DE60210697T2

DE60210697T2 - Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren mittels Bakterien der Gattung Escherichia

Info

Publication number: DE60210697T2
Application number: DE60210697T
Authority: DE
Inventors: Ekaterina Aleksandrovna Tabolina; Konstantin Vyacheslavovich Rybak; Evgeni Moiseevich Khourges; Elvira Borisovna Voroshilova; Mikhail Markovich Gusyatiner
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2001-02-13
Filing date: 2002-02-13
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2022-02-14
Also published as: EP1239041A3; JP2002300874A; EP1526181A1; DE60219968D1; DE60210697D1; BR122013017187B1; US7618804B2; DE60219969T2; JP5087194B2; JP2008073053A; DE60219969D1; CN1373226A; US20080261279A1; US20050239175A1; EP1526181B1; JP5087362B2; US7476531B2; CN100529057C; EP1239041A2; BR0200350B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Biotechnologie, speziell auf ein Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren durch Fermentation und insbesondere auf Gene, die sich von dem Bakterium Escherichia coli ableiten. Diese Gene eignen sich zur Verbesserung der Produktivität für L-Aminosäuren, beispielsweise L-Threonin, L-Valin, L-Prolin, L-Leucin, L-Methionin und L-Arginin.
Technischer Hintergrund
Konventionell werden L-Aminosäuren mit Hilfe eines Fermentationsverfahrens industriell hergestellt, wobei Mikroorganismenstämme, die aus natürlichen Quellen erhalten wurden, oder Mutanten dieser, die speziell zur Erhöhung der L-Aminosäure-produktivität modifiziert sind, verwendet werden.
Es wurden zahlreiche Methoden zum Erhöhen der Produktivität für L-Aminosäure beschrieben, beispielsweise durch Transformation eines Mikroorganismus mit Hilfe von rekombinanter DNA (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4,278,765). Diese Methoden beruhen auf der Erhöhung der Aktivität der Enzyme, die an der Aminosäure-Biosynthese beteiligt sind, und/oder der Desensibilisierung der Zielenzyme für die Rückkopplungshemmung durch die gebildete L-Aminosäure (siehe zum Beispiel Japanische Patentveröffentlichung Nr. 56-18596 (1981), WO 95/16042 oder US-Patente Nr. 5,661,012 und 6,040,160).
Andererseits kann eine erhöhte Ausscheidung der L-Aminosäure die Produktivität eines L-Aminosäure-produzierenden Stammes erhöhen. Ein Stamm eines Bakteriums der Gattung Corynebacterium, der erhöhte Expression des L-Lysin-Exkretionsgens (lysE-Gen) zeigt, ist beschrieben (WO 9723597A2). Außerdem wurden Gene, die für die Effluxproteine codieren, die sich für die Sekretion von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetylserin oder Thiazolidin-Derivaten eignen, beschrieben (US-Patent Nr. 5,972,663).
Zur Zeit sind einige Gene von Escherichia coli bekannt, die für vermutliche Membranproteine codieren, welche die L-Aminosäureproduktion erhöhen. Zusätzliche Kopien des rhtB-Gens machen ein Bakterium stärker resistent gegen L-Homoserin und erhöhen die Produktion von L-Homoserin, L-Threonin, L-Alanin, L-Valin und L-Isoleucin (Europäische Patentveröffentlichung EP994190A2 ). Zusätzliche Kopien des rhtC-Gens erhöhen die Resistenz eines Bakteriums gegen L-Homoserin und L-Threonin und erhöhen die Produktion von L-Homoserin, L-Threonin und L-Leucin (Europäische Patentveröffentlichung EP1013765A1 ). Zusätzliche Kopien der Gene yahN, yeaS, yfiK und yggA erhöhen die Produktion von L-Glutaminsäure, L-Lysin, L-Threonin, L-Alanin, L-Histidin, L-Prolin, L-Arginin, L-Valin und L-Isoleucin (Europäische Patentveröffentlichung EP1016710A2 ). Obwohl die vollständige Genomsequenz des Stammes Escherichia coli K-12 beschrieben ist (Blattner F. R., Plunkett G., Bloch C. A. et al., Science, 227, 1453-1474, 1997; ftp://ftp.genetics.wisc.edu/pub/sequence/ecolim52.seq.gz), gibt es viele ORFs (offene Leseraster) deren Funktion immer noch unbekannt ist.
Offenbarung der Erfindung
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Produktivität von L-Aminosäure-produzierten Stämmen zu erhöhen und ein Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, beispielsweise L- Threonin, L-Valin, L-Prolin, L-Leucin oder L-Methionin oder L-Arginin unter Verwendung dieser Stämme bereitzustellen.
Dieses Ziel wurde erreicht, indem Gene identifiziert wurden, die für Proteine codieren, welche nicht an dem Biosyntheseweg der Ziel-L-Aminosäure beteiligt sind, sondern deren Produktion erhöhen. Ein Beispiel für ein solches Protein könnte ein Membranprotein sein, welches Aktivität für die Ausscheidung beziehungsweise Exkretion der L-Aminosäure hat. Aufgrund der Analyse der vollständigen Genomsequenz von Escherichia coli wurden Proteine mit 4 oder mehr vermutlichen Transmembransegmenten (TMS) selektiert. Als Ergebnis der intensiven Selektion haben die Erfinder unter diesen mehrere Gene identifiziert, das heißt, b2682 und b2683 und diese gründlich untersucht. Die Gene b2682 und b2683 sind als mögliche CDS bekannt, die für funktionell unbekannte Proteine codieren können (Nucleotid-Nummern 92 bis 829 und 819 bis 1154 in der Sequenz der GenBank-Hinterlegungen AE000353 beziehungsweise U00096). Das Gen b2683 ist auch als ygaH bekannt.
Die Erfinder haben außerdem festgestellt, dass durch Erhöhen der Aktivität des durch das Gen b2682 oder das Gen b2683 codierte Protein die Produktivität eines L-Aminosäure-produzierenden Stammes erhöht wird. Die Erfindung wurde somit fertig gestellt.
Die vorliegende Erfindung umfasst:

1). Ein L-Aminosäure-produzierendes Bakterium der Gattung Escherichia, welches so modifiziert worden ist, dass die L-Aminosäureproduktion durch das Bakterium durch Erhöhen der Aktivitäten der Proteine, die im Folgenden durch (A) oder (B) und (C) oder (D) definiert sind, in einer Zelle des Bakteriums erhöht ist: (A) ein Protein, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 des Sequenzprotokolls umfasst; (B) ein Protein, welches die Aminosäuresequenz, einschließlich Deletion, Substitution, Insertion oder Addition von 1-24 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 des Sequenzprotokolls umfasst und das eine Aktivität aufweist, durch die das Bakterium mit einer erhöhten Resistenz gegen L-Aminosäure und/oder deren Analoga versehen wird; (C) ein Protein, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:5 des Sequenzprotokolls umfasst; (D) ein Protein, das die Aminosäuresequenz, einschließlich Deletion, Substitution, Insertion oder Addition von 1-11 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:5 des Sequenzprotokolls umfasst und das eine Aktivität aufweist, durch die das Bakterium mit einer erhöhten Resistenz gegen L-Aminosäuren und/oder deren Analoga versehen wird, wobei die Aktivitäten der Proteine durch Transformation des Bakteriums mit DNA, die für ein in (A) oder (B) und (C) oder (D) definiertes Protein codiert, oder durch Veränderung der Promotersequenz der DNA auf dem Chromosom des Bakteriums erhöht ist.

Nachstehend werden die vorstehend unter (A) oder (B) und (C) oder (D) definierten Proteine als "Proteine der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung" bezeichnet und das Bakterium der Gattung Escherichia, in welchem die Aktivitäten der obigen Proteine erhöht sind, wird manchmal als "Bakterium der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung" bezeichnet.

2). Das Bakterium nach dem obigen Bakterium, wobei die Transformation mit einem Mehrkopienvektor durchgeführt ist.
3). Ein Verfahren zum Herstellen einer L-Aminosäure, welches das Kultivieren des vorstehend definierten Bakteriums in einem Kulturmedium und das Gewinnen der herzustellenden und anzuhäufenden L-Aminosäure aus dem Kulturmedium umfasst.
4). Das Verfahren nach der obigen Methode, wobei die L-Aminosäure L-Threonin ist.
5). Das Verfahren nach der obigen Methode, wobei das Bakterium so modifiziert worden ist, dass das Bakterium eine erhöhte Expression des Threonin-Operons aufweist.
6). Das Verfahren nach der obigen Methode, wobei die L-Aminosäure L-Valin ist.
7). Das Verfahren nach der obigen Methode, wobei das Bakterium so modifiziert worden ist, dass das Bakterium eine erhöhte Expression des ilv-Operons aufweist.
8). Das Verfahren nach der obigen Methode, wobei die L-Aminosäure L-Prolin ist.
9). Das Verfahren nach der obigen Methode, wobei das Bakterium so modifiziert worden ist, dass das Bakterium eine erhöhte Expression von Genen für die Prolin-Biosynthese aufweist.
10). Das Verfahren nach der obigen Methode, wobei die L-Aminosäure L-Leucin ist.
11). Das Verfahren nach der obigen Methode, wobei das Bakterium so modifiziert worden ist, dass das Bakterium eine erhöhte Expression des leu-Operons aufweist.
12). Das Verfahren nach der obigen Methode, wobei die L-Aminosäure L-Methionin ist.
13). Das Verfahren nach der obigen Methode, wobei das Bakterium so modifiziert worden ist, dass das Bakterium eine erhöhte Expression des met-Regulons aufweist.

Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure umfasst die Produktion von L-Threonin unter Verwendung eines L-Threonin-produzierenden Bakteriums, in welchem die Aktivitäten der erfindungsgemäßen Proteine, wie die mit den in SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:5 gezeigten Aminosäuresequenzen, erhöht sind. Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure schließt auch die Produktion von L-Valin unter Verwendung eines L-Valin-produzierenden Bakteriums ein, in welchem die Aktivitäten der Proteine gemäß der Erfindung, wie der mit den in SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:5 gezeigten Aminosäuresequenzen, erhöht sind. Außerdem umfasst das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure die Produktion von L-Prolin unter Verwendung eines L-Prolin-produzierenden Bakteriums, in welchem die Aktivitäten der erfindungsgemäßen Proteine, wie der mit den in Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:5 gezeigt sind, erhöht sind. Darüber hinaus umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure die Produktion von L-Leucin unter Verwendung eines L-Leucin-produzierenden Bakteriums, in welchem die Aktivitäten der erfindungsgemäßen Proteine, wie der, welche die in SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:5 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweisen, erhöht sind. Das Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure umfasst auch die Produktion von L-Methionin unter Verwendung eines L-Methionin-produzierenden Bakteriums, in dem die Aktivitäten der erfindungsgemäßen Proteine, wie der, welche die in SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:5 gezeigten Aminosäuresequenzen, erhöht sind.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend ausführlich erläutert.
Das erfindungsgemäße Bakterium ist ein L-Aminosäure-produzierendes Bakterium der Gattung Escherichia, welches so modifiziert ist, dass die L-Aminosäureproduktion durch das Bakterium erhöht ist, indem die Aktivitäten der erfindungsgemäßen Proteine in den Zellen des Bakteriums erhöht wurden.
Erfindungsgemäß bedeutet "L-Aminosäure-produzierendes Bakterium" ein Bakterium, das die Fähigkeit hat, L-Aminosäuren in einem Medium anzureichern, wenn das Bakterium in dem Medium kultiviert wird. Die Fähigkeit zur Produktion von L-Aminosäure kann dem Bakterium als Eigenschaft eines Wildstammes des Bakteriums eigen sein oder kann durch Züchten verliehen oder erhöht worden sein.
Das erfindungsgemäße Bakterium ist ein L-Aminosäure-produzierendes Bakterium der Gattung Escherichia mit erhöhter Aktivität der Proteine, welche die Produktivität der gewünschten L-Aminosäure erhöhen. Konkret ist das erfindungsgemäße Bakterium ein L-Aminosäure-produzierendes Bakterium der Gattung Escherichia, das erhöhte Aktivität mindestens eines oder zwei der erfindungsgemäßen Proteine aufweist.
Der Ausdruck "Erhöhen der Aktivität eines Proteins" bedeutet, dass die Aktivität pro Zelle gegenüber der eines nich-tmodifizierten Stammes, beispielsweise eines Wildtyps des Bakteriums der Gattung Escherichia erhöht worden ist. So kann zum Beispiel der Fall erwähnt werden, in welchem die Anzahl der Proteinmoleküle pro Zelle erhöht ist, ein Fall, in welchem die spezifische Aktivität pro Proteinmolekül ansteigt und so weiter. Außerdem kann als Bakterium der Gattung Escherichia des Wildtyps, das als Vergleichsobjekt dient, beispielsweise der Wildstamm von Escherichia coli erwähnt werden.
Konkret enthält das erfindungsgemäße Bakterium die DNA, die mindestens eines der Gene b2682 und b2683, vorzugsweise beide Gene, überexprimiert, auf der chromosomalen DNA oder einem Plasmid in dem Bakterium und hat erhöhte Fähigkeit zur Produktion von L-Aminosäure, beispielsweise L-Threonin, L-Valin, L-Prolin, L-Leucin oder L-Methionin.
Die erfindungsgemäßen Proteine umfassen solche, die nachfolgend unter (A) oder (B) und (C) oder (D) definiert sind:
(A) ein Protein, welches die Aminosäuresequenz umfasst, die SEQ ID NO:3 in dem Sequenzprotokoll gezeigt ist;
(B) ein Protein, welches die Aminosäuresequenz, einschließlich Deletion, Substitution, Insertion oder Addition von 1-24 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:3 in dem Sequenzprotokoll gezeigt ist, umfasst und das eine Aktivität aufweist, durch die dem Bakterium eine erhöhte Resistenz gegen die L-Aminosäure und/oder deren Analoga verliehen wird;
(C) ein Protein, das die Aminosäuresequenz umfasst, die in SEQ ID NO:5 des Sequenzprotokolls gezeigt ist;
(D) ein Protein, das die Aminosäuresequenz, einschließlich Deletion, Substitution, Insertion oder Addition von 1-11 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:5 des Sequenzprotokolls umfasst und das eine Aktivität aufweist, durch die das Bakterium mit einer erhöhten Resistenz gegen L-Aminosäuren und/oder deren Analoga versehen wird.
Die Zahl "einige" Aminosäuren schwankt in Abhängigkeit von der Position oder der Art der Aminosäurereste in der dreidimensionalen Struktur des Proteins. Sie ist 2 bis 24, vorzugsweise 2 bis 12 und stärker bevorzugt 2 bis 5 für Protein (A) und 2 bis 11, vorzugsweise 2 bis 7, stärker bevorzugt 2 bis 5 für das Protein (C).
Erhöhte Resistenz gegen L-Aminosäuren und/oder deren Analoga bedeutet die Fähigkeit eines Bakteriums, auf einem Minimalmedium zu wachsen, welches eine L-Aminosäure oder deren Analogon in einer Konzentration enthält, bei der der unmodifizierte Stamm oder der Wildtypstamm oder der Elternstamm des Bakteriums nicht wachsen kann, oder die Fähigkeit eines Bakteriums, auf einem Medium, welches die L-Aminosäure oder deren Analogon enthält, schneller zu wachsen, als der unmodifizierte Stamm oder der Wildtypstamm oder der Elternstamm des Bakteriums.
Konkreter lässt sich sagen, dass ein Stamm von E. coli eine erhöhte Resistenz gegen eine L-Aminosäure oder deren Analogon hat, wenn der Stamm nach 2–4-tägiger Inkubation bei 37°C auf einer Platte mit festem Adams-Medium eine Kolonie bildet, die größer als die des unmodifizierten Stammes oder des Wildtypstammes von E. coli ist, wenn der Stamm auf einem Agarmedium, welche die L-Aminosäure oder deren Analogon enthält, unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird. Der Ausdruck "geeignete Bedingung" bezieht sich auf die Temperatur, den pH, die Luftzufuhr oder das optionale Vorhandensein von notwendigen Nährstoffen oder dergleichen für den zu kultivierenden E. coli-Stamm.
Beispiele für L-Aminosäure-Analoga sind 3,4-Dihydroprolin, DL-Thiaisoleucin, DL-o-Methylserin, 4-Azaleucin, Norleucin, L-o-Fluorphenylalanin und DL-o-Fluorphenylalanin, Homoserin, 6-Diazo-5-oxo-L-norleucin und DL-β-Hydroxynorvalin.
Die erwähnte Konzentration einer L-Aminosäure oder deren Analogon, bei der der unmodifizierte Stamm oder der Wildtyp stamm des Bakteriums nicht wachsen kann, variiert sehr stark (von 0,5 μg/ml für DL-Thiaisoleucin bis 9600 μg/ml für DL-o-Methylserin) in Abhängigkeit von der Struktur der verwendeten Verbindung. So beträgt zum Beispiel diese Konzentration im Allgemeinen 7 bis 70 μg/ml, vorzugsweise 20 bis 25 μg/ml im Fall von 3,4-Dihydroprolin, im Allgemeinen 0,5 bis 5 μg/ml, vorzugsweise 0,9 bis 1,1 im Fall von DL-Thiaisoleucin, im Allgemeinen 1100 bis 9600 μg/ml, vorzugsweise 3000 bis 3500 im Fall von DL-o-Methylserin, im Allgemeinen 15 bis 150 μg/ml, vorzugsweise 40 bis 50 μg/ml im Fall von 4-Azaleucin, im Allgemeinen 150 bis 1500 μg/ml, vorzugsweise 450 bis 550 μg/ml im Fall von Norleucin, im Allgemeinen 0,6 bis 6 μg/ml, vorzugsweise 1,5 bis 2 μg/ml im Fall von L-o-Fluorphenylalanin, im Allgemeinen 2 bis 20 μg/ml, vorzugsweise 5 bis 7 μg/ml im Fall von DL-o-Fluorphenylalanin, und im Allgemeinen 330 bis 3300 μg/ml, vorzugsweise 900 bis 1100 μg/ml im Fall von Homoserin, im Allgemeinen 5 bis 50 μg/ml, vorzugsweise 12 bis 18 im Fall von 6-Diazo-5-oxo-L-norleucin, und im Allgemeinen 25 bis 250 μg/ml, vorzugsweise 70 bis 90 μg/ml im Fall von DL-β-Hydroxynorvalin.
Empfindlichkeit gegen L-Aminosäuren und/oder deren Analoga bedeutet die Fähigkeit eines Bakteriums, in einer längeren Vermehrungszeit auf einem Minimalmedium, das eine Konzentration einer L-Aminosäure oder deren Analogon enthält, zu wachsen, als der unmodifizierte Stamm oder der Wildtypstamm.
Alternativ bedeutet die Empfindlichkeit (Sensibilität) gegen L-Aminosäuren und/oder deren Analoga die Fähigkeit eines Bakteriums, auf einem Minimalmedium, welches eine L-Aminosäure oder deren Analogon in einer Konzentration enthält, bei welcher der unmodifizierte Stamm oder der Wildtypstamm des Bak teriums wächst, nicht zu wachsen. Ein Beispiel für ein solches L-Aminosäure-Analogon ist S-(2-Aminoethyl)-cystein. Die vorstehend erwähnte Konzentration beträgt im Allgemeinen 0,2 bis 2,0 μg/ml, vorzugsweise 0,5 bis 1,0 μg/ml im Fall von S-(2-Aminoethyl)-cystein.
Das erfindungsgemäße Bakterium umfasst auch eines, in dem die Aktivitäten der Proteine gemäß der Erfindung durch Transformation des Bakteriums mit einer DNA, die für ein in (A) oder (B) und (C) oder (D) definiertes Protein codiert oder durch Änderung der Promotersequenz der DNA auf dem Chromosom des Bakteriums erhöht worden sind.
Die DNA, die für die Modifizierung des erfindungsgemäßen Bakteriums verwendet wird, codiert für ein putatives Membranprotein. Konkret codiert die DNA für ein Protein, das 4 oder mehr Transmembran-Segmente aufweist. Eine solche DNA kann für Proteine mit einer Aktivität für die Exkretion von L-Aminosäure codieren. Konkreter wird die DNA durch die Gene b2682 und b2683 repräsentiert. Es ist erforderlich, festzuhalten, dass die codierende Region des Gens b2682 in Position 728-738 und die codierende Region des Gens b2683 in Position 1-11 überlappen. Beide Gene können beispielsweise durch PCR als einziges PCR-Produkt unter Verwendung von Primern erhalten werden, welche die in SEQ ID NO:1 und 2 gezeigte Nucleotidsequenz haben.
Die Analyse der vollständigen Genomsequenz von Escherichia coli ermöglichte es, die Gene zu selektieren, die für Proteine mit 4 oder mehr putativen TMS codieren. Proteine mit bekannter Funktion und Transportproteine, die von Paulsen I. T., Sliwinski M. I., Saier M. H. (J.Mol.Biol., 1998, 277, 573) und Lipton K. J., Higgins C. F.(Molecular Microbiology, 1998, 28(1), 5) beschrieben sind, wurden aus der zu selektie renden Gruppe ausgeschlossen. Als Ergebnis einer intensiven Selektion unter den verbleibenden Genen wurden mehrere Gene ausgewählt, die für wahrscheinliche Membran-Exporter codieren. Es wurde gefunden, dass die Überexpression der Gene b2682 und b2683 die L-Aminosäureproduktion durch einen L-Aminosäure-produzierenden Stamm erhöht.
Die DNA gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst eine DNA, die für das Protein codiert, wobei die Deletion, Substitution, Insertion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren in einer oder mehr Positionen des Proteins (A) oder (C) eingeschlossen ist, solange diese die Aktivität des Proteins nicht verlieren. Die Anzahl "mehrere" Aminosäuren differiert in Abhängigkeit von der Position oder der Art der Aminosäurereste in der dreidimensionalen Struktur des Proteins und ist 2 bis 24, vorzugsweise 2 bis 12 und stärker bevorzugt 2 bis 5 für das Protein (A), und 2 bis 11, vorzugsweise 2 bis 7, und stärker bevorzugt 2 bis 5 für das Protein (C).
Die DNA, die für im Wesentlichen das gleiche Protein wie das in (A) oder in (C) definierte Protein codiert, kann beispielsweise durch Modifizieren der Nucleotidsequenz, die für das in (A) oder in (C) definierte Protein codiert durch ortsspezifische Mutagenese, sodass ein oder mehr Aminosäurereste entfernt, ersetzt, eingefügt oder hinzugefügt werden, erhalten werden. Eine solche modifizierte DNA kann mit Hilfe üblicher Methoden durch Behandlung mit Reagenzien und unter Bedingungen, bei der Mutationen erzeugt werden, erhalten werden. Eine solche Behandlung umfasst die Behandlung der für erfindungsgemäße Proteine codierenden DNA mit Hydroxylamin oder Behandlung des Bakteriums, welches die DNA enthält, mit UV-Strahlung oder einem Reagens, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin oder salpetriger Säure.
Die DNA gemäß der Erfindung umfasst Varianten, die in den verschiedenen Stämmen zu finden sind, und Varianten von Bakterien der Gattung Escherichia gemäß der natürlichen Vielfalt. Die für solche Varianten codierende DNA kann durch Isolieren der DNA, die mit dem Gen b2862 oder dem Gen b2683 oder einem Teil der Gene unter stringenten Bedingungen hybridisiert und für das Protein codiert, das die L-Aminosäureproduktion erhöht, erhalten werden. Die hier verwendete Bezeichnung "stringente Bedingungen" bedeutet Bedingungen, unter denen ein so genanntes spezifisches Hybrid gebildet wird, aber ein nicht-spezifisches Hybrid nicht gebildet wird. So umfassen beispielsweise stringente Bedingungen solche Bedinungen, unter denen DNAs mit hoher Homologie, beispielsweise DNAs mit einer Homologie von nicht weniger als 70% miteinander hybridisiert werden. Alternativ sind Beispiele für stringente Bedingungen solche Bedingungen, welche die üblichen Waschbedingungen bei der Southern-Hybridisierung, z. B. 60°C, 1 x SSC, 0,1% SDS, vorzugsweise 0,1 x SSC, 0,1% SDS, einschließen. Als Sonde für die DNA, die für Varianten codiert und mit dem Gen b2862 oder b2683 hybridisiert, kann auch eine Teilsequenz der Nucleotidsequenz SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:5 verwendet werden. Eine solche Sonde kann durch PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden hergestellt werden, die auf Basis der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:3 oder 5 als Primer und mit einem DNA-Fragment, welches die Nucleotidsequenz SEQ ID NO:3 oder 5 enthält, als Templat, hergestellt werden. Wenn ein DNA-Fragment einer Länge von etwa 300 bp als Sonde verwendet wird, bestehen die Waschbedingungen für die Hybridisierung beispielsweise aus den Bedingungen 50°C, 2 x SSC, und 0,1% SDS.
Die Transformation eines Bakteriums mit der für ein Protein codierenden DNA bedeutet das Einschleusen der DNA in die Bakterienzelle beispielsweise mit konventionellen Methoden, um die Expression des für das erfindungsgemäße Protein codierenden Gens zu erhöhen und die Aktivität des Proteins in den Bakterienzellen zu verstärken.
Methoden zum Verbessern der Genexpression umfassen Methoden, welche die Kopienzahl des Gens erhöhen. Das Einführen eines Gens in einen Vektor, der befähigt ist, in einem Bakterium der Gattung Escherichia zu wirken, erhöht die Kopienzahl des Gens. Zu diesem Zweck können vorzugsweise Mehrkopienvektoren verwendet werden. Beispiele für einen Mehrkopienvektor sind pBR322, pMW119, pUC19, pET22b oder dergleichen.
Außerdem kann eine Erhöhung der Genexpression durch Einführen von Mehrfachkopien des Gens in das Chromosom des Bakteriums erzielt werden, beispielsweise mit Hilfe der Methode der homologen Rekombination oder dergleichen.
Wenn die Expression von zwei oder mehr Genen erhöht wird, können die Gene zusammen in dem gleichen Plasmid oder gesondert in unterschiedlichen Plasmiden enthalten sein. Es ist außerdem möglich, dass eines der Gene auf dem Chromosom ist und das andere Gen sich in einem Plasmid befindet.
Andererseits kann eine Erhöhung der Genexpression durch Änderung der Expressions-Regulationssequenz des Gens erreicht werden. Die Änderung der Expressions-Regulationssequenz des Gens umfasst das Einführen einer Mutation in die inhärente Expressions-Regulationssequenz des Gens, wie einen Promoter, sodass die Expression des Gens verstärkt wird (WO00/18935) und Anordnen der erfindungsgemäßen DNA unter der Kontrolle eines wirksamen Promoters. So sind als wirksame Promoter bei spielsweise der lac-Promoter, trp-Promoter, trc-Promoter, P_L-Promoter des Lambdaphagen bekannt. Die Verwendung eines wirksamen Promoters kann mit einer Vermehrung der Kopien des Gens kombiniert werden.
Das erfindungsgemäße Bakterium kann durch Einschleusen der vorstehend genannten DNAs in ein Bakterium, das eine eigene Fähigkeit zur Bildung eines L-Aminosäure hat, erhalten werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Bakterium dadurch erhalten werden, dass einem Bakterium, welches die DNAs bereits enthält, die Fähigkeit zur Produktion von L-Aminosäure verliehen wird. Als Elternstamm, in dem die Aktivität der erfindungsgemäßen Proteine verstärkt werden soll, können L-Threonin-produzierende Bakterien der Gattung Escherichia, wie die Stämme VL2054 (VKPM B-8067), VNIIGenetika 472T23 (US-Patent Nr. 5,631,157), VKPM B-3996 (US-Patent Nr. 5,175,107 und 5,976,843), KCCM-10132 (WO009660A1), KCCM-10133 (WO009661A1) oder dergleichen verwendet werden. Als Elternstämme, in denen die Aktivitäten der erfindungsgemäßen Proteine verstärkt werden sollen, werden auch L-Valin-produzierende Bakterien der Gattung Escherichia, wie H-81 (VKPM B-8066), NRRL B-12287 und NRRL B-12288 (US-Patent Nr. 4,391,907), VKPM B-4411 (US-Patent Nr. 5,658,766), VKPM B-7707 (Europäische Patentveröffentlichung Nr. EP1016710A2 ) oder dergleichen verwendet. Außerdem werden als Elternstämme, in denen die Aktivitäten der erfindungsgemäßen Proteine verstärkt werden sollen, L-Prolin-produzierende Bakterien der Gattung Escherichia, wie NRRL B-12403 und NRRL B-12404 ( GB2075056 ), VKPM B-8012 (Russische Patentveröffentlichung 2207371), Plasmidmutanten, die in dem Patent DE3127361 beschrieben sind, Plasmidmutanten, die von Bloom F. R. et al. (The 15^th Miami winter symposium, 1983, S. 34) beschrieben sind oder dergleichen verwendet. Außerdem werden als Eltern stamm mit erhöhter Aktivität der erfindungsgemäßen Proteine L-Leucin-produzierende Bakterien der Gattung Escherichia verwendet, wie H-9070 (FERM BP-4704) und H-9072 (FERM BP-4706) ( US5744331 ), VKPM B-7386 und VKPM B-7388 ( RU2140450 ), W1485atpA401/pMWdAR6, W14851ip2/pMWdAR6 und AJ12631/pMWdAR6 ( EP0872547 ) oder dergleichen.
Ebenfalls verwendet als Elternstämme, in denen die Aktivitäten der Proteine gemäß der Erfindung erhöht werden sollen, eignen sich L-Methionin-produzierende Bakterien der Gattung Escherichia, wie AJ11539 (NRRL B-12399), AJ11540 (NRRL B-12400), AJ11541 (NRRL B-12401), AJ 11542 (NRRL B-12402) ( GB2075055 ) oder dergleichen.
Weiterhin können als Elternstamm, in dem die Aktivität der erfindungsgemäßen Proteine verstärkt werden soll, L-Arginin-produzierende Bakterien der Gattung Escherichia verwendet werden, wie die Stämme AJ11531 und AJ11538 ( JP56106598A2 ), AJ11593 (FERM P-5616) und AJ11594 (FERM P-5617) (offen gelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 57-5693) oder dergleichen.
Das erfindungsgemäße Bakterium kann außerdem mit verstärkter Expression eines oder mehrerer Gene, die an der Biosynthese von L-Aminosäuren beteiligt sind, ausgestattet werden. Beispiele für solche Gene, für L-Threonin-produzierende Bakterien sind das Threonin-Operon, das vorzugsweise ein für Aspartatkinase codierendes Gen umfasst, Homoserindehydrogenase, dessen Rückkopplungshemmung durch L-Threonin desensibilisiert ist (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 1-29559). Beispiele für solche Gene sind das ilv-Operon, d. h. ilvGMEDA-Operon, welches nicht bevorzugt Threonindeaminase exprimiert und dessen Attenuation unterdrückt ist (Japanische offen gelegte Patentveröffentlichung Nr. 8-47397) für L-Valin produzierende Bakterien. Beispiele für solche Gene sind Gene für die L-Prolin-Biosynthese, die vorzugsweise durch das für Glutamatkinase codierende Gen proB, dessen Rückkopplungshemmung durch L-Prolin desensibilisiert ist ( DE3127361 ) repräsentiert, für L-Prolin produzierende Bakterien. Weitere Beispiele für solche Gene sind für L-Leucin-produzierende Bakterien das Leucin-Operon, d. h. leu-Operon, das vorzugsweise ein für Isopropylmalatsynthase codierendes Gen umfasst, dessen Rückkopplungshemmung durch L-Leucin desensibilisiert ist (Russische Patentveröffentlichung 2201454). Ein weiteres Beispiel für solche Gene ist das Methionin-Regulon, für L-Methionin-produzierende Bakterien. Das Methionin-Regulon kann mutierte Gene, die für Proteine codieren, aufweisen, deren Aktivität zur Repression der Aminosäure-Biosynthese vermindert ist. Ein Beispiel für ein solches Gen ist die Variante des metJ-Gens, das für ein Repressorprotein bei der Biosynthese von L-Methionin codiert, von E. coli, dessen Aktivität zur Repression der Methionin-Biosynthese vermindert ist (JP 2000-157267 A2). Ein weiteres Beispiel für ein solches Gen ist das Arginin-Regulon, das vorzugsweise ein Gen umfasst, welches für N-Acetylglutamatsynthase codiert, dessen Rückkopplungshemmung durch L-Arginin desensibilisiert ist (Rajagopal B. S. et al, Appl. Environ. Microbiol., 1998, v. 64, Nr. 5, s.1805-1811).
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, das folgende Stufen umfasst: Kultivieren des erfindungsgemäßen Bakteriums in einem Kulturmedium, um zu ermöglichen, dass L-Threonin in dem Kulturmedium gebildet und angereichert wird, und Gewinnen von L-Threonin aus dem Kulturmedium. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst auch ein Verfahren zur Herstellung von L-Valin, welches folgende Stufen umfasst: Kultivieren des erfindungsgemäßen Bak teriums in einem Kulturmedium, um zu ermöglichen, dass L-Valin in dem Kulturmedium gebildet und angereichert wird, und Gewinnen von L-Valin aus dem Kulturmedium. Ferner umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zur Herstellung von L-Prolin, welches folgende Stufen umfasst: Kultivieren des erfindungsgemäßen Bakteriums in einem Kulturmedium, um zu ermöglichen, dass L-Prolin in dem Kulturmedium gebildet und angereichert wird, und Gewinnen von L-Prolin aus dem Kulturmedium. Weiterhin umfasst das erfindungsgemäße Verfahren ein Verfahren zur Herstellung von L-Leucin, das folgende Stufen umfasst: Kultivieren des erfindungsgemäßen Bakteriums in einem Kulturmedium, um die Bildung und Anreicherung von L-Leucin in dem Kulturmedium zu ermöglichen und Gewinnen von L-Leucin aus dem Kulturmedium. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst außerdem ein Verfahren zur Herstellung von L-Methionin, das folgende Stufen umfasst: Kultivieren des erfindungsgemäßen Bakteriums in einem Kulturmedium, um die Bildung und Anreicherung von L-Methionin in dem Kulturmedium zu ermöglichen und Gewinnen von L-Methionin aus dem Kulturmedium.
Erfindungsgemäß kann das Kultivieren, das Gewinnen und die Reinigung einer L-Aminosäure aus dem Medium und dergleichen in gleicher Weise wie bei der konventionellen Fermentationsmethode erfolgen, bei der eine Aminosäure unter Verwendung eines Mikroorganismus hergestellt wird. Das für die Kultur verwendete Medium kann entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches Medium sein, solange das Medium eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralien und erforderlichenfalls geeignete Mengen an Nährstoffen enthält, welche die Mikroorganismen für das Wachstum benötigen. Die Kohlenstoffquelle kann verschiedene Kohlenhydrate, wie Glucose und Saccharose, und verschiedene organische Säuren umfassen. In Abhängigkeit von dem Assimilationsmodus des verwendeten Mikroorganismus kann ein Alkohol, einschließlich Ethanol und Glycerin, verwendet werden. Als Stickstoffquelle werden verschiedene Ammoniumsalze, wie Ammoniak und Ammoniumsulfat, andere Stickstoffverbindungen, wie Amine, natürliche Stickstoffquellen, wie Pepton, Sojabohnenhydrolysat und verdaute fermentative Mikroorganismen verwendet. Als Mineralien eignen sich Kaliummonophosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat, Calciumchlorid und dergleichen.
Das Kultivieren erfolgt vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, wie als Schüttelkultur und Rührkultur unter Belüftung bei einer Temperatur von 20 bis 40°C, vorzugsweise 30 bis 38°C. Der pH der Kultur liegt gewöhnlich zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,2. Der pH-Wert der Kultur kann mit Ammoniak, Calciumcarbonat, verschiedenen Säuren, verschiedenen Basen und Puffern eingestellt werden. Gewöhnlich führt eine 1- bis 5-tägige Kultur zur Anreicherung der gewünschten L-Aminosäure in dem flüssigen Medium.
Nach der Kultur können Feststoffe, wie Zellen, aus dem flüssigen Kulturmedium durch Zentrifugieren oder Membranfiltration entfernt werden und die gewünschte L-Aminosäure kann gewonnen und durch Ionenaustausch, Konzentrations- und Kristallisationsmethoden gereinigt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt die Konstruktion des Plasmids pΔlacZ.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend genauer unter Bezugnahme auf Beispiele erläutert. In den Beispielen hat eine Aminosäure die L-Konfiguration, wenn nichts anderes angegeben ist.
Beispiel 1: Klonieren der Gene b2682 und b2683 auf dem Plasmid pΔlacZ
Zum Klonieren der Gene b2682 und b2683 wurde der Vektor pΔlacZ verwendet. Der Vektor pΔlacZ ist ein Derivat des Vektors pET-22b(+) (Novagen, Madison, WI, USA). pET-22b(+) wurde mit BglII und XbaI behandelt und mit dem Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Fragment von Plasmid pMB9-lac (Fuller F., Gene, 19, 43-54, 1982) ligiert, das mit den gleichen Restriktionsendonucleasen behandelt wurde und den P_lac UV5-Promoter trägt. Zum Amplifizieren des P_lac UV5-Promoterfragments durch PCR wurden Primer mit den in SEQ ID NO:7 und 8 gezeigten Sequenzen verwendet. Das resultierende Plasmid wurde mit dem Strukturteil des lacZ-Gens (237 bp ohne Promoter) ergänzt, indem das Sa1I-BamHI-Fragment des Plasmids pJEL250 kloniert wurde (Dymakova E. et al., Genetika (rus), 35, 2, 181-186, 1999). Das Schema zur Herstellung des Vektors pΔlacZ ist in 1 gezeigt.
Das Ausgangsmaterial zum Klonieren der angenommenen Leseraster von E. coli b2682 und b2683 (Gene b2682 und b2683) war das PCR-Fragment, welches unter Verwendung von DNA aus E. coli-Stamm TG1 als Templat erhalten wurde. Für die Synthese dieses Fragments wurden zwei Primer mit den in SEQ ID NO:1 und 2 gezeigten Sequenzen verwendet. PCR wurde in dem "Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400" unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 40 sec bei 95°C, 40 sec bei 47°C, 40 sec bei 72°C, 30 Zyklen. Somit wurde das lineare DNA-Fragment von 1158 bp, welches die Gene b2682 und b2683 enthielt, erhalten.
Dieses PCR-Fragment wurde mit den Restriktasen XbaI und BamHI behandelt und in dem Mehrkopienvektor pΔlacZ, der vorher mit den gleichen Restriktasen behandelt worden war, eingefügt.
Das resultierende Plasmid mit dem PCR-Fragment wurde als pYGAZH gezeichnet und enthielt beide Gene b2682 und b2683 unter der Kontrolle des Lactose-Promoters (P_lac UV5).
Beispiel 2: Einfluss der amplifizierten Gene b2682 und b2683 auf die Resistenz von E. coli-Stamm TG1 gegen Aminosäuren und deren Analoga
E. coli-Stamm TG1(pYGAZH), TG1(pYCHE), TG1(pYHGN) und Stamm TG1 mit einem Vektor ohne Insertion (Kontrollstamm) wurden über Nacht auf einem LB-Medium, das mit Ampicillin ergänzt war (100 μg/ml) gezüchtet. Die über Nacht erhaltenen Kulturen aller Stämme wurden in frischem LB-Medium, das mit Ampicillin (100 μg/ml) und IPTG (0,5 mM) ergänzt war, auf das 25-fache verdünnt und 2 Stunden unter Belüftung bei 37°C inkubiert. Die log-Phasen-Kulturen wurden in einer 0,9%igen Lösung von NaCl verdünnt und etwa 1000 Zellen wurden auf Platten mit festem Adams-Medium, das mit Ampicillin (100 μg/ml) IPTG (0,5 mM) und einer Aminosäure oder deren Analogon supplementiert war, aufgeimpft. Nach 2-4-tägiger Inkubation bei 37°C wurden die Unterschiede in der Koloniegröße und der Koloniezahl zwischen dem Stamm TG1 mit einem Hybridplasmid und dem Kontrollstamm TG1 registriert. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1

Keine:: kein Unterschied im Vergleich zu dem Kontrollstamm
R:: mehr Kolonien oder erhöhte Koloniegröße
S:: weniger Kolonien oder geringere Koloniegröße im Vergleich zu dem Kontrollstamm

Beispiel 3: Produktion von Threonin durch einen Stamm mit dem Plasmid pYGAZH
Der Threonin-erzeugende Stamm VL2054 wurde durch das Plasmid pYGAZH, welches die Gene b2682 und b2683 unter der Kontrolle des P_lac-UV5-Promoters trägt, transformiert. Der erhaltene Stamm wurde als VL2054(pYGAZH) bezeichnet. Der Stamm VL2054 ist ein Derivat des Stammes VKPM B-3996 und trägt auf seinem Chromosom:

a) das integrierte Threonin-Operon unter der Kontrolle des P_R-Promoters
b) Das Wildtyp-rhtA-Gen
c) das inaktivierte chromosomale Gen, das für Transhydrogenase codiert (tdh-Gen) und das inaktivierte Kanamycin-Resistenzgen (kan)-Gen in Tn5 (tdh:Tn5, Kan^S)
d) die Mutation ilvA₄₄₂.

Der Stamm VL2054 wurde am 30. Januar 2001 unter der Hinterlegungsnummer VKPM B-8067 bei der Russischen Nationalsammlung für industrielle Mikroorganismen (VKPM) (Russia 113545, Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1) hinterlegt und aus der ursprünglichen Hinterlegung am 1. Februar 2002 in die internationale Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag übergeführt.

Die 5 Kolonien jedes Stammes VL2054, des Stammes VL2054 (pΔlacZ) als Kontrollstamm der das Plasmid ohne Insertion enthält und VL2054(pYGAZH) wurden in 2 ml Minimalmedium ((NH₄)₂SO₄ – 11 g/l; NaCl – 0,4 g/l; MgSO₄ – 0,4 g/l; K₂HPO₄ – 1 g/l; FeSO₄ – 10 mg/l; MnSO₄ – 10 mg/l; Thiamin – 0,1 mg/l; Hefeextrakt – 0,5 g/l; Glucose – 40 g/l; Ampicillin – 300 mg/l falls erforderlich) in 20 ml-Reagenzgläsern suspendiert und über Nacht unter Belüftung bei 32°C inkubiert. 0,2 ml jeder der über Nacht erhaltenen Kulturen wurde in drei 20 ml- Reagenzgläser mit 2 ml frischem Medium für die Fermentation mit oder ohne IPTG übergeführt und 48 oder 72 Stunden bei 32°C mit einem Rotationsschüttler kultiviert. Zusammensetzung des Fermentationsmediums:

(NH₄)₂SO₄	22 g/l
NaCl	0,8 g/l
MgSO₄	0,8 g/l
K₂HPO₄	2 g/l
FeSO₄	20 mg/l
MnSO₄	20 mg/l
Thiamin	0,2 mg/l
Hefeextrakt	1 g/l
CaCO₃	30 g/l
Glucose	80 g/l
Ampicillin	300 mg/l, falls erforderlich
IPTG	0,5 mM, falls erforderlich

Nach dem Kultivieren wurden die Stabilität des Plasmids und die optische Absorption des Mediums bei 540 nm mit Hilfe von üblichen Methoden bestimmt. Die angereicherte Menge an Threonin in dem Medium wurde durch Dünnschichtchromatografie (TLC) bestimmt. Die Zusammensetzung der flüssigen Phase für die TLC war wie folgt: Isopropanol: 50 ml, Aceton: 50 ml, NH₄OH (30%): 12 ml, H₂O: 8 ml. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Wie ersichtlich ist, verbesserte das Hybridplasmid pYGAZH die Anreicherung von Threonin durch den Threoninbildenden Stamm VL2054.
Tabelle 2
Beispiel 4: Produktion von Valin durch einen Stamm mit dem Plasmid pYGAZH
Der Valin-produzierende Stamm H-81 wurde durch das Plasmid pYGAZH, welches die Gene b2682 und b2683 unter der Kontrolle des P_lac-UV5-Promoters trägt, transformiert. Der Stamm H-81 wurde am 30. Januar 2001 unter der Hinterlegungsnummer VKPM B-8066 bei der Russischen Nationalkollektion für industrielle Mikroorganismen (VKPM) (Russia 113545, Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1) hinterlegt und am 1. Februar 2002 aus der ursprünglichen Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag übergeführt.
5 Kolonien jedes Stammes H-81, H-81(pΔlacZ) als Kontrollstamm, der ein Plasmid ohne Insertion enthielt und H-81 (pYGAZH) wurden in 2 ml Minimalmedium in Reagenzgläsern suspendiert ((NH₄)₂SO₄ – 18 g/l, K₂HPO₄ – 1,8 g/l, MgSO₄ – 1,2 g/l, Thiamin – 0,1 mg/l, Hefeextrakt – 0,5 g/l, Glucose – 60 g/l, Ampicillin – 300 mg/l, falls erforderlich) und über Nacht unter Belüftung bei 32°C inkubiert. 0,2 ml jeder der über Nacht erhaltenen Kulturen wurde in drei 20 ml-Reagenzgläser mit 2 ml frischem Fermentationsmedium mit oder ohne IPTG übergeführt und bei 32°C während 48 oder 72 Stunden mit Hilfe eines Rotationsschüttlers kultiviert. Zusammensetzung des Fermentationsmediums:

(NH₄)₂SO₄ 18 g/l

K₂HPO₄ 1,8 g/l

MgSO₄ 1,2 g/l

CaCO₃ 20 mg/l

Thiamin 0,1 mg/l

Glucose 60 g/l

Ampicillin 300 mg/l, falls erforderlich

IPTG 0,5 mM, falls erforderlich
Nach dem Kultivieren wurden die Stabilität des Plasmids und die optische Absorption des Mediums bei 540 nm mit Hilfe von üblichen Methoden bestimmt. Die angereicherte Menge an Valin in dem Medium wurde durch TLC bestimmt. Die Zusammensetzung der flüssigen Phase für TLC war wie folgt: Isopropanol: 80 ml, Ethylacetat: 80 ml, NH₄OH (30%): 15 ml, H₂O: 45 ml. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Wie ersichtlich ist, verbesserte das Hybridplasmid pYGAZH die Anreicherung von Valin durch den Valin-produzierenden Stamm H-81.
Tabelle 3
Referenzbeispiel 1: Produktion von L-Prolin durch einen L-Prolin-produzierenden Stamm mit ilvA-Defizienz
Die Zellen des Wildtypstammes E. coli K12 (VKPM B-7) wurden mit einem Mutagen, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (0,1 mg/ml), 20 Minuten lang bei 37°C behandelt, gewaschen und auf ein Minimal-Agarmedium M9 aufgetragen, das mit 1,25 mg/ml Trypton, 10 mg/ml L-Prolin und 0,05 mg/ml 2,3,5-Triphenyl-tetrazoliumchlorid ergänzt war. Die meisten nach 3-tägiger Inkubation bei 37°C erschienen Kolonien waren rot gefärbt. Einige Kolonien, welche L-Prolin nicht oxidieren konnten, waren weiß. Eine dieser Kolonien wurde als Elternstamm zur Herstellung von Mutanten verwendet, die resistent gegen Prolin-Analoga (3,4-Dehydroxyprolin und Azetidin-2-carboxylat) sind, die jeweils in einer Konzentration von 2 mg/ml in M9-Agarmedium gegeben wurden.
Einige der aufgetretenen Mutanten konnten L-Prolin produzieren. Der beste L-Prolin-produzierende Stamm 702 wurde mit einem P1-Bakteriophagen behandelt, der auf Zellen des Stammes TG1 gewachsen war, in welchem das Gen ilvA durch Insertion eines Chloramphenicol (Cm)-Resistenz-Gen (Cm^r) zerstört war. Eine der erhaltenen Cm-resistenten Transduktanten, 702ilvA, die sich als L-Isoleucin-auxotroph erwies, war ein weit wirksamerer L-Prolin-Erzeuger als der L-Isoleucin-prototrophe Elternstamm 702 (Tabelle 4). Das Fermentationsmedium enthielt 60 g/l Glucose, 25 g/l Ammoniumsulfat, 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄, 0,1 mg/l Thiamin, 50 mg/l L-Isoleucin und 25 g/l Kreide (pH 7,2). Glucose und Kreide wurden separat sterilisiert. 2 ml des Mediums wurden in Reagenzgläser gegeben und mit einer Schleife des getesteten Mikroorganismus inokuliert und die Kultivierung erfolgte bei 37°C während 2 Tagen unter Schütteln.
Tabelle 4
Die Stämme 702 und 702ilvA sind seit 25. Juli 2000 unter den Hinterlegungsnummern VKPM B-8011 und VKPM B-8012 bei der Russischen Nationalkollektion von industriellen Mikroorganismen (VKPM) hinterlegt.
Beispiel 5: Produktion von Prolin durch einen Stamm mit dem Plasmid pYGAZH
Der Prolin-produzierende Stamm E. coli 702ilvA wurde mit Hilfe des Plasmids pYGAZH, welches die Gene b2682 und b2683 unter der Kontrolle des P_lac-UV5-Promoters trägt, transformiert.

5 Kolonien jedes Stammes 702ilvA, 702ilvA(pΔlacZ) als Kontrollstamm, der das Plasmid ohne Insertion enthielt, und 702ilvA(pYGAZH) wurden in 2 ml Minimalmedium ((NH₄)₂SO₄ – 18 g/l, K₂HPO₄ – 1,8 g/l, MgSO₄ – 1,2 g/l, Thiamin – 0,1 mg/l, Hefeextrakt – 0,5 g/l, Glucose – 60 g/l, Isoleucin – 50 mg/l, Ampicillin – 300 mg/l, falls erforderlich) in 20 ml-Reagenzgläsern suspendiert und über Nacht unter Belüftung bei 32°C inkubiert. 0,2 ml jeder der über Nacht erhaltenen Kulturen wurde in drei 20 ml-Reagenzgläser mit 2 ml frischem Fermen tationsmedium mit oder ohne IPTG übergeführt und 40 Stunden bei 32°C mit Hilfe eines Rotationsschüttlers kultiviert. Zusammensetzung des Fermentationsmediums:

(NH₄)₂SO₄	18 g/l
K₂HPO₄	1,8 g/l
MgSO₄	1,2 g/l
CaCO₃	20 mg/l
Thiamin	0,1 mg/l
Glucose	60 g/l
Isoleucin	60 g/l
Ampicillin	300 mg/l, falls erforderlich
IPTG	0,5 mM, falls erforderlich

Nach dem Kultivieren wurden die Stabilität des Plasmids und die optische Absorption des Mediums bei 540 nm mit Hilfe von üblichen Methoden bestimmt. Die in dem Medium angereicherte Menge an Prolin wurde durch TLC bestimmt. Die Zusammensetzung der flüssigen Phase für TLC war wie folgt: Ethanol: 80 ml, NH₄OH (30%): 5 ml, H₂O: 25 ml. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Wie ersichtlich ist, verbesserte das Hybridplasmid pYGAZH die Anreicherung von Prolin durch den Prolin-produzierenden Stamm 702ilvA.
Tabelle 5
Referenzbeispiel 2: Produktion von L-Leucin durch einen ilvE-defizienten L-Leucin-produzierenden Stamm
Die Zellen des Wildtypstamms E. coli K12 (VKPM B-7) wurden 20 Minuten bei 37°C mit einem Mutagen, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (0,05 mg/ml), behandelt, 4-mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und auf ein Minimal-Agarmedium M9 aufplattiert, das mit 4,0 mg/ml DL-4-Azaleucin ergänzt war. Die Platten wurden 5 Tage bei 37°C inkubiert. Auf den Platten erschienene Kolonien wurden aufgenommen und durch Aufstreichen auf L-Agar-Platten gereinigt. Eine der erhaltenen gegen DL-4-Azaleucin resistenten Mutanten wurde zur Induktion der L-Isoleucin- und L-Valin-Doppelauxotrophie verwendet. Es wurden zahllose Doppelauxotrophe erhalten, die L-Isoleucin- und L-Valin zum Wachstum benötigen. Es wurde gezeigt, dass die Doppelauxotrophie für L-Isoleucin- und L-Valin durch Mutation in dem ilvE-Gen verursacht war. Unter den erhaltenen Doppelauxotrophen wurde der beste L-Leucinproduzierende Stamm, Stamm 505 selektiert, der 1,8 g/l L-Leucin produzierte. Das Fermentationsmedium enthielt 60 g/l Glucose, 25 g/l Ammoniumsulfat, 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄, 0,1 mg/l Thiamin, 100 mg/l L-Isoleucin, 100 mg/l L-Valin und 25 g/l Kreide (pH 7,2). Glucose und Kreide wurden gesondert sterilisiert. 2 ml des Mediums wurden in Reagenzgläser gegeben und mit einer Schleife des Testmikroorganismus inokuliert und das Kultivieren erfolgte 2 Tage unter Schütteln bei 37°C.
Der Stamm E. coli 505 wurde am 14. Mai 2001 unter der Hinterlegungsnummer VKPM B-8124 bei der Russischen Nationalkollektion für industrielle Mikroorganismen (VKPM) (Russia 113545, Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1) hinterlegt und aus der ursprünglichen Hinterlegung am 1. Februar 2002 in die inter nationale Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag übergeführt.
Beispiel 6: Produktion von Leucin durch einen Stamm mit dem Plasmid pYGAZH
Der Leucin-produzierende Stamm E. coli 505 wurde durch das Plasmids pYGAZH, der die Gene b2682 und b2683 unter der Kontrolle des P_lac-UVS-Promoters enthielt, transformiert.

20 Kolonien jedes Stammes 505, 505(pΔlacZ) als Kontrollstamm, der das Plasmid ohne Insertion enthielt, und 505 (pYGAZH) wurden in Form einer Schleife der Kultur in 20 ml-Reagenzgläser mit L-Brühe mit oder ohne Ampicillin übergeführt und über Nacht unter Belüften bei 32°C inkubiert. 0,1 ml jeder der über Nacht erhaltenen Kulturen wurde in 20 ml-Reagenzgläser (Innendurchmesser 22 mm) übergeführt, in 2 ml Fermentationsmedium mit oder ohne IPTG suspendiert und 72 Stunden in einem Rotationsschüttler bei 32°C kultiviert. Zusammensetzung des Fermentationsmediums:

(NH₄)₂SO₄	15 g/l
K₂HPO₄	1,5 g/l
MgSO₄ × 7H₂O	1,0 g/l
CaCO₃	20 g/l (gesondert sterilisiert)
Thiamin	0,1 mg/l
Glucose	60 g/l (gesondert sterilisiert)
Isoleucin	0,3 g/l
Valin	0,3 g/l
Ampicillin	150 mg/l, falls erforderlich
IPTG	0,5 mM, falls erforderlich

Nach dem Kultivieren wurde die Stabilität des Plasmids mit Hilfe einer üblichen Methode bestimmt. Die angereicherte Menge an Leucin in dem Medium wurde durch TLC bestimmt. Die Zusammensetzung der flüssigen Phase für TLC war wie folgt: Isopropanol: 80 ml, Ethylacetat: 80 ml, NH₄OH (30%): 25 ml, H₂O: 50 ml. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Wie ersichtlich ist, verbesserte das Hybridplasmid pYGAZH die Leucin-Anreicherung durch den Leucin-produzierenden Stamm 505.
Tabelle 6
Referenzbeispiel 3: Produktion von L-Methionin durch einen L-Methionin-produzierenden Stamm der gegen Norleucin resistent ist
Der plasmidlose Threonin- und Leucin-defiziente Stamm E. coli C600 wurde als Elternstamm verwendet. Zuerst wurden Leu⁺-Varianten des Stammes E. coli C600 durch Transduktion mit dem Phagen P1 erhalten, der auf dem Stamm E. coli K-12 gewachsen war. Dann wurde nach der Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) der Mutantenstamm 44, der gegen 8 g/l L-Homoserin resistent war, erhalten. Stamm 44 ist L-Threonin-defizient und resistent gegen hohe Konzentrationen von L-Homoserin. Stamm 44 wurde bei der Russischen Nationalkollektion für industrielle Mikroorganismen (VKPM)unter der Hinterlegungsnummer VKPM B-2175 hinterlegt.
Dann wurden aus Stamm 44 durch Mutagenese unter Verwendung von NTG Mutantenstämme induziert, die gegen ein Methionin-Analogon, Norleucin, resistent sind. Die Zellen der über Nacht in L-Brühe gewachsenen Kultur wurden abgeschleudert und erneut in physiologischer Kochsalzlösung (0,9% NaCl), die 50 μg/ml NTG enthielt, suspendiert. Nach 30 minütigem Einwirken von NTG bei 37°C wurden die Zellen abgeschleudert, viermal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und auf Minimal-Agarmedium M9 aufgestrichen, das 0,5 mg/ml Threonin und 2,5 mg/ml oder 5,0 mg/ml Norleucin enthielt. Die Platten wurden 5 Tage bei 37°C inkubiert. Auf den Platten erschienene Kolonien wurden aufgenommen und durch Aufstreichen auf L-Agar-Platten gereinigt. Der beste L-Methionin-produzierende Stamm unter diesen war Stamm 218. Das Kultivieren des neuen Stammes 218 im Reagenzglas während 3 Tagen bei 32°C unter Schütteln führt zur Anreicherung von etwa 1 g/l L-Methionin in dem Kulturmedium. Als Fermentationsmedium wurde Minimalmedium M9 verwendet, das 4% Glucose, 2,5% Ammoniumsulfat, 0,5 g/l Threonin, 25 g/l Calciumcarbonat enthielt. Glucose und Kreide wurden gesondert sterilisiert.
Der Stamm 218 ist seit 14. Mai 2001 unter der Hinterlegungsnummer VKPM B-8124 bei der Russischen Nationalkollektion für industrielle Mikroorganismen (VKPM) hinterlegt und wurde aus der ursprünglichen Hinterlegung am 1. Februar 2002 in eine internationale Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag übergeführt.
Außerdem wurde die Deletion des ppc-Gens vermittels des Phagen P1 in den Stamm 218 eingeführt, wonach das pycA-Gen aus Bacillus subtilis eingefügt wurde (Russische Patentveröffentlichung 2207376). Der erhaltene Stamm 218pycA hat die Resistenz gegen Norleucin verloren. Daher wurde dem Stamm wieder Resistenz gegen Norleucin verliehen, wie oben beschrieben ist. Der beste L-Methionin-produzierende Stamm unter den erhaltenen Stämmen war Stamm E. coli 73, der unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen etwa 1 g/l L-Methionin produzierte.
Der Stamm E. coli 73 wurde am 14. Mai 2001 unter der Hinterlegungsnummer VKPM B-8126 in der Russischen Nationalkollektion für industrielle Mikroorganismen (VKPM) (Russia 113545, Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1) hinterlegt und am 1. Februar 2002 aus der ursprünglichen Hinterlegung in eine internationale Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag übergeführt.
Beispiel 7: Produktion von Methionin durch einen Stamm mit dem Plasmid pYGAZH
Der Methionin-produzierende Stamm E. coli 73 wurde mit Hilfe des Plasmids pYGAZH, welches die Gene b2682 und b2683 unter der Kontrolle des P_lac-UV5-Promoters trägt, transformiert.

5 Kolonien jedes Stammes 73, 73(pΔlacZ) als Kontrollstamm, der das Plasmid ohne Insertion enthielt und 73(pYGAZH) wurden in 2 ml Minimalmedium in 20 ml-Reagenzgläsern suspendiert ((NH₄)₂SO₄ – 18 g/l, K₂HPO₄ – 1,8 g/l, MgSO₄ – 1,2 g/l, Thiamin – 0,1 mg/l, Hefeextrakt – 10 g/l, Glucose – 60 g/l, Threonin – 400 mg/l, Ampicillin – 300 mg/l, falls erforderlich) und über Nacht unter Belüften bei 32°C inkubiert. 0,2 ml jeder der über Nacht erhaltenen Kulturen wurde in drei 20 ml-Reagenzgläser mit 2 ml frischem Fermentationsmedium mit oder ohne IPTG übergeführt und 48 Stunden auf einem Rotationsschüttler bei 32°C kultiviert. Zusammensetzung des Fermentationsmediums:

(NH₄)₂SO₄

18 g/l

K₂HPO₄	1,8 g/l
MgSO₄	1,2 g/l
CaCO₃	20 g/l
Thiamin	0,1 mg/l
Glucose	60 g/l
Threonin	400 g/l
Hefeextrakt	1,0 g/l
Ampicillin	300 mg/l, falls erforderlich
IPTG	0,5 mM, falls erforderlich

Nach dem Kultivieren wurden die Stabilität des Plasmids und die optische Absorption des Mediums bei 540 nm mit Hilfe von üblichen Methoden bestimmt. Die angereicherte Menge an Methionin in dem Medium wurde durch TLC bestimmt. Die Zusammensetzung der flüssigen Phase für TLC war wie folgt: Isopropanol: 80 ml, Ethylacetat: 80 ml, NH₄OH (30%): 15 ml, H₂O: 45 ml. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Wie ersichtlich ist, verbesserte das Hybridplasmid pYGAZH die Anreicherung von Methionin durch den Methionin-produzierenden Stamm 73.
Tabelle 7
Sequenzprotokoll

Claims

L-Aminosäure produzierendes Bakterium der Gattung Escherichia, welches so modifiziert worden ist, daß die L-Aminosäureproduktion durch das Bakterium durch Erhöhen der Aktivitäten der Proteine, die im folgenden durch (A) oder (B) und (C) oder (D) definiert sind, in einer Zelle des Bakteriums erhöht ist: (A) ein Protein, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 des Sequenzprotokolls umfaßt; (B) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz, einschließlich Deletion, Substitution, Insertion oder Addition von 1-24 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 des Sequenzprotokols umfaßt und das eine Aktivität aufweist, durch die das Bakterium mit einer erhöhten Resistenz gegen L-Aminosäure und/oder deren Analoga versehen wird; (C) ein Protein, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:5 des Sequenzprotokolls umfaßt; (D) ein Protein, das die Aminosäuresequenz, einschließlich Deletion, Substitution, Insertion oder Addition von 1-11 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:5 des Sequenzprotokolls umfaßt und das eine Aktivität aufweist, durch die das Bakterium mit einer erhöhten Resistenz gegen L-Aminosäuren und/oder deren Analoga versehen wird, wobei die Aktivitäten der Proteine durch Transformation des Bakteriums mit DNA, die für ein in (A) oder (B) und (C) oder (D) definiertes Protein codiert, oder durch Veränderung der Promotorsequenz der DNA auf dem Chromosom des Bakteriums erhöht ist.
Bakterium nach Anspruch 1, wobei die Transformation mit einem Mehrkopienvektor durchgeführt wird.
Verfahren zum Herstellen einer L-Aminosäure, welches das Kultivieren des Bakteriums nach Anspruch 1 oder 2 in einem Kulturmedium und das Gewinnen der herzustellenden und anzuhäufenden L-Aminosäure aus dem Kulturmedium umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die L-Aminosäure L-Threonin ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Bakterium so modifiziert worden ist, daß das Bakterium eine erhöhte Expression des Threonin-Operons aufweist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die L-Aminosäure L-Valin ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Bakterium so modifiziert worden ist, daß das Bakterium eine erhöhte Expression des ilv-Operons aufweist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die L-Aminosäure L-Prolin ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Bakterium so modifiziert worden ist, daß das Bakterium eine erhöhte Expression von Genen für die Prolin-Biosynthese aufweist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die L-Aminosäure L-Leucin ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Bakterium so modifiziert worden ist, daß das Bakterium eine erhöhte Expression des leu-Operons aufweist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die L-Aminosäure L-Methionin ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Bakterium so modifiziert worden ist, daß das Bakterium eine erhöhte Expression von Genen des met-Regulons aufweist.