DE112007002880T5

DE112007002880T5 - Verfahren zur Herstellung von Hydroxytyrosol

Info

Publication number: DE112007002880T5
Application number: DE112007002880T
Authority: DE
Inventors: Jihane Achkar; Abel Ferrandez
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2006-11-27
Filing date: 2007-11-27
Publication date: 2009-10-29
Also published as: US20100143990A1; WO2008064837A2; WO2008064835A1; DE112007002823T5; WO2008064839A3; WO2008064837A3; US20100047887A1; WO2008064839A2; US20100068775A1; WO2008064837A8; DE112007002868T5

Abstract

Verfahren Herstellung von Hydroxytyrosol aus Tyrosol, das die Zugabe von Tyrosol oder einer Tyrosol-enthaltenden Zusammensetzung zu einem Reaktionsgemisch, enthaltend einen Mikroorganismus, der Tyrosol hydroxylieren kann, oder zu einem Reaktionsgemisch, enthaltend ein Enzym, erzeugt aus besagtem Mikroorganismus, der das Wasserstoffatom an Stellung 3 in eine Hydroxylgruppe umwandeln kann, umfasst.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf genetisch veränderte Mikroorganismen und deren Verwendung für die direkte Herstellung von Hydroxytyrosol (2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-ethanol) aus Tyrosol(2-(4-Hydroxyphenyl)ethanol). Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung von Polynucleotiden und Polypeptiden als biotechnologische Werkzeuge bei der Herstellung von Hydroxytyrosol aus Mikroorganismen, wobei die Polynucleotide und/oder codierten Polypeptide einen direkten oder indirekten Einfluss auf Ausbeute, Produktion und/oder Produktionseffizienz des Fermentationsproduktes haben.
Hydroxytyrosol (hierin nachstehend Hy-T genannt) ist ein wirksames Antioxidationsmittel, das in Oliven zu finden ist, folglich in großer Anzahl in Abwässern einer Olivenmühle vorliegt. Hy-T wurde im Mittelmeerraum mit geringerer Sterblichkeit und geringerem Auftreten von Krebs in Verbindung gebracht, und ihm wurden kardioprotektive Eigenschaften zugeschrieben. Deshalb bestand erhöhtes Interesse an der Herstellung und Kommerzialisierung von Hy-T als Nahrungsergänzung.
Derzeit ist Hydroxytyrosol kommerziell lediglich in Form angereicherter Olivenextrakt erhältlich.
Verfahren für die chemische Synthese von Hy-T wurden beschrieben, diese machen jedoch von umweltschädlichen Produkten wie organischen Lösungsmitteln, starken Säuren, Hydriden und/oder Cyaniden Gebrauch. Daher wurden in den vergangenen Jahren andere Ansätze zur Herstellung von Hy-T unter Verwendung anderer Extraktionsverfahren und/oder Biotransformationen, die sowohl ökonomischer als auch ökologischer wären, untersucht.
Beispielsweise lehrt EP-A-1,623,960 die Gewinnung einer strukturanalogen Substanz von Hy-T wie Tyrosol aus Abwässern einer Olivenmühle mittels teurer Verfahrensweisen wie Mikrofiltration, Ultrafiltration, Nanofiltration und Umkehrosmose, gefolgt von Oxidation mit auf Schwermetall basierenden Katalysatoren. Ferner offenbart Bouzid O., et al. (Proc. Biochem. (2005) 40: 1855–1862) ein Verfahren zum Anreichern von Ölnebenprodukten in Hy-T durch deren Behandlung mit Zellen von Aspergillus niger, angereichert in Cinnamoyl esterasen. Verschiedene andere Beispiele für die Extraktion von Hy-T aus Olivenöl, Olivenbaumblättern oder Abwässern aus der Olivenölproduktion sind zu finden, wobei diese Verfahrensweisen bei schlechten Ausbeuten durchgeführt werden, teure Extraktionsverfahren und die Verwendung toxischer Verbindungen wie organischer Lösungsmittel oder Behandlungen mit gefährlichen starken Säuren erfordern.
Ferner offenbart WO/02/16628 ein Verfahren zur Umwandlung von Tyrosol in vitro unter Verwendung von gereinigter Pilztyrosinase. Die Hauptnachteile dieses enzymatischen Verfahrens sind die erhöhten Kosten eines gereinigten Enzyms sowie die intrinsische Instabilität von Enzymen, die aus ihrer natürlichen zellulären Umgebung isoliert werden. Des Weiteren sind die Reaktionsbedingungen in diesem Verfahren auf Phosphatlösungen, gepuffert auf pH 7, und die Verwendung von Raumtemperatur beschränkt, wobei von kostspieligen Proteinentfernungssystemen wie nach Molekülgröße unterscheidenden Membranen und Reinigungsverfahren Gebrauch gemacht wird, die auf Techniken wie HPLC basieren, die für industrielle Anwendungszwecke sehr teuer sind. Daher ist es wünschenswert, von Technologien Gebrauch zu machen, die einen breiteren Bereich an Reaktionsbedingungen für deren Anwendbarkeit bieten und selbst nicht auf die Verwendung gereinigter Pilztyrosinase beschränkt sind. Im Stand der Technik ist kein anderes Enzym als Pilztyrosinase zu finden, das organische Verbindungen wie beispielsweise Tyrosol in Hy-T umwandeln kann.
Schließlich wurde von der Fähigkeit, den Präkursor Tyrosol in Hydroxytyrosol umzuwandeln, bei einigen Mikroorganismen berichtet, es gab jedoch vorher keinen Bericht, der angibt, wie man die Fähigkeit von Mikroorganismen, Tyrosol in Hy-T umzuwandeln, erhöht. Ferner ist einer der Hauptnachteile der oben aufgeführten Ansätze die Verwendung unerwünschter menschlicher opportunistischer Krankheitserreger wie Pseudomonas aeruginosa (Allouche N., et al. Appl. Environ. Microbiol. (2004) 70: 2105–2109) oder Serratia marcensces (Allouche N., et al. J. Agric. Food Chem. (2005) 53: 6525–6530). Ferner wird beschrieben, dass diese Organismen nicht nur Tyrosol in Hy-T umwandeln können, sondern auch das kostspielige und sehr wertvolle Substrat Tyrosol als Kohlenstoffquelle verwenden, d. h., das Substrat und dessen Produkt Hy-T aus dem Kulturmedium entfernen können.
Überraschend ist nunmehr ein Verfahren zur Einführung einer Hydroxylgruppe an der 3-Stellung des aromatischen Kerns von Tyrosol unter Verwendung einer Reihe neuer nicht-pathogener Mikroorganismen gefunden worden.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Hy-T, welches die Zugabe von Tyrosol, einer aromatischen Verbindung, unsubstituiert an der 3-Stellung des aromatischen Ringes, zu einem Reaktionsgemisch, das einen Mikroorganismus enthält, der Enzymaktivitäten exprimiert, die Tyrosol an der 3-Stellung seines aromatischen Ringes hydroxylieren können, oder zu einem Reaktionsgemisch, das ein Enzym enthält, das von einem Mikroorganismus erzeugt wird, der das Wasserstoffatom an der 3-Stellung in eine Hydroxylgruppe umwandeln kann, umfasst.
Der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Mikroorganismus exprimiert Gene, die Enzyme codieren, die eine Hydroxylgruppe an der 3-Stellung des aromatischen Tyrosolringes einführen können, wobei der Mikroorganismus mindestens eine Polynucleotidsequenz gemäß SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 3, SEQ ID NR.: 5, SEQ ID NR.: 7 und SEQ ID NR.: 9 oder Varianten davon endogen trägt oder von dieser/diesen transfiziert oder transformiert wird.
Die Nucleotidsequenzen gemäß SEQ ID NR.: 1 und SEQ ID NR.: 3 entsprechen den hpaB- bzw. hpaC-Genen aus Escherichia coli W und exprimieren ein Zweikomponenten-Enzym, 4-Hydroxyphenylacetat-3-monooxygenase (HpaBC). Es wird berichtet, dass das HpaBC-Enzym eine Zweikomponenten-Flavin-abhängige Monooxygenase ist, die die Hydroxylierung von 4-Hydroxyphenylacetat zu 3,4-Dihydroxyphenylacetat katalysiert. Die große Komponente (HpaB), dargestellt von SEQ ID NR.: 2, ist eine reduzierte Flavin-nutzende Monooxygenase. Die kleine Komponente (HpaC), dargestellt von SEQ ID NR.: 4, ist eine Oxido-Reduktase, die die Flavinreduktion unter Verwendung von NAD(P)H als ein Reduktionsmittel katalysiert.
Die Nucleotidsequenzen gemäß SEQ ID NR.: 5 und SEQ ID NR.: 7 entsprechen Tyrosinaseenzymen aus Agaricus bisporus und codieren Enzyme, dargestellt durch SEQ ID NR.: 6 und SEQ ID NR.: 8. Die Nucleotidsequenz SEQ ID NR.: 9 entspricht einer Tyrosinase aus Pycnoporus sanguineus, die ein Enzym, dargestellt durch SEQ ID NR.: 10, codiert.
Auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist ferner die Bereitstellung eines Verfahrens zur Umwandlung des in natürlichen Quellen, wie zum Beispiel in natürlichen Pflanzenextrakten, bevorzugt Olivenextrakten, Olivensaft, Olivenwasser, Olivenvegetationswässern, Abwässern aus einer Olivenmühle und Gemischen davon oder Extrakten daraus, zu findenden Tyrosols in Hy-T unter Verwendung des oben beschriebenen Mikroorganismus. Bevorzugt führt ein solches Verfahren zu einer Erhöhung des Hy-T-Gehaltes (Anreicherung an Hy-T) der natürlichen Quellen, die anfänglich sowohl Tyrosol als auch Hy-T enthalten, durch die Verwendung des oben beschriebenen Mikroorganismus.
Ferner ist es auch ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus bereitzustellen, der gentechnisch verändert, beispielsweise durch solche Polynucleotid-(DNA-)Sequenzen oder Vektoren, die wie oben definierte Polynucleotide umfassen, transformiert wurde. Dies kann beispielsweise durch Überführen der Polynucleotide, wie hierin exemplarisch dargestellt, in eine rekombinante oder nicht rekombinante Wirtszelle, die ein endogenes Äquivalent des entsprechenden Gens enthalten kann oder nicht, erreicht werden.
Eine solche transformierte Zelle ist auch ein Gegenstand der Erfindung.
Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung werden aus den anhängenden Ansprüchen offensichtlich. Diese und andere Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sollten Fachleuten aus den Lehren hierin ersichtlich sein.
Wie hierin verwendet, ist unter „verbessert” oder „verbesserte Ausbeute von Hy-T” oder „höhere Ausbeute” oder „verbessertes Biokonversionsverhältnis” oder „höheres Biokonversionsverhältnis”, verursacht durch eine genetische Veränderung, eine Erhöhung von mindestens 5%, 10%, 25%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200% oder sogar mehr als 500% im Vergleich zu einer Zelle, die nicht genetisch verändert wurde, zu verstehen. Solche unveränderten Zellen werden oft auch als Wildtypzellen bezeichnet.
Unter dem Ausdruck „genetisch verändert” oder „gentechnisch verändert” ist jedes Mittel zur Veränderung des genetischen Materials eines lebenden Organismus zu verstehen. Er kann die Herstellung und Verwendung rekombinanter DNA involvieren, es sind jedoch auch andere Verfahren verfügbar und einem Fachmann zur Erzeugung genetisch veränderter Mikroorganismen bekannt, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf chemische Behandlungen oder Aussetzung UV- oder Röntgenstrahlung. Insbesondere wird er verwendet, um den gentechnisch veränderten oder modifizierten Organismus von natürlich vorkommenden Organismen abzugrenzen. Gentechnik kann mittels einer Vielzahl in der Technik bekannter Verfahren durchgeführt werden, wie z. B. Genersatz, Genamplifikation, Genunterbrechung, Transfektion, Transformation unter Verwendung von Plasmiden, Viren oder anderen Vektoren. Ein genetisch modifizierter Organismus, z. B. genetisch modifizierter Mikroorganismus, wird auch oft als ein rekombinanter Organismus, z. B. rekombinanter Mikroorganismus, bezeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Polynucleotid, das ein Protein, ausgewählt aus der oben definierten Gruppe, codiert, in einen rekombinanten oder nicht-rekombinanten Mikroorganismus – nachstehend auch als Wirtszelle bezeichnet – so überführt, dass im Vergleich zu dem Wildtypgegenstück dieser Zelle eine verbesserte Ausbeute und/oder Herstellungseffizienz für Hy-T, produziert von der Wirtszelle, herhalten wird.
Jede Zelle, die als Empfänger für die fremden Nucleotidsäuremoleküle dient, kann als Wirtszelle verwendet werden, wie beispielsweise eine Zelle, die einen replizierbaren Expressionsvektor oder Klonierungsvektor trägt, oder eine Zelle, die durch allgemein bekannte Verfahren gentechnisch verändert oder genetisch verändert wurde, so dass sie (ein) gewünschte(s) Gen(e) an ihren/ihrem Chromosom(en) oder Genom enthält. Die Wirtszelle kann prokaryotischen oder eukaryotischen Ursprungs sein, wie beispielsweise Bakterienzellen, Tierzellen, einschließlich menschlichen Zellen, Pilzzellen, einschließlich Hefezellen, und Pflanzenzellen. Vorzugsweise ist die Wirtszelle ein Mikroorganismus. Stärker bevorzugt gehört der Mikroorganismus zu Bakterien. Der Ausdruck Bakterien umfasst sowohl Gram-negative als auch Gram-positive Mikroorganismen. Beispiele Gram-negativer Bakterien sind beispielsweise jegliche der Gattungen Escherichia, Gluconobacter, Rhodobacter, Pseudomonas und Paracoccus. Gram-positive Bakterien sind aus jeglichen der Familien Bacillaceae, Brevibacteriaceae, Corynebacteriaceae, Lactobacillaceae und Streptococcaceae ausgewählt, jedoch nicht darauf beschränkt, und gehören insbesondere zu den Gattungen Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Lactobacillus, Lactococcus und Streptomyces. Unter der Gattung Bacillus sind B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis und B. pumilus bevorzugte Mikroor ganismen im Kontext der vorliegenden Erfindung. Unter Gluconobacter, Rhodobacter und Paracoccus sind die Gattungen G. oxydans, R. sphaeroides bzw. P. zeaxanthinifaciens bevorzugt.
Beispiele von Hefen sind Saccharomyces, insbesondere S. cerevisiae. Beispiele anderer bevorzugter Pilze sind Aspergillus niger und Penicillium chrysogenum.
Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können öffentlich von verschiedenen Quellen zugänglich sein, z. B. Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Deutschland, American Type Culture Collection (ATCC), P. O. Box 1549, Manassas, VA 20108 USA oder Culture Collection Division, NITE Biological Resource Center, 2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, 292-0818, Japan (ehemals: Institute for Fermentation, Osaka (IFO), 17–85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532-8686, Japan).
Bevorzugte Beispiele von Mikroorganismen gemäß der Erfindung leiten sich von dem Stamm Escherichia coli K-12 TOP10 ab, der von Invitrogen erhältlich ist.
Die Umwandlung des Substrats Tyrosol in Hy-T in Verbindung mit dem obigen Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus bedeutet, dass die Umwandlung des Substrats, die zu Hy-T führt, durch den Mikroorganismus durchgeführt wird, d. h., das Substrat kann direkt in Hy-T umgewandelt werden. Der Mikroorganismus wird unter Bedingungen, die eine solche Umwandlung aus dem Substrat gestatten, wie oben definiert, kultiviert.
Ein Medium, wie hierin für das obige Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus verwendet, kann irgendein geeignetes Medium für die Herstellung von Hy-T sein. Typischerweise ist das Medium ein wässeriges Medium, umfassend beispielsweise Salze, Substrat(e) und einen bestimmten pH. Das Medium, in dem das Substrat Tyrosol in Hy-T umgewandelt wird, wird auch als das Produktionsmedium bezeichnet.
„Fermentation” oder „Herstellung” oder „Fermentationsverfahren” oder „Biotransformation” oder „Biokonversion” oder „Umwandlung”, wie hierin verwendet, kann die Verwendung wachsender Zellen unter Verwendung irgendeines Kultivierungsmediums, irgendwelcher Bedingungen und Verfahren, die einem Fachmann bekannt sind, oder die Verwendung nicht wachsender, sogenannter ruhender Zellen, nachdem sie unter Verwendung irgendeines Wachstumsmediums, irgendwelcher Bedingungen und Verfahren, die einem Fachmann bekannt sind, kultiviert wurden, unter entsprechenden Bedingungen für die Umwandlung geeigneter Substrate in gewünschte Produkte wie Hy-T sein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich ruhende Zellen auf Zellen eines Mikroorganismus, die beispielsweise lebensfähig sind, jedoch aufgrund des Fehlens eines essenziellen Nährstoffes in dem Medium nicht aktiv wachsen, oder die bei niedrigen spezifischen Wachstumsraten [μ], beispielsweise Wachstumsraten, die kleiner als 0,02 h^–1, vorzugsweise kleiner als 0,01 h^–1, sind, wachsen. Man sagt, dass Zellen, die die obigen Wachstumsraten zeigen, sich in einem „ruhenden Zellmodus” befinden. Mikroorganismen im ruhenden Zellmodus können als Zellsuspensionen in einem flüssigen Medium, sei es wässerig, organisch oder ein Gemisch aus wässerigen und organischen Lösungsmitteln; oder als ausgeflockte oder immobilisierte Zellen auf einer festen Phase, sei es eine poröse oder polymere Matrix, verwendet werden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in verschiedenen Schritten oder Phasen durchgeführt werden. In einem Schritt, als Schritt (a) oder Wachstumsphase bezeichnet, kann der Mikroorganismus unter Bedingungen kultiviert werden, die sein Wachstum ermöglichen. In einem anderen Schritt, auch als Schritt (b) oder Übergangsphase bezeichnet, können die Kultivierungsbedingungen modifiziert werden, so dass die Wachstumsrate des Mikroorganismus sinkt, bis ein ruhender Zellmodus erreicht ist. In noch einem anderen Schritt, auch als Schritt (c) oder Produktionsphase bezeichnet, wird Hy-T aus einem Substrat in Gegenwart des Mikroorganismus erzeugt. In Verfahren, in denen ruhende Zellen verwendet werden, folgen auf Schritt (a) typischerweise die Schritte (b) und (c). In Verfahren, in denen wachsende Zellen verwendet werden, folgt auf Schritt (a) typischerweise Schritt (c).
Die Wachstums- und Produktionsphasen, wie in dem obigen Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus durchgeführt, können in demselben Behälter, d. h., nur in einem Behälter, oder in zwei oder mehr verschiedenen Behältern mit einem optionalen Zelltrennungsschritt zwischen den beiden Phasen durchgeführt werden. Das hergestellte Hy-T kann aus den Zellen durch jegliche geeigneten Mittel gewonnen werden. Gewinnung bedeutet beispielsweise, dass das hergestellte Hy-T von dem Produktionsmedium getrennt werden kann. Gege benenfalls kann das so hergestellte Hy-T weiter verarbeitet werden. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung, die sich auf das obige Verfahren bezieht, werden die Ausdrücke „Wachstumsphase”, „wachsender Schritt”, „Wachstumsschritt” und „Wachstumsperiode” hierin austauschbar verwendet. Selbiges trifft auch auf die Ausdrücke „Produktionsphase”, „Herstellungsschritt”, „Produktionszeitraum” zu.
Ein Weg zur Durchführung des obigen Verfahrens kann ein Verfahren sein, bei dem der Mikroorganismus in einem ersten Behälter, dem sogenannten Wachstumsbehälter, als eine Quelle für die ruhenden Zellen gezüchtet wird und zumindest ein Teil der Zellen in einen zweiten Behälter, den sogenannten Produktionsbehälter, überführt wird. Die Bedingungen in dem Produktionsbehälter können derart sein, dass die Zellen, die aus dem Wachstumsbehälter überführt wurden, ruhende Zellen werden, wie oben definiert. Hy-T wird in dem zweiten Behälter hergestellt und daraus gewonnen.
In Verbindung mit dem obigen Verfahren kann der Wachstumsschritt in einem wässerigen Medium, d. h. dem Wachstumsmedium, ergänzt mit entsprechenden Nährstoffen für ein Wachstum unter aeroben Bedingungen, durchgeführt werden. Die Kultivierung kann beispielsweise in Batch-, Fed-batch, halbkontinuierlicher oder kontinuierlicher Weise durchgeführt werden. Der Kultivierungszeitraum kann in Abhängigkeit der Art der Zellen, pH, Temperatur und zu verwendendem Nährmedium variieren, und kann beispielsweise etwa 10 h bis etwa 10 Tage, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 10 Tage, stärker bevorzugt etwa 1 bis etwa 5 Tage bei Betrieb in Batch- oder Fed-batch-Weise betragen, in Abhängigkeit des Mikroorganismus. Werden die Zellen auf kontinuierliche Weise gezüchtet, wird die Verweilzeit in Abhängigkeit des Mikroorganismus beispielsweise etwa 2 bis etwa 100 h, vorzugsweise etwa 2 bis etwa 50 h betragen. Ist der Mikroorganismus aus Bakterien ausgewählt, kann die Kultivierung beispielsweise bei einem pH von etwa 3,0 bis etwa 9,0, vorzugsweise etwa 4,0 bis etwa 9,0, stärker bevorzugt etwa 4,0 bis etwa 8,0, noch stärker bevorzugt etwa 5,0 bis etwa 8,0 durchgeführt werden. Werden Algen oder Hefe verwendet, kann die Kultivierung beispielsweise bei einem pH unter etwa 7,0, vorzugsweise unter etwa 6,0, stärker bevorzugt unter etwa 5,5 und am stärksten bevorzugt unter etwa 5,0 durchgeführt werden. Ein geeigneter Temperaturbereich zur Durchführung der Kultivierung unter Verwendung von Bakterien kann beispielsweise etwa 13°C bis etwa 40°C, vorzugsweise etwa 18°C bis etwa 37°C, stärker bevorzugt etwa 13°C bis etwa 36°C und am stärksten bevorzugt etwa 18°C bis etwa 33°C sein. Werden Algen oder Hefe verwendet, kann ein geeigneter Temperaturbereich für die Durchführung der Kultivierung beispielsweise etwa 15°C bis etwa 40°C, vorzugsweise etwa 20°C bis etwa 45°C, stärker bevorzugt etwa 25°C bis etwa 40°C, noch stärker bevorzugt etwa 25°C bis etwa 38°C und am stärksten bevorzugt etwa 30°C bis etwa 38°C sein. Das Kulturmedium für das Wachstum kann gewöhnlich Nährstoffe wie assimilierbare Kohlenstoffquellen, z. B. Glycerol, D-Mannitol, D-Sorbitol, L-Sorbose, Erythritol, Ribitol, Xylitol, Arabitol, Inositol, Dulcitol, D-Ribose, D-Fructose, Saccharose und D-Glucose oder Gemisch und davon abgeleitete Polymere, wie Maltose oder Stärke und dergleichen, vorzugsweise L-Sorbose, D-Glucose, D-Sorbitol, D-Mannitol und Glycerol; und aufschließbare Stickstoffquellen wie organische Substanzen, z. B. Pepton, Hefeextrakt und Aminosäuren, enthalten. Die Medien können mit oder ohne Harnstoff und/oder Maisquellwasser und/oder Bäckerhefe vorliegen. Verschiedene anorganische Substanzen können auch als Stickstoffquellen verwendet werden, z. B. Nitrate und Ammoniumsalze. Ferner kann das Wachstumsmedium gewöhnlich anorganische Salze, z. B. Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Kupfer(II)-sulfat, Kaliumphosphat, Natriumphosphat und Calciumcarbonat, enthalten.
In Verbindung mit dem obigen Verfahren betragen die spezifischen Wachstumsraten beispielsweise mindestens 0,02 h^–1. Für Zellen, die in Batch-, Fed-batch- oder halbkontinuierlicher Weise wachsen, hängt die Wachstumsrate beispielsweise von der Zusammensetzung des Wachstumsmediums, dem pH, der Temperatur und dergleichen ab. Im Allgemeinen können die Wachstumsraten beispielsweise im Bereich von etwa 0,05 bis etwa 0,2 h^–1, vorzugsweise etwa 0,06 bis etwa 0,15 h^–1 und am stärksten bevorzugt etwa 0,07 bis etwa 0,13 h^–1 liegen.
In einem anderen Aspekt des obigen Verfahrens können ruhende Zellen durch Kultivieren des entsprechenden Mikroorganismus auf Agarplatten, die folglich als Wachstumsbehälter dienen, unter Verwendung im Wesentlichen derselben Bedingungen, z. B. Kultivierungszeitraum, pH, Temperatur, Nährmedium, wie oben beschrieben, unter Zugabe von Agar bereitgestellt werden.
Werden die Wachstums- und Produktionsphase in zwei separaten Behältern durchgeführt, dann können die Zellen aus der Wachstumsphase geerntet oder konzentriert und in einen zweiten Behälter, den sogenannten Produktionsbehälter, überführt werden. Dieser Behälter kann ein wässeriges Medium, ergänzt mit irgendeinem geeigneten Produktionssubstrat, das von den Zellen in Hy-T umgewandelt werden kann, enthalten. Zellen aus dem Wachstumsbehälter können durch irgendein geeignetes Verfahren, wie beispielsweise Zentrifugation, Membran-Kreuzstrom-Ultrafiltration oder -Mikrofiltration, Filtration, Dekantierung, Ausflockung, geerntet oder konzentriert werden. Die so erhaltenen Zellen können in den Produktionsbehälter auch in Form der ursprünglichen Nährlösung aus dem Wachstumsbehälter, ohne dass sie geerntet, konzentriert oder gewaschen werden, d. h., in Form einer Zellsuspension, überführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen aus dem Wachstumsbehälter in den Produktionsbehälter in Form einer Zellsuspension ohne irgendeinen Wasch- oder Isolationsschritt dazwischen überführt. Werden die Wachstums- und Produktionsphase in demselben Behälter durchgeführt, können die Zellen unter entsprechenden Bedingungen zu der gewünschten Zelldichte gezüchtet werden, gefolgt von einem Austausch des Wachstumsmediums gegen das Produktionsmedium, das das Produktionssubstrat enthält. Ein solcher Austausch kann beispielsweise das Einspeisen des Produktionsmediums in den Behälter zur selben Zeit und bei derselben Rate wie der Abzug oder das Ernten des Überstandes aus dem Behälter sein. Um die ruhenden Zellen in dem Behälter zu halten, können Verfahren für das Zellrecycling oder die Zellretention, wie beispielsweise Zellrecyclingschritte, verwendet werden. Solche Recyclingschritte umfassend beispielsweise, sind jedoch nicht beschränkt auf Verfahren unter Verwendung von Zentrifugen, Filtern, Membran-Kreuzstrom-Mikrofiltrations- oder -Ultrafiltrationsschritten, Membranreaktoren, Ausflockung oder Zellimmobilisierung in entsprechenden porösen, nicht porösen oder polymeren Matrizes. Nach einer Übergangsphase wird der Behälter auf Verfahrensbedingungen gebracht, unter denen sich die Zellen in einem ruhenden Zellmodus befinden, wie oben definiert, und das Produktionssubstrat wird effizient in Hy-T umgewandelt.
Alternativ könnten die Zellen zur Herstellung von Hy-T im Wachstumsmodus verwendet werden, wie bei der teilweisen Umwandlung eines gegebenen Substrats in Hy-T, während es teilweise als Kohlenstoffquelle verwendet wird. Die Zellen können als wachsende Zellen verwendet werden, indem eine Kohlenstoffquelle und ein in Hy-T umzuwandelndes Substrat oder Kombinationen von diesen zugeführt werden. Die Zellen können auch durch die Zugabe externer organischer Verbindungen (Induktoren) verändert werden, so dass sie die erforderlichen Aktivitäten bei der Induktion exprimieren können.
Das wässerige Medium in dem Produktionsbehälter, wie es für den Herstellungsschritt in Verbindung mit dem obigen Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus verwendet wird, hierin nachstehend Produktionsmedium genannt, kann lediglich das in Hy-T umzuwandelnde Produktionssubstrat enthalten oder kann beispielsweise weitere anorganische Salze, z. B. Natriumchlorid, Calciumchlorid, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Calciumphosphat und Calciumcarbonat, enthalten. Das Produktionsmedium kann auch aufschließbare Stickstoffquellen wie beispielsweise organische Substanzen, z. B. Pepton, Hefeextrakt, Harnstoff, Aminosäuren und Maisquellwasser, und anorganische Substanzen, z. B. Ammoniak, Ammoniumsulfat und Natriumnitrat, bei solchen Konzentrationen enthalten, dass die Zellen in einem ruhenden Zellmodus gehalten werden, wie oben definiert. Das Medium kann mit oder ohne Harnstoff und/oder Maisquellwasser und/oder Bäckerhefe vorliegen. Der Herstellungsschritt kann beispielsweise in Batch-, Fed-batch-, halbkontinuierlicher oder kontinuierlicher Weise durchgeführt werden. Im Falle des Fed-batch-, halbkontinuierlichen oder kontinuierlichen Modus können sowohl Zellen aus dem Wachstumsbehälter als auch das Produktionsmedium kontinuierlich oder periodisch in den Produktionsbehälter bei entsprechenden Einspeiseraten eingespeist werden. Alternativ kann nur das Produktionsmedium kontinuierlich oder periodisch in den Produktionsbehälter eingespeist werden, während die Zellen, die aus dem Wachstumsbehälter stammen, auf einmal in den Produktionsbehälter überführt werden. Die Zellen, die aus dem Wachstumsbehälter stammen, können als eine Zellsuspension innerhalb des Produktionsbehälters verwendet werden, oder können beispielsweise als ausgeflockte oder immobilisierte Zellen in irgendeiner festen Phase wie porösen oder polymeren Matrizes verwendet werden. Der Produktionszeitraum, definiert als Zeitspanne, die zwischen dem Eintritt des Substrats in den Produktionsbehälter und der Ernte des Überstandes, enthaltend Hy-T, dem sogenannten Erntestrom, vergeht, kann in Abhängigkeit von beispielsweise der Art und Konzentration der Zellen, pH, Temperatur und zu verwendendem Nährmedium variieren und beträgt vorzugsweise etwa 2 bis etwa 100 h. Der pH und die Temperatur können sich von dem pH und der Temperatur des Wachstumsschrittes unterscheiden, sind aber im Wesentlichen dieselben wie für den Wachstumsschritt.
In einer Ausführungsform wird der Herstellungsschritt auf kontinuierliche Weise durchgeführt, worunter zu verstehen ist, dass ein erster Speisestrom, der die Zellen aus dem Wachstumsbehälter enthält, und ein zweiter Speisestrom, der das Substrat enthält, kontinuierlich oder periodisch in den Produktionsbehälter eingeführt werden. Der erste Strom kann entwe der nur die Zellen, die aus dem Wachstumsmedium isoliert/getrennt wurden, oder eine Zellsuspension, die direkt aus dem Wachstumsschritt stammt, d. h., Zellen, suspendiert in Wachstumsmedium, ohne irgendwelche Zwischenschritte der Zelltrennung, Waschen und/oder Isolieren und/oder Konzentrieren enthalten. Der zweite Speisestrom, wie hierin definiert, kann alle anderen Speiseströme enthalten, die für die Durchführung des Herstellungsschrittes notwendig sind, z. B. das Produktionsmedium, das das Substrat in Form eines oder mehrerer verschiedener Ströme umfasst, Wasser zur Verdünnung und Säure oder Base zur pH-Kontrolle.
In Verbindung mit dem obigen Verfahren kann, wenn beide Ströme kontinuierlich eingespeist werden, das Verhältnis der Einspeiserate des ersten Stroms zur Einspeiserate des zweiten Stroms zwischen etwa 0,01 und etwa 10, vorzugsweise zwischen etwa 0,01 und etwa 5, am stärksten bevorzugt zwischen etwa 0,02 und etwa 2, variieren. Dieses Verhältnis ist von der Konzentration der Zellen und dem Substrat in dem ersten bzw. zweiten Strom abhängig.
Ein anderer Weg zur Durchführung des obigen Verfahrens unter Verwendung eines Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung kann ein Verfahren unter Verwendung einer bestimmten Zelldichte der ruhenden Zellen in dem Produktionsbehälter sein. Die Zelldichte wird als Absorptionseinheiten (optische Dichte) bei 600 nm durch einem Fachmann bekannte Verfahren gemessen. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Zelldichte in dem Herstellungsschritt mindestens etwa 2, stärker bevorzugt zwischen etwa 2 und etwa 200, noch stärker bevorzugt zwischen etwa 10 und etwa 200, noch stärker bevorzugt zwischen etwa 15 und etwa 200, noch stärker bevorzugt zwischen etwa 15 und etwa 120, und am stärksten bevorzugt zwischen etwa 20 und etwa 120.
Um die Zellen in dem Produktionsbehälter während der Produktionsphase, wie sie beispielsweise in kontinuierlicher oder halbkontinuierlicher Weise durchgeführt wird, bei der gewünschten Zelldichte zu halten, können jegliche in der Technik bekannte Mittel verwendet werden, wie beispielsweise Zellrecycling durch Zentrifugation, Filtration, Membran-Kreuzstrom-Ultrafiltration oder -Mikrofiltration, Dekantierung, Ausflockung, Zellretention in dem Behälter durch Membranvorrichtungen oder Zellimmobilisierung. Ferner kann, wenn der Herstellungsschritt in kontinuierlicher oder halbkontinuierlicher Weise durchgeführt wird und die Zellen kontinuierlich oder periodisch aus dem Wachstumsbehälter eingespeist werden, die Zelldichte in dem Produktionsbehälter bei einem konstanten Niveau gehalten werden, indem beispielsweise eine Menge an Zellen aus dem Produktionsbehälter geerntet wird, die der Menge an Zellen entspricht, die aus dem Wachstumsbehälter eingespeist werden.
In Verbindung mit dem obigen Verfahren wird das gewonnene Hy-T, das in dem sogenannten Erntestrom enthalten ist, aus dem Produktionsbehälter gewonnen/geerntet. Der Erntestrom kann beispielsweise zellfreie oder zellhaltige wässerige Lösung, die aus dem Produktionsbehälter stammt, enthalten, die Hy-T als ein Ergebnis der Umwandlung des Produktionssubstrats durch die ruhenden Zellen in dem Produktionsbehälter enthält. Zellen, die in dem Erntestrom noch vorhanden sind, können von dem Hy-T durch irgendwelche in der Technik bekannte Verfahren, wie beispielsweise Filtration, Zentrifugation, Dekantierung, Membran-Kreuzstrom-Ultrafiltration oder -Mikrofiltration, Tangentialfluss-Ultrafiltration oder -Mikrofiltration oder Dead-End-Filtration, getrennt werden. Nach diesem Zelltrennungsverfahren ist der Erntestrom im Wesentlichen frei von Zellen.
In einem weiteren Aspekt kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung mit weiteren Schritten der Trennung und/oder Reinigung des hergestellten Hy-T von anderen Komponenten, die in dem Erntestrom enthalten sind, d. h., sogenannten Aufarbeitungsverfahrensschritten, kombiniert werden. Diese Schritte können jegliche einem Fachmann bekannte Mittel umfassen, wie beispielsweise Konzentration, Extraktion, Kristallisation, Ausfällung, Adsorption, Ionenaustausch, Chromatographie, Destillation, Elektrodialyse, bipolare Membran-Elektrodialyse und/oder Umkehrosmose. Jegliche dieser Verfahrensweisen allein oder in Kombination stellen ein geeignetes Mittel zur Isolation und Reinigung des Produktes, d. h. Hy-T, dar. Das so erhaltene Produkt kann ferner in einer Weise wie z. B. durch Konzentration, Kristallisation, Ausfällung, Waschen und Trocknen isoliert und/oder ferner durch beispielsweise Behandlung mit Aktivkohle, Ionenaustausch und/oder Umkristallisieren gereinigt werden.
Polynucleotide, die Enzyme codieren, wie oben definiert, und deren Auswahl werden hierin nachstehend ausführlicher beschrieben. Unter dem Ausdruck „Gen”, wie hierin verwendet, ist ein Polynucleotid zu verstehen, das ein Protein codiert, wie oben definiert.
Die Erfindung umfasst die in SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 3, SEQ ID NR.: 5, SEQ ID NR.: 7 und SEQ ID NR.: 9 gezeigten Polynucleotide.
Die Erfindung umfasst außerdem Polynucleotide, die zu einer dieser Sequenzen im Wesentlichen homolog sind. In diesem Kontext sollte erwähnt werden, dass sich der Ausdruck „ein Polynucleotid, das im Wesentlichen homolog ist” auf eine Polynucleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

a) Polynucleotiden, die ein Protein codieren, umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR.: 2, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 6, SEQ ID NR.: 8 und SEQ ID NR.: 10;
b) Polynucleotiden, die ein Fragment oder Derivat eines Polypeptids, das von einem Polynucleotid nach (a) codiert wird, codieren, wobei in dem Derivat verglichen mit dem Polypeptid ein oder mehrere Aminosäurereste konservativ substituiert sind;
c) Polynucleotiden, deren komplementärer Strang unter stringenten Bedingungen zu einem Polynucleotid, wie in einem von (a) oder (b) definiert, hybridisiert;
d) Polynucleotiden, die zu mindestens 70%, wie 85, 90 oder 95%, homolog zu einem Polynucleotid, wie in einem von (a) bis (c) definiert, sind;
e) dem komplementären Strang eines Polynucleotids, wie in (a) bis (d) definiert, bezieht.

Die Erfindung umfasst auch Polypeptide, wie in SEQ ID NR.: 2, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 6, SEQ ID NR.: 8 und SEQ ID NR.: 10 gezeigt.
Die Erfindung umfasst außerdem Polypeptide, die zu einer dieser Aminosäuresequenzen im Wesentlichen homolog sind. In diesem Kontext sollte erwähnt werden, dass sich der Ausdruck „ein Polypeptid, das im Wesentlichen homolog ist” auf eine Polypeptidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

a) Polypeptiden, die eine Aminosäuresequenz umfassen, umfassend ein Fragment oder Derivat einer Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR.: 2, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 6, SEQ ID NR.: 8 und SEQ ID NR.: 10;
b) Polypeptiden, die eine Aminosäuresequenz umfassen, codiert durch ein Fragment oder Derivat einer Polynucleotidsequenz gemäß SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 3, SEQ ID NR.: 5, SEQ ID NR.: 7 und SEQ ID NR.: 9;
c) Polypeptiden, die zu mindestens 50%, wie 70, 80 oder 90%, homolog zu einem Polypeptid gemäß SEQ ID NR.: 2, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 6, SEQ ID NR.: 8 und SEQ ID NR.: 10 sind, bezieht.

Ein „isoliertes Nucleinsäurefragment” ist ein Nucleinsäurefragment, das als Fragment nicht natürlich vorkommt und im Naturzustand nicht zu finden wäre.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Ausdrücke „Polynucleotid”, „Gen” und „rekombinantes Gen” auf Nucleinsäuremoleküle, die aus chromosomaler oder Plasmid-DNA isoliert werden können oder durch synthetische Verfahren, welche ein offenes Leseraster (ORF), das ein wie oben veranschaulichtes Protein codiert, umfassen, generiert werden können. Ein Polynucleotid kann eine Polynucleotidsequenz oder Fragmente davon und Regionen upstream und downstream der Gensequenzen, die beispielsweise Promotorregionen, Regulatorregionen und Terminatorregionen umfassen können, die für die entsprechende Expression und Stabilisierung des davon abgeleiteten Polypeptids wichtig sind, umfassen.
Ein Gen kann codierende Sequenzen, nicht codierende Sequenzen, wie beispielsweise untranslatierte Sequenzen, die sich an den 3'- und 5'-Enden der codierenden Region eines Gens befinden, und regulatorische Sequenzen umfassen. Überdies bezieht sich ein Gen auf ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, wie hierin definiert. Ein Fachmann wird ferner erkennen, dass DNA-Sequenzpolymorphismus, der zu Veränderungen in den Aminosäuresequenzen des Proteins führt, innerhalb einer Genpopulation existieren kann. Ein solcher genetischer Polymorphismus in dem Gen kann unter Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation oder in Zellen aus unterschiedlichen Populationen existieren. Solche natürlichen Variationen können typischerweise zu einer 1- bis 5%igen Varianz in der Nucleotidsequenz des entsprechenden Gens führen. Jegliche und alle derartigen Nucleotidvariationen und der resultierende Aminosäurepolymorphismus sind das Ergebnis natürlicher Variation. Sie verändern die funktionelle Aktivität von Proteinen nicht, und folglich sollen sie im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen.
Wie hierin verwendet, sollen die Ausdrücke „Polynucleotid” oder „Nucleinsäuremolekül” DNA-Moleküle (z. B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z. B. mRNA) und Analoga der DNA oder RNA, die unter Verwendung von Nucleotidanaloga generiert wird, umfassen. Das Nucleinsäuremolekül kann einsträngig oder doppelsträngig sein, ist jedoch vorzugsweise doppelsträngige DNA. Die Nucleinsäure kann unter Verwendung von Oligonucleotidanaloga oder Derivaten (z. B. Inosin- oder Phosphorothioatnucleotiden) synthetisiert werden. Solche Oligonucleotide können beispielsweise verwendet werden, um Nucleinsäuren mit verändertem Basenpaarungsvermögen oder erhöhter Beständigkeit gegenüber Nucleasen herzustellen.
Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Nucleotidsequenzen, die hierin durch Sequenzieren eines DNA-Moleküls bestimmt wurden, unter Verwendung eines DNA-Sequenzierungsautomaten bestimmt, und wurden alle Aminosäuresequenzen von Polypeptiden, die von hierin bestimmten DNA-Molekülen codiert werden, durch Translation einer wie oben bestimmten DNA-Sequenz vorhergesagt. Folglich kann, wie in der Technik für jede DNA-Sequenz, die durch diesen automatisierten Ansatz bestimmt wird, bekannt ist, jede hierin bestimmte Nucleotidsequenz einige Fehler enthalten. Nucleotidsequenzen, die durch Automation bestimmt wurden, sind typischerweise zu mindestens 90%, noch typischer zu mindestens etwa 95% bis zu mindestens etwa 99,9% mit der tatsächlichen Nucleotidsequenz des sequenzierten DNA-Moleküls identisch. Die tatsächliche Sequenz kann durch andere Ansätze, einschließlich in der Technik allgemein bekannter manueller DNA-Sequenzierungsverfahren, noch genauer bestimmt werden. Wie in der Technik außerdem bekannt ist, wird eine einzelne Insertion oder Deletion in einer bestimmten Nucleotidsequenz im Vergleich zu der tatsächlichen Sequenz eine Rasterverschiebung bei der Translation der Nucleotidsequenz verursachen, so dass sich die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die von einer bestimmten Nucleotidsequenz codiert wird, vollständig von der Aminosäuresequenz unterscheiden wird, die tatsächlich von dem sequenzierten DNA-Molekül codiert wird, beginnend an dem Punkt einer solchen Insertion oder Deletion.
Ein Fachmann kann solche irrtümlicherweise identifizierten Basen identifizieren und weiß, wie solche Fehler zu korrigieren sind.
Homologe oder im Wesentlichen identische Gensequenzen können isoliert werden, beispielsweise, indem PCR unter Verwendung zwei degenerierter Oligonucleotid-Primer-Pools, die auf der Basis der Nucleotidsequenzen, wie hierin gelehrt, gestaltet wurden, durchgeführt wird.
Die Matrize für die Reaktion kann cDNA, erhalten durch Umkehrtranskription von mRNA, hergestellt aus Stämmen, die bekanntermaßen oder vermutlich ein Polynucleotid gemäß der Erfindung exprimieren, sein. Das PCR-Produkt kann subkloniert und sequenziert werden, um sicherzustellen, dass die amplifizierten Sequenzen die Sequenzen einer neuen Nucleinsäuresequenz, wie hierin beschrieben, oder ein funktionelles Äquivalent davon darstellen.
Das PCR-Fragment kann dann verwendet werden, um einen Volllängen-cDNA-Klon durch eine Vielzahl bekannter Verfahren zu isolieren. Beispielsweise kann das amplifizierte Fragment markiert und zum Screenen einer Bacteriophagen- oder Cosmid-cDNA-Bibliothek verwendet werden. Alternativ kann das markierte Fragment zum Screenen einer genomischen Bibliothek verwendet werden.
PCR-Technologie kann auch verwendet werden, um Volllängen-cDNA-Sequenzen aus anderen Organismen zu isolieren. Beispielsweise kann RNA gemäß Standardverfahrensweisen aus einer entsprechenden zellulären oder Gewebequelle isoliert werden. Eine Umkehrtranskriptionsreaktion kann an der RNA unter Verwendung eines Oligonucleotidprimers, der für das äußerste 5'-Ende des amplifizierten Fragments zum Primen der ersten Strangsynthese spezifisch ist, durchgeführt werden.
Der resultierende RNA/DNA-Hybride kann dann unter Verwendung einer terminalen Standardtransferasereaktion „angeschwänzt” werden (z. B. mit Guaninen), der Hybride kann mit RNaseH digeriert werden, und eine zweite Strangsynthese kann dann (z. B. mit einem Poly-C-Primer) geprimt werden. Folglich können cDNA-Sequenzen upstream des amplifizierten Fragments ohne weiteres isoliert werden. Für einen Überblick über verwendbare Klonierungsstrategien siehe z. B. Sambrook, et al. (Sambrook J. et al. „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor (NY, USA): Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001); und Ausubel et al. (Ausubel F. M. et al., „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons (NY, USA): John Wiley & Sons, 2007).
Homologe, im Wesentlichen identische Sequenzen, funktionelle Äquivalente und Orthologa von hierin veranschaulichten Genen und Proteinen, wie beispielsweise das Gen gemäß SEQ ID NR.: 1 und das codierte Protein gemäß SEQ ID NR.: 2, können aus einer Vielzahl unterschiedlicher Mikroorganismen erhalten werden. In diesem Kontext sollte erwähnt werden, dass auch die folgenden Abschnitte mutatis mutandis für alle anderen oben definierten Enzyme Anwendung finden.
Die Verfahrensweisen für die Isolation spezifischer Gene und/oder Fragmente davon werden hierin veranschaulicht. Demgemäß liegen Nucleinsäuren, die andere Familienmitglieder codieren, die folglich eine Nucleotidsequenz aufweisen, die sich von einer Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NR.: 1 unterscheidet, innerhalb des Umfangs der Erfindung. Überdies liegen Nucleinsäuren, die Proteine anderer Spezies codieren, die folglich eine Nucleotidsequenz aufweisen, die sich von einer in SEQ ID NR.: 1 gezeigten Nucleotidsequenz unterscheidet, innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Die Erfindung offenbart auch ein isoliertes Polynucleotid, das unter stringenten Bedingungen, vorzugsweise unter hochstringenten Bedingungen, zu einem Polynucleotid gemäß der vorliegenden Erfindung, wie beispielsweise einem in SEQ ID NR.: 1 gezeigten Polynucleotid, hybridisierbar ist. Vorteilhafterweise können solche Polynucleotide aus einem Mikroorganismus erhalten werden, der eine gegebene Kohlenstoffquelle direkt in Hy-T umwandeln kann.
Wie hierin verwendet, soll der Ausdruck „Hybridisieren” Bedingungen für Hybridisierung und Waschen beschreiben, unter denen Nucleotidsequenzen, die mindestens etwa 50%, mindestens etwa 60%, mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt mindestens etwa 80%, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 85% bis 90%, am stärksten bevorzugt mindestens 95% homolog zueinander sind, typischerweise miteinander hybridisiert bleiben.
Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel solcher Hybridisierungsbedingungen ist die Hybridisierung in 6× Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einer oder mehreren Wäschen in 1 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55°C, stärker bevorzugt bei 60°C und noch stärker bevorzugt bei 65°C.
Hochstringente Bedingungen umfassen beispielsweise 2 h bis 4 Tage Inkubation bei 42°C unter Verwendung einer Digoxigenin-(DIG-)-markierten DNA-Sonde (hergestellt durch die Verwendung eines DIG-Markierungssystems; Roche Diagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Deutschland) in einer Lösung wie DigEasyHyb-Lösung (Roche Diagnostics GmbH) mit oder ohne 100 mg/ml Lachssperma-DNA oder einer Lösung, umfassend 50% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 0,02% Natriumdodecylsulfat, 0,1% N-Lauroylsarcosin und 2% Blocking-Reagens (Roche Diagnostics GmbH), gefolgt von zweimaligem Waschen der Filter für 5 bis 15 Minuten in 2 × SSC und 0,1% SDS bei Raumtemperatur und dann zweimaligem Waschen für 15–30 Minuten in 0,5 × SSC und 0,1% SDS oder 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 65–68°C.
Ein Fachmann wird wissen, welche Bedingungen für stringente und hochstringente Hybridisierungsbedingungen anzuwenden sind. Eine weitere Orientierung in Bezug auf solche Bedingungen ist ohne weiteres in der Technik erhältlich, beispielsweise in Sambrook et al., (supra), Ausubel et al. (supra). Selbstverständlich wäre ein Polynucleotid, das nur an eine Poly(A)-Sequenz (wie den 3'-terminalen Poly(A)-Trakt von mRNAs) oder an einen komplementären Stretch von T- (oder U-) Resten hybridisiert, von einem Polynucleotid der Erfindung, das speziell zur Hybridisierung an einen Teil einer Nucleinsäure der Erfindung verwendet wird, nicht umfasst, da solch ein Polynucleotid an jedes Nucleinsäuremolekül, das ein Poly(A)-Stretch oder das Komplement davon enthält (z. B. praktisch jeden doppelsträngigen cDNA-Klon), hybridisieren würde.
Ein Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, wie beispielsweise ein in SEQ ID NR.: 1 gezeigtes Nucleinsäuremolekül oder ein Fragment oder Derivat davon, kann unter Verwendung von Standardmolekularbiologieverfahren und der hierin bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise können unter Verwendung des gesamten oder eines Teils der in SEQ ID NR.: 1 gezeigten Nucleinsäure als eine Hybridisierungssonde Nucleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung unter Verwendung von Standardhybridisierungsund -Klonierungsverfahren isoliert werden (z. B. wie in Sambrook et al. (supra) beschrieben).
Ferner können Oligonucleotide, die Nucleotidsequenzen gemäß der Erfindung entsprechen oder damit hybridisierbar sind, durch Standardsyntheseverfahren, z. B. unter Verwendung eines DNA-Syntheseautomaten, hergestellt oder durch Gensynthese erhalten werden, wie sie von Unternehmen, wie beispielsweise DNA2.0 (DNA2.0, Menlo Park, 94025 CA, USA), durchgeführt wird, basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzinformationen.
Die Ausdrücke „Homologie”, „identisch”, „Prozentidentität” oder „gleich” werden hierin austauschbar verwendet. Für die Zwecke dieser Erfindung wird hier definiert, dass zur Bestimmung der Prozentidentität von zwei Aminosäuresequenzen oder von zwei Nucleinsäuresequenzen die Sequenzen für optimale Vergleichszwecke ausgerichtet werden (z. B. können Gaps in die Sequenz einer ersten Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenz für eine optimale Ausrichtung mit einer zweiten Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenz eingeführt werden). Die Aminosäurereste oder Nucleotide an entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nucleotidpositionen werden dann verglichen. Ist eine Position in der ersten Sequenz von demselben Aminosäurerest oder Nucleotid besetzt, wie die entsprechende Position in der zweiten Sequenz, sind die Moleküle an dieser Position identisch. Die Prozentidentität zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl identischer Positionen, die von den Sequenzen geteilt werden (d. h., %-Identität = Anzahl an identischen Positionen/Gesamtanzahl an Positionen (d. h., überlappenden Positionen) × 100). Vorzugsweise haben die beiden Sequenzen dieselbe Länge.
Dem Fachmann wird die Tatsache bewusst sein, dass mehrere verschiedene Computerprogramme zur Bestimmung der Homologie zwischen zwei Sequenzen verfügbar sind. Beispielsweise können ein Vergleich von Sequenzen und die Bestimmung der Prozentidentität zwischen zwei Sequenzen unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Prozentidentität zwischen zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Needleman-Wunsch-Algorithmus (Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. (1970) 48: 443–453), der in das GAP-Programm in dem GCG-Softwarepaket (erhältlich bei http://www.accelrys.com) eingearbeitet wurde, unter Verwendung von entweder einer BLOSUM62-Matrix oder einer PAM250-Matrix und einem Gap-Gewicht von 16, 14, 12, 10, 8, 6 oder 4 und einem Längen-Gewicht von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bestimmt. Ein Fachmann wird erkennen, dass all diese unterschiedlichen Parameter etwas unterschiedliche Ergebnisse ergeben werden, dass jedoch die prozentuale Identität von zwei Sequenzen insgesamt nicht signifikant verändert wird, wenn unterschiedliche Algorithmen verwendet werden.
In noch einer anderen Ausführungsform wird die Prozentidentität zwischen zwei Nucleotidsequenzen unter Verwendung des GAP- oder ClustalW+-Programms in dem GCG-Softwarepaket (erhältlich bei http://www.accelrys.com) unter Verwendung einer NWSGAP DNA.CMP-Matrix und eines Gap-Gewichtes von 40, 50, 60, 70 oder 80 und eines Längen-Gewichtes von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bestimmt. In einer anderen Ausführungsform wird die Prozentidentität zwischen zwei Aminosäure- oder Nucleotidsequenzen unter Verwendung des Algorithmus von E. Meyers und W. Miller (Meyers und Miller, Comput. Appl. Biosci. (1989) 4: 11–17), der in das ALIGN-Programm (Version 2.0) (erhältlich bei http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) eingearbeitet wurde, unter Verwendung einer PAM120-Gewichtungstabelle (weight residue table), eines Lückenlängenwertes (Gap Length Penalty) von 12 und eines Lückenwertes (Gap Penalty) von 4 bestimmt.
Die Nucleinsäure- und Proteinsequenzen der vorliegenden Erfindung können ferner als eine „Abfragesequenz” verwendet werden, um eine Suche gegenüber öffentlichen Datenbanken durchzuführen, um beispielsweise andere Familienmitglieder oder verwandte Sequenzen zu identifizieren. Solche Recherchen können unter Verwendung des BLASTN- und BLASTP-Programms (Version 2.0) von Altschul, et al. (J. Mol. Biol. (1990) 215: 403–410) durchgeführt werden. BLAST-Nucleotid-Recherchen können mit dem BLASTN-Programm, Maßzahl = 100, Wortlänge = 12 durchgeführt werden, um Nucleotidsequenzen zu erhalten, die zu den Nucleinsäuremolekülen der vorliegenden Erfindung homolog sind. BLAST-Protein-Recherchen können mit dem BLASTP-Programm, Maßzahl = 50, Wortlänge = 3 durchgeführt werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die zu den Proteinmolekülen der vorliegenden Erfindung homolog sind. Um eine mit Lücken versehene Ausrichtung für Vergleichszwecke zu erhalten, kann Gapped BLAST eingesetzt werden, wie in Altschul et al., (Nucleic Acids Res. (1997) 25: 3389–3402) beschrieben. Werden das BLAST- und Gapped BLAST-Programm eingesetzt, können die Default-Parameter des entsprechenden Programms (z. B. BLASTP und BLASTN) verwendet werden (siehe beispielsweise http://www.ncbi.nim.nih.gov).
In einer anderen Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nucleinsäuremolekül der Erfindung ein Nucleinsäuremolekül, das das Komplement einer Nucleotidsequenz wie der vorliegenden Erfindung ist, wie beispielsweise die in SEQ ID NR.: 5 gezeigte Sequenz. Ein Nucleinsäuremolekül, das zu einer hierin offenbarten Nucleotidsequenz komplementär ist, ist eines, das zu einer in SEQ ID NR.: 1 gezeigten Nucleotidsequenz ausreichend komplementär ist, so dass es an die Nucleotidsequenz hybridisieren kann, wodurch ein stabiler Doppelstrang gebildet wird.
In einer weiteren Ausführungsform enthält eine Nucleinsäure der Erfindung, wie beispielsweise in SEQ ID NR.: 1 gezeigt, oder das Komplement davon mindestens eine Mutation, die zu einem Genprodukt mit modifizierter Funktion/Aktivität führt. Die mindestens eine Mutation kann durch in der Technik bekannte oder hierin beschriebene Verfahren eingeführt werden. Im Hinblick auf im Vorstehenden veranschaulichte Gruppe von Enzymen führt die mindestens eine Mutation zu einem Protein, dessen Funktion im Vergleich zu dem Wildtyp-Gegenstück gesteigert oder verbessert ist. Die Aktivität des Proteins wird dadurch erhöht. Verfahren zur Einführung solcher Mutationen sind in der Technik allgemein bekannt.
Ein anderer Aspekt betrifft Vektoren, enthaltend eine Nucleinsäure, die ein Protein gemäß der Erfindung codiert, oder ein funktionelles Äquivalent oder Teil davon. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Vektor” auf ein Nucleinsäuremolekül, das eine andere Nucleinsäure, mit der es verbunden wurde, transportieren kann. Eine Vektorenart ist ein „Plasmid”, was sich auf ein ringförmiges doppelsträngiges DNA-Molekül bezieht, in das weitere DNA-Segmente eingeführt werden können. Eine andere Vektorenart ist ein viraler Vektor, wobei weitere DNA-Segmente in das virale Genom insertiert werden können. Bestimmte Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle, in die sie eingeführt werden, fähig (z. B. bakterielle Vektoren mit einem DNA-Replikationsursprung, der in den Bakterien funktional ist). Andere Vektoren werden in das Genom einer Wirtszelle bei der Einführung in die Wirtszelle integriert und folglich zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert.
Überdies können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie operativ verknüpft sind, steuern. Solche Vektoren werden hierin als „Expressionsvektoren” bezeichnet. Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren von Nutzen in rekombinanten DNA-Verfahren oft in Form von Plasmiden vor. Die Ausdrücke „Plasmid” und „Vektor” können hierin austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form des Vektors ist. Die Erfindung soll jedoch auch andere Formen von Expressionsvektoren, wie virale Vektoren (z. B. replikationsdefekte Retroviren, Adenoviren und adenoassoziierte Viren), die äquivalente Funktionen bedienen, umfassen.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können für die Expression von wie oben definierten Enzymen in einem geeigneten Mikroorganismus gestaltet sein. Expressionsvektoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, umfassen aus Chromosomen, Episomen und Viren stammende Vektoren, z. B. Vektoren, die von bakteriellen Plasmiden abgeleitet sind, Bacteriophage und Vektoren, die aus Kombinationen davon abgeleitet sind, wie die, die von genetischen Plasmid- und Bacteriophagen-Elementen abgeleitet sind, wie Cosmide und Phagemide.
Die rekombinanten Vektoren der Erfindung umfassen eine Nucleinsäure der Erfindung in einer Form, die für die Expression der Nucleinsäure in einer Wirtszelle geeignet ist, was bedeutet, dass der rekombinante Expressionsvektor eine oder mehrere regulatorische Sequenzen, ausgewählt auf der Basis der für die Expression zu verwendenden Wirtszellen, die operativ mit der zu exprimierenden Nucleinsäuresequenz verknüpft sind, umfasst. In einem rekombinanten Expressionsvektor sollte unter „operativ verknüpft” zu verstehen sein, dass die Nucleotidsequenz von Interesse mit der/den regulatorischen Sequenz(en) in einer Weise verbunden ist, die die Expression der Nucleotidsequenz gestattet (z. B. in einem In-vitro-Transkriptions/Translations-System oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingeführt wird). Der Ausdruck „regulatorische Sequenz” soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z. B. Attenuatoren) umfassen. Solche regulatorischen Sequenzen werden beispielsweise in „Methods in Enzymology", Band 185: „Gene Expression Technology", Goeddel DV (Hrsg.), Academic Press (San Diego, CA), 1990, beschrieben. Regulatorische Sequenzen umfassen die, die die konstitutive oder induzierbare Expression einer Nucleotidsequenz in vielen Arten von Wirtszellen steuern, und die, die die Expression der Nucleotidsequenz nur in einer bestimmten Wirtszelle steuern (z. B. Gewebe-spezifische regulatorische Sequenzen). Ein Fachmann wird erkennen, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von Faktoren wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Expressionsgrad des gewünschten Proteins, usw. abhängen wird. Die Expressionsvektoren der Erfindung können in Wirtszellen eingeführt werden, um dadurch Proteine oder Peptide, die von den hierin beschriebenen Nucleinsäuren codiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf mutante Proteine, Fragmente davon, Varianten oder funktionelle Äquivalente davon, und Fusionsproteine, die von einer hierin beschriebenen Nucleinsäure codiert werden, herzustellen.
Das DNA-Insert kann mit einem geeigneten Promotor, der entweder ein konstitutiver oder induzierbarer Promotor sein kann, operativ verknüpft sein. Der Fachmann wird wissen, wie geeignete Promotoren auszuwählen sind. Die Expressionskonstrukte können Stellen für die Transkriptionsinitiation, Termination und in der transkribierten Region eine Ribosomenbindungsstelle für die Translation enthalten. Der codierende Teil der reifen Transkripte, die von den Konstrukten exprimiert werden, können vorzugsweise ein Startcodon am Beginn und ein Stoppcodon, das sich geeigneterweise am Ende des zu translatierenden Polypeptids befindet, umfassen.
Vektor-DNA kann in geeignete Wirtszellen mittels konventionellen Transformations- oder Transfektionsverfahren eingeführt werden. Wie hierin verwendet, sollen sich die Ausdrücke „Transformation”, „Konjugation” und „Transfektion” auf eine Vielzahl von in der Technik bekannten Verfahren zur Einführung fremder Nucleinsäure (z. B. DNA) in eine Wirtszelle beziehen, Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Mitfällung, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Transduktion, Infektion, Lipofektion, kationische Lipid-vermittelte Transfektion oder Elektroporation eingeschlossen. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen sind in Sambrook, et al. (supra), Davis et al., („Basic Methods in Molecular Biology", Elsevier (NY, USA), 1986) und anderen Labortagebüchern zu finden.
Um Zellen zu identifizieren und auszuwählen, in deren Genom die fremde DNA integriert ist, wird ein Gen, das einen selektierbaren Marker codiert (z. B. Antibiotikaresistenz), in die Wirtszellen im Allgemeinen zusammen mit dem Gen von Interesse eingeführt. Bevorzugte selektierbare Marker umfassen die, die Arzneimitteln, wie Kanamycin, Tetracyclin, Ampicillin und Streptomycin, Resistenz verleihen. Eine Nucleinsäure, die einen selektierbaren Marker codiert, wird in eine Wirtszelle vorzugsweise an demselben Vektor wie dem, der ein Protein gemäß der Erfindung codiert, eingeführt oder kann an einem separaten Vektor, wie beispielsweise einem Suizid-Vektor, der in der Wirtszellen nicht replizieren kann, eingeführt werden. Zellen, die mit der eingeführten Nucleinsäure stabil transfektiert wurden, können durch Arzneimittelselektion identifiziert werden (z. B. werden Zellen, in die das selektierbare Markergen eingeführt wurde, überleben, während die anderen Zellen sterben).
Wie oben erwähnt, können die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung bei der gentechnischen Veränderung einer geeigneten Wirtszelle verwendet werden, um diese für die Herstel lung, beispielsweise in einem direkten Fermentationsverfahren, von Hy-T zu verbessern und effizienter zu machen.
Folglich bezieht sich die Erfindung auch auf die gleichzeitige Verwendung von Genen, die Polypeptide mit wie oben spezifizierten Aktivitäten codieren. Eine solche Wirtszelle wird dann eine verbesserte Fähigkeit zur direkten Herstellung von Hy-T zeigen.
Die Veränderung in dem Genom des Mikroorganismus kann z. B. durch Ersetzen einer Wildtyp-DNA-Sequenz durch eine DNA-Sequenz, die die Veränderung enthält, mittels einer Einfach- oder Doppel-Crossing-over-Rekombination erhalten werden. Für eine geeignete Auswahl von Transformanten des Mikroorganismus mit der Veränderung in seinem Genom kann die Veränderung z. B. eine DNA-Sequenz, die einen Antibiotikaresistenz-Marker codiert, oder ein Gen, das eine mögliche Auxotrophie des Mikroorganismus ergänzt, sein. Mutationen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Deletion-Insertion-Mutationen.
Eine Veränderung in dem Genom des Mikroorganismus, die zu einem funktionelleren Polypeptid führt, kann auch durch zufälliges Mutagenisieren des Genoms des Mikroorganismus unter Verwendung von z. B. chemischen Mutagenen, Strahlung oder Transposonen und Selektion oder Screenen nach Mutanten, die bessere oder effizientere Produzenten eines oder mehrerer Fermentationsprodukte sind, erhalten werden. Standardverfahren für Screening und Selektion sind einem Fachmann bekannt.
In einer anderen speziellen Ausführungsform ist es gewünscht, die Aktivität eines Proteins, ausgewählt aus der Gruppe der hierin zuvor spezifizierten Enzyme, zu steigern und/oder zu verbessern.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Mikroorganismen, wobei die Aktivität eines gegebenen Polypeptids gesteigert und/oder verbessert wird, so dass die Ausbeute an Hy-T, das direkt hergestellt wird, erhöht wird, vorzugsweise in den Organismen, die die Polypetide oder ein aktives Fragment oder Derivat davon überexprimieren. Dies kann beispielsweise durch Überführen eines Polynucleotids gemäß der Erfindung in einen rekombinanten oder nicht rekombinanten Mikroorganismus, der ein endogenes Äquivalent des entsprechenden Gens enthalten kann oder nicht, erreicht werden.
Der Fachmann wird wissen, wie die Aktivität eines Proteins gesteigert und/oder verbessert werden kann. Dies kann durch genetisches Modifizieren des Wirtsorganismus in einer solchen Weise, dass er mehr oder stabilere Kopien des Proteins erzeugt als der Wildtyp-Organismus, erreicht werden. Es kann auch die Erhöhung der spezifischen Aktivität des Proteins erreicht werden.
In den folgenden Abschnitten werden Verfahrensweisen beschrieben, wie dieses Ziel zu erreichen ist, d. h., die Erhöhung in Bezug auf Ausbeute und/oder Produktion von Hy-T durch Erhöhen (Hochregulierung) der Aktivität eines speziellen Proteins. Diese Verfahrensweisen finden mutatis mutandis auf dieselben Proteine Anwendung, deren Funktionen im Vergleich zu dem Wildtyp-Gegenstück gesteigert oder verbessert werden müssen.
Modifikationen, damit der Organismus mehr Kopien eines speziellen Gens, d. h. Überexprimieren des Gens, und/oder Proteins produzieren kann, können die Verwendung eines starken Promotors oder die Mutation (z. B. Insertion, Deletion oder Punktmutation) (von Teilen) des Gens oder seiner regulatorischen Elemente umfassen. Es kann auch die Insertion mehrerer Kopien des Gens in einen geeigneten Mikroorganismus umfassen. Eine Erhöhung der spezifischen Aktivität eines Proteins kann auch durch in der Technik bekannte Verfahren erreicht werden. Solche Verfahren können die Mutation (z. B. Insertion, Deletion oder Punktmutation) (von Teilen) des codierenden Gens umfassen.
Eine Mutation, wie hierin verwendet, kann irgendeine Mutation sein, die zu einem funktionelleren oder stabileren Polypeptid, z. B. funktionelleren oder stabileren Genprodukten, führt. Dies kann beispielsweise eine Veränderung in dem Genom eines Mikroorganismus umfassen, die die Synthese des Proteins verbessert oder zur Expression des Proteins mit einer veränderten Aminosäuresequenz führt, deren Funktion verglichen mit dem Wildtyp-Gegenstück mit nicht veränderter Aminosäuresequenz verbessert und/oder gesteigert ist. Diese Interferenz kann bei der Transkriptions-, Translations- oder Post-translations-Stufe auftreten.
Der Ausdruck „Erhöhung” der Aktivität, wie hierin verwendet, umfasst das Erhöhen der Aktivität von einem oder mehreren Polypeptiden in dem produzierenden Organismus, welche wiederum von den entsprechenden hierin beschriebenen Polynucleotiden codiert werden. In der Technik sind mehrere Verfahren zugänglich, um die Erhöhung der Aktivität eines gegebenen Proteins zu erreichen. Im Allgemeinen kann die spezifische Aktivität eines Proteins erhöht werden oder die Kopienzahl des Proteins kann erhöht werden.
Um eine solche Erhöhung zu erleichtert, kann die Kopienzahl der Gene, die den hierin beschriebenen Polynucleotiden entsprechen, erhöht werden. Alternativ kann ein starker Promotor verwendet werden, um die Expression des Polynucleotids zu steuern. In einer anderen Ausführungsform können der Promotor, die regulatorische Region und/oder die Ribosomenbindungsstelle upstream des Gens verändert werden, um die Expression zu erhöhen. Die Expression kann auch gesteigert oder erhöht werden, indem die relative Halbwertszeit der Messenger-RNA erhöht wird. In einer anderen Ausführungsform kann die Aktivität des Polypeptids selbst erhöht werden, indem eine oder mehrere Mutationen in der Polypeptid-Aminosäuresequenz eingesetzt werden, die die Aktivität erhöhen. Beispielsweise werden eine Verringerung der relativen Km und/oder eine Erhöhung der kcat des Polypeptids mit dessen entsprechendem Substrat zu einer verbesserten Aktivität führen. Ebenso kann die relative Halbwertszeit des Polypeptids erhöht werden. In beiden Szenarien, welche gesteigerte Genexpression oder erhöhte spezifische Aktivität sind, kann die Verbesserung durch Verändern der Zusammensetzung des Zellkulturmediums und/oder von Verfahren, die für die Kultivierung verwendet werden, erreicht werden. Unter „gesteigerte Expression” oder „verbesserte Aktivität”, wie hierin verwendet, ist eine Erhöhung von mindestens 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200% oder sogar mehr als 500% im Vergleich zu einem Wildtyp-Protein, -Polynucleotid, -Gen oder der Aktivität und/oder der Konzentration des Proteins, bevor die Polynucleotide oder Polypeptide gesteigert und/oder verbessert werden, zu verstehen. Die Aktivität des Proteins kann auch durch Kontaktieren des Proteins mit einem spezifischen oder allgemeinen Enhancer dieser Aktivität gesteigert werden.
Die Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die nicht als einschränkend betrachtet werden sollen.
Beispiele für die Hydroxytyrosol-Herstellung aus Tyrosol
Materialien und Verfahren
Stämme und Plasmide

Die für die Erfindung verwendeten Bakterienstämme waren Escherichia coli W (ATCC 11105, American Type Culture Collection), Escherichia coli TOP10 (Invitrogen). Die in dieser Studie verwendeten Plasmide waren pCR-XL-TOPO (Invitrogen), pJF119EH (Furste et al., Gene (1986) 48: 119–131) und pJF119EH hpaB hpaC (auch als pJF hpaB hpaC, pJFhpaBC oder pD1 bezeichnet). Das Plasmid pJF119EH hpaB hpaC (alias pD1) ist in WO 2004/015094 beschrieben und wurde gemäß dem Budapester Vertrag am 23. Juli 2002 bei der DSMZ unter der Nummer DSM 15109 hinterlegt. Tabelle 1. Beschreibung von Stämmen und Plasmiden, die für die Hydroxytyrosol-Herstellung verwendet werden

Wirtsstamm & Plasmide	Beschreibung
E. coli TOP10	F^– mcrA Δ(mrr^–hsdRMS^–mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araΔ139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL(StrR) nupG.
pD1 = pJFhpaBC	hpaBC-Gene, die für 4-Hydroxyphenylessigsäure-3-monooxygenase codieren, aus E. coli W ATCC 11105, kloniert als ein BamHI/HindIII-Fragment in der MCS des Vektors pJF119EH unter der Kontrolle eines IPTG-induzierbaren tac-Promotors; Ap^R.

Allgemeine Mikrobiologie
Alle Lösungen wurden in deionisiertem Wasser hergestellt. LB-Medium (1 l) enthielt Bacto-Trypton (10 g), Bacto-Hefeextrakt (5 g) und NaCl (10 g). Sofern nicht anders angegeben, waren die zugegeben Antibiotika für die folgenden Endkonzentrationen geeignet: Ampicillin (Ap), 100 mg/l; Kanamycin (Km), 50 mg/l; Chloramphenicol (Cm), 33 mg/l. Stammlösungen aus 4-Hydroxyphenylessigsäure, 2-(3-Hydroxyphenyl)ethanol und Tyrosol wurden in Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) hergestellt. Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) wurde als eine 100-mM-Stammlösung in Wasser hergestellt. Lösungen aus LB-Medium, Kaliumphosphatpuffer, MgSO₄ und D-Glucose wurden vor dem Mischen einzeln autoklaviert. Lösungen aus Antibiotika, Tyrosol, 4-Hydroxyphenylessigsäure, 2-(3-Hydroxyphenyl)-ethanol, Ascorbinsäure, Glycerol und IPTG wurden durch 0,22-μm-Membranen sterilisiert. Festes Medium wurde durch die Zugabe von Difco-Agar auf eine Endkonzentration von 1,5% (Gew./Vol.) hergestellt. Sofern nicht anders angegeben, wurden Flüssigkulturen von E. coli bei 37°C unter Rühren bei 250 U/min gezüchtet und wurden Feststoffkulturen bei 30°C inkubiert. Das Bakterienwachstum wurde durch Messen der optischen Dichte (O. D.) von Flüssigkulturen bei 600 nm (OD₆₀₀) unter Verwendung eines Spektrophotometers überwacht. Molekulare Standardklonierungsverfahren, die einem Fachmann allgemein bekannt sind, wurden für die Konstruktion und Analyse von Plasmid-DNA sowie für die Transformation von E. coli-Stämmen durchgeführt, wie in Sambrook J. et al. „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor (NY, USA): Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, beschrieben. Kommerziell erhältliche Kits für die Isolierung und Amplifikation von Nucleinsäuren wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. QIAprep Spin Miniprep Kit wurde von Qiagen erworben und für die Plasmid-DNA-Isolierung verwendet. Das hochreine PCR-Matrizenherstellungskit wurde von Roche Diagnostics erworben und für chromosomale DNA-Isolierung verwendet. Polymerasekettenreaktionen (PCR) wurden mit Herculase^TM Enhanced DNA Polymerase von Stratagene unter Verwendung eines iCyclers, einem thermischen Cycler von BioRad, durchgeführt. Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs oder Roche Diagnostics erworben. Nucleinsäureligationen wurden unter Verwendung von T4-Ligase von Roche Diagnostics durchgeführt.
Herstellung von Substratlösungen aus getrocknetem Olivenabwasser (OWW), das Hydroxytyrosol und Tyrosol enthält.
Olivenabwasser (OWW) wurde für eine leichte Manipulation in seiner getrockneten, pulverisierten Form verwendet. Zwei Lösungen wurden in separaten Zentrifugenröhrchen durch Auflösen des getrockneten OWW (5 g) in Kaliumphosphatpuffer (15 ml, 50 mM, pH 7,0) hergestellt. Der Hydroxytyrosolgehalt, bezogen auf das Gewicht, in dem getrockneten OWW betrug ~2% und der Tyrosolgehalt betrug ~2%. Die Lösungen wurden unter Verwendung von KOH auf einen pH von 7,0 titriert, dann zentrifugiert (16 min, 4000 U/min, 4°C), um Feststoff und Olivenöl aus der Tyrosol- und Polyphenol-enthaltenden wässerigen Phase abzutrennen. Jede wässerige Phase wurde in ein sauberes Zentrifugenröhrchen überführt, und der Zentrifugationsschritt wurde zweimal wiederholt. Die OWW-Lösungen wurden dann vereinigt, homogenisiert und ohne Sterilisation verwendet.
Herstellung von Substratlösungen aus Extrakten von Olivenabwasser, das Hydroxytyrosol und Tyrosol enthält.
Der Hydroxytyrosolgehalt, bezogen auf das Gewicht, wurde durch Extraktion des OWW unter Verwendung organischer Lösungsmittel auf ~3,9% erhöht und der Tyrosolgehalt auf ~0,4%. Die resultierenden viskosen OWW-Extrakte wurden durch Mikrowellenerwärmung für 30 s verflüssigt. Die OWW-Extrakte (5 g) wurden nach kräftigem Verwirbeln und Erwärmen auf 40°C in Kaliumphosphatpuffer (5 ml, 50 mM, pH 7,0) gelöst. Der pH wurde unter Verwendung von KOH auf 7,0 eingestellt. Das Lösungsvolumen wurde unter Verwendung von Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) auf 15 ml eingestellt. Die Lösungen wurden ohne Sterilisation verwendet.
HPLC-Analyse

Zu mehreren Zeitpunkten während des Kultivierungs- und Inkubationszeitraums wurden Reaktionsproben (1,0 ml) genommen. Die Proben wurden zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Der klare Überstand (0,75 ml) wurde in eine Braunglasampulle für die HPLC-Analyse überführt. Umkehrphasen-HPLC-Verfahren wurden für die gleichzeitige Quantifizierung von Tyrosol, Hydroxytyrosol, 4-Hydroxyphenylessigsäure, 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure, Tyramin, L-Tyrosin und verwandte Substanzen entwickelt (siehe nachstehend): Verfahren 2 führt im Vergleich zu Verfahren 1 zu einer besseren Trennung von L-Tyrosin und Tyramin (Tabelle 2). HPLC wurde auf einem Agilent 1100 HPLC-System, ausgestattet mit einem thermostatischen Autosampler und einem Diodenarraydetektor, durchgeführt. Die Trennung wurde unter Verwendung einer Phenomenex Security Guard C18-Vorsäule (4 mm × 3,0 mm I. D.) und einer analytischen YMC Pack ProC18-Säule (5 μm, 150 mm × 4,6 mm I. D.) durchgeführt. Die Säulentemperatur wurde bei 23°C und die Fließgeschwindigkeit bei 1,0 ml/min gehalten. Typischerweise variierte der Säulendruck von 70 (zu Beginn) bis 120 bar. Probendetektion wurde bei 210 nm erreicht. Das Injektionsvolumen betrug 3 μl. Die Verbindungen wurden durch Vergleich der Retentionszeiten und deren online aufgezeichneten UV-Spektren mit denen von Referenzverbindungen identifiziert. Die Konzentrationen wurden durch Integration von Peakflächen und basierend auf zuvor konstruierten Standardkalibrierungskurven berechnet (siehe Tabelle 2 für eine Auflistung der Retentionszeiten).
Verfahren 1: Ein Gradient von Acetonitril (ACN) in 0,1% wässeriger Methansulfonsäure wurde als eine mobile Phase mit dem folgenden Elutionsprofil verwendet: 0 bis 5 min, 10% ACN; 5 bis 20 min, Erhöhen von ACN auf 90%; 20 bis 25 min, Halten von ACN bei 90%.
Verfahren 2: Ein Gradient von ACN in 0,1% wässeriger Methansulfonsäure wurde als eine mobile Phase mit dem folgenden Elutionsprofil verwendet: 0 bis 3 min, 6% ACN; 4 bis 20 min, Erhöhen von ACN auf 70%; 20 bis 25 min, Halten von ACN bei 70%. Tabelle 2. HPLC-Retentionszeiten

Verbindungsname	Abkürzung der Verbindung	Retentionszeit (min)
		Verfahren 1 (alt)	Verfahren 2 (neu)
Hydroxytyrosol	HO-Tyrosol	4,80	7,65
3,4-Dihydroxyphenylessigsäure	3,4-DHPA	6,50	9,11
Tyrosol	4-HPE	7,80	10,00
4-Hydroxyphenylessigsäure	4-HPA	9,59	11,35
2-(3-Hydroxyphenyl)ethanol	3-HPE	9,63	11,39

Beispiel 1: Biokonversion von Tyrosol zu Hydroxytyrosol durch nicht-pathogene Escherichia coli-Stämme.
Der nicht-pathogene Mikroorganismus Escherichia coli W ATCC 11105 wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit, Tyrosol in Hydroxytyrosol zu transformieren, getestet (Prieto M. A. und Garcia J. L. Biochem. Biophys. Res. Comm. (1997) 232: 759–765). Die Expression chromosomaler hpa-Gene wie hpaB und hpaC, die die Zweikomponenten-Flavin-diffusionsfähige 4-Hydroxyphenylacetat-3-monooxygenase codieren, konnten durch Zugabe von Phenylessigsäure und/oder davon abgeleiteten Molekülen, wie zum Beispiel 4-Hydroxyphenylessigsäure oder 3-Hydroxyphenylessigsäure, zu dem Zellkulturmedium induziert werden. Eine Einzelkolonie von E. coli W, gesammelt von einer Platte mit verfestigtem LB-Medium, wurde zur Inokulation von 50 ml der LB-Kulturlösung verwendet. Die resultierende Kultur wurde über Nacht bei 37°C unter Schütteln bei 250 U/min, um die richtige Belüftung sicherzustellen, inkubiert. Das Über-Nacht-Wachstum wurde zur Inokulation jeder der beiden 50 ml-Kulturen einer frischen LB-Kulturlösung auf eine optische Dichte (O. D.) bei 600 nm von 0,1 verwendet. Die Kultivierung wurde unter denselben Bedingungen fortgesetzt, bis eine O. D. bei 600 nm von 0,5 erreicht war. Zu diesem Zeitpunkt wurde die hpaBC-Genexpression durch die Zugabe von 1 mM 4-Hydroxyphenylessigsäure zu einer der Kulturen induziert. Die zweite Kultur wurde nicht behandelt, was E. coli W-Kontrollzellen lieferte, die die hpaBC-Gene nicht exprimierten. Das Heranziehen wurde für weitere 3,5 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, mit 5 ml Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) gewaschen und schließlich in frischem Puffer auf eine endgültige O. D. von 20–40 resuspen diert. Variierende Mengen der Zellsuspension (0,25–3,0 ml) wurden in Biotransformationsreaktionen (5 ml) in Gegenwart von Tyrosol (16 mM) und Ascorbinsäure (40 mM) in Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) eingebracht. Die Reaktionen wurden bei 37°C unter Schütteln bei 250 U/min, um die richtige Belüftung sicherzustellen, inkubiert. Die Proben wurden abgezogen, und das Fortschreiten der Reaktion wurde durch HPLC-Analyse der zellfreien Überstände überwacht, wie im Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben. Nach einer Reaktionszeit von 18 h wurde Hydroxytyrosol mit einer Ausbeute von bis zu 26% (mol/mol aus Tyrosol) in Reaktionen, die auf eine O. D. bei 600 nm von 20 induzierte E. coli W-Zellen enthielten, erhalten. Die E. coli W-Zellen, die während der Kultivierung nicht mit dem Induktor 4-Hydroxyphenylessigsäure behandelt wurden, katalysierten die Bildung von Hydroxytyrosol aus Tyrosol nicht. Unsere Beobachtungen demonstrieren, das hochregulierte hpaBC-Genexpression zur Tyrosolkonversion zu Hydroxytyrosol durch E. coli W ATCC 11105-Zellen führt. Bis heute wurde die Fähigkeit von Mikroorganismen, Tyrosol in Hydroxytyrosol umzuwandeln, immer mit ihrer Fähigkeit, Tyrosol als die alleinige Kohlenstoffund Energiequelle für das Wachstum zu nutzen, in Verbindung gebracht (Allouche N. et al. Appl. Environ. Microbiol. (2004) 70: 2105–2109 und J. Agric. Food. Chem. (2005) 53: 6525–6530), jedoch wurden die Enzyme oder codierenden Gene selbst, die die Bildung von Hydroxytyrosol katalysieren, bisher nicht identifiziert. Bisher wurde noch kein E. coli-Stamm beschrieben, der fähig ist, auf Tyrosol als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle zu wachsen (Diaz E. et al. Microbiol. Mo/. Biol. Rev. (2001) 65: 523–569). Die Entdeckung, dass ein E. coli-Stamm wie E. co/i W ATCC 11105 zur Tyrosol-zu-Hydroxytyrosol-Umwandlung fähig ist, war daher unerwartet. Ebenso unerwartet war die eindeutige Feststellung, dass das Enzym 4-Hydroxyphenylacetat-3-monooxygenase (HpaBC) und die codierenden Gene hpaB und hpaC für die Hydroxytyrosolproduktion aus Tyrosol verantwortlich sind.
Beispiel 2: Biokonversion von Tyrosol zu Hydroxytyrosol durch ruhende Escherichia coli-Zellen, die hpaB- und hpaC-Gene exprimieren.
Die offenen Leseraster (ORFs) von hpaB (SEQ ID NR.: 1) und hpaC (SEQ ID NR.: 3) aus E. coli W ATCC 11105, die eine 4-Hydroxyphenylacetat-3-hydroxylase (SEQ ID NR.: 2) bzw. eine Flavin: NAD(P)H-Reduktase (SEQ ID NR.: 4) codieren, wurden wie von Kramer M. et al. WO 2004/015094 beschrieben, zugänglich gemacht. In dem resultierenden Plasmid pD1 wurden die hpaBC-Gene aus dem IPTG-induzierbaren tac-Promotor transkribiert. Kompetente Zellen des E. coli-Stammes TOP10 (Invitrogen), ein E. coli K-12-Derivat, das keine hpa-Gene aufweist, wurden mit dem Plasmid pD1 transformiert. Der resultierende rekombinante E. coli-Stamm TOP10/pD1 wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit, Tyrosol in Hydroxytyrosol umzuwandeln, getestet. Die Impfmaterialien wurden mit einer Einzelkolonie von E. coli TOP10/pD1 gestartet und über Nacht bei 37°C unter Rühren bei 250 U/min in LB-Kulturlösung (5 ml), enthaltend Ampicillin (100 mg/l), gezüchtet. Ein aliquoter Teil der Übernachtkultur (1% Impfmaterial) wurde in frische LB-Kulturlösung (25 ml), enthaltend Ampicillin (100 mg/ml), überführt. Die Kultur wurde bei 37°C unter Rühren bei 250 U/min auf OD₆₀₀ = 0,5 gezüchtet, wobei zu diesem Zeitpunkt die Proteinexpression durch die Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 1 mM induziert wurde. Die Kultivierung wurde fortgesetzt, bis eine OD₆₀₀ von 1,0 erreicht war. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (3220 g, 15 min) geerntet, dann in 5 ml Tris-HCl-Puffer (10 mM, pH 8,0) resuspendiert. Aliquote Teile (1 ml) wurden in drei separate Reaktionsröhrchen verteilt: Röhrchen Nr. 1 wurde mit Tyrosol (5 mM) behandelt; Röhrchen Nr. 2 wurde mit 4-Hydroxyphenylessigsäure (5 mM) behandelt, was eine Positivkontrolle lieferte; Röhrchen Nr. 3 wurde nicht behandelt, was eine Negativkontrolle lieferte. Nach einer Inkubation von 48 h bei 37°C unter Schütteln bei 350 U/min zeigten nur die Röhrchen Nr. 1 und 2 eine braune Färbung, was ein Anzeichen für die Bildung von Catecholderivaten ist. Die Bildung von Hydroxytyrosol aus Tyrosol in Röhrchen Nr. 1 wurde durch DC-Analyse bestätigt. Ruhende Zellen von E. coli TOP10/pD1, die Plasmid-codierte hpaBC-Gene exprimieren, katalysierten die Bildung von Hydroxytyrosol aus Tyrosol in einem 20%igen Umwandlungsverhältnis, wie durch ¹H-NMR-Analyse des zellfreien Reaktionsüberstandes beurteilt werden konnte. Dieses Experiment demonstriert Tyrosolhydroxylaseaktivität für das hpaB- und hpaC-codierte Enzym HpaBC. Ein Fachmann wird erkennen, dass zahlreiche andere Mikroorganismen als E. coli, die 4-Hydroxyphenylessigsäure oder ähnliche aromatische Moleküle metabolisieren können, erwartungsgemäß auch Hydroxytyrosol mittels aromatischer Hydroxylierung produzieren können, ungeachtet dessen, ob diese Mikroorganismen Tyrosol oder Hydroxytyrosol als eine Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen können oder nicht.
Beispiel 3: Biokonversion von 2-(3-Hydroxyphenyl)ethanol zu Hydroxytyrosol durch ruhende Escherichia coli-Zellen, die hpaB- und hpaC-Gene exprimieren.
Die Impfmaterialien wurden mit einer Einzelkolonie von E. coli TOP10/pD1 gestartet und über Nacht bei 37°C unter Rühren bei 250 U/min in LB-Kulturlösung (5 ml), enthaltend Ampicillin (100 mg/l), gezüchtet. Ein aliquoter Teil der Übernachtkultur wurde in jede von zwei Kulturen einer frischen LB-Kulturlösung (50 ml), enthaltend Ampicillin (100 mg/ml), überführt. Beide Kulturen wurden bei 37°C unter Rühren bei 250 U/min auf OD₆₀₀ = 0,85 gezüchtet, wobei zu diesem Zeitpunkt die Proteinexpression in einer der Kulturen durch Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 0,5 mM induziert wurde. Die andere Kultur wurde nicht behandelt, was Zellen für Negativkontrollen lieferte. Die Kultivierung wurde für 3 h bei 37°C unter Schütteln fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (2500 g, 10 min) geerntet, in 5 ml Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) gewaschen, dann in 8 ml desselben Puffers auf eine endgültige OD₆₀₀ = 11 für die Kontrollzellen und OD₆₀₀ = 10,5 für die IPTG-behandelten Zellen resuspendiert. Aliquote Teile (1 ml) wurden in separaten Reaktionsröhrchen verteilt: die Röhrchen 1a, 2a und 3a enthielten Kontrollzellen; die Röhrchen 1b, 2b und 3b enthielten IPTG-behandelte E. coli TOP10/pD1-Zellen; die Röhrchen 1a und 1b wurden mit Ethanol (0,1 ml) behandelt, was eine Negativkontrolle lieferte; die Röhrchen 2a und 2b wurden mit Tyrosol (15 mM) behandelt, was eine Positivkontrolle lieferte; und die Röhrchen 3a und 3b wurden mit 2-(3-Hydroxyphenyl)ethanol (25 mM) behandelt. Die Reaktionen wurden für 20 h bei 37°C unter Schütteln bei 250 U/min inkubiert. Nur die Röhrchen 2b und 3b zeigten eine braune Verfärbung, was ein Anzeichen für die Bildung von Catecholderivaten wie Hydroxytyrosol ist. In den Negativkontrollreaktionen 1a oder 1b, die mit Ethanol behandelt wurden, wurde durch HPLC-Analyse kein Hydroxytyrosol detektiert. Als Positivkontrolle bestätigte die HPLC-Analyse der zellfreien Überstände der Reaktionen 2a und 2b, dass die Produktion von Hydroxytyrosol aus Tyrosol im Vergleich zu Reaktionen, enthaltend die E. coli TOP10/pD1-Kontrollzellen (Umwandlungsverhältnis von weniger als 4 mol-%), in Reaktionen, enthaltend die IPTG-induzierten E. coli TOP10/pD1-Zellen (Umwandlungsverhältnis von bis zu 26 mol-%), höher war. Die HPLC-Analyse der Reaktionen 3a und 3b demonstrierte, dass ruhende Zellen von E. coli TOP10/pD1, die Plasmid-codierte hpaBC-Gene exprimieren, die Produktion von Hydroxytyrosol aus einer anderen Quelle als Tyrosol katalysierten: Reaktionen, enthaltend IPTG-induzierte E. coli TOP10/pD1-Zellen zeigten ein 2-(3-Hydroxyphenyl)ethanol-zu-Hydroxytyrosol-Biokonversionsverhältnis von 4–6%, während das Biokonversionsverhältnis für Reaktionen mit E. coli TOP10/pD1-Kontrollzellen 0,5% nicht überstieg. Dieses Experiment demonstriert, dass die hpaB- und hpaC-codierte aromatische Monooxygenase HpaBC 2-(3-Hydroxyphenyl)ethanol als ein Substrat annimmt. Diese Biotransformation eines anderen Substrats als Tyrosol zur Herstellung von Hydroxytyrosol war bisher beispiellos.
Beispiel 4: Verbesserung der Biokonversion von Tyrosol zu Hydroxytyrosol durch ruhende Escherichia coli-Zellen, die hpaB- und hpaC-Gene exprimieren.
Zur Maximierung der Biokonversionsausbeute von Hydroxytyrosol aus Tyrosol wurden Moleküle wie Glutathion oder Glycerol zugegeben. In einem typischen Experiment wurde eine Einzelkolonie von E. coli TOP10/pD1 zur Inokulation von 50 ml LB-Kulturlösung, ergänzt mit Ampicillin (100 mg/ml), zur Plasmiderhaltung verwendet. Die resultierende Kultur wurde über Nacht bei 37°C unter Schütteln bei 250 U/min, um die richtige Belüftung sicherzustellen, gezüchtet. Das Über-Nacht-Wachstum wurde zur Inokulation mehrer Arbeitskulturen von 50 ml LB-Kulturlösung, ergänzt mit Ampicillin, auf eine Ausgangs-O. D. bei 600 nm von 0,1 verwendet. Die resultierenden Kulturen wurden bei 37°C geschüttelt, bis eine O. D. bei 600 nm von 0,8–1,0 erreicht war, wobei zu diesem Zeitpunkt dem Medium IPTG auf eine Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben wurde. Die Kulturen wurden bei 37°C einen 3,5stündigen Induktionszeitraum weiter geschüttelt und dann auf Eis abgeschreckt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, mit Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) gewaschen, erneut durch Zentrifugation geerntet und schließlich in Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) auf eine endgültige O. D. bei 600 nm von 20–30 resuspendiert. Die resultierenden Zellen wurden unmittelbar in Biotransformationsreaktionen (5 ml), enthaltend Tyrosol (16 mM), in Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) eingebracht. Reaktionen, in denen Zellen zugegeben wurden, um eine O. D. bei 600 nm von 6–8 zu erhalten, produzierten Hydroxytyrosol in 23%iger Umwandlung (mol/mol aus Tyrosol) nach einer Reaktionszeit von 18 h. Unter denselben Reaktionsbedingungen, aber in Gegenwart von Glutathion (40 mM) wurde Hydroxytyrosol in 49%iger Umwandlung (mol/mol aus Tyrosol) produziert. Unter ähnlichen Reaktionsbedingungen, aber in Gegenwart von Glycerol (50 mM), wurde Hydroxytyrosol in 62%iger Umwandlung (mol/mol aus Tyrosol) produziert. Wurden dem Reaktionsgemisch sowohl Glycerol (25 mM) als auch Ascorbinsäure (20 mM) zugegeben, erhöhten sich die Hydroxytyrosolumwandlungsverhältnisse auf 83% (mol/mol aus Tyrosol). Unter denselben Reaktionsbedingungen wurde 4-Hydroxyphenylacetat (16 mM) anstelle von Tyrosol als das Ausgangsmaterial verwendet. In Gegenwart von Glutathion (50 mM) wurde selbst nach längeren Reaktionszeiten kein erwartetes 3,4-Dihydroxyphenylacetatprodukt in dem Reaktionsgemisch detektiert. Wurden sowohl Ascorbat als auch Glycerol zugegeben, wurden nicht mehr als 3% Umwandlung zu 3,4-Dihydroxyphenylacetat (mol/mol aus 4-Hydroxyphenylacetat) erreicht, wobei dies noch überraschender ist, da 4-Hydroxyphenylacetat angeblich das natürliche Substrat von HpaBC ist (Prieto M. A. et al. J. Bacteriol (1993) 175: 2162–2167).
Beispiel 5: Verbesserung der Biokonversion von Tyrosol zu Hydroxytyrosol durch wachsende Escherichia coli-Zellen, die hpaB- und hpaC-Gene exprimieren.
Zum weiteren Testen der Stabilität der Hydroxytyrosolproduktion aus Tyrosol wurde die HpaBC-katalysierte Biotransformation unter Verwendung von wachsenden E. coli TOP10/pD1-Zellen, die hpaB- und hpaC-Gene exprimieren, durchgeführt. In einem typischen Experiment wurde eine Einzelkolonie von E. coli TOP10/pD1 zum Inokulieren von 50 ml einer LB-Kulturlösung, ergänzt mit Ampicillin (100 mg/ml), zur Plasmiderhaltung verwendet. Die resultierende Kultur wurde über Nacht bei 37°C unter Schütteln bei 250 U/min, um die richtige Belüftung sicherzustellen, gezüchtet. Das Über-Nacht-Wachstum wurde zum Inokulieren mehrerer Arbeitskulturen von 50 ml einer LB-Kulturlösung, ergänzt mit Ampicillin, auf eine Ausgangs-O. D. bei 600 nm von 0,1 verwendet. Die resultierenden Kulturen wurden bei 37°C geschüttelt, bis eine O. D. bei 600 nm von 0,8–1,0 erreicht war, wobei zu diesem Zeitpunkt dem Medium IPTG auf eine Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben wurde. Die Kulturen wurden bei 37°C und 250 U/min weitere 4 h geschüttelt. Die Experimente wurden durch Zugabe des Substrats Tyrosol auf eine Endkonzentration von 8,3 mM initiiert (t = 0). Auch Glycerol (27 mM) und Ascorbinsäure (20 mM) wurden dem Kulturmedium zu diesem Zeitpunkt zugegeben. Zu mehreren Zeitpunkten wurden Proben (1 ml) aus den wachsenden E. coil TOP10/pD1-Kulturen abgezogen und die entsprechenden zellfreien Kulturüberstände durch HPLC analysiert. Typischerweise wurden Proben der Bakterienkulturen kurz vor der Substratzugabe (t = –0,3 h) für eine Hintergrundüberprüfung; unmittelbar nach der Substratzugabe für eine experimentelle Messung der anfänglichen Substratkonzentration (t = 0); dann 1–2 h nach der Substratzugabe zur Detektion potentieller biosynthetischer Zwischenprodukte und schließlich 16 h und 40 h nach der Substratzugabe zur Messung der Produkt- und Nebenproduktkonzentrationen genommen. Die E. coil TOP10/pD1-Wachstumszellen können Tyrosol zu Hydroxytyrosol in einem 55- bis 62%igen Biokonversionsverhältnis (mol/mol aus Tyrosol) innerhalb einer Reaktionszeit von 1,6 h transformieren. Nach 16stündiger Reaktion war das gesamte Tyrosol verbraucht und in einem 93- bis 100mol-%igen Umwandlungsverhältnis in Hydroxytyrosol umgewandelt, wie durch HPLC-Analyse beurteilt werden konnte.
Steigerung der Tyrosol-zu-Hydroxytyrosol-Biokonversion
Beispiel 6: Biotransformation von Tyrosol zu Hydroxytyrosol in einem 20-Liter-Fed-Batch-Fermenter unter Verwendung von wachsenden E. coli TOP10/pD1-Zellen, die hpaB- und hpaC-Gene exprimieren.
Die Kultivierung des E. coli-Stammes TOP10/pD1 unter Fed-Batch-Fermentationsbedingungen wurde in einem New Brunswick Scientific BioFlo 4500-Kulturgefäß mit einer Arbeitskapazität von 20 l durchgeführt. Temperatur, pH und gelöster Sauerstoff (D. O.) wurden mit PID-Kontrollschleifen kontrolliert. Die Temperatur wurde bei 27°C gehalten. Die Zugabe von konzentriertem NaOH oder konzentrierter H₂SO₄ wurde zur Aufrechterhaltung des pH bei 7,2 verwendet. D. O. wurde unter Verwendung eines O₂-Sensors überwacht und bei 30% Luftsättigung gehalten, indem die Rührergeschwindigkeit reguliert wurde. Der Luftstrom wurde auf 7,8 nl/min eingestellt. Schaumhemmer (Basildon 86/013k) wurde nach Bedarf zugegeben. Die anfängliche Glucosekonzentration in dem Fermentationsmedium betrug 8,8 g/l. Nach dem anfänglichen Glucoseverbrauch wurde die Glucosekonzentration während der Fermentation unter 1 g/l gehalten, indem die Zugaberate einer Glucosespeisung (500 g/l) kontrolliert wurde. Alle Lösungen wurden in deionisiertem Wasser hergestellt, sofern nicht etwas anderes angegeben ist. Das Fermentations-Vorkulturmedium (1 l) enthielt Hefeextrakt (19 g), Na₂HPO₄·2H₂O (8,9 g), KH₂PO₄ (6,8 g), NH₄Cl (2,4 g) und Ampicillin (100 mg). Das Fermentationsmedium (1 l) enthielt K₂HPO₄ (7 g), Zitronensäuremonohydrat (1 g), MgSO₄·7H₂O (2,3 g), Ammoniumsulfat (1,7 g), Hefeextrakt (40 g), FeSO₄·7H₂O (30 mg) und wurde in dem Fermentationsgefäß zusammen mit den kalibrierten pH- und O₂-Sensoren sterilisiert. Eine Lösung aus Glucosemonohydrat (400 g/l) wurde separat autoklaviert und dem sterilen Fermentationsmedium vor der Inokulation auf eine Endkonzentration von 8,8 g/l zugegeben. Eine Stammlösung von Ampicillin (12 g/l) wurde durch eine 0,22-μm-Membran filtersterilisiert und dem sterilen Fermentationsmedium vor der Inokulation auf eine Endkonzentration von 0,1 g/l zugegeben. Eine IPTG-Stammlösung (20 g/l) wurde hergestellt. Substrat und Additivlösungen wurden durch Auflösen von 35 g Tyrosol in 90 ml Ethanol, 63 g Ascorbinsäure in 200 ml Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) und 36 g Glycerol in 70 ml Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) hergestellt. Die Lösungen von IPTG, Ascorbinsäure und Glycerol wurden durch eine 0,22-μm-Membran filtersterilisiert. Die Zelldichten wurden durch Verdünnen der Fermentationskulturlösung mit Wasser, gefolgt von Messungen der Absorption bei 600 nm (OD₆₀₀) bestimmt. Proben der Fermentationskulturlösung (7,5 ml) wurden periodisch genommen, Zellen wurden durch Zentrifugation (4300 g, 4°C, 6 min) abgetrennt und der zellfreie Überstand wurde durch HPLC analysiert.
Gefrorene Zellvorräte in 20% Glycerol wurden durch Einführung einer Einzelkolonie von E. coli TOP10/pD1, gesammelt von einer frisch ausgestrichenen Agarplatte, in 100 ml LB-Medium, enthaltend 100 mg/l Ampicillin, hergestellt. Die Kultur wurde bei 37°C unter Rühren bei 200 U/min gezüchtet, bis eine OD₆₀₀ von 0,6 erreicht war. Bis zu 35 gefrorene Zellvorräte wurden aseptisch durch Mischen von 0,6 ml einer bakteriellen Zellkultur mit 0,4 ml einer 50%igen Glycerollösung in 2-ml-Kryophiolen hergestellt. Die resultierende Zellsuspension wurde bei –80°C bis zur Verwendung eingefroren.
Fermentationsvorkulturen wurden in Schüttelkolben (2 l), enthaltend steriles Vorkulturmedium (300 ml), inokuliert mit 1 ml gefrorenen E. coli TOP10/pD1-Zellen in 20% Glycerol, durchgeführt. Die Vorkulturen wurden bei 220 U/min und 27°C 24 h geschüttelt. Die Fermentationsexperimente wurden initiiert (t = 0), als 240 ml Vorkultur (4%iges Impfmaterial) in das Fermentergefäß, enthaltend steriles Fermentationsmedium (6 l), Glucose (53 g) und Ampicillin (0,6 g), überführt wurden. Die Glucosespeisung wurde 11 h nach Beginn des Verfahrens begonnen. Die Genexpression wurde durch Zugabe von 50 ml einer IPTG-Stammlösung (20 g/l) in das Bioreaktorgefäß 23 h und erneut 27 h nach Beginn des Verfahrens induziert. Zu diesem Zeitpunkt (t = 27 h) wurden Tyrosol (35 g), Ascorbinsäure (63 g) und Glycerol (36 g) in den Bioreaktor gegeben. Die HPLC-Analyse der Kulturüberstände deckte auf, dass das Tyrosol vollständig verbraucht und in einem 54%-mol/mol-Biokonversionsverhältnis und in weniger als 1,5 h von wachsenden E. coli TOP10/pD1-Zellen (~182 g Trockenzellgewicht), die hpaB- und hpaC-Gene exprimieren, in Hydroxytyrosol umgewandelt und in ~7,8 kg Fermentationskulturlösung kultiviert worden war.
Beispiel 7: Großmaßstäbliche Biotransformation von Tyrosol zu Hydroxytyrosol unter Verwendung von ruhenden E. coli TOP10/pD1-Zellen, die hpaB- und hpaC-Gene exprimieren.
Die Kultivierung des E. coli-Stammes TOP10/pD1 wurde in einem New Brunswick Scientific BioFlo 4500-Kulturgefäß mit einer Arbeitskapazität von 20 l unter Fed-Batch-Fermentationsbedingungen, wie in dem vorstehenden Beispiel beschrieben, durchgeführt. Die Fermentationsexperimente wurden initiiert (t = 0), als 240 ml Vorkultur (4%iges Impfmaterial) in das Fermentergefäß, enthaltend steriles Fermentationsmedium (6 l), Glucose (53 g) und Ampicil lin (0,6 g), überführt wurden. Die Glucosespeisung wurde 11 h nach Beginn des Verfahrens begonnen. Die Genexpression wurde durch Zugabe von 50 ml einer IPTG-Stammlösung (20 g/l) in das Bioreaktorgefäß 23 h nach Beginn des Verfahrens induziert. Etwa 3–4 h nach der IPTG-Zugabe wurden die Zellen durch Zentrifugation (4300 g, 4°C, 5 min) geerntet, mit kaltem Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) gewaschen, dann erneut durch Zentrifugation geerntet. Die resultierende Biomasse wurden in drei ungleiche Teile geteilt, die in 1,25 l Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) auf endgültige Trockenzellkonzentrationen von 41, 26 und 11 g/kg Puffer resuspendiert und in ein New Brunswick Scientific BioFlo 3000-Kulturgefäß mit einer Arbeitskapazität von 2,5 l geladen wurden. Die resultierenden ruhenden E. coli TOP10/pD1-Zellsuspensionen wurden mit IPTG (0,14 g), Tyrosol (6,25 g), Ascorbinsäure (11,2 g) und Glycerol (6,5 g) behandelt. Die Temperatur wurde bei 37°C gehalten. D. O. wurde unter Verwendung eines O₂-Sensors überwacht und durch Regulierung der Rührergeschwindigkeit bei einer 30%igen Luftsättigung gehalten. Die HPLC-Analyse der Reaktionsüberstände deckte auf, dass Tyrosol in 58 bis 65%-mol/mol-Biokonversionsverhältnissen innerhalb von 3 h durch ruhende E. coli TOP10/pD1-Zellen, die hpaB- und hpaC-Gene exprimieren, vollständig in Hydroxytyrosol umgewandelt worden war, wie in der nachstehenden Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3. Biokonversion von Tyrosol zu Hydroxytyrosol durch ruhende E. coli TOP10/pD1-Zellen in dem Fermenter.

Biotransformation A B C

OD₆₀₀ 60 42 21

Biomassenkonzentration (g/kg) 41 26 11

Biokonversionsverhältnis (%, mol/mol aus Tyrosol) 58 59 65

Zeit bis Tyrosol erschöpft ist (h) 0,6 2,7 2,6
Anreicherung von Olivenabwässern und Olivenabwasserextrakten in Hydroxytyrosol unter Verwendung von Biotechnologie.
Bis heute ist die Extraktion von Hydroxytyrosol aus natürlichen Quellen (d. h. Olivenabwasser, Vegetationswasser, Olivensaft, Olivenextrakten) die Hauptquelle für potentiell „natürliches” Hydroxytyrosol. Neben Hydroxytyrosol und anderen phenolischen und Polyphenol-Verbindungen ist auch Tyrosol in Olivenabwasser (OWW) vorhanden. Das oben beschriebene Tyrosol-Biokonversionsverfahren wurde zum Anreichern „natürlicher” Rohmaterialien mit Hydroxytyrosol durch Hydroxylierung von Tyrosol unter Verwendung des rekombinanten E. coli-Stammes TOP10/pD1, der hpaBC-Gene exprimiert, durch Messen einer deutlichen Verringerung des Tyrosolgehaltes mit einer entsprechenden Erhöhung des Hydroxytyrosolgehaltes in Olivenwässern oder -extrakten angewendet.
Die in den nachstehenden Beispielen veranschaulichten Experimente nutzen OWW und OWW-Extrakte, die sowohl Tyrosol als auch Hydroxytyrosol in einem ~1:11-Verhältnis enthalten, und zeigen, dass Tyrosol- und Hydroxytyrosol-enthaltende „natürliche” Rohmaterialien unter Verwendung der hierin beschriebenen Technologie, die E. coli TOP10/pD1-exprimierende 4-Hydroxyphenylacetat-3-monooxygenase (HpaBC) involviert, mit Hydroxytyrosol angereichert werden können. Die hierin beschriebenen Erkenntnisse können zur Erhöhung des Hydroxytyrosolgehaltes jeglicher „natürlicher” Matrix, die Tyrosol enthält, wie zum Beispiel OWW, Vegetationswasser, Olivensaft und Olivenextrakte, verwendet werden.
Allgemeines Schüttelkolbenverfahren
Impfmaterialien des E. coli-Stammes TOP10/pD1 wurden durch die Einführung einer Einzelkolonie in 50 ml einer LB-Kulturlösung, ergänzt mit Ampicillin (Ap, 100 mg/l), gestartet und bei 37°C über Nacht gezüchtet. Aliquote Teile dieser Übernachtkultur wurden in mehrere Arbeitskulturen (50 ml) von LB/Ap auf eine Ausgangs-OD₆₀₀ von 0,1 (4%iges Impfmaterial) überfährt. Die 50-ml-Kulturen wurden bei 37°C unter Rühren bei 250 U/min auf OD₆₀₀ = 0,7–0,9 gezüchtet. Dann wurde die Proteinexpression durch die Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 0,5 mM induziert. Die Kulturen wurden bei 37°C und 250 U/min 4 h geschüttelt. Die Experimente wurden durch die Zugabe von 2,5-ml-Substratlösungen wie OWW (0,34 g/ml Stammlösung) oder OWW-Extrakten (0,33 g/ml Stammlösung) initiiert (t = 0). Als Kontrollexperiment wurde den Wachstumskulturen von E. coli TOP10/pD1 auch Tyrosol (5 ml, 83 mM Stammlösung) zugegeben. Ascorbinsäurelösung (1M-Stammlösung) und/oder Glycerollösung (0,68-M-Stammlösung) wurden wie im Text angegeben zugegeben. Es wurden mehrere Male Proben (1 ml) der Kulturlösung genommen (t = –0,25, 0, 1,5, 16 und 40 h) und zentrifugiert. Der resultierende zellfreie Überstand wurde durch HPLC analysiert.
Beispiel 8: Anreicherung von OWW mit Hydroxytyrosol durch Hydroxylierung von Tyrosol.
Zur Bestimmung, ob OWW unter Verwendung des rekombinanten E. coli-Stammes TOP10/pD1, der hpaB- und hpaC-Gene codiert, mit Hydroxytyrosol angereichert und an Ty rosol ärmer gemacht werden kann, wurden Schüttelkolbenexperimente durchgeführt. Eine gepufferte Lösung von OWW wurde den Wachstumskulturen von TOP10/pD1 in Gegenwart oder Abwesenheit von Ascorbinsäure und/oder Glycerol in situ zugegeben.
Für die Herstellung von OWW-Lösungen wurde ein Standardverfahren entwickelt (siehe Materialien und Verfahren). Zunächst wurde lyophilisiertes OWW in Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) rehydratisiert und unter Verwendung von KOH auf einen pH von 7,0 titriert. Die resultierende Suspension wurde mehrere Male zentrifugiert, um so die Tyrosol- und Hydroxytyrosol-haltige wässerige Phase von festen Gewebetrümmern und restlichem Olivenöl zu trennen. Die Polyphenol-enthaltende wässerige Phase wurde den wachsenden E. coli-Kulturen ohne weitere Sterilisation zugegeben. Lösungen von OWW-Extrakten wurden durch ein ähnliches Verfahren hergestellt (siehe Materialien und Verfahren).
Die HPLC-Analyse der OWW-Lösungen deckte ein Tyrosol-zu-Hydroxytyrosol-Verhältnis von 1:11 in natürlichem OWW auf. Dieses Verhältnis war schwer auszuwerten und wurde nur in Gegenwart von 20–40 mM Ascorbinsäure bestimmt. Die Hydroxytyrosolinstabilität wurde unter Kultivierungsbedingungen verstärkt. Aliquote Teile der OWW-Lösung wurden Wachstumskulturen von E. coli TOP10/pD1, die hpaBC-Gene exprimieren, für Tyrosolhydroxylase-(HpaBC-)-Aktivität zugegeben. In Abwesenheit von Ascorbinsäure verringerte sich der Polyphenolgesamtgehalt dramatisch, wie in 1, Kolben 1 & 3 veranschaulicht. Hydroxytyrosol kann durch die Zugabe von Ascorbinsäure stabilisiert werden. Zu wenig Ascorbinsäure verhindert jedoch die Hydroxytyrosolzersetzung, wie in 1, Kolben 4 veranschaulicht, nicht. Es wurde herausgefunden, dass Ascorbinsäure die HpaBC-vermittelte Tyrosolbiokonversion inhibiert, wenn sie bezogen auf Tyrosol und/oder Hydroxytyrosol in großem Überschuss zugegeben wird. Unter optimierten Bedingungen wurden OWW-Lösungen, die mit wachsenden E. coli TOP10/pD1-Zellen, die hpaBC-Gene exprimieren, behandelt wurden, unter entsprechender Verringerung von Tyrosol mit Hydroxytyrosol angereichert, wie in 1, Kolben 2 veranschaulicht. Das gesamte anfänglich in der OWW-Lösung vorhandene Tyrosol wurde ohne jegliche Hydroxytyrosolzersetzung während des Verfahrens in Hydroxytyrosol umgewandelt.
Beispiel 9: Anreicherung von OWW-Extrakten mit Hydroxytyrosol durch Hydroxylierung von Tyrosol.
Es wurden ähnliche Experimente durch die Zugabe von OWW-Extrakten anstelle von OWW-Lösungen in eine Wachstumskultur von E. coli TOP10/pD1, die hpaBC-Gene exprimiert, für Tyrosolhydroxylaseaktivität durchgeführt. Die Zugabe solcher „Olivenextrakte” zu Wachstumskulturen von E. coli TOP10/pD1 führte zu einer Anreicherung mit Hydroxytyrosol unter entsprechender Verringerung des Tyrosolgehalts, wie in 2, Kolben 2 & 4 und in 3, Kolben 1, 3 & 5 veranschaulicht. Eine vollständige Umwandlung von Tyrosol zu Hydroxytyrosol wurde innerhalb der ersten Stunde der Reaktion erreicht, wie in 3 veranschaulicht.
Beispiel 10: Wirkung von Ascorbinsäure für das Verfahren zur Anreicherung von OWW mit Hydroxytyrosol
Die Notwendigkeit, dass Ascorbinsäure Hydroxytyrosol in dem Kulturmedium stabilisiert, wurde demonstriert, wie in 2, Kolben 3 veranschaulicht. Die experimentellen Daten zeigen deutlich die Existenz eines optimalen Ascorbinsäurekonzentrationsbereiches: Hydroxytyrosol zersetzt sich in Gegenwart von 10 mM Ascorbinsäure (2, Kolben 1 & 5), eine Erhöhung der Ascorbinsäurekonzentration auf 20 mM führt jedoch zu einer vollständigen Tyrosol-zu-Hydroxytyrosol-Biokonversion unter Erhalt des Kohlenstoffgleichgewichts (2, Kolben 2 & 4 und 3, Kolben 1, 3 & 5). Eine weitere Erhöhung der Ascorbinsäurekonzentration auf 40 mM inhibierte HpaBC-katalysierte Tyrosolhydroxylierung vollständig (3, Kolben 2, 4 & 6). Selbstverständlich sind solche Konzentrationsgrenzwerte nicht absolut und hängen von dem Hydroxytyrosoltiter in dem Kulturmedium, von der Zelldichte und von den HpaBC-Expressionsgraden ab. Folglich müssen sie an jedes Verfahren angepasst werden.
Beispiel 11: Wirkung von Glycerol auf das Verfahren zur Anreicherung von OWW mit Hydroxytyrosol
Auf den ersten Blick schien Glycerol nur eine geringe Wirkung auf die Tyrosol-Biokonversion oder Hydroxytyrosolstabilität zu haben. Eine Verdopplung der Konzentration an Glycerol in dem Medium in Gegenwart der optimalen Ascorbinsäurekonzentration (20 mM) hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Biokonversionsrate (3, Kolben 3 gegenüber 5). Waren jedoch suboptimale Ascorbinsäuremengen (10 mM) in dem Kulturmedium vorhanden, dann schien die Zugabe von Glycerol die Hydroxytyrosolzersetzung zu verlangsamen (2, Kolben 5 gegenüber 1). Folglich hatte Glycerol insgesamt eine vorteilhafte Wirkung auf die Produktstabilität.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neu identifizierte Mikroorganismen, die Hydroxytoyrosol (im Folgenden auch bezeichnet als Hy-T) aus Tyrosol direkt herstellen können. Die Erfindung betrifft außerdem Polynukleotid-Sequenzen umfassend Gene, die Proteine kodieren, die an der Synthese von Hy-T aus Tyrosol beteiligt sind. Ebenfalls eingeschlossen sind Methoden/Verfahren zur Verwendung der Polynukleotide und modifizierten Polynukleotid-Sequenzen zur Transformation von Wirts-Mikroorganismen. Die Erfindung betrifft ebenfalls genetisch veränderte Mikroorganismen und ihre Verwendung für die Umwandlung von Tyrosol in Hy-T.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- EP 1623960 A [0005]
- WO 02/16628 [0006]
- WO 2004/015094 [0094, 0100]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Bouzid O., et al. (Proc. Biochem. (2005) 40: 1855–1862) [0005]
- Allouche N., et al. Appl. Environ. Microbiol. (2004) 70: 2105–2109 [0007]
- Allouche N., et al. J. Agric. Food Chem. (2005) 53: 6525–6530 [0007]
- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Deutschland, American Type Culture Collection (ATCC), P. O. Box 1549, Manassas, VA 20108 USA [0022]
- Culture Collection Division, NITE Biological Resource Center, 2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, 292-0818, Japan [0022]
- Institute for Fermentation, Osaka (IFO), 17–85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532-8686, Japan [0022]
- Sambrook, et al. (Sambrook J. et al. „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor (NY, USA): Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) [0058]
- Ausubel et al. (Ausubel F. M. et al., „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons (NY, USA): John Wiley & Sons, 2007) [0058]
- Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. (1970) 48: 443–453 [0069]
- http://www.accelrys.com [0069]
- http://www.accelrys.com [0070]
- Meyers und Miller, Comput. Appl. Biosci. (1989) 4: 11–17 [0070]
- http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi [0070]
- J. Mol. Biol. (1990) 215: 403–410 [0071]
- Nucleic Acids Res. (1997) 25: 3389–3402 [0071]
- http://www.ncbi.nim.nih.gov [0071]
- „Methods in Enzymology”, Band 185: „Gene Expression Technology”, Goeddel DV (Hrsg.), Academic Press (San Diego, CA), 1990 [0077]
- „Basic Methods in Molecular Biology”, Elsevier (NY, USA), 1986 [0079]
- Furste et al., Gene (1986) 48: 119–131 [0094]
- Sambrook J. et al. „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor (NY, USA): Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 [0095]
- Prieto M. A. und Garcia J. L. Biochem. Biophys. Res. Comm. (1997) 232: 759–765 [0099]
- Allouche N. et al. Appl. Environ. Microbiol. (2004) 70: 2105–2109 und J. Agric. Food. Chem. (2005) 53: 6525–6530 [0099]
- Diaz E. et al. Microbiol. Mo/. Biol. Rev. (2001) 65: 523–569 [0099]
- Prieto M. A. et al. J. Bacteriol (1993) 175: 2162–2167 [0102]

Claims

Verfahren Herstellung von Hydroxytyrosol aus Tyrosol, das die Zugabe von Tyrosol oder einer Tyrosol-enthaltenden Zusammensetzung zu einem Reaktionsgemisch, enthaltend einen Mikroorganismus, der Tyrosol hydroxylieren kann, oder zu einem Reaktionsgemisch, enthaltend ein Enzym, erzeugt aus besagtem Mikroorganismus, der das Wasserstoffatom an Stellung 3 in eine Hydroxylgruppe umwandeln kann, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus mindestens eine DNA-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Polynucleotiden, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, umfassend die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR.: 2, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 6, SEQ ID NR.: 8 und SEQ ID NR.: 10, wobei die Proteine von SEQ ID NR.: 2 und 4 die Aktivität einer Monooxygenase haben und die Proteine von SEQ ID NR.: 6, SEQ ID NR.: 8 und SEQ ID NR.: 10 die Aktivität einer Tyrosinase haben; b) Polynucleotiden, umfassend die Nucleotidsequenz nach SEQ ID NR.: 1, SEQ ID NR.: 3, SEQ ID NR.: 5, SEQ ID NR.: 7 und SEQ ID NR.: 9; c) Polynucleotiden, umfassend eine Nucleotidsequenz, die ein Fragment oder Derivat eines Polypeptids, codiert durch ein Polynucleotid von irgendeinem von (a) oder (b), codiert, wobei in dem Derivat ein oder mehrere Aminosäurerest(e) im Vergleich zu dem Polypeptid konservativ substituiert ist/sind, und das Fragment oder Derivat ein Protein mit der Aktivität einer Monooxygenase oder einer Tyrosinase codieren; d) Polynucleotiden, deren komplementärer Strang unter stringenten Bedingungen an ein Polynucleotid, das ein die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR.: 2, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 6, SEQ ID NR.: 8 und SEQ ID NR.: 10 umfassendes Polypeptid codiert, oder an ein wie in (a) bis (c) definiertes Polynucleotid hybridisiert; und die ein Protein mit der Aktivität einer Monooxygenase oder einer Tyrosinase codieren; e) Polynucleotiden, die mindestens zu 70%, wie 85, 90 oder 95%, zu einem Polynucleotid, das ein die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR.: 2, SEQ ID NR.: 4, SEQ ID NR.: 6, SEQ ID NR.: 8 und SEQ ID NR.: 10 umfassendes Polypeptid codiert, oder zu einem wie in (a) bis (d) definierten Polynucleotid homolog sind; oder f) dem komplementären Strang eines solchen Polynucleotids, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Mikroorganismus genetisch verändert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Mikroorganismus a) Nucleotidsequenzen, die die Polypeptide, umfassend die Aminosäuresequenzen nach SEQ ID NR.: 2 und SEQ ID NR.: 4, codieren, oder b) Nucleotidsequenzen nach SEQ ID NR.: 1 und SEQ ED NR.: 3 umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass dem Reaktionsmedium Glutathion und/oder Glycerol und/oder Ascorbinsäure zugegeben werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass dem Reaktionsmedium ein Kupfersalz zugegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Hydroxytyrosol von ruhenden Zellen produziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Hydroxytyrosol von wachsenden Zellen produziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Tyrosol-enthaltende Zusammensetzung Olivenvegetationswasser oder Olivenwasser oder Abwasser einer Olivenmühle oder Gemische davon und Extrakte daraus ist.