DE112014000710B4

DE112014000710B4 - Bakterienstamm mit hoher Ausbeute an 5-Aminolävulinsäure, Herstellungsverfahren und Verwendungen dafür

Info

Publication number: DE112014000710B4
Application number: DE112014000710.2T
Authority: DE
Inventors: Ping Zheng; Jiuzhou Chen; Wei Pu; Jibin Sun; Xinyang Wu; Yanhe Ma
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2013-02-07
Filing date: 2014-01-28
Publication date: 2022-01-20
Anticipated expiration: 2034-01-29
Also published as: WO2014121724A1; JP6341936B2; CN103981203B; US10975400B2; KR20150145223A; KR101814888B1; US20150376661A1; CN103981203A; JP2016506738A; DE112014000710T5

Abstract

Ein Verfahren zum Aufbau eines ALA erzeugenden Bakterienstammes, wobei das Verfahren die Aktivität von relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat in dem 5-Aminolävulinsäure (ALA) erzeugenden Bakterienstamm fördern, verstärkt oder exogene relevante Enzyme, die die Synthese von Oxalacetat fördern, wie Phosphoenolpyruvat-Carboxylase oder Pyruvat-Carboxylase, einführt und/oder die Aktivität von relevanten Enzymen im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A, wie Succinyl-Coenzym-A-Synthetase oder Succinat-Dehydrogenase, in dem Bakterienstamm reduziert und/oder die Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms reduziert. Ein unter Verwendung des Verfahrens aufgebauter Bakterienstamm mit hoher ALA-Ausbeute und ein Verfahren zur Verwendung des Bakterienstamms zur Herstellung von ALA.

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Gentechnik und mikrobiellen Fermentation. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Stamm mit hoher Ausbeute an 5-Aminolävulinsäure sowie ein Herstellungsverfahren und eine Verwendung dafür.
Hintergrund
5-Aminolävulinsäure (ALA) ist ein Vorläufer für die Synthese von Tetrapyrrolverbindungen, wie Häm, Chlorophyll, Vitamin B12, in einem Organismus, und Tetrapyrrolverbindungen sind wichtige Komponenten für Cytochrome, Hämoglobin und Chloroplastenprotein, die bei Aktivitäten des Lebens eine wichtige Rolle spielen. ALA wird verbreitet in der Medizin, Landwirtschaft, Tierzucht, als Grundchemikalien und in anderen Bereichen verwendet, und aufgrund ihrer Vorteile, wie biologische Abbaubarkeit, Nichttoxizität und Rückstandslosigkeit ist sie eine wichtige hochwertige Chemikalie auf biologischer Basis. ALA kann als neue Generation von photodynamischen Wirkstoffen in der Krebstherapie, Tumordiagnose und Behandlung von Hautkrankheiten verwendet werden; sie kann als Pflanzenwachstumsregulator verwendet werden, um das Wachstum von Blumen, Pflanzen und Gemüse erheblich zu fördern und die Qualität von Feldfrüchten, Obst und Gemüse zu steigern; und ALA kann als Tierfutterzusatz verwendet werden, um den Stoffwechsel und die Immunität von Tieren zu verstärken. In neuerer Zeit wird ALA auch als Hauptzutat in der Entwicklung von Kosmetik und funktioneller Lebensmittel verwendet, und entsprechende Produkte werden auch vermarktet.
Zurzeit wird ALA jedoch hauptsächlich durch chemische Synthese hergestellt, und da gibt es einige Nachteile, wie mehrere Reaktionsschritte, eine geringe Umsetzungsrate, hohe Produktionskosten, hoher Energie- und Materialverbrauch, toxische Rohstoffe, die während der Herstellung verwendet werden, starke Umweltverschmutzung und hoher Preis. Zurzeit beträgt der Erzeugerpreis für ALA-Hydrochlorid auf dem chinesischen Markt etwa 17000 bis 19000 CNY/kg, während der Preis des analysenreinen Produkts bis zu 2000 CNY/g beträgt. Hohe Herstellungskosten sind zu einem begrenzenden Faktor in der ALA-Anwendung geworden.
Mit der Entwicklung der Gesellschaft und der Wissenschaft und Technik ist der Ersatz der chemischen Synthese durch saubere und effiziente Fermentierungsverfahren zur Herstellung von ALA in den Fokus der Forschung gerückt. Zurzeit gehören die Verfahren zur Herstellung von ALA unter Verwendung von Mikroorganismen im Allgemeinen zu zwei Typen: Der erste besteht darin, dass photosynthetische Bakterien zur Mutation gebracht werden, um ALA-Mutanten mit hoher Ausbeute zu züchten, und die erhaltene Mutante wird in einem speziellen Medium kultiviert, um hohe Konzentrationen an ALA anzuhäufen, doch ist die Fermentationszeit eines solchen Verfahrens relativ lang, die Steuerungsbedingungen sind komplex, und die Zugabe von Substraten und Inhibitoren erhöht die Produktionskosten. Der zweite besteht darin, dass der Stoffwechselweg eines Mikroorganismus durch gentechnische Stoffwechselveränderung modifiziert wird, und durch Stärkung der ALA-Synthese wird eine überschüssige Anhäufung von ALA erreicht. In Mikroorganismen gibt es hauptsächlich zwei Wege zum Synthetisieren von ALA; einer davon ist der C4-Weg, wobei ALA durch ALA-Synthetase unter Verwendung von Succinyl-CoA und Glycin als Vorläufer synthetisiert wird; ein anderer ist der C5-Weg, wobei ALA unter Verwendung von Glutamyl-tRNA als Vorläufer durch eine zweistufige Reaktion synthetisiert wird. Xie et al. (Xie L, Hall D, Eiteman MA, Altman E, Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 63 (3): 267-273) berichteten, dass 5,2 g/l ALA-Ausbeute erhalten werden kann, indem man Wildtyp-E.-coli MG1655, das ALA-Synthetase aus Rhodobacter sphaeroides exprimiert, verwendet und die Fermentationsbedingungen optimiert. Jianping Lin et al. ( CN200710068168.6 , CN201210013562.0 ) berichteten, dass 6,6 g/l ALA-Ausbeute erhalten werden kann, indem man das ALA-Synthetase-Gen aus Rhodobacter sphaeroides unter Optimierung der Fermentationsbedingungen in E. coli Rosetta 2 (DE3) exprimiert, und nach weiterer Optimierung kann in einem 15-Liter-Fermenter eine ALA-Ausbeute von 9,4 g/l erhalten werden, die höchste in der Literatur beschriebene Ausbeute. Alle die obigen Studien fokussierten sich auf einen relativ einfachen C4-Weg, und die Wirkungen werden hauptsächlich dadurch erreicht, dass man exogene ALA-Synthetase in E. coli exprimiert und in einem angereicherten LB-Medium Substrate (Bernsteinsäure und Glycin) und Inhibitoren nachgelagerter Stoffwechselwege hinzufügt. Durch die obigen Verfahren wurde ein höherer Wert der ALA-Ausbeute erhalten, doch ist die Steuerung des Fermentationsvorgangs aufgrund der Verwendung von LB-Medium und der Zugabe von Substraten und Inhibitoren komplex, und die Produktionskosten steigen, wodurch die im großen Maßstab erfolgenden industriellen Anwendungen begrenzt sind. Shin et al. (Shin JA, Kwon YD, Kwon OH, Lee HS, Kim P, J Microbiol Biotechnol, 2007, 17 (9): 1579-1584) berichteten, dass ALA-Synthetase aus Rhodobacter sphaeroides in E. coli mit dem NADPabhängigen Malat-Enzym von E. coli selbst coexprimiert wurde, und unter anaeroben Bedingungen kann die ALA-Ausbeute in einem angereicherten Medium ohne Zugabe von Bernsteinsäure verbessert werden. Was den ALA-Verbesserungsgrad betrifft, ist die Gesamtausbeute jedoch immer noch gering und kann die Produktionsanforderungen nicht erfüllen. In Kang et al. (Kang Z, Wang Y, Gu P, Wang Q, Qi Q, Metab Eng, 2011, 13 (5): 492-498) wurde ein optimierter C5-Weg verwendet, und ALA-Transporter wurden in E. coli exprimiert. Und in einem 5-Liter-Fermenter kann 4,13 g/l ALA-Ausbeute erhalten werden, und ALA kann durch Fermentation unter Verwendung eines synthetischen Mediums produziert werden, wobei Glucose die Hauptkohlenstoffquelle ist. Die Fermentationszeit ist jedoch lang, und die Glucoseumsetzungsrate ist gering, und zwar nur 0,168 g/g (Stoffmengenverhältnis von etwa 0,23). In den obigen Studien wurden einige Anstrengungen unternommen, um das Substrat zum Synthetisieren von ALA intrazellulär zuzuführen, doch die Gesamtwirkung ist nicht gut. Daher wird bisher eine exogene Zugabe für die Zufuhr von Substraten zum Synthetisieren von ALA verwendet, insbesondere für den am häufigsten verwendeten C4-Syntheseweg bei der Synthese von ALA. Es ist kein Bericht davon zu finden, dass ALA durch Fermentierung unter Verwendung von gentechnisch veränderten Stämmen mit einem C4-Weg in einem Medium, das die billige Glucose als Hauptkohlenstoffquelle enthält, erzeugt werden kann.
Alles in Allem ist es dringend notwendig, ein effizientes, kostengünstiges, umweltschonendes Herstellungsverfahren für ALA zu entwickeln.
Kurzbeschreibung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Aufbau von Stämmen mit hoher Ausbeute an 5-Aminolävulinsäure anzugeben und die erhaltenen Stämme bereitzustellen.
Im ersten Aspekt gibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Aufbau eines 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stammes an, wobei das Verfahren umfasst:

Verstärken der Aktivität von relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm fördern, oder Einführen von exogenen relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat fördern; und/oder

Dämpfen der Aktivität von relevanten Enzymen im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm.
In einer speziellen Ausführungsform handelt es sich bei dem relevanten Enzym, das die Synthese von Oxalacetat fördert, um Phosphoenolpyruvat-Carboxylase oder Pyruvat-Carboxylase, und bei dem relevanten Enzym im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A handelt es sich um Succinyl-Coenzym-A-Synthetase oder Succinat-Dehydrogenase.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Verstärkung der Aktivität von relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm fördern, durch eines der folgenden Verfahren oder eine Kombination davon erreicht werden: Verstärken der Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxylase und/oder Verstärken der Aktivität von Pyruvat-Carboxylase.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann die Verstärkung der Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxylase oder Pyruvat-Carboxylase durch eines der folgenden Verfahren oder eine Kombination davon erreicht werden: Exprimieren eines homologen oder heterologen Gens, das Phosphoenolpyruvat-Carboxylase oder Pyruvat-Carboxylase codiert, und/oder Erhöhen der Anzahl von Kopien des codierenden Gens und/oder Modifizieren des Promotors des codierenden Gens zur Erhöhung der Transcriptionsstartgeschwindigkeit und/oder Modifizieren des translationsregulatorischen Bereichs der Messenger-RNA, die das codierende Gen trägt, zur Erhöhung der Translationsintensität.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die „Dämpfung“ das Deletieren des relevanten Enzyms in einem nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem relevanten Enzym in dem nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A um Succinyl-Coenzym-A-Synthetase oder Succinat-Dehydrogenase.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Dämpfung der Aktivität von relevanten Enzymen im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm durch eines der folgenden Verfahren oder eine Kombination davon erreicht werden: Ausschalten eines Teils oder des gesamten codierenden Gens von Succinyl-Coenzym-A-Synthetase oder Succinat-Dehydrogenase, Gen-Inaktivierung durch Mutation, Modifizieren eines Promotors oder eines translationsregulatorischen Bereichs, um dessen Transcription oder Translation zu dämpfen, Änderung der Gensequenz, um die Stabilität von mRNA oder die Stabilität der Enzymstruktur zu dämpfen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin das Verstärken des Synthesewegs von 5-Aminolävulinsäure in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm oder das Einführen eines exogenen Synthesewegs von 5-Aminolävulinsäure.
In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die „Verstärkung des Synthesewegs von 5-Aminolävulinsäure in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm“ auf die Verstärkung der Aktivität von 5-Aminolävulinsäure-Synthetase in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm oder das Einführen von exogener 5-Aminolävulinsäure-Synthetase.
In einer anderen speziellen Ausführungsform umfasst das Verfahren das Verstärken der Aktivität von 5-Aminolävulinsäure-Synthetase oder das Einführen von exogener 5-Aminolävulinsäure-Synthetase, das Verstärken der Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxylase und das Ausschalten von Succinat-Dehydrogenase in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin das Bestimmen der Ausbeute von 5-Aminolävulinsäure in dem erhaltenen Stamm.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann durch Verwendung des durch das Verfahren erhaltenen 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamms 5-Aminolävulinsäure in großer Menge produziert werden, ohne exogene Bernsteinsäure hinzuzufügen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann durch Verwendung des durch das Verfahren erhaltenen 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamms 5-Aminolävulinsäure unter aeroben Bedingungen, in großer Menge und ohne exogene Zugabe von Bernsteinsäure produziert werden.
In einer anderen speziellen Ausführungsform kann der Stamm selbst 5-Aminolävulinsäure synthetisieren.
In einer anderen speziellen Ausführungsform umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung weiterhin das Dämpfen der Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Dämpfen der Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms durch Ausschalten des Gens von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms erreicht.
In einem anderen Aspekt gibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Aufbau eines 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stammes an, wobei das Verfahren umfasst: Dämpfen der Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm; und Verstärken des Synthesewegs von 5-Aminolävulinsäure in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm oder Einführen eines exogenen Synthesewegs von 5-Aminolävulinsäure.
Im zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm bereit, wobei in dem Stamm die Aktivität von relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat fördern, verstärkt ist oder exogene relevante Enzyme, die die Synthese von Oxalacetat fördern, eingeführt sind, und/oder
die Aktivität von relevanten Enzymen in einem nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A gedämpft ist.
In einer speziellen Ausführungsform handelt es sich bei dem relevanten Enzym, das die Synthese von Oxalacetat fördert, um Phosphoenolpyruvat-Carboxylase oder Pyruvat-Carboxylase, und bei dem relevanten Enzym im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A handelt es sich um Succinyl-Coenzym-A-Synthetase oder Succinat-Dehydrogenase.
In einer anderen speziellen Ausführungsform ist der Syntheseweg von 5-Aminolävulinsäure in dem Stamm verstärkt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist in dem Stamm die Aktivität von 5-Aminolävulinsäure-Synthetase verstärkt, oder exogene 5-Aminolävulinsäure-Synthetase ist eingeführt.
In einer anderen speziellen Ausführungsform ist in dem Stamm die Aktivität von 5-Aminolävulinsäure-Synthetase verstärkt, oder exogene 5-Aminolävulinsäure-Synthetase ist eingeführt, die Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxylase ist verstärkt, oder exogene Phosphoenolpyruvat-Carboxylase ist eingeführt, und Succinat-Dehydrogenase ist ausgeschaltet.
In einer anderen speziellen Ausführungsform ist der Stamm ausgewählt aus Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Rhodobacter sphaeroides, Rhodopseudomonas palustris usw.
In einer anderen speziellen Ausführungsform ist die Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms in dem Stamm gedämpft.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gen von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms in dem Stamm ausgeschaltet.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm bereit, wobei die Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms in dem Stamm gedämpft ist und der Syntheseweg von 5-Aminolävulinsäure in dem Stamm verstärkt ist oder ein exogener Syntheseweg von 5-Aminolävulinsäure eingeführt ist.
Im dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Stamm von Escherichia coli zur Produktion von 5-Aminolävulinsäure bereit, und der Stamm ist aus der folgenden Gruppe ausgewählt: dem Stamm, der beim China General Microbiological Culture Collection Center unter der Akzessionsnummer CGMCC 6588 hinterlegt ist, oder dem Stamm, der beim China General Microbiological Culture Collection Center unter der Akzessionsnummer CGMCC 6589 hinterlegt ist.
In einer speziellen Ausführungsform kann 5-Aminolävulinsäure unter Verwendung des Stamms hergestellt werden, ohne exogen Bernsteinsäure hinzuzufügen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Ausbeute der von dem Stamm erzeugten 5-Aminolävulinsäure größer als 7 g/l.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Glucoseumsetzungsrate für die Produktion von 5-Aminolävulinsäure in dem Stamm größer als 0,35 (Stoffmengenverhältnis), vorzugsweise größer als 0,45 (Stoffmengenverhältnis) und am meisten bevorzugt größer als 0,5 (Stoffmengenverhältnis).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann durch Verwendung des 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamms 5-Aminolävulinsäure in großer Menge produziert werden, ohne exogene Bernsteinsäure hinzuzufügen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann durch Verwendung des 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamms 5-Aminolävulinsäure unter aeroben Bedingungen, in großer Menge und ohne exogene Zugabe von Bernsteinsäure produziert werden.
Im vierten Aspekt gibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 5-Aminolävulinsäure an, wobei das Verfahren umfasst:

1) Kultivieren des Stammes gemäß dem zweiten oder dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung, was 5-Aminolävulinsäure ergibt; und
2) Gewinnen von 5-Aminolävulinsäure aus dem Fermentationssystem von 1).

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Ausbeute der durch das Verfahren erzeugten 5-Aminolävulinsäure größer als 7 g/l.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann durch Verwendung des Verfahrens 5-Aminolävulinsäure in großer Menge produziert werden, ohne exogene Bernsteinsäure hinzuzufügen.
Im fünften Aspekt gibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 5-Aminolävulinsäure an, wobei das Verfahren umfasst:

1) Kultivieren eines 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stammes in einem Medium in Gegenwart von Inhibitoren relevanter Enzyme im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A, was 5-Aminolävulinsäure ergibt; und
2) Gewinnen von 5-Aminolävulinsäure aus dem Kultursystem von 1).

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem relevanten Enzym in dem nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A um Succinyl-Coenzym-A-Synthetase oder Succinat-Dehydrogenase.
Im sechsten Aspekt gibt die vorliegende Erfindung die Verwendung des Stammes gemäß dem zweiten oder dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von 5-Aminolävulinsäure und/oder zur Herstellung nachgelagerter Produkte durch Verwendung von 5-Aminolävulinsäure als Vorläufer an.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem nachgelagerten Produkt um Häm oder Vitamin B12, wobei ALA als Vorläufer verwendet wird.
Man sollte sich darüber im Klaren sein, dass in der vorliegenden Erfindung die technischen Merkmale, die oben und im Folgenden (wie in den Beispielen) speziell genannt werden, miteinander kombiniert werden können, wodurch sie eine neue oder bevorzugte technische Lösung bilden, die nicht im Einzelnen beschrieben werden muss.
Figurenliste

1 ist ein schematisches Diagramm, das die technische Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verbesserung der Ausbeute an ALA zeigt.
2 zeigt die genetischen Profile der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Expressionsvektoren.
3 ist ein schematisches Diagramm, das eine andere technische Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verbesserung der Ausbeute an ALA zeigt.
4 ist ein schematisches Diagramm, das den Aufbau der rekombinanten Vektoren pZWA1 und pZWA2 zeigt.

Wege zur Durchführung der Erfindung
Durch umfassende und intensive Forschung haben die Erfinder unerwarteterweise herausgefunden, dass die Ausbeute an 5-Aminolävulinsäure in einem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm stark verbessert werden kann, indem man die Aktivität von relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat in dem erzeugenden Stamm fördern, verstärkt; die Erfinder haben weiterhin herausgefunden, dass die Ausbeute an 5-Aminolävulinsäure in dem erzeugenden Stamm auch dadurch verbessert werden kann, dass man die Aktivität von relevanten Enzymen in einem nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A in dem erzeugenden Stamm dämpft; außerdem haben die Erfinder herausgefunden, dass die Ausbeute an 5-Aminolävulinsäure signifikant verbessert werden kann, indem man die Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und des Malat-Enzyms dämpft; und die Ausbeute an 5-Aminolävulinsäure in einem erhaltenen erzeugenden Stamm kann weiterhin durch jede Kombination von zweien oder dreien der oben genannten technischen Mittel verbessert werden. Auf der Grundlage der obigen Ergebnisse wurde die vorliegende Erfindung fertiggestellt.
Definitionen
Der hier verwendete Ausdruck „exogen“ bezieht sich auf eine Situation, in der ein System eine Substanz enthält, die ursprünglich nicht dort vorkommt. Zum Beispiel wird ein Gen, das ein Enzym codiert, welches in einem Stamm nicht vorkommt, durch Transformation in den Stamm eingeführt, wodurch das Enzym in dem Stamm exprimiert wird, und entsprechend ist das Enzym bezüglich des Stamms „exogen“.
Der hier verwendete Ausdruck „verstärken“ bezieht sich auf das Erhöhen, Verbessern, Steigern oder Anheben der Aktivität eines Proteins, wie eines Enzyms. Auf der Grundlage der Lehren der vorliegenden Erfindung und des Standes der Technik wird ein Fachmann leicht verstehen, dass der hier verwendete Ausdruck „verstärken“ auch das Verstärken der Aktivität eines Enzyms durch Expression von heterologen Genen, die das Enzym codieren, umfassen sollte. In einer speziellen Ausführungsform kann die Aktivität eines Enzyms dadurch verstärkt werden, dass man ein homologes oder heterologes codierendes Gen des Enzyms exprimiert und/oder die Anzahl der Kopien des codierenden Gens erhöht und/oder den Promotor des codierenden Gens so modifiziert, dass die Transcriptionsstartgeschwindigkeit erhöht wird, und/oder den translationsregulatorischen Bereich der Messenger-RNA, die das codierende Gen trägt, so modifiziert, dass die Translationsintensität erhöht wird, und/oder das codierende Gen selbst so modifiziert, dass die Stabilität der mRNA oder die Stabilität des Proteins erhöht wird oder die Feedback-Hemmung des Proteins beseitigt wird.
Ähnlich bezieht sich der hier verwendete Ausdruck „dämpfen“ auf das Reduzieren, Schwächen, Senken oder Beseitigen der Aktivität eines bestimmten Proteins, wie eines Enzyms. In einer speziellen Ausführungsform kann die Aktivität eines Enzyms dadurch gedämpft werden, dass man einen Teil oder das gesamte codierende Gen ausschaltet, das Gen durch Mutation inaktiviert oder teilweise inaktiviert, den Promotor oder den translationsregulatorischen Bereich eines Gens so modifiziert, dass die Transcription oder Translation desselben gedämpft wird, oder die Gensequenz so verändert, dass die Stabilität der mRNA oder die Stabilität der Enzymstruktur gedämpft wird.
Der hier verwendete Ausdruck „relevante Enzyme, die die Synthese von Oxalacetat fördern,“ bezieht sich auf Enzyme, die für die Synthese von Oxalacetat relevant sind und positive Wirkungen, wie fördernde, verbessernde, erhöhende Wirkungen, auf die Synthese von Oxalacetat ausüben. In einer speziellen Ausführungsform umfassen die relevanten Enzyme der vorliegenden Erfindung, die die Synthese von Oxalacetat fördern, unter Anderem: Phosphoenolpyruvat-Carboxylase ppc oder Pyruvat-Carboxylase pyc. Außerdem wird der Fachmann auf der Grundlage der Lehren der vorliegenden Erfindung und des Standes der Technik leicht verstehen, dass die relevanten Enzyme, die die Synthese von Oxalacetat fördern, verschiedener Herkunft in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, solange das Enzym die Synthese von Oxalacetat in Stämmen fördern, verbessern oder erhöhen kann. In einer speziellen Ausführungsform stammt die in der vorliegenden Erfindung verwendete Phosphoenolpyruvat-Carboxylase von Escherichia coli, und die Pyruvat-Carboxylase stammt von Rhizobia.
Der hier verwendete Ausdruck „relevante Enzyme im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A“ bezieht sich auf ein Enzym, das Succinyl-Coenzym A als Substrat verwendet, um andere Substanzen zu synthetisieren, wodurch Succinyl-Coenzym A verbraucht wird. In einer speziellen Ausführungsform umfassen die relevanten Enzyme im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A unter Anderem: Succinyl-Coenzym-A-Synthetase oder Succinat-Dehydrogenase.
Der hier verwendete Ausdruck „Syntheseweg von 5-Aminolävulinsäure“ bezieht sich auf einen speziellen Weg zur Erzeugung von 5-Aminolävulinsäure in Mikroorganismen, der verschiedene Enzyme umfasst, wie 5-Aminolävulinsäure-Synthetase, Glutamyl-tRNA-Synthetase, Glutamyl-tRNA-Reductase oder Glutamat-1-semialdehyd-Aminotransferase und dergleichen. Ähnlich bezieht sich der hier verwendete Ausdruck „Verstärken des Synthesewegs von 5-Aminolävulinsäure“ auf die Verstärkung der Aktivität von relevanten Enzymen, die am Syntheseweg von 5-Aminolävulinsäure beteiligt sind, wie 5-Aminolävulinsäure-Synthetase, Glutamyl-tRNA-Synthetase, Glutamyl-tRNA-Reductase oder Glutamat-1-semialdehyd-Aminotransferase. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Enzym um 5-Aminolävulinsäure-Synthetase, die von Rhodopseudomonas palustris stammt.
5-Aminolävulinsäure erzeugender Stamm gemäß der vorliegenden Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm bereit, wobei in dem Stamm die Aktivität von relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat fördern, verstärkt ist oder exogene relevante Enzyme, die die Synthese von Oxalacetat fördern, eingeführt sind und/oder die Aktivität von relevanten Enzymen im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A gedämpft ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die relevanten Enzyme, die die Synthese von Oxalacetat fördern, unter Anderem: Phosphoenolpyruvat-Carboxylase oder Pyruvat-Carboxylase; und die relevanten Enzyme im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A umfassen unter Anderem: Succinyl-Coenzym-A-Synthetase oder Succinat-Dehydrogenase.
In anderen Ausführungsformen ist der Syntheseweg von 5-Aminolävulinsäure in dem Stamm verstärkt, oder ein exogener Syntheseweg von 5-Aminolävulinsäure ist eingeführt. Dementsprechend ist in einer speziellen Ausführungsform in dem Stamm gemäß der vorliegenden Erfindung der Syntheseweg von 5-Aminolävulinsäure verstärkt, oder ein exogener Syntheseweg von 5-Aminolävulinsäure ist eingeführt, die Aktivität von relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat fördern, ist verstärkt, oder die exogenen relevanten Enzyme, die die Synthese von Oxalacetat fördern, sind eingeführt, und/oder die Aktivität von relevanten Enzymen im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A ist gedämpft. In einer bevorzugten Ausführungsform ist in dem Stamm gemäß der vorliegenden Erfindung die Aktivität von 5-Aminolävulinsäure-Synthetase verstärkt, oder exogene 5-Aminolävulinsäure-Synthetase ist eingeführt, die Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxylase ist verstärkt, oder exogene Pyruvat-Carboxylase ist eingeführt, und Succinat-Dehydrogenase ist ausgeschaltet.
In einer speziellen Ausführungsform ist die Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms in dem Stamm gemäß der vorliegenden Erfindung gedämpft.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gen von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms in dem Stamm gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeschaltet.
Der Fachmann wird wissen, dass viele Stämme verwendet werden können, um 5-Aminolävulinsäure zu erzeugen. Diese Stämme sind unterschiedlich, doch das Synthesesystem oder der Weg zum Synthetisieren von 5-Aminolävulinsäure ist ähnlich. Dementsprechend wird der Fachmann auf der Grundlage der Lehren der vorliegenden Erfindung und des Standes der Technik verstehen, dass der Stamm der vorliegenden Erfindung jeder Stamm sein kann, der verwendet werden kann, um 5-Aminolävulinsäure zu erzeugen, einschließlich unter Anderem: Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Rhodobacter sphaeroides, Rhodopseudomonas palustris und dergleichen.
In einer speziellen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen Stamm von Escherichia coli bereit, der beim China General Microbiological Culture Collection Center unter der Akzessionsnummer CGMCC 6588 hinterlegt ist. In einer anderen speziellen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen Stamm von Escherichia coli bereit, der beim China General Microbiological Culture Collection Center unter der Akzessionsnummer CGMCC 6589 hinterlegt ist.
5-Aminolävulinsäure kann unter Verwendung des Stammes der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, ohne den Vorläufer Bernsteinsäure exogen hinzuzufügen, und die Ausbeute an erzeugter 5-Aminolävulinsäure ist größer als 7 g/l.
Außerdem ist bei Verwendung des Stammes der vorliegenden Erfindung zur Erzeugung von 5-Aminolävulinsäure die Glucoseumsetzungsrate größer als 0,35 (Stoffmengenverhältnis), vorzugsweise größer als 0,45 (Stoffmengenverhältnis) und am meisten bevorzugt größer als 0,5 (Stoffmengenverhältnis). In einer bevorzugten Ausführungsform kann bei Verwendung des Stammes der vorliegenden Erfindung 5-Aminolävulinsäure in großer Menge produziert werden, ohne exogene Bernsteinsäure hinzuzufügen, 5-Aminolävulinsäure kann unter aeroben Bedingungen und in großer Menge produziert werden, und daher ist es nicht notwendig, Geräte im Stand der Technik, wie den Fermenter, zu verändern, um die industrielle Maßstabsvergrößerung zu erleichtern.
Dementsprechend kann 5-Aminolävulinsäure bei Verwendung des Stammes der vorliegenden Erfindung leicht zu geringeren Kosten hergestellt werden.
Der Fachmann wird verstehen, dass der Stamm der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden kann, um neben 5-Aminolävulinsäure verschiedene nachgelagerte Produkte zu produzieren, wobei 5-Aminolävulinsäure als Vorläufer verwendet wird. In einer speziellen Ausführungsform handelt es sich bei dem nachgelagerten Produkt um Häm oder Vitamin B12, wobei ALA als Vorläufer verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung gibt auch ein Verfahren zum Aufbau eines 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stammes an, wobei das Verfahren umfasst: Verstärken der Aktivität von relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm fördern, oder Einführen von exogenen relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat fördern, und/oder Dämpfen der Aktivität von relevanten Enzymen im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem relevanten Enzym, das die Synthese von Oxalacetat fördert, um Phosphoenolpyruvat-Carboxylase oder Pyruvat-Carboxylase, und bei dem relevanten Enzym im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A handelt es sich um Succinyl-Coenzym-A-Synthetase oder Succinat-Dehydrogenase.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Verstärkung der Aktivität von relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm fördern, durch eines der folgenden Verfahren oder eine Kombination davon erreicht werden: Verstärken der Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxylase und/oder Verstärken der Aktivität von Pyruvat-Carboxylase.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform kann die Verstärkung der Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxylase oder Pyruvat-Carboxylase durch eines der folgenden Verfahren oder eine Kombination davon erreicht werden: Exprimieren eines homologen oder heterologen Gens, das Phosphoenolpyruvat-Carboxylase oder Pyruvat-Carboxylase codiert, und/oder Erhöhen der Anzahl von Kopien des codierenden Gens und/oder Modifizieren des Promotors des codierenden Gens zur Erhöhung der Transcriptionsstartgeschwindigkeit und/oder Modifizieren des translationsregulatorischen Bereichs der Messenger-RNA, die das codierende Gen trägt, zur Erhöhung der Translationsintensität.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die „Dämpfung“ das Deletieren des relevanten Enzyms in einem nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem relevanten Enzym in dem nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A um Succinyl-Coenzym-A-Synthetase oder Succinat-Dehydrogenase.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Dämpfung der Aktivität von relevanten Enzymen im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm durch eines der folgenden Verfahren oder eine Kombination davon erreicht werden: Ausschalten eines Teils oder des gesamten codierenden Gens von Succinyl-Coenzym-A-Synthetase oder Succinat-Dehydrogenase, Gen-Inaktivierung durch Mutation, Modifizieren eines Promotors oder eines translationsregulatorischen Bereichs, um dessen Transcription oder Translation zu dämpfen, Änderung der Gensequenz, um die Stabilität von mRNA oder die Stabilität der Enzymstruktur zu dämpfen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin das Verstärken des Synthesewegs von 5-Aminolävulinsäure in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm oder das Einführen eines exogenen Synthesewegs von 5-Aminolävulinsäure. Dementsprechend umfasst in einer speziellen Ausführungsform das Verfahren das Verstärken des Synthesewegs von 5-Aminolävulinsäure in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm oder das Einführen eines exogenen Synthesewegs von 5-Aminolävulinsäure, das Verstärken der Aktivität von relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat fördern, oder das Einführen von exogenen relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat fördern, und/oder das Dämpfen der Aktivität von relevanten Enzymen im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verstärkung der Aktivität von 5-Aminolävulinsäure-Synthetase oder das Einführen von exogener 5-Aminolävulinsäure-Synthetase, die Verstärkung (der Aktivität) von Phosphoenolpyruvat-Carboxylase und das Ausschalten von Succinat-Dehydrogenase in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm.
In einer anderen speziellen Ausführungsform umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung weiterhin das Dämpfen der Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Dämpfen der Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms durch Ausschalten des Gens von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms erreicht.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin das Bestimmen der Ausbeute von 5-Aminolävulinsäure in dem erhaltenen Stamm.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann durch Verwendung des durch das Verfahren erhaltenen 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamms 5-Aminolävulinsäure in großer Menge produziert werden, ohne exogene Bernsteinsäure hinzuzufügen.
Auf der Grundlage der Lehren der vorliegenden Erfindung und des Standes der Technik wird ein Fachmann verstehen, dass gemäß der vorliegenden Erfindung die Kapazität eines Ausgangsstamms zur Erzeugung von 5-Aminolävulinsäure dadurch verbessert wurde, dass man die Aktivität von relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat im Ausgangsstamm fördern, verstärkte oder dass man exogene relevante Enzyme, die die Synthese von Oxalacetat fördern, einführte und/oder dass man die Aktivität von relevanten Enzymen im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A im Ausgangsstamm dämpfte und/oder dass man die Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms dämpfte. Daher sollten ein Verfahren zum Aufbau oder zum Modifizieren eines Stamms durch eines oder durch eine Kombination von zweien oder dreien der obigen technischen Mittel zur Verbesserung der Ausbeute von 5-Aminolävulinsäure sowie der erhaltene Stamm in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung fallen, und der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung ist nicht auf die speziellen Verfahren, die in den Beispielen eingesetzt werden, und die resultierenden Stämme beschränkt.
Auf der Grundlage des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung und der resultierenden Stämme gibt die vorliegende Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von 5-Aminolävulinsäure an, wobei das Verfahren umfasst: 1) Kultivieren des Stammes gemäß der vorliegenden Erfindung, was 5-Aminolävulinsäure ergibt; und 2) Gewinnen von 5-Aminolävulinsäure aus dem Fermentationssystem von 1). In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Ausbeute der durch das Verfahren erzeugten 5-Aminolävulinsäure größer als 7 g/l. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist es gemäß dem Verfahren nicht notwendig, exogen Bernsteinsäure hinzuzufügen, und/oder es ist ausreichend, nur Glucose als Kohlenstoffquelle zu verwenden.
Auf der Grundlage der Anregungen und Lehren der vorliegenden Erfindung wird der Fachmann verstehen, dass die Ausbeute an 5-Aminolävulinsäure auch dadurch verbessert werden kann, dass man Inhibitoren von relevanten Enzymen im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A in das Kultursystem eines 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stammes gibt. In einer speziellen Ausführungsform handelt es sich bei dem relevanten Enzym im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A um Succinyl-Coenzym-A-Synthetase oder Succinat-Dehydrogenase.
Vorteile der vorliegenden Erfindung:

1. Bezüglich des Stammes der vorliegenden Erfindung ist die Glucoseumsetzungsrate verbessert, und die Synthese von Succinyl-Coenzym A, eines der notwendigen Substrate zum Synthetisieren von ALA, wird erhöht, wodurch die Ausbeute an ALA verbessert wird;
2. Wenn man ALA unter Verwendung des Stammes der vorliegenden Erfindung herstellt, ist es nicht notwendig, den Vorläufer Bernsteinsäure exogen hinzuzufügen, und daher sind die Zugabe von Bernsteinsäure und die Verwendung von kostspieligem Medium, wie LB, während der Produktion nicht notwendig, wodurch die Produktionskosten stark reduziert werden.

Die Erfindung wird weiterhin unter Bezugnahme auf die folgenden speziellen Beispiele veranschaulicht. Man sollte sich darüber im Klaren sein, dass diese Beispiele die Erfindung nur veranschaulichen, aber nicht den Umfang der Erfindung einschränken sollen. Wenn für die experimentellen Verfahren in den folgenden Beispielen keine besonderen Bedingungen angegeben sind, werden sie unter Routinebedingungen, wie den Bedingungen, die bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, beschrieben sind, oder gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Materialien und Methoden
Die in den Beispielen der vorliegenden Erfindung verwendete DNA-Polymerase wurde vom Fastpfu von TransGen Biotech (Peking) bezogen, und die Restriktionsenzyme und die DNA-Ligase wurden von Fermentas bezogen.
Hefeextrakt und Pepton wurden von Oxoid (UK) bezogen, Glycin und IPTG wurden von Promega bezogen, 5-ALA und p-Dimethylaminobenzaldehyd wurden von Sigma bezogen; Agarpulver und Antibiotika wurden von Solarbio (Peking) bezogen, und Glucose, Essigsäure, Perchlorsäure, Trichloressigsäure, Acetylaceton, Chloroform und andere übliche chemische Reagentien wurden von Sinopharm bezogen.
Der Plasmidextraktionskit und der Agarose-Gel-Elektrophorese-Extraktionskit wurden von Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., bezogen und im Einklang mit den Anweisungen des Herstellers eingesetzt.
Der Aufbau und die Sequenzierung von Plasmiden wurden vom BGI durchgeführt.
Kompetente DH5a-Zellen wurden von TransGen Biotech (Peking) bezogen.
Zusammensetzung des LB-Mediums: Hefeextrakt 5 g/l, Pepton 10 g/l, NaCI 10 g/l, festes Medium mit 2% Agar ergänzt.
Konzentration des Antibiotikums: Ampicillin 100 µg/ml, Kanamycin 30 µg/ml.
Nachweis von ALA: 100 µl Natriumacetatpuffer (pH 4,6) wurde zu 200 µl verdünnte Fermentationsbouillon gegeben, dann wurden 5 µl Acetylaceton hinzugefügt, es wurde 15 min lang in einem Wasserbad bei 100 °C inkubiert und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Und dann wurde ein gleiches Volumen Ehrlich-Reagens (42 ml Eisessig, 8 ml 70%-ige Perchlorsäure, 1 g Dimethylaminobenzaldehyd) hinzugefügt, und es wurde bis zur Gleichmäßigkeit gemischt. Nach 10 min Entwicklung wurde die Extinktion bei einer Wellenlänge von 553 nm gemessen.
Ein SBA-40D-Biosensor-Analysator (Shandong Academy) wurde verwendet, um eine Glucoseanalyse durchzuführen.
Beispiel 1. Aufbau einer Succinyl-Coenzym-A-Synthetase-Deletionsmutante und einer Succinat-Dehydrogenase-Deletionsmutante
Gene von E. coli wurden durch ein klassisches Red-Rekombinationsverfahren (siehe einschlägige Literatur) wie folgt ausgeschaltet: Zum Ausschalten des Succinyl-Coenzym-A-Synthetase-Struktur-Gens sucCD wurden zuerst die Primer sucCD-1 und sucCD-2, deren spezifische Sequenz im Primersequenzprotokoll zu finden ist, gemäß der durch das NCBI veröffentlichten Genomsequenz von E. coli MG1655 und der Sequenz des Hilfsvektors pKD13 entworfen, und ein Kan-Resistenz-Genfragment mit Upstream- und Downstream-Homologiearmen des sucCD-Gens wurde amplifiziert, wobei pKD13 als Matrize verwendet wurde. Die Parameter der PCR-Amplifikation waren wie folgt aufgeführt: 94 °C 2 min; 94 °C 20 s, 64 °C 20 s, 72 °C 1 min, 30 Zyklen; 72 °C Verlängerung 5 min. Das PCR-Produkt wurde aus dem Gel gewonnen, und der Stamm MG1655/pKD46 wurde durch Elektroporation mit dem Produkt transformiert, wobei die Herstellung und Transformation von kompetenten Zellen gemäß J. Sambrook et al. „Molecular Cloning: A Laboratory Manual“ durchgeführt wurden. Die Transformanten wurden unter Verwendung der Primer sucCD-3 und sucCD-4 PCR-überprüft, und die Größe des Fragments vom Wildtypstamm betrug 2267 bp, während die Größe der Zielbande aus dem Stamm mit dem deletierten sucCD-Gen 1558 bp betrug. Die sucCD-Deletionsmutante wurde gemäß der Größe der Bande ausgewählt und ZPEcA1 genannt.
Zum Ausschalten von sdhAB wurden zuerst die Primer sdhAB-1 und sdhAB-2 gemäß der durch das NCBI veröffentlichten Genomsequenz von E. coli MG1655 und der Sequenz des Hilfsvektors pKD13 entworfen, und ein Kan-Resistenz-Genfragment mit Upstream- und Downstream-Homologiearmen des sdhAB-Gens wurde amplifiziert, wobei pKD13 als Matrize verwendet wurde. Die Parameter der PCR-Amplifikation waren wie folgt aufgeführt: 94 °C 2 min; 94 °C 20 s, 64 °C 20 s, 72 °C 1 min, 30 Zyklen; 72 °C Verlängerung 5 min. Das PCR-Produkt wurde aus dem Gel gewonnen, und der Stamm MG1655/pKD46 wurde mit dem Produkt transformiert, wobei die Herstellung und Transformation von kompetenten Zellen gemäß J. Sambrook et al. „Molecular Cloning: A Laboratory Manual“ durchgeführt wurden. Die Transformanten wurden unter Verwendung der Primer sdhAB-3 und sdhAB-4 PCR-überprüft, und die Größe des Fragments vom Wildtypstamm betrug 2553 bp, während die Größe der Zielbande aus dem Stamm mit dem deletierten sucCD-Gen 1408 bp betrug. Die sdhAB-Deletionsmutante wurde gemäß der Größe der Bande ausgewählt und ZPEcA2 genannt.
Beispiel 2. Aufbau eines Plasmids für die Coexpression von Phosphoenolpyruvat-Carboxylase ppc und ALA-Synthetase
Die Primer ppc-F und ppc-R wurden gemäß der durch das NCBI veröffentlichten Genomsequenz von E. coli MG1655 entworfen, und ein ppc-Genfragment mit einem Promotor des Gens wurde PCR-amplifiziert, indem man das Genom von E. coli MG1655 als Matrize verwendete. Die Parameter der PCR-Amplifikation waren wie folgt aufgeführt: 94 °C 2 min; 94 °C 20 s, 60 °C 20 s, 72 °C 1,5 min, 30 Zyklen; 72 °C Verlängerung 5 min. Ein ppc-Genfragment wurde gewonnen und mit HindIII behandelt, und das Plasmid pZGA24, das das ALA-Synthetase-Gen enthielt (der Aufbau von pZGA24 ist zu finden in: Guo, Xiaofei et al., Synthesis of 5-aminolevulinic acid by using 5-aminolevulinic acid dehydratase deleted recombinant E. coli, Journal of Tianjin University of Science and Technology, 2012, 27(4): 1-6), wurde ebenfalls mit HindIII behandelt. Der Vektor und das Fragment wurden gewonnen und unter Verwendung von T4-Ligase ligiert. Kompetente DH5a-Zellen wurden mit dem ligierten Produkt transformiert und auf LB-Platten, die Amp enthielten, ausgestrichen. Positive Klone wurden selektiert, und Plasmide wurden extrahiert und durch Verdau mit Restriktionsenzym überprüft. Nach der Sequenzierung wurde das korrekte rekombinante Plasmid pZPA6 genannt.
Beispiel 3. Aufbau eines Plasmids für die Coexpression von Pyruvat-Carboxylase pyc und ALA-Synthetase
Die Primer pyc-1 und pyc-2 wurden gemäß der in BioBrick offenbarten Sequenz des Promotors BBa_J23105 und der durch das NCBI veröffentlichten Genomsequenz von Rhizobia CFN42 entworfen, und ein pyc-Genfragment mit der Sequenz des konstitutiven Promotors wurde PCR-amplifiziert, indem man das Genom von Rhizobia CFN42 als Matrize verwendete. Die Parameter der PCR-Amplifikation waren wie folgt aufgeführt: 94 °C 2 min; 94 °C 20 s, 60 °C 20 s, 72 °C 2 min, 30 Zyklen; 72 °C Verlängerung 5 min. Die Zielfragmente wurden gewonnen und dann mit Phosphatase behandelt. Der Vektor pWSK29 wurde mit dem Restriktionsenzym PvuII behandelt und dann mit Phosphatase behandelt. Das erhaltene Vektorfragment wurde unter Verwendung von T4-Ligase ligiert. Kompetente DH5a-Zellen wurden mit dem ligierten Produkt transformiert und auf LB-Platten, die Amp enthielten, ausgestrichen. Positive Klone wurden selektiert, und Plasmide wurden extrahiert und durch Verdau mit Restriktionsenzym überprüft. Nach der Sequenzierung wurde das korrekte rekombinante Plasmid pSLS33 genannt.
Die Primer pyc-F und pyc-R, deren spezifische Sequenz im Primersequenzprotokoll zu finden ist, wurden gemäß der Sequenz von pSLS33 so bezeichnet, wie es oben angegeben ist, und das pyc-Genfragment mit dem konstitutiven Promotor wurde amplifiziert, wobei pSLS33 als Matrize verwendet wurde. Die Parameter der PCR-Amplifikation waren wie folgt aufgeführt: 94 °C 2 min; 94 °C 20 s, 60 °C 20 s, 72 °C 2 min, 30 Zyklen; 72 °C Verlängerung 5 min. Die Primer pA-1 und pA-2 wurden gemäß der Sequenz des pZGA24-Vektors bezeichnet, und der pTrc-hemA-Vektor mit dem ALA-Synthetase-Gen wurde durch inverse PCR amplifiziert, wobei pZGA24 als Matrize verwendet wurde. Die Parameter der PCR-Amplifikation waren wie folgt aufgeführt: 94 °C 2 min; 94 °C 20 s, 60 °C 20 s, 72 °C 3 min, 30 Zyklen; 72 °C Verlängerung 5 min. Die pyc-Genfragmente wurden gewonnen und dann mit Endonuclease SmaI behandelt und mit dem Vektor pZGA24 ligiert, dann wurde durch inverse PCR amplifiziert und gereinigt, wobei man T4-Ligase verwendete. Kompetente DH5a-Zellen wurden mit dem ligierten Produkt transformiert und auf LB-Platten, die Amp enthielten, ausgestrichen. Positive Klone wurden selektiert, und Plasmide wurden extrahiert und durch Verdau mit Restriktionsenzym überprüft. Nach der Sequenzierung wurde das korrekte rekombinante Plasmid pZPA7 genannt.
Anmerkung: Kursiv und fett gedruckte Buchstaben weisen auf die Homologiearme hin, und unterstrichene Buchstaben weisen auf die Spaltungsstellen hin.
Beispiel 4. Aufbau von rekombinanten Stämmen und Vergleich von ALA
Der Wildtyp E. coli MG1655 und die sucCD-Deletionsmutante und die sdhAB-Deletionsmutante ZPEcA2 wurden durch die wie oben aufgebauten rekombinanten Plasmide pZGA24, pZPA6 bzw. pZPA7 transformiert und dann auf LB-Platten mit Amp-Resistenz ausgestrichen. Nachdem sie über Nacht kultiviert worden waren, wurden positive Klone selektiert, und Plasmide wurden extrahiert und überprüft. Die rekombinanten Stämme MG1655/pZGA24, ZPEcA1/pZGA24, ZPEcA2/pZGA24, MG1655/pZPA6, ZPEcA1/pZPA6, ZPEcA2/pZPA6, MG1655/ pZPA7, ZPEcA1/pZPA7 bzw. ZPEcA2/pZPA7 wurden erhalten.
Eine einzelne Kolonie der obigen rekombinanten Stämme wurde in 5 ml LB-Flüssigmedium, das 100 µg/ml Ampicillin enthielt, eingeimpft und 12 h lang mit 220 U/min bei 37 °C kultiviert. Die Impfflüssigkeit wurde in einen 250-ml-Kolben, der 50 ml Fermentationsmedium mit einer Anfangs-OD von 0,05 enthielt, übergeführt und 2,5 h lang mit 220 U/min bei 37 °C kultiviert. Dann wurde eine endgültige Konzentration von 25 µM IPTG hinzugefügt. Nach Induzieren und 19 h Kultivieren wurde die Fermentationsflüssigkeit aufgefangen, und die Konzentration von ALA wurde bestimmt. Das Fermentationsmedium war M9-Medium, das mit einer kleineren Menge Hefeextrakt ergänzt war, wobei die Hauptkomponenten folgende waren: Na₂HPO₄•12H₂O 12,8 g/l, KH₂PO₄ 3,0 g/l, NaCl 0,5 g/l, NH₄Cl 1,0 g/l, MgSO₄ 2 mM, CaCl₂ 0,1 mM, Glucose 10 g/l, Hefeextrakt 2 g/l, Glycin 4 g/l, wobei die Konzentration des Ampicillins 100 µg/ml betrug. Die Bestimmung von ALA und das Analyseverfahren für Glucose sind im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben.
Die Ausbeute von ALA für jeden rekombinanten Stamm ist in Tabelle 2 gezeigt, wobei die Ausbeute von ALA für den Kontrollstamm MG1655/pZGA24 nur 1,06 g/l betrug, die Ausbeute von ALA für die sucCD- oder sdhAB-deletierten Stämme ZPEcA1/pZGA24 und ZPEcA2/pZGA24 1,33 g/l bzw. 1,45 g/l betrug, was im Vergleich zum Ausgangsstamm einer Erhöhung von 25% bzw. 37% entsprach, was vermuten lässt, dass die Deletion eines Teils oder der gesamten Aktivität von Succinyl-Coenzym-A-Synthetase oder Succinat-Dehydrogenase in E. coli die Ausbeute von ALA erhöhen kann. Im Stamm MG1655/pZPA6, der ppc exprimiert, und im Stamm MG1655/pZPA7, der pyc exprimiert, betrug die Ausbeute von ALA 2,52 g/l bzw. 2 g/l, was dem 2,38-fachen bzw. dem 1,89-fachen des Ausgangsstamms entsprach, was vermuten lässt, dass die Ausbeute von ALA signifikant verbessert werden kann, indem man die Aktivität von relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat fördern, verstärkt. Während in sucCD- oder sdhAB-deletierten und pyc- oder ppc-überexprimierten Stämmen ZPEcA1/pZPA6, ZPEcA2/pZPA6, ZPEcA1/pZPA7 bzw. ZPEcA2/pZPA7 die Ausbeute von ALA 2,43 g/l, 3,08 g/l, 2,12 g/l bzw. 2,66 g/l betrug, was alles höher war als bei dem Kontrollstamm, was vermuten lässt, dass die Deletion von sucCD oder sdhAB und die Überexpression von pyc oder ppc bestimmte synergistische Wirkungen hat, die die Biosynthese von ALA fördern können. Von diesen Stämmen wiesen der sdhAB-deletierte und der ppc-überexprimierte ZPEcA2/pZPA6 die höchste Ausbeute von ALA auf, die 2,91-mal so groß war wie die des Kontrollstamms MG1655/pZGA24, und die höchste Glucoseumsetzungsrate von 0,47 (Stoffmengenverhältnis) auf, was dem 2,57-fachen des Ausgangsstamms entsprach. Wenn die Stämme der vorliegenden Erfindung in Fermentern verwendet wurden, betrug die Ausbeute von ALA 7 g/l oder mehr, was ein besserer Wert ist. Die obigen experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Ausbeute von ALA durch die Expression von endogener ALA-Synthetase in E. coli in Kombination mit der Deletion eines Teils oder der gesamten Aktivität von Succinyl-Coenzym-A-Synthetase oder Succinat-Dehydrogenase und der Verstärkung der Aktivität von relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat fördern, signifikant verbessert werden kann.

Am 19. September 2012 wurden die obigen rekombinanten Stämme MG1655/pZPA6 und ZPEcA2/pZPA6 beim China General Microbiological Culture Collection Center (Nr 1 West Beichen Road, Chaoyang District, Peking) mit der Akzessionsnummer CGMCC 6588 bzw. CGMCC 6589 hinterlegt. Tabelle 2. Fermentationsdaten von Stämmen in Kolben

Stamm	ALA(g/l)	ALA/OD₆₀₀	Glucoseumsetzungsrate (Stoffmengenverhältnis)
MG1655/pZGA24	1,06	0,30	0,18
ZPEcA1/pZGA24	1,33	0,35	0,23
ZPEcA2/pZGA24	1,45	0,41	0,24
MG1655/pZPA6	2,52	0,56	0,39
ZPEcA1/pZPA6	2,43	0,65	0,37
ZPEcA2/pZPA6	3,08	0,76	0,47
MG1655/pZPA7	2,00	0,47	0,35
ZPEcA1/pZPA7	2,12	0,40	0,36
ZPEcA2/pZPA7	2,66	0,48	0,41

Beispiel 5. Wiederholte Bestätigung im Stamm BW25113
Aufbau des rekombinanten Stamms: E. coli BW25113 (BW25113 als Kontrollstamm wurde vom CGSC (The Coli Genetic Stock Center, Yale University, USA) erhalten), die sucC-deletierte Mutante JW0717 (JW0717-Stamm mit deletierter β-Untereinheit (sucC) der Succinyl-Coenzym-A-Synthetase) und die sdhA-deletierte Mutante JW0713 (JW0717 und JW0713 wurden von der Kelio Collection, National BioResource Project E. coli, Microbial Genetics Laboratory, National Institute of Genetics 1111 Yata, Mishima, Shizuoka, 411-8540 Japan, erhalten) wurden durch die obigen Plasmide pZGA24, pZPA6 bzw. pZPA7 transformiert und auf LB-Platten mit Amp-Resistenz ausgestrichen. Nachdem sie über Nacht kultiviert worden waren, wurden positive Klone herausgesucht, und Plasmide wurden extrahiert und überprüft. Die rekombinanten Stämme BW25113/pZGA24, JW0717/pZGA24, JW0713/pZGA24, BW25113/pZPA6, JW0717/pZPA6, JW0713/pZPA6, BW25113/pZPA7, JW0717/pZPA7 bzw. JW0713/pZPA7 wurden erhalten.

Die Verfahren der Kolbenfermentierung und des Nachweises von ALA und Glucose für jeden rekombinanten Stamm waren dieselben, wie sie oben erwähnt sind, und ihre Ergebnisse sind in Tabelle 3 zu finden. Wie aus der Tabelle zu ersehen ist, weist jeder rekombinante Stamm im Wesentlichen dieselbe Ausbeute und Veränderung von ALA auf wie der entsprechende rekombinante MG1655-Stamm. Der sdhA-deletierte und der ppc-exprimierende JW0713/pZPA7-Stamm wiesen die höchste Ausbeute auf, wobei die Ausbeute von ALA 3,21 g/l betrug und die Glucoseumsetzungsrate 0,56 betrug (Stoffmengenverhältnis), was vermuten lässt, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch auf andere Stämme von E. coli anwendbar ist. Tabelle 3. Fermentationsdaten von Stämmen in Kolben

Stamm	ALA (g/l)	ALA/OD₆₀₀	Glucoseumsetzungsrate (Stoffmengenverhältnis)
BW25113/pZGA24	1,59	0,39	0,27
JW0717/pZGA24	1,21	0,32	0,23
JW0713/pZGA24	2,23	0,49	0,38
BW25113/pZPA6	3,11	0,55	0,43
JW0717/pZPA6	1,88	0,53	0,32
JW0713/pZPA6	3,08	0,74	0,52
BW25113/pZPA7	2,61	0,58	0,44
JW0717/pZPA7	2,25	0,50	0,39
JW0713/pZPA7	3,21	0,72	0,56

Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass bei Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, wenn man die rekombinanten Stämme in einem Medium, das Glucose als Hauptkohlenstoffquelle enthält, in Kolben fermentiert, die Ausbeute von ALA 3,08 g/l erreichen kann, und die Ausbeute von ALA in Myzeleinheiten kann 0,76 g/l/OD erreichen, das sind das 2,91-fache bzw. 2,59-fache des anfänglichen Stamms, und die Glucoseumsetzungsrate kann 0,47 (mol/mol) erreichen, das ist das 2,57-fache des anfänglichen Stamms. Bei Verwendung der rekombinanten Stämme, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung aufgebaut wurden, und der Verfahren zur Herstellung von ALA mit Hilfe der Stämme sind die Zugabe von Bernsteinsäure und die Verwendung von teurem Medium, wie LB, nicht notwendig, was gute Aussichten für die industrielle Anwendung und Wirtschaftlichkeit bedeutet.
Beispiel 6. Aufbau von rekombinanten Stämmen mit verstärkter Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und Malat-Enzym und Vergleich der ALA-Ausbeute
Gemäß ähnlichen Verfahren wie den in den Beispielen 1-5 beschriebenen wurden von den Erfindern rekombinante Stämme mit verstärkter Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (codierendes Gen: pck) und Malat-Enzym (codierendes Gen: maeB) aufgebaut, und die Ausbeute von ALA für diese Stämme wurde nachgewiesen.
Erstens wurde unter Verwendung der in Tabelle 4 gezeigten Primer, die das Gen pck der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase von E. coli MG1655 codieren, nach einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 2 kloniert und mit einem pZGA24-Vektor verbunden. Das erhaltene rekombinante Plasmid wurde pZPA12 genannt.
Zweitens wurden die Primer maeB-F und maeB-R, wie sie in Tabelle 4 gezeigt sind, gemäß der durch das NCBI veröffentlichten Genomsequenz von E. coli MG1655 entworfen. Das codierende Gen maeB der Malat-Dehydrogenase wurde durch PCR-Amplifikation erhalten, wobei das Genom von E. coli MG1655 als Matrize verwendet wurde. Zielfragmente wurden mit T4-Polynucleotid-Kinase phosphoryliert und mit pZGA24-Vektorfragmenten, die durch inverse Amplifikation erhalten wurden, ligiert. Nach Transformation, Verdau mit Restriktionsenzym und Sequenzierung wurde das korrekte Plasmid als pZPA14 bezeichnet.

Anmerkung: unterstrichene Buchstaben zeigen Spaltungsstellen an.
Nach ähnlichen Verfahren wie den in Beispiel 4 beschriebenen wurde Wildtyp-E.-coli MG1655 mit den oben aufgebauten rekombinanten Plasmiden pZPA12 bzw. pZPA14 transformiert, wobei man die rekombinanten Stämme MG1655/pZPA12 und MG1655/pZPA14 erhielt. Die Ausbeute von ALA für jeden rekombinanten Stamm wurde durch ein ähnliches Verfahren wie in Beispiel 4 bestimmt, und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6. Fermentationsdaten in Kolben

Stamm ALA (g/l) OD₆₀₀ Glucoseumsetzungsrate (Stoffmengenverhältnis)

MG1655/pZGA24 1,06 0,30 0,18

MG1655/pZPA12 0,57 4,20 0,10

MG1655/pZPA14 0,88 3,90 0,16
Wie aus der obigen Tabelle zu ersehen ist, wurde die Ausbeute von ALA bei den gentechnisch veränderten Stämmen MG1655/pZPA12 und MG1655/pZPA14 im Vergleich zu dem Kontrollstamm MG1655/pZGA24 um 46% bzw. 17% reduziert. Die Verstärkung der Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase führt nicht zu einer Verbesserung der ALA-Ausbeute.
Beispiel 7. Einfluss des Ausschaltens des pck- oder maeB-Gens auf die Ausbeute von ALA
Auf der Grundlage der Ergebnisse von Beispiel 9 untersuchten die Erfinder weiterhin den Einfluss des Ausschaltens des pck- oder maeB-Gens auf die Synthese von ALA.
Der Coexpressionsvektor pZPA6 von ALAS und PPC wurde in den ein einzelnes deletiertes Gen aufweisenden Stamm JW3366 (pck-Gen-deletierter Stamm) bzw. JW2447 (maeB-Gen-deletierter Stamm), die von der Kelio Collection (National BioResource Project E. coli, Microbial Genetics Laboratory, National Institute of Genetics 1111 Yata, Mishima, Shizuoka, 411-8540 Japan) erhalten wurden, eingeführt. Nach Validierung wurden die korrekt veränderten Stämme JW3366/pZPA6 und JW2447/pZPA6 erhalten. Der in Beispiel 5 erhaltene Stamm BW25113/pZPA6 wurde als Kontrolle verwendet, und die obigen rekombinanten Stämme wurden in Fermentationsmedien, bei denen anfangs 15 g/l Glucose und 4 g/l Glycin hinzugefügt wurden, fermentiert, um die Fähigkeit der Stämme zur Produktion von ALA zu überprüfen. Nach 12 h Kultur wurden während des Fermentationsvorgangs 5 g/l Glucose und 2 g/l Glycin ergänzt. Die Ergebnisse der Fermentierung sind in Tabelle 7 zu finden. Für JW3366/pZPA6 betrug die Ausbeute von ALA nach 25 h Kultur 4,84 g/l (im Vergleich zum Kontrollstamm BW25113/pZPA6 um 29% erhöht), und die Glucoseumsetzungsrate betrug 0,51 mol/mol (im Vergleich zum Kontrollstamm BW25113/pZPA6 um 20,8% erhöht), während für JW2447/pZPA6 die Ausbeute von ALA leicht reduziert war und die Umsetzungsrate um 7,8% gestiegen war.
Die Ergebnisse beweisen, dass die Deletion des pck- oder maeB-Gens die Akkumulation von ALA erleichtert. Insbesondere erleichtert die Abschaltung des pck-Gens die Akkumulation von ALA und die Verbesserung der Glucoseumsetzungsrate. Tabelle 7. Einfluss der Deletion des pck- oder maeB-Gens auf die Akkumulation von ALA

Stamm ALA (g/l) OD ₆₀₀ Glucoseumsetzungsrate (Stoffmengenverhältnis)

BW25113/pZPA6 3,75 8,37 - 0,42

JW3366/pZPA6 4,84 8,71 0,50

JW2447/pZPA6 3,60 7,9 0,45
Beispiel 8. Aufbau eines Expressionsvektors für Corynebacterium glutamicum und Überprüfung der Fermentierung
Die Primer hemA-F (Primersequenz: GGCGAATTCAAGGAGATATAGATATGAATTA-CGAAGCCTATTTCCGCCGT; SEQ ID Nr. 21) und hemA-R (Primersequenz: TATACCCCGGGTCAGGCCGCCTTGGCGAGAC; SEQ ID Nr. 22) wurden gemäß der codierenden Gensequenz der ALA-Synthetase aus Rhodopseudomonas palustris ATCC 17001, veröffentlicht vom NCBI (GenBank: JQ048720.1), entworfen. Das Ziel-Gen hemA wurde durch PCR-Amplifikation erhalten, wobei man den Vektor pZGA24 als Matrize verwendete (der Aufbau von pZGA24 ist in Guo, Xiaofei et al., Journal of Tianjin University of Science and Technology, 2012, 27(4): 1-6, zu finden). Die Parameter der PCR-Amplifikation waren wie folgt aufgeführt: 94 °C 10 min; 94 °C 20 s, 65 °C 30 s, 72 °C 40 s, 30 Zyklen; 72 °C Verlängerung 5 min. Die Zielfragmente wurden mit EcoRI und SmaI behandelt, und dann wurden die erhaltenen Fragmente mit dem Plasmid pEC-XK99E, das mit denselben Enzymen behandelt worden war, unter der Einwirkung von DNA-Ligase ligiert. Kompetente DH5a-Zellen wurden mit den ligierten Produkten transformiert, auf Platten mit Kanamycin-Resistenz ausgestrichen und über Nacht kultiviert. Positive Klone wurden selektiert, und die Kolonien wurden durch PCR überprüft. Nach der Überprüfung wurden die korrekten Transformanten sequenziert, und der korrekte rekombinante Vektor wurde als pZWA1 bezeichnet (4).
Zweitens wurden die Primer Cg-ppc-F (ATACCCCGGGAAGGAGATAT-AGATATGACTGATTTTTTACGCGATGAC; SEQ ID Nr. 23) und Cg-ppc-R (GCTCTAGACTAGCCGGAGTTGCGCAGCGCAGT: SEQ ID Nr. 24) gemäß der Sequenz des codierenden Gens ppc für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, veröffentlicht vom NCBI (GenBank: BA000036.3), entworfen. Das Ziel-Gen wurde durch PCR-Amplifikation erhalten, wobei man das Genom von ATCC 13032 als Matrize verwendete. Die Parameter der PCR-Amplifikation waren wie folgt aufgeführt: 94 °C 10 min; 94 °C 20 s, 65 °C 30 s, 72 °C 2 min, 30 Zyklen; 72 °C Verlängerung 5 min. Die Zielfragmente wurden mit SmaI und XbaI behandelt, und dann wurden die erhaltenen Fragmente mit dem Vektor pZWA1, der mit denselben Enzymen behandelt worden war, unter der Einwirkung von DNA-Ligase ligiert. Kompetente DH5a-Zellen wurden mit den ligierten Produkten transformiert, auf Platten mit Kanamycin-Resistenz ausgestrichen und über Nacht kultiviert. Positive Klone wurden selektiert, und die Kolonien wurden durch PCR überprüft. Nach der Überprüfung wurden die korrekten Transformanten sequenziert, und der korrekte rekombinante Vektor wurde als pZWA2 bezeichnet (4).
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde mit den obigen rekombinanten Vektoren pZWA1 und pZWA2 sowie dem neutralen Vergleichsvektor pEC-XK99E transformiert, wobei man die rekombinanten Stämme ATCC13032/pEC-XK99E, ATCC13032/pZWA1 und ATCC13032/pZWA2 erhielt.
Eine einzelne Kolonie der obigen rekombinanten Stämme wurde in 10 ml LB-Flüssigmedium, das 25 µg/ml Kanamycin und 24 g/l Glucose enthielt, eingeimpft und 12 h lang mit 200 U/min bei 30 °C kultiviert. Die Impfflüssigkeit wurde in einen 500-ml-Kolben, der 50 ml Fermentationsmedium mit einer Anfangs-OD von 0,3 enthielt, übergeführt und 3 h lang mit 200 U/min bei 30 °C kultiviert. Dann wurde eine endgültige Konzentration von 100 µM IPTG hinzugefügt. Nach Induzieren und 32 h Kultivieren wurde die Fermentationsflüssigkeit aufgefangen, und die Konzentration von ALA wurde bestimmt. Die Zusammensetzung des Fermentationsmediums im Kolben war: Glu 50 g/l, (NH₄)₂SO₄ 10 g/l, MnSO₄ 1 g/l, K₂HPO₄ 1,5 g/l, MgSO₄ 0,6 g/l, Maissirup 1 g/l, Glycin 4 g/l, MOPS 31,395 g/l, pH auf 7,0 eingestellt, und die Endkonzentration des Kanamycins betrug 25 µg/ml. Die Bestimmung von ALA und das Analyseverfahren für Glucose sind im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben.
Die Ergebnisse der Kolbenfermentation sind in Tabelle 8 gezeigt. Die Ausbeute von ALA bei dem Stamm ATCC13032/pZWA1, der nur exogene ALA-Synthase exprimierte, betrug 1,31 g/l, und die Glucoseumsetzungsrate (Stoffmengenverhältnis) betrug 0,052, während die Ausbeute von ALA und die Glucoseumsetzungsrate im Stamm ATCC13032/pZWA2 1,95 g/l bzw. 0,077 betrugen, die beide im Vergleich zu dem Stamm ATCC13032/pZWA1 um 48% erhöht waren, wodurch offensichtliche technische Wirkungen bewiesen werden. Daher ist das von der vorliegenden Erfindung angegebene Verfahren zum Modifizieren von ALA erzeugenden Stämmen auch für andere Mikroorganismen geeignet, die in der Fermentierungsindustrie häufig verwendet werden, wie Corynebacterium glutamicum. Tabelle 8. Fermentierungsdaten von Corynebacterium-glutamicum-Stämmen in Kolben

Stamm ALA (g/l) OD₆₀₀ Glucoseumsetzungsrate (Stoffmengenverhältnis)

ATCC13032/pEC-XK99E 0,02 18,05 0,0008

ATCC13032/pZWA1 1,31 20,35 0,052

ATCC13032/pZWA2 1,95 23,18 0,077
Diskussion
Auf der Grundlage des Synthesewegs von 5-Aminolävulinsäure modifizierten die Erfinder Zucker-Stoffwechselwege von Wirtsstämmen durch rationales Design, um ALA produzierende rekombinante Stämme zu erhalten. Die Ergebnisse beweisen, dass die Glucoseumsetzungsrate und die Ausbeute von ALA signifikant verbessert werden können, indem man die Aktivität von relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat fördern, verstärkt. Insbesondere können gemäß der vorliegenden Erfindung die Ausbeute von ALA und die Glucoseumsetzungsrate signifikant verbessert werden, indem Phosphoenolpyruvat-Carboxylase oder Pyruvat-Carboxylase exprimiert werden, um die Anaplerose von Oxalacetat zu verbessern.
Die Erfinder fanden weiterhin heraus, dass ähnliche technische Wirkungen erzeugt werden können, indem man die Aktivität von relevanten Enzymen im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A, d.h. Succinyl-Coenzym-A-Synthetase und Succinat-Dehydrogenase, dämpft. Gemäß dem allgemeinen Konsens in der Biologie kann ein aus mehreren Untereinheiten bestehendes Enzym seine vollständige biologische Funktion nur dann ausüben, wenn alle Untereinheiten zusammenarbeiten, und daher wird jeder Unterschied in der Sequenz, Struktur oder dem Expressionsniveau irgendeiner Untereinheit die Gesamtaktivität des Enzyms beeinflussen. Succinyl-Coenzym-A-Synthetase und Succinat-Dehydrogenase sind aus mehreren Untereinheiten bestehende Enzyme, wobei Succinyl-Coenzym-A-Synthetase zwei Untereinheiten umfasst, die durch sucC bzw. sucD codiert werden, und die Succinat-Dehydrogenase vier Untereinheiten umfasst, die durch sdhA, sdhB, sdhC bzw. sdhD codiert werden. In den Beispielen 4 und 5 bestätigten die Erfinder, dass die Deletion der Gene sucC und sucD, sucC, sdhA und sdhB bzw. sdhA die entsprechenden Enzyme inaktiviert, was wiederum die Synthese von ALA erleichtert. Gemäß dem allgemeinen Konsens in der Biologie ist zu erwarten, dass eine andere genetische Modifikation, die die Aktivitäten der zwei Enzyme dämpft, oder andere Verfahren, wie die exogene Zugabe von Inhibitoren der Succinyl-Coenzym-A-Synthetase oder Succinat-Dehydrogenase, um die Aktivitäten der beiden Enzyme zu hemmen oder zu reduzieren, die Biosynthese von ALA erleichtert.
Die Glucoseumsetzungsrate und die Ausbeute von ALA können weiterhin dadurch verbessert werden, dass man die obigen beiden Strategien miteinander kombiniert. Im Vergleich zu dem Kontrollstamm, der nur ALA-Synthetase exprimiert, wurden die Ausbeute von ALA und die Glucoseumsetzungsrate des modifizierten Stammes auf das 1,91-fache bzw. 1,57-fache erhöht. Wenn der Stamm der vorliegenden Erfindung in einem Fermenter verwendet wird, kann die Ausbeute von ALA 7 g/l oder mehr erreichen, was ein besserer Wert ist. Außerdem kann das Modifikationsverfahren der vorliegenden Erfindung eine bessere Universalität besitzen und ist auch für andere Mikroorganismen geeignet, die in der Fermentierungsindustrie häufig verwendet werden, wie Corynebacterium glutamicum.
Daher können die Ausbeute von ALA und die Glucoseumsetzungsrate durch die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Stämme und angegebenen Verfahren signifikant verbessert werden, und die Zugabe von Bernsteinsäure und die Verwendung von teurem Medium, wie LB-Medium, während der Synthese von ALA sind nicht notwendig, wodurch die Produktionskosten signifikant reduziert werden und gute Aussichten für eine gewerbliche Anwendung bestehen.
Zunächst erwarteten die Erfinder, dass die Verstärkung der Aktivität der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase auch die Synthese von Oxalacetat verbessern und die Menge der für die Synthese von ALA erforderlichen Vorläufer erhöhen würde, wodurch die Ausbeute von ALA steigen würde. Die Experimente zeigen jedoch, dass die Verstärkung der Aktivität der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase nicht die erwartete technische Wirkung ergibt. Ähnlich haben die Erfinder auch herausgefunden, dass die Verstärkung der Aktivität des Malat-Enzyms die Ausbeute von ALA nicht verbessern kann. Auf der Grundlage weiterer Forschungen fanden die Erfinder unerwarteterweise heraus, dass eine Dämpfung der Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und des Malat-Enzyms die Ausbeute von ALA signifikant erhöht. Insbesondere die Deletion von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kann die Ausbeute von ALA und die Glucoseumsetzungsrate signifikant erhöhen, und die Deletion des Malat-Enzyms erleichtert ebenfalls die Verbesserung der Glucoseumsetzungsrate.
Auf alle Literaturangaben in der vorliegenden Anmeldung wird hiermit so ausdrücklich Bezug genommen, als ob auf jede einzeln ausdrücklich Bezug genommen worden wäre. Außerdem sollte man sich darüber im Klarten sein, dass der Fachmann nach der Lektüre der obigen Lehre viele Variationen und Modifikationen vornehmen kann und dass diese Äquivalente ebenfalls in den Schutzumfang fallen, wie er durch die beigefügten Ansprüche definiert wird.
Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO ST.25. Dieses kann sowohl in DEPATISnet als auch im DPMAregister aufgerufen werden.

Claims

Verfahren zum Aufbau eines 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stammes, wobei das Verfahren umfasst: Verstärken der Aktivität von relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm fördern, oder Einführen von exogenen relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat fördern.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren weiterhin das Dämpfen der Aktivität von relevanten Enzymen im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem relevanten Enzym, das die Synthese von Oxalacetat fördert, um Phosphoenolpyruvat-Carboxylase oder Pyruvat-Carboxylase und/oder bei dem relevanten Enzym im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A um Succinyl-Coenzym-A-Synthetase oder Succinat-Dehydrogenase handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren weiterhin das Verstärken des Synthesewegs von 5-Aminolävulinsäure in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm oder das Einführen eines exogenen Synthesewegs von 5-Aminolävulinsäure umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 4, wobei das Verfahren weiterhin das Dämpfen der Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms umfasst.
Verfahren zum Aufbau eines 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stammes, wobei das Verfahren umfasst: Dämpfen der Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm; und Verstärken des Synthesewegs von 5-Aminolävulinsäure in dem 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Stamm oder Einführen eines exogenen Synthesewegs von 5-Aminolävulinsäure.
5-Aminolävulinsäure erzeugender Stamm, wobei in dem Stamm die Aktivität von relevanten Enzymen, die die Synthese von Oxalacetat fördern, verstärkt ist oder exogene relevante Enzyme, die die Synthese von Oxalacetat fördern, eingeführt sind.
Stamm gemäß Anspruch 7, wobei in dem Stamm die Aktivität von relevanten Enzymen in einem nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A gedämpft ist.
Stamm gemäß Anspruch 7 oder 8, wobei es sich bei dem relevanten Enzym, das die Synthese von Oxalacetat fördert, um Phosphoenolpyruvat-Carboxylase oder Pyruvat-Carboxylase und/oder bei dem relevanten Enzym im nachgelagerten Stoffwechselweg von Succinyl-Coenzym A um Succinyl-Coenzym-A-Synthetase oder Succinat-Dehydrogenase handelt.
Stamm gemäß Anspruch 9, wobei der Syntheseweg von 5-Aminolävulinsäure in dem Stamm verstärkt ist oder ein exogener Syntheseweg von 5-Aminolävulinsäure-Synthetase in den Stamm eingeführt ist.
Stamm gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei der Stamm aus Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Rhodobacter sphaeroides, Rhodopseudomonas palustris usw. ausgewählt ist.
Stamm gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei die Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms in dem Stamm gedämpft ist.
5-Aminolävulinsäure erzeugender Stamm, wobei die Aktivität von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase und/oder des Malat-Enzyms in dem Stamm gedämpft ist und der Syntheseweg von 5-Aminolävulinsäure in dem Stamm verstärkt ist oder ein exogener Syntheseweg von 5-Aminolävulinsäure eingeführt ist.
Stamm von Escherichia coli zur Produktion von 5-Aminolävulinsäure, wobei der Stamm aus dem Stamm, der beim China General Microbiological Culture Collection Center unter der Akzessionsnummer CGMCC 6588 hinterlegt ist, oder dem Stamm, der beim China General Microbiological Culture Collection Center unter der Akzessionsnummer CGMCC 6589 hinterlegt ist, ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung von 5-Aminolävulinsäure, wobei das Verfahren umfasst: 1) Kultivieren des Stammes gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14, was 5-Aminolävulinsäure ergibt; und 2) Gewinnen von 5-Aminolävulinsäure aus dem Fermentationssystem von 1).
Verwendung des Stammes gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14 zur Herstellung von 5-Aminolävulinsäure und/oder zur Herstellung nachgelagerter Produkte durch Verwendung von 5-Aminolävulinsäure als Vorläufer.