DE69534801T2 - Neues lysin decarboxylasegen und verfahren zur herstellung von l-lysin - Google Patents
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Description
- Technisches Gebiet
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Lysindecarboxylasegen von Escherichia coli, das für die Zersetzung von L-Lysin zuständig ist, einen Mikroorganismus der Gattung Escherichia mit beschränkter Expression des Gens und/oder eines anderen Lysindecarboxylasegens, das als cadA-Gen bekannt ist und ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Verwendung dieses Mikroorganismus. In jüngerer Zeit hat sich die Nachfrage nach L-Lysin als Futterzusatz lebhaft erhöht.
- Technischer Hintergrund
- Lysindecarboxylase, welches die Reaktion zur Bildung von Cadaverin durch Decarboxylierung von L-Lysin katalysiert, ist als L-Lysin-abbauendes Enzym von Escherichia coli bekannt. Über die Nukleotidsequenz dieses als cadA bezeichneten Gens und die durch das Gen kodierte Aminosäuresequenz wurde bereits berichtet (Meng, S. und Bennett, G. N., J. Bacteriol., 174, 2659 (1992)). Es gibt zwei Berichte über Lysindecarboxylase, für die ein anderes Gen als cadA von Escherichia coli kodiert, welche beschreiben, dass schwache Aktivität in einem Mutantenstamm von Escherichia coli festgestellt wurde (Goldemberg, S. H., J. Bacteriol., 141, 1428 (1980); Wertheimer, S. J. und Leifer, Z., Biochem. Biophys. Res. Commun., 114, 882 (1983)). Von S. H. Goldemberg wurde jedoch über diese Aktivität berichtet, dass die Aktivität des Enzyms nach einer 4-minütigen Wärmebehandlung bei 60°C um etwa 30% abnahm, während von S. J. Wertheimer berichtet wurde, dass keine solche Erscheinung beobachtet wurde. Das Vorliegen der zweiten Lysindecarboxylase ist daher ungewiss.
- Andererseits wird L-Lysin mit Hilfe von bekannten Verfahren unter Verwendung von Escherichia coli hergestellt, die ein Verfahren einschließen, bei dem ein gegenüber einem Lysin-Ana logon resistenter Mutantenstamm oder ein rekombinanter Stamm, der einen Vektor mit einer eingefügten Desoxyribonukleinsäure einschließt, welche die genetische Information für die L-Lysin-Biosynthese trägt, kultiviert wird (Japanische offen gelegte Patentanmeldung Nr. 56-18596). Es gibt jedoch keinerlei Bericht über die Produktion von L-Lysin unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Escherichia mit einer eingeschränkten Expression des Lysindecarboxylasegens.
- B. Lereverend et al., Proc. Int. Symp. Genet. Ind. Microorganisms, 4 Meet., 1982, S. 113 offenbaren eine Escherichia coli-Mutante mit Lysin-Überproduktion, die eine cadA-Mutation trägt, welche die Aktivität der Lysindecarboxylase beeinflusst und somit den Lysin-Katabolismus vermindert.
- K. Igarashi et. al., J. Bacteriol., Band 166, Nr. 1, 1986, S. 128-124 beschreiben das Vorhandensein von zwei Arten der Lysindecarboxylaseaktivität in E. coli. Eine ist die normale induzierbare Lysindecarboxylase und eine weitere ist Ornithindecarboxylase, die durch das speC-Gen kodiert wird.
- Offenbarung der Erfindung
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Lysindecarboxylasegen von Escherichia coli zu erhalten, einen L-Lysin produzierenden Mikroorganismus der Gattung Escherichia zu erzeugen, der eingeschränkter Expression des Gens und/oder des cadA-Gens aufweist und ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Kultivieren des Mikroorganismus der Gattung Escherichia bereitzustellen.
- Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden durch die beigefügten Patentansprüche gelöst.
- Als die Erfinder einen Stamm von Escherichia coli erzeugten, in welchem das cadA-Gen als bekanntes Lysindecarboxylasegen zerstört war, wurde festgestellt, dass Cadaverin als Abbaupro dukt von L-Lysin durch Lysindecarboxylase in diesem Mikrobenstamm immer noch produziert wurde. Die Erfinder haben daher angenommen, dass in Escherichia coli ein neues Lysindecarboxylasegen vorhanden sein würde und dass dieses die fermentative Herstellung von L-Lysin unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Escherichia stark beeinflussen würde. Als Ergebnis von Versuchen, das Gen zu klonieren, haben die Erfinder erfolgreich ein neues Lysindecarboxylasegen erhalten, das sich von dem cadA-Gen unterscheidet. Es wurde außerdem gefunden, dass die Aktivität zum Abbau von L-Lysin merklich vermindert oder verschwunden war und dass die Produktivität für L-Lysin wesentlich verbessert wurde, indem die Expression dieses Gens und die Expression des cadA-Gens in einem L-Lysin bildenden Mikroorganismus von Escherichia coli beschränkt wurde. Somit wurde die Erfindung fertig gestellt.
- Die Erfindung stellt ein neues Gen aus Escherichia coli, welches für Lysindecarboxylase kodiert, bereit. Dieses Gen wurde als "ldc"-Gen bezeichnet.
- Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Mikroorganismus, welcher der Gattung Escherichia angehört, bereit, der Produktivität für L-Lysin hat und in den Zellen verminderte oder beseitigte Lysindecarboxylaseaktivität aufweist.
- Gemäß einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin bereitgestellt, welches als Stufen das Züchten des vorstehend beschriebenen Mikroorganismus der Gattung Escherichia in einem flüssigen Medium, um L-Lysin zu produzieren und in der Kulturflüssigkeit anzureichern, und Gewinnen dieses umfasst.
- Der vorstehend beschriebene Mikroorganismus der Gattung Escherichia umfasst einen Mikroorganismus, in welchem die Lysindecarboxylaseaktivität in den Zellen verringert oder beseitigt ist, indem die Expression des ldc-Gens und/oder des cadA-Gens eingeschränkt ist.
- Die vorliegende Erfindung wird nachstehend ausführlich beschrieben.
- <1> Herstellung eines DNA-Fragments, welches das neue Lysindecarboxylasegen enthält
- Ein DNA-Fragment, welches das neue Lysindecarboxylasegen (ldc) gemäß der Erfindung enthält, kann wie folgt aus einem zugänglichen Stamm von Escherichia coli, beispielsweise dem Stamm K-12 oder einem davon abgeleiteten Stamm, erhalten werden.
- Zuerst wird das cadA-Gen, welches das Gen der bekannten Lysindecarboxylase ist, unter Verwendung einer Methode der Polymerasekettenreaktion (nachstehend als "PCR-Methode" bezeichnet) aus der chromosomalen DNA des Stammes W3110 erhalten, der von Escherichia coli K-12 abgeleitet ist. Die Nukleotidsequenz des cadA-Gens und die durch dieses kodierte Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NO:5 und 6 gezeigt. DNA-Fragmente mit Sequenzen ähnlich dem cadA-Gen werden aus einer chromosomalen DNA-Bibliothek von Escherichia coli W3110 gemäß einer Methode unter Verwendung eines Plasmidvektors oder eines Phagenvektors kloniert, um zu bestätigen, ob das neue Lysindecarboxylasegen in den DNA-Fragmenten enthalten ist. Die Bestätigung der Tatsache, dass das betreffende Gen enthalten ist, kann mit Hilfe einer Southern-Hybridisierungsmethode erhalten werden, wobei eine durch die PCR-Methode hergestellte Sonde verwendet wird.
- Die Nukleotidsequenz des in dem so erhaltenen DNA-Fragment enthaltenen Gens wird wie folgt bestimmt. Zuerst wird das DNA-Fragment mit einem Plasmidvektor ligiert, der in Zellen von Escherichia coli autonom replizierbar ist, um eine rekombinante DNA herzustellen, welche in kompetente Zellen von Escherichia coli eingeschleust wird. Der erhaltene Transformant wird in einem flüssigen Medium kultiviert und die rekombinante DNA wird aus den vermehrten Zellen gewonnen. Eine ganze Nukleotidsequenz des in der gewonnenen rekombinanten DNA enthaltenen DNA-Fragments wird mit Hilfe der Dideoxy-Methode bestimmt (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)). Die Struktur der DNA wird analysiert, um vorhandene Positionen des Promotors, Operators, SD-Sequenz, Startkodon, Terminationskodon, offenen Leseraster und so weiter zu bestimmen.
- Das neue Lysindecarboxylasegen gemäß der Erfindung hat eine Sequenz von dem 1005-1007. ATG bis 3141-3143. GGA der gesamten Nukleotidsequenz des DNA-Fragments, das in SEQ ID NO:3 in der Sequenzliste gezeigt ist. Dieses Gen kodiert für Lysindecarboxylase mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:4 in der Sequenzliste gezeigt ist. Es wurde gefunden, dass die Homologie zwischen der neuen Lysindecarboxylase und der durch das cadA-Gen kodierten Lysindecarboxylase 69,4% ist.
- Das erfindungsgemäße Gen kann ein solches sein, das für Lysindecarboxylase mit der Aminosäuresequenz kodiert, die in SEQ ID NO:4 in Sequenzliste gezeigt ist, deren Nukleotidsequenz nicht auf die oben beschriebene Nukleotidsequenz beschränkt ist. Die durch das erfindungsgemäße Gen kodierte Lysindecarboxylase kann eine Substitution, Deletion oder Insertion von drei oder weniger Aminosäureresten in der vorstehend beschriebenen Aminosäuresequenz haben, ohne dass eine wesentliche Beeinträchtigung der Lysindecarboxylaseaktivität auftritt. Gene, welche für Lysindecarboxylase kodieren, die eine solche Deletion, Insertion oder Substitution hat, können aus Varianten, spontanen Mutantenstämmen oder künstlichen Mutantenstämmen von Escherichia coli oder von anderen Mikroorganismen der Gattung Escherichia erhalten werden, die nicht Escherichia coli sind. Die Mutantengene, welche für Lysindecarboxylase kodieren, die Deletionen, Insertionen oder Substitutionen hat, können auch dadurch erhalten werden, dass eine in vitro-Mutationsbehandlung oder eine ortsgerichtete Mutagenesebehandlung für das Gen, welches für Lysindecarboxylase mit der in SEQ ID NO:4 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert, durchgeführt wird. Diese Mutationsbehandlungen können mit Hilfe von Methoden durchgeführt werden, die dem Fachmann des beschriebenen Gebiets gut bekannt sind.
- Das Gen, welches für Lysindecarboxylase mit einer Substitution, Deletion oder Insertion von drei oder weniger Aminosäureresten kodiert, umfasst solche, die sich von dem "ldc-Gen" ableiten und die als im Wesentlichen das Gleiche wie das ldc-Gen betrachtet werden können. Es ist nicht beabsichtigt, die Bedeutung dieser Gene mit unterschiedlichen Ursprüngen auszudehnen.
- Es ist für den Fachmann leicht ersichtlich, dass beispielsweise das cadA-Gen, welches für das Protein kodiert, das sich in nicht weniger als 200 Aminosäureresten von dem unterscheidet, das die in SEQ ID NO:4 gezeigte Aminosäuresequenz hat, verschieden von dem erfindungsgemäßen Gen ist und dass die Gene, die für Proteine mit gleichwertiger Lysindecarboxylaseaktivität kodieren, von der vorliegenden Erfindung umfasst werden, selbst wenn sie im Hinblick auf zwei oder drei Aminosäureresten verschieden von dem sind, das die Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID NO:4 gezeigt ist.
- <2> Erzeugen eines Mikroorganismus der Gattung Escherichia mit eingeschränkter Expression des Lysindecarboxylasegens
- Der Mikroorganismus der Gattung Escherichia gemäß der Erfindung ist ein Mikroorganismus, welcher der Gattung Escherichia angehört, in welchem die Lysindecarboxylaseaktivität in den Zellen verringert oder beseitigt ist. Zu den Mikroorganismen der Gattung Escherichia gehört Escherichia coli. Die Lysindecarboxylaseaktivität in den Zellen wird beispielsweise dadurch verringert oder beseitigt, dass die Expression eines oder bei der des neuen Lysindecarboxylasegens (ldc) und des bekannten cadA-Gens, das vorher beschrieben wurde, beschränkt wird. Alternativ kann die Lysindecarboxylaseaktivität in den Zellen auch dadurch verringert oder beseitigt werden, dass die spezifischen Aktivitäten der durch diese Gene kodierten Lysindecarboxylaseenzyme vermindert oder beseitigt werden, indem die Struktur der Enzyme modifiziert wird.
- Zu den Mitteln zum Beschränken der Expression des ldc-Gens und des bekannten cadA-Gens gehört beispielsweise eine Methode zum Beschränken der Expression der Gene auf der Transkriptions-Stufe, indem die Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide in den Promotorsequenzen dieser Gene verursacht wird und die Promotoraktivitäten vermindert werden (M. Rosenberg und D. Court, Ann. Rev. Genetics 13 (1979) S. 319, und P. Youderian, S. Bouvier und M. Susskind, Cell 30 (1982) S. 843-853). Alternativ kann die Expression dieser Gene in der Translations-Stufe beschränkt werden, indem man die Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide in den Bereich zwischen einer SD-Sequenz und einem Startkodon bewirkt (J. J. Dunn, E. Buzash-Pollert und F. W. Studier, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 75 (1978) S. 2743). Um außerdem die spezifische Aktivität des Lysindecarboxylaseenzyms zu verringern oder zu beseitigen existiert eine Methode, in der der kodierende Bereich des Lysindecarboxylasegens modifiziert oder zerstört wird, indem die Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide in der Nukleotidsequenz in dem kodierenden Bereich modifiziert oder zerstört wird.
- Das Gen, in dem Nukleotid-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition oder -Inversion verursacht wird, kann ein ldc-Gen oder cadA-Gen sein, das Substitution, Deletion oder Insertion eines oder mehrerer Aminosäurereste besitzt, welche die we sentliche Aktivität der kodierten Lysindecarboxylase nicht beeinträchtigt, zusätzlich zu dem ldc-Gen oder dem cadA-Gen.
- Das Verfahren zum Verursachen der Nukleotid-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition oder -Inversion in dem Gen umfasst speziell eine ortsgerichtete Mutagenesemethode (Kramer, W. und Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)), und eine Behandlung mit Hilfe eines chemischen Mittels, wie Natriumhyposulfit und Hydroxylamin (Shortle, D. und Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 270 (1978)).
- Die Methode der ortsgerichteten Mutagenese ist eine Methode, bei der ein synthetisches Oligonukleotid verwendet wird, die eine Technik darstellt, welche die Einführung einer beliebigen Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion in ein beliebiges und limitiertes Nukleotidpaar ermöglicht. Zur Anwendung dieser Methode wird zuerst ein Einzelstrang durch Denaturieren eines Plasmids hergestellt, das das klonierte betreffende Gen mit einer bestimmten Nukleotidsequenz der DNA hat. Dann wird ein synthetisches Oligonukleotid synthetisiert, das zu dem zu mutierenden Bereich komplementär ist. Bei diesem Verfahren lässt man jedoch das synthetische Oligonukleotid nicht eine vollständig komplementäre Sequenz haben, sondern dieses wird so ausgebildet, dass es eine optionale Nukleotid-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition oder -Inversion aufweist. Danach wird die einsträngige DNA mit dem synthetischen Oligonukleotid, welches die optionale Nukleotid-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition oder -Inversion hat, verbunden. Ein vollständiges doppelsträngiges Plasmid wird unter Verwendung von T4 Ligase und dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I synthetisiert und in kompetente Zellen von Escherichia coli eingeschleust. Einige der so erhaltenen Transformanten haben ein Plasmid, welches ein Gen enthält, in welchem die optionale Nukleotid-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition oder -Inversion fixiert ist. Als ähnliche Methode, die zur Einführung einer Mutation in ein Gen befähigt ist, um dieses zu modifizieren oder zu zerstören, kann eine rekombinante PCR-Methode erwähnt werden (PCR Technology, Stockton press (1989)).
- Die Methode unter Verwendung des chemischen Mittels ist eine Methode, bei der eine Mutation, die Nukleotid-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition oder -Inversion einschließt, regellos in ein DNA-Fragment eingeführt wird, indem das DNA-Fragment, welches das betreffende Gen enthält, direkt mit Natriumhyposulfit, Hydroxylamin oder dergleichen behandelt wird.
- Die Expression des ldc-Gens und/oder des cadA-Gens in Zellen kann eingeschränkt werden, indem ein normales Gen auf dem Chromosom eines Mikroorganismus der Gattung Escherichia durch das modifizierte oder zerstörte Gen ersetzt wird, welches durch die oben beschriebene Einführung einer Mutation erhalten wird. Die Methode zum Ersatz des Gens umschließt Methoden, welche die homologe Rekombination ausnutzen (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. und Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)). Die homologe Rekombination beruht auf einer Fähigkeit, welche Mikroorganismen der Gattung Escherichia im Allgemeinen besitzen. Wenn ein Plasmid oder dergleichen, das homolog mit einer Sequenz auf dem Chromosom ist, in Zellen eingeschleust wird, tritt Rekombination mit einer gewissen Häufigkeit an einer Stelle der Sequenz, welche die Homologie aufweist, ein und das gesamte eingeschleuste Plasmid wird in das Chromosom eingebaut. Wenn danach weitere Rekombination an der Stelle der Sequenz, die Homologie aufweist, auf dem Chromosom auftritt, fällt das Plasmid wieder aus dem Chromosom heraus. Während dieses Vorgangs wird jedoch das Gen mit der eingeführten Mutation gelegentlich bevorzugt auf dem Chromosom fixiert, in Abhängigkeit von der Stelle, an der die Rekombina tion stattfindet, und das ursprüngliche normale Gen löst sich zusammen mit dem Plasmid von dem Chromosom. Die Selektion solcher Mikrobenstämme ermöglicht es, einen Mikrobenstamm zu erhalten, in welchem das normale Gen auf dem Chromosom durch das modifizierte oder zerstörte Gen ersetzt ist, welches durch Einführung einer Mutation erhalten wurde, die Nukleotid-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition oder -Inversion hat.
- Der Mikroorganismus der Gattung Escherichia, welcher dem Genaustausch unterworfen werden soll, ist ein Mikroorganismus mit L-Lysin-Produktivität. Der Mikroorganismus der Gattung Escherichia mit L-Lysin-Produktivität, beispielsweise ein Mikroorganismus von Escherichia coli kann erhalten werden, indem ein Stamm, der keine L-Lysin-Produktivität hat, einer Mutationsbehandlung unterworfen wird, um ihm Resistenz gegen ein Lysin-Analogon, wie S-(2-Aminoethyl)-L-cystein (nachstehend als "AEC" bezeichnet) zu verleihen. Methoden der Mutationsbehandlung schließen Methoden ein, bei denen die Zellen von Escherichia coli einer Behandlung mit einem chemischen Mittel, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin oder salpetriger Säure, oder einer Behandlung durch Bestrahlung mit Ultraviolettlicht, Strahlung oder dergleichen, unterworfen werden. Zu solchen Mikrobenstämmen gehört speziell Escherichia coli AJ13069 (FERM P-14690). Dieser Mikrobenstamm wurde erzeugt, indem der von Escherichia coli K-12 abstammende Stamm W3110 mit AEC-Resistenz ausgestattet wurde. Escherichia coli AJ13069 wurde bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology der Agency of Industrial Science and Technology (Post-Code:305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japan) unter der Hinterlegungsnummer FERM P-14690 am 6. Dezember 1994 hinterlegt und am 29. September 1995 in die internationale Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag übergeführt, wobei er die Hinterlegungsnummer FERM BP-5252 erhielt.
- Ein Mikrobenstamm von Escherichia coli mit L-Lysin-Produktivität kann auch dadurch erzeugt werden, dass man mit Hilfe der Genrekombinationstechnik DNA, welche die genetische Information für die Biosynthese von L-Lysin trägt, einführt und verstärkt. Das einzuführende Gen ist ein Gen, welches für Enzyme auf dem Biosyntheseweg von L-Lysin kodiert, wie Aspartokinase, Dihydrodipicolinat-Synthetase, Dihydrodipicolinat-Reduktase, Succinyldiaminopimelat-Transaminase, und Succinyldiaminopimelat-Deacylase. Im Fall eines Gens des Enzyms, welches der Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt, wie Aspartokinase und Dihydrodipicolinat-Synthetase, ist es wünschenswert ein Gen des Mutantentyps zu verwenden, welches für ein Enzym kodiert, welches gegen eine solche Hemmung desensibilisiert ist. Um das Gen einzuführen und zu verstärken ist eine Methode zugänglich, bei der das Gen mit einem Vektor ligiert wird, der sich in Zellen von Escherichia coli autonom replizieren lässt, um rekombinante DNA herzustellen, mit der Escherichia coli transformiert wird. Alternativ kann das Gen auch mit Hilfe einer Methode unter Verwendung von Transduktion, Transposon (Berg, D. E. und Berg, C. M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)), Mu-Phage (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 2-109985), oder homologer Rekombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)) in das Chromosom eines Wirts eingefügt werden.
- Andere Methoden zur Herstellung des Mikroorganismus der Gattung Escherichia mit einer zerstörten Funktion des Gens umfassen eine Methode zum Erzielen einer Genmutation, bei der Zellen des Mikroorganismus der Gattung Escherichia, die das Gen enthalten, einer Behandlung mit einem chemischen Mittel, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin oder salpetriger Säure oder einer Behandlung durch Bestrahlen mit Ultraviolettlicht, Strahlung oder dergleichen, unterworfen werden.
- In dem nachstehend beschriebenen Beispiel wurde ein Stamm von Escherichia coli mit einer zerstörten Funktion des Lysindecarboxylasegens erzeugt, indem ein Teil seiner kodierenden Region entfernt wurde, an dessen Stelle ein Arzneimittel-Resistenzgen eingefügt wurde, um ein Lysindecarboxylasegen zu erhalten, welches verwendet wurde, um ein Lysindecarboxylasegen auf dem Chromosom von Escherichia coli gemäß der Methode der homologen Rekombination, die vorstehend beschrieben wurde, zu ersetzen.
- Es ist möglich, die Expression des neuen Lysindecarboxylasegens gemäß der Erfindung oder des cadA-Gens zu beschränken oder die Expression beider Gene in einem Mikrobenstamm zu beschränken. Die Expression des Lysindecarboxylasegens kann gemäß der vorstehend beschriebenen Methode in dem Mikroorganismus der Gattung Escherichia mit L-Lysin-Produktivität beschränkt werden oder L-Lysin-Produktivität kann dem Mikroorganismus der Gattung Escherichia mit einer eingeschränkten Expression des Lysindecarboxylasegens verliehen werden.
- <3> Herstellung von L-Lysin unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Escherichia mit eingeschränkter Expression des Lysindecarboxylasegens
- Eine beträchtliche Menge an L-Lysin wird in einer Kulturflüssigkeit gebildet und angereichert, wenn ein Mikroorganismus der Gattung Escherichia mit einer eingeschränkten Expression des Lysindecarboxylasegens kultiviert wird, der wie vorstehend beschrieben ist, erhalten wurde. Die angereicherte Menge an L-Lysin wird erhöht, indem nur die Expression des bekannten cadA-Gens eingeschränkt wird. Für eine Erhöhung der angereicherten Menge an L-Lysin ist es jedoch wirksamer, die Expression des erfindungsgemäßen neuen Lysindecarboxylasegens zu beschränken. Das bevorzugteste Ergebnis für die Produktion von L-Lysin wird erhalten, wenn ein Mikrobenstamm verwendet wird, in welchem die Expression sowohl des cadA-Gens, als auch des neuen Gens der vorliegenden Erfindung eingeschränkt ist.
- Das für die Herstellung von L-Lysin zu verwendende Medium ist ein übliches Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und gegebenenfalls andere organische Spurennährstoffe enthält. Es ist möglich, als Kohlenstoffquelle Zucker, wie Glucose, Lactose, Galactose, Fructose und Stärkehydrolysat, Alkohole, wie Glycerin und Sorbit und organische Säuren, wie Fumarsäure, Citronensäure und Bernsteinsäure, zu verwenden. Als Stickstoffquelle können anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat, organische Stickstoffquellen, wie Sojabohnenhydrolysat, gasförmiges Ammoniak und wässeriges Ammoniak verwendet werden. Als anorganische Ionen werden Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen und so weiter in kleinen Mengen zugesetzt. Außerdem ist es wünschenswert, Vitamin B1, Hefeextrakt oder dergleichen in geeigneten Mengen als organische Spurennährstoffe zuzugeben.
- Die Kultivierung erfolgt vorzugsweise unter aeroben Bedingungen während etwa 16-72 Stunden. Die Kulturtemperatur wird auf 30°C bis 45°C eingestellt und der pH wird während der Kultur auf 5-7 eingestellt. Zum Einstellen des pH-Werts können anorganische oder organische, saure oder alkalische Substanzen oder gasförmiges Ammoniak oder dergleichen verwendet werden.
- Nach Beendigung der Kultur kann die Gewinnung des L-Lysins aus der Kulturflüssigkeit in geeigneter Weise durch Kombinieren einer üblichen Ionenaustauschmethode, einer Fällungsmethode und andere bekannter Methoden durchgeführt werden.
- Kurze Beschreibung der Zeichnungen
-
1 zeigt die Struktur des Plasmids pUC6F5HH5, welches das neue Lysindecarboxylasegen enthält. -
2 zeigt die Struktur eines temperaturempfindlichen Plasmids pTS6F5HH5, welches das neue Lysindecarboxylasegen enthält, und die Konstruktion des Plasmids pTS6F5HH5Cm, in welchem ein Teil des Gens durch ein Fragment ersetzt ist, das ein Chloramphenicol-Resistenzgen enthält. -
3 zeigt einen Vergleich der Aktivitäten zur Zersetzung von L-Lysin in einem Stamm WC196, der ein normales Lysindecarboxylasegen enthält, und der Stämme WC196C, WC196L, und WC196LC mit zerstörten Lysindecarboxylasegenen. - Beste Ausführungsform der Erfindung
- Die vorliegende Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf Beispiele ausführlicher erläutert.
- Beispiel 1
- (1) Klonieren des neuen Lysindecarboxylasegens
- Chromosomale DNA wurde nach einer üblichen Methode aus Zellen des Stammes W3110 von Escherichia coli K-12 extrahiert, die von dem National Institute of Genetics (Yata 1111, Mishimashi, Shizuoka-ken, Japan) erhalten wurden. Andererseits wurden zwei synthetische DNA-Primer, wie sie in SEQ ID NO:1 und 2 in der Sequenzliste gezeigt sind, mit Hilfe einer üblichen Methode auf Basis der Nukleotidsequenz des cadA-Gens (siehe SEQ ID NO:5) synthetisiert, die von Meng, S. und Bennett, G. N., J. Bacteriol., 174, 2659 (1992) beschrieben ist. Diese hatten Sequenzen, die homolog mit einem Bereich stromabwärts vom 5'-Terminal und einem Teil des 3'-Terminal des cadA-Gens waren. Die chromosomale DNA und die DNA-Primer wurden zur Durchführung der PCR-Methode nach der Methode von Erlich et al. (PCR Technology, Stockton press (1989)) verwendet. Dabei wurde ein DNA-Fragment von 2,1 kbp erhalten, welches fast alle Teile des cadA-Gens enthielt. Dieses Fragment wurde mit "Random Primer Labeling Kit" (hergestellt von Takara Shuzo) und [α-32P]dCTP (hergestellt von Amersham Japan) markiert, um eine Sonde für die Hybridisierung herzustellen.
- Dann wurde die Hybridisierung mit Hilfe einer üblichen Methode (Molecular Cloning (2. Auflage), Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)) unter Verwendung der hergestellten Sonde und von Escherichia coli/Gene Mapping Membrane (hergestellt von Takara Shuzo) durchgeführt. Eine Bibliothek von Kohara et al. (Lambdaphagen-Bibliothek der chromosomalen DNA von Escherichia coli: vergleiche Kohara, Y. et al. Cell, 50, 495-508 (1987)) war an Escherichia coli/Gene Mapping Membrane, adsorbiert worden. Klone von Lambdaphage mit Sequenzen ähnlich dem cadA-Gen wurden durch Schwächen der Bedingung zum Waschen der Sonde (2 × SSC, 55°C, 30 Minuten) selektiert, als die Hybridisierung durchgeführt war. Als Ergebnis konnten schwache Signale von drei Klonen von E2B8, 6F5H, und 10F9 zusätzlich zu starken Signalen von Klonen, welche die cadA-Genregion enthalten (21H11, 5G7) erhalten werden. Insertionssequenzen der drei Klone des Lambdaphagen E2B8, 6F5H, und 10F9 bleiben auf dem Chromosom von Escherichia coli, während sie einander überlappen. Lambdaphagen-DNA 6F5H aus der Bibliothek von Kohara et al. (Kohara, Y. et al. Cell, 50, 495-508 (1987)) wurde mit Hilfe einer üblichen Methode abgetrennt, mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut, um eine Southern-Hybridisierung unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Sonde durchzuführen, wie sie vorstehend beschrieben wurde. Dabei wurde gefunden, dass eine dem cadA-Gen ähnliche Sequenz in einem DNA-Fragment von etwa 5 kbp vorhanden war, das durch Verdauung mit HindIII erhalten wurde.
- Das durch Verdauung der Lambdaphagen-DNA 6F5H mit HindIII erhaltene Fragment von etwa 5 kbp wurde unter Verwendung von T4 DNA-Ligase mit einem HindIII-Verdauungsprodukt des Plasmids pUC19 (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert. Dieses Reaktionsgemisch wurde verwendet, um Escherichia coli JM109 (herge stellt von Takara Shuzo) zu transformieren, wobei Ampicillinresistente Stämme erhalten wurden, die auf einem Vollmedium (das 10 g Polypepton, 5 g Hefeextrakt und 5 g Natriumchlorid in 1 l Wasser enthielt), dem 50 mg/ml Ampicillin zugesetzt waren, wuchsen. Davon wurde ein Mikrobenstamm erhalten, der ein Plasmid mit der Insertion des Fragments von etwa 5 kbp enthielt, das durch Verdauen der Lambdaphagen-DNA 6F5H mit HindIII erhalten wurde. Ein Plasmid wurde aus den Zellen extrahiert und es wurde Plasmid pUC6F5HH5 erhalten.
1 zeigt die Struktur des Plasmids pUC6F5HH5. - Escherichia coli JM109/pUC6F5HH5, der dieses Plasmid enthielt, wurde als AJ13068 bezeichnet, unter der Hinterlegungsnummer FERM P-14689 am 6. Dezember 1994 bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt, am 29. September 1995 in eine internationale Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag übergeführt, und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-5251.
- (2) Bestimmung der Nukleotidsequenz des neuen Lysindecarboxylasegens
- Die Nukleotidsequenz einer Region zwischen den Schnittstellen der Enzyme ClaI und HindIII des erhaltenen pUC6F5HH5 wurde mit Hilfe einer Methode bestimmt, die in Molecular Cloning (2. Auflage), Cold Spring Harbor Laboratory press (1989) beschrieben ist. Dabei wurde gefunden, dass die in SEQ ID NO:3 in der Sequenzliste gezeigte Nukleotidsequenz kodiert wurde. Diese DNA-Sequenz enthält ein offenes Leseraster, welches für die Aminosäuresequenz kodiert, die in SEQ ID NO:4 in der Sequenzliste gezeigt ist.
- (3) Herstellung von Escherichia coli mit L-Lysin-Produktivität
- Escherichia coli W3110 wurde 4 Stunden bei 37°C in einem Vollmedium (das 10 g Polypepton, 5 g Hefeextrakt und 5 g Natrium chlorid in 1 l Wasser enthielt) kultiviert, wobei Mikrobenzellen erhalten wurden, die 30 Minuten lang bei 37°C in einer Lösung von N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin mit einer Konzentration von 200 μg/ml einer Mutationsbehandlung unterworfen wurden, gewaschen und dann auf ein Minimalmedium aufgetragen wurden (das 7 g Dinatriumhydrogenphosphat, 3 g Kaliumdihydrogenphosphat, 1 g Ammoniumchlorid, 0,5 g Natriumchlorid, 5 g Glucose, 0,25 g Magnesiumsulfat-heptahydrat, und 15 g Agar in 1 l Wasser enthielt), dem 5 g/l AEC zugesetzt waren. AEC-resistente Stämme wurden durch Abtrennung von Kolonien erhalten, die nach 48-stündigem Kultivieren bei 37°C erschienen waren. Als ein Stamm unter diesen hatte Stamm WC196 L-Lysin-Produktivität. Stamm WC196 wurde als AJ13069 bezeichnet, am 6. Dezember 1994 unter der Hinterlegungsnummer FERM P-14690 bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology der Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt, am 29. September 1995 in eine internationale Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag übergeführt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-5252.
- (4) Erzeugen eines Stammes WC196 mit zerstörter Funktion des neuen Lysindecarboxylasegens
- Das vorstehend beschriebene Fragment von etwa 5 kbp, das durch Verdauen der Lambdaphagen-DNA 6F5H mit HindIII erhalten wurde, wurde mit einem HindIII-Verdauungsprodukt eines temperaturempfindlichen Plasmids pMAN031 (Yasueda, H. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 211 (1991)) unter Verwendung von T4 DNA-Ligase ligiert. Dieses Reaktionsgemisch wurde zur Transformation von Escherichia coli JM109 verwendet, wonach eine Kultivierung während 24 Stunden bei 37°C auf einem Vollmedium, dem 50 mg/l Ampicillin zugesetzt waren, durchgeführt wurde, um Ampicillin-resistente Stämme zu züchten. Dabei wurde ein Mikrobenstamm erhalten, der ein Plasmid mit der Insertion des Fragments von etwa 5 kbp enthielt, das durch Verdauen der Lambdaphagen-DNA 6F5H mit HindIII erhalten wurde. Das Plasmid wurde aus den Zellen dieses Stammes extrahiert, wobei ein Plasmid pTS6F5HH5 erhalten wurde. Das Plasmid pTS6F5HH5 wurde mit EcoRV verdaut, um ein DNA-Fragment von etwa 1 kbp zu entfernen. Dann wurde T4 Ligase verwendet, um ein Fragment mit einem Chloramphenicol-Resistenzgen von etwa 1 kbp einzuschleusen, das durch Verdauen von pHSG399 (hergestellt von Takara Shuzo) mit AccI erhalten wurde. Somit wurde ein Plasmid pTS6F5HH5Cm konstruiert. Als Ergebnis des vorstehend beschriebenen Vorgangs wurde erfolgreich die Konstruktion des Plasmids durchgeführt, das ein DNA-Fragment mit zerstörter Funktion des neuen Lysindecarboxylasegens hatte.
2 zeigt die Struktur des Plasmids pTS6F5HH5 und das Plasmid pTS6F5HH5Cm. - Danach wurde ein Stamm erzeugt, in welchem das neue Lysindecarboxylasegen auf dem Chromosom des Stammes WC196 durch das DNA-Fragment mit zerstörter Funktion des neuen Lysindecarboxylasegens mit Hilfe einer allgemeinen homologen Rekombinationstechnik ersetzt wurde (Matsuyama, S. und Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)) wobei die Eigenschaft der Temperaturempfindlichkeit des Plasmids pTS6F5HH5Cm ausgenutzt wurde. Dabei wurde Stamm WC196 mit dem Plasmid pTS6F5HH5Cm transformiert, wobei zuerst ein Stamm erhalten wurde, der bei 30°C resistent gegen Ampicillin und resistent gegen Chloramphenicol war. Dieser Stamm wurde dann verwendet, um einen Stamm zu erhalten, der bei 42°C resistent gegen Ampicillin und resistent gegen Chloramphenicol war. Weiterhin wurde dieser Stamm verwendet, um einen Stamm zu erhalten, der bei 30°C empfindlich gegen Ampicillin und resistent gegen Chloramphenicol war. Somit wurde der oben beschriebene Stamm erzeugt, in welchem das neue Lysindecarboxylasegen auf dem Chromosom des Stammes WC196 durch das DNA-Fragment mit zerstörter Funktion des neuen Lysindecarboxylasegens ersetzt war. Dieser Stamm wurde als Stamm WC196L bezeichnet.
- (5) Erzeugen des Stammes WC196 und des Stammes WC196L mit fehlendem cadA-Gen
- Escherichia coli, in welchem cadA als das bekannte Lysindecarboxylasegen zerstört ist, ist bereits bekannt, einschließlich zum Beispiel des Stammes GNB10181, der von Escherichia coli K-12 abgeleitet ist (siehe Auger, E. A. et al., Mol. Microbiol., 3, 609 (1989); dieser Mikrobenstamm ist beispielsweise von dem E. coli Genetic Stock Center (Connecticut, USA) erhältlich). Es hat sich gezeigt, dass in diesem Mikrobenstamm die Region des cadA-Gens fehlt. Somit wurde die Eigenschaft der cadA-Gen-Defizienz des Stammes GNB10181 mit Hilfe einer allgemeinen Methode unter Verwendung des P1-Phagen (A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992)) in den Stamm WC196 transdutiert, wobei der Stamm WC196C erzeugt wurde. Die Defizienz des cadA-Gens des Stammes WC196 wurde durch Southern-Hybridisierung bestätigt. Außerdem wurde mit Hilfe einer ähnlichen Methode wie der vorstehend beschriebenen der Stamm WC196LC mit einer Defizienz des cadA-Gens aus Stamm WC196L erzeugt.
- Beispiel 2
- (1) Bestätigung der Aktivität zum Abbau von L-Lysin der Stämme WC196, WC196C, WC196L und WC196LC
- Die vier erzeugten, oben beschriebenen Stämme wurden 17 Stunden bei 37°C unter Verwendung eines Mediums für die L-Lysin-Produktion kultiviert (enthaltend 40 g Glucose, 16 g Ammoniumsulfat, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat, 2 g Hefeextrakt, 10 mg Mangansulfat-tetra-bis-pentahydrat und 10 mg Eisensulfatheptahydrat in 1 l Wasser, der pH war mit Kaliumhydroxid auf 7,0 eingestellt, wonach 30 g gesondert sterilisiertes Calciumcarbonat zugesetzt wurden). Die gewonnenen Mikrobenzellen wurden zweimal mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen, in einem Medium zum Prüfen des Abbaus von L-Lysin (enthaltend 17 g Dinatriumhydrogenphosphat-dodecahydrat, 3 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g Natriumchlorid und 10 g L-Lysin-hydrochlorid in 1 l Wasser) suspendiert und 31 Stunden bei 37°C kultiviert.
- Die
3 zeigt die Veränderung der in den Kulturflüssigkeiten verbliebenen Mengen von L-Lysin im Verlauf der Zeit. Die Menge an L-Lysin wurde unter Verwendung des Biotech Analyzers AS-210 (Produkt der Asahi Chemical Industry) quantitativ bestimmt. Im Stamm WC196 wurde ein bedeutender Abbau von L-Lysin beobachtet. Jedoch war die Abbauaktivität in WC196C mit der Defizienz des cadA-Gens als bekanntes Lysindecarboxylasegen etwas vermindert. In den Stämmen WC196L und WC196LC, in denen die Funktion des neuen Lysindecarboxylasegens zerstört war, wurde kein Abbau von L-Lysin beobachtet. Bei allen der Mikrobenstämme verminderte sich das in der Kulturflüssigkeit verbliebene L-Lysin während einer Kultivierungsdauer bis etwa 3 Stunden. Diese Erscheinung wurde jedoch durch den Einschluss von L-Lysin in Mikrobenzellen, nicht jedoch durch Abbau verursacht. - (2) Produktion von L-Lysin durch die Stämme WC196, WC196C, WC196L und WC196LC
- Die vier oben beschriebenen Stämme wurden 20 Stunden bei 37°C in dem vorstehend beschriebenen Medium für die Produktion von L-Lysin kultiviert. Die in den Kulturflüssigkeiten gebildeten und angereicherten Mengen an L-Lysin und Cadaverin wurden bestimmt. Die Menge des L-Lysins wurde unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Biotech Analyzers AS-210 quantitativ bestimmt. Die Menge an Cadaverin wurde mit Hilfe von Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie quantitativ bestimmt.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Anreicherung von L-Lysin war erhöht und die Anreicherung von Cadaverin als Zer setzungsprodukt von L-Lysin war vermindert in dem Stamm WC196C, dessen cadA-Gen zerstört war, im Vergleich mit Stamm WC196, und in dem Stamm WC196L, in dem die Funktion des neuen Lysindecarboxylasegens zerstört war, im Vergleich mit den Stämmen WC196 und WC196C. Die Anreicherung von L-Lysin war noch weiter erhöht und die Anreicherung von Cadaverin als Zersetzungsprodukt von L-Lysin wurde nicht festgestellt in dem Stamm WC196LC, in welchem die Funktion der beiden Lysindecarboxylasegene zerstört war. Tabelle 1
- Beispiel 3
- Escherichia coli WC196LC, dessen Aktivität zur Zersetzung von L-Lysin beseitigt war, wurde mit pUC6F5HH5, welches das neue Lysindecarboxylasegen enthielt, transformiert, wobei ein Ampicillin-resistenter Stamm erhalten wurde. Der Stamm WC196LC und der Stamm WC196LC/pUC6F5HH5 wurden 16 Stunden bei 37°C in einem Medium für die L-Lysin-Produktion kultiviert, dem 5 g/l L-Lysin zugesetzt waren, und die Menge des gebildeten Cadaverins wurde bestimmt.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Der Stamm WC196LC konnte L-Lysin nicht in Cadaverin umwandeln, während WC196LC/pUC6F5HH5 die Fähigkeit zur Umwandlung von L-Lysin in Cadaverin hatte. Tabelle 2
- Industrielle Anwendbarkeit
- Das erfindungsgemäße neue Lysindecarboxylasegen trägt zur Zersetzung von L-Lysin in Escherichia coli bei. L-Lysin kann preiswert und wirksam durch Kultivieren des Bakteriums der Gattung Escherichia mit L-Lysin-Produktivität hergestellt werden, das eingeschränkte Expression des oben beschriebenen Gens und/oder des cadA-Gens zeigt. SEQUENZLISTE
Claims (9)
- Gen, das für Lysindecarboxylase mit der in (A) oder (B) definierten Aminosäuresequenz kodiert: (A) Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:4 des Sequenzprotokolls, (B) Aminosäuresequenz mit Substitution, Deletion oder Insertion von 3 Aminosäureresten oder weniger in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:4 des Sequenzprotokolls und mit Lysindecarboxylaseaktivität.
- Gen nach Anspruch 1, worin das Gen eine Nukleotidsequenz von dem Nukleotid 1005 bis zu dem Nukleotid 3143 der SEQ ID NO:3 des Sequenzprotokolls aufweist.
- DNA-Fragment, das ein Gen nach Anspruch 1 oder 2 enthält.
- Verfahren zum Verringern oder Beseitigen der Aktivität der Lysindecarboxylase, die durch das Gen nach Anspruch 1 oder 2 kodiert wird, wobei das Gen nach Anspruch 1 oder 2 durch Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide in einer Nukleotidsequenz in dem Gen modifiziert ist.
- Mikroorganismus der Gattung Escherichia, worin das Gen nach Anspruch 1 oder 2, eine Promotorsequenz des Gens oder eine Region zwischen einer SD-Sequenz und einem Initiationskodon des Gens durch Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide in der Nukleotidsequenz des Gens, der Promotorsequenz oder der Region zwischen einer SD-Sequenz und einem Initiationskodon modifiziert ist, wobei die Aktivität einer durch das Gen kodierten Lysindecarboxylase in Zellen verringert oder beseitigt worden ist.
- Mikroorganismus nach Anspruch 5, worin der Mikroorganismus Escherichia coli ist.
- Mikroorganismus nach Anspruch 5 oder 6, worin das cadA-Gen, das für Lysindecarboxylase mit der in SEQ ID NO:6 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert, eine Promotorsequenz des cadA-Gens oder eine Region zwischen einer SD-Sequenz und einem Initiationskodon des cadA-Gens durch Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide in der Nukleotidsequenz des cadA-Gens, der Promotorsequenz des cadA-Gens oder der Region zwischen einer SD-Sequenz und einem Initiationskodon des cadA-Gens modifiziert ist, wobei die Aktivität einer durch das cadA-Gen kodierten Lysindecarboxylase zusätzlich verringert oder beseitigt worden ist.
- Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 5, 6 und 7, welcher zur Gattung Escherichia gehört und L-Lysinproduktivität hat.
- Verfahren zum Herstellen von L-Lysin, welches die Stufe umfasst, bei der ein Mikroorganismus nach Anspruch 8 in einem flüssigen Medium kultiviert wird.
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