulargenetische Methoden derart verändert sind, daß ihr Stoffwechselfluß verstärkt in die Richtung der Biosynthese von Vitamin B12 oder dessen Abkömmlingen verläuft (metabolic engineering). Beispielsweise sind bei diesen Produktionsstämmen ein oder mehrere Gene) und/oder die korrespondierenden Enzyme, die an entscheidenden und entsprechend komplex regulierten Schlüsselpositionen des Stoffwechselweges (Flaschenhals) stehen in ihrer Regulation verändert oder sogar dereguliert. Die vorliegende Erfindung umfaßt hierbei sämtliche bereits bekannte Vitamin B12-Produktionsstämme der Gattung Bacillus oder homologer Organismen. Zu den erfindungsgemäß vorteilhaften Stämmen gehören insbesondere die Stämme von B. megaterium DSMZ32, DSMZ 509 und DSMZ 2894.
  • Erfindungsgemäß genetisch veränderte Bakterienstämme können prinzipiell durch klassische Mutagenese und bevorzugt durch gezielte molekularbiologische Techniken und entsprechende Selektionsverfahren hergestellt werden. Interessante Ansatzpunkte zur gezielten gentechnischen Manipulation sind u.a. Verzweigungsstellen der zum Vitamin B12 führenden Biosynthesewege, durch die der Stoffwechselfluß gezielt in Richtung einer maximalen Vitamin B12-Produktion gesteuert werden kann. Gezielte Modifikationen von an der Regulation des Stoffwechesflusses beteiligten Genen schließt auch Untersuchungen und Veränderungen der regulatorischen Bereiche vor und hinter den Strukturgenen ein, wie z.B. die Optimierung und/oder den Austausch von Promotoren, Enhancern, Terminatoren, Ribosomenbindungsstellen etc.. Auch die Verbesserung der Stabilität der DNA, mRNA oder der durch sie kodierten Proteine, beispielsweise durch die Verringerung oder Verhinderung des Abbaus durch Nukleasen bzw. Proteasen ist erfindungsgemäß umfaßt.
  • In einer Variante der vorliegenden Erfindung ist in dem genetisch veränderten Bacillus megaterium Stamm das hemA[KK]-Gen gemäß SEQ ID No. 4 in das Bakterien-Chromosom integriert.
  • Eine weitere Variante eines genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes zeichnet sich dadurch aus, daß in diesem Bakterium ein Teil des hemZ-Gens als antisense-RNA (ashemZ) plasmidkodiert, in erhöhter Kopienzahl vorliegt.
  • Unter einem Teil des hemZ-Gens ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, daß ausgehend von der Nukleotidsequenz des hemZ-Gens gemäß SEQ ID No. 1, die Herstellung verschiedener antisense-RNAs möglich. Vorgehensweisen zur Herstellung von antisense-RNA, z.B. über PCR, sind dem Fachmann bekannt und gehören zur gängigen Laborpraxis. Die Unterschiede können sich beispielsweise durch die Länge der erstellten antisense-RNAs ergeben oder durch die Auswahl der Bereiche der hemZ-Nukleotidsequenz von der die antisense-RNAs) abgeleitet wird (werden). Die antisense-mRNA-Sequenzen können dabei hinsichtlich ihrer Länge beispielsweise zwischen wenigen Nukleotiden und dem gesamten Sequenzabschnitt des Kodierbereichs variieren. Bevorzugt ist erfindungsgemäß eine antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3.
  • Die erhöhte Kopienzahl kann durch eine verstärkte Replikation eines entsprechenden Vektors, resultierend in einer erhöhter Kopienzahl, bedingt sein.
  • Prinzipiell kann eine erhöhte Kopienzahl auch durch eine mehrfache Integration eines Gens oder Teile davon in das Bakterienchromosom erreicht werden. Erfindungsgemäß umfaßt ist auch ein genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm, bei dem das hemA[KK]-Gen in das Bakterien-Chromosom integriert ist und ein Teil des hemZ-Gens als antisense-RNA (ashemZ) in erhöhter Kopienzahl vorliegt.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls ein genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm, bei dem das hemA[KK]-Gen, organisiert in dem hemA[KK]XCDBL-Operon, und/oder der Teil des hemZ-Gens als antisense-RNA (ashemZ) unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht. Beispiele für induzierbare Promotoren sind der Xylose-induzierbare XylA-Promotor oder der ein Beta-Galaktosidase-induzierbarer Promotor (Miller, J.H., 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) Erfindunsgemäß bevorzugt handelt es sich bei dem Xylose-induzierbaren Promotor um den xylA-Promotor des Xylose-Operons aus pWH1520 (Rygus, T. et al., 1991, Appl. Microbiol. Biotechnol., 35: 594-599). Durch die Zugabe von Xylose zum Kulturmedium kann die Initiation der Transkription der unter der Kontrolle des xylA-Promotors liegenden Gene, also hier die Genexpression von hemA[KK]XCDBL und/oder ashemZ, gesteigert werden.
  • Zur Herstellung der zuvor beschriebenen genetisch veränderten Bacillus megaterium Stämme werden erfindungsgemäß geeignete Vektoren konstruiert, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind.
  • So umfaßt die vorliegende Erfindung einen integrativen Vektor enthaltend ein Gen hemA[KK] kodierend für eine feedback-resistente Glutamyl-tRNA-Reduktase gemäß SEQ ID No. 4 sowie operativ damit verknüpfte Sequenzen zur induzierten Genexpression, Selektion, Replikation und/oder Integration in das Chromosom der Wirtszelle.
  • Unter einem integrativen Vektor ist ein Vektor zu verstehen, der durch ortsspezifische Rekombination an einer definierten Stelle in das Wirtszellchromosom integriert wird und dort zusammen mit dem Chromosom repliziert. In einer erfindungsgemäßen Variante erfolgt diese ortsspezifische Rekombination über die homologen Sequenzen des hemA-Gens.
  • Unter homologen Sequenzen sind erfindungsgemäß solche zu verstehen, die zu den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen komplementär sind und/oder mit diesen hybridisieren. Der Begriff hybridisierende Sequenzen schließt erfindungsgemäß substanziell ähnliche Nukleotidsequenzen aus der Gruppe von DNA oder RNA ein, die unter an sich bekannten stringenten Bedingungen eine spezifische Wechselwirkung (Bindung) mit den zuvor genannten Nukleotidsequenzen eingehen.
  • Solche homologen Sequenzen lassen sich ausgehend von der in SEQ ID NO: 4 beschriebenen DNA-Sequenz oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Organismen isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide, beispielsweise der konservierten Bereiche, die über Vergleiche mit anderen hemA-Genen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure: Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
  • Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42°C und 58°C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50 % Formamid ( beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50 % Formamid) zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100. Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
  • Weiterhin sind unter homologen Sequenzen der in SEQ ID NO: 4 genannten Sequenz beispielsweise Varianten zu verstehen, die mindestens 95 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 96 % Homologie, besonders bevorzugt mindestens 97 oder 98 % Homologie, ganz besonders bevorzugt mindestens 99 oder 99,9 % Homologie aufweisen. Die Homologie wurde über den gesamten Aminosäurebereich berechnet. Es wurde das Programm PileUp verwendet (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153). Unter Homologie ist für die vorliegende Erfindung Identität zu verstehen. Beide Begriffe sind synonym.
  • Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente derart, daß jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Diese regulatorischen Nukleotidsequenzen können natürlichen Ursprungs sein oder durch chemische Synthese erhalten werden.
  • Als Promotor ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Genexpression in dem entsprechenden Wirtsorganismus steuern kann. Erfindungsgemäß bevorzugt sind chemisch induzierbare Promotoren, durch die die Expression der ihnen unterliegenden Gene in der Wirtszelle zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden können. Beispielhaft sei hier das β-Galakosidase-, Arabinose- oder Xyloseinduzierbare-System genannt. Erfindungsgemäß bevorzugt wird das Xyloseinduzierbare-System und hierbei der xylA-Promotor aus pWH1520 (Rygus, T. et al., 1991, Appl. Microbiol. Biotechnol., 35: 594-599).
  • Erfindungsgemäß umfaßt ist somit auch ein integrativer Vektor der zuvor beschriebenen Art, bei dem die Genexpression unter der Kontrolle des xylA-Promotors steht.
  • Beispiele für Sequenzen zur Selektion, Replikation und/oder Integration in das Chromosom der Wirtszelle sind in der Literatur zahlreich beschrieben. So sind verschiedene Selektionsmarker bekannt, wie z.B. Gene, die eine Resistenz gegenüber Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin oder Erythromycin vermitteln. Diese Aufzählung ist jedoch nicht abschließend oder limitierend für die vorliegenden Erfindung. Erfindungsgemäß vorteilhafte Sequenzen zur Selektion sind das Ampicillinresistenzgen zur Selektion des Vektors in E. coli oder das Erythromycinresistenzgen zur Selektion in B. megaterium.
  • Vorteilhafte Varianten eines Replikationsursprungs in E. coli sind pBR322 (Sutcliffe, J.G., 1979, Cold Spring Habor Symp. Quant. Biol., 43, Pt 1: 77-90 bzw. in B. megaterium pE194ts oder repF. Der temperatursensitive Origin pE194ts für B. megaterium läßt eine Replikation nur unterhalb von 40°C zu, wodurch oberhalb dieser „permissiven" Temperatur ein Selektionsdruck für eine Integration in das Chromosom aufgebaut werden kann (Rygus et al., 1992). Das repF Genprodukt wird beschrieben als ein in-trans-agierendes Element, das für die Replikation des Plasmids in Gram-positiven Bakterien erforderlich ist (Villafane et al., 1987).
  • Eine weitere Variante eines erfindungsgemäßen integrativen Vektors zeichnet sich dadurch aus, daß er wenigstens einen temperatursensitiven Replikationsursprung aufweist. Bevorzugt ist ein integrativer Vektor der den temperatursensitiven Replikationsursprung pE194ts aufweist.
  • Eine weitere Variante der vorliegenden Erfindung umfaßt einen integrativen Vektor der sich dadurch auszeichnet, daß er eine genetisch veränderte Nukleotidsequenz des hemA-Gens (hemA[KK]) enthält, die für eine feedback-resistente Glutamyl-tRNA- Synthase kodiert, deren Aminosäuresequenz eine Insertion von wenigstens zwei positiv geladenen Aminosäuren aufweist. Bevorzugt kodiert die in dem integrativen Vektor enthaltene genetische veränderte Nukleotidsequenz für eine feed-backresistente Glutamyl-tRNA, die 2 bis 6, bevorzugt 2 bis 4 und besonders bevorzugt zwei zusätzliche Aminosäuren aufweist. Diese zusätzlichen Aminosäuren können auf der Ebene der sie kodierenden Nukleotidsequenz durch die Insertion von zwei oder entsprechend bis zu 6 Triplets nach dem Fachmann bekannten Vorgehensweisen, z.B. über PCR, in die kodierende Nukleotidsequenz eingeführt werden.
  • Eine bevorzugte Variante des integrativen Vektors enthält eine genetisch veränderte Nukleotidsequenz des hemA-Gens (hemA[KK]), die für eine feedback-resistente Glutamyl-tRNA-Synthase kodiert, deren Aminosäuresequenz an Position 3 und 4 des N-Terminus eine Insertion von zwei positiv geladenen Aminosäuren aufweist. Bevorzugt handelt es sich bei den positiv geladenen Aminosäuren um Lysinreste.
  • Unter einer feedback-resistenten Form eines Enzyms ist ein Protein zu verstehen, das durch das Endprodukt des Stoffwechselweges (oder eines Stoffwechselzweiges) in seiner Aktivität nicht mehr gehemmt wird. Erfindungsgemäß ist auch das Enzym einer feedback-resistenten Glutamyl-tRNA-Reduktase mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 5 kodiert durch das hemA[KK]-Gen aus B. megaterium umfaßt.
  • Die genetisch veränderte Nukleotidsequenz des hemA-Gens (hemA[KK]) umfaßt dabei natürlich vorkommende Varianten der hier beschriebenen hemA-Sequenz sowie eine künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene, und gegebenenfalls an den Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus angepaßte Nukleotid-Sequenz. Genetische Veränderungen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Inbegriffen sind hier auch sogenannte Sinnmutationen (sense mutations), die auf Proteinebene beispielsweise zum Austausch konservierter Aminosäuren führen können, welche aber zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen und somit funktionsneutral sind. Dabei können beispielsweise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Basizität, Hydrophobizität etc.) ersetzt werden. Beispielsweise werden Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucinreste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht. Dies beinhaltet auch Veränderungen der Nukleotidsequenz, die auf Proteinebene den N- oder C-Terminus eines Proteins betreffen, ohne jedoch die katalytische Funktion des Proteins, wohl aber die Regulation der Aktivität, wesentlich zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können sogar stabilisierenden Einfluß auf die Proteinstruktur ausüben.
  • Bevorzugt werden 6 Nukleotide, die in Anlehnung an den Kodongebrauch von B. megaterium für Lysin kodieren, in die kodierende Nukleotidsequenz eingefügt.
  • Diese Veränderungen können nach an sich bekannten Methoden vorgenommen werden.
  • Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung einen Vektor enthaltend einen Teil der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 (hemZ) als antisense-RNA (ashemZ) sowie operativ damit verknüpft Sequenzen zur induzierten Genexpression, Selektion, Replikation und/oder Integration in das Chromosom der Wirtszelle.
  • Eine bevorzugte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Vektors enthält eine antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 sowie operativ damit verknüpft Sequenzen zur induzierten Genexpression, Selektion, Replikation und/oder Integration in das Chromosom der Wirtszelle.
  • Bevorzugt ist eine verstärkte Replikation des Vektors resultierend in einer erhöhten Kopienzahl eines Teils des hemZ-Gens als antisense-RNA (ashemZ), bevorzugt einer antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3.
  • Zur Erzielung einer erhöhten Genexpression (Überexpression) kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden. Ferner kann die Promotor- und/oder Regulationsregion und/oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, entsprechend so verändert werden, daß die Expression mit erhöhter Rate erfolgt. In gleicher Weise können Expressionskassetten wirken, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der Vitamin B12-Produktion zu steigern.
  • Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein.
  • Weiterhin kann auch die Aktivität des Enzyms selbst erhöht sein, beispielsweise durch eine erhöhte katalytische Aktivität oder eine deregulierte oder feedbackdesensitive (feedback-resistente) Aktivität gegenüber Inhibitoren oder durch die Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins verstärkt werden. Alternativ kann ferner eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. In der Wirtszelle enthaltend einen Teil des hemZ-Gens als antisense-RNA (ashemZ) lagert sich die gebildete (exprimierte) antisense-RNA an den entsprechenden (komplemantären) Bereich des für die Coproporphyrinogen-III-Oxidase kodierenden mRNA an.
  • Vorzugsweise blockiert sie dadurch die Ribosomenbindungsstelle des hemZ-Gens und hemmt auf diese Weise die Translation und Expression des an der Häm-Biosynthese beteiligten Schlüsselenzyms. Dies wiederum hat eine reduzierte Häm-Biosynthese zur Folge, mit dem Vorteil eines gesteigerten Flusses an Stoffwechselmetaboliten in Richtung der Vitamin-B12-Produktion.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Vektor enthaltend einen Teil der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 (hemZ) als antisense-RNA (ashemZ), bevorzugt einer antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3, bei dem die Genexpression unter der Kontrolle des xylA-Promotors steht.
  • Ferner kann auch dieser Vektor prinzipiell in das Chromosom des Wirtszelle integrieren, beispielsweise wenn er mit einem temperatursensitiven Replikationsursprung ausgestattet ist. Eine Variante dieses Vektors weist wenigstens einen temperatursensitiven Replikationsursprung auf. Bevorzugt weist eine solche Vektorvariante den temperatursensitiven Replikationsursprung pE194ts auf.
  • Die Herstellung der erfindungsgemäßen Vektoren erfolgt durch Fusion der zuvor erwähnten Komponenten, wie Promotor, kodierende Genabschnitte, Replikationsursprung, Gene zur Selektion etc. nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in Sambrook, J. et al., 1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York beschrieben sind.
  • Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung des integrativen Vektors enthaltend das hemA[KK]-Gen der zuvor beschriebenen Art zur Herstellung eines erfindungsgemäß genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes.
  • Ebenso umfaßt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 zur Herstellung einer antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3. Außerdem ist die Verwendung einer antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 zur Herstellung eines Vektors der zuvor genannten Art enthaltend einen Teil des hemZ-Gens gemäß SEQ ID No. 1 als antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 in der vorliegenden Erfindung umfaßt. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung eines Vektors enthaltend ein Teil des hemZ-Gens gemäß SEQ ID No. 1 als antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 zur Herstellung eines genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes der erfindungsgemäßen Art. Erfindungsgemäß kann auch der integrative Vektor enthaltend das hemA[KK]-Gen und der Vektor enthaltend eine antisense-RNA (ashemZ) in einen geeigneten Bacillus megaterium Stamm übertragen werden und der resultierende genetisch veränderte Stamm zur Herstellung von Vitamin B12 eingesetzt werden.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch die Verwendung eines genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes der beschriebenen Art zur Herstellung von Vitamin B12.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 mittels einer Kultur enthaltend einen genetisch veränderten Bacillus megaterium Stamm der beschriebenen Art, wobei die Fermentation unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird.
  • In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in der exponentiellen Wachstumsphase der aerob fermentierten Zellen ein Übergang von aeroben zu anaeroben Fermentationsbedingungen. Durch diesen sogenannten Shift bzw. ein zweistufiges Fermentationsverfahren kann die Vitamin B12 Produktion noch weiter gesteigert werden.
  • Erfindungsgemäß vorteilhaft ist hierbei ein Verfahren, bei dem der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentierung erfolgt, sobald die aerobe Kultur ihre maximale optische Dichte, wenigstens jedoch eine optische Dichte von etwa 2 bis 3 erreicht hat. Die Bestimmung der optischen Dichte erfolgt in der Regel bei 570-600 nm.
  • Unter anaeroben Bedingungen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung diejenigen Bedingungen zu verstehen, die eintreten, wenn die Bakterien nach aerober Anzucht in Anaerobierflaschen überführt und dort fermentiert werden. Der Zeitpunkt der Überführung in die Anaerobierflaschen erfolgt insbesondere bei dem zweistufigen Verfahren, sobald sich die aerob angezüchteten Bakterienzellen in der exponentiellen Wachstumsphase befinden. D.h. nach der Überführung in die Anaerobierflaschen verbrauchen die Bakterien den dort vorliegenden Sauerstoff und es wird kein Sauerstoff mehr zugeführt. Diese Bedingungen können auch mit semianaerob bezeichnet werden. Die entsprechenden Vorgehensweisen sind gängige Laborpraxis und dem Fachmann bekannt.
  • Vergleichbare Bedingungen herrschen auch vor, wenn die Bakterien in einem Fermenter zunächst aerob kultiviert werden und dann die Sauerstoffzufuhr sukzessive reduziert wird, so daß sich mit der Zeit semi-anaerobe Bedingungen einstellen. Alternativ kann der Sauerstoff auch aktiv über eine Begasung mit Inertgas, wie Stickstoff, ausgetrieben werden.
  • In einer besonderen Variante der vorliegenden Erfindung können auch beispielsweise durch die Zugabe von Reduktionsmitteln zum Kulturmedium strikt anaerobe Bedingungen geschaffen werden.
  • Generell ist für eine erfindungsgemäße Fermentation unter anaeroben Bedingungen (ob nun semi-anaerob oder strikt anaerob), eine aerobe Anzucht (Vorkultur) der Bakterien nicht zwingend erforderlich. D.h. die Bakterien können auch unter anaeroben Bedingungen angezüchtet werden und anschließend unter semi-anaeroben oder strikt anaeroben Bedingungen weiter fermentiert werden. Denkbar ist auch, daß das Inoculum direkt aus der Stammhaltung entnommen und zur Herstellung von Vitamin B12 unter anaeroben Bedingungen eingesetzt wird.
  • Die Fermentation des erfindungsgemäß genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes kann in einem batch-Ansatz erfolgen. Varianten, bei denen die Fermentation in einem fed-batch-Ansatz oder in kontinuierlicher Kultur erfolgt, sind ebenfalls erfindungsgemäß umfaßt.
  • Erfindungsgemäß vorteilhaft ist ein Verfahren, bei dem die Expression des hemA[KK]XCDBL-Operons und/oder die Expression der für eine antisense-RNA des hemZ-Gens kodierenden Nukleotidsequenz (ashemZ) durch Zugabe von Xylose zum Fermentationsmedium induziert wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Variante des genannten Verfahrens zur Herstellung von Vitamin B12, bei dem die Expression des hemA[KK]XCDBL-Operons gemäß SEQ ID No. 4 und/oder die Expression der für eine antisense-RNA des hemZ-Gens kodierende Nukleotidsequenz (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 durch die Zugabe von Xylose zum Fermentationsmedium induziert wird.
  • Bei erfindungsgemäßen Vitamin B12-Herstellungsverfahren erweisen sich Konzentrationen an Xylose von etwa 0,1 bis 1% als vorteilhaft. Bevorzugt wird ein Zusatz von etwa 0,2 bis 0,5 % Xylose zum Kulturmedium. Besonders bevorzugt ist der Zusatz von etwa 0,20-0,25%, insbesondere 0,23% Xylose unter aeroben und 0,4-0,5%, insbesondere 0,5 % unter anaeroben Fermentationsbedingungen.
  • Die erfindungsgemäße Überexpression des hemA[KK]XCDBL-Operons in dem genetisch veränderten B. megaterium Stamm, der das hemA[KK]XCDBL-Operon unter der induzierten Kontrolle des xylA-Promotors im Chromosom integriert aufweist („integrierter Stamm"), führt zu einer Steigerung des Vitamin B12-Gehaltes um einen Faktor von wenigstens 15-40, bevorzugt 20-35, besonderes bevorzugt 22 beim Vergleich des B. megaterium Stammes DSMZ509 mit dem „integrierten" Stamm (μg/L × OD). Bei der Berechnung der Steigerung der Vitamin B12-Produktin in μg/l ergibt sich eine Steigerung um einen Faktor von wenigstens 15-40, bevorzugt 20-35, besonderes bevorzugt 30.
  • Die erfindungsgemäße Überexpression des ashemZ-Gens in einem genetisch veränderten B. megaterium Stamm, wie z.B. DSMZ509, die beispielsweise aufgrund einer erhöhten Kopienzahl in der Zelle beruht und zusätzlich durch die Zugabe von Xylose zum Kulturmedium induziert werden kann, führt zum Zeitpunkt von etwa 3 Stunden nach der Induktion mit Xylose zu einem Vitamin B12-Gehalt, der um den Faktor von etwa 15-40%, bevorzugt 20-35%, besonderes bevorzugt 22% gegenüber dem Vergleichsstamm gesteigert ist. Zum Zeitpunkt von etwa 6 Stunden nach der Induktion mit Xylose kann beispielsweise eine Steigerung des Vitamin B12-Gehaltes von etwa 16% vorliegen.
  • Unter einem Vergleichsstamm ist ein B. megaterium Stamm zu verstehen, der ebenfalls einen Vektor, jedoch ohne ashemZ-Insert, trägt.
  • In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dem Kulturmedium wenigstens Cobalt und/oder 5-Aminolävulinsäure zugegeben wird.
  • Vorteilhaft erfolgt die Fermentierung unter aeroben Bedingungen unter Zusatz von etwa 250 μM Cobalt; unter anaeroben Bedingungen ist ein Zusatz von bis zu 500 μM Cobalt vorteilhaft. Bei der Zugabe von 5-Aminolävulinsäure sind sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen bis zu 300 μM vorteilhaft. In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der Vitamin B12 Gehalt durch die Zugabe von etwa 200 bis 750 μM, vorzugsweise 250 bis 500 μM Cobalt pro Liter Kulturmedium angehoben werden.
  • Bei Wachstum mit Cobalt und ALA werden in dem genetisch veränderten B. megaterium DSMZ509-pHBasHemZ sechs Stunden nach der Induktion mit Xylose wenigstens 1-25%, bevorzugt 5-18% und besonders bevorzugt 10 % mehr Vitamin B12 als in dem Vergleichsstamm gebildet.
  • Dies zeigt, daß die Transkription der antisense-hemZ-RNA nicht nur die Synthese von Hämen inhibiert, sondern gleichzeitig zu einer erhöhten Vitamin B12-Bildung führt. Durch die Inhibierung der Häm-Synthese wird der Metabolitenfluß der Tetrapyrrolsynthese verstärkt in den Vitamin B12-Syntheseweg gelenkt.
  • Im Anschluß an die Fermentation kann das gebildete Vitamin B12 aus dem Fermentationsmedium aufbereitet werden. Maßnahmen dazu gehören zur gängigen Laborpraxis und werden hier nicht weiter ausgeführt.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert, die jedoch nicht limitierend sind:
  • Bakterienstämme und Plasmide
  • Es wurden Bakterienstämme und Plasmide gemäß den nachfolgenden Tabellen 1 und 2 eingesetzt. Tabelle 1: Verwendete Bakterienstämme
    Figure 00180001
    Tabelle 2: Verwendete Plasmide
    Figure 00180002
    Puffer und Lösungen Minimalmedien Mopso-Minimalmedium
    Figure 00190001
    Titrationsreagenz war KOH-Lösung.
  • Für feste Medien wurden 15 g/l Agar-Agar zugesetzt. Lösungen zur Protoplastentransformation von Bacillus megaterium SMMP-Puffer
    Figure 00190002
    Titrationsreagenz war NaOH-Lösung. PEG-P-Lösung
    Figure 00190003
    Titrationsreagenz war NaOH-Lösung. cR5 Top-Apar
    Figure 00190004
    Figure 00200001
    Titrationsreagenz war NaOH-Lösung.
  • Medien und Medienzusätze
  • Falls nicht gesondert angegeben, wurde mit Vollmedium Luria-Bertani Broth (LB) wie bei Sambrook et. al (1989) beschrieben, gearbeitet. Für feste Medien wurden zusätzlich 15 g Agar pro Liter zugesetzt.
  • Zusätze
  • Zusätze wie Kohlenstoffquellen, Aminosäuren, Antibiotika oder Salze wurden entweder den Medien zugefügt und zusammen mit diesen autoklaviert oder als konzentrierte Stammlösungen in Wasser angesetzt und sterilisiert oder sterilfiltriert. Die Substanzen wurden den autoklavierten und auf unter 50 °C abgekühlten Medien zugesetzt. Bei lichtempfindlichen Substanzen wie Tetracyclin wurde auf Inkubation im Dunkeln geachtet. Die üblicherweise verwendeten Endkonzentrationen waren folgende, die eine Variation jedoch nicht ausschließt:
    Figure 00200002
  • Mikrobiologische Techniken
  • Sterilisation
  • Soweit nicht anders angegeben wurden sämtliche Medien und Puffer für 20 min bei 120°C und 1 bar Überdruck dampfsterilisiert. Temperaturempfindliche Substanzen wurden sterilfiltriert (Porendurchmesser des Filters 0,2 μm), Glaswaren mindestens 3 h bei 180°C hitzesterilisiert.
  • Allgemeine Wachstumsbedinqungen für Bakterien-Flüssigkulturen
  • Mit einer sterilen Impföse wurden von einer LB-Agar-Platte oder aus einer Glycerinkultur Bakterien entnommen und in das Nährmedium gegeben, welches bei Bedarf ein Antibiotikum enthielt.
  • Aerobe Bakterienkulturen wurden in Schikanekolben bei 37°C und einer Drehzahl von 180 rpm inkubiert. Die Inkubationszeiten wurden entsprechend den erwünschten optischen Dichten der Bakterienkulturen variiert.
  • Wachstumsbedinqungen für Bacillus megaterium
  • Aerobe Kulturen wurden für eine bestmögliche Durchlüftung in Schikanekolben bei 250 rpm und 37°C inkubiert. Anaerobe Kulturen wurden in einem Volumen von 150 ml in 150 ml Anaerobenflaschen bei 37°C und 100 rpm kultiviert. In beiden Fällen wurde auf eine Animpfung im Verhältnis 1:100 aus Übernachtkulturen, sowie Verwendung gleichbleibender Bedingungen für die Übernachtkulturen geachtet. Um höhere Ausbeuten an Zellmasse unter anaeroben Bedingungen zu erzielen, wurden B. megaterium Kulturen aerob vorinkubiert und bei einer Wunschdichte auf anaerobe Wachstumsbedingungen umgestellt. B. megaterium wurde dazu zunächst in Shikanekolben bei 250 rpm und 37°C inkubiert. In der Mitte des exponentiellen Wachstums bzw. zum Anfang der stationären Phase wurde die gesamte Kultur in eine 150 ml Anaerobenflasche überführt und weiterhin bei 37°C und 100 rpm kultiviert.
  • Plattenkulturen von Bakterien
  • Mit einer sterilen Impföse wurden aus einer Glycerinkultur Bakterien entnommen und auf einer LB-Agar-Platte, die bei Bedarf mit einem entsprechenden Antibiotikum versetzt war, fraktioniert ausgestrichen, so dass nach einer Inkubation bei 37°C über Nacht einzelne Kolonien auf der Platte zu sehen waren. Wenn Bakterien aus einer Flüssigkultur verwendet wurden, so wurden diese auf der LB-Agar-Platte mit einem Drygalski-Spatel ausgestrichen und anschließend über Nacht bei 37°C inkubiert.
  • Bestimmung der Zelldichte
  • Die Zelldichte einer Bakterienkultur wurde durch Messung der optischen Dichte (OD) bei 578 nm bestimmt, wobei davon ausgegangen wurde, dass einer OD578 von eins eine Zellzahl von 1 × 109 Zellen entspricht.
  • Lagerung von Bakterien
  • Zur längerfristigen Aufbewahrung von Bakterien wurden sogenannte Glycerinkulturen hergestellt. Dazu wurden 850 μl einer Bakterien-Übernachtkultur mit 150 μl sterilem 85%igem Glycerin gründlich vermischt und danach bei –80°C gelagert.
  • Molekularbiologische Methoden
  • Das Standardwerk für die beschriebenen molekularbiologischen Methoden ist Sambrook et al. (1989).
  • Herstellung kompetenter Zellen
  • Zur Herstellung von kompetenten E. coli-Zellen wurden 500 ml Flüssigkulturen mit LB-Medium bis zu einer OD578 von 0.5-1 kultiviert. Die Kultur wurde auf Eis abgekühlt und zentrifugiert (4000 × g; 15 min; 4°C). Das Zellsediment wurde in sterilem, deionisiertem Wasser gut resuspendiert, abzentrifugiert (4000 × g; 8 min; 4°C), erneut mit sterilem, deionisiertem Wasser gewaschen und wieder zentrifugiert (4000 × g; 8 min; 4°C). Nach Waschen des Sediments mit 10%iger (v/v) Glycerin-Lösung wurde abzentrifugiert (4000 × g; 8 min; 4°C) und das Sediment in so wenig wie möglich 10%iger (v/v) Glycerin-Lösung resuspendiert. Die kompetenten E. coli-Zellen wurden sofort für die Transformation verwendet oder bei –80°C eingefroren.
  • Transformation von Bakterien durch Elektroporation
  • Die Transformation erfolgte durch Elektroporation mit Hilfe eines Gene Pulsers mit angeschlossenem Pulse Controller (BioRad). Dazu wurden je 40 μl kompetente E. coli-Zellen und 1 μg Plasmid-DNA in eine Transformationsküvette überführt und im Gene Pulser einer Feldstärke von 12 kV/cm bei 25 μF und einem parallelen Widerstand von 200 Ω ausgesetzt. Für den Fall, dass mehr als 2 μl der Plasmid-DNA zugegeben werden mußte, wurde dialysiert.
  • Zur anschließenden Regeneration wurden die transformierten Zellen sofort nach der Transformation in 1 ml LB-Medium eine halbe Stunde bei 37°C auf dem Thermoschüttler inkubiert. Von den Ansätzen wurden anschließend verschiedene Volumina auf LB-Platten mit entsprechendem Antibiotikazusatz ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.
  • Protoplastentransformation von Bacillus megaterium
  • Protoplastenpräparation
  • 50 ml LB-Medium wurden mit 1 ml einer Übernachtkultur von B. megaterium angeimpft und bei 37°C inkubiert. Bei einer OD578 von 1 wurden die Zellen abzentrifugiert (10000 × g; 15 min; 4°C) und in 5 ml frisch hergestellten SMMP-Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von Lysozym in SMMP-Puffer wurde die Suspension 60 min bei 37°C inkubiert und die Protoplastenbildung unter dem Mikroskop kontrolliert. Nach Ernten der Zellen durch Zentrifugation (3000 × g; 8 min; Rt) wurde das Zellsediment vorsichtig in 5 ml SMMP-Puffer resuspendiert und der Zentrifugations- und Waschschritt ein zweites mal durchgeführt. Die Protoplastensuspension konnte nun, nach Zugabe von 10 % (v/v) Glycerin, portioniert und bei –80°C eingefroren werden.
  • Transformation
  • 500 μl der Protoplastensuspension wurden mit 0.5 bis 1 μg DNA in SMMP-Puffer versetzt und 1.5 ml PEG-P-Lösung zugegeben. Nach Inkubation bei Rt für 2 min wurden 5 ml SMMP-Puffer hinzugefügt, vorsichtig gemischt und die Suspension zentrifugiert (3000 × g; 5 min; RT). Sofort danach wurde der Überstand abgenommen und das kaum sichtbare Sediment in 500 μl SMMP-Puffer resuspendiert. Die Suspension wurde 90 min bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Danach wurden 50 – 200 μl der transformierten Zellen mit 2.5 ml cR5-Topagar gemischt und auf LB-Agar-Platten gegeben, die die für die Selektion geeigneten Antibiotika enthielten. Transformierte Kolonien wurden nach eintägiger Inkubation bei 37°C sichtbar.
  • Klonierung und Sequenzierung des hemZ-Gens aus Bacillus megaterium
  • Zur Sequenzierung des hemZ-Gens aus Bacillus megaterium DSMZ509 wurde genomische DNA isoliert und als template in eine PCR Reaktion mit nachfolgenden primern eingesetzt:
    Figure 00230001
  • Es wurde ein 480 bp langes PCR-Fragment amplifiziert, das 65,1 % Identität mit dem hemZ-Gen aus B. subtilis aufweist und eine Teilsequenz des hemZ-Gens aus B. megaterium darstellt. Zur Vervollständigung der hemZ-Teilsequenz wurde eine unidirektionale PCR, d.h. eine sogenannte Vectoretten-PCR, mit dem Vectorettensystem der Firma Sigma-Genosys durchgeführt.
  • Die Vectoretten-PCR ermöglicht die Amplifikation von unbekannten DNA-Bereichen, die an bekannte Sequenzabschnitte angrenzen. Dabei wird ein erster Primer anhand der bekannten DNA-Sequenz entworfen. Zur Etablierung einer bekannten DNA-Sequenz für die Hybridisierung des zweiten nötigen PCR-Primers wird das Genom mit einer Restriktionsendonuclease zerschnitten und alle entstandenen Enden mit einer bekannten kurzen DNA-Sequenz verbunden. Diese kurze Sequenz (Vectorette) dient nach Synthese des Primärstranges als Zielsequenz des zweiten Primers.
  • Den gesamten mit den Vectoretteneinheiten fusionierten Restriktionsverdau kann man als eine Art Genbank, die Vectorette-Bank, betrachten, mit deren Hilfe sich jede beliebige Sequenz amplifizieren läßt. Da die Vectorette aus einem teilweise ungepaarten Oligonucleotiddoppelstrang besteht, kann der zu ihr komplementäre PCR-Primer für die zweite Amplifikationsrunde erst hybridisieren, wenn der für den bekannten Sequenzbereich spezifische Primer verlängert wurde und die komplementäre Sequenz entstanden ist. Das garantiert die alleinige Amplifikation der Wunsch-DNA.
  • Vorbedingung für eine erfolgreiche Vectoretten-PCR ist eine amplifizierbare Fragmentgröße der gesuchten, genomischen DNA. Dabei sollte die Fragmentgröße 6-7 kb nicht überschreiten, damit eine spezielle DNA-Polymerase (Taq) das Fragment ohne Abbruch bis zum Ende synthetisieren kann. Ein adäquates Restriktionsenzym zum Verdau der genomischen DNA wird durch Southern Blot-Voranalyse bestimmt. Hierzu wurde das Restriktionsenzym CIal gewählt. Die durch die Southern Blot-Analyse bestimmte Fragmentgröße erlaubt die Kalkulation der Größe des zu erwartenden PCR-Fragments und erleichtert damit dessen Identifikation.
  • Durch die Vectoretten-PCR wurde ein Strang des vollständigen hemZ-Gens aus Bacillus megaterium isoliert. Durch inverse PCR konnte ausgehend von dieser Sequenz das gesamte hemZ-Gen vollständig amplifiziert und sequenziert werden. Die Sequenz ist gemäß SEQ ID No. 1 dargestellt.
  • Vektorkonstruktionen
  • Konstruktion von pHBintE
  • Als Ausgangsplasmide fungierten pWH1967E (Schmiedel, D. et al., 1997, Appl. Micorbiol. Biotechnol., 47 (5): 543-546) und pMM1520 (Malten, Marco, 2002, Produktion und Sekretion einer Dextransucrase in Bacillus megaterium, Doktorarbeit, Institut für Mikrobiologie (Prof. Dr. D. Jahn), Technische Universität Braunschweig). Die beiden Plasmide wurden zunächst jeweils mit PstI und HindIII geschnitten. Anschließend wurde jeweils der komplette Ansatz auf ein Agarosegel aufgetragen und die interessierenden Fragmente eluiert. Das eluierte Fragment von pWH1967E (4198 bp) enthielt eine Erythromycinresistenz, das repF-Gen, den temperatursensitiven Origin pE194ts und eine halbe Ampicillinresistenz. Das Fragment von pMM1520 (1485 bp) enthielt den xylA'-Promotor aus B. megaterium, direkt stromaufwärts des Promotors eine multiple cloning site, den Origin aus pBR322 und den zweiten Teil des Ampicillinresistenz-Gens, das die Ampicillinresistenz komplementiert. Die kohäsiven Enden der beiden Fragmente wurden nun ligiert. Das so erhaltene Plasmid erhielt die Bezeichnung pHBintE. Die Klonierungsstrategie ist in 1 schematisch dargestellt.
  • Das klonierte Plasmid pHBintE (1) hat somit die folgenden Eigenschaften. Es weist eine Ampicillinresistenz zur Selektion in E. coli- und eine Erythromycinresistenz zur Selektion von B. megaterium-Transformanten auf. Die wichtigen Elemente zur Replikation in E. coli (pBR322) und B. megaterium (pE194ts und repF) sind vorhanden. Der temperatursensitive Origin pE194 ts für B. megaterium läßt eine Replikation nur unterhalb von 40 °C zu, wodurch oberhalb dieser „permissiven" Temperatur ein Selektionsdruck für eine Integration in das Chromosom aufgebaut werden kann (Rygus et al., 1992). Das repF Genprodukt wird beschrieben als ein trans-agierendes Element, das für die Replikation des Plasmids in Gram-positiven Bakterien erforderlich ist (Villafane et al., 1987). Des weiteren enthält das Plasmid den xylA'-Promotor mit einer multiplen cloning site direkt stromaufwärts. Dieser Promotor ermöglicht die Induktion von in die multiple cloning site eingefügten Genen mit Xylose.
  • Konstruktion von pHBiHemA[KK]
  • In 2 sind die ersten 27 Aminosäuren des Alignment Reports für HemA von B. megaterium mit „KK-dereguliertem HemA", B. megaterium Wildtyp und von S. typhimurium dargestellt. Dort ist nochmals verdeutlicht, an welcher Stelle die Insertion stattfinden soll.
  • Die Klonierung der HemA[KK]-Mutante erfolgte mittels PCR. Als Template diente chromosomale DNA von B. megaterium. Da die Sequenz des hemA-Gens von B. megaterium bekannt war, konnten Primer abgeleitet werden. Die Sequenzen der Primer sind nachfolgend dargestellt:
    Figure 00260001
  • Die abgeleiteten Primer hatten keine vollständige Homologie zur B. megaterium-Sequenz. In den Forward-Primer wurden zum einen 6 Basen gegen eine Spel-Schnittstelle ausgetauscht (kursiv). Zum anderen wurden weitere 6 Basen zur Klonierung der HemA[KK]-Mutante durch eine 6 Basen lange DNA-Sequenz, die für zwei Lysine codiert, ersetzt (unterstrichen). Die Stelle der Insertion ist so gewählt, dass die „KK-Insertion" an die dritte und vierte Position des N-Terminus der Aminosäuresequenz gelangt. Da der genetische Code degeneriert ist, wurde zur Ermittlung der wahrscheinlichsten Sequenz die Codon-Usage von B. megaterium benutzt. Die Codon-Usage gibt an, mit welcher Wahrscheinlichkeit im Genom des Organismus ein bestimmtes Basentriplett für eine Aminosäure codiert. Bei B. megaterium ist für Lysin „AAA" mit einer prozentualen Verwendung von 76 % das häufigste Triplett. In den Reverse-Primer wurde eine KpnI-Schnittstelle eingefügt. Die Synthese der Primer erfolgte durch die Firma MWG, Ebersbach.
  • Die über PCR amplifizierte hemA[KK]-Mutante wurde mit einem PCR-Purification-Kit von Quiagen gereinigt, mit SpeI und KpnI geschnitten und erneut gereinigt. Das Plasmid pHBintE wurde ebenfalls mit SpeI und KpnI geschnitten und mit einem PCR-Purification-Kit von Quiagen gereinigt. Nach der Konzentrationsbestimmung wurden diese beiden Fragmente mit einem Vektor/Insert Verhältnis von 1:4 zu dem Integrationsvektor mit der Bezeichnung pHBiHemAKK ligiert. Die Klonierungsstrategie für das Plasmid pHBiHemAKK ist in 3 schematisch dargestellt.
  • Da pHBiHemAKK sich im wesentlichen nur durch die Insertion der hemA[KK]-Mutante von pHBintE unterscheidet, behält es dessen Eigenschaften bei. Es sind weiterhin die Ampicillin- und die Erythromycinresistenz zur Selektion in E. coli bzw. in B. megaterium vorhanden. Zur Replikation in E. coli dient der Origin pBR322 und in B. megaterium der temperatursensitive Origin pE194ts und repF. Xyl A' und die hemA[KK]-Mutante wurden zu einer Translationsfusion ligiert und stehen unter der Kontrolle des xyl-Promotors. Aufgrund der hemA[KK]-Insertion besitzt pHBiHemAKK einen homologen Abschnitt zum B. megaterium Chromosom und damit zusätzlich die Möglichkeit über „single crossing over recombination" in das Chromosom zu integrieren.
  • Zur Selektion dieses Integrationsereignisses ist der temperatursensitive Origin pE194ts von Bedeutung. Da bei 30 °C das Plasmid repliziert wird, können B. megaterium-Transformanten auf Erythromycin bei dieser Temperatur selektioniert werden. Bei Erhöhung der Temperatur auf 42 °C kann das Plasmid nicht mehr repliziert werden. Dies bedeutet, dass nur die Transformanten wachsen können, die das Plasmid und damit die Erythromycin Resistenz in ihr Chromosom integriert haben.
  • Die Integration von pHBiHemA[KK] in das B. megaterium-Chromosom ermöglicht somit eine Xylose-induzierbare Überexpression des gesamten hemAXCDBL-Operons. Zudem enthält das Plasmid durch die feedback deregulierte Mutante des HemA-Proteins eine verbesserte Möglichkeit zur Überproduktion von Vitamin B12. Der B. megaterium Stamm DSMZ509 mit integriertem Plasmid pHBiHemA[KK] wird im Folgenden mit HBBm1 bezeichnet.
  • Konstruktion von pHBasHemZ
  • Ausgehend von genomischer DNA, isoliert aus B. megaterium DSMZ509, wurde mittels PCR und der nachfolgend aufgeführten primer nach gängiger Laborpraxis ein 129 bp langes BamHI/SpeI-Fragment aus dem 5'-Bereich der mRNA des hemZ-Gens in Form einer antisense-RNA amplifiziert.
  • Primer forward (ashemZ): enthält BamHi-Schnittstelle
    5'-GCGGGATCCCTTGAACTGAGCACCTTGACCGG-3'
  • Primer reverse (ashemZ): enthält Spel-Schnittstelle
    5'-TCGACTAGTCGGACGTAAAAAACGTTCATCTTCTATACC-3'
  • PCR-Bedingungen:
    • 7 min/95°C
    • 30 mal: 1 min/95°C 1 min/64°C 1 min/72°C
    • 7 min/72°C
  • Anschließend wurde das amplifizierte BamHI/SpeI-antisense-RNA-Fragment aufgereinigt und in den Vektor pWH1520 (Rygus, T. et al., 1991, Appl. Microbiol. Biotechnol., 35: 594-599) kloniert, der zuvor mit den Restriktionsendonukleasen SpeI und BamHI linearisiert wurde. Das resultierende Plasmid pHBasHemZ, welches eine antisense-hemZ-RNA unter der Kontrolle des xylA-Promotors enthält, ist in 4 dargestellt.
  • Die inserierte antisense-hemZ-RNA gemäß SEQ ID No. 3 weist eine Länge von 129 bp auf, die 82 Nukleotide vor dem Startcodon des eigentlichen hemZ Gens beginnt. Eine Übersicht über die Lage der antisense-hemZ-RNA ist nachfolgend gegeben:
    Figure 00280001
  • Das Transkript der antisense RNA bildet demzufolge mit der hemZ-mRNA eine doppelsträngige RNA und blockiert so die Ribosomenbindestelle des hemZ-Gens für die Ribosomen.
  • Transformation und Integration von pHBiHemAKK in Bacillus megaterium
  • Um den vorliegenden Integrationsvektor in das Chromosom integrieren zu können, wurde B. megaterium DSMZ509 zunächst mit pHBiHemAKK mittels Protoplastentransformation transformiert. Der transformierte Stamm wurde auf Agarplatten mit einem Zusatz von Erythromycin (1 μg/ml und 75 μg/ml) kultiviert. Als Kultivierungstemperatur wurde 30°C gewählt, weil bei dieser Temperatur das Plasmid repliziert werden kann.
  • Nach 24 Stunden Wachstum sind Kolonien bei allen angegebenen Konzentrationen von Erythromycin identifiziert worden. Auch ein Überimpfen einiger Kolonien auf Agarplatten mit einem Erythromycinzusatz (75 μg/ml) führte unter den genannten Bedingungen nach 24 Stunden zum Wachstum. Damit war die Transformation von pHBiHemAKK in B. megaterium DSMZ509 erfolgreich.
  • Mit diesen Transformanten wurde eine 110 ml LB Kultur mit 5 μg/ml Erythromycin und 0,23 % Xylose angeimpft und unter aeroben Bedingungen (250 rpm Schütteln) bei 30°C inkubiert. Nach ca. 12 h wurde die Temperatur auf 42°C erhöht, so dass keine weitere Replikation des Plasmides erfolgen konnte und dadurch ein Druck zur Integration aufgebaut wurde. Nach weiteren 12 h wurde für insgesamt 3 Tage jeweils in neues LB-Medium überimpft und weiter bei 42°C inkubiert. Nach dieser Zeit zeigte sich ein guter Bewuchs des LB-Mediums, der die Integration des Plasmids ins Chromosom anzeigte, da Transformanten mit frei replizierbaren Plasmiden unter diesen Bedingungen keine Weitergabe des Plasmides durch Replikation möglich gewesen wäre.
  • Wachstumsverhalten des genetisch veränderten B. megaterium DSMZ509
  • B. megaterium DSMZ509 mit integriertem pHBiHemA[KK] unter aeroben Bedingungen
  • Zur Überprüfung der Wachstumsfähigkeit des neuen Stammes wurden Wachstumskurven in LB-Medium aufgenommen mit Zusatz von 5 μg/ml Erythromycin und 0,23 % Xylose bei 42°C unter aeroben Bedingungen. Es zeigte sich für die pHBiHemAKK-Integrationstransformante ein gutes aerobes Wachstum wenn im Medium eine geringe Menge Xylose vorhanden ist.
  • B. megaterium DSMZ509 mit pHBasHemZ im Transferexperiment
  • Bei sogenannten „Transferexperimenten" wird B, megaterium zunächst unter aeroben Bedingungen kultiviert, um eine hohe Zelldichte zu erzielen. Anschließend wird die Kultur zum Ende der exponentiellen Phase zu anaeroben Bedingungen überführt, da unter anaeroben Bedingungen die Bakterien einen wesentlich höheren Vitamin B12-Gehalt erreichen (Barg, H., 2000, Vitamin B12-Produktion durch Bacillus megaterium, Diplomarbeit, Albert Ludwigs-Universität, Freiburg).
  • Es wurden der nicht-transformierte Stamm B. megaterium DSMZ509 und die Transformanten DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ bei Wachstum mit Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle verglichen.
  • Den Kulturen der Transformanten wurden wieder 30 μg/ml Tetracyclin zugesetzt. Die Induktion mit 0.5 % (w/v) Xylose erfolgte nach 9 Stunden Wachstum; das bedeutet 1 Stunde vor dem Transfer von aeroben zu anaeroben Bedingungen.
  • Da kein deutlicher Unterschied des Wachstums der antisense-hemZ-RNA bildenden Transformante und der Vergleichstransformante festgestellt wurde, wurden Wachstumsvergleiche mit der Zugabe von CoCl2 und ALA unternommen. Aufgrund der Zugabe von ALA sollte es auch zu einem vermehrten Metabolitenfluß in den Häm-Syntheseweg kommen. Eine Inhibierung durch die antisense-hemZ-RNA sollte somit einen deutlichen Wachstumsunterschied in Bezug zur Vergleichstransformante zeigen. Bei diesem Transferexperiment erhielten die Kulturen der Transformanten erneut einen Tetracyclin-Zusatz von 30 μg/ml und zusätzlich eine Zugabe von 250 μM CoCl2 und 298 μM ALA. Die Induktion mit 0.5 % (w/v) Xylose erfolgte nach 10 Stunden Wachstum (entspricht 1 Stunde vor dem Transfer).
  • Die 5 zeigt, daß bei Zugabe von 298 μM ALA und 250 μM CoCl2 das Wachstum von B. megaterium DSMZ509-pHBasHemZ (-!-) über den gesamten Verlauf deutlich schlechter ist als bei der Vergleichstransformante DSMZ509-pWH1520 (-+-). Dies bedeutet, daß eine Reduktion der Häm-Bildung durch die antisense RNA stattgefunden hat. Die Zugabe von ALA (dem Vorläufermolekül aller Tetrapyrrole) scheint die Tetrapyrrolsynthese derart zu stimulieren, daß sich die Inhibierung der Coproporphyrinogen-III-Oxidase (HemZ) durch die antisense-hemZ-RNA im Wachstum bemerkbar macht.
  • Mit der Zugabe von ALA und CoCl2 werden geringere Zelldichten erreicht als beim Wachstum ohne diese Zusätze. Die erreichten Zelldichten hatten bei den Transformanten eine OD578 von 3.9 für die antisense Transformante und 5.2 für die Vergleichstransformante (ohne Zusätze: 8.7 und 8.8). Der nicht-transformierte Stamm DSMZ509 (-
    Figure 00310001
    -) zeigt über den gesamten Verlauf das beste Wachstum und hatte zum Zeitpunkt des Transfers mit einer OD578 von 7.8 die höchste Zelldichte (ohne Zusätze: 10.8).
  • Der Wachstumsnachteil der Transformanten im Vergleich zum nicht-transformierten Stamm ist bedingt durch die zusätzliche Replikation der Plasmide und durch den Antibiotikazusatz im Medium.
  • Bacillus megaterium DSMZ509-pHBasHemZ bei Cobalt- und ALA-Zusatz unter aeroben Bedinungen
  • Bei den vorangegangenen Transferexperimenten fand nach der Induktion lediglich eine Stunde Wachstum unter aeroben Bedingungen statt. Da Häme hauptsächlich unter aeroben Bedingungen benötigt werden, wurde ein Wachstumsvergleich der beiden B. megaterium Transformanten DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle und der Zugabe von 250 μM CoCl2 und 298 μM ALA unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Die Induktion mit 0.5 % Xylose (w/v) fand bei einer OD578 von 2 statt.
  • Die 6 bestätigt, daß die gebildete antisense-hemZ-RNA das Wachstum hemmt. Auch hier ist das Wachstum von DSMZ509-pHBasHemZ (-!-) zu jedem Zeitpunkt schlechter als das der Vergleichstransformante (-+-). So erreicht die antisense-hemZ-RNA bildenden Transformante eine maximale OD578 von 8.3, während die maximale OD578 der Vergleichstransformante 10.0 beträgt. Dies bedeutet, daß eine Inhibierung der Coproporphyrinogen III-Oxidase stattgefunden hat.
  • Quantitative Vitamin B12-Analyse
  • Zur quantitativen Vitamin B12-Bestimmung wurden zwei verschiedene Methoden angewendet. Zum einen erfolgte die Bestimmung anhand des Wachstums von S.typhimurium metE cysG Doppelmutanten, zum anderen mit dem RIDASCREEN®FAST Vitamin B12 ELISA Test der Firma r-biopharm in Verbindung mit dem Plattenlesegerät Fusion von Packard.
  • Vitamin 812-Bestimmung mit S. typhimurium metE cysG Doppelmutanten
  • Es wurden in verschiedenen Wachstumsphasen Proben von B. megaterium-Kulturen genommen. Nach Bestimmung der OD578 wurden die Zellen durch Zentrifugieren (4000 × g; 15 min; 4°C) vom Medium abgetrennt. Die erhaltenen Zellsedimente sowie die abgenommenen Medien wurden anschließend gefriergetrocknet.
  • S. typhimurium metE cysG Doppelmutanten wurden über Nacht auf Methionin und Cystein enthaltendem Minimalmedium bei 37 °C inkubiert, von der Platte gekratzt und mit 40 ml isotonischer NaCl-Lösung gewaschen. Nach Abzentrifugieren wurde das Zellsediment wieder in isotonischer Kochsalzlösung resuspendiert. Die gewaschene Bakterienkultur wurde sorgfältig mit 400 ml 47-48°C warmem, Cystein enthaltendem Minimalmedium-Agar gemischt.
  • 10 μl der in deionisiertem, sterilem Wasser resuspendierten und 15 min im Wasserbad gekochten B. megaterium-Proben wurden auf die abgekühlten Platten gegeben und für 18 h bei 37°C inkubiert. Die Durchmesser der gewachsenen Salmonellen Kolonien sind dann proportional dem Gehalt an Vitamin B12 der aufgetragenen B. megaterium-Proben. Durch Vergleich mit einer Eichkurve, angefertigt aus der Zugabe von 0.01, 0.1, 1, 10 und 40 pmol Vitamin B12, wurde auf den Gehalt an Vitamin B12 in den untersuchten Proben zurückgeschlossen. Diese Standardmethode erlaubt schnell und sehr reproduzierbar den Nachweis geringer Vitamin B12-Mengen in biologischen Materialien.
  • Vitamin B12-Bestimmung mit dem ELISA-Test
  • Testprinzip:
  • Grundlage ist eine Antigen-Antikörper-Reaktion, bei der Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit spezifischen Antikörpern gegen Vitamin B12 beschichtet sind. Nach der Zugabe von enzymmarkiertem Vitamin B12 (Enzymkonjugat) und Probelösungen bzw. Vitamin B12-Standardlösungen konkurrieren freies und enzymmarkiertes Vitamin B12 um die Vitamin B12-Antikörperbindungsstellen (kompetetiver Enzymimmunoassay).
  • Nicht gebundenes enzymmarkiertes Vitamin B12 wird anschließend in einem Waschschritt wieder entfernt. Der Nachweis erfolgt durch Zugabe von Substrat-/Chromogenlösung (Tetramethylbenzidin/Harnstoffperoxid). Gebundenes Enzymkonjugat wandelt das Chromogen in ein blaues Endprodukt um. Die Zugabe des Stop-Reagenzes führt zu einem Farbumschlag von blau nach gelb. Die Messung erfolgt photometrisch bei 450 nm. Somit ist die Extinktion der Lösung umgekehrt proportional zur Vitamin B12-Konzentration in der Probe.
  • Durchführung:
  • Aus der zu messenden B. megaterium-Flüssigkultur wurden 2 ml Proben zu verschiedenen Zeitpunkten des Wachstums entnommen und die OD578 bestimmt. Durch anschließendes Zentrifugieren (4000 × g; 5 min; 4°C) wurden die Zellen vom Medium getrennt, der Überstand verworfen und das Sediment gefriergetrocknet.
  • Nun wurden die benötigten Reagenzien (Standards, Enzymkonjugat und Waschpuffer-Konzentrat) des Testkits auf Raumtemperatur gebracht und wie in der zugehörigen Vorschrift beschrieben vorbereitet und verdünnt.
  • Unmittelbar vor dem Test erfolgte die Vorbereitung der Proben. Hierzu wurden die gefriergetrockneten Zellen in 0.5 ml sterilem, deionisiertem Wasser resuspendiert. Durch die Zugabe von 50 μl Lysozym-Lösung (1 mg/ml), anschließender Inkubation (30 min; 37°C; Schütteln bei 300 rpm), Ultraschall (5 min) und Kochen (3 min; 100 °C) wurde ein quantitativer Zellaufschluß erreicht. Die Proben wurden nun mit Eis auf Raumtemperatur gekühlt und zentrifugiert (4000 × g; 5 min; 15°C). Der Überstand wurde entnommen und mit dem Probenverdünnungspuffer 1:5 verdünnt.
  • Nun konnten jeweils 50 μl der verdünnten Proben bzw. der verdünnten Vitamin B12-Standards in die Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettiert werden. Nach der Zugabe von 50 μl des verdünnten Enzymkonjugats, wurde gemischt (Schüttel-Funktion im Fusion-Gerät) und inkubiert (15 min; RT). Im Anschluß an die Inkubation wurden die Kavitäten durch Ausklopfen der Mikrotiterplatte entleert und mit 250 μl Waschpuffer pro Kavität gewaschen. Die Kavitäten wurden wieder durch ausklopfen entleert und der Waschschritt zweimal wiederholt. Nun wurden äquitemporal zwei Tropfen Stop-Reagenz pro Kavität zugegeben, gemischt und 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach der äquitemporalen Zugabe von zwei Tropfen des Stop-Reagenzes pro Kavität wurde die Extinktion bei 450 nm im Fusion-Gerät von Packard gemessen.
  • Zur Auswertung wurde die prozentuale Extinktion wie folgt errechnet:
    Figure 00330001
  • Anhand der Auftragung der Extinktion in % über log(ppb) konnte nun eine Eichgerade ermittelt werden. Über die Geradengleichung, den Verdünnungsfaktor und die bekannte Zelldichte (OD578) konnte anschließend der Vitamin B12-Gehalt der Proben in μg/(l × OD) angegeben werden.
  • ELISA-Vitamin B12-Bestimmungen von Bacillus megaterium DSMZ509 mit integriertem pHBiHemAKK
  • Zur Überprüfung der Vitamin B12-Gehalte von Kulturen mit Xylose induzierbarem hemA[KK]XCDBL-Operon wurden der integrierte Stamm, sowie DSMZ509 und Z509-pWH1520-cobA als Vergleichsstämme aerob kultiviert. Nach zehn Stunden Wachstum und 5 Stunden nach Induktion (t = 5) wurden die Proben nach dem ausgearbeiteten ELISA-Vitamin B12-Test aufgeschlossen und die Vitamin B12-Gehalte vermessen. Bereits die zentrifugierten Zellpellets ließen durch ihre rotbraune Färbung gegenüber der gelblichen DSMZ509-Vergleichskultur auf einen erhöhten Gehalt an Tetrapyrrolen schließen.
  • Der ELISA-Test bestätigt dies, wie die 7 und 8 zeigen.
  • Die vermutete Überexpression des hemA[KK]XCDBL-Operons führte zu einer Steigerung des Vitamin B12-Gehaltes von 0,07 (g/l·OD578 des Wildstammes (DSMZ509) auf 1,59 (g/l·OD578 beim integrierten Stamm. Dies entspricht einer Steigerung um den Faktor 22. Berechnet man die Steigerung in (g/l, so ergibt sich sogar eine Steigerung um den Faktor 30 (von 0,26 (g/l bei DSMZ509 auf 8,51 μg/l bei DSMZ509 mit integriertem pHBiHemAKK).
  • ELISA-Vitamin B12-Bestimmung von Bacillus megaterium DSMZ509-pHBasHemZ
  • Bei den Transferexperimenten wurden drei Stunden (T = 3) und sechs Stunden (T = 6) nach der Xyloseinduktion Proben der B. megaterium Transformanten DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ genommen. Diese wurden anhand eines ELISA-Tests der Firma R-Biopharm, der ausführlich im Material und Methodenteil beschrieben ist, auf Vitamin B12 untersucht.
  • Die Überführung von aeroben zu anaeroben Bedingungen fand bei den Transferexperimenten eine Stunde nach der Induktion statt.
  • In 9 und 10 sind die Ergebnisse der Vitamin B12-Bestimmung bei Wachstum mit Glucose (1, 2, 5, 6) und bei Wachstum mit Glucose unter Zugabe von 298 μM ALA und 250 μM CoCl2 (3, 4, 7, 8) dargestellt.
  • 9 zeigt die Vitamin B12-Konzentrationen bezogen auf die Zelldichte der jeweiligen Kultur. Dort ist zu erkennen, daß DSMZ509-pHBasHemZ in drei von vier Fällen (Nr. 2, 6 und 8) mehr Vitamin B12 gebildet hat als die Vergleichstransformante (Nr. 1, 5 und 7). So liegt der Vitamin B12-Gehalt der antisense-hemZ-RNA bildenden Transformante bei Wachstum ohne Zugaben zum Zeitpunkt T = 3 (Nr. 2) um 21 % höher und bei T = 6 (Nr. 6) um 16 % höher als der der Vergleichstransformante. Bei Wachstum mit Cobalt und ALA bildet DSMZ509-pHBasHemZ sechs Stunden nach der Induktion (Nr. 8) 10 % mehr Vitamin B12 als DSMZ509-pWH1520.
  • In 10 ist der Unterschied der Vitamin B12-Konzentrationen zwischen den Kulturen ohne Cobalt und ALA Zugabe zu denen mit einer Zugabe größer. Dies ist bedingt durch die höheren Zelldichten, die bei Wachstum ohne Zugaben erreicht wurden.
  • Bio-Assay-Vitamin B12-Bestimmung von Bacillus megaterium DSMZ509-pHBasHemZ
  • Zur Bestimmung der Vitamin B12-Gehalte in den Transferexperimenten wurden mittels Bio-Assay Proben zu drei verschiedenen Zeitpunkten genommen. Die Probenahme erfolgte: 1.) zum Zeitpunkt der Induktion (T = 0), 2.) drei Stunden nach der Induktion (T = 3) und 3.) sechs Stunden nach der Induktion während der stationären Phase (T = stationär). Der Transfer von aeroben zu anaeroben Bedingungen fand dabei eine Stunde nach der Induktion statt. Es wurden die Vitamin B12-Gehalte der B. megaterium Stämme DSMZ509, DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ gemessen. Zum einen bei Wachstum mit Glucose, zum anderen bei Wachstum mit Glucose und der Zugabe von 250 μM CoCl2 und 298 μM ALA. Die Bestimmung wurde mit der S. typhimurium metE cysG-Doppelmutante AR3612 durchgeführt. Der Gehalt an Vitamin B12 ist in pmol/OD578 und in μg/l dargestellt (11-12).
  • In 11 zeigt sich bei Wachstum mit Glucose, daß die Vitamin B12-Gehalte bezogen auf die Zelldichte bei DSMZ509-pHBasHemZ (Nr. 3, 6 und 9) zu jedem Zeitpunkt am höchsten sind. Dies zeigt somit erneut, daß es durch die Inhibierung der Häm-Synthese zu einem vermehrten Metabolitenfluss in die Vitamin B12 Synthese kommt.
  • Die Darstellung der Ergebnisse in μg pro Liter Bakterienkultur (12) zeigt, daß die antisense-hemZ-RNA transkribierende Transformante (Nr. 3, 6 und 9) auch insgesamt am meisten Vitamin B12 produziert hat, obwohl diese Transformante eine niedrige Zelldichte erzielte.
  • 13 zeigt, daß bei einer Zugabe von CoCl2 und ALA zum Medium die antisense-hemZ-RNA transkribierende Transformante lediglich drei Stunden nach der Induktion den höchsten Vitamin B12-Gehalt erzielt (Nr. 6). Dies scheint zunächst damit erklärbar zu sein, daß die Induktion nicht umgehend zu einer maximalen Plasmidreplikation führt, sondern erst anlaufen muß. Die Betrachtung der Vitamin B12-Gehalte pro Liter Bakterienkultur zeigt, daß aufgrund des besseren Wachstums der untransformierte Stamm DSMZ509 mehr Vitamin B12 produziert als die anderen beiden transformierten Stämme (14).
  • Methoden der relativen Coproporphyrinogen III Bestimmung
  • Fluoreszenzspektren
  • Aus der zu messenden B. megaterium-Flüssigkultur wurden 2 ml Proben zu verschiedenen Zeitpunkten des Wachstums entnommen und die OD578 bestimmt. Durch anschließendes Zentrifugieren (4000 × g; 5 min; 4°C) wurden die Zellen vom Medium getrennt, der Überstand verworfen und das Sediment gefriergetrocknet.
  • Unmittelbar vor einer Messung wurden die Proben in 1 ml sterilem, deionisiertem Wasser resuspendiert und anschließend die optischen Dichten durch Verdünnen mit Wasser angeglichen. 1 ml dieser angeglichenen Proben wurden nun mit 50 μl Lysozym (1 mg/ml) versetzt und bei 37°C für 30 min im Rüttler bei 300 rpm inkubiert. Nun wurden die Proben für 10 min ins Ultraschallbad gestellt und im Anschluß 3 min bei 4000 × g zentrifugiert. Mit dem Überstand wurde nun die Fluoreszenzmessung durchgeführt. Dabei lagen folgende Einstellungen vor:
    Start: 430 nm
    End: 680 nm
    Excitation: 409 nm
    Ex Slit 12 nm
    Em Slit: 12 nm
    Scan Speed: 200 nm/min
  • Die Wachstumskurven mit der Zugabe von CoCl2 und ALA ergaben die erste Hinweise auf eine Inhibierung der Häm-Synthese durch antisense-hemZ-RNA. Die durch Xylose induzierbare antisense-hemZ-RNA inhibiert durch Besetzen der hemZ-mRNA die Ribosomenbindestelle und verhindert damit eine Translation zu HemZ. Dadurch kommt es zu einer verringerten Bildung des HemZ-Proteins, das die Reaktion von Coproporphyrinogen III zu Protoporhyrinogen IX katalysiert. Da der eigentliche Metabolitenfluß an dieser Stelle unterbrochen ist, kommt es zu einer Anhäufung von Coproporphyrinogen III.
  • Der direkte Nachweis von Coproporphyrinogen III in Proben erweist sich als schwierig, da Coproporphyrinogen III an der Luft zu Coproporphyrin III oxidiert wird. Vorversuche ergaben, daß das Fluoreszenzspektrum von Coproporphyrin III bei ca. 579 nm und ca. 620 nm Emmissionspeaks aufweist. Relative Mengen von Coproporphyrinogen III sollten demnach anhand von Fluoreszenzspektren indirekt nachgewiesen werden können, wobei die oxidierte Form (Coproporphyrin III) gemessen wird.
  • Um einen Unterschied von relativen Coproporphyrinogen III Mengen in DSMZ509-pHBasHemZ und der Vergleichstransformante DSMZ509-pWH1520 zu zeigen, wurden Fluoreszenzmessungen durchgeführt. Von den Wachstumsversuch mit Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle und einer Zugabe von 298 μM ALA und 250 μM CoCl2 wurden drei Stunden nach der Induktion mit 0.5 % (w/v) Xylose Proben von den Transformanten DSMZ509-pHBasHemZ und DSMZ509-pWH1520 genommen. Durch Verdünnen mit Wasser wurden die optischen Dichten der Proben zunächst angeglichen. Anschließend wurde ein Zellaufschluß durchgeführt und der Zellextrakt vermessen.
  • Die Einzelspektren dieser Proben zeigen einen ähnlichen Verlauf, wobei das Spektrum der antisense-hemZ-RNA tragenden Transformante stets eine höhere Fluoreszenz zeigt. Der Unterschied der beiden Spektren scheint sich bei den Peaks (bei 579 nm und 612 nm) zu vergrößern.
  • Um diesen Unterschied zu verdeutlichen, ist in 15 das Differenzspektrum der beiden Proben (DSMZ509-pHBasHemZ minus DSMZ509-pWH1520) dargestellt. Die Peaks bei 579.83 nm und 617.86 nm zeigen, daß die antisense-RNA bildende Transformante in Bezug zur Vergleichstransformante Coproporphyrinogen III anhäuft. Dies ist ein sicherer Nachweis, daß eine Inhibierung der Häm-Biosynthese anhand von antisense RNA erzielt worden ist. Somit ist man mit DSMZ509-pHBasHemZ in der Lage durch eine gezielte Xylose-Induktion den Häm-Biosyntheseweg zu unterbinden, was andererseits einen ungestörten Metabolitenfluss in den Vitamin B12-Syntheseweg erlauben sollte.
  • Legende zu den Figuren
  • Im folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand der Figuren noch erläutert.
  • 1 zeigt die Schematische Darstellung der Klonierung des integrativen Plasmids pHBintE für B. megaterium. Die Ausgangsplasmide pWH1967E und pMM1520 wurden mit den Endonukleasen PstI und HindIII geschnitten. Das 4198 by Fragment (zwischen PstI-2786 und HindIII-6984) von pWH1967E und das 1485 by Fragment (zwischen HindIII-7212 und PstI-1307) von pMM1520 wurden eluiert und ligiert.
  • 2 zeigt eine Darstellung der ersten 27 Aminosäuren des Alignment Report für 1.) S. typhimurium HemA, 2.) B. megaterium HemA und 3.) B. megaterium HemAKK. Unterstrichen: Insertion von zwei positiv geladenen Lysinresten (KK) an Position 3 und 4 des N-Terminus.
  • 3 zeigt eine schematische Darstellung der Klonierungsstrategie des Plasmids pHBiHemAKK. Die durch PCR amplifizierte hemA[KK]-Mutante und der Vektor pHBintE wurden jeweils mit SpeI und KpnI geschnitten und die entstandenen kohäsiven Enden zum Integrationsvektor pHBiHemAKK ligiert.
  • 4 zeigt eine schematische Darstellung des Plasmids pHBasHemZ. Die in der Darstellung angegebenen Schnittstellen SpeI und BamHI wurden verwendet, um die antisense RNA zu inserieren.
  • 5 zeigt das Wachstumsverhalten des B. megaterium-Stammes DSMZ509 und Transformanten dieses Stammes bei 37°C in Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle und dem Zusatz von 298μM ALA und 250 μM CoCl2. Transfer (shift) von aeroben zu anaeroben Wachstum fand am Ende der exponentiellen Phase statt (nach 11 h). Wachstum von DSMZ509 untransformiert (-
    Figure 00390001
    -), DSMZ509 pWH1520 (-+-) und DSMZ509 pHBasHemZ (-!-). Induktion der Genexpression des xylA-Promotors auf pHBasHemZ und pWH1520 erfolgte durch Zugabe von 0.5 % (w/v) Xylose nach 10 h Wachstum. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
  • 6 zeigt das Wachstumsverhalten des B. megaterium-Stammes DSMZ509-pWH1520 (-+-) und DSMZ509-pHBasHemZ (-!-) in Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle und dem Zusatz von 298 μM ALA und 250 μM CoCl2 unter aeroben Wachstumsbedingungen. Induktion erfolgte durch Zugabe von 0.5 (w/v) Xylose bei einer OD578 von 2. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
  • 7 zeigt den Gehalt von Vitamin B12 in μg/l·OD unter aeroben Wachstumsbedingungen von B. megaterium DSMZ509 (1), DSMZ509-pWH1520-cobA (2) und DSMZ509 mit integriertem pHBiHemAKK (3) in LB-Medium, gemessen mit einem ELISA-Test. Induktion erfolgte mit 0.5 % (w/v) Xylose nach 5 h Wachstum; die Zellernte nach 10 h Wachstum.
    1 = DSMZ509
    2 = DSMZ509-pWH1520-cobA
    3 = DSMZ509 mit integriertem pHBiHemAKK
  • 8 zeigt den Gehalt von Vitamin B12 in μg/l unter aeroben Wachstumsbedingungen von B. megaterium DSMZ509 (1), DSMZ509-pWH1520-cobA (2) und DSMZ509 mit integriertem pHBiHemAKK (3) in LB-Medium, gemessen mit einem ELISA-Test. Induktion erfolgte mit 0.5 % (w/v) Xylose nach 5 h Wachstum; die Zellernte nach 10 h Wachstum.
    1 = DSMZ509
    2 = DSMZ509-pWH1520-cobA
    3 = DSMZ509 mit integriertem pHBiHemAKK
  • 9 die Vitamin B12-Produktion im Transferexperiment von 8. megaterium DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle gemessen mit einem ELISA-Test. Induktion erfolgte mit 0.5 % (w/v) Xylose nach 9 h (1, 2, 5, 6,) bzw. 10 h (3, 4, 7, 8) Wachstum. Der Transfer vom aeroben zum anaeroben fand eine Stunde nach der Induktion statt. Es ist der Gehalt an Vitamin B12 in μg pro Liter Bakterien-Kultur und OD578 angegeben.
    1 = DSMZ509-pWH1520 ohne Zusätze, 3 h nach Induktion.
    2 = DSMZ509-pHBasHemZ ohne Zusätze, 3 h nach Induktion.
    3 = DSMZ509-pWH1520 mit Zugabe von 250 μM CoCl2 und 298 μM ALA, 3 h nach Induktion.
    4 = DSMZ509-pHBasHemZ mit Zugabe von 250 μM CoCl2 und 298 μM ALA, 3 h nach Induktion.
    5 = DSMZ509-pWH1520 ohne Zusätze, 6 h nach Induktion.
    6 = DSMZ509-pHBasHemZ ohne Zusätze, 6 h nach Induktion.
    7 = DSMZ509-pWH1520 mit Zugabe von 250 μM CoCl2 und 298 μM ALA, 6 h nach Induktion.
    8 = DSMZ509-pHBasHemZ mit Zugabe von 250 μM CoCl2 und 298 μM ALA, 6 h nach Induktion.
  • 10 zeigt die Vitamin B12-Produktion im Transferexperiment von B. megaterium DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle gemessen mit einem ELISA-Test. Induktion erfolgte mit 0.5 % (w/v) Xylose nach 9 h (1, 2, 5, 6,) bzw. 10 h (3, 4, 7, 8) Wachstum. Der Transfer vom aeroben zum anaeroben fand eine Stunde nach der Induktion statt. Es ist der Gehalt an Vitamin B12 in μg pro Liter Bakterien-Kultur angegeben.
    1 = DSMZ509-pWH1520 ohne Zusätze, 3 h nach Induktion.
    2 = DSMZ509-pHBasHemZ ohne Zusätze, 3 h nach Induktion.
    3 = DSMZ509-pWH1520 mit Zugabe von 250 μM CoCl2 und 298 μM ALA, 3 h nach Induktion.
    4 = DSMZ509-pHBasHemZ mit Zugabe von 250 μM CoCl2 und 298 μM ALA, 3 h nach Induktion.
    5 = DSMZ509-pWH1520 ohne Zusätze, 6 h nach Induktion.
    6 = DSMZ509-pHBasHemZ ohne Zusätze, 6 h nach Induktion.
    7 = DSMZ509-pWH1520 mit Zugabe von 250 μM CoCl2 und 298 μM ALA, 6 h nach Induktion.
    8 = DSMZ509-pHBasHemZ mit Zugabe von 250 μM CoCl2 und 298 μM ALA, 6 h nach Induktion.
  • 11 zeigt die Vitamin B12-Produktion im Transferexperiment von B. megaterium DSMZ509, DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle. Der Transfer vom aeroben zum anaeroben fand eine Stunde nach der Induktion statt. Induktion erfolgte mit 0.5 (w/v) Xylose nach 9 h Wachstum. Es ist der Gehalt an Vitamin B12 pro Zellmasse in pmol/OD578 angegeben.
    1 = DSMZ509, zum Zeitpunkt der Induktion.
    2 = DSMZ509-pWH1520, zum Zeitpunkt der Induktion.
    3 = DSMZ509-pHBasHemZ, zum Zeitpunkt der Induktion.
    4 = DSMZ509, 3 h nach Induktion.
    5 = DSMZ509-pWH1520, 3 h nach Induktion.
    6 = DSMZ509-pHBasHemZ, 3 h nach Induktion.
    7 = DSMZ509, 6 h nach Induktion.
    8 = DSMZ509-pWH1520, 6 h nach Induktion.
    9 = DSMZ509-pHBasHemZ, 6 h nach Induktion.
  • 12 zeigt die Vitamin B12-Produktion im Transferexperiment von B. megaterium DSMZ509, DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle. Der Transfer vom aeroben zum anaeroben fand eine Stunde nach der Induktion statt. Induktion erfolgte mit 0.5 % (w/v) Xylose nach 9 h Wachstum. Es ist der Gehalt an Vitamin B12 in μg pro Liter Bakterien-Kultur angegeben.
    1 = DSMZ509, zum Zeitpunkt der Induktion.
    2 = DSMZ509-pWH1520, zum Zeitpunkt der Induktion.
    3 = DSMZ509-pHBasHemZ, zum Zeitpunkt der Induktion.
    4 = DSMZ509, 3 h nach Induktion.
    5 = DSMZ509-pWH1520, 3 h nach Induktion.
    6 = DSMZ509-pHBasHemZ, 3 h nach Induktion.
    7 = DSMZ509, 6 h nach Induktion.
    8 = DSMZ509-pWH1520, 6 h nach Induktion.
    9 = DSMZ509-pHBasHemZ, 6 h nach Induktion.
  • 13 zeigt die Vitamin B12-Produktion im Transferexperiment von B. megaterium DSMZ509, DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle unter Zugabe von 298 μM ALA und 250 μM CoCl2. Der Transfer vom aeroben zum anaeroben fand eine Stunde nach der Induktion statt. Induktion erfolgte mit 0.5 % (w/v) Xylose nach 10 h Wachstum. Es ist der Gehalt an Vitamin B12 pro Zellmasse in pmol/OD578 angegeben.
    1 = DSMZ509, zum Zeitpunkt der Induktion.
    2 = DSMZ509-pWH1520, zum Zeitpunkt der Induktion.
    3 = DSMZ509-pHBasHemZ, zum Zeitpunkt der Induktion.
    4 = DSMZ509, 3 h nach Induktion.
    5 = DSMZ509-pWH1520, 3 h nach Induktion.
    6 = DSMZ509-pHBasHemZ, 3 h nach Induktion.
    7 = DSMZ509, 6 h nach Induktion.
    8 = DSMZ509-pWH1520, 6 h nach Induktion.
    9 = DSMZ509-pHBasHemZ, 6 h nach Induktion
  • 14 zeigt die Vitamin B12-Produktion im Transferexperiment von B. megaterium DSMZ509, DSMZ509-pWH1520 und DSMZ509-pHBasHemZ in Mopso-Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle unter Zugabe von 298 μM ALA und 250 μM CoCl2. Der Transfer vom aeroben zum anaeroben fand eine Stunde nach der Induktion statt. Induktion erfolgte mit 0.5 % (w/v) Xylose nach 10 h Wachstum. Es ist der Gehalt an Vitamin B12 in μg pro Liter Bakterien-Kultur angegeben.
    1 = DSMZ509, zum Zeitpunkt der Induktion.
    2 = DSMZ509-pWH1520, zum Zeitpunkt der Induktion.
    3 = DSMZ509-pHBasHemZ, zum Zeitpunkt der Induktion.
    4 = DSMZ509, 3 h nach Induktion.
    5 = DSMZ509-pWH1520, 3 h nach Induktion.
    6 = DSMZ509-pHBasHemZ, 3 h nach Induktion.
    7 = DSMZ509, 6 h nach Induktion.
    8 = DSMZ509-pWH1520, 6 h nach Induktion.
    9 = DSMZ509-pHBasHemZ, 6 h nach Induktion
  • 15 zeigt das Differenz-Fluoreszenzspektrum von B. megaterium DSMZ509-pHBasHemZ minus dem Fluoreszenzspektrum von DSMZ509-pWH1520 bei einer Anregung mit 409 nm. Die Emissionspeaks bei 579 nm und 618 nm zeigen Coproporphyrin III an und damit eine Anhäufung des Metaboliten in DSMZ509-pHBasHemZ im Vergleich zu DSMZ509-pWH1520.

Claims (33)

  1. Genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm enthaltend ein Gen hemA[KK] gemäß SEQ ID No. 4 kodierend für eine feedback-resistente Glutamyl-tRNA-Reduktase und/oder einen Teil der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 (hemZ) als antisense-RNA (ashemZ).
  2. Genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm nach Anspruch 1 enthaltend ein Gen hemA[KK] gemäß SEQ ID No. 4 organisiert in einem hemA[KK]XCDBL-Operon und/oder eine antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3.
  3. Genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem das hemA[KK]-Gen in das Chromosom des Bakteriums integriert ist.
  4. Genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm gemäß einem der Ansprüche 1-3, bei dem der Teil des hemZ-Gens als antisense-RNA (ashemZ) plasmidkodiert, in erhöhter Kopienzahl vorliegt.
  5. Genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm gemäß einem der Ansprüche 1-4, bei dem das hemA[KK]-Gen, organisiert in dem hemA[KK]XCDBL-Operon und/oder der Teil des hemZ-Gens als antisense-RNA (ashemZ) unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht.
  6. Genetisch veränderter Bacillus megaterium Stamm gemäß Anspruch 5, der als induzierbaren Promotor den xylA-Promotor aufweist.
  7. Integrativer Vektor enthaltend ein Gen hemA[KK] kodierend für eine feedback resistente Glutamyl-tRNA-Reduktase gemäß SEQ ID No. 4 sowie operativ damit verknüpfte Sequenzen zur induzierten Genexpression, Selektion, Replikation und/oder Integration in das Chromosom der Wirtszelle.
  8. Integrativer Vektor gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß er eine genetisch veränderte Nukleotidsequenz des hemA-Gens (hemA[KK]) enthält, die für eine feedback-resistente Glutamyl-tRNA-Synthase kodiert, deren Aminosäuresequenz eine Insertion von wenigstens zwei positiv geladenen Aminosäuren aufweist.
  9. Integrativer Vektor gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er eine genetisch veränderte Nukleotidsequenz des hemA-Gens (hemA[KK]) aufweist, die für eine feedback-resistente Glutamyl-tRNA-Synthase kodiert, deren Aminosäuresequenz an Position 3 und 4 des N-Terminus eine Insertion von zwei positiv geladenen Aminosäuren aufweist.
  10. Integrativer Vektor gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die insertierten positiv geladenen Aminosäuren Lysin sind.
  11. Integrativer Vektor gemäß einem der Ansprüche 7-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Genexpression unter der Kontrolle des xylA-Promotors steht.
  12. Integrativer Vektor gemäß einem der Ansprüche 7-11, dadurch gekennzeichnet, daß er wenigstens einen temperatursensitiven Replikationsursprung aufweist.
  13. Integrativer Vektor gemäß einem der Ansprüche 7-12, dadurch gekennzeichnet, daß er den temperatursensitiven Replikationsursprung pE194ts aufweist.
  14. Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 kodierend für eine Coproporphyrinogen-III-Oxidase.
  15. Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie zu dem für eine Coproporphyrinogen-III-Oxidase kodierenden Bereich des hemZ-Gens vorgeschaltete und/oder nachgeschaltete Sequenzen mit regulatorischer Funktion enthält.
  16. Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Bacillus megaterium stammt.
  17. Coproporphyrinogen-III-Oxidase mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2.
  18. Coproporphyrinogen-III-Oxidase gemäß Anspruch 17 kodiert durch eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 14-16.
  19. Vektor enthaltend einen Teil der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 (hemZ) als antisense-RNA (ashemZ) sowie operativ damit verknüpft Sequenzen zur induzierten Genexpression, Selektion, Replikation und/oder Integration in das Chromosom der Wirtszelle.
  20. Vektor gemäß Anspruch 19 enthaltend eine antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 sowie operativ damit verknüpft Sequenzen zur induzierten Genexpression, Selektion, Replikation und/oder Integration in das Chromosom der Wirtszelle.
  21. Vektor gemäß einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Genexpression unter der Kontrolle des xylA-Promotors steht.
  22. Vektor gemäß einem der Ansprüche 19-21, dadurch gekennzeichnet, daß er wenigstens einen temperatursensitiven Replikationsursprung aufweist.
  23. Vektor gemäß einem der Ansprüche 19-22, dadurch gekennzeichnet, daß er den temperatursensitiven Replikationsursprung pE194ts aufweist.
  24. Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 mittels einer Kultur enthaltend einen genetisch veränderten Bacillus megaterium Stamm gemäß einem der Ansprüche 1-6, wobei die Fermentation unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird.
  25. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des hemA[KK]XCDBL-Operons und/oder die Expression der für eine antisense-RNA des hemZ-Gens kodierende Nukleotidsequenz (ashemZ) durch Zugabe von Xylose zum Fermentationsmedium induziert wird.
  26. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des hemA[KK]XCDBL-Operons gemäß SEQ ID No. 4 und/oder die Expression der für eine antisense-RNA des hemZ-Gens kodierende Nukleotidsequenz (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 durch die Zugabe von Xylose zum Fermentationsmedium induziert wird.
  27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24-26, dadurch gekennzeichnet, daß in der exponentiellen Wachstumsphase der aerob fermentierten Zellen ein Übergang von aeroben zu anaeroben Fermentationsbedingungen erfolgt.
  28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24-27, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium wenigstens Cobalt und/oder 5-Aminolävulinsäure zugegeben wird.
  29. Verwendung einer Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 14-16 zur Herstellung einer antisense-RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3.
  30. Verwendung einer antisense RNA (ashemZ) gemäß SEQ ID No. 3 zur Herstellung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 19-23.
  31. Verwendung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 19-23 zur Herstellung eines genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes gemäß einem der Ansprüche 1-6.
  32. Verwendung des integrativen Vektors gemäß einem der Ansprüche 7-13 zur Herstellung eines genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes gemäß einem der Ansprüche 1-6.
  33. Verwendung eines genetisch veränderten Bacillus megaterium Stammes gemäß einem der Ansprüche 1-6 zur Herstellung von Vitamin B12.
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