SU1433981A1 - Способ получени ферментного препарата L-лизиндекарбоксилазы - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности. Цель изобретени  - увеличение ферментативной активности и стабильности. Дл  получени  ферментного препарата ли- зиндекарбоксилазы - аналитической композиции - провод т глубинное культивирование бактерий Escherichia coli MRE 600 в питательной среде, содержащей , мас.%: глюкоза 0,35-0,4; пептон 0,09-0,11; лизин кормовой кристаллический 0,78-0,82; натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,22-0,24; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,52- 0,54; натрий хлористый 0,09-0,11. Выращивание провод т в анаэробных услови х без насыщени  питательной среды воздухом и ее перемешивани  при рН 6,0- 6,2 и температуре 30-32 С до достижени  оптической плотности культураль- ной жидкости, 0,4-0,45 (540 нм, 0,5см). Отцентрифугированную биомассу ацето- нируют 4-6-кратным объемом ацетона. Аце- тонированные клетки смешивают с безводным однозамещеннымфосфатом натри ,дву- замещенным фосфатом натри ,растворимым крахмалом, глюкозой, стеаратом кальци  в соотношении, мас.%: 12:45,4:3,2: :30,4:8:1 соответственно, и таблети- руют при давлении, обеспечивающем рас- падаемость таблеток в воде при 40 - 50 С в течение 0,5-1,0 мин. 1 ил. 2 табл. (Л 4 О9 СО СО 00

Description

Изобретение относитс  к микробиологической промьшшенности, в частности к производству ферментов, и каса- етс  получени  ферментного препарата лизиндекарбоксилазы - аналитической композиции, используемого в качестве реагента дл  определени  концентрации L-лизина в растворах при работе автоматического L-аминокислотного анализатора.

.Цель изобретени  - увеличение ферментативной активности и стабильности .

На чертеже показана зависимость остаточной лизиндекарбоксилазной ак- тивности биомассы, высушенной разными способами, от продолжительности хранени , где крива  1 - биомасса, обработанна  ацетоном и эфиром (по известному способу); крива  2 - биомасса , обработанна  ацетоном без эфира (по предлагаемому способу).

Способ заключаетс  в том, что понижение в 2 раза концентрации пептона и глюкозы в питательной среде, отказ от насыщени  воздухом питательной среды и перемешивани  культураль- ной жидкости во врем  ферментации, сужение интервала температуры выращивани  биомассы до 30-32 взамен 30- 34 С и укорочение времени культивировани  бактерий до 3-3,5 вместо 4 - 5,5 ч позвол ет повысить лизиндекар- боксилазнуто активность препарата в 1,3 раза при применении 250-литровык ферментеров и в 3 раза при укрупненном производстве с применением 1500- литровых ферментеров. Кроме значительного повьшени  тшзиндекарбокси- лазной активности в последнем случае в препарате -отсутствует индуцируема  глутамино вой кислотой, которую содержит пептон, глутаматдекарбоксилазна  активность, по вл юща с  в аэробных услови х.

Улучшение условий техники безопасности при ацетонировании биомассы достигнуто путем применени  меньшего (в 4 раза) количества ацетона (легко возгорающейс  жидкости) взамен его 18-20-кратнбго объема, а также отказа от промывани  ацетонированной биомассы ацетоном и эфиром, обладающим сильным наркотическим действием, При этом лизиндекарбоксилазна  активность ацетонированных клеток повышаетс  в 1,3 раза, а стабильность при хранении - в 1,5 раза.

Компоненты препарата лизиндекарбо- ксипазы - аналитической композиции - ацетонированна  биомасса клеток продуцента лизиндекарбоксилазы, одно- и двузамещенные фосфаты натри ,растворимый крахмал, глюкоза и стеарат кальци  в соотношении, мас.%: 12:45, 4:3, 2:30, 4:8:1, позвол ют получить

при помощи таблеточного пресса таблетки , раствор ющиес  в 1 мл анализируемой жидкости при 40-50 С и пе- ремепшвании в течение 0,5-1,0 мин с образованием буферного раствора с

рН 5,5 и лизиндеркабоксилазной активностью не менее 4 ед/мл, т.е. обладающие свойствами, необходимыми при работе автоматического анализатора лизина при серийных анализах.

Пример. Музейную культуру пе- рассевают на 2%-ный м ср-пептонный агар (МПА) в чашки Петри и инкубируют в термостате при 30 С 24 ч. Оживленную культуру пересевают на кос ки МПА в 30 пробирках и инкубируют при 30°С 24 ч. Культуру, выросшую на кос ках, далее вьфащивают в среде объемом 3,750 л, содержащей, мас.%: глюкоза 0,4; пептон 0,1; кормовой

лизин кристаллический 0,8; натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,23; калий однозамещенный фосфорнокислый 0,53; натрий хлористый 0,1, рН среды 6,4. При подготовке среды раствор

глюкозы стерилизз от при 0,5 атм

30 мин, а смесь растворов остальных компонентов - при 1 атм 20 мин. Культуру инкубируют при 30 С 5 ч и ис- польззтот дл  приготовлени  инокул та в сателлите, содержащего 37,5 Л питательной среды того же состава. Инокул т выращивают при 32 С до оптической плотности 0,8 при 540 нм и толщине сло  0,5 см. Инокул т засевают в ферментер объемом 1500 л, содержащий 710л питательной среды с рН 6,3. Ферментацию провод т при 31°С без перемешивани  и подачи воздуха со свободным падением рН до 6,0 до образовани  оптической плотности среды 0,4 при 540 нм и толщине сло  0,5 см. Суспензию клеток хлаждают до и биомассу отцентрифугируют при 17000 об/мин. Получают 900 г сырой биомассы. Измер ют активность биомассы после ее дезинтеграции ультразвуком при следующих услови х,: рН 5,7j 37 Cj концентраци  субстрата 0,05 М, пиридоксальфосфата 0,05 мМ.

Лизиндекарбоксилазна  активность биомассы составл ет 10 ед/мг сухого ве- ,щества, удельна  активность 32 ед/мг белка, глутаматдекарбоксилазна  ак- тивность не обнаруживаетс .

Ацетонирование биомассы провод т порци ми по 70 г. К навеске биомассы добавл ют 10 мл физиологического раствора и в лед ной бане размешива- ют до получени  однородной суспензии в которую при перемешивании приливают 350 мл охлажденного до +4°С ацетона , перемешивают .10 мин, фильтруют на вакуум-фильтре и высушивают на воздухе.

Необходимые комоненты аналитической композиции в количестве 33 г аце- тонированных клеток, 124,8 г натри  фосфорнокислого однозамёщенного, 8,7 г фосфорнокислого двузамещенного 83,6 г растворимого крахмала, 22 г глюкозы, 2,75 г стеарата кальци  перемешивают до образовани  однородной массы и таблетируют на прессе ПЛТ-1 с пресс-инструментом ф5 мм. Примен етс  такое давление прессовани , при котором врем  распадаемости таблетки в 1 МП воды при 42 С и перемешивании не превышало 1,О мин.

Значение рН образовавшейс  суспензии соответствует 5,5 лизиндекарбо- ксилазна  активность - 13 ед/мл.

Пример приведен при одних значени х параметров, так как в границах допустимых колебаний результат - качество аналитической композиции - не мен етс .

Вли ние аэрации на лизиндекарбо- ксилазную активность биомассы и об- разование сопутствующей глутаматде- карбоксилазной активности показано в табл. 1.

При выращивании продуцента в 1500-литровых ферментерах (масштабирование около 8 раз) по предлагаемому способу Лизиндекарбоксилазна  активность сырой биомассы, а также после ее ацетонировани  в среднем в 3 раза выше, чем по известному способу Кроме того, в биомассе не содержитс  нежелательна  .примесь глутаматдекар боксилазы. Это объ сн етс  тем, что при ферментации в больших объемах , (1500 л) перемешивание и насыщение воздухом питательной среды приводит к по влению сопутствующей глутамат- декарбоксилазной активности и снижению лизиндекарбоксилазной активности .

SasHciiMocTb лизиндекарбоксилазной активности биомассы от количества ацетона показано в табл. 2.

Дл  ацетонировани  биомассы, суспендированной в минимальном количестве физиологического раствора в соотношении 7:1 соответственно, необходимо использовать 4-6-кратный объем ацетона.

Последующа  обработка ацетониро- ванной. биомассы эфиром ухудшает стабильность лизиндекарбоксилазной активности при хранении (см.чертеж).

Как видно из чертежа, при хранени в течение года остаточна  активность биомассы, обработанной ацетоном согласно изобретению, в 1,5 раза вьш1е, чем по известному способу. Поэтому дл  повьш1ени  стабильности лизиндекарбоксилазной akтивнocти следует отказатьс  от досушивани  ацетониро- ванной биомассы эфиром.

Использование предлагаемого способа получени  ферментного препарата лизиндекарбоксилазы - аналитической композиции - дает следующие преимущества:

. При выращивании продуцента лизин- декарбоксипазы в 1500-литровых ферментерах , т.е. при масштабировании процесса ферментации в 8 раз, можно получить в 3 раза более активную биомассу .

Сокращаетс  врем , энергозатраты и упрощаетс  подготовка питательной среды дл  ферментации. Так, стерилизаци  растворов лизина, пептона, одно- и двузамещенных фосфатов натри , хлористого натри  производитс  совместно , что особенно важно при больших объемах растворов. Дл  получени  посевного материала требуетс  засев культурой 30 пробирок (вместо 60). Питательна  среда не продуваетс  воздухом в течение 35 мин и не перемешиваетс , что позвол ет экономить врем  и энергию.

Питательна  среда содержит в 2 ра за меньше глюкозы (0,4 вместо 0,8%) и в 2 раза меньше пептона (0,1 вместо 0,2%), что позвол ет экономить пищевое сырье и удешевить процесс ферментации , а также исключить индуцирование глутаматдекарбоксилазной активности .

Отказ от насьпцени  воздухом пита- 1|ельной среды и перемегшвани  во вре ферментации при ее масштабирова- в 8 раз позвол ет избежать обра- з|овани  сопутствующей глутаматдекар- фксилазы.

Ацетонирование биомассы произво- Д|Итс  А-6-кратным (вместо 18-20) объемом ацетона,  вл ющегос  легко возгорающейс  жидкостью (ЛВЖ), без применени  эфира (ЛВЖ, сильный наркотик чго значительно сокращает расход материалов и улучшает услюви  техники безопасности работающих.

I За счет изменени  условий ацетони р звани  биомассы стабильность лизин- дакарбоксилазной активности при хрангнии возрастает в 1,5 раза, а активность - в 1,3 раза.

При таблетировании аналитической к мпозиции используютс  клетки, аце- т нированные 4-6 объемами ацетона, что позвол ет избежать значительной (до 40%) инактивации ферментативной а1стивности, котора  обычно происхо- Д1(1Т при таблетировании ферментов.

i Применение ферментного препарата - аналитической композиции - позвол ет автоматизировать процесс выполнени  анализов. Препарат предназначен в качестве реактивов дл  серийных ана- шгзов, вьшолн емых при помощи автоматического анализатора лизина, в П1| отивоположность препарату лизинде- к рбоксилазы, ползд енному по извест- способу и используемому дл  одиночных Анализов, вьтолн емых вручную Состав и соотношение ко1 Отонентов ана Л1| тической композиции позвол ет обес П€|чить необходимый рН (5,5) и лизин- д€|карбоксилазную активность (не ме- Н€|е 4 ед/мл) в анализируемых пробах культуральной жидкости. Это позвол ет исключить взвешивание на аналитических весах ферментного препарата ПИИ каждом единичном анализе, приготовление буферов, контроль в каждой анализируемой пробе значени  рН.

фосфорнокислый однозамещенный в количестве 0,52-0,54 мас,%, натрий хло- ристьй в количестве 0,09-0,11 мас.%,

пептон, лизин кормовой кристаллический в количестве 0,78-0,82 мас.%, дистиллированную воду при рН 6,0-6,2 с последующим отделением клеток центрифугированием и ацетонированием биомассы , отличающийс  тем, что, с целью увеличени  ферментативной активности и стабильности, про цесс культивировани  провод т в анаэробных услови х до достижени  оптической плотности культуральной жидкости 0,4-0,45, причем количества глюкозы и пептона устанавливают соответственно равными 0,35-0,40 и 0,09-0,11 мас.%, ацетонирование биомассы ведут 4-6-кратным объемом ацетона , полученные ацетонированные клетки смешивают с безводным одно- замеЩенным фосфатом натри , двуза- мещенным фосфатом натри , растворимым крахмалом, глюкозой, стеаратом кальци  в соотношении, мас.%: 12:45, 4:3, 2:30, 4:8:1 соответственно, и таблетирзтат при давлении, обеспечивающем распадаемость таблеток в воде при 40-50 С в течение 0,5-1,0 мин.

i

Таблица 1

„

45

Извест

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  ферментного пре- najpaTa L-лизиндекарбоксилазы путем гл|убинного культивировани  продуцента Escherichia .coll MRE 600 в пита- те|льной среде, содержащей ггпокбзу, натрий фосфорнокислый дЕ1узамещенный в Количестве 0,22-0,24 масД, калий

   (Насыщение питательной среды воздухом 10 в течение 35 мин и перемешивание 200 об/ /мин во врем  ферментации. Без насыщени  воздухом и перемешивани  f

   Таблица 2