WO2008148640A1 - Mikrobiologische herstellung von aldehyden, insbesondere von 3-hydroxypropionaldehyd - Google Patents

Mikrobiologische herstellung von aldehyden, insbesondere von 3-hydroxypropionaldehyd Download PDF

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WO2008148640A1
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glycerol
enzyme
hydroxypropionaldehyde
cell
cells
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PCT/EP2008/056195
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Steffen Schaffer
Mirja Wessel
Thomas Haas
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Evonik Degussa Gmbh
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    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/0103—Glycerol dehydratase (4.2.1.30)

Definitions

  • the present invention relates to a genetically modified cell, a method for producing a genetically modified cell, the genetically modified cell obtainable by these methods, processes for the preparation of aldehydes, in particular of 3-hydroxypropionaldehyde, and a process for the preparation of C3 compounds 3-hydroxypropionaldehyde.
  • 3-hydroxypropionaldehyde is a C3 compound which, by further oxidation, reduction or dehydration, whether biocatalytically or chemically-catalytically, is converted into the "building blocks" 3-hydroxypropionic acid, 1, 3-propanediol and acrolein, which are important for the chemical industry
  • Acrolein for example, is an important intermediate for the production of methionine (for use as a pharmaceutical amino acid or feed additive), acrylic acid (monomer of the polyacrylic acid used as superabsorbent) or methyl acrylate (monomers for high-performance polymers).
  • Hydroxypropionaldehyde can be efficiently produced by biotransformation from glycerol.
  • the responsible enzyme is the coenzyme Bi2-dependent glycerol dehydratase, which was detected in a number of Gram-positive and Gram-negative bacteria.
  • 3-hydroxypropionaldehyde can be prepared by biotransformation of glycerol with Lacbacillus reuteri cells (see Example Doleyres et al .. in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 68 (4), 2005, pp. 467-474; Vollenweider and Lacroix in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 64 (1), 2004, pages 16-27; Lüthi-Peng et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 60 (1-2), 2002, pages 73-80.)
  • Lactobacillus reuteri is capable of partially forming the formed 3-hydroxypropionaldehyde into 1,3-propanediol (with the aid of the enzyme 1,3-propanediol oxidoreductase or 1,3-propanediol dehydrogenase) (see, for example, Vollenweider and Lacroix in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.
  • lactic acid in turn inhibits the growth of the cells and leads to a reduction of the carbon source-related biomass yield and to increased costs for the production of the biomass and thus of the biocatalyst.
  • other host cells such as, for example, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii or Enterobacter agglomerans, have also been used for the fermentative production of 3-hydroxypropionaldehyde (see, for example, Slininger et al., Applied Environmental Microbiology, 46, 1983, pages 62 -67 and for review Vollenweider and Lacroix in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 64 (1), 2004, pages 16-27).
  • the object of the present invention was to overcome the disadvantages resulting from the prior art.
  • the present invention has the object to provide cells which are even more efficient than the cells known from the prior art capable of producing aldehydes from suitable carbon compounds, but in particular 3-hydroxypropionaldehyde from glycerol.
  • the cells used for this purpose should be able to automatically produce the coenzyme Bi 2 required by the enzyme glycerol dehydratase.
  • a further object of the present invention is to provide a process for the preparation of aldehydes, in particular of 3-hydroxypropionaldehyde, by means of which these aldehydes can be prepared directly and in particular without prior reaction with reactive compounds, such as semicarbazide.
  • a contribution to achieving the abovementioned objects is made by a cell which is capable of forming corrinoids and which has been genetically engineered with respect to its wild type in such a way that it produces more aldehydes from diols, for example from 1,2-propanediol, compared to its wild type , from triols or from polyols, for example from D-galactonate or D-mannonate, but preferably more 3-hydroxypropionaldehyde from glycerol can form.
  • the ability of the cell to form corrionoids by itself enables it to form the aldehydes, preferably 3-hydroxypropionaldehyde, even in a culture medium containing no corrionides
  • the use of preferably resting, genetically engineered cells capable of producing coenzyme Bi 2 enables efficient fermentative production of 3-hydroxypropionaldehyde without the need to add reactive compounds such as semicarbazide to reduce its bacteriocidal or bacteriostatic effect.
  • corrionoid is understood to mean a heterocyclic ring system which is related to the porphyrin ring in hemoglobin
  • Corionoids which are preferred according to the invention are, in particular, vitamin B12, coenzyme B12 and cobalamin.
  • Resting cells in the sense of the invention are understood to mean cells which are in a state in which the ability of the cells to divide is limited, preferably not at all, as a result of a lack of metabolic products required for division.
  • a wild-type cell is preferably designated as the cell whose genome is in a state as naturally produced by evolution, and which is used both for the entire cell and for individual genes. In particular, therefore, no such cells or genes whose gene sequences have been altered at least in part by humans by means of recombinant methods are included.
  • 3-hydroxyproplonaldehyde describes the corresponding compound in the form in which it is present in the nutrient medium after production by the cells
  • the term "3-hydroxypropionaldehyde” therefore includes in particular the free monomer of FIG Hydroxypropionaldehyde (C3O2H6), the hydrate of 3-hydroxypropionaldehyde (CsOsH 8 ), the cyclized dimer of 3-hydroxypropionaldehyde (CeO 4 Hi 2 ), oligomers of the 3-hydroxypropionaldehyde Hydroxypropionaldehyds and known as "reuterin" mixture of the monomer, the hydrate of the 3-hydroxypropionaldehyde and the cyclized dimer of the 3-hydroxypropionaldehyde.
  • the wording "that it is able to form more aldehydes from diols, triols or polyols, preferably more glycerol 3-hydroxypropionaldehyde compared to its wild type” also applies to the case where the wild-type of the genetically modified cell has no aldehydes or no 3-hydroxypropionaldehyde at least, but at least no detectable amounts of these compounds can form and only after the genetic modification detectable amounts of this compound can be formed.
  • Hydroxypropionaldehyde from glycerol "clarify that the cells, the aldehydes or 3-hydroxypropionaldehyde directly from the nutrient medium offered diols, triols or
  • Polyols preferably from glycerol, o- but that the cells other carbon compounds, such as glucose, sucrose or other mono- and polysaccharides, first to diols, triols or polyols, preferably to glycerol, implement and then these diiodes, triols or polyols, preferably glycerol, can then be converted to the corresponding aldehydes, preferably to 3-hydroxypropionaldehyde.
  • the genetically modified cell is genetically engineered such that it is metabolized within a defined time interval, preferably within 2 hours, even more preferably within 8 hours, and most preferably within 24 hours, at least 2 times, more preferably at least 10 times, more preferably at least 100 times, even more preferably at least 1000 times, and most preferably at least lO.OOO times more aldehydes,
  • the increase in product formation can be determined, for example, by cultivating the cell according to the invention and the wild-type cell separately under the same conditions (same cell density, same nutrient medium, same culture conditions) for a specific time interval in a suitable nutrient medium and then Amount of target product (aldehyde, preferably monomer of 3-hydroxypropionaldehyde, hydrate of 3-hydroxypropionaldehyde, cyclized dimer of 3-hydroxypropionaldehyde, oligomer of 3-hydroxypropionaldehyde or reuterin) in the nutrient medium is determined.
  • target product aldehyde, preferably monomer of 3-hydroxypropionaldehyde, hydrate of 3-hydroxypropionaldehyde, cyclized dimer of 3-hydroxypropionaldehyde, oligomer of 3-hydroxypropionaldehyde or reuterin
  • the cells according to the invention can in principle be derived from all cells whose wild-type is already able to form corrinoids, preferably vitamin B12, coenzyme B12 and cobalamin. However, it is also conceivable to use cells whose wild-type is not or is insufficiently capable of forming corrinoids, but which have been modified by recombinant techniques in such a way that they can form sufficient amounts of corrinoids.
  • the cells are recombinant cells of the genus Bacillus, in particular those of the species Bacillus megaterium. Bacillus megaterium is a Gram-positive, immobile, rod-shaped bacterium that is approximately 2 x 5 ⁇ m in size.
  • Bacillus megaterium is endospore-producing.
  • cells of the species Bacillus megaterium are available under the accession numbers DSM 32 T , DSM 90, DSM 319, DSM 321, DSM 322, DSM 333, DSM 337, DSM 339, DSM 344, DSM 509, DSM 510, DSM 786, DSM 1517, DSM 1668, DSM 1669, DSM 1670, DSM 1671, DSM 1804, DSM 2894, DSM 3228 and
  • the cells are recombinant cells of the genus Escherichia, in particular the species Escherichia coli or the species Escherichia leafata.
  • Escherichia blattae belongs to the Enterobacteriaceae family and also grows under aerobic conditions. Cells of the species Escherichia blattae, for example, under the accession numbers DSM 4481 deposited with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH.
  • the cell according to the invention according to the first and also according to the second particular embodiment has a comparison with its wild type.
  • increased activity of an enzyme has egg, which catalyzes the conversion of glycerol to 3-hydroxypropionaldehyde.
  • an increase in the enzymatic activity can be achieved by increasing the copy number of the gene sequence or of the gene sequences which code for the enzyme, use a strong promoter or use a gene or allele which, for a corresponding enzyme, has an increased protein Activity encoded and, where appropriate, combined these measures.
  • Genetically modified cells according to the invention are produced, for example, by transformation, transduction, conjugation or a combination of these methods with a vector which contains the desired gene, an allele of this gene or parts thereof and a vector which enables expression of the gene.
  • Heterologous expression is achieved in particular by integration of the gene or alleles into the chromosome of the cell or an extrachromosomally replicating vector.
  • a common method for preparing the protein gels in co-reactive bacteria and for identifying the proteins is that described by Hermann et al. in Electrophoresis, Volume 22: 1712-23 (2001). Protein concentration can also be assessed by Western blot hybridization with an antibody specific for the protein to be detected (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Co., Spring Harbor Laboratory Press, ColD Spring Harbor, NY USA, 1989) and subsequent optical evaluation with appropriate software for concentration determination (Lohaus and Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647).
  • DNA-binding proteins can be measured by DNA band shift assays (also referred to as gel retardation) (Wilson et al., (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155).
  • DNA band shift assays also referred to as gel retardation
  • the effect of DNA-binding proteins on the expression of other genes can be demonstrated by various well-described methods of the reporter gene assay (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, ColD Spring Harbor, NY USA, 1989).
  • the Intracellular enzymatic activities can be determined by various methods described (Donahue et al., (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al.
  • mutations can be generated either undirected by conventional methods, for example by UV irradiation or by mutation-triggering chemicals, or specifically by means of genetic engineering methods such as deletion (s). Insertion (s) and / or nucleotide exchange (s). These mutations result in genetically engineered cells.
  • Particularly preferred mutants of enzymes are in particular those enzymes which are no longer or at least reduced in comparison to the wild-type enzyme reduced jfeecibacJc-inhibitable.
  • the increase in enzyme activity is achieved by increasing the expression of an enzyme, for example, the copy number of the corresponding genes is increased or the promoter and regulatory region or ribosome is mutated. Binding site, which is located upstream of the structural gene.
  • expression cassettes act, which are installed upstream of the structural gene. By inducible promoters, it is additionally possible to increase the expression at any time.
  • the enzyme gene can be assigned as regulatory sequences but also so-called “enhancers", which also bring about an improved interaction between RNA polymerase and DNA increased gene expression. Measures to extend the lifetime of mRNA also improve expression. Furthermore, by preventing degradation of the enzyme protein, enzyme activity is also enhanced.
  • the genes or gene constructs are present either in plasmids with a different copy number or are integrated and amplified in the chromosome. Alternatively, overexpression of the genes in question can be achieved by changing the composition of the medium and culture. For guidance, the skilled artisan will find, inter alia, Martin et al. (Bio / Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al.
  • episomal plasmids are used, for example. Suitable plasmids are in particular those which are replicated in coryneform bacteria. Numerous known plasmid vectors, such as pZl (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology 64: 549-554 (1989)), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 107: 69-74 (1991)) or pHS2- L (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) are based on the cryptic plasmids pHM1519, pBLI or pGAl.
  • plasmid vectors such as those based on pCG4 (US 4,489,160) or pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66: 119-124 (1990)), pAG1 (US 5,158,891) or pWH1520 (Rygus and Hillen , Applied Microbiology and Biotechnology 35: 594-599 (1991)) can be used in the same way.
  • plasmid vectors by means of which the gene amplification method can be used by integration into the chromosome, as described, for example, by Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60: 126-132 (1994)) for duplication or Amplification of the homodb operon has been described.
  • the complete gene is cloned into a plasmid vector which can be replicated in a host (typically Escherichia coli) but not in Corynebacterium glutamicum.
  • vectors which are used are pSUP301 (Simon et al., Bio / Technology 1: 784-791 (1983)), pKl ⁇ mob or pK19mob (Schäfer et al., Gene 145: 69-73 (1994)), pGEM-T ( Promega Corporation, Madison, Wiscon sin, USA), pCR2.1 T0P0 (Shuman, Journal of Biological Chemischen mistry 269: 32678-84 (1994)), pCR ® Blunt (Invitrogen, Groningen, The Netherlands), pEMl (shrink et al .., Journal of Bacterlology 173: 4510-4516)) or pBGS8 (Spratt et al., Gene 41: 337-342 (1986)).
  • the plasmid vector containing the gene to be amplified is then converted by conjugation or transformation into the desired strain of Corynebacterium glutamicum.
  • the method of conjugation is described, for example, in Schwarzerbach et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994).
  • Methods for transformation are described, for example, in Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican and Shivnan, Bio / Technology 7: 1067-1070 (1989), and Tauch et al., FEMS Microbiology Let - Ters 123: 343-347 (1994).
  • the resulting strain contains at least two copies of the gene of interest.
  • an activity of an enzyme E x which is increased with respect to its wild-type is preferably always a factor of at least 2, more preferably of at least 10, moreover of at least 100, above more preferably at least 1,000, and most preferably at least 10,000, enhanced activity of the respective enzyme E x
  • the cell according to the invention which "has an activity of an enzyme E x increased compared to its wild type, in particular also a cell, their wild type has no or at least no detectable activity of this enzyme E x and only after increasing the Enzyme activity, for example by overexpression, a detectable activity of this enzyme E x shows.
  • the term "overexpression” or the expression “increase in expression” used in the following also encompasses the case that a starting cell, for example a wild-type cell, has no or at least no detectable expression and only by recombinant methods a detectable Expression of the gene coding for the enzyme E x is induced.
  • reduced activity of an enzyme E x it is preferable to use a factor of at least 0.5, more preferably at least 0.1, more preferably at least 0.01, even more preferably at least
  • the reduction of the activity of a particular enzyme may be, for example, by targeted mutation, by the addition of competitive or non-competitive inhibitors or by other measures known to those skilled in the art to reduce the expression of a done certain enzyme encoding gene.
  • the enzyme Ei which catalyzes the conversion of glycerol to 3-hydroxypropionaldehyde, is preferably a glycerol dehydratase or a diol dehydratase (EC 4.2.1.30).
  • the present invention therefore relates in particular to cells which are capable of forming corrinoids and in which the activity of glycerol dehydratase or diol dehydratase has been increased.
  • This enzyme is preferably encoded by the genes selected from the group consisting of pduC, pduD, pduE, pddA, pddB, pddC, dhaB, dhaC, dhaE and the gIdABC genes from Lactobacillus reuteri ATCC55730. Also advantageous is the use of the glycerol dehydratase variant SHGDH22 described in WO-A-2004/056963, which comprises the SEQ. ID No. 322 has.
  • nucleotide sequence of these and other suitable genes for a glycerol dehydratase can be found, for example, in the "Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes" (KEGG database), the National Center for Biotechnology Information (NCBI) databases of the National Library of Medicine (NCBI).
  • glycerol dehydratase from the genera Klebsiella, Citrobacter, Clostridium, Lactobacillus, Enterobacter, Cauloramator , Salmonella and Listeria, more preferably glycerol dehydratase from the species Klebsiella pneumoniae, Citrobacter pneumoniae, Clostridium pasteurianum, Lactobacillus leichmannii, Citrobacter intermedium, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus brevis, Enterobacter agglomerans, Clostridium pasteurianum, Clostridium perfringens, Clostridium kluyveri, Calora mator viterbensis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus hilgard
  • the diol dehydratase in the cells from the genera Klebsiella, Propionibacterium, Clostridium, Lactobacillus, Salmonella, Citrobacter, Flavobacterium, A- cetobacterium, Brucella and Fusobacterium, particularly preferably from the species Klebsiella pneumoniae, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium glycolicum, Lactobacillus brevis, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii, Lactobacillus buchneri, Brucella melitensis, Fusobacterium nucleatum, Klebsiella oxytoca, Salmonella typhimurium,
  • the activity of an enzyme E2 which catalyzes the reactivation of inactivated enzyme Ei is increased in the cell, whereby this enzyme E2 is preferably the glycerol dehydratase.
  • Reactivation factor or a diol dehydratase reactivation factor is preferably the glycerol dehydratase.
  • Reactivation factor is a factor capable of reactivating the inactivated center of the dehydratase after the conversion of glycerol to the 3-hydroxypropionaldehyde.
  • the active center of glycerol dehydratase or diol dehydratase comprises the coenzyme Bi 2 , which is inactivated after the conversion of glycerol to 3-hydroxypropionaldehyde.
  • the glycerol dehydratase reactivation factor or the diol dehydratase reactivation factor are able to replace this inactivated coenzyme B12 by an active coenzyme B12.
  • the dehydratase reactivation factor comprises a large subunit of the glycerol dehydratase Reactivation factor or the diol dehydratase reactivation factor and a small subunit of the glycerol dehydratase reactivation factor or the diol dehydratase reactivation factor, particularly preferably a large subunit of the glycerol dehydratase
  • Reactivation factor and a small subunit of the glycerol dehydratase reactivation factor or the diol dehydratase reactivation factor most preferably a glycerol dehydratase reactivation factor and a small subunit of the glycerol dehydratase
  • Reactivation factor of the ddr ⁇ gene and the large subunit of the glycerol dehydratase reactivation factor are encoded by the gdr ⁇ gene, while the small subunit of the diol dehydratase reactivation factor is encoded by the ddrß gene and the small subunit of the glycerol dehydratase reactivation factor by the gdrß gene can be encoded.
  • the glycerol dehydratase reactivation factor can be expressed from cells of the genus Lactobacillus, Klebsiella, Citrobacter, Clostridium and Enterobacter, in particular from cells of the species Lactobacillus sp., Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus leichmannii, Citrobacter freundii, Citrobacter intermedium , Lactobacillus reuteri, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus brevis, Clostridium pasteurianum, Enterobacter agglomerans and Clostridium kluyveri and most preferably from cells of the species Lactobacillus reuteri.
  • the diol dehydratase reactivation factor is preferably derived Cells of the genus Klebsiella, Citrobacter, Propionibacterium, Lactobacillus, Flavobacterium and Etcobacterium, in particular from the species Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Flavobacterium sp. and Etcobacterium sp., the diol dehydratase reactivating factor being of the genus Lactobacillus, especially of the species Lactobacillus brevis and Lactobacillus buchneri, being most preferred.
  • these two components can originate from the same species or from different species.
  • the activity of an enzyme E 3 is increased in the cell, which facilitates the diffusion of glycerol into the cell.
  • the enzyme E3 is a glycerol channel or a glycerol facilitator (TC IA8.1.1, TC IA8.2.1 or TC IA8.2.2), which is preferably encoded by the glpF gene.
  • Hydroxypropionaldehyd can produce from glycerol, it is also conceivable in principle, the cell of the invention by recombinant means to modify so that they can not only take on the nutrient medium provided glycerol and convert intracellularly to 3-hydroxypropionaldehyde, but that they may also receive via the nutrient medium provided glucose, sucrose or other mono- and polysaccharides, intracellular to glycerol implement and then glycerol can be converted intracellularly to 3-hydroxypropionaldehyde.
  • the glycerol formed in the meantime can also accumulate extracellularly before it is taken up again into the cell and converted intracellularly into 3-hydroxypropionaldehyde.
  • an enzyme E 4 which catalyzes the conversion of dihydroxyacetone phosphate to glycerol-3-phosphate
  • an enzyme E 5 which catalyzes the conversion of glycerol-3-phosphate to glycerol
  • an enzyme E 6 which catalyzes the conversion of dihydroxyacetone phosphate to dihydroxyacetone
  • an enzyme E 7 which catalyzes the conversion of dihydroxyacetone to glycerol.
  • Particularly preferred cells are those cells in which the activity of the following enzymes or combination of enzymes is increased: EiE 4 , EiE 5 , EiE 6 , EiE 7 , EiE 4 E 5 , EiE 4 E 6 , EiE 4 E 7 , EiE 5 e 6, EiE 5 e 7, EiE 6 e 7, EiE 2 e 4, EiE 2 e 5, EiE 2 e 6, EiE 2 e 7 and EiE 2 e 4 e 5 e 6 e 7, wherein the combination EiE 2 e 4 E 5 E 6 E 7 is most preferred.
  • the enzymes or combination of enzymes is increased: EiE 4 , EiE 5 , EiE 6 , EiE 7 , EiE 4 E 5 , EiE 4 E 6 , EiE 4 E 7 , EiE 5 e 6, EiE 5 e 7, EiE 6 e 7, EiE 2 e 4, EiE 2 e 5, EiE 2 e 6, EiE 2 e 7 and EiE 2 e 4 e 5 e 6 e
  • E 4 is a glycerol-3-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.8)
  • E 5 is a glycerol-3-phosphate phosphatase (EC 3.1.3.21)
  • the glycerol-3-phosphate dehydrogenase is preferably encoded by genes selected from the group comprising Gpdl, Gpd2, LOC607942, Gpdh and gps ⁇ .
  • the glycerol-3-phosphate phosphatase is preferably encoded by the corresponding gene of this enzyme from Escherichia coli.
  • the dihydroxyacetone ceton-phosphate phosphatase is preferably selected from genes encoding ⁇ from the group consisting of phoA, ALPI, ALPL, ALPP, ALPPL2, Akp2, Akp3 and Akp5, while the glycerol dehydrogenase is preferably encoded by the gldA gene.
  • nucleotide sequences of further suitable genes of the enzymes E 4 to E 7 can be found in the KEGG database, the NCBI database or the EMBL database.
  • a reduced activity of at least one of the enzymes Eg to En comprises: an enzyme E 8 , which catalyzes the conversion of glycerol to glycerol-3-phosphate; an enzyme Eg, which catalyzes the conversion of glycerol to dihydroxyacetone; an enzyme Eio, which is the reaction of
  • Hydroxypropionaldehyde catalyzed to 1, 3-propanediol; an enzyme En, which catalyzes the conversion of 3-hydroxypropionaldehyde to 3-hydroxypropionic acid.
  • Particularly preferred cells are those cells in which the activity of the following enzymes or combination of enzymes is reduced: E 8 , E 9 , Ei 0 , En, E 8 E 9 , E 8 Ei 0 , E 8 En, E 9 EiO, E 9 En, Ei 0 EiI and E 8 E 9 Ei 0 EiI, the combination E 8 E 9 Ei 0 Ei I being most preferred.
  • E 9 is a glycerol dehydrogenase (EC 1.1.1.6 or
  • a further contribution to the solution of the abovementioned objects is made by a process for producing a genetically modified cell which is capable of forming corrosions, comprising the process step of increasing the activity of an enzyme egg, which catalyzes the intracellular conversion of diols, triols or polyols to aldehydes, preferably from glycerol to 3-hydroxypropionaldehyde.
  • Preferred enzymes Ei are in particular those which have already been mentioned above in connection with the cells according to the invention.
  • the method additionally comprises the step of increasing the activity of an enzyme E 2 , which catalyzes the reactivation of inactivated enzyme Ei, and optionally also increasing an enzyme E 4 , which is the reaction catalyzed by dihydroxyacetone phosphate to glycerol-3-phosphate, and / or an enzyme E 5 , which catalyzes the conversion of glycerol-3-phosphate to glycerol, and / or an enzyme Ee, the reaction of dihydroxyacetone phosphate to Dihydroxyacetone catalyzes, and / or an enzyme E 7 , which catalyzes the conversion of dihydroxyacetone to glycerol, wherein preferred enzymes E 2 , E 4 , E 5 , Ee and E 7 are in turn those already mentioned in connection with the cell of the invention have been mentioned.
  • the process according to the invention for the production of a genetically modified cell can also comprise the process step of reducing the activity of one or more of the enzymes E 8 to En mentioned in connection with the cell according to the invention.
  • the cells according to the invention produce aldehydes from diols, for example propionaldehyde from 1,2-propanediol
  • the cell according to the invention has an increased activity of an enzyme E 12 which catalyzes the conversion of 1,2-diols into the corresponding aldehydes, this enzyme E 12 preferably being a diol dehydratase
  • the inventive Cell has an increased activity of an enzyme E 13 , which catalyzes the conversion of polyols to the corresponding aldehydes, wherein this enzyme E 13 is preferably a D-galactonate dehydratase or a D-mannonate dehydratase.
  • a contribution to achieving the abovementioned objects is also made by a process for the preparation of aldehydes from diols, triols or polyols, preferably from 3-hydroxypropionaldehyde from glycerol, comprising the following process steps:
  • a culture medium in which the biomass formed per unit time and volume unit is at least 50%, particularly preferably at least 90%, particularly preferably at least 99%, compared to the time and volume unit in method step i) is reduced and which contains diols, triols or polyols, preferably glycerol, under conditions in which the
  • Cells from the diols, triols or polyols form aldehydes, preferably from the glycerol 3-hydroxypropionaldehyde;
  • a cell according to the invention or a cell obtainable by the method according to the invention is brought into contact with a culture medium which allows the formation of biomass from the cells.
  • the phrase "which allows the formation of biomass from the cells” is intended to express that the cells in the culture medium used in step i) are able to divide sufficiently.
  • the culture medium used in process step i) is preferably a nutrient medium containing as carbon source preferably carbohydrates, in particular glucose, sucrose or other mono- and polysaccharides, glycerol or a mixture of carbohydrates, in particular glucose, and glycerol. If the cells used in the process according to the invention for the preparation of aldehydes, preferably of 3-hydroxypropionaldehyde, are capable of producing aldehydes, especially
  • Hydroxypropionaldehyd produce from carbohydrates such as glucose, sucrose or other mono- and polysaccharides, it is advantageous that the activity of the enzyme egg and optionally also the activity of the enzyme E 2 during the performance of process step i) is not increased to prevent in that aldehydes, in particular 3-hydroxypropionaldehyde, are already formed in process step i).
  • This can be achieved, for example, by the fact that the genes of the enzyme Ei and optionally of the enzyme E 2 are located in the cells under the control of suitable promoters and only in process step iii) are these promoters induced.
  • the expression of the genes lying under the control of this promoter for the enzyme Ei and possibly also for the enzyme E 2 could be effected only in process step iii) by the addition of suitable inducers such as IPTG. It is also conceivable to use promoters which can be regulated by way of certain physical parameters, such as the temperature, in order to control the expression of the enzyme Ei and possibly also of the enzyme E 2 .
  • the genetically modified cells according to the invention can be used continuously or discontinuously in the batch process (batch culturing) or in the fed-batch process (feed process) or repeated-fed-batch process (reactive feed process) for the purpose of producing biomass in process step i ) are brought into contact with the nutrient medium and thus cultivated. Also conceivable is a semi-continuous process, as described in GB-A-1009370.
  • a summary of known cultivation methods can be found in the textbook by Chmiel ("Bioreatechnik 1. Introduction to Bioprocess Engineering” (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas ("Bioreactors and Peripheral Facilities", Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994).
  • the culture medium to be used in process step i) must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington D.C, USA, 1981).
  • carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and fats such.
  • oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut oil, fatty acids such.
  • palmitic acid, stearic acid and linoleic acid or glycerol can be used. These substances can be used individually or as a mixture.
  • Particularly preferred is the use of carbohydrates, in particular of glucose, or of glycerol.
  • organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea, or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • Phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the phosphorus source.
  • the culture medium must continue to contain salts of metals such. As magnesium sulfate or iron sulfate, which are necessary for growth.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used in addition to the above-mentioned substances.
  • suitable precursors can be added to the culture medium.
  • the stated feedstocks can be added to the culture in the form of a one-time batch or fed in during the cultivation in a suitable manner.
  • the culture For pH control of the culture, basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid are suitably used.
  • B. fatty acid polyglycol esters are used.
  • the medium suitable selective substances such as B. antibiotics are added.
  • oxygen or oxygen-containing gas mixtures such as air, registered in the culture.
  • the temperature The culture is usually at 20 0 C to 80 0 C and preferably at 25 ° C to 40 0 C.
  • step i) After a sufficient biomass of recombinant Bacillus megaterium, Escherichia coli or Escherichia blattae cells has been produced in step i), it can, in particular if the cells are not immobilized on or in a substrate and in this form in step iii ) should be used for the preparation of aldehydes or 3-hydroxypropionaldehyde, be advantageous to separate the cells thus obtained in step ii) of the culture medium used.
  • the separation of the cells takes place by means of the separation process known to those skilled in the art.
  • the cells separated in this way if they have been obtained in several successive stages of separation, optionally combined and can be fed directly to the process step iii). However, it may prove advantageous to wash the cells before carrying out process step iii), wherein this Washing is preferably carried out already with that culture medium which is used in process step iii).
  • the cells For washing the cells, they can be resuspended, for example, in a suitable volume of the culture medium used in process step iii) and then freed from the culture medium by the separation processes described above, in particular by filtration, sedimentation or centrifugation or else by a combination of these measures , In this way, the cells can be freed from those components of the nutrient medium used in process step i), which in particular allow growth of the cells (nitrogen compounds, phosphorus compounds, essential amino acids and the like).
  • the cells are then termed "quiescent cells" with a culture medium in which the time and volume unit related biomass formation by at least 50%, more preferably by at least 90%, more preferably at least 99% over the time and volume unit related biomass formation in step i), and which includes diols, triols or polyols, preferably glycerol, under conditions in which the cells from the diols, triols or polyols aldehydes, preferably Most preferably, process step iii) involves the use of a culture medium in which there is no detectable biomass formation, meaning that the cells scarcely dissociate significantly any more.A reduction in biomass formation of 50%.
  • the cells according to the invention are then able to convert the diols, triols or polyols, preferably the offered glycerol, over the culture medium into aldehydes, preferably to 3-hydroxypropionaldehyde, in high yield.
  • the culture medium used in process step iii) contains, in addition to the glycerol, also suitable inducers of the promoter or ., corresponding physical parameters, such as the temperature, in process step iii) are adjusted accordingly in order to induce the expression of the enzymes.
  • the culture medium used in process step iii) can be any of the solvents or solutions known to those skilled in the art, which are suitable for cultivating cells of the species Bacillus megaterium, Escherichia coli or Escherichia blattae without these cells disseminating to any significant extent, but without the Vitality of the cells to an appreciable extent.
  • the cells should, after a removal, if appropriate in a further process step v), take place from the step iii) as far as possible be able to form new biomass in a resuspension in a nutrient medium permitting cell division.
  • culture medium in method step iii) include.
  • buffered salt solutions such as PBS (phosphate buffered saline) or other saline solutions, which are preferably suitable pH buffer systems such as HEPES, MOPS or other buffer components, is conceivable as culture medium in method step iii) include.
  • the culture medium used in method step iii) contains no corrinoids, preferably no coenzyme B12, no vitamin B12 and no cobalamin.
  • the aldehydes thus formed or the 3-hydroxypropionaldehyde thus formed can then be separated off in a further process step iv) from the culture medium used in process step iii) and optionally unreacted glycerol and thus purified, this purification being carried out by methods known to the person skilled in the art such as by crystallization, lyophilization by lyophilization, by chromatographic methods or by a combination of these methods can be carried out. Further possibilities for the purification of, for example, 3-hydroxypropionaldehyde and derivatives thereof can be found, inter alia, Vollenweider et al. in Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol.
  • step II optionally separating the cells from the culture medium to ⁇ ; III) bringing the cells into contact with a culture medium in which the biomass formed per unit time and volume unit is at least 50%, particularly preferably at least 90%, particularly preferably at least 99%, compared to the time and volume unit in method step I) is reduced and which contains glucose, sucrose or other mono- and polysaccharides and optionally also glycerol, under conditions under which the cells from the glucose, sucrose or other mono- and polysaccharides via glycerol as an intermediate and optionally also directly from glycerol Form hydroxypropionaldehyde;
  • Hydroxypropionaldehyde provided by the above described method for the production of 3-hydroxypropionaldehyde from glycerol or the method described above for the preparation of 3-hydroxypropionaldehyde from glucose, sucrose or other mono- and polysaccharides, said optionally substituted as described above in connexion with ⁇ To described in this method, may have been purified from the fermentation solution.
  • 3-hydroxypropionaldehyde can then be obtained chemically or biocatalytically by reduction, oxidation or dehydration to give C 3 compounds, in particular to give 1,3-propanediol (reduction), acrolein (dehydration) or 3-hydroxypropionaldehyde.
  • Hydroxypropionic acid (oxidation) be implemented.
  • details of the conversion of 3-hydroxypropionaldehyde to acrolein, among other ⁇ rem by Hall and star in Journal of the Chemical Socie ty ⁇ , 1950, pages 490 to 498 are described as details of the preparation of 1, 3-propanediol from 3-hydroxypropionaldehyde
  • US 5,334,778 can be taken ent ⁇ .
  • the production of 3- Hydroxypropionic acid from 3-hydroxypropionaldehyde is described inter alia in US Pat. No. 6,852,517.
  • Process step D) be further implemented chemically or microbiologically by reduction, oxidation or addition.
  • Particularly suitable here is the reaction of acrolein obtained in process step C) by oxidation to acrylic acid, which can then optionally be reacted in a still further process step D) radically to form acrylic acid-based polymers.
  • Particularly suitable here is the free-radical polymerization of optionally partially neutralized acrylic acid in the presence of suitable
  • Crosslinking agents to form water-absorbing polyacrylates which are also referred to as "superabsorbents.”
  • the chemical oxidation of acrolein to acrylic acid and the subsequent free-radical polymerization of the resulting acrylic acid is described inter alia in WO-A-2006/136336.
  • the second preculture was also completely converted into 1 1 of fresh MRS medium and 15 h at 37 0 C without agitation in a 1000 mL Schott bottle. Subsequently, the cells were harvested (10 min, 4000 g, RT), washed with 0.1 M potassium phosphate buffer and used directly for the production of 3-hydroxypropionaldehyde. The cell pellet was resuspended in 100 ml of 250 mM glycerol to start the biotransformation of glycerol to 3-hydroxypropionaldehyde.
  • LB medium (according to Miller, Merck KGaA, Darmstadt) with B. megaterium DSM319 or E. blattae DSM4481 cells from a fresh LB plate (Miller, Merck KGaA, Darmstadt) were used. vaccinated and incubated at 37 0 C and at 180 rpm for about 8 h. Subsequently, 100 ml of LB medium were inoculated with 1.5% (v / v) of the preculture and the cells were inoculated to stationary Phase (about 16 h) at 37 ° C, cultured 180 rpm. L.
  • reuteri cells were cultured in MRS medium (without glycerol) as described above. Subsequently, the cells were harvested by centrifugation (10 min, 5292 g, 4 ° C), washed once with 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7) and in 5 ml of the 160 mM 3-hydroxypropionaldehyde solution described above resuspended. The biomass concentration was -IxIO 10 cells per ml.
  • Chromosomal DNA from Lactobacillus reuteri ATCC55730 served as a template for a PCR with the "Expand TM High Fiddleiy" PCR kit from Roche Diagnostics (Mannheim), according to the manufacturer's instructions
  • the coding range of the glycerol dehydratase (gldABC) and The corresponding reactivation factor (gldDE) encoding genes including 34 bp before the gldA start codon was isolated from the chromosomal DNA using the oligonucleotides Bm_GDfw_XmaI (SEQ ID NO: 03) and Bm_GDRFrv_SphI (SEQ ID NO: 04) of Lactobacillus reuteri ATCC55730 in a PCR ("PCR protocols: A guide to methods and applications", 1990, Academic Press) and in this way at the 5 'end or 3' end with an Xmal or a SpM
  • the following oligonucleotides
  • the PCR product (5,212 base pairs) was purified using the QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden) according to the manufacturer's instructions and then lastedd by means of the restriction endonucleases Xmal and SphI (according to the instructions of the manufacturer, New England Biolabs, Schwalbach) cut.
  • the now 5,202 bp fragment was ligated into the Xmal / Sphl-cut expression vector pWH1520 (7,896 base pairs, described by Rygus and Hillen in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol.
  • the resulting plasmid pWH1520-gldABCDE (SEQ ID NO: 02) is 13,098 base pairs in size.
  • the ligation and the transformation of chemically competent E. coli cells were carried out in a manner known to the person skilled in the art. The authenticity of the insert was checked by DNA sequence analysis.
  • the plasmid pWH1520-gldABCDE as well as the empty vector pWH1520 were introduced into B.
  • the B. megaterium xyl ⁇ promoter in plasmid pWH1520-gldABCDE was first replaced by the lacZ promoter from E. coli.
  • the lacZ promoter was amplified by PCR according to Innis et al. using pUC19 DNA (GenBank entry L09137) as template and the following oligonucleotides:
  • PlacZ-fw 5'-TAT ATA GCT AGC CTC ATT AGG CAC CCC AGG C-3 '(SEQ ID NO: 05, containing a NheI recognition sequence at the 5' end)
  • PlacZ-rv 5'-TAT ATA CCC GGG CAA TTC CAC ACA ACA TAC GAG CC-3 '(SEQ ID NO: 06, containing a Xmal recognition sequence at the 5' end)
  • the PCR product (84 base pairs) was purified using the QIA-quick PCR purification kit from Qiagen, Hilden, according to the manufacturer's instructions.
  • the purified PCR product was digested by NheI and Xmal (also according to the instructions of the restriction endonuclease producer, New England Biolabs, Schwalbach) and into the NheI / Xmal-cut vector pWH1520-gld ⁇ BCDE (Example 2) to obtain the vector pWH1520 -gldABCD.E-lacZ (10,896 base pairs, SEQ ID NO: 07).
  • the authenticity of the insert was determined by DNA sequencing. Ligation of the expression vector and the preparation and the
  • Transformation of chemically competent E. coli cells was carried out in a manner known to the person skilled in the art.
  • the PCR product (2,738 base pairs) was analyzed by means of the
  • GDRF-fw 5'-GGA AGC TAA GGA GAT ATA CCA TGT CGC TTT
  • the PCR product (2,234 base pairs) was purified using the QIAquick PCR purification kit from Qiagen, Hilden, according to the manufacturer's instructions.
  • the glycerine dehydratase variant SHGDH22 was crossover-PCRed (according to Innis et al.) Using the two primary PCR products, as well as the large and small subunit of the corresponding Klebsiella pneumoniae reactivation factor Encode ATCC25955, put together.
  • 1 ng each of the two primary PCR products were combined and used together as a template for a PCR with the oligonucleotides GD-fw (SEQ. ID No. 09) and GDRF-rv (SEQ.
  • the PCR product (4,938 base pairs) was purified using the QIAquick PCR purification kit from Qiagen, Hilden, according to Information from the manufacturer purified.
  • the purified PCR product was digested by Xmal and SphI (also according to the instructions of the manufacturer of the restriction endonucleases, New England Biolabs, Schwalbach) and into the Xmal / 5phl-cut vector pWH1520-gldABCDE (Example 2) to obtain the vector pWH1520 -SHGDH22 (10,118 base pairs, SEQ ID NO: 13).
  • the authenticity of the insert was determined by DNA sequencing. Ligation of the expression vector and the production and transformation of chemically competent E. coli cells were carried out in a manner known to the person skilled in the art.
  • the plasmids pWH1520, pWH1520-gldABCD.E-lacZ and pWH1520-SHGDH22 were electroporated into
  • E. blattae DSM4481 and the resulting strains E. J blattae / pWH1520, E. blattae / pWR1520-gldABCDE and E. J blattae / pWH1520-SHGDH22 called.
  • 1 l of LB medium (Miller, Merck KGaA, Darmstadt) was inoculated with 10 ml of an overnight culture, cultured until reaching an OD of 0.7 at 37 ° C., and then the cells were incubated for 30 min incubated on ice. All further steps were done on ice.
  • the cells were washed with 1 liter of ice-cold water and again with 500 ml of ice-cold water. This was followed by another washing step with 10 ml glycerol solution (10%, w / v, 15 min, 3300 g, 4 ° C). The cell pellet was resuspended in 2 ml of 10% glycerol solution and 40 ul aliquots stored at - 80 0 C.
  • the DNA to be transformed (1-2 ⁇ g) was added to an aliquot of frozen, competent E. blattae cells and thawed on ice (maximum 10 minutes). Subsequently, the batch was transferred to a pre-cooled electroporation cuvette.
  • Example 4 HPLC-based quantification of glycerol, 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionaldehyde
  • E. blattae strains E. blattae J / pWH1520, E. blattae / pWR1520-gldABCDE or E. blattae J / pWH1520-SHGDH22 were first in 5 ml LB medium containing 100 ug / ml ampicillin overnight cultured at 37 ° C and 180 rpm. The next morning, 2 ml of these precultures were used to inoculate 200 ml LB each with 2% (w / v) glucose, 20 mM glycerol and 100 ⁇ g / ml ampicillin in 1-1 baffled flasks. Both flasks were incubated at 37 ° C.
  • Control strain B. megaterium / p ⁇ lR1520 were initially dissolved in 5 ml of A5 medium (Malten, M., Hollmann, R., Deckwer,

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zelle, die in der Lage ist, Corrinoide zu bilden und die gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Aldehyde aus Diolen, Triolen oder Polyolen, vorzugsweise mehr 3- Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin, zu bilden vermag. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, die durch diese Verfahren erhältliche gentechnisch veränderte Zelle, Verfahren zur Herstellung von Aldehyden, vorzugsweise von 3- Hydroxypropionaldehyd, sowie ein Verfahren zur Herstellung von C3-Verbindungen aus 3-Hydroxypropionaldehyd.

Description

Mikrobiologische Herstellung von Aldehyden, insbesondere von 3-Hydroxypropionaldehyd
Die vorliegende Erfindung betrifft eine gentechnisch veränderte Zelle, ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, die durch diese Verfahren erhältliche, gentechnisch veränderte Zelle, Verfahren zur Herstellung von Aldehyden, insbesondere von 3- Hydroxypropionaldehyd, sowie ein Verfahren zur Herstellung von C3~Verbindungen aus 3-Hydroxypropionaldehyd.
3-Hydroxypropionaldehyd ist eine C3-Verbindung, die durch weitere Oxidation, Reduktion oder Dehydratisierung, sei es biokatalytisch oder chemisch-katalytisch, zu den für die chemische Industrie wichtigen „building blocks" 3- Hydroxypropionsäure, 1, 3-Propandiol und Acrolein umgesetzt werden kann. Acrolein ist zum Beispiel ein wichtiges Inter- mediat für die Herstellung von Methionin (zur Verwendung als Pharma-Aminosäure oder Futtermittel-Additiv) , Acrylsäu- re (Monomer der als Superabsorber verwendeten Polyacrylsäu- re) oder Acrylsäuremethylestern (Monomere für Hochleistungspolymere) .
Aus dem Stand der Technik ist bereits bekannt, dass 3-
Hydroxypropionaldehyd effizient durch Biotransformation aus Glycerin hergestellt werden kann. Das verantwortliche Enzym ist die Coenzym Bi2~abhängige Glycerin-Dehydratase, die in einer Reihe von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien nachgewiesen werden konnte. 3-Hydroxypropionaldehyd kann unter anderem durch Biotransformation von Glycerin mit Lac- tobacillus reuteri-Zellen hergestellt werden (siehe zum Beispiel Doleyres et al .. in Applied Microbiology and Bio- technology, Vol. 68 (4), 2005, Seiten 467-474; Vollenweider und Lacroix in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 64 (1), 2004, Seiten 16-27; Lüthi-Peng et al .. in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 60 (1-2), 2002, Seiten 73-80.)
Die Herstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd mit Lactobacil- lus reuteri weist mindestens zwei gravierende Nachteile auf. Zum einen vermag Lactobacillus reuteri das gebildete 3-Hydroxypropionaldehyd teilweise zu 1, 3-Propandiol (mit Hilfe des Enzyms 1, 3-Propandiol-Oxidoreduktase bzw. 1,3- Propandiol-Dehydrogenase) (siehe zum Beispiel Vollenweider und Lacroix in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 64 (1), 2004, Seiten 16-27) bzw. 3-Hydroxypropionsäure (mit Hilfe des Enzyms 3-Hydroxypropionaldehyd-Dehydrogenase) (siehe zum Beispiel Chen et al. in Journal of Biomedical Materials Research, Vol. 61, 2002, Seiten 360-369) umzusetzen, wodurch der 3-Hydroxypropionaldehyd-Ertrag reduziert wird. Diese Nebenprodukte können im Weiteren auch die Aufarbeitung des gebildeten 3-Hydroxypropionaldehyds erschweren. Zum anderen hat Lactobacillus reuteri, wie andere Lac- tobacillen, einen geringen Biomasse-Ertrag, bezogen auf die eingesetzte Kohlenstoffquelle . Ursache ist die Unfähigkeit dieser Zellen, Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor zu verwenden. Es werden daher erhebliche Mengen an reduzierten Gärungsprodukten, wie etwa Milchsäure, gebildet. Diese Milchsäure-Bildung wiederum inhibiert das Wachstum der Zellen und führt zu einer Reduzierung des kohlenstoff- quellenbezogenen Biomasse-Ertrages und zu erhöhten Kosten für die Herstellung der Biomasse und damit des Biokatalysators . Neben Lactobacillus reuteri wurden auch andere Wirtszellen, wie beispielsweise Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii oder Enterobacter agglomerans, zur fermentativen Herstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd eingesetzt (siehe zum Beispiel Slininger et al . in Applied Environmental Mic- robiology, Vol. 46, 1983, Seiten 62-67 und zur Übersicht Vollenweider und Lacroix in Applied Microbiology and Bio- technology, Vol. 64 (1), 2004, Seiten 16-27). Der Nachteil des Einsatzes solcher Mikroorganismen zur Herstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd besteht allerdings darin, dass aufgrund der im Hinblick auf diese Mikroorganismen bakteriozi- den Wirkung des gebildeten 3-Hydroxypropionaldehyds Semi- carbazid zugesetzt werden muss, dass durch Umsetzung mit 3-Hydroxypropionaldehyd zum entsprechenden Semicarbazon 3- Hydroxypropionaldehyd aus dem Nährmedium entfernt. Bei Abwesenheit von Semicarbazid werden nur geringe Mengen 3- Hydroxypropionaldehyd gebildet, (siehe zum Beispiel Vollenweider und Lacroix in Applied Microbiology and Biotechnolo- gy, Vol. 64 (1), 2004, Seiten 16-27). Der Zusatz von Semicarbazid wäre aber im Falle einer großtechnischen Anwendung der Technologie ein erheblicher Kostenfaktor und würde die weitere Aufarbeitung des 3-Hydroxypropionaldehyds erschweren .
Schließlich wurden auch bereits rekombinante Zellen beschrieben, die in der Lage sind, 3-Hydroxypropionaldehyd zu bilden (siehe zum Beispiel EP-A-I 669 457) . Jedoch musste hier Coenzym Bi2 zugesetzt werden, dass vom Enzym Glycerin- Dehydratase als Cofaktor aufgrund des radikalischen Reaktionsmechanismus benötigt wird, von den eingesetzten Zellen aber nicht selbst gebildet werden kann. Aufgrund des hohen Preises von Coenzym Bi2 ist auch diese Technologie für eine großtechnische Anwendung ungeeignet.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile zu ü- berwinden .
Insbesondere lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Zellen bereitzustellen, welche noch effizienter als die aus dem Stand der Technik bekannten Zellen in der Lage sind, Aldehyde aus geeigneten Kohlenstoffverbindungen, insbesondere jedoch 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin herzustellen. Dabei sollten aus dem Glycerin in möglichst geringem Umfang von 3-Hydroxypropionaldehyd verschiedene C3~Verbindungen, so genannte Nebenprodukte, hergestellt werden. Die dafür verwendeten Zellen sollen in der Lage sein, selbsttätig das vom Enzym Glycerin-Dehydratase benötigte Coenzym Bi2 herzustellen.
Weiterhin lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Aldehyden, insbesondere von 3-Hydroxypropionaldehyd, anzugeben, mittels dessen diese Aldehyde unmittelbar und insbesondere ohne vorherige Umsetzung mit reaktiven Verbindungen, wie etwa Semicarbazid, hergestellt werden können.
Einen Beitrag zur Lösung der vorstehend genannten Aufgaben leistet eine Zelle, die in der Lage ist, Corrinoide zu bilden und die gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Aldehyde aus Diolen, beispielsweise aus 1,2- Propandiol, aus Triolen oder aus Polyolen, beispielsweise aus D-Galactonat oder D- Mannonat, vorzugsweise jedoch mehr 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin, zu bilden vermag. Durch die Fähigkeit der Zelle, selbst Corrionoide zu bilden, ist diese in der Lage, die Aldehyde, vorzugweise 3- Hydroxypropionaldehyd, auch in einem Kulturmedium zu bilden, welches keine Corrionide enthält
Völlig überraschend, dafür aber nicht minder vorteilhaft, wurde festgestellt, dass sich gentechnisch veränderte ZeI- len, die in der Lage sind Coenzym Bi2 herzustellen, eignen, um effizient beispielsweise 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin herzustellen. Dieses war für den Fachmann keinesfalls vorherzusehen, da aus dem Stand der Technik bekannt war, dass 3-Hydroxypropionaldehyd auf zahlreiche Mikroorga- nismen, deren Wildtyp auf natürliche Weise kein 3-
Hydroxypropionaldehyd bildet und die daher im Gegensatz zu Lactobacillus reuteri nicht an die Bildung dieser Verbindung adaptiert sind, bakteriostatisch oder bakteriozid wirkt (siehe zum Beispiel Chen et al .. in Journal of Biome- dical Materials Research, Vol. 61 (3), 2002, Seiten 360- 369) . Der Einsatz von vorzugsweise ruhenden, gentechnisch veränderten Zellen, die in der Lage sind, Coenzym Bi2 herzustellen, ermöglicht die effiziente fermentative Herstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd, ohne dass zur Verminderung von dessen bakterioziden oder bakteriostatischen Wirkung reaktive Verbindungen wie etwa Semicarbazid zugesetzt werden müssen .
Unter einem „Corrionoid" wird ein heteroyclisches Ringsys- tem verstanden, welches mit dem Porphyrin-Ring im Hämoglobin verwand ist. Das Ringsystem des Corrinoids besteht aus vier reduzierten Pyrrol-Untereinheiten (Tetrapyrrol) , die auf zwei gegenüberliegenden Seiten über je eine -C(CH3)= Methin-Brücke, auf einer Seite über eine -CH= Methin-Brücke und auf der letzten Seite direkt verbunden sind. Erfin-
dungsgemäß bevorzugte Corrionoide sind insbesondere Vitamin B12, Coenzym B12 und Cobalamin.
Unter „ruhenden Zellen" im Sinne der Erfindung werden ZeI- len verstanden, welche sich in einem Zustand befinden, in dem die Teilungsfähigkeit der Zellen infolge eines Mangels an für eine Teilung erforderlichen Stoffwechselprodukten eingeschränkt, vorzugsweise überhaupt nicht gegeben ist.
Unter einem „Wildtyp" einer Zelle wird vorzugsweise diejenige Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff „Wild- typ" fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind.
Der Begriff „3-Hydroxyproplonaldehyd" , wie er hierin verwendet wird, beschreibt die entsprechende Verbindung in derjenigen Form, in der sie nach der Herstellung durch die Zellen im Nährmedium vorliegt. Der Begriff „3- Hydroxypropionaldehyd" umfasst daher insbesondere das freie Monomer des 3-Hydroxypropionaldehyds (C3O2H6) , das Hydrat des 3-Hydroxypropionaldehyds (CsOsH8) , das zyklisierte Dimer des 3-Hydroxypropionaldehyds (CeO4Hi2) , Oligomere des 3- Hydroxypropionaldehyds sowie die als „Reuterin" bekannte Mischung aus dem Monomer, dem Hydrat des 3- Hydroxypropionaldehyd und dem zyklisierten Dimer des 3- Hydroxypropionaldehyds .
Die Formulierung „dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Aldehyde aus Diolen, Triolen oder Polyolen , vorzugsweise mehr 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin , zu bilden vermag" betrifft auch den Fall, dass der Wildtyp der gen- technisch veränderten Zelle überhaupt keine Aldehyde bzw. überhaupt kein 3-Hydroxypropionaldehyd, zumindest aber keine nachweisbaren Mengen dieser Verbindungen zu bilden vermag und erst nach der gentechnischen Veränderung nachweisbare Mengen dieser Verbindung gebildet werden können.
Weiterhin soll die Formulierung „mehr Aldehyde aus Diolen, Triolen oder Polyolen , vorzugsweise mehr 3-
Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin" verdeutlichen, dass die Zellen die Aldehyde bzw. 3-Hyroxypropionaldehyd direkt aus den über das Nährmedium angebotenen Diolen, Triolen oder
Polyolen, vorzugsweise aus Glycerin, herstellen können, o- der aber, dass die Zellen andere Kohlenstoffverbindungen, wie etwa Glucose, Saccharose oder andere Mono- und Polysaccharide, zunächst zu Diolen, Triolen oder Polyolen, vor- zugsweise zu Glycerin, umsetzen können und dann diese Dio- Ie, Triole oder Polyole, vorzugsweise das Glycerin, anschließend zu den entsprechenden Aldehyden, vorzugsweise zum 3-Hydroxypropionaldehyd, umsetzen können.
In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass die gentechnisch veränderte Zelle derart gentechnisch verändert ist, dass sie in einem definierten Zeitintervall, vorzugsweise innerhalb von 2 Stunden, noch mehr bevorzugt innerhalb von 8 Stunden und am meisten bevorzugt innerhalb von 24 Stunden, mindestens 2mal, besonders bevorzugt mindestens lOmal, darüber hinaus bevorzugt mindestens lOOmal, darüber hinaus noch mehr bevorzugt mindestens l.OOOmal und am meisten bevorzugt mindestens lO.OOOmal mehr Aldehyde,
vorzugsweise mehr 3-Hydroxypropionaldehyd bildet als der Wildtyp der Zelle. Die Zunahme der Produktbildung kann da- bei beispielsweise dadurch bestimmt werden, dass die erfindungsgemäße Zelle und die Wildtyp-Zelle jeweils getrennt unter gleichen Bedingungen (gleiche Zelldichte, gleiches Nährmedium, gleiche Kulturbedingungen) für ein bestimmtes Zeitintervall in einem geeigneten Nährmedium kultiviert werden und anschließend die Menge an Zielprodukt (Aldehyd, vorzugsweise Monomer des 3-Hydroxypropionaldehyds, Hydrat des 3-Hydroxypropionaldehyds, zyklisiertes Dimer des 3- Hydroxypropionaldehyds, Oligomer des 3- Hydroxypropionaldehyds oder Reuterin) im Nährmedium be- stimmt wird. Verfahren zur Bestimmung der Menge dieser Verbindungen in einem Nährmedium mittels GC-MS sind beispielsweise durch Chen et al. im Journal of Biomedical Materials Research, Vol. 61 (3), 2002, Seiten 360-369 beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Zellen können sich grundsätzlich von allen Zellen ableiten, deren Wildtyp bereits in der Lage ist, Corrinoide, vorzugsweise Vitamin B12, Coenzym B12 und Cobalamin zu bilden. Denkbar ist jedoch auch der Einsatz von Zellen, deren Wildtyp nicht oder nicht ausreichend in der Lage ist, Corrinoide zu bilden, die jedoch durch rekom- binante Techniken derart verändert wurden, dass sie ausreichende Mengen an Corrinoiden bilden können. Gemäß einer ersten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zellen handelt es sich bei den Zellen um re- kombinante Zellen der Gattung Bacillus, insbesondere um solche der Spezies Bacillus megaterium. Bacillus megaterium ist ein Gram-positives, unbewegliches, stäbchenförmiges Bakterium, welches eine Größe von etwa 2 x 5 μm aufweist. Das Bakterium wächst unter aeroben Bedingungen, ist oxida- se-negativ und Katalase-positiv. Wie alle Bakterien aus der Gattung Bacillus ist Bacillus megaterium endosporenbildend. Zellen der Spezies Bacillus megaterium sind beispielsweise unter den Hinterlegungsnummern DSM 32T, DSM 90, DSM 319, DSM 321, DSM 322, DSM 333, DSM 337, DSM 339, DSM 344, DSM 509, DSM 510, DSM 786, DSM 1517, DSM 1668, DSM 1669, DSM 1670, DSM 1671, DSM 1804, DSM 2894, DSM 3228 und
DSM 3641 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH hinterlegt.
Gemäß einer zweiten besonderen Ausführungsform der erfin- dungsgemäßen Zellen handelt es sich bei den Zellen um re- kombinante Zellen der Gattung Escherichia, insbesondere der Spezies Escherichia coli oder der Spezies Escherichia blat- tae . Escherichia blattae zählt zur Familie der Enterobacte- riaceae und wächst ebenfalls unter aeroben Bedingungen. Zellen der Spezies Escherichia blattae sind beispielsweise unter den Hinterlegungsnummern DSM 4481 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH hinterlegt .
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass die erfindungsgemäße Zelle gemäß der ersten und auch gemäß der zweiten besonderen Ausführungsform eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp ge- steigerte Aktivität eines Enzyms Ei aufweist, welches die Umsetzung von Glycerin zu 3-Hydroxypropionaldehyd katalysiert .
Die nun folgenden Ausführungen zur Erhöhung der Enzymaktivität in Zellen gelten sowohl für die Erhöhung der Aktivität des Enzyms Ei als auch für alle nachfolgend genannten Enzyme, deren Aktivität gegebenenfalls erhöht werden kann.
Grundsätzlich lässt sich eine Steigerung der enzymatischen Aktivität dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das Enzym kodieren, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel nutzt, das für ein entsprechendes Enzym mit ei- ner gesteigerten Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Zellen werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder eine Kombination dieser Methoden mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und einen die Expression des Gens ermöglichenden Vektor enthält. Die hete- rologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Zelle oder einen extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt.
Einen Überblick über die Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen am Beispiel der Pyruvat-Carboxylase gibt DE-A-100 31 999, die hiermit als Referenz eingeführt wird und deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglich- keiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivität in Zellen einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet. Die Expression der vorstehend und aller nachfolgend genannten Enzyme bzw. Gene ist mit Hilfe von 1- und 2- dimensionaler Proteingelauftrennung und anschließender optischer Identifizierung der Proteinkonzentration mit ent- sprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Wenn die Erhöhung einer Enzymaktivität ausschließlich auf einer Erhöhung der Expression des entsprechenden Gens basiert, so kann die Quantifizierung der Erhöhung der Enzymaktivität in einfacher Weise durch einen Vergleich der 1- oder 2- dimensionalen Proteinauftrennungen zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderter Zelle bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei co- ryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. in Electrophoresis, Volume 22: 1712-23 (2001) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N. Y. USA, 1989) und anschließender optische Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647) analysiert werden. Die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen kann mittels DNA-Band-Shift-Assays (auch als Gelretardation bezeichnet) gemessen werden (Wilson et al. (2001), Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155). Die Wirkung von DNA- bindenden Proteinen auf die Expression anderer Gene kann durch verschiedene gut beschriebene Methoden des Reporter- gen-Assays nachgewiesen werden (Sambrook et al . , Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N. Y. USA, 1989) . Die intrazellulären enzymatischen Aktivitäten können nach verschiedenen beschriebenen Methoden (Donahue et al . (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8) : 2277-2284; Freed- berg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816- 823) bestimmt werden. Sofern in den nachfolgenden Ausführungen keine konkreten Methoden zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten Enzyms angegeben werden, erfolgt die Bestimmung der Steigerung der Enzymaktivität und auch die Bestimmung der Verminderung einer Enzymaktivität vorzugsweise mittels der in Hermann et al .. , Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al .. , Biospektrum 5 32- 39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630- 2647 (1999) und Wilson et al .. , Journal of Bacterlolo- gy 183: 2151-2155 (2001) beschriebenen Methoden.
Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Mutation des endogenen Gens bewerkstelligt, so können derartige Mutationen entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt wer- den, wie etwa durch UV-Bestrahlung oder durch mutationsaus- lösende Chemikalien, oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion (en) , Insertion (en) und/oder Nukleotidaustausch (e) . Durch diese Mutationen werden gentechnisch veränderte Zellen erhalten. Besonders bevorzugte Mutanten von Enzymen sind insbesondere auch solche Enzyme, die nicht mehr oder zumindest im Vergleich zum Wildtyp- Enzym vermindert jfeecibacJc-inhibierbar sind.
Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Erhöhung der Ex- pression eines Enzyms bewerkstelligt, so erhöht man beispielsweise die Kopienzahl der entsprechenden Gene oder mutiert die Promotor- und Regulationsregion oder die Riboso- menbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Ex- pression zu jedem beliebigen Zeitpunkt zu steigern. Des
Weiteren können dem Enzym-Gen als regulatorische Sequenzen aber auch so genannte "Enhancer" zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA ebenfalls eine erhöhte Genexpression bewirken. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte liegen dabei entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopien- zahl vor oder sind im Chromosom integriert und amplifi- ziert. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al .. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al .. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga {Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al .. {Gene 102, 93-98 (1991)), in EP-A-O 472 869, im US 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler {Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Reinscheid et al .. (Applied and Environ- mental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al.. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in WO-A-96/15246, bei Malumbres et al .. (Gene 134, 15-24 (1993), in JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer (Biotech- nology and Bioengineering 58, 191-195 (1998) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Die vor- stehend beschriebenen Maßnahmen führen ebenso wie die Mutationen zu gentechnisch veränderten Zellen.
Zur Erhöhung der Expression der jeweiligen Gene werden zum Beispiel episomale Plasmide eingesetzt. Als Plasmide eignen sich insbesondere solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, wie zum Beispiel pZl (Menkel et al .. , Applied and Environmental Microbiology 64: 549-554 (1989)), pEKExl (Eikmanns et al .. , Gene 107: 69-74 (1991)) oder pHS2-l (Sonnen et al .. , Gene 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBLl oder pGAl . Andere Plasmidvektoren, wie zum Beispiel solche, die auf pCG4 (US 4,489,160) oder pNG2 (Serwold-Davis et al .. , FEMS Microbiology Letters 66: 119- 124 (1990)), pAGl (US 5,158,891) oder pWH1520 (Rygus und Hillen, Applied Microbiology and Biotechnology 35: 594-599 (1991)) beruhen, können in gleicher Weise eingesetzt werden .
Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren, mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al .. (Applied and Environmental Microbiology 60: 126-132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom- thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmid- vektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise Escherichia coli) , nicht aber in Corynebacterium glutamicum repliziert werden kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al.., Bio/Technology 1: 784-791 (1983)), pKlδmob oder pK19mob (Schäfer et al .. , Gene 145: 69- 73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wiscon- sin, USA), pCR2.1-T0P0 (Shuman, Journal of Biological Che- mistry 269: 32678-84 (1994)), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Niederlande), pEMl (Schrumpf et al .. , Journal of Bacterlology 173: 4510-4516)) oder pBGS8 (Spratt et al.., Gene 41: 337-342 (1986)) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von Corynebacterlum glutamlcum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.., Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al .. , Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican und Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989) und Tauch et al.., FEMS Microbiology Let- ters 123: 343-347 (1994) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines „cross-over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens .
Unter der vorstehend und in den nachfolgenden Ausführungen verwendeten Formulierung „eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ex" ist vorzugsweise stets eine um ein den Faktor von mindestens 2, besonders bevorzugt von mindestens 10, darüber hinaus bevorzugt von min- destens 100, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 1.000 und am meisten bevorzugt von mindestens 10.000 gesteigerte Aktivität des jeweiligen Enzyms Ex zu verstehen. Weiterhin umfasst die erfindungsgemäße Zelle, welche „eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ex" aufweist, insbesondere auch eine Zelle, deren Wildtyp keine oder zumindest keine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms Ex aufweist und die erst nach Erhöhung der Enzymaktivität, beispielsweise durch Überexpression, eine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms Ex zeigt. In diesem Zusammenhang umfasst der Begriff „Überexpression" oder die in den nachfolgenden Ausführungen verwendete Formulierung „Erhöhung der Expression" auch den Fall, dass eine Ausgangszelle, beispielsweise eine Wildtyp-Zelle, keine oder zumindest keine nachweisbare Expression aufweist und erst durch rekombinante Verfahren eine nachweisbare Expression des für Enzyms Ex kodierenden Gens induziert wird.
Unter der nachfolgend verwendeten Formulierung „verminderte Aktivität eines Enzyms Ex" wird dementsprechend vorzugsweise eine um einen Faktor von mindestens 0,5, besonders bevorzugt von mindestens 0,1, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 0,01, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 0,001 und am meisten bevorzugt von mindestens 0,0001 verminderte Aktivität verstanden. Die Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms kann beispielsweise durch gezielte Mutation, durch Zugabe von kompetitiven oder nicht kompetitiven Inhibitoren oder durch andere, dem Fachmann bekannte Maßnahmen zur Verminderung der Expression eines für ein bestimmtes Enzym kodierenden Gens erfolgen.
Bei dem Enzym Ei, welches die Umsetzung von Glycerin zu 3- Hydroxypropion-aldehyd katalysiert, handelt es sich vorzugsweise um eine Glycerin-Dehydratase bzw. eine Diol- Dehydratase (EC 4.2.1.30). Die vorliegende Erfindung betrifft daher insbesondere Zellen, die in der Lage sind, Corrinoide zu bilden und in denen die Aktivität der Glyce- rin-Dehydratase bzw. der Diol-Dehydratase erhöht worden ist. Dieses Enzym wird vorzugsweise von den Genen kodiert ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus pduC, pduD, pduE, pddA, pddB, pddC, dhaB, dhaC, dhaE und den gIdABC-Genen aus Lactobacillus reuteri ATCC55730. Vorteilhaft ist weiterhin der Einsatz der in WO-A-2004/056963 beschriebenen Glycerin- Dehydratase-Variante SHGDH22, welche die in WO-A- 2004/056963 offenbarte SEQ. -ID-Nr. 322 aufweist. Die Nukle- otidsequenz dieser und weiterer geeigneter Gene für eine Glycerin-Dehydratase können beispielsweise der „Kyoto En- cyclopedia of Genes and Genomes" (KEGG-Datenbank) , den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) oder der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories entnommen werden. Weiterhin kann es erfindungsgemäß vorteilhaft sein, in den Zellen insbesondere die Glycerin-Dehydratase aus den Gattungen Klebsiella, Citrobacter, Clostridium, Lactobacillus, Enterobacter, Ca- loramator, Salmonella und Listeria, besonders bevorzugt die Glycerin-Dehydratase aus den Spezies Klebsiella pneumoniae, Citrobacter pneumoniae, Clostridium pasteurianum, Lactobacillus leichmannii, Citrobacter intermedium, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus brevis, Enterobacter agglomerans, Clostridium pasteurianum, Clostridium perfringens, Clostridium kluyveri , Caloramator viter- bensis, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus hilgardii, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes und Listeria innocua zu exprimieren, wobei die Expression der Glycerin- Dehydratase aus den Zellen der Spezies Lactobacillus reuteri in Bacillus megaterium-, Escherichia coli- oder Escherichia jblattae-Zellen am meisten bevorzugt ist. Besonders bevorzugt ist daher eine Bacillus megaterium-, Escherichia coli- oder Escherichia blattae-Zelle, in der eine Glycerin- Dehydratase exprimiert wird, die von dem Gen für die Glycerin-Dehydratase aus Lactobacillus reuteri kodiert wird. Im Zusammenhang mit der Diol-Dehydratase kann es vorteilhaft sein, in den Zellen insbesondere die Diol-Dehydratase aus den Gattungen Klebsiella, Propionibacterium, Clostridium, Lactobacillus, Salmonella, Citrobacter, Flavobacterium, A- cetobacterium, Brucella und Fusobacterium, besonders bevorzugt aus den Spezies Klebsiella pneumoniae, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium glycolicum, Lactobacillus brevis, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii, Lactobacillus buchneri, Brucella melitensis, Fusobacterium nucleatum, Klebsiella oxytoca, Salmonella typhimurium,
Listeria monocytogenes und Listeria innocua zu exprimieren.
Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass in der Zelle zusätzlich zur Aktivität des Enzyms Ei auch die Akti- vität eines Enzyms E2 erhöht ist, welches die Reaktivierung von inaktiviertem Enzym Ei katalysiert, wobei es sich bei diesem Enzym E2 vorzugsweise um den Glycerin-Dehydratase- Reaktivierungsfaktor oder einen Diol-Dehydratase- Reaktivierungsfaktor handelt. Bei dem Glycerin-Dehydratase- Reaktivierungsfaktor bzw. dem Diol-Dehydratase-
Reaktivierungs-faktor handelt es sich um einen Faktor, der in der Lage ist, dass nach Durchführung der Umsetzung von Glycerin zum 3-Hydroxypropionaldehyd inaktivierte Zentrum der Dehydratase zu reaktivieren. Das aktive Zentrum der Glycerin-Dehydratase bzw. der Diol-Dehydratase umfasst das Coenzym Bi2, welches nach der Umsetzung des Glycerins zum 3-Hydroxypropionaldehyd inaktiviert wird. Der Glycerin- Dehydratase-Reaktivierungsfaktor bzw. der Diol-Dehydratase- Reaktivierungsfaktor sind in der Lage, dieses inaktivierte Coenzym B12 durch ein aktives Coenzym B12 zu ersetzen. Vorzugsweise umfasst der Dehydratase-Reaktivierungsfaktor eine große Untereinheit des Glycerin-Dehydratase- Reaktivierungsfaktors oder des Diol-Dehydratase- Reaktivierungsfaktors und eine kleine Untereinheit des GIy- cerin-Dehydratase-Reaktivierungsfaktors oder des Diol- Dehydratase-Reaktivierungsfaktors, besonders bevorzugt ei- nes große Untereinheit des Glycerin-Dehydratase-
Reaktivierungsfaktors und eine kleine Untereinheit des GIy- cerin-Dehydratase-Reaktivierungsfaktors oder des Diol- Dehydratase-Reaktivierungsfaktors, am meisten bevorzugt eines Glycerin-Dehydratase-Reaktivierungsfaktors und eine kleine Untereinheit des Glycerin-Dehydratase-
Reaktivierungsfaktors . Weiterhin kann beispielsweise die große Untereinheit des Diol-Dehydratase-
Reaktivierungsfaktors vom ddrΛ-Gen und die große Untereinheit des Glycerin-Dehydratase-Reaktivierungsfaktors vom gdrΛ-Gen kodiert werden, während die kleine Untereinheit des Diol-Dehydratase-Reaktivierungsfaktors vom ddrß-Gen und die kleine Untereinheit des Glycerin-Dehydratase- Reaktivierungsfaktors vom gdrß-Gen kodiert werden kann. Besonders vorteilhaft ist insbesondere die Expression der gldDE-Gene aus Lactobacillus reuteri ATCC55730 in den erfindungsgemäßen Zellen. Beispielsweise kann in den erfindungsgemäßen Zellen der Glycerin-Dehydratase- Reaktivierungsfaktor aus Zellen der Gattung Lactobacillus, Klebsiella, Citrobacter, Clostridium und Enterobacter exprimiert werden, insbesondere aus Zellen der Spezies Lactobacillus sp., Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus leich- mannii, Citrobacter freundii, Citrobacter intermedium, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus brevis, Clostridium pasteurianum, Enterobacter agglomerans und Clostridium kluyveri und am meisten bevorzugt aus Zellen der Spezies Lactobacillus reuteri. Der Diol- Dehydratase-Reaktivierungsfaktor stammt vorzugsweise aus Zellen der Gattung Klebsiella, Citrobacter, Propionibacterium, Lactobacillus, Flavobacterium und Äcetobacterium, insbesondere aus den Spezies Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Propionibacterium freudenreichii, Lactoba- cillus brevis, Lactobacillus buchneri, Flavobacterium sp. und Äcetobacterium sp., wobei der Diol-Dehydratase- Reaktivierungsfaktor aus der Gattung Lactobacillus, insbesondere aus den Spezies Lactobacillus brevis und Lactobacillus buchneri am meisten bevorzugt ist.
Weiterhin können im Falle einer Expression der Dehydratase und des Dehydratase-Reaktivierungsfaktors in den erfindungsgemäßen Zellen diese beiden Komponenten aus der gleichen Spezies oder aber von unterschiedlichen Spezies stam- men.
Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass in der Zelle neben der Aktivität des Enzyms Ei und gegebenenfalls auch der Aktivität des Enzyms E2 die Aktivität eines Enzyms E3 erhöht ist, welches die Diffusion von Glycerin in die Zelle hinein erleichtert. Durch diese Maßnahme kann das Vermögen der Zelle, über das Nährmedium bereitgestelltes Glycerin aufzunehmen und intrazellulär zu 3- Hydroxypropionaldehyd umzusetzen, verbessert werden. Vor- zugsweise handelt es sich bei dem Enzym E3 um einen Glyce- rin-Kanal bzw. einen Glycerin-Facilitator (TC I.A.8.1.1, TC I.A.8.2.1 oder TC I.A.8.2.2), der vorzugsweise vom glpF- Gen kodiert wird.
Im Falle einer erfindungsgemäßen Zelle, welche 3-
Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin herstellen kann, ist es grundsätzlich auch denkbar, die erfindungsgemäße Zelle durch rekombinante Maßnahmen derart zu modifizieren, dass sie nicht nur über das Nährmedium bereitgestelltes Glycerin aufnehmen und intrazellulär zu 3-Hydroxypropionaldehyd umsetzen kann, sondern dass sie gegebenenfalls auch über das Nährmedium bereitgestellte Glucose, Saccharose oder andere Mono- und Polysaccharide aufnehmen, intrazellulär zu Glycerin umsetzen und dann das Glycerin intrazellulär zu 3- Hydroxypropionaldehyd umsetzen kann. Alternativ kann das gebildete Glycerin zwischenzeitlich auch extrazellulär ak- kumulieren, bevor es wieder in die Zelle aufgenommen und intrazellulär zu 3-Hydroxypropionaldehyd umgesetzt wird. In diesem Zusammenhang kann es insbesondere vorteilhaft sein, wenn in den Zellen zusätzlich zur Aktivität des Enzyms Ei und gegebenenfalls der Enzyme E2 und E3 auch die Aktivität mindestens eines der Enzyme E4, E5, E6 oder E7 erhöht ist:
eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von Dihydroxya- ceton-Phosphat zu Glycerin-3-Phosphat katalysiert; eines Enzyms E5, welches die Umsetzung von Glycerin-3- Phosphat zu Glycerin katalysiert; eines Enzyms E6, welches die Umsetzung von Dihydroxya- ceton-Phosphat zu Dihydroxyaceton katalysiert; eines Enzyms E7, welches die Umsetzung von Dihydroxyaceton zu Glycerin katalysiert.
Bevorzugte Zellen sind insbesondere diejenigen Zellen, in denen die Aktivität folgender Enzyme bzw. Kombination von Enzymen erhöht ist: EiE4, EiE5, EiE6, EiE7, EiE4E5, EiE4E6, EiE4E7, EiE5E6, EiE5E7, EiE6E7, EiE2E4, EiE2E5, EiE2E6, EiE2E7 und EiE2E4E5E6E7, wobei die Kombination EiE2E4E5E6E7 am meisten bevorzugt ist. In diesem Zusammenhang ist es weiterhin bevorzugt, dass das Enzym
E4 eine Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.8), E5 eine Glycerin-3-Phosphat-Phosphatase (EC 3.1.3.21),
E6 Dihydroxyaceton-Phosphat-Phosphatase (EC 3.1.3.1), und
E7 eine Glycerin-Dehydrogenase (EC 1.1.1.6)
ist .
Die Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Gpdl , Gpd2, LOC607942, Gpdh und gpsÄ kodiert. Die Glycerin-3-Phosphat- Phosphatase wird vorzugsweise von dem entsprechenden Gen dieses Enzyms aus Escherichia coli kodiert. Die Dihydroxya- ceton-Phosphat-Phosphatase wird vorzugweise von Genen aus¬ gewählt aus der Gruppe umfassend phoA, ALPI, ALPL, ALPP, ALPPL2, Akp2, Akp3 und Akp5 kodiert, während die Glycerin- Dehydrogenase vorzugsweise vom gldA-Gen kodiert wird.
Die Nukleotidsequenzen weiterer geeigneter Gene der Enzyme E4 bis E7 können der KEGG-Datenbank, der NCBI-Datenbank o- der EMBL-Datenbank entnommen werden.
Weiterhin kann es im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Zelle auch vorteilhaft sein, wenn die Zelle zusätzlich zur Erhöhung des Enzyms Ei, zur Erhöhung des Enzyms Ei und E2, zur Erhöhung der Enzyme Ei, E2 und eines oder mehrerer der E3 bis E7 eine verminderte Aktivität mindestens eines der Enzyme Eg bis En aufweist: eines Enzyms E8, welches die Umsetzung von Glycerin zu Glycerol-3-Phosphat katalysiert; eines Enzyms Eg, welches die Umsetzung von Glycerin zu Dihydroxyaceton katalysiert; - eines Enzyms Eio, welches die Umsetzung von 3-
Hydroxypropionaldehyd zu 1, 3-Propandiol katalysiert; eines Enzyms En, welches die Umsetzung von 3- Hydroxypropionaldehyd zu 3-Hydroxypropionsäure katalysiert .
Bevorzugte Zellen sind insbesondere diejenigen Zellen, in denen die Aktivität folgender Enzyme bzw. Kombination von Enzymen vermindert ist: E8, E9, Ei0, En, E8E9, E8Ei0, E8En, E9EiO, E9En, Ei0EiI und E8E9Ei0EiI, wobei die Kombination E8E9Ei0EiI am meisten bevorzugt ist.
In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass das Enzym
E8 e ine Gl ycerin-Kinase ( EC 2 . 7 . 1 . 30 ) ,
E9 eine Glycerin-Dehydrogenase (EC 1.1.1.6 oder
EC 1.1.1.156 oder EC 1.1.99.22) und
Ei0 eine 1, 3-Propandiol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.202) En eine 3-Hydroxypropionaldehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.3 oder EC 1.2.1.5)
ist .
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, die in der Lage ist, Corrio- noide zu bilden, umfassend den Verfahrensschritt der Erhö- hung der Aktivität eines Enzyms Ei, welches die intrazelluläre Umsetzung von Diolen, Triolen oder Polyolen zu Aldehyden, vorzugsweise von Glycerin zu 3-Hydroxypropionaldehyd, katalysiert. Bevorzugte Enzyme Ei sind dabei insbesondere diejenigen, die bereits vorstehend im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Zellen genannt worden sind.
Weiterhin ist es gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt, dass das Verfahren zusätzlich den Verfahrensschritt des Erhöhens der Aktivität eines Enzyms E2, welches die Reaktivierung von inaktiviertem Enzym Ei katalysiert, und gegebenenfalls auch zusätzlich die Erhöhung eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von Dihydroxyaceton-Phosphat zu Glycerin-3-Phosphat kataly- siert, und/oder eines Enzyms E5, welches die Umsetzung von Glycerin-3-Phosphat zu Glycerin katalysiert, und/oder eines Enzyms Ee, welches die Umsetzung von Dihydroxyaceton- Phosphat zu Dihydroxyaceton katalysiert, und/oder eines Enzyms E7, welches die Umsetzung von Dihydroxyaceton zu GIy- cerin katalysiert, umfasst, wobei bevorzugte Enzyme E2, E4, E5, Ee und E7 wiederum diejenigen sind, die bereits eingangs im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Zelle genannt worden sind.
Weiterhin kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle auch noch den Verfahrensschritt der Verminderung der Aktivität eines oder mehrere der im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Zelle genannten Enzyme E8 bis En umfassen.
Sofern die erfindungsgemäßen Zellen Aldehyde aus Diolen, beispielsweise Propionaldehyd aus 1, 2-Propandiol, herstel- len können, ist es bevorzugt, dass die erfindungsgemäße Zelle eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms E12 aufweist, welches die Umsetzung von 1,2-Diolen zu den entsprechenden Aldehyden katalysiert, wobei es sich bei diesem Enzym E12 vorzugsweise um eine Diol-Dehydratase handelt. Sofern die erfindungsgemäßen Zellen Aldehyde aus Polyolen, beispielsweise 2-Dehydro-3-deoxy-D-Galactonat aus D-Galactonat oder 2-Dehydro-3-deoxy-D-Gluconat aus D- Mannonat herstellen können, ist es bevorzugt, dass die erfindungsgemäße Zelle eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms E13 aufweist, welches die Umsetzung von Polyolen zu den entsprechenden Aldehyden katalysiert, wobei es sich bei diesem Enzym E13 vorzugsweise um eine D-Galactonat-Dehydratase oder um eine D- Mannonat-Dehydratase handelt.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet weiterhin die durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhältliche Zelle.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Verfahren zur Herstellung von Aldehyden aus Diolen, Triolen oder Polyolen, vorzugsweise von 3- Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin, umfassend die folgenden Verfahrensschritte :
i) in Kontakt bringen einer erfindungsgemäßen Zelle oder einer durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlichen Zelle mit einem Kulturmedium, welches die Bildung von Biomasse ermöglicht, wobei dieses in Kontakt bringen der Zelle mit dem Nährmedium vorzugsweise unter Bedingungen erfolgt, unter denen keine Aldehyde, vorzugswei- se kein 3-Hydroxypropionaldehyd, in für die Zellen toxischer Konzentration gebildet werden;
ii) gegebenenfalls Abtrennen der Zellen von dem Kulturmedi- um;
n Kontakt bringen der Zellen mit einem Kulturmedium, in welchem die pro Zeit- und Volumeneinheit gebildete Bio- masse um mindestens 50 %, besonders bevorzugt um mindestens 90 %, besonders bevorzugt um mindestens 99 % gegenüber der pro Zeit- und Volumeneinheit im Verfahrensschritt i) gebildeten Biomasse reduziert ist und welches Diole, Triole oder Polyole, vorzugsweise Glyce- rin, beinhaltet, unter Bedingungen, unter denen die
Zellen aus den Diolen, Triolen oder Polyolen Aldehyde, vorzugsweise aus dem Glycerin 3-Hydroxypropionaldehyd, bilden;
iv) gegebenenfalls Aufreinigung der gebildeten Aldehyde, vorzugsweise des gebildeten 3-Hydroxypropionaldehyds, aus dem Kulturmedium.
Im Verfahrensschritt i) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine erfindungsgemäße Zelle oder eine durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältliche Zelle mit einem Kulturmedium, welches die Bildung von Biomasse aus den Zellen ermöglicht, in Kontakt gebracht. Die Formulierung „welches die Bildung von Biomasse aus den Zellen ermöglicht" soll dabei zum Ausdruck bringen, dass die Zellen in dem im Verfahrensschritt i) eingesetzten Kulturmedium in der Lage sind, sich ausreichend zu teilen. Bei dem im Verfahrensschritt i) eingesetzten Kulturmedium handelt es sich vorzugsweise um ein Nährmedium beinhaltend als Kohlenstoffquelle vorzugsweise Kohlenhydrate, insbeson- dere Glucose, Saccharose oder andere Mono- und Polysaccharide, Glycerin oder eine Mischung aus Kohlenhydraten, insbesondere Glucose, und Glycerin. Sofern die im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Aldehyden, vorzugsweise von 3-Hydroxypropionaldehyd, eingesetzten Zellen in der Lage sind, Aldehyde, insbesondere 3-
Hydroxypropionaldehyd aus Kohlenhydraten wie etwa Glucose, Saccharose oder andere Mono- und Polysaccharide herzustellen, ist es vorteilhaft, dass die Aktivität des Enzyms Ei und gegebenenfalls auch die Aktivität des Enzyms E2 während der Durchführung des Verfahrensschrittes i) noch nicht erhöht ist, um zu verhindern, dass schon im Verfahrensschritt i) Aldehyde, insbesondere 3-Hydroxypropionaldehyd, gebildet wird. Dieses kann beispielsweise dadurch realisiert werden, dass die Gene des Enzyms Ei und gegebenenfalls des Enzyms E2 sich in den Zellen unter der Kontrolle geeigneter Promotoren befinden und erst im Verfahrensschritt iii) diese Promotoren induziert werden. Wird beispielsweise der lacZ- Promotor eingesetzt, so könnte die Expression der unter der Kontrolle dieses Promotors liegenden Gene für das Enzym Ei und gegebenenfalls auch für das Enzym E2 durch die Zugabe geeigneter Induktoren wie etwa IPTG erst im Verfahrensschritt iii) erfolgen. Denkbar ist weiterhin der Einsatz von Promotoren, die über bestimmte physikalische Parameter, wie etwa die Temperatur, reguliert werden können, um die Expression des Enzyms Ei und gegebenenfalls auch des Enzyms E2 zu steuern. Die erfindungsgemäßen, gentechnisch veränderten Zellen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch- Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch-Verfahren (Zulaufverfahren) oder repeated-fed-batch-Verfahren (repe- titives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Erzeugung von Biomasse im Verfahrensschritt i) mit dem Nährmedium in Kontakt gebracht und somit kultiviert werden. Denkbar ist auch ein semi-kontinuierliches Verfahren, wie es in der GB-A-1009370 beschrieben wird. Eine Zusammenfassung über bekannte Kulti- vierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel („Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas ( „Bioreaktoren und periphere Einrichtungen" , Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium im Verfahrensschritt i) muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Kohlehydrate wie z. B. Gluco- se, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmi- tinsäure, Stearinsäure und Linolsäure oder Glycerin verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Kohlehydraten, insbesondere von Glucose, oder von Glycerin. Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoni- umchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydro- genphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchs- Stoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise wäh- rend der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hin- zugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie z. B. Luft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 200C bis 800C und vorzugsweise bei 25°C bis 400C.
Nachdem im Verfahrensschritt i) eine ausreichende Biomasse von rekombinanten Bacillus megaterium- , Escherichia coli- oder Escherichia blattae-Zellen hergestellt worden ist, kann es, insbesondere dann, wenn die Zellen nicht an ein oder in einem Substrat immobilisiert und in dieser Form im Verfahrensschritt iii) zur Herstellung von Aldehyden bzw. 3-Hydroxypropionaldehyd eingesetzt werden sollen, vorteilhaft sein, die so erhaltenen Zellen im Verfahrensschritt ii) von dem verwendeten Kulturmedium abzutrennen. Das Abtrennen der Zellen erfolgt dabei mittels dem Fachmann bekannter Abtrennverfahren. Denkbar ist in diesem Zusammen- hang insbesondere eine kontinuierliche Abtrennung der Zellen von dem Nährmedium beispielsweise mittels eines geeigneten Filters, etwa mittels eines Filters mit einer Ausschlußgröße in einem Bereich von 20 bis 200 kDa . Denkbar ist auch der Einsatz einer Zentrifuge, einer geeigneten Se- dimentationsvorrichtung oder einer Kombination dieser Vorrichtungen, wobei es besonders bevorzugt ist, zumindest einen Teil der Mikroorganismen zunächst durch Sedimentation abzutrennen und anschließend die von den Mikroorganismen teilweise befreite Fermentationsbrühe einer Ultrafiltration oder Zentrifugationsvorrichtung zuzuführen.
Die auf diese Weise abgetrennten Zellen werden, wenn sie in mehreren nacheinander durchgeführten Trennstufen erhalten wurden, gegebenenfalls vereinigt und können direkt dem Ver- fahrensschritt iii) zugeführt werden. Es kann sich jedoch als vorteilhaft erweisen, die Zellen vor der Durchführung des Verfahrensschrittes iii) noch zu waschen, wobei dieses Waschen vorzugsweise bereits mit demjenigen Kulturmedium erfolgt, welches im Verfahrensschritt iii) eingesetzt wird. Zum Waschen der Zellen können diese beispielsweise in einem geeigneten Volumen des im Verfahrensschritt iii) eingesetz- ten Kulturmediums resuspendiert und anschließend durch die vorstehend beschriebenen Abtrennverfahren, insbesondere durch Filtration, Sedimentation oder Zentrifugation, oder aber durch eine Kombination dieser Maßnahmen, von dem Kulturmedium befreit werden. Auf diese Weise können die Zellen von denjenigen Komponenten des im Verfahrensschritt i) eingesetzten Nährmediums, welche insbesondere ein Wachstum der Zellen ermöglichen (Stickstoffverbindungen, Phosphorverbindungen, essentielle Aminosäuren und dergleichen) befreit werden .
Im Verfahrensschritt iii) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen dann als „ruhende Zellen" mit einem Kulturmedium, in welchem die auf eine Zeit- und Volumeneinheit bezogene Biomasse-Bildung um mindestens 50 %, besonders be- vorzugt um mindestens 90 %, besonders bevorzugt um mindestens 99 % gegenüber der auf eine Zeit- und Volumeneinheit bezogene Biomassebildung im Verfahrensschritt i) reduziert ist, und welches Diole, Triole oder Polyole, vorzugsweise Glycerin, beinhaltet, unter Bedingungen, unter denen die Zellen aus den Diolen, Triolen oder Polyolen Aldehyde, vorzugsweise aus dem Glycerin 3-Hydroxypropionaldehyd, bilden, in Kontakt gebracht. Am meisten bevorzugt erfolgt im Verfahrensschritt iii) der Einsatz eines Kulturmediums, in dem keine nachweisbare Biomassenbildung mehr erfolgt, sich die Zellen also kaum noch nennenswert teilen. Eine Reduktion der Biomassebildung von 50 % ist beispielsweise erreicht, wenn in dem im Verfahrensschritt i) eingesetzten Kulturme- dium unter den Kultivierungsbedingungen im Verfahrensschritt i) 10 g Mikroorganismen pro Liter und pro Stunde gebildet werden, während im Verfahrensschritt iii) mittels des dort eingesetzten Kulturmediums unter den gleichen KuI- tivierungsbedingungen wie im Verfahrensschritt i) nur 5 g Mikroorganismen pro Liter und pro Stunde gebildet werden.
In diesem Kulturmedium sind die erfindungsgemäßen Zellen dann in der Lage, die über das Kulturmedium angebotenen Di- ole, Triole oder Polyole, vorzugsweise das angebotene GIy- cerin, in hoher Ausbeute zu Aldehyden, vorzugsweise zu 3- Hydroxypropionaldehyd, umzusetzen .
Sofern, wie vorstehend beschrieben, die Aktivität des En- zyms Ei und gegebenenfalls auch des Enzyms E2 beispielsweise durch den Einsatz geeigneter Promotoren erst im Verfahrensschritt iii) erhöht wird, enthält das im Verfahrensschritt iii) eingesetzte Kulturmedium neben dem Glycerin auch geeignete Induktoren des Promotors bzw. werden ent- sprechende physikalische Parameter, wie etwa die Temperatur, im Verfahrensschritt iii) entsprechend eingestellt, um die Expression der Enzyme zu induzieren.
Als Kulturmedium können im Verfahrensschritt iii) alle dem Fachmann bekannten Lösungsmittel bzw. Lösungen eingesetzt werden, die geeignet sind, um Zellen der Spezies Bacillus megaterium, Escherichia coli oder Escherichia blattae zu kultivieren, ohne dass sich diese Zellen in nennenswertem Maße teilen, jedoch ohne die Vitalität der Zellen in nen- nenswertem Maße zu beeinträchtigen. So sollen die Zellen nach einer gegebenenfalls in einem weiteren Verfahrensschritt v) erfolgenden Abtrennung von dem im Verfahrens- schritt iii) eingesetzten Kulturmedium möglichst wieder in der Lage sein, bei einer Resuspendierung in einem die Zellteilung ermöglichenden Nährmedium wieder neue Biomasse zu bilden .
Denkbar als Kulturmedium im Verfahrensschritt iii) ist beispielsweise der Einsatz von Wasser, von gepufferten Salzlösungen wie etwa PBS („phosphate buffered saline") oder anderen Salzlösungen, wobei diese Medien vorzugsweise geeig- nete pH-Puffersysteme, wie etwa HEPES, MOPS oder andere Pufferkomponenten beinhalten.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass das im Verfahrensschritt iii) eingesetzte Kulturmedium keine Corrinoide, vorzugsweise kein Coenzym B12, kein Vitamin B12 und kein Co- balamin beinhaltet.
Die so gebildeten Aldehyde bzw. das so gebildete 3- Hydroxypropionaldehyd können dann in einem weiteren Verfah- rensschritt iv) von dem im Verfahrensschritt iii) eingesetzten Kulturmedium und von gegebenenfalls nicht umgesetzten Glycerin abgetrennt und somit aufgereinigt werden, wobei diese Aufreinigung durch dem Fachmann bekannte Verfahren, wie beispielsweise durch Kristallisation, durch Ly- ophilisierung, durch chromatographische Verfahren oder durch eine Kombination dieser Verfahren erfolgen kann. Weitere Möglichkeiten zur Aufreinigung von beispielsweise 3- Hydroxypropionaldehyd und dessen Derivaten können unter anderem Vollenweider et al. in Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 51, 2003, Seiten 3.287-3.293 entnommen werden, deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglichkeiten zur Aufreinigung von 3-Hydroxypropionaledehyd aus Fermentationslösungen hiermit als Referenz eingeführt wird und einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet. Nach Aufreinigung der Aldehyde kann im Falle des 3- Hydroxypropionaldehyds eine Zusammensetzung erhalten wer- den, die, je nach Art des Aufreinigungsverfahrens, neben dem Monomer des 3-Hydroxypropionaldehyds auch das Hydrat des 3-Hydroxypropionaldehyds, das zyklisierte Dimer des 3- Hydroxypropionaldehyds und gegebenenfalls weitere Oligomere des 3-Hydroxypropionaldehyds beinhaltet.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von 3- Hydroxypropionaldehyd aus Glucose, Saccharose oder anderen Mono- und Polysacchariden, umfassend die folgenden Verfah- rensschritte :
I) in Kontakt bringen einer erfindungsgemäßen Zelle, in der neben der Aktivität des Enzyms Ei und gegebenenfalls auch des Enzyms E2 auch die Aktivität mindestens eines der, vorzugsweise aller Enzyme E4 bis E7 erhöht ist, mit einem Kulturmedium, welches eine Bildung von Biomasse aus den Zellen ermöglicht, wobei dieses in Kontakt bringen der Zelle mit dem Nährmedium vorzugs¬ weise unter Bedingungen erfolgt, unter denen keine Al- dehyde, vorzugsweise kein 3-Hydroxypropionaldehyd, in für die Zellen toxischer Konzentration gebildet werden;
II) gegebenenfalls Abtrennen der Zellen von dem Kulturmedi¬ um; III) in Kontakt bringen der Zellen mit einem Kulturmedium, in welchem die pro Zeit- und Volumeneinheit gebildete Biomasse um mindestens 50 %, besonders bevorzugt um mindestens 90 %, besonders bevorzugt um mindestens 99 % gegenüber der pro Zeit- und Volumeneinheit im Verfahrensschritt I) gebildeten Biomasse reduziert ist und welches Glucose, Saccharose oder andere Mono- und Polysaccharide sowie gegebenenfalls auch Glycerin beinhaltet, unter Bedingungen, unter denen die Zellen aus der Glucose, Saccharose oder anderen Mono- und Polysacchariden über Glycerin als Zwischenprodukt und gegebenenfalls auch direkt aus Glycerin 3-Hydroxypropionaldehyd bilden;
IV) gegebenenfalls Aufreinigung des gebildeten 3- Hydroxypropionaldehyds aus dem Kulturmedium.
Hinsichtlich der Einzelheiten zu diesem Verfahren wird auf die entsprechenden Ausführungen im Zusammenhang mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von 3- Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin, umfassend die Verfahrensschritte i) bis iv) verwiesen.
Einen weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Verfahren zur Herstellung von C3- Verbindungen aus 3-Hydroxypropionaldehyd, umfassend die Verfahrensschritte :
A) Bereitstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin oder des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von 3- Hydroxypropionaldehyd aus Glucose, Saccharose oder an¬ deren Mono- und Polysacchariden;
B) chemische oder biokatalytische Umsetzung des 3- Hydroxypropionaldehys durch Reduktion, Oxidation oder Dehydratisierung unter Erhalt von C3-Verbindungen;
C) gegebenenfalls die weitere chemische oder biokatalyti¬ sche Umsetzung der im Verfahrensschritt II) erhaltenen C3-Verbindung durch Reduktion, Oxidation oder Addition.
Zunächst wird im Verfahrensschritt I) 3-
Hydroxypropionaldehyd mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin oder des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glucose, Sac- charose oder anderen Mono- und Polysacchariden bereitgestellt, wobei dieses gegebenenfalls, wie vorstehend im Zu¬ sammenhang mit diesen Verfahren beschrieben, aus der Fermentationslösung aufgereinigt worden sein kann.
Im Verfahrensschritt II) kann 3-Hydroxypropionaldehyd dann chemisch oder biokatalytisch durch Reduktion, Oxidation o- der Dehydratisierung unter Erhalt von C3-Verbindungen, insbesondere unter Erhalt von 1, 3-Propandiol (Reduktion), Ac- rolein (Dehydratisierung) oder 3-Hydroxypropionsäure (Oxi- dation) , umgesetzt werden. Dabei sind Einzelheiten zur Umsetzung von 3-Hydroxypropionaldehyd zu Acrolein unter ande¬ rem durch Hall und Stern in Journal of the Chemical Socie¬ ty, 1950, Seiten 490-498 beschrieben, während Einzelheiten zur Herstellung von 1, 3-Propandiol aus 3- Hydroxypropionaldehyd unter anderem der US 5,334,778 ent¬ nommen werden können. Die Herstellung von 3- Hydroxypropionsäure aus 3-Hydroxypropionaldehyd wiederum ist unter anderem in US 6,852,517 beschrieben.
Gegebenenfalls können die im Verfahrensschritt C) erhaltenen C3-Verbindungen in einem weiteren
Verfahrensschritt D) chemisch oder mikrobiologisch durch Reduktion, Oxidation oder Addition noch weiter umgesetzt werden. In Betracht kommt hier insbesondere die Umsetzung von im Verfahrensschritt C) erhaltenem Acrolein durch Oxidation zur Acrylsäure, die dann gegebenenfalls in einem noch weiteren Verfahrensschritt D) radikalisch unter Bildung von auf Acrylsäure basierenden Polymeren umgesetzt werden kann. In Betracht kommt hier insbesondere die radikalische Polymerisierung von gegebenenfalls teilneutralisierter Acrylsäure in Gegenwart geeigneter
Vernetzer unter Bildung wasserabsorbierender Polyacrylate, die auch als „Superabsorber" bezeichnet werden. Die chemische Oxidation von Acrolein zu Acrylsäure und die anschließende radikalische Polymerisation der so erhaltenen Acrylsäure ist unter anderem in der WO-A-2006/136336 beschrieben .
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand nicht limitierender Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1
(Vergleichende Analyse der Resistenz von ruhenden Bakterienzellen gegenüber 3-Hydroxypropionaldehyd)
- Zur Analyse der Resistenz ruhender Bakterienzellen gegenüber 3-Hydroxypropionaldehyd (3- Hydroxypropionaldehyd) wurde in einem Zwei-Stufen- Prozess eine wässrige 3-Hydroxypropionaldehyd-Lösung hergestellt. Dazu wurden 10 ml MRS-Medium (Difco, Heidelberg), welches zusätzlich 20 mM Glycerin enthielt, mit 1 % (v/v) einer Gefrierkultur von L. reuteri be- impft, 18 h ohne Schütteln bei 37°C inkubiert und diese Vorkultur vollständig zu 40 ml frischem MRS-Medium gegeben und weitere 6 h bei 37°C ohne Schütteln inkubiert. Die zweite Vorkultur wurde ebenfalls vollständig in 1 1 frisches MRS-Medium überführt und 15 h bei 370C ohne Schütteln in einer 1000-ml-Schottflasche kultiviert. Anschließend wurden die Zellen geerntet (10 min, 4000 g, RT), mit 0,1 M Kalium-Phosphatpuffer gewaschen und direkt für die Produktion von 3-Hydroxypropionaldehyd eingesetzt. Das Zellpellet wurde in 100 ml 250 mM Glycerin resuspendiert, um die Biotransformation von Glycerin zu 3-Hydroxypropionaldehyd zu starten. Nach 60 min wurde der Ansatz erneut zentrifugiert (10 min, 12000 g, 4 0C; der resultierende Überstand enthielt 160 mM 3- Hydroxypropionaldehyd. Die Quantifizierung von 3- Hydroxypropionaldehyd wurde mittels eines colorimetri- schen Tests gemäß Doleyres et al . („Production of 3- hydroxypropionaldehyde using a two-step process with Lactobacillus reuteri, Applied Microbiology and Biotech- nology, Vol. 68, 2005, Seiten 467-474) durchgeführt.
Zur Analyse der Wirtsresistenz wurden 5 ml LB-Medium (nach Miller; Merck KGaA, Darmstadt) mit B. megaterium DSM319- bzw. E. blattae DSM4481-Zellen von einer frischen LB-Platte (nach Miller; Merck KGaA, Darmstadt) an- geimpft und ca. 8 h bei 370C und mit 180 rpm inkubiert. Anschließend wurden 100 ml LB-Medium mit 1,5 % (v/v) der Vorkultur beimpft und die Zellen bis zur stationären Phase (ca. 16 h) bei 37°C, 180 rpm kultiviert. L. reute- ri-Zellen wurden wie oben beschrieben in MRS-Medium (ohne Glycerin) kultiviert. Anschließend wurden die Zellen durch eine Zentrifugation (10 min, 5292 g, 4°C) geern- tet, einmal mit 0,1 M Kalium-Phosphatpuffer (pH 7) gewaschen und in 5 ml der oben beschriebenen 160 mM 3- Hydroxypropionaldehyd-Lösung resuspendiert. Die Biomassekonzentration betrug -IxIO10 Zellen pro ml.
- Die Ansätze wurden 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und jeweils nach 10 min 100 μl-Proben zur Bestimmung der Lebendzellzahl entnommen. Dazu wurden geeignete Verdünnungen der Zellsuspension in Verdünnungslösung (0,85 % (w/v) NaCl, 0,1 % (w/v) Pepton aus Casein) auf MRS- Agarplatten ausplattiert und 48 h anaerob bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellkolonien ausgezählt und die Lebendzellzahl bestimmt. Es wurde beobachtet, dass ebenso wie bei Lactobacillus reuteri ATCC55730 die Inkubation ruhender B. megaterium DSM319- bzw. E. blat- tae DSM4481-Zellen mit 3-Hydroxypropionaldehyd nicht zu einer signifikanten Reduktion der Lebendzellzahl innerhalb des analysierten Zeitraums führt. Die 3- Hydroxypropionaldehyd-Konzentration nahm über den analysierten Zeitraums hinweg nicht signifikant ab.
Beispiel 2
(Herstellung einer rekombinanten B. megaterium-Zelle, bei der die Aktivität der Glycerin-Dehydratase erhöht worden ist)
Zur Überexpression der Lactobacillus reuteri ATCC55730 Gene gldABC (Enzym Ei) und gldDE (Enzym E2, siehe auch GenBank-Einträge DQ233724 - DQ233720) (SEQ. -ID-Nr. Ol) in Escherichia blattae DSM4481 und Bacillus megaterium DSM319 wurde das Plasmid pWHl52 O-gldÄBCDE konstruiert (SEQ. -ID Nr. 02). Chromosomale DNA aus Lactobacillus reuteri ATCC55730 diente als Matrize für eine PCR mit dem „Expand™ High Fideltiy"-PCR-Kit von Roche Di- agnostics (Mannheim), gemäß Angaben des Herstellers. Der kodierende Bereich der die Glycerin-Dehydratase (gldABC) und den zugehörigen Reaktivierungsfaktors (gldDE) kodie- renden Gene einschließlich 34 bp vor dem gldA-Startkodon wurde mit Hilfe der Oligonukleotide Bm_GDfw_XmaI (SEQ.- ID-Nr. 03) und Bm_GDRFrv_SphI (SEQ. -ID-Nr. 04) aus der chromosmalen DNA von Lactobacillus reuteri ATCC55730 in einer PCR amplifiziert ("PCR protocols. A guide to me- thods and applications", 1990, Academic Press) und auf diesem Wege am 5' -Ende bzw. 3' -Ende mit einer Xmal bzw. einer SpM-Schnittstelle versehen. Dafür wurden die folgenden Oligonukleotide eingesetzt:
- Bm_GDfw_XmaI:
5'-TCC CCC CGG GCA TTA AGT AGA TCT GGA AGG AGG A-3' (SEQ. -ID-Nr. 02, beinhaltend eine Xmal-Erkennungssequenz am 5' -Ende)
- Bm_GDRFrv_SphI :
5'-ACA TGC ATG CAA ATC ACC TGT TTA CCA TTT CCT T-3' (SEQ. -ID-Nr. 03, beinhaltend eine Sphl-Erkennungssequenz am 5' -Ende)
- Das PCR-Produkt (5.212 Basenpaare) wurde mittels des QIAquick PCR-Purification Kits (Qiagen, Hilden) gemäß den Angaben des Herstellers aufgereinigt und anschlie- ßend mittels der Restriktionsendonukleasen Xmal und SphI (gemäß den Angaben des Herstellers, New England Biolabs, Schwalbach) geschnitten. Das nunmehr 5.202 bp große Fragment wurde in den Xmal/Sphl-geschnittenen Expressi- onsvektor pWH1520 (7.896 Basenpaare; beschrieben durch Rygus und Hillen in Applied Microbiology and Biotechno- logy, Vol. 35 (5), 1991, Seiten 594-599) ligiert. Das resultierende Plasmid pWHl520-gldABCDE (SEQ. -ID-Nr. 02) ist 13.098 Basenpaare groß. Die Ligation sowie die Transformation chemisch kompetenter E. coli-Zellen (New England Biolabs, Schwalbach) erfolgten in dem Fachmann bekannter Art und Weise. Die Authentizität des Inserts wurde durch eine DNA-Sequenzanalyse überprüft. Das Plasmid pWH1520-gldABCDE wie auch der Leervektor pWH1520 wurden mittels Protoplastentransformation gemäß Biedendieck (Biedendieck, „Versatile Tools for Producti- on, Secretion and Purification of Recombinant Proteins", 2006, Dissertation, S. 45-47) in B. megaterium DSM319 eingebracht. Der resultierende Stamm wurde B . mega teri um/p¥lR152 0 - gl dABCDE genannt .
Bei spiel 3
(Herstellung einer rekombinanten E. blattae-Zelle, bei der die Aktivität der Glycerin-Dehydratase erhöht worden ist)
Um die Eignung von E. blattae für die Produktion von 3-Hydroxypropionaldehyd zu testen, wurde zunächst der B. megaterium xylΛ-Promoter in Plasmid pWH1520- gldABCDE durch den lacZ-Promoter aus E. coli ersetzt. Dazu wurde der lacZ-Promoter mittels PCR gemäß Innis et al. unter Verwendung von pUC19-DNA (GenBank-Eintrag L09137) als Matrize und folgender Oligonukleotide amplifiziert :
PlacZ-fw: 5'- TAT ATA GCT AGC CTC ATT AGG CAC CCC AGG C-3' (SEQ. -ID Nr. 05, beinhaltend eine Nhel- Erkennungssequenz am 5' -Ende)
PlacZ-rv : 5'- TAT ATA CCC GGG CAA TTC CAC ACA ACA TAC GAG CC-3' (SEQ. -ID Nr. 06, beinhaltend eine Xmal- Erkennungssequenz am 5' -Ende)
Das PCR-Produkt (84 Basenpaare) wurde mittels des QIA- quick-PCR-Aufreinigungskits von Qiagen, Hilden, gemäß den Angaben des Herstellers aufgereinigt . Das aufgereinigte PCR-Produkt wurde mittels Nhel und Xmal (e- benfalls gemäß den Angaben des Herstellers der Restriktionsendonukleasen, New England Biolabs, Schwalbach) verdaut und in den Nhel/Xmal-geschnittenen Vektor pWHl520-gldÄBCDE (Beispiel 2) unter Erhalt des Vektors pWH1520-gldABCD.E-lacZ (10.896 Basenpaare, SEQ. -ID-Nr. 07) ligiert. Die Authentizität des Inserts wurde mittels DNA-Sequenzierung bestimmt. Ligation des Expressionsvektors sowie die Herstellung und die
Transformation chemisch kompetenter E. coli-Zellen erfolgten in dem Fachmann bekannter Art und Weise.
Um die Eignung von via directed evolution verbesserten Glycerin-Dehydratasen für die Produktion von 3-
Hydroxypropionaldehyd zu prüfen, wurde die in Patenanmeldung WO-A-2004/056963 unter der SEQ. -ID-Nr. 322 aufgeführte Klebsiella pneumoniae Glycerin- Dehydratase-Variante SHGDH22 verwendet. Diese Variante zeichnet sich gegenüber dem Wildtyp-Biokatalysator durch knapp sechsfach erhöhten Umsatz von Glycerin zu 3-Hydroxypropionaldehyd in Gegenwart von 600 mM 1,3- Propandiol aus. Die entsprechende kodierende Sequenz (SEQ. -ID-Nr. 08) wurde durch die GeneArt AG (Regensburg) synthetisiert. Um ein synthetisches Operon aus der die Glycerin-Dehydratase-Variante SHGDH22 kodie- renden Sequenz und den kodierenden Sequenzen des zugehörigen Reaktivierungsfaktors (große und kleine Untereinheit) zu konstruieren, wurde zunächst die Glycerin- Dehydratase-Variante SHGDH22 kodierende Sequenz mittels PCR (gemäß Innis et al.) mit dem durch GeneArt bereitgestellten Vektor, welcher als Insert die Glycerin-Dehydratase-Variante SHGDH22 kodierende Sequenz enthält, als Matrize und folgenden Oligonukleotiden amplifiziert :
GD-fw:
5'- TAT ATA CCC GGG AAG GAG GAC TAC TTT ATT ATG AAA AGA TCA AAA CGA TTT GCA G-3' (SEQ.- ID Nr. 09, beinhaltend eine Xmal- Erkennungssequenz am 5' -Ende)
GD-rv:
5'- GAC ATG GTA TAT CTC CTT AGC TTC CTT TAC GTA GCT TAT GCC-3' (SEQ. -ID Nr. 10)
Das PCR-Produkt (2.738 Basenpaare) wurde mittels des
QIAquick-PCR-Aufreinigungskits von Qiagen, Hilden, gemäß den Angaben des Herstellers aufgereinigt . Parallel wurde das in Patentanmeldung EP-A-I 669 457 beschriebene synthetische Operon aus den die große und kleine Untereinheit des zugehörigen Reaktivierungsfaktors aus Klebsiella pneumoniae ATCC25955 kodierenden Sequenzen unter Verwendung von Vektor 2 (SEQ. -ID-Nr. 02 in EP-A- 1 669 457) mit folgenden Oligonukleotiden amplifi- ziert :
GDRF-fw: 5'- GGA AGC TAA GGA GAT ATA CCA TGT CGC TTT
CAC C-3' (SEQ. -ID Nr. 11)
GDRF-rv:
5'- TAT ATA GCA TGC TTA ATT CGC CTG ACC GGC CAG -3' (SEQ. -ID Nr. 12, beinhaltend eine
SpM-Erkennungssequenz am 5' -Ende
Das PCR-Produkt (2.234 Basenpaare) wurde mittels des QIAquick-PCR-Aufreinigungskits von Qiagen, Hilden, ge- maß den Angaben des Herstellers aufgereinigt . Im nächsten Schritt wurde mittels crossover-PCR (gemäß Innis et al.) unter Verwendung der beiden primären PCR-Produkte, die zum einen die Glycerin-Dehydratase- Variante SHGDH22, zum anderen die große und kleine Un- tereinheit des zugehörigen Reaktivierungsfaktors aus Klebsiella pneumoniae ATCC25955 kodieren, zusammengefügt. Dazu wurden je 1 ng der beiden primären PCR- Produkte kombiniert und gemeinsam als Matrize für eine PCR mit den Oligonukleotiden GD-fw (SEQ. -ID Nr. 09) und GDRF-rv (SEQ. -ID Nr. 12) verwendet. Das PCR- Produkt (4.938 Basenpaare) wurde mittels des QIAquick- PCR-Aufreinigungskits von Qiagen, Hilden, gemäß den Angaben des Herstellers aufgereinigt . Das aufgereinigte PCR-Produkt wurde mittels Xmal und SphI (ebenfalls gemäß den Angaben des Herstellers der Restriktionsen- donukleasen, New England Biolabs, Schwalbach) verdaut und in den Xmal/5phl-geschnittenen Vektor pWH1520- gldABCDE (Beispiel 2) unter Erhalt des Vektors pWH1520-SHGDH22 (10.118 Basenpaare, SEQ. -ID-Nr. 13) ligiert. Die Authentizität des Inserts wurde mittels DNA-Sequenzierung bestimmt. Ligation des Expressions- vektors sowie die Herstellung und die Transformation chemisch kompetenter E. coli-Zellen erfolgten in dem Fachmann bekannter Art und Weise.
Die Plasmide pWH1520, pWH1520-gldABCD.E-lacZ und pWH1520-SHGDH22 wurden mittels Elektroporation in
E. blattae DSM4481 eingebracht und die resultierenden Stämme E. Jblattae/pWH1520, E. blattae/pWR1520-gldABCDE bzw. E. Jblattae/pWH1520-SHGDH22 genannt. Zur Präparation elektrokompetenter E. blattae-Zellen wurde 1 1 LB-Medium (nach Miller; Merck KGaA, Darmstadt) mit 10 ml einer Übernachtkultur beimpft, bis zum Erreichen einer ODεoo von 0,7 bei 37°C kultiviert und anschließend die Zellen 30 min auf Eis inkubiert. Alle weiteren Schritte wurden auf Eis durchgeführt. Nach einer Zentrifugation (15 min, 5292 g, 4°C), wurden die Zellen mit 1 1 eiskaltem Wasser und erneut mit 500 ml eiskaltem Wasser gewaschen. Anschließend folgte ein weiterer Waschschritt mit 10 ml Glycerin-Lösung (10 %, w/v, 15 min, 3300 g, 4°C) . Das Zellpellet wurde in 2 ml 10 %iger Glycerin-Lösung resuspendiert und 40 μl Aliquots bei - 80 0C gelagert. Für die Elektroporation wurde die zu transformierende DNA (1-2 μg) zu einem Aliquot gefrorener, kompetenter E. blattae-Zellen gegeben und auf Eis aufgetaut (maximal 10 min) . Anschließend wurde der Ansatz in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette überführt. Die
Zellen wurden einem Strompuls ausgesetzt, wobei folgende Parameter eingestellt wurden: Spannung: 1,8 kV; Widerstand: 200 Ω; Kapazität: 25 μF. Sofort nach der Elektroporation wurde 1 ml LB-Medium zugegeben und der Ansatz 1 h bei 37 0C und 700 rpm inkubiert. Danach wurden die Zellen auf selektiven LB-Platten (100 μg/ml Ampicillin) ausplattiert.
Beispiel 4 (HPLC-basierte Quantifizierung von Glycerin, 1, 3-Propandiol und 3- Hydroxypropionaldehyd)
Zur Quantifizierung von Glycerin, 1, 3-Propandiol und 3-Hydroxypropionaldehyd wurde in je 1 ml Zellsuspensi- on die Biomasse durch Zentrifugation (10 min, 16.100 g, 40C) abgetrennt und 40 μl des Kulturüberstands unter Verwendung eines Agilent Technologies 1200 LC Systems (High Performance Autosampier, G136B; Thermostat für Probengeber, G1330B; Micro-Vacuum Degasser, G1379B; Binäre Pumpe, G1312A; Säulenthermostat,
G1316A; Brechungsindex-Detektor, G1362A, Agilent Technologies, Waldbronn) mit einer Aminex HPX-87H 300 x 7,8 mm Trennsäule (Bio-Rad Laboratories GmbH, München) mit 9 μm Partikelgröße analysiert. Die zu analysieren- den Substanzen wurden isokratisch mit einer mobilen
Phase aus 10 mM Schwefelsäure mit einer Flussrate von 0,6 ml/min 20 min bei 400C eluiert. Glycerin, 1,3- Propandiol und 3-Hydroxypropionaldehyd wurden durch einen Vergleich mit der Verweilzeit von Referenzsubstanzen (Glycerin und 1, 3-Propandiol : Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim; 3-Hydroxypropionaldehyd: eige- ne Herstellung) identifiziert. Die Konzentration der drei Verbindungen in den Kulturüberständen wurde über einen Vergleich der Peakflächen mit einer zuvor mit externen Standards erstellten Kalibriergerade berechnet .
Beispiel 5
(Produktion von 3-Hydroxypropionaldehyd mit rekombinanten E. blattae-Zellen, bei denen die Aktivität der Glycerin- Dehydratase erhöht worden ist)
Die in Beispiel 3 konstruierten E. blattae-Stämme E. Jblattae/pWH1520, E. blattae/pWR1520-gldABCDE bzw. E. Jblattae/pWH1520-SHGDH22 wurden zunächst in 5 ml LB- Medium mit 100 μg/ml Ampicillin über Nacht bei 37°C und 180 rpm kultiviert. Am nächsten Morgen wurden 2 ml dieser Vorkulturen genutzt, um je 200 ml LB mit 2 % (w/v) Glukose, 20 mM Glycerin und 100 μg/ml Ampicillin in 1-1-Schikanenkolben zu inokulieren. Beide Kolben wurden bei 370C und 180 rpm inkubiert. Das Wachstum dieser Kulturen wurde anhand der scheinbaren optischen Dichte (OD6Oo) verfolgt. Bei einer OD6oo von ~ 2 wurden die Zellen geerntet, zweimal mit je 200 ml Saline (0,9 % (w/v) NaCl) gewaschen und in 20 ml 250 mM Glycerin resuspendiert. Für einen Zeitraum von 1 h wurden alle 10 min Proben genommen und die Konzentration von Glycerin, 1, 3-Propandiol und 3-Hydroxypropionaldehyd per HPLC (Beispiel 4) analysiert. Während der Kontroll- stamm E. Jblattae/pWH1520 keinerlei 3- Hydroxypropionaldehyd produzierte, konnte im Fall E. blattae/pWR1520-gldABCDE und E. Jblattae/pWH1520- SHGDH22 die Bildung von 3-Hydroxypropionaldehyd nach- gewiesen werden.
Beispiel 6
(Produktion von 3-Hydroxypropionaldehyd mit rekombinanten B. megaterium-Zellen, bei denen die Aktivität der Glycerin- Dehydratase erhöht worden ist)
Der in Beispiel 2 konstruierte B. megaterium-Stamm
B. megaterium/p¥lR1520-gldABCDE sowie der entsprechende
Kontrollstamm B. megaterium/p¥lR1520 wurden zunächst in 5 ml A5-Medium (Malten, M., Hollmann, R., Deckwer,
W. D., Jahn, D. Production and secretion of recombinant Leuconostoc mesenteroides dextransucrase DsrS in Ba- cillus megaterium. Biotechnol. Bioeng. 2005. 89 (2) :206-18. ) mit 4 g/l Hefeextrakt und 10 μg/ml Tetrazyklin über Nacht bei 37°C und 180 rpm kultiviert. Am nächsten Morgen wurden 2 ml dieser Vorkulturen genutzt, um je 200 ml A5-Medium mit 20 mM Glycerin und 10 μg/ml Tetrazyklin in 1-1-Schikanenkolben zu i- nokulieren. Beide Kolben wurden bei 37°C und 180 rpm inkubiert. Das Wachstum dieser Kulturen wurde anhand der scheinbaren optischen Dichte (OD6oo) verfolgt. Bei einer OD6oo von - 0,4 wurde den Kulturen 0,5% (w/v) D- Xylose zugesetzt, um die Bildung des Biokatalysators zu induzieren. Bei einer OD6oo von ~ 4 wurden die ZeI- len geerntet, zweimal mit je 200 ml Saline (0,9 %
(w/v) NaCl) gewaschen und in 20 ml 250 mM Glycerin resuspendiert. Für einen Zeitraum von 1 h wurden alle 10 min Proben genommen und die Konzentration von Glyce- rin, 1 , 3-Propandiol und 3-Hydroxypropionaldehyd per HPLC (Beispiel 4) analysiert. Während der Kontrollstamm B. megaterium/p¥lR1520 pWH1520 keinerlei 3- Hydroxypropionaldehyd produzierte, konnte im Fall von B. megaterium/pWR1520-gldABCDE die Bildung von 3- Hydroxypropionaldehyd nachgewiesen werden.

Claims

Patentansprüche
1. Eine Zelle, die in der Lage ist, Corrinoide zu bilden und die gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Aldehyde aus Diolen, Triolen oder Polyolen, vorzugsweise mehr 3-Hydroxypropionaldehyd aus Glyce- rin, zu bilden vermag.
2. Die Zelle nach Anspruch 1, wobei die Corrinoide ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Coen- zym Bi2, Vitamin Bi2 und Cobalamin.
3. Die Zelle nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zelle von einer Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli, Escherichia blattae und Bacil- lus megaterium.
4. Die Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ei aufweist, welches die Umsetzung von Diolen, Triolen oder Polyolen zu Aldehyden, vorzugsweise von Glycerin zu 3- Hydroxypropionaldehyd, katalysiert .
5. Die Zelle nach Anspruch 4, wobei das Enzym Ei eine Glycerin-Dehydratase oder eine Diol-Dehydratase
(EC 4.2.1.30) ist.
6. Die Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in der Zelle zusätzlich zur Aktivität des Enzyms Ei auch die Aktivität eines Enzyms E2 erhöht ist, welches die Reaktivierung von inaktiviertem Enzym Ei katalysiert.
7. Die Zelle nach Anspruch 5, wobei das Enzym E2 ein Glycerin-Dehydratase-Reaktivierungsfaktor oder ein Diol-Dehydratase-Reakti-vierungsfaktor ist .
8. Die Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in der Zelle zusätzlich zu dem Enzym Ei und ge- gebenenfalls dem Enzym E2 auch die Aktivität eines
Enzyms E3 erhöht ist, welches die Diffusion von GIy- cerin in die Zelle hinein erleichtert.
9. Die Zelle nach Anspruch 8, wobei das Enzym E3 ein Glycerin-Kanal bzw. ein Glycerin-Facilitator
(TC I.A.8.1.1, TC I.A.8.2.1 oder TC I.A.8.2.2) ist.
10. Die Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei in der Zelle zusätzlich zur Aktivität des Enzyms Ei und gegebenenfalls des Enzyms E2 auch die Aktivität mindestens eines der Enzyme E4, E5, E6 oder E7 erhöht ist: eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von Di- hydroxyaceton-Phosphat zu Glycerin-3-Phosphat ka- talysiert; eines Enzyms E5, welches die Umsetzung von Glyce- rin-3-Phosphat zu Glycerin katalysiert; eines Enzyms E6, welches die Umsetzung von Di- hydroxyaceton-Phosphat zu Dihydroxyaceton kataly- siert; eines Enzyms E7, welches die Umsetzung von Dihydroxyaceton zu Glycerin katalysiert.
11. Die Zelle nach Anspruch 10, wobei das Enzym E4 eine Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase
(EC 1.1.1.8) , E5 eine Glycerin-3-Phosphat-Phosphatase (EC 3.1.3.21) ,
Ee eine Dihydroxyaceton-Phosphat-Phosphatase (EC 3.1.3.1) , und
E7 eine Glycerin-Dehydrogenase (EC 1.1.1.6) ist.
12. Die Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zelle eine verminderte Aktivität mindestens eines der Enzyme E8 bis En aufweist: - eines Enzyms Eg, welches die Umsetzung von Glyce- rin zu Glycerin-3-Phosphat katalysiert; eines Enzyms Eg, welches die Umsetzung von Glyce- rin zu Dihydroxyaceton katalysiert; eines Enzyms Eio, welches die Umsetzung von 3- Hydroxypropionaldehyd zu 1, 3-Propandiol katalysiert; eines Enzyms En, welches die Umsetzung von 3- Hydroxypropionaldehyd zu 3-Hydroxypropionsäure katalysiert .
13. Die Zelle nach Anspruch 12, wobei das Enzym E8 eine Glycerin-Kinase (EC 2.7.1.30),
Eg eine Glycerin-Dehydrogenase (EC 1.1.1.6 oder
EC 1.1.1.156 oder EC 1.1.99.22), E10 eine 1 , 3 - Propandiol -Dehydrogenase (EC 1 . 1 . 1 . 202 ) und En eine 3- Hydroxypropionaldehyd-Dehydrogenase
(EC 1.2.1.3 oder EC 1.2.1.5) ist.
14. Ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, die in der Lage ist, Corrinoide zu bilden, umfassend den Verfahrensschritt der Erhöhung der Aktivität eines Enzyms Ei, welches die intrazelluläre Umsetzung von Diolen, Triolen oder Polyolen zu Aldehyden, vorzugsweise von Glycerin zu 3- Hydroxypropionaldehyd, katalysiert .
15. Das Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Verfahren zusätzlich den Verfahrensschritt des Erhöhens der Ak- tivität eines Enzyms E2, welches die Reaktivierung von inaktiviertem Enzym Ei katalysiert, umfasst.
16. Eine Zelle, erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 14 oder 15.
17. Ein Verfahren zur Herstellung von Aldehyden aus Diolen, Triolen oder Polyolen, vorzugsweise von 3- Hydroxypropionaldehyd aus Glycerin, umfassend die folgenden Verfahrensschritte: i) in Kontakt bringen einer Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder 12 und 13 mit einem Kulturmedium, welches eine Bildung von Biomasse aus den Zellen ermöglicht; ii) gegebenenfalls Abtrennen der Zellen von dem KuI- turmedium; iü) i n Kontakt bringen der Zellen mit einem Kulturmedium, in welchem die pro Zeit- und Volumeneinheit gebildete Biomasse um mindestens 50 % gegenüber der pro Zeit- und Volumeneinheit im Verfahrens- schritt i) gebildeten Biomasse reduziert ist, und welches Diole, Triole oder Polyole, vorzugsweise Glycerin, beinhaltet, unter Bedingungen, unter denen die Zellen aus den Diolen, Triolen oder Po- lyolen Aldehyde, vorzugsweise aus Glycerin 3- Hydroxypropionaldehyd, bilden; iv) gegebenenfalls Aufreinigung der gebildeten Aldehyde, vorzugsweise des gebildeten 3- Hydroxypropionaldehyds, aus dem Kulturmedium.
18. Ein Verfahren zur Herstellung von 3-
Hydroxypropionaldehyd aus Glucose, Saccharose oder anderen Mono- und Polysacchariden, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:
I) in Kontakt bringen einer Zelle nach einem der An- sprüche 10 bis 13 mit einem Kulturmedium, welches eine Bildung von Biomasse aus den Zellen ermöglicht;
II) gegebenenfalls Abtrennen der Zellen von dem Kulturmedium; III) in Kontakt bringen der Zellen mit einem Kulturmedium, in welchem die pro Zeit- und Volumeneinheit gebildete Biomasse um mindestens 50 % gegenüber der pro Zeit- und Volumeneinheit im Verfahrensschritt I) gebildeten Biomasse reduziert ist und welches Glucose, Saccharose oder andere Mono- und
Polysaccharide beinhaltet, unter Bedingungen, unter denen die Zellen aus der Glucose, Saccharose oder anderen Mono- und Polysacchariden über GIy- cerin als Zwischenprodukt 3-Hydroxypropionaldehyd bilden;
IV) gegebenenfalls Aufreinigung des gebildeten 3- Hydroxypropion-aldehyds aus dem Kulturmedium.
19. Ein Verfahren zur Herstellung von C3-Verbindungen aus 3-Hydroxypropionaldehyd, umfassend die Verfahrens¬ schritte : A) Bereitstellung von 3-Hydroxypropionaldehyd mit¬ tels eines Verfahrens nach Anspruch 17 oder 18;
B) chemische oder biokatalytische Umsetzung des 3- Hydroxypropionaldehys durch Reduktion, Oxidation oder Dehydratisierung unter Erhalt von C3- Verbindungen;
C) gegebenenfalls weitere chemische oder biokataly¬ tische Umsetzung der im Verfahrensschritt B) er¬ haltenen C3-Verbindung durch Reduktion, Oxidation oder Addition.
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