BR112015007916B1

BR112015007916B1 - Método para produzir l-aminoácido

Info

Publication number: BR112015007916B1
Application number: BR112015007916-4A
Authority: BR
Inventors: Seiko Hirano; Kazuyuki Hayashi
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc
Priority date: 2013-05-13
Filing date: 2014-05-13
Publication date: 2023-04-04
Also published as: BR112015007916A2; JP5831669B2; JPWO2014185430A1; PH12015500792B1; EP2868745A1; EP2868745B1; KR101773755B1; MY185322A; US9506094B2; CN105008532B; US20150307907A1; CN105008532A; PE20150681A1; EP2868745A4; WO2014185430A1; PH12015500792A1; KR20150099809A

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR L-AMINOÁCIDO. Um método para produzir L-aminoácido é provido. Um L-aminoácido é produzido por cultivo de uma bactéria corineforme tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido, que é modificado de modo que a atividade de um transportador de fosfato é aumentada, em um meio, e coletar o L-aminoácido a partir do meio.

Description

Descrição Campo Técnico

[0001] A presente invenção refere-se a um método para produzir L- aminoácido usando uma bactéria corineforme. L-Aminoácidos são industrialmente utilizáveis como aditivos para rações animais, ingredientes de temperos, alimentos e bebidas, infusões de aminoácidos, e assim em diante. Fundamentos da Técnica L-Aminoácidos são industrialmente produzidos por, por exemplo, fermentação usando vários micro-organismos tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido. Exemplos de métodos para produzir um L- aminoácido por fermentação incluem, por exemplo, métodos de usar um micro-organismo tipo selvagem (cepa tipo selvagem), métodos de usar uma cepa auxotrófica derivada de uma cepa tipo selvagem, métodos de usar a cepa mutante de regulação metabólica derivada como uma cepa mutante resistente a qualquer um dos vários fármacos de uma cepa tipo selvagem, e métodos de usar uma cepa tendo características tanto como uma cepa auxotrófica como uma cepa mutante de regulação metabólica.

[0002] Além disso, em anos recentes, micro-organismos a partir dos quais uma capacidade de produzir L-aminoácido é melhorada por técnicas de DNA recombinante são usados para a produção de L-aminoácidos. Exemplos de métodos para melhorar uma capacidade de produzir L-aminoácido de um micro-organismo incluem, por exemplo, melhorar uma expressão de um gene codificando para uma enzima biossintética de L-aminoácido (documentos de patente 1 e 2), e melhorar o influxo e uma fonte de carbono dentro de um sistema de biossíntese de L-aminoácidos (documento de patente 3).

[0003] Escherichia coli tem pelo menos dois tipos de sistemas de absorção de fosfato inorgânico (documento não patente 1). Um é o sistema de transportador de fosfato inorgânico de baixa afinidade (Pit), e o outro é o sistema de transportador de fosfato inorgânico de alta afinidade (Pst). Os genes codificando para o sistema Pit, o gene pitA e o gene pitB são conhecidos. Os genes codificando para o sistema Pst, os genes pstSCAB são conhecidos. Os produtos dos genes pstSCAB formam um complexo para funcionar como o sistema Pst. No entanto, a relação entre as atividades destes transportadores de fosfato e produção de L-aminoácido não era conhecida.

Referência da Técnica Anterior Documentos de patente Documento de patente 1: Patente US 5.168.056 Documento de patente 2: Patente US 5.776.736 Documento de patente 3: Patente US 5.906.925 Documento não patente

[0004] Documento não patente 1: R.M. Harris et al., Journal of Bacteriology, Set. 2001, pp.5008-5014

Descrição da Invenção Objeto a ser alcançado pela invenção

[0005] Um objeto da presente invenção consiste em desenvolver uma nova técnica para melhorar uma capacidade de produzir L-aminoácido de uma bactéria corineforme e, assim, prover um método para produzir de modo eficaz um L-aminoácido.

Meios para alcançar o objeto

[0006] O inventor da presente invenção conduziu várias pesquisas a fim de alcançar o objeto acima mencionado. Com um resultado, o inventor verificou que uma capacidade de produzir L-aminoácido de uma bactéria corineforme poderia ser melhorada por modificação da bactéria corineforme de modo que a atividade de um transportador de fosfato é aumentada, e alcançou a presente invenção.

[0007] Isto é, a presente invenção pode ser corporificada, por exemplo, como a seguir. [1] Um método para produzir L-aminoácido compreendendo: cultivar uma bactéria corineforme tendo uma capacidade de produzir L- aminoácido em um meio; e coletar o L-aminoácido a partir do meio, em que a bactéria foi modificada de modo que a atividade de um transportador de fosfato é aumentada. [2] O método como mencionado acima, em que a atividade do transportador de fosfato é aumentada por aumento da expressão de um gene codificando para o transportador de fosfato. [3] O método como mencionado acima, em que o gene é o gene pitA. [4] O método como mencionado acima, em que o gene pitA é um DNA definido nos seguintes (a) ou (b): (a) um DNA compreendendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 5 ou 25, (b) um DNA hibridizável sob condições estringentes com uma sequência complementar a uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 5 ou 25 ou com uma sonda que pode ser preparada a partir de dita sequência complementar, e em que ditos DNA hibridizáveis codificam para uma proteína tendo a atividade de transportador de fosfato. [5] O método como mencionado acima, em que o gene pitA é um DNA codificando para uma proteína definida nos seguintes (A) ou (B): (A) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6 ou 26, (B) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6 ou 26, mas incluindo substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácidos, e em que dita proteína tem a atividade de transportador de fosfato. [6] O método como mencionado acima, em que a expressão do gene é aumentada por aumento do número de cópias do gene, e/ou por modificação de uma sequência de controle de expressão do gene. [7] O método como mencionado acima, em que a atividade do transportador de fosfato é aumentada ao tornar a bactéria um abrigo de um gene pitA mutante codificando para um transportador de fosfato tendo uma mutação em que o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo fenilalanina na posição 246 em SEQ ID NO: 6 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente de resíduo fenilalanina. [8] O método como mencionado acima, em que o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo fenilalanina na posição 246 em SEQ ID NO: 6 é substituído com um resíduo serina. [9] Um método para produzir L-aminoácido compreendendo: cultivar uma bactéria corineforme tendo uma capacidade de produzir L- aminoácido em um meio; e coletar o L-aminoácido a partir do meio, em que a bactéria abriga um gene mutante pitA codificando para um transportador de fosfato tendo uma mutação em que o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo fenilalanina na posição 246 em SEQ ID NO: 6 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente de resíduo fenilalanina. [10] O método como mencionado acima, em que o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo fenilalanina na posição 246 em SEQ ID NO: 6 é substituído com um resíduo serina. [11] O método como mencionado acima, em que a bactéria é uma bactéria Corynebacterium. [12] O método como mencionado acima, em que a bactéria é Corynebacterium glutamicum. [13] O método como mencionado acima, em que o L-aminoácido é ácido L- glutâmico. [14] O método como mencionado acima, em que o ácido L-glutâmico é L- glutamato monoamônio ou L-glutamato mossódio. [15] Uma codificação de DNA para um transportador de fosfato tendo uma mutação que o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo de fenilalanina na posição 246 na SEQ ID NO: 6 é substituído com um resíduo de serina. [16] Uma bactéria corineforme abrigando um gene pitA mutante codificando para um transportador de fosfato tendo uma mutação em que o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo fenilalanina na posição 246 em SEQ ID NO: 6 é substituído com um resíduo de serina.

Modos para realizar a invenção

[0008] A seguir, a presente invenção será explicada em detalhes.

[0009] O método da presente invenção é um método para produzir L-aminoácido compreendendo cultivar uma bactéria corineforme tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido em um meio, e coletar o L- aminoácido a partir do meio, em que a bactéria foi modificada de modo que a atividade de um transportador de fosfato é aumentada. A bactéria corineforme usada para este método é também referida como "a bactéria da presente invenção".

<1> Bactéria da presente invenção

[00010] A bactéria da presente invenção é uma bactéria corineforme tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido, que foi modificado de modo que a atividade de um transportador de fosfato é aumentada.

<1-1> Bactéria corineforme tendo capacidade de produzir L-aminoácido

[00011] Na presente invenção, uma "bactéria tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido" refere-se a uma bactéria tendo uma capacidade para produzir e acumular um L-aminoácido objetivo em um meio ou células de uma bactéria em tal grau que o L-aminoácido pode ser coletado, quando a bactéria é cultivada no meio. A bactéria tendo uma capacidade de produzir L- aminoácido pode ser uma bactéria que pode acumular um L-aminoácido objetivo em um meio em uma quantidade maior do que a obtenível com uma cepa não modificada. Exemplos da cepa não modificada incluem cepas de tipo selvagem e cepas parentais. A bactéria tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido pode ser uma bactéria que pode acumular um L-aminoácido objetivo em um meio em uma quantidade de preferivelmente 0,5 g/L ou mais, mais preferivelmente 1,0 g/L ou mais.

[00012] Exemplos do L-aminoácido incluem aminoácidos básicos como L-lisina, L-ornitina, L-arginina, L-histidina, e L-citrulina; aminoácidos alifáticos como L-isoleucina, L-alanina, L-valina, L-leucina, e glicina; aminoácidos que são ácidos hidróxi-monoaminocarboxílicos como L-treonina e L-serina; aminoácidos cíclicos como L-prolina; aminoácidos aromáticos como L-fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano; aminoácidos contendo enxofre como L-cisteína, L-cistina, e L-metionina; aminoácidos ácidos como ácido L-glutâmico e ácido L-aspártico; e aminoácidos tendo um grupo amida na cadeia lateral como L-glutamina e L-asparagina. A bactéria da presente invenção pode ter uma capacidade para produzir dois ou mais tipos aminoácidos.

[00013] Na presente invenção, um aminoácido é um L-aminoácido salvo indicado de outra forma. O L-aminoácido pode ser um composto livre, um sal do mesmo, ou uma mistura do mesmo. Isso quer dizer, na presente invenção, que o termo “L-aminoácido” pode significar um L-aminoácido na forma livre, um sal do mesmo, ou uma mistura do mesmo. Exemplos do sal incluem, por exemplo, sulfato, cloridrato, carbonato, sal de amônia, sal de sódio, e sal de potássio. L-lisina pode ser, por exemplo, L-lisina em uma forma livre, o sal de cloridrato de L-lisina, o sal de carbonato de L-lisina, ou uma mistura dos mesmos. Adicionalmente, ácido L-glutâmico pode ser, por exemplo, ácido L-glutâmico em uma forma livre, glutamato monossódico (MSG), glutamato monoamônico, ou uma mistura dos mesmos.

[00014] Exemplos da bactéria corineforme incluem bactérias pertencendo ao gênero das bactérias Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, ou similares.

[00015] Exemplos específicos das bactérias corineformes incluem as seguintes espécies. Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium Corynebacterium melassecola Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens) Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) Brevibacterium album Brevibacterium cerinum Microbacterium ammoniaphilum

[00016] Exemplos específicos das bactérias corineformes incluem as seguintes cepas. Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511 Corynebacterium callunae ATCC 15991 Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539) Corynebacterium herculis ATCC 13868 Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020 Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205) Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869 Brevibacterium roseum ATCC 13825 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872 Brevibacterium album ATCC 15111 Brevibacterium cerinum ATCC 15112 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354

[00017] As bactérias Corynebacterium incluem as bactérias que foram previamente classificadas no gênero Brevibacterium, mas são atualmente unidas no gênero Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)). Além disso, Corynebacterium stationis inclui tal bactéria que foi previamente classificada em Corynebacterium ammoniagenes, mas foi atualmente re- classificada em Corynebacterium stationis com base na análise da sequência de nucleotídeos de 16S rRNA etc. (Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879 (2010)).

[00018] Estas cepas são disponíveis a partir de, por exemplo, American Type Culture Collection (Endereço: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América). Isto é, números de registro são designados às cepas respectivas, e as cepas podem ser ordenadas usando estes números de registro (fazer referência a http://www.atcc.org/). Os números de registro das cepas são listados no catálogo do American Type Culture Collection.

[00019] A bactéria da presente invenção pode ser uma bactéria tendo inerentemente uma capacidade de produzir L-aminoácido, ou pode ser uma bactéria modificada de modo que ela tenha a capacidade de produzir L- aminoácido. A bactéria tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido pode ser obtida ao conferir a capacidade de produzir L-aminoácido a tal bactéria como mencionado acima, ou aumentando a capacidade de produzir L- aminoácido de tal bactéria como mencionado acima.

[00020] Para conferir ou melhorar uma capacidade de produzir L- aminoácido, métodos convencionalmente empregados na criação de cepas produzindo aminoácidos de bactérias corineformes, bactérias Escherichia, e assim em diante (ver "Amino Acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center (Ltd.), 1a. ed. publicado em 30 de maio de 1986, pp.77-100) podem ser usados. Exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, adquirir uma cepa mutante auxotrófica, adquirir uma cepa resistente a análogo de L-aminoácido, adquirir uma cepa mutante de regulação metabólica, e construir uma cepa recombinante em que a atividade de uma enzima biossintética de L- aminoácido é melhorada. Na criação de bactérias produzindo L-aminoácido, uma das propriedades acima-descritas como mutação de auxotrofia, resistência a análogo, e de regulação metabólica pode ser conferida sozinha, ou duas ou três ou mais de tais propriedades pode ser conferida em combinação. A atividade de uma das enzimas biossintéticas de L-aminoácidos pode ser melhorada sozinha, ou as atividades de duas ou três ou mais de tais enzimas pode ser melhorada em combinação. Além disso, conferir propriedade(s) como mutação de auxotrofia, resistência a análogo, e de regulação metabólica pode ser combinada com melhorar a atividade(s) da(s) enzima(s) biossintética(s).

[00021] Uma cepa mutante auxotrófica, cepa resistente a análogo de L- aminoácido, ou cepa mutante de regulação metabólica tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido pode ser obtida por submetendo uma cepa parental ou cepa tipo selvagem a um tratamento de mutagenese comum e então selecionando uma cepa exibindo a mutação de autotrofia, resistência a análogo, ou de regulação metabólica, e tendo uma capacidade de produzir L- aminoácido a partir das obtidas cepas mutantes. Exemplos do tratamento de mutagenese comum incluem irradiação de raio-X ou ultravioleta e um tratamento com um agente de mutação como N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina (MNNG), etil metanossulfonato (EMS), e metil metanossulfonato (MMS).

[00022] Uma capacidade de produzir L-aminoácido também pode ser conferida ou melhorada por melhora da atividade de uma enzima envolvida na biossíntese de um L-aminoácido objetivo. Uma atividade de enzima pode ser melhorada por, por exemplo, modificação da bactéria de modo que a expressão de um gene codificando para a enzima é melhorada. Métodos para melhorar a expressão dos genes são descritos em WO00/18935, EP 1010755 A, e assim em diante. Os procedimentos detalhados para melhorar a atividade de enzima serão descritos depois.

[00023] Além disso, uma capacidade de produzir L-aminoácido também pode ser conferida ou melhorada por redução de uma atividade de uma enzima que catalisa uma reação se ramificando fora da via biossintética de um L-aminoácido objetivo para gerar um composto diferente do objetivo L-aminoácido. A "enzima que catalisa a reação se ramificando fora da via biossintética de um L-aminoácido objetivo para gerar um composto diferente do objetivo L-aminoácido" referido aqui inclui uma enzima envolvida em decomposição do aminoácido objetivo. O método para reduzir uma atividade de enzima será descrito depois.

[00024] A seguir, bactérias produzindo L-aminoácido e métodos para conferir ou melhorar uma capacidade de produzir L-aminoácido serão especificamente exemplificadas. Todas as propriedades das bactérias produzindo L-aminoácido e modificações para conferir ou melhorar uma capacidade de produzir L-aminoácido podem ser usadas independentemente ou em qualquer combinação apropriada.

<Bactérias produzindo Ácido L-glutâmico >

[00025] Exemplos de bactérias produzindo ácido L-glutâmico e cepas parentais para derivar as mesmas incluem cepas em que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas dentre as enzimas biossintéticas de ácido L-glutâmico são melhoradas. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, glutamato desidrogenase (gdhA), glutamina sintetase (glnA), glutamato sintetase (gltBD), isocitrato desidrogenase (icdA), aconitato hidratase (acnA, acnB), citrato sintase (gltA), metilcitrato sintase (prpC), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvato desidrogenase (aceEF, lpdA), piruvato cinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgmI), fosfoglicerato cinase (pgk), gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase (gapA), triose fosfato isomerase (tpiA), frutose bisfosfato aldolase (fbp), fosfofructocinase (pfkA, pfkB), glucose fosfato isomerase (pgi), 6-fosfogluconato desidratase (edd), 2-ceto-3-deoxi-6- fosfogluconato aldolase (eda), e trans-hidrogenase. Mostrados em parêntese após os nomes das enzimas estão os nomes dos genes codificando as enzimas (o mesmo deve se aplicar às mesmas ocasiões a seguir). É preferível melhorar a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas dentre, por exemplo, glutamato desidrogenase, citrato sintase, fosfoenol piruvato carboxilase, e metilcitrato sintase, dentre estas enzimas.

[00026] Exemplos de bactérias corineformes modificadas de modo que a expressão do gene glutamato sintetase (gltBD) é aumentada incluem os descritos em WO99/07853.

[00027] Além disso, exemplos de bactérias produzindo ácido L- glutâmico e cepas parentais para derivar os mesmos também incluem cepas em que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas que catalisam a reação se ramificando fora a partir da via de biossíntese de ácido L-glutâmico para gerar um composto diferente de ácido L-glutâmico são reduzidas ou eliminadas. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, isocitrato liase (aceA), -cetoglutarato desidrogenase (sucA, odhA), fosfotransacetilase (pta), acetato cinase (ack), sintase de ácido acetohidróxi (ilvG), acetolactato sintase (ilvI), formato acetiltransferase (pfl), lactato desidrogenase (ldh), glutamato decarboxilase (gadAB), succinato desidrogenase (sdhABCD), e 1-pirolina-5-carboxilato desidrogenase (putA).

[00028] Bactérias corineformes em que a atividade de -cetoglutarato desidrogenase é reduzida ou eliminada, e métodos para obter as mesmas são descritos em WO2008/075483. Exemplos específicos de bactérias corineformes em que a atividade de -cetoglutarato desidrogenase é reduzida ou eliminada incluem, por exemplo, as seguintes cepas.

[00029] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) cepa L30-2 (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2006-340603)

[00030] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) cepa S (WO95/34672)

[00031] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12821 (FERM BP-4172, Patente FR No. 9401748)

[00032] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ12822 (FERM BP-4173, Patente FR No. 9401748)

[00033] Corynebacterium glutamicum AJ12823 (FERM BP-4174, Patente FR No. 9401748)

[00034] Corynebacterium glutamicum cepa L30-2 (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2006-340603)

[00035] Exemplos de bactérias produzindo ácido L-glutâmico e cepas parentais para derivar as mesmas também incluem cepas em que ambas a atividade de -cetoglutarato desidrogenase (sucA) e a atividade succinato desidrogenase (sdh) são reduzidas ou eliminadas (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2010-041920). Exemplos específicos de tais cepas incluem, por exemplo, Corynebacterium glutamicum cepa 8L3GSDH, que é a cepa deficiente dupla odhAsdhA de Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2010-041920).

[00036] Exemplos de bactérias produzindo ácido L-glutâmico e cepas parentais para derivar as mesmas também incluem cepas que foram modificadas de modo que a atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou a atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase são/é melhorada (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kohyo) No. 2008-509661). Ou uma dentre a atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase pode ser melhorada, ou ambas podem ser melhoradas. Neste relatório, D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e frutose-6- fosfato fosfocetolase pode ser coletivamente referidas como fosfocetolase.

[00037] A atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase significa uma atividade para converter xilulose-5-fosfato em gliceraldeído-3-fosfato e acetil fosfato com consumo de ácido fosfórico para liberar uma moléculas de H2O. Esta atividade pode ser medida por método descrito por Goldberg, M. et al. (Methods Enzymol., 9, 515-520, 1996) ou o método descrito por L. Meile (J. Bacteriol., 183:2929-2936, 2001).

[00038] A atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase significa uma atividade para converter frutose-6-fosfato em eritrose-4-fosfato e acetil fosfato com consumo de ácido fosfórico para liberar uma molécula de H2O. Esta atividade pode ser medida por método descrito por Racker, E. (Methods Enzymol., 5, 276-280, 1962) ou o método descrito por L. Meile (J. Bacteriol., 183:2929-2936, 2001).

[00039] Além disso, exemplos de métodos para conferir ou melhorar capacidade de produzir ácido L-glutâmico para ou em bactérias corineformes também incluem métodos de conferir resistência a um análogo de ácido orgânico, inibidor respiratório, ou similares, e métodos de conferir sensibilidade a um inibidor de síntese de parede celular. Exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, o método de conferir resistência ao ácido monofluoroacético (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 50-113209), o método de conferir resistência a adenina ou resistência a timina (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 57-065198), o método de atenuar a atividade de urease (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 52-038088), o método de conferir resistência a ácido malônico (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 52-038088), o método de conferir resistência a benzopironas ou naftoquinonas (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 56-1889), o método de conferir resistência a HOQNO (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 56-140895), o método de conferir resistência a ácido - cetomalônico (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 57-2689), o método de conferir guanidina resistência (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 56-35981), e o método de conferir sensibilidade a penicilina (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 4-88994).

[00040] Exemplos específicos de tais bactérias resistentes ou sensíveis incluem as seguintes cepas.

[00041] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ3949 (FERM BP-2632, consultar a patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 50-113209)

[00042] Corynebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736, consultar a patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 57065198)

[00043] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11355 (FERM P-5007, consultar a patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 56-1889)

[00044] Corynebacterium glutamicum AJ11368 (FERM P-5020, consultar a patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 56-1889)

[00045] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11217 (FERM P-4318, consultar a patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 57-2869)

[00046] Corynebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319, consultar a patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 57-2869)

[00047] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11564 (FERM BP-5472, consultar a patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 56-140895)

[00048] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11439 (FERM BP-5136, consultar a patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 56-35981)

[00049] Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004, consultar a patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 04-88994)

[00050] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ11426 (FERM P-5123, consultar a patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 56-048890)

[00051] Corynebacterium glutamicum AJ11440 (FERM P-5137, consultar a patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 56048890)

[00052] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ11796 (FERM P-6402, consultar a patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 58-158192)

[00053] Além disso, exemplos de métodos para conferir ou melhorar capacidade de produzir ácido L-glutâmico para uma ou mais bactérias corineformes também incluem um método de melhorar a expressão do gene yggB e um método de introduzir um gene mutante yggB tendo uma mutação na região de codificação (WO2006/070944). O gene yggB é um gene codificando para um canal mecanossensível. O gene yggB de Corynebacterium glutamicum cepa ATCC 13032 corresponde a sequência complementar à sequência do nucleotídeo números 1.336.091 a 1.337.692 na sequência de genoma registrada como Genbank Acesso No. NC_003450 na base de dados NCBI, e é também chamada NCgl1221. A proteína YggB é registrada como GenBank número de acesso NP_600492. A sequência de nucleotídeos do gene yggB de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) e a sequência de aminoácidos da proteína YggB codificada pelo gene são mostradas em SEQ ID NOS: 21 e 22, respectivamente.

[00054] Exemplos do gene mutante yggB utilizável nos métodos acima mencionados incluem genes yggB tendo a(s) seguinte(s) mutação(s). A proteína YggB codificada por um gene mutante yggB é também referida como uma proteína mutante YggB. Um gene yggB gene não tendo tal mutação(s) e a proteína YggB codificada pelo gene são também referidas como um gene yggB de tipo selvagem e uma proteína YggB de tipo selvagem, respectivamente. Exemplos de proteína YggB de tipo selvagem proteína incluem, por exemplo, uma proteína tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 22.

(1) Mutação no lado C-terminal

[00055] A mutação no lado C-terminal é uma mutação introduzida em uma parte de uma sequência de nucleotídeos da região codificando para a sequência do aminoácido números 419 a 533 em SEQ ID NO: 22. Apesar de uma mutação no lado C-terminal não ser particularmente limitado desde que uma mutação seja introduzida em pelo menos uma parte de uma sequência de nucleotídeos da região acima mencionada, uma mutação no lado C-terminal é preferivelmente uma mutação para inserir uma sequência de inserção (aqui abaixo também referida como uma "IS") ou inserir transposon. A mutação no lado C-terminal pode ser qualquer uma mutação para introduzir substituição de aminoácido (mutação de sentido errado), uma mutação para introduzir mutação de deslocamento de quadro induzida por inserção do acima mencionado IS ou similares, e uma mutação para introduzir mutação não sentido. Exemplos específicos do gene mutante yggB tendo uma mutação no lado C-terminal incluem, por exemplo, um gene yggB inserido com IS no sítio codificando para o resíduo de valina na posição 419 em SEQ ID NO: 22, e assim codificando para uma proteína mutante YggB de 423 resíduos amino no comprimento completo, que é mais curto do que a proteína YggB de tipo selvagem (SEQ ID NO: 22) (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2007-222163). A sequência de nucleotídeos deste gene mutante yggB (V419::IS) e a sequência de aminoácidos da proteína mutante YggB codificada por este gene são mostradas em SEQ ID NOS: 23 e 24, respectivamente. Exemplos de uma mutação no lado C-terminal também incluem uma mutação para substituir um resíduo prolina presente na região dos aminoácidos números 419 a 533 em SEQ ID NO: 22 com outro resíduo de aminoácido.

(2) Mutação em região de transmembrana

[00056] Estima-se que a proteína YggB codificada por gene yggB tenha cinco regiões de transmembrana. Em uma sequência de aminoácidos da proteína YggB de tipo selvagem de SEQ ID NO: 22, as regiões de transmembrana correspondem às regiões do aminoácido números 1 a 23 (primeira região de transmembrana), 25 a 47 (segunda região de transmembrana), 62 a 84 (terceira região de transmembrana), 86 a 108 (quarta região de transmembrana), e 110 a 132 (quinta região de transmembrana). O gene yggB pode ter uma mutação em uma região codificando para qualquer uma destas regiões de transmembrana. A mutação na região de transmembrana é desejavelmente uma mutação incluindo substituição, deleção, adição, inserção, ou inversão e um ou vários resíduos de aminoácidos enquanto não acompanhados por mutação de deslocamento de quadro ou mutação não sentido. Exemplos de uma mutação na região de transmembrana incluem uma mutação para inserir um ou vários resíduos de aminoácido entre o resíduo leucina na posição 14 e o resíduo triptofano na posição 15, uma mutação para substituir o resíduo alanina na posição 100 com outro resíduo de aminoácido, e uma mutação para substituir o resíduo alanina na posição 111 com outro resíduo de aminoácido, em uma sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 22, e assim em diante. O número de “um ou muitos” é, em particular, preferivelmente 1 a 20, mais preferivelmente 1 a 10, ainda mais preferivelmente1 a 5, particularmente preferivelmente 1 a 3.

[00057] Quando a proteína YggB de tipo selvagem tem uma sequência de aminoácidos diferente de uma sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 22, o gene mutante yggB pode ter uma mutação em uma região codificando para o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo de aminoácido na posição acima mencionado em SEQ ID NO: 22. Em uma proteína YggB de tipo selvagem arbitrário, cujo resíduo de aminoácido é "o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo de aminoácido na posição acima mencionada em SEQ ID NO: 22" pode ser determinado com base em alinhamento entre uma sequência de aminoácidos da proteína YggB de tipo selvagem e a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. Para variantes de tais gene mutante yggB e proteína mutante YggB, as descrições para variantes do transportador de fosfato mutante e do gene codificando para o mencionado por último podem ser aplicadas, mutatis mutandis. O "aminoácido número X em SEQ ID NO: 22" pode ser lido como a “posição X em SEQ ID NO: 22".

<Bactérias produzindo L-glutamina>

[00058] Exemplos do método para conferir ou melhorar a capacidade de produzir L-glutamina incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de modo que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionados dentre as enzimas de biossíntese de L-glutamina são melhoradas. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, glutamato desidrogenase (gdhA) e glutamina sintetase (glnA).

[00059] Exemplos do método para conferir ou melhorar a capacidade de produzir L-glutamina também incluem, por exemplo, um método de modificar a bactéria de modo que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas que catalisam uma reação se ramificando fora a partir da via de biossíntese de L-glutamina para gerar um composto diferente de L- glutamina são reduzidas. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, glutaminase.

[00060] Exemplos de bactérias produzindo L-glutamina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem bactérias corineformes em que a atividade ou atividades de glutamato desidrogenase (gdhA) e/ou glutamina sintetase (glnA) (EP 1229121, EP 1424398) são melhoradas, e bactérias corineformes em que a atividade de glutaminase (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2004-187684) é reduzida. A atividade de glutamina sintetase também pode ser melhorada por ruptura do gene adenililtransferase glutamina (glnE) ou ruptura do gene de proteína de controle de PII (glnB) (EP 1229121).

[00061] Exemplos dos métodos para conferir ou melhorar a capacidade de produzir L-glutamina para ou em bactérias corineformes também incluem o método de conferir resistência a 6-diazo-5-oxo-norleucina (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 3-232497), o método de conferir resistência a purina ao análogo e resistência a sulfóxido de metionina (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 61-202694), e o método de conferir resistência ao ácido -cetomalônico (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 56-151495). Exemplos específicos de bactérias corineformes tendo a capacidade de produzir L-glutamina incluem, por exemplo, as seguintes cepas.

[00062] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11573 (FERM P-5492, patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 56-151495)

[00063] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11576 (FERM BP-10381, patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 56-151495)

[00064] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ12212 (FERM P-8123, patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 61-202694)

< Bactérias produzindo L-Prolina >

[00065] Exemplos de bactérias produzindo L-prolina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem cepas em que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionados dentre a enzima biossintética L-prolina são melhoradas. Exemplos das enzimas envolvidas na biossíntese de L- prolina incluem glutamato-5-cinase, -glutamilfosfato redutase, e pirolina-5- carboxilato redutase. Para melhorar esta atividade enzimática, por exemplo, o gene proB codificando para glutamato cinase dessensibilizado para a inibição de realimentação por L-prolina (Patente DE No. 3127361) pode ser preferivelmente usado.

[00066] Exemplos de bactérias produzindo L- prolina e cepas parentais para derivar as mesmas também incluem cepas em que a atividade de uma enzima envolvida em decomposição de L-prolina é reduzida. Exemplos de tal enzima incluem prolina desidrogenase e ornitina aminotransferase.

< Bactérias produzindo L-Treonina >

[00067] Exemplos de bactérias produzindo L-treonina- e cepas parentais para derivar as mesmas incluem cepas em que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionado dentre as enzimas biossintéticas de L-treonina são melhoradas. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, aspartocinase III (lysC), aspartato semialdeído desidrogenase (asd), aspartocinase I (thrA), homoserina cinase (thrB), treonina sintase (thrC), e aspartato aminotransferase (aspartato transaminase) (aspC). É preferível melhorar a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas dentre aspartocinase III, aspartato semialdeído desidrogenase, aspartocinase I, homoserina cinase, aspartato aminotransferase, e treonina sintase, dentre estas enzimas. Qualquer um dos genes codificando para as enzimas biossintéticas de L-treonina pode ser introduzido em uma cepa em que a decomposição de treonina é reduzida.

[00068] As atividades das enzimas biossintéticas de L-treonina são inibidas para o produto final, L-treonina. Assim, para a construção de cepas produzindo L-treonina, é preferível modificar genes das enzimas biossintéticas de L-treonina de modo que as enzimas são dessensibilizadas para inibição em realimentação por L-treonina. Os genes acima mencionados thrA, thrB, e thrC constituem o operon de treonina, que forma uma estrutura do atenuador. A expressão do operon de operon de treonina é inibida por isoleucina e treonina no meio de cultura e também suprimida por atenuação. Assim, a expressão do operon de treonina pode ser melhorada por remoção da sequência líder ou atenuador na região de atenuação (consultar Lynn, S.P., Burton, W.S., Donohue, T.J., Gould, R.M., Gumport, R.L, e Gardner, J.F., J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); WO02/26993; WO2005/049808; WO2003/097839).

[00069] O promotor nativo do operon de treonina está presente à montante do operon de treonina, mas ele pode ser substituído com um promotor não nativo (consultar WO98/04715). O operon de treonina pode ser construído de modo que os genes de biossíntese de treonina são expressados sob o controle do repressor e promotor de fago (EP 0593792 B). Além disso, a bactéria modificada de modo que ela é dessensibilizada para inibição em realimentação por L-treonina também pode ser obtida por seleção de uma cepa resistente a ácido -amino--hidróxi isovalérico (AHV), que é um análogo de L-treonina.

[00070] É preferido que a quantidade de expressão do operon de treonina que é modificada de modo a ser dessensibilizada para inibição em realimentação por L-treonina como descrito acima seja aumentada em um hospedeiro por aumento do seu número de cópias ou por ligação do mesmo a um promotor potente. O número de cópias pode ser aumentado por introdução de um plasmídeo contendo o operon de treonina em um hospedeiro. O número de cópias também pode ser aumentado por transferência do operon de treonina para o genoma de um hospedeiro usando um transposon, fago Mu, ou similares.

[00071] O gene thrA codificando para aspartocinase homoserina desidrogenase I de E. coli foi elucidado (nucleotídeo números 337 a 2799, GenBank ACESSO NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrA está localizado entre os genes thrL e thrB sobre o cromossomo de E. coli K-12. O gene thrB codificando para homoserina cinase de Escherichia coli foi elucidado (nucleotídeo números 2801 a 3733, GenBank acesso NC 000913.2, gi: 49175990). O gene thrB está localizado entre os genes thrA e thrC sobre o cromossoma de E. coli K-12. O gene thrC codificando para a treonina sintase de E. coli foi elucidado (nucleotídeo números 3734 a 5020, GenBank acesso NC 000913.2, gi: 49175990). O gene thrC está localizado entre o gene thrB e o quadro de leitura aberta yaaX sobre o cromossoma de E. coli K-12. O operon thrA*BC contendo um gene mutante thrA codificando para aspartocinase homoserina desidrogenase I resistente a inibição em realimentação por treonina e genes thrBC de tipo selvagem pode ser obtida a partir do plasmídeo pVIC40 bem conhecido, que está presente em E. coli produzindo treonina cepa VKPM B-3996 (Patente US 5,705,371).

[00072] O gene rhtA de E. coli está presente a 18 min sobre o cromossomo de E. coli próximo do operon de glnHPQ, que codifica componentes do sistema de transporte de glutamina. O gene rhtA é idêntico a ORFl (gene ybiF, nucleotídeos números 764 a 1651, GenBank número acesso AAA218541, gi:440181), e está localizado entre os genes pexB e ompX. A unidade que expressa a proteína codificada por ORPl é referida como um gene rhtA (rht: resistente a homoserina e treonina). Foi também revelado que a mutação de rhtA23, que confere resistência contra uma elevada concentração de treonina ou homoserina, é uma substituição A-para-G na posição -1 com relação ao códon de partida de ATG (ABSTRACTS do 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology em conjunto com Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, Califórnia 24-29 de agosto de 1997, Abstract No. 457, EP 1013765 A).

[00073] O gene asd de E. coli já tinha sido elucidado (nucleotídeo números 3572511 a 3571408, GenBank acesso NC_000913.1, gi:16131307), e pode ser obtido por PCR (consultar White, T.J. et al., Trends Genet, 5, 185 (1989)) utilizando iniciadores preparados com base em uma sequência de nucleotídeos do gene. Os genes asd de outros micro-organismos também podem ser obtidos de modo similar.

[00074] O gene aspC de E. coli também já tinha sido elucidado (nucleotídeo números 983742 a 984932, GenBank acesso NC 000913.1, gi:16128895), e pode ser obtido por PCR utilizando iniciadores preparados com base em sequência de nucleotídeos do gene. O genes aspC de outros micro-organismos também podem ser obtidos de modo similar.

[00075] Além disso, exemplos de bactérias corineformes tendo capacidade de produzir L-treonina incluem, por exemplo, Corynebacterium acetoacidophilum AJ12318 (FERM BP-1172, consultar a Patente US 5,188,949).

<Bactérias produzindo L-lisina>

[00076] Exemplos de bactérias produzindo L-lisina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem cepas em que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas dentre as enzimas biossintéticas de L- lisina são melhoradas. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, dihidrodipicolinato sintase (dapA), aspartocinase III (lysC), dihidrodipicolinato redutase (dapB), diaminopimelato decarboxilase (lysA), diaminopimelato desidrogenase (ddh) (Patente US 6,040,160), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), aspartato semialdeído desidrogenase (asd), aspartato aminotransferase (aspartato transaminase) (aspC), diaminopimelato epimerase (dapF), tetrahidrodipicolinato sucinilase (dapD), sucinil diaminopimelato deacilase (dapE), e aspartase (aspA) (EP 1253195 A). É preferível melhorar a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionados dentre, por exemplo, dihidrodipicolinato redutase, diaminopimelato decarboxilase, diaminopimelato desidrogenase, fosfoenolpiruvato carboxilase, aspartato aminotransferase, diaminopimelato epimerase, aspartato semialdeído desidrogenase, tetrahidrodipicolinato sucinilase, e sucinil diaminopimelato deacilase, dentre estas enzimas. Além disso, bactérias produzindo L-lisina e cepas parentais para derivar as mesmas podem expressar um nível aumentado do gene envolvido em eficiência de energia (cyo) (EP 1170376 A), o gene codificando nicotinamida nucleotídeo transhidrogenase (pntAB) (Patente US 5,830,716), o gene ybjE (WO2005/073390), ou uma combinação dos mesmos. Porque aspartocinase III (lysC) está sujeita a inibição em realimentação para L-lisina, um gene mutante lysC codificando para uma aspartocinase III dessensibilizada para inibição em realimentação por L-lisina (Patente US 5,932,453) podem ser usados para melhorar a atividade desta enzima. Além disso, porque a dihidrodipicolinato sintase (dapA) está sujeita a inibição em realimentação por L-lisina, um gene mutante dapA codificando para uma dihidrodipicolinato sintase dessensibilizada para inibição em realimentação por L-lisina podem ser usados para melhorar a atividade desta enzima.

[00077] Exemplos de bactérias produzindo L-lisina e cepas parentais para derivar as mesmas também incluem cepas em que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas que catalisam uma reação se ramificando fora a partir da via biossintética de L-lisina para gerar um composto diferente de L-lisina são reduzidas ou eliminadas. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, homoserina desidrogenase, lisina decarboxilase (Patente US 5.827.698), e a enzima málica (WO2005/010175).

[00078] Exemplos de bactérias produzindo L-lisina e cepas parentais para derivar as mesmas também incluem cepas mutantes tendo resistência a um análogo de L-lisina. Os análogos de L-Lisina inibem o crescimento de bactérias como bactérias da família Enterobacteriaceae e bactérias corineformes, mas esta inibição é completamente ou parcialmente liberada quando L-lisina está presente no meio. Exemplos destes análogos de L-lisina incluem, mas não são particularmente limitados a, oxalisina, lisina hidroxamato, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), -metil lisina, e - clorocaprolactama. As cepas mutantes tendo resistência a estes análogos de lisina podem ser obtidas submetendo-se a bactéria a um tratamento de mutagenese artificial convencional.

[00079] Exemplos específicos de bactérias corineformes tendo capacidade de produzir L-lisina incluem, por exemplo, as cepas mutantes resistentes a AEC (Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum AJ11082) cepa (NRRL B-11470) etc., consultar a Publicação de Patente JP (Kokoku) Nos. 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 5730474, 58-10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7112437 e 7-112438); cepas mutantes requerendo um aminoácido como L- homoserina para seu crescimento (consultar a Publicação de Patente JP Nos. 48-28078 e 56-6499); cepas mutantes mostrando resistência a AEC e ainda requerendo um aminoácido como L-leucina, L-homoserina, L-prolina, L- serina, L-arginina, L-alanina, e L-valina (consultar as Patentes US Nos. 3.708.395 e 3.825.472); cepas mutantes mostrando resistência a DL--amino- -caprolactama, -amino-lauril lactama, análogo de ácido aspártico, fármaco sulfa, quinóide, e N-lauroil leucina; cepas mutantes mostrando resistência a um inibidor de oxaloacetato decarboxilase ou um inibidor de enzima de cadeia respiratória (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) Nos. 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995, 56-39778, Publicação de Patente JP Nos. 53-43591 e 53-1833); cepas mutantes requerendo inositol ou ácido acético (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) Nos. 55-9784 e 56-8692); cepas mutantes que são susceptíveis a ácido fluoropirúvico ou temperatura de 34°C ou maior (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) Nos. 55-9783 e 53-86090); e cepas mutantes mostrando resistência a etileno glicol (Patente US 4,411,997).

< Bactérias produzindo L-Arginina >

[00080] Exemplos de bactérias produzindo L-arginina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem cepas em que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionados dentre as enzimas biossintéticas de L- arginina são melhoradas. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, N-acetilglutamato sintetase (argA), N- acetilglutamil fosfato redutase (argC), ornitina acetil transferase (argJ), N- acetilglutamato cinase (argB), acetilornitina transaminase (argD), ornitina carbamoil transferase (argF), arginino succinato sintetase (argG), arginino succinato liase (argH), e carbamoil fosfato sintetase (carAB). Como o gene de N-acetilglutamato sintase (argA), por exemplo, um gene codificando para uma N-acetilglutamato sintase mutante dessensibilizada para inibição em realimentação por L-arginina por substituição para os resíduos de aminoácido correspondendo a posições 15 a 19 da enzima de tipo selvagem (EP 1170361 A) podem ser preferivelmente usados.

[00081] Exemplos de bactérias produzindo L-arginina e cepas parentais para derivar as mesmas também incluem cepas tendo resistência a um análogo de aminoácido ou similares. Exemplos de tais cepas incluem, por exemplo, as cepas de bactérias corineformes tendo resistência a 2-tiazol alanina e ainda exibindo auxotrofia para L-histidina, L-prolina, L-treonina, L-isoleucina, L- metionina, ou L-triptofano (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 54-44096); cepas de bactérias corineformes resistentes a ácido cetomalônico, ácido fluoromalônico, ou ácido monofluoroacético (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 57-18989); cepas de bactérias corineformes resistentes a argininol (Publicação de Patente JP No. 62-24075); cepas de bactérias corineformes resistentes a X-guanidina (X representa uma cadeia alifática ou um derivado da mesma, patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2-186995); e cepas de bactérias corineformes resistentes a arginina hidroxamato e 6-azauracil (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 57-150381). Exemplos específicos de bactérias corineformes tendo capacidade de produzir L-arginina incluem as seguintes cepas.

[00082] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11169 (FERM BP-6892)

[00083] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12092 (FERM BP-6906)

[00084] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11336 (FERM BP-6893)

[00085] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11345 (FERM BP-6894)

[00086] Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12430 (FERM BP-2228)

<Bactérias produzindo L-Citrulina- e bactérias produzindo L-ornitina>

[00087] As vias biossintéticas de L-citrulina e L-ornitina são comuns às de L-arginina. Assim, uma capacidade para produzir L-citrulina e/ou L- ornitina pode ser conferida ou melhorada por aumento da atividade ou atividades de N-acetilglutamato sintase (argA), N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), ornitina acetiltransferase (argJ), N-acetilglutamato cinase (argB), acetilornitina transaminase (argD), e/ou acetilornitina deacetilase (argE) (WO2006/35831).

< Bactérias produzindo L-Histidina>

[00088] Exemplos de bactérias produzindo L-histidina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem cepas em que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionados dentre as enzimas biossintéticas de L-histidina são melhoradas. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, ATP fosforibosiltransferase (hisG), fosforibosil AMP ciclohidrolase (hisI), fosforibosil-ATP pirofosfohidrolase (hisI), fosforibosilformimino-5-aminoimidazol carboxamida ribotídeo isomerase (hisA), amidotransferase (hisH), histidinol fosfato aminotransferase (hisC), histidinol fosfatase (hisB), e histidinol desidrogenase (hisD).

[00089] Dentre estas enzimas, as enzimas biossintéticas L-histidina codificadas por hisG e hisBHAFI são conhecidas como sendo inibidas por L- histidina. Assim, uma capacidade para produzir L-histidina pode ser conferida ou melhorada por, por exemplo, introdução de uma mutação para conferir resistência para inibição em realimentação no gene codificando para ATP fosforibosiltransferase (hisG) (Patente Russa Nos. 2003677 e 2119536).

<Bactérias produzindo L-Cisteína>

[00090] Exemplos de bactérias produzindo L-cisteína e cepas parentais para derivar as mesmas incluem cepas em que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionados dentre as enzimas biossintéticas de L- cisteína são melhoradas. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, serina acetiltransferase e 3-fosfoglicerato desidrogenase. A atividade de serina acetiltransferase pode ser melhorada por, por exemplo, introdução de um gene mutante cysE codificando para uma serina acetiltransferase mutante resistente a inibição em realimentação por cisteína em uma bactéria. Tal serina acetiltransferase mutante é descrita em, por exemplo, patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 11-155571 e Pedido de Patente US Publicado No. 20050112731. Além disso, a atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase pode ser melhorada por, por exemplo, introdução de um gene mutante serA codificando para uma 3- fosfoglicerato desidrogenase mutante resistente à inibição em realimentação por serina em uma bactéria. Esta 3-fosfoglicerato desidrogenase mutante é descrita em, por exemplo, Patente US 6.180.373.

[00091] Além disso, exemplos de bactérias produzindo L-cisteína e cepas parentais para derivar as mesmas também incluem cepas em que a atividade ou atividades de um dos mais tipos de enzimas selecionadas dentre enzimas que catalisam a reação se ramificando fora da via biossintética de L- cisteína para gerar um composto diferente de L-cisteína são reduzidas ou eliminadas. Exemplos de tais enzimas incluem, por exemplo, enzimas envolvidas na decomposição de L-cisteína. Exemplos de enzimas envolvidas na decomposição de L-cisteína incluem, mas não são particularmente limitados a, cisteína desulfidrase (aecD) (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2002-233384).

[00092] Além disso, exemplos de bactérias produzindo L-cisteína e cepas parentais para derivar as mesmas também incluem cepas em que o sistema excretório de L-cisteína é melhorado, e cepas em que o sistema de transporte de sulfato/tiossulfato é melhorado. Exemplos de proteínas do sistema excretório de L-cisteína incluem a proteína codificada pelo gene ydeD (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2002-233384), a proteína codificada pelo gene yfiK (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2004-49237), proteínas codificadas pelos genes emrAB, emrKY, yojIH, acrEF, bcr, e cusA (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2005-287333), e a proteína codificada pelo gene yeaS (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2010-187552). Exemplos das proteínas do sistema de transporte sulfato/tiossulfato incluem as proteínas codificadas pelo agrupamento de gene cysPTWAM.

[00093] Além disso, exemplos de bactérias corineformes tendo capacidade de produzir L-cisteína incluem bactérias corineformes tendo serina acetiltransferase dessensibilizada para inibição em realimentação por L-cisteína de modo a mostrar uma melhorada atividade de serina acetiltransferase intracelular (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2002-233384).

< Bactérias produzindo L-Metionina>

[00094] Exemplos de bactérias produzindo L-metionina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem cepas auxotróficas de L-treonina e cepas mutantes resistentes a norleucina (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2000-139471). Exemplos de bactérias produzindo L- metionina e cepas parentais para derivar as mesmas também incluem a cepa contendo uma homoserina transsucinilase mutante resistente à inibição em realimentação por L-metionina (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2000-139471, Pedido de Patente US Publicado No. 20090029424). Porque a L-metionina é biossintetizada via L-cisteína como um intermediário, a capacidade de produzir L-metionina também pode ser melhorada por aperfeiçoamento da capacidade de produzir L-cisteína (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2000-139471, Pedido de Patente US Publicado No. 20080311632).

< Bactérias produzindo L-Leucina >

[00095] Exemplos de bactérias produzindo L-leucina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem cepas em que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionado dentre as enzima biossintéticas de L- leucina são melhoradas. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, as enzimas codificadas pelos genes de operon leuABCD. Além disso, para acentuar a atividade de tal enzima, por exemplo, o gene leuA mutante codificando para isopropil maleato sintase dessensibilizado para inibição em realimentação por L-leucina (Patente US 6,403,342) pode ser preferivelmente usado.

[00096] Exemplos de bactérias corineformes tendo capacidade de produzir L-leucina incluem, por exemplo, Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ3718 (FERM P-2516), que é resistente a 2-tiazol alanina e -hidróxi leucina e auxotrófico para isoleucina e metionina.

< Bactérias produzindo L-Isoleucina >

[00097] Exemplos do método para conferir ou melhorar capacidade de produzir L-isoleucina incluem, por exemplo, um método de modificar a bactéria de modo que atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionado dentre a enzima biossintética L-isoleucina são aumentadas. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, treonina desaminase e acetohidróxi sintase de ácido (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2-458, FR 0356739, Patente US 5.998.178).

[00098] Exemplos de bactérias corineformes tendo capacidade de produzir L-isoleucina incluem a bactéria corineforme em que gene brnE codificando para uma proteína de excreção de aminoácido de cadeia ramificada é amplificada (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2001-169788), a bactéria corineforme à qual a capacidade de produzir L- isoleucina é conferida por fusão de protoplastos com uma bactéria produzindo L-lisina (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 62-74293), a bactéria corineforme em que homoserina desidrogenase é melhorada (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 62-91193), a cepa resistente a treonina hidroxamato (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No 62-195293), a cepa resistente a ácido -cetomalônico (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 61-15695), a cepa resistente a metilisina (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 61-15696), e Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ12149 (FERM BP- 759, Patente US 4.656.135).

< Bactérias produzindo L-Valina- >

[00099] Exemplos de bactérias produzindo L-valina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem cepas em que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionado dentre enzima biossintética a L-valina são melhoradas. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, as enzimas codificadas pelos genes do operon ilvGMEDA e as enzimas codificadas pelos genes do operon ilvBNC. Os genes ilvBN codificam para ácido acetohidróxi sintase, e o gene ilvC codifica para isomeroredutase (WO00/50624). Expressões do operon ilvGMEDA operon e do operon ilvBNC são suprimidas (atenuadas) por L-valina, L-isoleucina, e/ou L-leucina. Assim, para acentuar as atividades de enzima, é preferido que a supressão de expressão pela L-valina produzidas seja liberada por remoção ou modificação de uma região requerida para a atenuação. Além disso, a treonina desaminase codificada pelo gene ilvA é uma enzima que catalisa a reação de desaminação de L-treonina resultando em ácido 2-cetobutírico, que é uma etapa de limitação de taxa do sistema de biossíntese de L-isoleucina. Assim, para a produção de L-valina, prefere-se que a atividade de treonina desaminase seja reduzida por ruptura do gene ilvA ou similares.

[000100] Exemplos de bactérias produzindo L-valina e cepas parentais para derivar as mesmas também incluem cepas em que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionados dentre enzimas que catalisam a reação se ramificando fora da via biossintética de L-valina para gerar um composto diferente de L-valina são reduzidas. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, treonina desidratase envolvida na síntese de L-leucina, e as enzimas envolvidas na síntese de ácido D-pantotênico (WO00/50624).

[000101] Exemplos de bactérias produzindo L-valina e cepas parentais para derivar as mesmas também incluem cepas resistente a um análogo de aminoácido ou similar. Exemplos de tais cepas incluem, por exemplo, as cepas de bactéria corineforme que são auxotróficas para L-isoleucina e L- metionina, e resistente a D-ribose, purina ribonucleosídeo, ou pirimidina ribonucleosídeo, e têm uma capacidade para produzir L-valina (FERM P-1841, FERM P-29) (Publicação de Patente JP No. 53-025034), cepas de bactérias corineformes resistentes a policetídeos (FERM P-1763, FERM P-1764) (Publicação de Patente JP No. 06-065314), e cepas de bactérias corineformes resistentes a L-valina em um meio contendo ácido acético como a única fonte de carbono e sensível a análogos de ácido pirúvico (ácido fluoropirúvico, etc.) em um meio contendo glucose como a única fonte de carbono (FERM BP-3006, BP-3007) (Patente Japonesa No. 3006929).

< Bactérias produzindo L-Alanina >

[000102] Exemplos de bactérias produzindo L-alanina e cepas parentais para derivar as mesmas incluem as bactérias corineformes deficientes em H+-ATPase (Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001 Nov., 57(4):534-40) e bactérias corineformes em que a atividade de aspartato - decarboxilase é melhorada (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 07-163383).

< Bactérias produzindo L-Triptofano, bactérias produzindo L-fenilalanina, e bactérias produzindo L-tirosina >

[000103] Exemplos do método para conferir ou melhorar capacidade de produzir L-triptofano-, capacidade de produzir L-fenilalanina, e/ou capacidade de produzir L-tirosina incluem, por exemplo, um método de modificar a bactéria de modo que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionados dentre as enzimas biossintéticas L-triptofano, L-fenilalanina, e/ou L-tirosina são melhoradas.

[000104] Exemplos de enzimas comuns aos sistemas de biossíntese destes aminoácidos aromáticos incluem, mas não são particularmente limitados a, 3-deoxi-D-arabinoheptulosonato-7-fosfato sintase (aroG), 3- dehidroquinateosintase (aroB), shikimato desidrogenase (aroE), shikimato cinase (aroL), 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (aroA), e corismato sintase (aroC) (EP 763127 B). As expressões dos genes codificando para estas enzimas são controladas pelo repressor de tirosina (tyrR), e as atividades destas enzimas podem ser melhoradas por deleção do gene tyrR (EP 763127 B).

[000105] Exemplos da enzima biossintética L-triptofano incluem, mas não são particularmente limitados a, antranilato sintase (trpE), triptofano sintase (trpAB), e fosfoglicerato desidrogenase (serA). Por exemplo, por introdução de um DNA contendo o operon triptofano, a capacidade de produzir L-triptofano pode ser conferida ou melhorada. Triptofano sintase consiste de subunidades e codificadas pelos genes trpA e trpB, respectivamente. Uma vez que a antranilato sintase está sujeita a inibição em realimentação por L-triptofano, um gene codificando para esta enzima introduzida com uma mutação para dessensibilização para inibição em realimentação podem ser usados para melhorar a atividade desta enzima. Porque a fosfoglicerato desidrogenase está sujeita a inibição em realimentação por L-serina, um gene codificando para esta enzima introduzida com uma mutação para dessensibilização para inibição em realimentação pode ser usado para melhorar a atividade desta enzima. Além disso, acentuando a expressão do operon (operon ace) consistindo do gene de maleato sintase (aceB), gene isocitrato liase (aceA), e gene isocitrato desidrogenase cinase/fosfatase (aceK), a capacidade de produzir L-triptofano pode ser conferida ou melhorada (WO2005/103275).

[000106] Exemplos da enzima biossintética L-fenilalanina incluem, mas não são particularmente limitados a, corismato mutase e prefenato desidratase. corismato mutase e prefenato desidratase são codificadas pelo gene pheA como uma enzima bifuncional. Porque corismato mutase e prefenato desidratase estão sujeitos a inibição em realimentação por L- fenilalanina, um gene codificando para estas enzimas introduzidas com uma mutação para dessensibilização para inibição em realimentação pode ser usado para melhorar as atividades destas enzimas.

[000107] Exemplos da enzima biossintética L-tirosina incluem, mas não são particularmente limitados a, corismato mutase e prefenato desidrogenase. A corismato mutase e a prefenato desidrogenase são codificadas pelo gene tyrA como uma enzima bifuncional. Porque corismato mutase e prefenato desidrogenase estão sujeitos a inibição em realimentação por L-tirosina, um gene codificando paras estas enzimas introduzidas com uma mutação para dessensibilização para inibição em realimentação pode ser usado para melhorar as atividades destas enzimas.

[000108] As bactérias produzindo L-triptofano, L-fenilalanina, e/ou L- tirosina podem ser modificadas de modo que a biossíntese de um aminoácido aromático diferente dos aminoácidos aromáticos objetivos é reduzida. Além disso, as bactérias produzindo L-triptofano, L-fenilalanina, e/ou L-tirosina podem ser modificadas de modo que um sistema de absorção de subproduto é melhorado. Exemplos do subproduto incluem aromáticos aminoácidos diferentes dos aminoácidos aromáticos objetivos. Exemplos do gene codificando para tal sistema de absorção de subproduto incluem tnaB e mtr, que são genes codificando para o sistema de absorção de L-triptofano, pheP, que é um gene codificando para o sistema de absorção de L-fenilalanina, e tyrP, que é um gene codificando para o sistema de absorção de L-tirosina (EP 1484410).

[000109] Exemplos de bactérias corineformes tendo capacidade de produzir L-triptofano incluem Corynebacterium glutamicum AJ12118 (FERM BP-478) (Patente Japonesa No. 01681002), que é resistente a sulfaguanidina, a cepa introduzida com o operon triptofano (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 63-240794), e a cepa introduzida com um gene codificando para shikimato cinase derivada de uma bactéria corineforme (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 01-994749).

[000110] Exemplos de bactérias corineformes tendo capacidade de produzir L-fenilalanina incluem, por exemplo, Corynebacterium glutamicum cepas BPS-13 (FERM BP-1777), K77 (FERM BP-2062), e K78 (FERM BP- 2063) (EP 331145 A, patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 02-303495), das quais as atividades de fosfoenolpiruvato carboxilase ou piruvato cinase são reduzidas, e a cepa auxotrófica tirosina (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 05-049489).

[000111] Exemplos de bactérias corineformes tendo capacidade de produzir L-tirosina incluem, por exemplo, Corynebacterium glutamicum AJ11655 (FERM P-5836, Publicação de Patente JP No. 2-6517), e Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12081 (FERM P-7249, patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 6070093).

[000112] Além disso, exemplos de métodos para conferir ou melhorar uma capacidade de produzir L-aminoácido incluem, por exemplo, um método de modificar a bactéria de modo que a atividade para secretar um L- aminoácido a partir da célula bacteriana é aumentada. A atividade para secretar um L-aminoácido pode ser aumentada por, por exemplo, acréscimo da expressão de um gene codificando para uma proteína responsável pela secreção do L-aminoácido. Exemplos de genes codificando para proteínas responsáveis pela secreção de vários aminoácidos incluem, por exemplo, gene b2682 (ygaZ), gene b2683 (ygaH), gene b1242 (ychE), e gene b3434 (yhgN) (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2002-300874).

[000113] Além disso, exemplos de métodos para conferir ou melhorar uma capacidade de produzir L-aminoácido também incluem, por exemplo, um método de modificar a bactéria de modo que a atividade ou atividades de um ou mais das proteínas envolvidas no glicometabolismo e proteínas envolvidas no metabolismo de energia são aumentadas.

[000114] Exemplos das proteínas envolvidas no glicometabolismo incluem proteínas envolvidas absorção de sacarídeos e as enzimas do sistema de glicose. Exemplos de genes codificando para as proteínas envolvidas no glicometabolismo incluem o gene glucose-6-fosfato isomerase (pgi, WO01/02542), gene fosfoenolpiruvato sintase (pps, EP 877090 A), gene fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc, WO95/06114), gene piruvato carboxilase (pyc, WO99/18228, EP 1092776 A), gene fosfoglucomutase (pgm, WO03/04598), gene frutose bisfosfato aldolase (pfkB, fbp, WO03/04664), gene piruvato cinase (pykF, WO03/008609), gene transaldolase (talB, WO03/008611), gene fumarase (fum, WO01/02545), gene de absorção de sacarose não PTS (csc, EP 149911 A), e gene de utilização de sacarose. (operon scrAB, WO90/04636).

[000115] Exemplos de genes codificando para as proteínas envolvidas no metabolismo de energia incluem o gene transhidrogenase (pntAB, Patente US 5.830.716) e gene tipo citocromo bo oxidase (cyoB, EP 1070376 A).

[000116] Os genes usados para a criação das bactérias produzindo L- aminoácido acima mencionados não são limitados aos genes exemplificados acima e genes tendo uma sequência de nucleotídeos conhecida e também podem ser variantes dos mesmos, desde que as funções das proteínas codificadas não sejam degradadas. Por exemplo, os genes usados para a criação das bactérias produzindo L-aminoácido podem ser cada um gene codificando para uma proteína tendo um sequência de aminoácidos de uma proteína conhecida, mas incluindo substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácidos em uma ou várias posições. Para as variantes de genes e proteínas, as descrições para as variantes do gene transportador de fosfato e transportador de fosfato mencionados depois podem ser aplicadas, mutatis mutandis.

<1-2> Melhora da atividade de transportador de fosfato

[000117] A bactéria da presente invenção foi modificada de modo que a atividade de transportador de fosfato é aumentada. A bactéria da presente invenção pode ser obtida por modificação de uma bactéria corineforme tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido de modo que a sua atividade de transportador de fosfato é aumentada. A bactéria da presente invenção também pode ser obtida por modificação de uma bactéria corineforme de modo que a sua atividade de transportador de fosfato é aumentada, e então conferindo ou melhorando uma capacidade de produzir L-aminoácido. A bactéria da presente invenção pode ser uma bactéria que adquiriu uma capacidade de produzir L-aminoácido ao ser modificada de modo que a atividade de transportador de fosfato da mesma é aumentada. As modificações para construir uma bactéria da presente invenção podem ser realizadas em uma ordem arbitrária.

[000118] A seguir, transportadores de fosfato e genes codificando para os mesmos serão explicados.

[000119] Na presente invenção, o "transportador de fosfato" refere-se a uma proteína tendo a atividade de transportador de fosfato. Na presente invenção, a "atividade de transportador de fosfato" refere-se a uma atividade para absorver ácido fosfórico inorgânico (Pi) no interior de uma célula a partir do exterior da célula.

[000120] Exemplos do transportador de fosfato incluem o sistema transportador de fosfato inorgânico de baixa afinidade (Pit) e sistema transportador específico de fosfato de alta afinidade (Pst). Exemplos de genes codificando para um transportador de fosfato (também referido como "gene transportador de fosfato") incluem, o gene pitA e gene pitB codificando para o sistema Pit, e o gene pstSCAB codificando para o sistema Pst (documento não patente 1). O sistema Pst funciona como um complexo de quarto proteínas (isto é, os produtos de gene pstSCAB).

[000121] Na presente invenção, a atividade ou para o sistema Pit ou o sistema Pst pode ser aumentada. Na presente invenção, é preferível aumentar a atividade do sistema Pit, e é mais preferível aumentar a atividade da proteína PitA, que é o produto do gene pitA.

[000122] O gene pitA de Escherichia coli cepa K12 MG1655 corresponde à sequência nas posições 3635665 a 3637164 na sequência do genoma registrada na base de dados NCBI como GenBank acesso NC_000913 (VERSÃO NC_000913.2 GI: 49175990). O gene pitA de Escherichia coli cepa K12 MG1655 é sinônimo com ECK3478 e JW3460. Além disso, a proteína PitA de Escherichia coli cepa K12 MG1655 é registrada como GenBank acesso NP_417950 (versão NP_417950,1 GI: 16131365, locus_tag="b3493"). A sequência de nucleotídeos do gene pitA da cepa MG1655 e a sequência de aminoácidos da proteína PitA codificada para este gene são mostradas em SEQ ID NOS: 1 e 2, respectivamente.

[000123] O gene pitA de Pantoea ananatis cepa LMG20103 corresponde à sequência complementar a uma sequência nas posições 1397898 a 1399514 na sequência de genoma registrada na base de dados NCBI como GenBank acesso NC_013956 (VERSÃO NC_013956.2 GI: 332139403). Além disso, a proteína PitA de Pantoea ananatis cepa LMG20103 é registrada como GenBank acesso YP_003519531 (versão YP_003519531.1 GI: 291616789, locus_tag="PANA_1236"). A sequência de nucleotídeos do gene pitA de Pantoea ananatis cepa LMG20103 e a sequência de aminoácidos da proteína PitA codificada por este gene são mostradas em SEQ ID NOS: 3 e 4, respectivamente.

[000124] O gene pitA do Corynebacterium glutamicum cepa ATCC 13032 corresponde à sequência complementar a uma sequência nas posições 481391 a 482776 na sequência do genoma registrada na base de dados NCBI como GenBank acesso NC_003450 (VERSÃO NC_003450.3 GI: 58036263). O gene pitA de Corynebacterium glutamicum cepa ATCC 13032 é sinônimo com Cgl0460. Além disso, a proteína PitA de Corynebacterium glutamicum cepa ATCC 13032 é registrada como GenBank acesso NP_599707 (versão NP_599707.1 GI: 19551705, locus_tag="NCgl0445"). As sequências de nucleotídeos do gene pitA de Corynebacterium glutamicum cepa ATCC 13032 e a sequência de aminoácidos da proteína PitA codificada por este gene são mostradas em SEQ ID NOS: 25 e 26, respectivamente. Além disso, a sequência de nucleotídeos do gene pitA de Corynebacterium glutamicum cepa 2256 (ATCC 13869) e a sequência de aminoácidos da proteína PitA codificada por este gene são mostradas em SEQ ID NOS: 5 e 6, respectivamente.

[000125] O transportador de fosfato pode ser uma variante de qualquer um dos transportadores de fosfato acima mencionados como as várias proteínas PitA, desde que tenha a atividade de transportador de fosfato. Esta variante também pode ser referida como uma "variante conservativa". Exemplos da variante conservativa incluem, por exemplo, homólogos e variantes artificialmente modificadas dos transportadores de fosfato acima mencionados como as várias proteínas PitA.

[000126] Um gene codificando para um homólogo da proteína PitA acima mencionada pode ser facilmente obtido a partir de uma base de dados pública por, por exemplo, busca BLAST ou busca FASTA usando a sequência de nucleotídeos do gene pitA acima mencionado (SEQ ID NO: 1, 3, 5, ou 25) como uma sequência de pergunta. Além disso, um gene codificando para um homólogo da proteína PitA acima mencionada pode ser obtido por, por exemplo, PCR usando o cromossomo de uma bactéria ou levedura como o gabarito, e oligonucleotídeos preparados com base de uma sequência de genes conhecidos da mesma como iniciadores.

[000127] O gene codificando para uma variante conservativa do transportador de fosfato pode ser, por exemplo, tal gene como mencionado abaixo. Isto é, o transportador de fosfato gene pode ser um gene codificando para uma proteína tendo a sequência de aminoácidos acima mencionada, mas incluindo substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácidos em uma ou várias posições, desde que ele codifique para uma proteína tendo a atividade de transportador de fosfato. em tal caso, geralmente 70% ou mais, preferivelmente 80% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, da atividade de transportador de fosfato é mantida na proteína variante, com relação à proteína antes de incluir adição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácidos. Apesar do número de "um ou vários" poder diferir dependendo das posições na estrutura tridimensional da proteína ou dos tipos de resíduos de aminoácido, especificamente, é preferivelmente 1 a 20, mais preferivelmente 1 a 10, ainda mais preferivelmente 1 a 5, particularmente preferivelmente 1 a 3.

[000128] As acima mencionadas substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácidos é uma mutação conservativa que mantém a função normal da proteína. Os exemplos típicos da mutação conservativa são substituições conservativas. A substituição conservativa é uma mutação em que substituição ocorre mutuamente dentre Phe, Trp, e Tyr, se o sítio de substituição for um aminoácido aromático; dentre Leu, Ile, e Val, se for um aminoácido hidrofóbico; entre Gln e Asn, se for um aminoácido polar; dentre Lys, Arg, e His, se for um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se for um aminoácido ácido; e entre Ser e Thr, se for um aminoácido tendo um grupo hidroxila. Exemplos de substituições considerados como substituições conservativas incluem, especificamente, substituição de Ser ou Thr com Ala, substituição de Gln, His, ou Lys com Arg, substituição de Glu, Gln, Lys, His, ou Asp com Asn, substituição de Asn, Glu, ou Gln com Asp, substituição de Ser ou Ala com Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp, ou Arg com Gln, substituição de Gly, Asn, Gln, Lys, ou Asp com Glu, substituição de Pro com Gly, substituição de Asn, Lys, Gln, Arg, ou Tyr com His, substituição de Leu, Met, Val, ou Phe com Ile, substituição de Ile, Met, Val, ou Phe com Leu, substituição de Asn, Glu, Gln, His, ou Arg com Lys, substituição de Ile, Leu, Val, ou Phe com Met, substituição de Trp, Tyr, Met, Ile, ou Leu com Phe, substituição de Thr ou Ala com Ser, substituição de Ser ou Ala com Thr, substituição de Phe ou Tyr com Trp, substituição de His, Phe, ou Trp com Tyr, e substituição de Met, Ile, ou Leu com Val. Além disso, tais substituição, deleção, inserção, adição, inversão, ou similares de resíduos de aminoácidos como mencionado acima inclui uma mutação naturalmente ocorrendo devido a uma diferença individual, ou uma diferença de espécies do organismo a partir do qual o gene é derivado (mutante ou variante).

[000129] Além disso, o gene tendo tal mutação conservativa como mencionado acima pode ser um gene codificando para uma proteína mostrando uma homologia de 80% ou mais, preferivelmente 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais, ainda mais preferivelmente 97% ou mais, particularmente preferivelmente 99% ou mais, da sequência de aminoácidos totais mencionada acima, e tendo a atividade de transportador de fosfato. Adicionalmente, neste relatório, "homologia" significa "identidade".

[000130] Ainda mais, o transportador de fosfato gene pode ser um DNA que é capaz de hibridizar sob condições estringentes com uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência de genes conhecida, como uma sequência complementar a uma parte ou o todo da sequência de nucleotídeos acima mencionada, e a qual o DNA codifica para uma proteína tendo a atividade de transportador de fosfato. As "condições estringentes" consultam as condições sob as quais um assim chamado híbrido específico é formado, e um híbrido não específico não é formado, Exemplos das condições estringentes incluem as sob as quais DNAs altamente homólogos hibridizam para cada outro, por exemplo, DNAs não menos do que 80% homólogos, preferivelmente não menos do que 90% homólogos, mais preferivelmente não menos do que 95% homólogos, ainda mais preferivelmente não menos do que 97% homólogos, particularmente preferivelmente não menos do que 99% homólogos, hibridizam para cada outro, e DNAs menos homólogos do que os acima não hibridizam para cada outro, ou sob condições de lavagem de hibridização Southern típica, isto é, condições de lavagem de uma vez, preferivelmente 2 ou 3 vezes, a uma concentração de sal e temperatura correspondendo a 1 x SSC, 0,1% SDS a 60°C, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 60°C, mais preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 68°C.

[000131] As sondas usadas para a hibridização acima mencionada podem ser uma parte de uma sequência que é complementar a um gene como descrito acima. Esta sonda pode ser preparada por PCR usando oligonucleotídeos preparados com base em uma sequência de genes conhecidos como iniciadores e um fragmento de DNA contendo uma sequência de nucleotídeos como um gabarito. Quanto às sondas, por exemplo, um fragmento de DNA tendo o comprimento de cerca de 300 bp pode ser usado. Quando um fragmento de DNA tendo um comprimento de cerca de 300 bp é usado como a sonda, em particular, as condições de lavagem da hibridização podem ser, por exemplo, 50°C, 2 x SSC e 0,1% SDS.

[000132] Além disso, o transportador de fosfato gene pode ser um gene em que um códon arbitrário é substituído com um códon equivalente, desde que o gene codifique para uma proteína tendo a atividade de transportador de fosfato. Por exemplo, o gene transportador de fosfato pode ser modificado de modo que ele tenha os códons originais de acordo com as frequências de códons em um hospedeiro a ser usado.

[000133] A porcentagem de identidade de sequência entre duas sequências pode ser determinada por, por exemplo, usando um algoritmo matemático. Exemplos não limitantes de tal algoritmo matemático incluem o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-17, o algoritmo de homologia local de Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, o método para procurar homologia de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci 85:2444-2448, e uma versão modificada do algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 87:2264, assim como descrito em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci EUA 90:58735877.

[000134] Através do uso de um programa baseado em tal algoritmo matemático, comparação de sequência (i.e. alinhamento) para determinar a identidade de sequência pode ser executada. O programa pode ser apropriadamente executado por um computador. Exemplos de tal programa incluem, mas não estão limitados a, CLUSTAL de PC/programa de gene (disponível de Intelligenetics, Mountain View, Calif.), programa ALIGN (versão 2.0), e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA do Pacote de Software de Genética de Winsconsin, Versão 8, (disponível do Grupo de Computador de Genética (CGC), 575 Science Drive, Madison, Wis., EUA). Alinhamento usando esses programas pode ser executado pelo uso de, por exemplo, parâmetros iniciais. O programa CLUSTAL é bem descrito em Higgins et al. (1988), Gene 73:237-244 (1988), Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153, Corpet et al. (1988) Res. de Ácidos Nucleicos 16:10881-90, Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65, e Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331.

[000135] Para obter uma sequência de nucleotídeo homóloga a uma sequência de nucleotídeo alvo, em particular, por exemplo, busca de nucleotídeo BLAST pode ser executada pelo uso do programa BLASTN com a contagem de 100 e comprimento de palavra de 12. Para obter uma sequência de aminoácido homóloga a uma proteína alvo, em particular, por exemplo, busca de proteína BLAST pode ser executada pelo uso do programa BLASTX com a contagem de 50 e o comprimento de palavra de 3. Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov para busca de nucleotídeo BLAST e busca de proteína BLAST. Adicionalmente, BLAST com folga (BLAST 2.0) pode ser usado para obter um alinhamento incluindo folga(s) para o propósito de comparação. Adicionalmente, PSI-BLAST pode ser usado para executar busca repetitiva para detectar relações distantes entre sequências. Ver Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 for Gapped BLAST and PSI-BLAST. Quando se usa o BLAST, BLAST com folgas, ou PSI-BLAST, parâmetros iniciais de cada programa (ex.: BLAST para sequências de nucleotídeos, e BLASTX para sequências de aminoácidos) podem ser usados. Alinhamento pode também executado manualmente.

[000136] A identidade de sequência entre duas sequências é calculada como a razão de resíduos correspondente em duas sequências quando alinhando as duas sequências de forma a se encaixarem uma na outra maximamente.

[000137] As descrições acima com relação às variantes de genes e proteínas também podem ser aplicadas mutatis mutandis a proteínas arbitrárias como enzima biossintética de L-aminoácidos e genes codificando para as mesmas.

<1-3> Métodos para aumentar atividade de proteína

[000138] A seguir, métodos para aumentar a atividade de uma proteína serão explicados.

[000139] A expressão "a atividade de uma proteína é aumentada" significa que a atividade da proteína por célula é aumentada como comparada com a de uma cepa não modificada como a cepa tipo selvagem e cepa parental. A afirmação que "a atividade de uma proteína é aumentada" é também expressada como "a atividade de uma proteína é melhorada". Especificamente, a expressão "a atividade de uma proteína é aumentada" significa que o número de moléculas da proteína por célula é aumentada, e/ou a função de cada molécula da proteína é aumentada como comparada com as de uma cepa não modificada. Isto é, o termo "atividade " na expressão "a atividade de uma proteína é aumentada" não é limitado à atividade catalítica da proteína, mas pode significar a quantidade de transcrição de um gene (a quantidade de mRNA) codificando para a proteína, ou a quantidade de tradução da proteína (a quantidade da proteína). Apesar do grau de aumentar a atividade de uma proteína não ser particularmente limitado desde que a atividade da proteína seja aumentada como comparada com a da cepa não modificada, a atividade da proteína pode ser aumentada 1,5 vezes ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais, como comparada com a de uma cepa não modificada. Além disso, o estado de que "a atividade de uma proteína é aumentada" inclui não somente um estado em que a atividade de uma proteína objetiva é aumentada na cepa inerentemente tendo a atividade da proteína objetiva, mas também um estado em que a atividade de uma proteína objetiva é conferida a uma cepa não tendo inerentemente a atividade da proteína objetiva. Além disso, desde que a atividade da proteína é eventualmente aumentada, a atividade da proteína objetiva inerentemente contida no hospedeiro pode ser atenuada e/ou eliminada, e então um tipo apropriado da proteína pode ser introduzido na mesma.

[000140] A modificação que aumenta a atividade de uma proteína é atingida por, por exemplo, aumento da expressão de um gene codificando para a proteína. O estado que "a expressão de um gene é aumentada" é também referido como "a expressão de um gene é melhorada". A expressão de um gene pode ser aumentada 1.5 vezes ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais, comparada com a observada na cepa não modificada. Além disso, o estado que "a expressão de um gene é aumentada" inclui não somente um estado que uma quantidade de expressão de um gene alvo é aumentado na cepa que inerentemente expressa o gene alvo, mas também um estado que o gene é introduzida na cepa que não expressa inerentemente o gene alvo, e expressada no mesmo. Isto é, a frase "a expressão de um gene é aumentada" também significa, por exemplo, que o gene alvo é introduzida em uma cepa que não tem o gene, e expressado na mesma.

[000141] A expressão de um gene pode ser aumentada por, por exemplo, aumento do número de cópias do gene.

[000142] O número de cópias de um gene pode ser aumentado por introdução do gene no cromossomo de um hospedeiro. Um gene pode ser introduzido em um cromossomo por, por exemplo, usando recombinação homóloga (Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory). Somente uma, ou duas ou mais cópias de um gene podem ser introduzidas. Por exemplo, realizando a recombinação homóloga usando uma sequência que está presente em múltiplas cópias em um cromossomo como um alvo, múltiplas cópias de um gene podem ser introduzidas no cromossomo. Exemplos de tal sequência que está presente em múltiplas cópias em um cromossomo incluem DNAs repetitivos, e repetições invertidas localizadas em ambas as extremidades de um transposon. Alternativamente, recombinação homóloga pode ser realizada usando uma sequência apropriada em um cromossomo como um gene desnecessário para a produção de L-aminoácido como um alvo. A recombinação homóloga pode ser realizada por, por exemplo, um método usando um DNA linear como integração dirigida por Red - (Datsenko, K.A., e Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645 (2000)), um método usando um plasmídeo incluindo uma origem de replicação sensível a temperatura, um método usando um plasmídeo capaz de transferência conjugativa, um método usando um vetor suicida não incluindo um origem de replicação que funciona no hospedeiro, ou um método de transdução usando um fago. Além disso, um gene também pode ser introduzido aleatoriamente em um cromossomo usando um transposon ou Mini-Mu (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2-109985, Patente US 5.882.888, EP 805867 B1).

[000143] Introdução de um gene alvo em um cromossomo pode ser confirmada por hibridização Southern usando uma sonda tendo uma sequência complementar ao todo ou a uma parte do gene, PCR usando iniciadores preparados com base em uma sequência do gene, ou similares.

[000144] Além disso, o número de cópias de um gene alvo também pode ser aumentado por introdução de um vetor incluindo o gene em um hospedeiro. Por exemplo, o número de cópias de um gene alvo pode ser aumentado por ligação de um fragmento de DNA incluindo o gene alvo com um vetor que funciona no hospedeiro para construir um vetor de expressão do gene, e por transformação do hospedeiro com um vetor de expressão. O fragmento de DNA incluindo o gene alvo pode ser obtido por, por exemplo, PCR usando o DNA genômico de um micro-organismo tendo o gene alvo como o gabarito. Como o vetor, um vetor autonomamente replicável na célula do hospedeiro pode ser usado. O vetor é preferivelmente um vetor de múltiplas cópias. Além disso, o vetor preferivelmente inclui um marcador como um gene de resistência a antibióticos para a seleção de transformante. O vetor pode ser, por exemplo, um vetor derivado de um plasmídeo bacteriano, um vetor derivado de um plasmídeo de levedura, um vetor derivado de um bacteriófago, cosmídeo, fagemídeo, ou similares. Exemplos específicos de vetor autonomamente replicável em bactérias corineformes incluem, por exemplo, pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); pAM330 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); plasmídeos obtidos por aperfeiçoamento dos vetores acima e incluindo um gene de resistência a fármacos; plasmídeo pCRY30 descrito em patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 3-210184; plasmídeos pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, e pCRY3KX descritos em patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2-72876 e Patente US 5,185,262; plasmídeos pCRY2 e pCRY3 descritos na patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 1-191686; pAJ655, pAJ611, e pAJ1844 descritos na patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 58-192900; pCG1 descrito na patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 57-134500; pCG2 descrito na patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 58-35197; e pCG4 e pCG11 descrito na patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 57-183799.

[000145] Quando um gene é introduzido, é suficiente que o gene seja expressivamente abrigado por uma bactéria da presente invenção. Especificamente, é suficiente que o gene seja introduzido de modo que é expressada sob o controle de uma sequência de promotor que funciona na bactéria da presente invenção. O promotor pode ser um promotor derivado do hospedeiro, ou um promotor heterogêneo. O promotor pode ser o promotor nativo do gene a ser introduzido, ou um promotor de outro gene. Como o promotor, por exemplo, tal promotor mais potente como mencionado depois também pode ser usado.

[000146] Além disso, quando dois ou mais tipos de genes são introduzidos, é suficiente que os genes sejam, cada, expressivamente abrigados pela bactéria da presente invenção. Por exemplo, todos os genes podem ser carregados por um vetor único de expressão ou um cromossomo. Além disso, os genes podem ser separadamente transportados por dois ou mais vetores de expressão, ou separadamente transportados por um único ou dois ou mais vetores de expressão e um cromossomo. Um operon constituído por dois ou mais genes também pode ser introduzido.

[000147] O gene a ser introduzida não é particularmente limitado desde que ele codifique para uma proteína que funciona no hospedeiro. O gene a ser introduzido pode ser um gene derivado do hospedeiro, ou pode ser um gene heterogêneo.

[000148] Além disso, a expressão de um gene pode ser aumentada por aperfeiçoamento da transcrição eficiência do gene. A eficiência de transcrição de um gene pode ser melhorada por, por exemplo, substituindo o promotor do gene em um cromossomo por um promotor mais forte. O "promotor mais forte" significa um promotor provendo uma melhorada transcrição de um gene comparada com um promotor do gene de tipo selvagem inerentemente existente. Exemplos de promotores mais fortes utilizável em bactérias corineformes incluem o promotor P54-6 artificialmente projetado (Appl. Microbiol. Biotechnolo., 53, 674-679 (2000)), promotores pta, aceA, aceB, adh, e amyE indutíveis em bactérias corineformes com ácido acético, etanol, ácido pirúvico, ou similares, promotores cspB, SOD, e tuf, que são promotores potentes provendo uma grande quantidade de expressão em bactérias corineformes (Journal of Biotechnology, 104 (2003) 311-323; Appl. Environ. Microbiol., 2005 Dez; 71 (12):8587-96.), promotor lac, promotor tac, e promotor trc. Além disso, como o promotor mais forte, um tipo altamente ativo de um promotor existente também pode ser obtido usando vários genes repórteres. Por exemplo, fazendo as regiões -35 e -10 no promotor mais próximas da sequência de consenso, a atividade do promotor pode ser melhorada (WO00/18935). Métodos para avalizar a potência dos promotores e exemplos de promotores fortes são descritos no trabalho de Goldstein et al. (Prokaryotic Promoters in Biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)), e assim em diante.

[000149] Além disso, a expressão de um gene também pode ser melhorada por aperfeiçoamento da eficiência de tradução do gene. A eficiência de tradução de um gene pode ser melhorada por, por exemplo, substituindo a de sequência Shine-Dalgarno (SD) (também referida como um sítio de ligação de ribossoma (RBS)) para o gene em um cromossomo com a sequência SD a mais forte. A " sequência SD a mais forte" significa um sequência SD que fornece uma tradução melhorada de mRNA, qunado comparada com a sequência SD de tipo selvagem inerentemente existente do gene. Exemplos de sequências SD mais fortes incluem, por exemplo, RBS do gene 10 derivado de fago T7 (Olins P.O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235). Além disso, é conhecido que substituição, inserção, ou deleção de vários nucleotídeos na região de espaçador entre RBS e o códon de partida, especialmente na sequência imediatamente à montante do códon de partida (5'-UTR), significantemente afeta a estabilidade e a eficiência de tradução de mRNA, e assim, a eficiência de tradução de um gene também pode ser melhorada por modificação do mesmo.

[000150] Na presente invenção, sítios que afetam a expressão do gene, como um promotor, sequência SD, e região de espaçador entre RBS e o códon de partida, são também coletivamente chamados "região de controle de expressão". Uma região de controle de expressão pode ser identificada usando um vetor de busca de promotor software de análise de genes como GENETYX. Tal região de controle de expressão pode ser modificada por, por exemplo, um método usando um vetor sensível a temperatura ou o método de integração dirigido por Red (WO2005/010175).

[000151] A eficiência de tradução de um gene também pode ser melhorada por, por exemplo, modificando os códons. Por exemplo, no caso de expressão heterogênea de um gene ou similares, a eficiência de tradução do gene pode ser melhorada por substituição de um códon raro presente no gene com um códon sinônimo mais frequentemente usado. Códons podem ser substituídos por, por exemplo, o método de sítio-mutação específica para introduzir uma mutação objetiva em um sítio objetivo de DNA. Alternativamente, um fragmento de gene em que códons objetivos são substituídos pode ser totalmente sintetizado. As frequências de códons em vários organismos são descritos em "Codon Usage Database" (http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)).

[000152] Além disso, a expressão de um gene também pode ser aumentada por amplificação de um regulador que aumenta a expressão do gene, ou deletando ou atenuando um regulador que reduz a expressão do gene.

[000153] Estes métodos para aumentar a expressão do gene como mencionado acima podem ser usados independentemente ou em uma combinação arbitrária.

[000154] Além disso, a modificação que aumenta a atividade de uma enzima também pode ser atingida por, por exemplo, melhora da atividade específica da enzima. Uma enzima mostrando uma atividade específica melhorada pode ser obtida por, por exemplo, buscando em vários organismos. Além disso, um tipo altamente ativo de uma enzima existente também pode ser obtido por introdução de uma mutação na enzima existente. Melhora da atividade específica pode ser independentemente usada, ou pode ser usada em uma combinação arbitrária com tais métodos para melhorar a expressão do gene como mencionado acima.

[000155] A atividade do transportador de fosfato também pode ser aumentada por, por exemplo, levando um hospedeiro a abrigar um gene transportador de fosfato codificando para um transportador de fosfato tendo uma "mutação específica". Na presente invenção, um transportador de fosfato tendo a "mutação específica" é também referido como um transportador de fosfato mutante, e um gene codificando par ao mesmo é também referido como um gene mutante do transportador de fosfato. Além disso, na presente invenção, um transportador de fosfato não tendo a "mutação específica" é também referido como um transportador de fosfato de tipo selvagem, e um gene codificando para o mesmo é também referido como um gene transportador de fosfato de tipo selvagem. O transportador de fosfato mutante tendo a "mutação específica” pode ter uma atividade específica maior do que a de um transportador de fosfato de tipo selvagem.

[000156] Exemplos do transportador de fosfato de tipo selvagem incluem proteínas PitA não tendo a "mutação específica" (proteína PitA de tipo selvagem). Exemplos do transportador de fosfato mutante incluem proteínas PitA tendo a "mutação específica" (proteína PitA mutante). Um gene codificando para uma proteína PitA de tipo selvagem é também referido como um gene pitA de tipo selvagem, e um gene codificando para uma proteína PitA mutante é também referido como um gene pitA mutante. Exemplos de proteínas PitA de tipo selvagem incluem as várias proteínas PitA exemplificadas acima, e variantes conservativas das mesmas não tendo a "mutação específica". Isto é, o transportador de fosfato mutante pode ser o mesmo que uma proteína selecionada dentre as várias proteínas PitA exemplificadas acima e variantes conservativas das mesmas, desde que tenha a "mutação específica".

[000157] Especificamente, o transportador de fosfato mutante pode ser, por exemplo, uma proteína tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2, 4, 6, ou 26 desde que tenha uma "mutação específica". Além disso, especificamente, o transportador de fosfato mutante pode ser também, por exemplo, uma proteína tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2, 4, 6, ou 26, mas incluindo substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácidos, desde que tenha a "mutação específica". Além disso, especificamente, o transportador de fosfato mutante também pode ser, por exemplo, uma proteína mostrando uma homologia de 80% ou mais, preferivelmente 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais, ainda mais preferivelmente 97% ou mais, particularmente preferivelmente 99% ou mais, para uma sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2, 4, 6, ou 26, desde que tenha a "mutação específica". Adicionalmente, nesta especificação, “homologia” significa “identidade”.

[000158] Em outras palavras, o transportador de fosfato mutante pode ser uma variante de qualquer uma das várias proteínas PitA exemplificadas acima, que tenha a "mutação específica" e ainda inclua uma mutação conservativa em um sítio diferente do da "mutação específica".

[000159] Especificamente, o transportador de fosfato mutante pode ser, por exemplo, uma proteína tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2, 4, 6, ou 26, mas tendo a "mutação específica", e ainda incluindo substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácidos em um sítio diferente do da "mutação específica".

[000160] O número de “um ou muitos” é, em particular, preferivelmente 1 a 20, mais preferivelmente 1 a 10, ainda mais preferivelmente 1 a 5, particularmente preferivelmente 1 a 3. A substituição acima mencionada, deleção, inserção, ou adição de um ou muitos resíduos de aminoácidos é uma mutação conservativa que mantém função normal da proteína. Exemplos típicos de mutação conservativa são substituições conservativas. A substituição conservativa é uma mutação na qual substituição acontece mutuamente entre Phe, Trp e Tyr, se o local de substituição for um aminoácido aromático; entre Leu, Ile, e Val, se for um aminoácido hidrofóbico; entre Gln e Asn, se for um aminoácido polar; entre Lys, Arg, e His se for um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se for um aminoácido acídico; e entre Ser e Thr, se for um aminoácido tendo um grupo hidroxila. Exemplos de substituições consideradas como conservativas incluem, especificamente, substituição de Ser ou Thr por Ala, substituição de Gln, His, or Lys para Arg, substituição de Glu, Gln, Lys, His, ou Asp para Asn, substituição de Asn, Glu, ou Gln por Asp, substituição de Ser ou Ala por Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp, ou Arg por Gln, substituição de Gly, Asn, Gln, Lys, ou Asp por Glu, substituição de Pro por Gly, substituição de Asn, Lys, Gln, Arg, ou Tyr por His, substituição de Ile, Met, Val, ou Phe por Leu, substituição de Ile, Met, Val, ou Phe por Leu, a substituição de Asn, Glu, Gln, His, ou Arg por Lys, substituição de Ile, Leu, Val, ou Phe por Met, substituição de Trp, Tyr, Met, Ile, ou Leu por Phe, substituição de Thr por Ala ou Ser, a substituição de Ser ou Ala por Thr, substituição de Phe ou Tyr por Trp, substituição de His, Phe, ou Trp por Tyr, e substituição de Met, Ile, ou Leu por Val. Adicionalmente, tal substituição, deleção, inserção, adição, inversão, ou qualquer um dos mesmos de resíduos de aminioácidos como mencionado acima, inclui uma mutuação de ocorrência natural por causa da diferença individual, ou uma diferença de espécies do organismo do qual o gene é derivado (mutante ou variante).

[000161] Exemplos da "mutação específica" incluem, por exemplo, uma mutação em que um resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo fenilalanina na posição 246 em SEQ ID NO: 6 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente de resíduo fenilalanina. O resíduo de aminoácido após a substituição pode ser qualquer aminoácido natural diferente de fenilalanina, e selecionado dentre lisina, ácido glutâmico, tirosina, valina, isoleucina, serina, ácido aspártico, asparagina, glutamina, arginina, cisteína, metionina, triptofano, glicina, alanina, e histidina, mas é especialmente preferivelmente serina.

[000162] A "posição X" em uma sequência de aminoácidos é a X enésima posição contada a partir do N-término de uma sequência de aminoácidos, e o resíduo de aminoácido do N-término é o resíduo de aminoácido na posição 1. A posição de um resíduo de aminoácido representa uma posição relativa, e a posição absoluta do mesmo pode se deslocar devido a deleção, inserção, adição, ou similares de um resíduo de aminoácido ou resíduos. Isto é, quando um resíduo de aminoácido é deletado no lado N- terminal de posição 246 na sequência de SEQ ID NO: 6, o "resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo fenilalanina na posição 246 em SEQ ID NO: 6" significa o 245°. resíduo de aminoácido contado a partir do N- término. Além disso, quando um resíduo de aminoácido é inserido no lado N- terminal de posição 246 na sequência de SEQ ID NO: 6, o "resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo fenilalanina na posição 246 em SEQ ID NO: 6" significa o 247°. resíduo de aminoácido contado a partir do N- término.

[000163] Este resíduo de aminoácido é o "resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo fenilalanina na posição 246 em SEQ ID NO: 6" em uma sequência de aminoácidos arbitrária pode ser determinado com base em alinhamento entre a sequência arbitrária de aminoácidos e a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. O alinhamento pode ser realizado por, por exemplo, uso de software conhecido de análise de gene. Exemplos específicos de tal software incluem DNASIS produzido por Hitachi Solutions, GENETYX produzido por Genetyx, e assim em diante (Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24 (1) 72-96, 1991; Barton GJ et al., Journal of Molecular Biology, 198 (2), 327-37, 1987).

[000164] Na presente invenção, quando um transportador de fosfato de tipo selvagem tem uma sequência de aminoácidos diferente da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6, o "resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo fenilalanina na posição 246 em SEQ ID NO: 6" pode não ser um resíduo fenilalanina. Isto é, por exemplo, a "mutação em que o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo fenilalanina na posição 246 em SEQ ID NO: 6 é substituída com resíduo serina " não é limitada a uma mutação como quando o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo fenilalanina na posição 246 em SEQ ID NO: 6 é um resíduo fenilalanina, este resíduo fenilalanina é substituído com resíduo serina, mas também inclui uma mutação que, quando o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo fenilalanina na posição 246 em SEQ ID NO: 6 é um resíduo de aminoácido diferente de resíduo fenilalanina e resíduo serina, este resíduo de aminoácido é substituído com resíduo serina.

[000165] O gene mutante do transportador de fosfato pode ser obtido por modificação de um gene do transportador de fosfato de tipo selvagem de modo que transportador de fosfato codificado deveria ter a "mutação específica". O gene transportador de fosfato de tipo selvagem pode ser um gene derivado de um hospedeiro em que o gene mutante do transportador de fosfato deve ser introduzido, ou pode ser um gene de origem heterogênea. A modificação de DNA pode ser realizada por um método conhecido. Exemplos métodos de mutagenese específicos de sítio para introduzir uma mutação objetiva em um sítio objetivo de DNA incluem, por exemplo, um método usando PCR (Higuchi, R., 61, em PCR Technology, Erlich, H.A. Eds., Stockton Press, 1989; Carter P., Meth. In Enzymol., 154, 382, 1987), e um método usando um fago (Kramer, W. e Frits, H.J., Meth. in Enzymol., 154, 350, 1987; Kunkel, T.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367, 1987). Além disso, o gene mutante do transportador de fosfato também pode ser obtido por síntese química.

[000166] Introduzindo um gene mutante do transportador de fosfato em uma bactéria corineforme, a bactéria corineforme pode ser levada a abrigar o gene mutante do transportador de fosfato. O método para introduzir o gene mutante do transportador de fosfato na bactéria corineforme não é particularmente limitado, e um método convencionalmente conhecido pode ser usado. Por exemplo, um gene mutante do transportador de fosfato pode ser introduzido em uma bactéria corineforme do mesmo modo que do método de aumentar o número de cópias de um gene mencionado acima. Além disso, um gene transportador de fosfato de tipo selvagem de uma bactéria corineforme pode ser modificado de modo que o transportador de fosfato codificado deveria ter a "mutação específica" por mutação natural ou com um tratamento com um mutagene. Quando a bactéria da presente invenção abriga um gene mutante do transportador de fosfato, a bactéria da presente invenção pode ter ou não um gene transportador de fosfato de tipo selvagem. A bactéria da presente invenção pode ter uma ou mais cópias de um gene mutante do transportador de fosfato.

[000167] O método para a transformação não é particularmente limitado, e métodos convencionalmente conhecidos podem ser usados. Podem ser usados, por exemplo, um método de tratamento de células recipientes com cloreto de cálcio de modo a aumentar a sua permeabilidade para DNA, que foi relatado para Escherichia coli cepa K-12 (Mandel, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 1970, 53, 159-162), e um método de preparar células competentes a partir de células que estão em fase de crescimento, seguido por transformação com DNA, que foi relatado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. e Young, F.E., Gene, 1977, 1:153-167). Alternativamente, também pode ser usado um método de produzir células recipientes de DNA em protoplastos ou esferoplastos, que podem facilmente absorver o DNA recombinante, seguido por introdução de um DNA recombinante nas células recipientes de DNA, que é conhecido como sendo aplicável a Bacillus subtilis, actinomicetes, e leveduras (Chang, S. e Choen, S.N., 1979, Mol. Gen. Genet., 168:111-115; Bibb, M.J., Ward, J.M. e Hopwood, O.A., 1978, Nature, 274:398-400; Hinnen, A., Hicks, J.B. e Fink, G.R., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1929-1933). Além disso, método de pulso elétrico registrado para bactérias corineformes (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2-207791) também pode ser usado.

[000168] Um aumento na atividade de uma proteína pode ser confirmado por medida da atividade da proteína. A atividade de transportador de fosfato pode ser medida por, por exemplo, medindo a absorção do ácido fosfórico inorgânico usando um método conhecido (R.M. Harris et al., Journal of Bacteriology, Set. 2001, pp.5008-5014).

[000169] Um aumento na atividade de uma proteína também pode ser confirmado confirmando um aumento na expressão de um gene codificando para a proteína. Um aumento na expressão de um gene pode ser confirmado confirmando um aumento na quantidade de transcrição do gene, ou confirmando um aumento na quantidade de uma proteína expressada a partir do gene.

[000170] Um aumento da quantidade de transcrição de um gene pode ser confirmado comparando a quantidade de mRNA transcrito a partir do gene com o observado na cepa não modificada como uma cepa de tipo selvagem ou cepa parental. Exemplos do método para avaliar a quantidade de mRNA incluem hibridização Northern, RT-PCR, e assim em diante (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/3a. ed., Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001). A quantidade de mRNA por aumentar, por exemplo, 1,5 vezes ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais, como comparada com a de uma cepa não modificada.

[000171] Um aumento na quantidade de uma proteína pode ser confirmado por Western blotting usando anticorpos (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001). A quantidade da proteína pode aumentar, por exemplo, 1,5 vezes ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais, como comparada com que de uma cepa não modificada.

[000172] Os métodos acima mencionados para aumentar a atividade de uma proteína podem ser aplicados em uma melhora da atividade de uma proteína arbitrária como enzima biossintética de L-aminoácidos, e melhora de uma expressão de um gene arbitrário como genes codificando para esta proteína arbitrária além da melhora de uma atividade do transportador de fosfato.

<1-4> Método para reduzir atividade de proteína

[000173] A seguir, métodos para reduzir a atividade de uma proteína serão explicados abaixo.

[000174] A expressão "a atividade de uma proteína é reduzida" significa que a atividade da proteína por célula é diminuída como comparada com a de uma cepa não modificada como uma cepa de tipo selvagem ou cepa parental, e inclui um estado que a atividade desapareceu completamente. Especificamente, a expressão "a atividade de uma proteína é reduzida" significa que o número de moléculas da proteína por célula é reduzido, e/ou a função de cada molécula da proteína é reduzida como comparada com as de uma cepa não modificada. Isto é, o termo "atividade" na expressão "a atividade de uma proteína é reduzida" não é limitada à atividade catalítica da proteína, mas pode significar a quantidade de transcrição de um gene (a quantidade de mRNA) codificando para a proteína ou a quantidade de tradução da proteína (a quantidade da proteína). O estado que "o número de moléculas da proteína por célula é reduzido" inclui um estado em que a proteína não existe de todo. O estado que "a função de cada molécula da proteína é reduzida" inclui um estado em que a função de cada molécula proteína desaparece completamente. Apesar do grau de redução na atividade de uma proteína não ser particularmente limitado desde que a atividade seja reduzida como comparada com a de uma cepa não modificada, ele pode ser reduzido a, por exemplo, 50% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, ou 0% do de uma cepa não modificada.

[000175] A modificação para reduzir a atividade de uma proteína pode ser atingida por, por exemplo, redução da expressão de um gene codificando para a proteína. O estado que "a expressão de um gene é reduzida" inclui um estado em que o gene não é expressado de todo. O estado que "a expressão de um gene é reduzida" é também referido como "a expressão de um gene é atenuada". A expressão de um gene pode ser reduzida a 50% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, ou 0% da de uma cepa não modificada.

[000176] A redução em expressão de gene pode ser devido a, por exemplo, a redução na eficiência de transcrição, a redução na eficiência de tradução, ou uma combinação das mesmas. A expressão de um gene pode ser reduzida modificando uma sequência de controle de expressão do gene como um promotor e sequência de Shine-Dalgarno (SD). Quando uma sequência de controle de expressão é modificada, preferivelmente um ou mais nucleotídeos, mais preferivelmente dois ou mais nucleotídeos, particularmente preferivelmente três ou mais nucleotídeos, de uma sequência de controle de expressão são modificados. Além disso, uma parte ou toda a sequência de controle de expressão pode ser deletada. A expressão de um gene também pode ser reduzida por, por exemplo, manipulação de um fator responsável pelo controle de expressão. Exemplos do fator responsável pelo controle da expressão incluem as poucas moléculas responsáveis pelo controle de transcrição ou tradução (indutores, inibidores, etc.), proteínas responsáveis pelo controle da transcrição ou tradução (fatores de transcrição etc.), ácidos nucleicos responsáveis pelo controle de transcrição ou tradução (siRNA etc.), e assim em diante.

[000177] A modificação para reduzir a atividade de uma proteína também pode ser atingida por, por exemplo, ruptura de um gene codificando para a proteína. A ruptura de um gene pode ser atingida por, por exemplo, deleção de parte ou de todo a região do gene codificando em um cromossomo. Além disso, o todo de um gene incluindo sequências à montante e à jusante a partir do gene em um cromossomo pode ser deletado. A região a ser deletada pode ser qualquer região como uma região de N-término, uma região interna, ou uma região de C-término, desde que a atividade da proteína possa ser reduzida. Deleção de uma região mais longa pode geralmente inativar com maior segurança o gene. Além disso, prefere-se que os quadros de leitura das sequências à montante e à jusante a partir da região a ser deletada são sejam os mesmos.

[000178] A ruptura de um gene também pode ser atingida por, por exemplo, introdução de uma mutação para uma substituição de aminoácido (mutação de sentido errado), um códon de parada (mutação não sentido), uma mutação de deslocamento de quadro que adiciona ou deleta um ou dois resíduos de nucleotídeo, ou similares na região de codificação do gene em um cromossomo (Journal of Biological Chemistry, 272:8611-8617 (1997); Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95 5511-5515 (1998); Journal of Biological Chemistry, 26 116, 20833-20839 (1991)).

[000179] A ruptura de um gene também pode ser atingida por, por exemplo, inserção de outra sequência em uma região de codificação do gene em um cromossomo. O sítio da inserção pode estar em qualquer região do gene, e inserção de uma região mais longa pode geralmente inativar com maior segurança o gene. Prefere-se que os quadros de leitura das sequências à montante e à jusante a partir da sítio de inserção são sejam os mesmos, A outra sequência não é particularmente limitada desde que a sequência que reduz ou elimina a atividade da proteína codificada seja escolhida, e seus exemplos, por exemplo, um gene marcador como genes de resistência a antibióticos, e um gene utilizável para a produção de um L-aminoácido.

[000180] Esta modificação de um gene em um cromossomo como descrito acima pode ser atingida por, por exemplo, preparação de um gene de tipo deficiente, em que a sequência parcial do gene é deletada de modo que ela não pode produzir uma proteína que pode normalmente funcionar, e transformar um hospedeiro com um DNA recombinante incluindo o gene de tipo deficiente para levar à recombinação homóloga entre o gene de tipo deficiente e o gene de tipo selvagem em um cromossomo e assim substituir o gene de tipo deficiente pelo gene de tipo selvagem no cromossomo. Neste procedimento, se um gene marcador selecionado de acordo com as características do hospedeiro como auxotrofia é incluído no DNA recombinante, a operação se torna fácil. A proteína codificada para o gene de tipo deficiente tem uma conformação diferente da proteína de tipo selvagem, mesmo se for produzido, e assim a sua função é reduzida ou eliminada. Esta ruptura de gene com base na substituição de gene utilizando recombinação homóloga já foi estabelecida, e são métodos de usando um DNA linear como um método chamado "Red driven integration" (Datsenko, K.A, e Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645 (2000)), e um método utilizando integração dirigida por Red em combinação com um sistema de excisão derivado de fago (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., J. Bacteriol., 184:5200-5203 (2002)) (consultar WO2005/010175), um método usando um plasmídeo incluindo uma origem de replicação sensível a temperatura, um método usando um plasmídeo capaz de transferência conjugativa, um método utilizando um vetor suicida não incluindo uma origem de replicação que funciona no hospedeiro (Patente US 6,303,383, patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 05-007491), e assim em diante.

[000181] A modificação para reduzir a atividade de uma proteína também pode ser atingida por, por exemplo, um tratamento de mutagenese. Exemplos do tratamento de mutagenese incluem tratamentos comuns de mutação como irradiação de raios X ou ultravioleta e tratamento com agente de mutação como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), etil metanossulfonato (EMS), e metil metanossulfonato (MMS).

[000182] A redução na atividade de uma proteína pode ser confirmada por medida da atividade da proteína.

[000183] A redução na expressão de um gene pode ser confirmada por confirmação da redução na quantidade de transcrição do gene ou a redução na quantidade da proteína expressada a partir do gene.

[000184] A redução na quantidade de transcrição de um gene pode ser confirmada por comparação da quantidade de mRNA transcrita a partir do gene com a observada na cepa não modificada. Exemplos do método para avaliar a quantidade de mRNA incluem hibridização Northern, RT-PCR, e assim em diante (Molecular Cloning, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001). A quantidade de mRNA é preferivelmente diminuída a, por exemplo, 50% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, ou 0%, da observada na cepa não modificada.

[000185] A redução na quantidade de uma proteína pode ser confirmada por Western blotting usando anticorpos (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA) 2001). A quantidade da proteína é preferivelmente diminuída a, por exemplo, 50% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, ou 0%, da observada na cepa não modificada.

[000186] A ruptura de um gene pode ser confirmada determinando a sequência de nucleotídeos de uma parte ou de todo o gene, mapa de enzima de restrição, comprimento completo, ou similares do gene dependendo dos meios usados para a ruptura.

[000187] Os métodos acima mencionados para reduzir a atividade de uma proteína podem ser aplicados à redução na atividade de uma proteína arbitrária como enzimas que catalisam a reação se ramificando fora a partir da via biossintética de um L-aminoácido objetivo para gerar um composto diferente do L-aminoácido objetivo, e redução na expressão de um gene arbitrário como genes codificando para estas proteínas arbitrárias.

<2> Método para produzir L-aminoácido da presente invenção

[000188] O método da presente invenção é um método para produzir L- aminoácido compreendendo cultivar uma bactéria da presente invenção no meio, e coletar o L-aminoácido a partir do meio.

[000189] O meio a ser usado não é particularmente limitado, desde que a bactéria da presente invenção possa proliferar no mesmo, e um L- aminoácido objetivo pode ser produzido. Como o meio, por exemplo, um meio comum usado para cultura de bactérias como bactérias corineformes pode ser usado. Como o meio, por exemplo, um meio contendo fonte de carbono, fonte de nitrogênio, fonte de fósforo, fonte de enxofre, assim como componentes selecionados dentre outros vários componentes orgânicos e componentes inorgânicos como necessário podem ser usados. Tipos e concentrações dos componentes do meio podem ser determinados de modo apropriado de acordo com várias condições como o tipo de uma bactéria a ser usada e o tipo do aminoácido a ser produzido.

[000190] Os exemplos específicos da fonte de carbono incluem, por exemplo, os sacarídeos tais como glicose, frutose, sacarose, lactose, galactose, xilose, arabinose, melaços escuros, hidrolisados de amido, e hidrolisados de biomassa e ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido fumárico, cítrico ácido, e o ácido succínico, álcoois, tais como o glicerol, glicerol em bruto, e etanol, e ácidos alifáticos. Como a fonte de carbono, um único tipo de fonte de carbono pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de carbono podem ser usados em combinação.

[000191] Os exemplos específicos de fonte de nitrogênio incluem, por exemplo, sais de amônio, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, e fosfato de amônio, fontes de nitrogênio orgânico tal como a peptona, extrato de levedura, extrato de carne, e os produtos de decomposição de proteínas de soja, amônia e uréia. Gás amônia ou amônia aquosa usadas para ajuste de pH, também pode ser usadas como fonte de nitrogênio. Como a fonte de nitrogênio, um único tipo de fonte de nitrogênio pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de nitrogênio podem ser usados em combinação.

[000192] Os exemplos específicos da fonte de fosfato incluem, por exemplo, sais de ácido fosfórico, tais como di-hidrogenofosfato de potássio e hidrogenofosfato dipotássico, e polímeros de ácido fosfórico, tais como o ácido pirofosfórico. Como a fonte de fosfato, um único tipo de fonte de fosfato pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de fosfato podem ser usados em combinação.

[000193] Os exemplos específicos da fonte de enxofre, incluem, por exemplo, compostos de enxofre inorgânicos tais como sulfatos, tiossulfatos, e sulfitos, e aminoácidos contendo enxofre, tais como cisteína, cistina e glutationa. Como a fonte de enxofre, um único tipo de fonte de enxofre pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de enxofre podem ser usados em combinação.

[000194] Os exemplos específicos de outros componentes orgânicos e componentes inorgânicos incluem, por exemplo, sais inorgânicos tais como cloreto de sódio e cloreto de potássio; traços de metais, tais como ferro, manganês, magnésio, e cálcio; vitaminas, tais como vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, o ácido nicotínico, nicotinamida, e vitamina B12; aminoácidos; ácidos nucleicos; e componentes orgânicos contendo os mesmos, tais como peptona, casaminoácido, extrato de levedura, e produtos de decomposição de proteína de soja. Como outros componentes orgânicos e componentes inorgânicos, um único tipo de componente pode ser usado, ou dois ou mais tipos de componentes podem ser usados em combinação.

[000195] Além disso, quando um mutante auxotrófico que requer um aminoácido ou similares para seu crescimento é usado, é preferível suplementar um nutriente requerido ao meio. Por exemplo, em muitas das bactérias produzindo L-lisina, a via biossintética de L-lisina é melhorada e a capacidade de degradação de L-lisina é atenuada. Assim, quando tal bactéria produzindo L-lisina é cultivada, por exemplo, um ou mais tipos de aminoácidos selecionados dentre L-treonina, L-homoserina, L-isoleucina, e L- metionina são preferivelmente adicionados ao meio.

[000196] Além disso, quando ácido L-glutâmico é produzido usando uma bactéria corineforme, é preferível, por exemplo, restringir a quantidade de biotina no meio, ou adicionar um tensoativo ou penicilina ao meio.

[000197] As condições de cultura não são particularmente limitadas desde que a bactéria da presente invenção possa proliferar, e um L- aminoácido objetivo pode ser produzido. A cultura pode ser realizada, por exemplo, sob condições normais usadas para cultivar bactérias como bactérias corineformes. As condições de cultura podem ser fixadas de modo apropriado de acordo com vários condições como o tipo de bactéria a ser usada e o tipo de aminoácido a ser produzido.

[000198] A cultura pode ser realizada aerobicamente usando um meio líquido. Especificamente, a cultura pode ser realizada com arejamento ou agitação. A temperatura da cultura pode ser, por exemplo, de 20 a 40°C, preferencialmente de 25 a 37°C. pH do meio pode ser ajustado, por exemplo, de 5 a 8. Para ajustar o pH, substâncias ácidas ou alcalinas inorgânicas ou orgânicas, tais como o gás de amônia e assim por diante, podem ser usadas. O período de cultura pode ser, por exemplo, 15 a 90 horas. A cultura pode ser realizada como cultura em batelada, cultura em batelada alimentada, cultura contínua, ou uma combinação das mesmas. Além disso, a cultura pode ser realizada em duas etapas de uma cultura de semente e a cultura principal. Em tal caso, as condições de cultura da cultura de semente e da cultura principal podem ou não ser iguais. Por exemplo, tanto a cultura de semente como a cultura principal podem ser executadas como uma cultura de batelada. Alternativamente, por exemplo, a cultura de semente pode ser realizada como cultura em batelada, e a cultura principal pode ser realizada como a cultura em bateladas alimentadas ou cultura contínua. Por cultura da bactéria da presente invenção, sob tais condições, um L-aminoácido é acumulado no meio

[000199] Além disso, quando ácido L-glutâmico é produzido, a cultura pode ser realizada usando um meio líquido ajustado para atender a uma condição sob a qual o ácido L-glutâmico é precipitado, enquanto precipitando o ácido L-glutâmico no meio. Exemplos da condição sob a qual o ácido L- glutâmico é precipitado incluem, por exemplo, pH de 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, particularmente preferivelmente pH 4,0 (EP 1078989 A).

[000200] Quando um aminoácido básico como L-lisina é produzido, pode ser empregado um método em que o aminoácido básico é produzido por fermentação usando íons bicarbonato e/ou íons carbonato como os contra-íons principais para o aminoácido básico (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) No. 2002-65287, Pedido de Patente US Publicado No. 20020025564, EP 1813677 A). Para tal método, um aminoácido básico pode ser produzido enquanto reduzindo a(s) quantidade(s) de íons sulfato e/ou íons cloreto a ser usada, que tem sido convencionalmente usados como contra-íons para um aminoácido básico.

[000201] O L-aminoácido pode ser geralmente coletado a partir do caldo de fermentação por uma combinação de métodos convencionalmente conhecidos como método de resina de troca iônica (Nagai, H. et al., Separation Science and Technology, 39(16), 3691-3710), precipitação, separação de membrana (patente japonesa aberta à inspeção pública (Kokai) Nos. 9-164323 e 9-173792), cristalização (WO2008/078448, WO2008/078646), e outros métodos. Quando o L-aminoácido se acumula nas células, as células podem ser rompidas com, por exemplo, ondas ultrassônicas ou similares, e então o L-aminoácido pode ser coletado pelo método de resina de troca iônica ou similares a partir do sobrenadante obtido por remoção das células a partir da suspensão rompida por células por centrifugação. O L- aminoácido a ser coletado pode ser um composto livre, um sal do mesmo, ou uma mistura dos mesmos. Exemplos do sal incluem, por exemplo, sulfato, cloridrato, carbonato, sal de amônio, sal de sódio e sal de potássio. Por exemplo, no caso do ácido L-glutâmico, L-glutamato mossódico (MSG) pode ser obtido pela cristalização de L-glutamato monoamônico no caldo de fermentação pela adição de um ácido, e então pela adição de um equimolar de hidróxido de sódio ao cristal. Adicionalmente, descolorização pode ser executada pelo uso de carbono ativado antes e/ou depois da cristalização (ver, Tetsuya KAWAKITA, “Industrial Crystallization for Monosodium L- Glutamate.”, Bulletin of the Society of Sea Water Science, Japan, Vol.56:5).

[000202] Além disso, quando o L-aminoácido se deposita no meio, ele pode ser coletado por centrifugação, filtração, ou similares. O L-aminoácido depositado no meio também pode ser isolado junto com o L-aminoácido dissolvido no meio após o L-aminoácido dissolvido no meio ser cristalizado.

[000203] O L-aminoácido coletado pode conter células bacterianas, componentes do meio, umidade, e metabólitos de subproduto da bactéria, além do L-aminoácido. A pureza do L-aminoácido coletado pode ser, por exemplo, 50% ou maior, preferivelmente 85% ou maior, particularmente preferivelmente 95% ou maior (Patente Japonesa No. 1214636, Patente US Nos. 5.431.933, 4.956.471, 4.777.051, 4.946.654, 5.840.358, 6.238.714, Pedido de Patente US Publicado No. 20050025878).

[000204] Quando o L-aminoácido é ácido L-glutâmico, por exemplo, o cristal L-glutamato monossódico pode ser usado como um tempero de umami. O cristal de L-glutamato monossódico pode ser usado como tempero em combinação com o ácido nucleico tal como um sal dissódico 5'-GMP e sal dissódico 5'-GMP. que também tem gosto de umami.

[000205] Também, uma forma de realização do método da presente invenção é um método para produzir L-aminoácido compreendendo cultivar uma bactéria corineforme tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido em um meio. e coletar o L-aminoácido a partir do meio. em que a bactéria abriga um gene pitA mutante codificando para um transportador de fosfato tendo uma mutação em que o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo fenilalanina na posição 246 em SEQ ID NO: 6 é substituído com um resíduo de aminoácido diferente de resíduo fenilalanina.

[000206] Para esta forma de realização do método da presente invenção. as descrições acima mencionadas com relação à bactéria da presente invenção e o método da presente invenção podem ser aplicadas. mutatis mutandis. Por exemplo. nesta forma de realização. é preferido em que o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo fenilalanina na posição 246 em SEQ ID NO: 6 seja substituído com resíduo serina. Além disso. nesta forma de realização. a bactéria corineforme é preferivelmente Corynebacterium glutamicum. Além disso. nesta forma de realização. apesar do aminoácido a ser produzidos poder ser qualquer L-aminoácido. ele é preferivelmente ácido L-glutâmico.

Exemplos

[000207] A presente invenção será mais especificamente explicada com referência aos seguinte exemplos. No entanto. estes exemplos não devem ser construídos como limitando a presente invenção em qualquer significado.

Exemplo 1: Cultura de produção de Glu usando cepa melhorada em pitA

[000208] Neste exemplo. produção de Glu foi realizada usando uma cepa produzindo Glu de C. glutamicum em que a expressão do gene pitA foi melhorada. e influência da melhora de expressão de gene pitA sobre a produção de Glu foi avaliada. As cepas usadas foram as seguintes. C. glutamicum 2256ΔldhAΔsucA yggB*/pVK9 C. glutamicum 2256ΔldhAΔsucA yggB*/pVK9-Plac-pitA

(1) Método para construir cepas bacterianas

[000209] Como um modelo de cepa produzindo Glu, cepa 2256ΔldhAΔsucA yggB* foi construídas pelo seguinte método usando a cepa C. glutamicum 2256 (ATCC 13869) como a cepa parental. Os iniciadores usados são mostrados na Tabela 1. Tabela 1 - Legenda - Iniciador - Sequência de nucleotídeos

[000210] Primeiro, fragmentos de DNA para deletar o gene IdhA foram amplificados usando o DNA cromossômico da cepa 2256 como o gabarito, e o par do iniciadores 1 e 2 e o par do iniciadores 3 e 4, individualmente. Então, PCR foi realizado usando uma mistura de quantidades equivalentes de ambos os fragmentos amplificados como o gabarito assim como os iniciadores 5 e 6 para obter um fragmento de DNA consistindo ambos os fragmentos fusionados juntos. O fragmento de DNA obtido foi tratado com SalI, e introduzida no plasmídeo pBS4S (WO2005/113745) no sítio SalI para construir um plasmídeo para deletar ldhA. Este plasmídeo para deletar ldhA foi inserido no cromossoma da cepa 2256, e então curado a partir do mesmo, de modo a deletar o gene ldhA.

[000211] Então, fragmentos de DNA para deletar o gene sucA foram amplificados usando o DNA cromossômico da cepa 2256 como o gabarito, e o par do iniciadores 7 e 8 e o par do iniciadores 9 e 10, individualmente. então, PCR foi realizado usando uma mistura de quantidades equivalentes de ambos os fragmentos amplificados como o gabarito assim como os iniciadores 11 e 12 para obter um fragmento de DNA consistindo ambos os fragmentos fusionados juntos. O fragmento de DNA obtido foi tratado com BamHI, e introduzido no plasmídeo pBS3 (WO2006/070944) no sítio BamHI para construir um plasmídeo para deletar sucA. Este plasmídeo para deletar sucA foi inserido no cromossoma da cepa 2256ldhA, e então curado a partir do mesmo, de modo a deletar o gene sucA. Várias variantes da cepa deficiente em sucA obtida foram cultivadas sob uma condição suficiente de biotina, e a cepa tendo capacidade de produzir Glu foi selecionada. Como um resultado, uma cepa produzindo Glu tendo mutação IS (V419::IS) no gene yggB foi obtida. A sequência de nucleotídeos do gene yggB tendo a mutação IS (V419::IS) e a sequência de aminoácidos da proteína YggB codificada por este gene são mostradas em SEQ ID NOS: 23 e 24, respectivamente. A cepa produzindo Glu obtida foi designada cepa 2256ldhAsucA yggB*.

[000212] O plasmídeo de expressão pitA (pVK9-Plac-pitA) foi construído por seguinte método. Primeiro, um fragmento de gene pitA foi amplificado usando o DNA cromossômico da cepa 2256 como o gabarito assim como os iniciadores 13 e 14. Então, os fragmentos amplificados foram ligados ao plasmídeo pVK9 (Pedido de Patente US Publicado No. 20060141588) tratado com BamHI e PstI usando In-Fusion (TaKaRa INC.) para construir um plasmídeo de expressão de pitA. O plasmídeo de expressão de pitA construído foi designado pVK9-Plac-pitA.

[000213] O pVK9-Plac-pitA construído e pVK9 como um controle de vetor foram, cada, introduzidos na bactéria produzindo Glu, cepa 2256ldhAsucA yggB*, para construir a cepa 2256ldhAsucA yggB*/pVK9-Plac-pitA e a cepa 2256ldhAsucA yggB*/pVK9, respectivamente.

(2) Cultura de produção de Glu

[000214] A cultura de produção de Glu foi realizada usando a cepa 2256ldhAsucA yggB*/pVK9-Plac-pitA e a cepa 2256ldhAsucA yggB*/pVK9. A composição do meio usado é mostrada na Tabela 2. Tabela 2

[000215] Um meio tendo a composição acima mencionada e ajustado a pH 8.0 com KOH foi preparado, esterelizado por autoclave (115°C, 15 minutos), e usado para a cultura

<Método de cultura>

[000216] Cultura (pré-cultura e cultura principal) foi realizada colocando 20 mL do meio em um frasco Sakaguchi, adicionando 50 g/L de CaCO3, e agitando o meio a 31,5°C com um agitador de caixa. Primeiro, como a precultura, cada uma das cepas acima mencionadas foi cultivada durante 24 horas usando o Meio 1. Então, 2 mL do caldo de pré-cultura obtido foram inoculados no Meio 2, e Tween 40 (concentração final, 4 g/L) foi adicionado ao mesmo 2 horas após a inoculação, para realizar a cultura principal. O meio foi amostrado 17 horas após a inoculação. O sacarídeo residual e ácido glutâmico foram quantificados usando AS-310 (Asahi Chemical Industry).

[000217] Os resultados são mostrados na Tabela 3. Tabela 3, "RS" representa a quantidade do sacarídeo residual, e "Glu" representa a quantidade de ácido glutâmico. Foi revelado por este exemplo que crescimento e produtividade de Glu de C. glutamicum são melhorados por aumento da expressão do gene pitA em C. glutamicum. Assim, foi concluído que o aumento da atividade do transportador de fosfato codificado pelo gene pitA é eficaz para a produção de um aminoácido como ácido glutâmico. Tabela 3

Exemplo 2: Cultura de produção de Glu usando cepa mutante pitA

[000218] Por exemplo, a produção de Glu foi realizada usando uma cepa produzindo Glu de C. glutamicum em que uma mutação foi introduzida no gene pitA, e influência de uma mutação do gene pitA sobre a produção de Glu foi avaliada. As cepas usadas foram as seguintes. C. glutamicum 2256ldhAsucA yggB* C. glutamicum 2256ldhAsucA yggB* pitAmut

(1) Método para construir cepas bacterianas

[000219] A cepa 2256ldhAsucA yggB* pitAmut em que uma mutação foi introduzida no gene pitA foi construída usando a cepa 2256ldhAsucA yggB*, que foi uma cepa produzindo Glu modelo construída no Exemplo 1, como a cepa parental. Os iniciadores usados são mostrados na Tabela 4. [Tabela 4] Tabela 4 - Legenda - Iniciador - Sequência de nucleotídeos

[000220] Um plasmídeo pBS4S-pitAmut para introduzir uma mutação em pitA foi construído pelo seguinte método. PCR foi realizado usando DNA cromossômico da bactéria produzindo Glu cepa B3 em que uma mutação substituindo o resíduo fenilalanina na posição 246 da proteína PitA com resíduo serina (Phe246Ser ttc->tcc) foi introduzida na região de codificação do gene pitA como o gabarito assim como os iniciadores 15 e 16 para amplificar o fragmento do gene pitA tendo a mutação acima mencionada. Então, os fragmentos amplificados foram ligados ao plasmídeo pBS4S tratado com PstI e BamHI usando In-Fusion (TaKaRa INC.) para construir um plasmídeo para introduzir uma mutação em pitA. O plasmídeo construído para introduzir uma mutação em pitA foi designado pBS4S-pitAmut.

[000221] O pBS4S-pitAmut construído foi inserido no cromossoma da bactéria produzindo Glu cepa 2256ldhAsucA yggB*, e então curado a partir do mesmo, de modo a construir a cepa 2256ldhAsucA yggB* pitAmut em que a mutação foi introduzida no gene pitA.

[000222] Apesar da cepa mutada pitA acima mencionada, cepa 2256ldhAsucA yggB* pitAmut, ser construída usando o plasmídeo para introduzir uma mutação construída usando o DNA cromossômico da bactéria produzindo Glu cepa B3 como o gabarito, ela também pode ser construída usando um plasmídeo para introduzir uma mutação preparada com o kit PrimeSTAR® Mutagenesis Basal produzido por Takara Bio. Por exemplo, PCR é realizado usando o DNA cromossômico de uma cepa tipo selvagem como C. glutamicum cepa 2256 (ATCC 13869) como o gabarito assim como os iniciadores 15 e 16 para amplificar um fragmento do gene pitA não tendo a mutação. Então, os fragmentos amplificados são ligados ao plasmídeo pBS4S tratado com BamHI e PstI usando In-Fusion (TaKaRa INC.) para construir um plasmídeo incluindo a sequência do gene pitA de tipo selvagem. Além disso, PCR pode ser realizado usando este plasmídeo como o gabarito assim como iniciadores apropriados para modificar T na posição 737 do gene pitA em C de acordo com a instrução do kit PrimeSTAR® Mutagenesis Basal para construir o plasmídeo pBS4S-pitAmut para introduzir uma mutação em pitA. A mesma cepa mutante pitA pode ser construída usando este plasmídeo.

[000223] (2) Cultura de produção de Glu

[000224] Cultura de produção de Glu foi realizada usando a cepa 2256ldhAsucA yggB* e a cepa 2256ldhAsucA yggB* pitAmut. A composição do meio usado é mostrada na Tabela 5. Tabela 5

[000225] Um meio tendo a composição acima mencionada e ajustado a pH 8,0 com KOH foi preparado, esterilizado por autoclave (115°C, 15 minutes), e usado para a cultura.

<Método de cultura>

[000226] Cultura (pré-cultura e cultura principal) foi realizada colocando 20 mL do meio em um frasco Sakaguchi, adicionando 50 g/L of CaCO3, e agitando o meio a 31,5°C com uma caixa agitadora. Primeiro, como a precultura, cada uma das cepas acima mencionadas foi cultivada durante 24 horas usando o Meio 3. Então, 2 mL do caldo de pré-cultura obtido foram inoculados para o Meio 3, e Tween 40 (concentração final, 4 g/L) foi adicionado 2 horas após a inoculação, para realizar a cultura principal. O meio foi amostrado 21,5 horas após a inoculação. O sacarídeo residual e ácido glutâmico foram quantificados usando AS-310 (Asahi Chemical Industry).

[000227] Os resultados são mostrados na Tabela 6. Na Tabela 6, "RS" representa a quantidade de sacarídeo residual, e "Glu" representa a quantidade de ácido glutâmico. Foi revelado por este exemplo que crescimento e produtividade de Glu de C. glutamicum são melhorados por introdução de uma mutação (Phe246Ser) no gene pitA em C. glutamicum. Assim, foi concluído que esta mutação pitA (Phe246Ser) é efetiva para a produção de um aminoácido como ácido glutâmico. Tabela 6

Aplicabilidade Industrial

[000228] De acordo com a presente invenção, uma habilidade de produção de L-aminoácido de uma bactéria corineforme pode ser melhorada, e um L-aminoácido pode ser eficientemente produzido. Explicação da Listagem de Sequências SEQ ID NO: 1. Sequência de nucleotídeos de gene pitA de E. coli MG1655 SEQ ID NO: 2. Sequência de aminoácidos de proteína PitA de E. coli MG1655 SEQ ID NO: 3. Sequência de nucleotídeos do gene pitA de Pantoea ananatis LMG20103 SEQ ID NO: 4. Sequência de aminoácidos de proteína PitA de Pantoea ananatis LMG20103 SEQ ID NO: 5. Sequência de nucleotídeos de gene pitA de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) SEQ ID NO: 6. Sequência de aminoácidos de proteína PitA de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) SEQ ID NOS: 7 a 20, Iniciadores SEQ ID NO: 21. Sequência de nucleotídeos de gene yggB de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) SEQ ID NO: 22. Sequência de aminoácidos de proteína YggB de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) SEQ ID NO: 23. Sequência de nucleotídeos de gene yggB (V419::IS) de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) SEQ ID NO: 24. Sequência de aminoácidos de proteína YggB (V419::IS) de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) SEQ ID NO: 25. Sequência de nucleotídeos de gene pitA de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 SEQ ID NO: 26. Sequência de aminoácidos de proteína PitA de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 SEQ ID NOS: 27 e 28, Iniciadores

Claims

1. Método para produzir L-aminoácido, caracterizado pelo fato de compreender: cultivar uma bactéria corineforme tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido em um meio; e coletar o L-aminoácido a partir do meio, em que o L-aminoácido é ácido L-glutâmico, em que a bactéria é uma bactéria Corynebacterium, em que a bactéria foi modificada de modo que a atividade de um transportador de fosfato é aumentada por aumento da expressão de um gene pitA compreendendo a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 5 ou 25 ou sua sequência degenerada que gera a proteína mostrada na SEQ ID NO: 6 ou 26.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene é aumentada por aumento do número de cópias do gene, e/ou por modificação de uma sequência de controle de expressão do gene.

3. Método para produzir L-aminoácido, caracterizado pelo fato de compreender: cultivar uma bactéria corineforme tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido em um meio; e coletar o L-aminoácido a partir do meio, em que o L-aminoácido é ácido L-glutâmico, em que a bactéria é uma bactéria Corynebacterium,em que a bactéria abriga um gene pitA mutante codificando para um transportador de fosfato tendo uma mutação em que o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo fenilalanina na posição 246 em SEQ ID NO: 6 é substituído com um resíduo de serina, e em que um gene pitA de tipo selvagem correspondente ao gene pitA mutante compreende a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 5 ou sua sequência degenerada que gera a proteína mostrada na SEQ ID NO: 6.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a bactéria corineforme é Corynebacterium glutamicum.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o ácido L-glutâmico é um L-glutamato de monoamônia ou um L-glutamato monossódico.