WO1997001637A1 - Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aminosäuren mittels rekombinanter mikroorganismen mit erhöhter sekretionsrate - Google Patents

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WO1997001637A1
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amino acid
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amino acids
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host cell
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PCT/DE1996/001162
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Axel Wehrmann
Lothar Eggeling
Reinhard Krämer
Hermann Sahm
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Forschungszentrum Jülich GmbH
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine

Definitions

  • the invention relates to a method for the microbial production of amino acids according to claims 1 to 7, a transport gene according to claim 8, vectors according to claims 9 and 10 and transformed cells according to claims 11 to 15.
  • Amino acids are of great economic interest, and the need for amino acids continues to increase.
  • L-tryptophan is required as a medication and as an additive to animal feed;
  • L-tyrosine is also needed as a drug and as a raw material in the pharmaceutical industry.
  • L-phenylalanine is particularly required for the production of the sweetener aspartame.
  • biotechnological production is the only way to obtain amino acids in the desired optically active form under economically justifiable conditions. The biotechnological production takes place either enzymatically or by microbial fermentation. The microbial production has the advantage that simple and inexpensive raw materials can be used. Since the biosynthesis of amino acids is controlled in many ways in the cell, various attempts to increase product formation have already been made.
  • amino acid analogs were used to switch off the regulation of biosynthesis.
  • a method is described in which Corynebacterium strains are used which are resistant to L-tyrosine and L-phenylalanine analogs (Jap. Patent Application No. 19037/1976 and No. 39517/1978).
  • a process is also described in which 5-methyltryptophan-resistant microorganisms are used against the L-tryptophan analogue.
  • microorganisms constructed by recombinant DNA techniques are known, in which the regulation of the biosynthesis is likewise abolished by cloning and expressing the genes which code for the key enzymes which can no longer be inhibited by feedback.
  • a recombinant, L-tyrosine-producing bacterium with plasmid-coded, feed-back-resistant 3-deoxy-D-arabino-hepturosonate-7-phosphate synthase and feed-back-resistant chorismate mutase is described (Jap. Patent Application No. 34197/1985).
  • a recombinant L-phenylalanine-producing bacterium with feed-back-resistant prephenate dehydrogenase is also known (Japanese Patent Application No. 124375/1986, European Patent Application No.
  • This object is achieved in that a transport gene which codes for a protein for taking up an amino acid is isolated from a microorganism strain, cloned and then transformed into a host cell which produces the corresponding amino acid. It has surprisingly been found that the secretion rate, ie the export of the amino acid per unit time, is increased in such transformants, although the cloned and transformed transport gene is not responsible for the export but for the uptake of the corresponding amino acid. Host cells transformed in this way also excrete an increased proportion of the corresponding amino acid into the culture medium.
  • the isolation, cloning and transformation of the corresponding transport gene is carried out according to common methods: in the case of cloning a transport gene from Corynebacterium, the method of homologous complementation or the heterologous complementation of uptake-defective Escherichia coli mutants is suitable, for example.
  • Vectors with a low copy number are preferably used since overexpression of transport genes can be toxic (P. Natl. Acad. Sei., USA (1979) 76: 4360-4364).
  • vector sequences can first be inserted into the transport gene in order to then isolate it in the form of inactive fragments by means of plasmid rescue.
  • a large number of sequences are known which are unrelated to membrane proteins encode known function so that the transport gene is first identified by functional analysis, and then used to improve amino acid production.
  • C. glutamicum ATCC 13032 Genes from Corynebacterium, e.g. C. glutamicum ATCC 13032 or C. glutamicum ssp. flavum DSM 2041 or C. glutamicum ssp. lactofermentum DSM 2042.
  • the gene isolated from C. glutamicum ATCC 13032 is particularly suitable for the production of aromatic amino acids with the gene sequence according to Table 1 for the production of aromatic amino acids by the process according to the invention.
  • the host cell producing the corresponding amino acid is transformed by electroporation (FEMS Microbiol. Lett. (1989) 65: 299-304) or Conjugation (J. Bacteriol. (1990) 172: 1663-1666).
  • Those amino acid-producing strains in particular from the genus Corynebacterium, in which the enzymes involved in the synthesis of the corresponding amino acid are deregulated and / or which provide an increased proportion of central metabolism metabolites are preferably used as host cells.
  • Plasmid pJCdapEBamHI-3.4 (Microbiology, UK (1994) 140: 3349-3356) contains chromosomal DNA from C. glutamicum ATCC13032. After culturing in LB at 37 ° C., this plasmid was isolated from E. coli DH5 by means of alkaline lysis (Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). The plasmid was cut with the restriction enzymes BamHI and Bstl according to the manufacturer's instructions, and the resulting 276 bp DNA fragment (orf5int1, FIG. 1) with the plasmid pEMl (J. Bacteriol. (1991) 173: 4510, which does not replicate in C. glutamicum -4516). The resulting plasmid pEMorf5intl was made by conjugation
  • C. glutamicum:: orf5int1 with the ORF5 locus inactivated in the chromosome.
  • C. glutamicum :: orf5inti was grown overnight on LB medium at 30 ° C., the cells from 60 ml were harvested by centrifugation and by alkaline lysis, after preincubation with 0.5 ml lysozyme (20 mg lysozyme / 10 mM tris HCL, 1 mM EDTA pH 8) the chromosomal DNA of this strain was isolated. This DNA was restricted with HindIII, ligated with T4 ligase, and used to transform E. coli DH5 with it, selecting pEM1 for its own kanamycin resistance.
  • Klenow polymerase-treated plasmid pEM1 was ligated.
  • the strain C. glutamicum:: orf5int2 was thus produced by conjugation.
  • the three strains C. glutamicum pJCorf5, C. glutami cum:: orf5int2, and the wild type of C. glutamicum were grown overnight on BHI complex medium (Difco 0502-08-5B) at 30 ° C. They were then harvested by centrifugation, washed with 0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.5 and transferred in minimal medium CGXII (J. Bacteriol. (1993) 175: 5595-5603) without a nitrogen source but with 4% glucose. After three hours of incubation at 30 ° C, the cells were harvested again by centrifugation, washed with 0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.5, and transferred in minimal medium CGXII again without a nitrogen source with 4% glucose.
  • Three of the flasks each additionally contained L-alanine, aminobutyric acid, L-arginine, L-asparagine, L-aspartate, or L-aspartate, L-glutamate, L-glutamine, L-glycine, L-histidine, L-isoleucine, L -Leucine, or L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine (all amino acids each ImM).
  • One of the three strains was transferred to each set of pistons.
  • C. glutamicum pJCorf5 an increased uptake of the three aromatic amino acids compared to C. glutamicum.
  • ORF5 is thus identified as the aromatic amino acid uptake gene con C. glutamicum. Accordingly, the In sertion mutant C. glutamicum :: orf5int2 reduced absorption of L-tyrosine and L-tryptophan. c) Increased product formation by the transport gene
  • pJCorf5 was grown overnight on BHI complex medium at 30 ° C. The cells were then harvested by centrifugation, washed with 0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.5, and thus, with an initial OD of 10 (on the Zeiss spectrophotometer PM6), the minimal medium CGXII without nitrogen source, but 4% glucose and 1 mM dipeptide Tyr -Phe containing, inoculates. At time 0 and after one and two hours of incubation at 30 ° C., samples were taken for dipeptide and amino acid analysis. These were again quantified using high pressure liquid chromatography after pre-column derivatization with orthophthalaldehyde.
  • the two strains C. glutamicum pJCorf5 and C. glutamicum were grown on BHI complex medium, washed with 0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.5, and thus the minimal medium CGXII (J. Bacteriol. (1993) 175: 5595-5603) without a nitrogen source , but containing 4% glucose and 1 mM dipeptide Tyr-Phe.
  • aliquots of 200 ⁇ l were withdrawn and placed in Beckmann centrifuge vials containing 30 ⁇ l, 20% HClO 4 and 65 ⁇ l silicone oil with a density of 1.04, and directly in the Beckmann centrifuge were centrifuged for 1.25 minutes.
  • FIG. 1 to 3 show in detail:
  • Figure 1 Overview of the dapE, aroP locus of Corynebacterium glutamicum. The starting clone to isolate ORF5 is shown in the figure above. The chromosomal 3.9 kb HindIII-EcoRI fragment (orf5c3.9) was finally isolated on the basis of the sequence created.
  • this ORF was identified as the aroP gene of C. glutamicum, which encodes the general uptake system for aromatic amino acids. Selected restriction sites of the chromosome and those that were important for the respective constructions for cloning and functional identification are indicated. The abbreviations are: B, BamHI; Bg, BglII; Bs, BstEI; E, EcoRV; H, Hind III; Sa, SalI; Sc, SacI; X, XhoI.
  • Figure 2 Identification of aroP by direct detection of the uptake of aromatic amino acids by the wild type of C. glutamicum ( ⁇ ), as well as the aroP defect mutant ( ⁇ ), and the strain C. glutamicum paroP ( ⁇ ) with plasmid-coded, overexpressed aroP.
  • Figure 3 Increased tyrosine excretion by the aroP overexpressor ( ⁇ ) compared to the aroP defect mutant ( ⁇ ).
  • the cytosolic tyrosine concentrations also indicated additionally indicate the increased export activity of the aroP overexpressor.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren, bei dem ein für ein Protein zur Aufnahme einer Aminosäure kodierendes Transportgen aus einem Mikroorganismen-Stamm isoliert, kloniert und in eine, die entsprechende Aminosäure produzierende Wirtszelle transformiert wird, wonach nach Expression des Transportgens die Sekretionsrate der Aminosäure erhöht ist und die Wirtszelle einen erhöhten Anteil an Aminosäure ins Medium ausscheidet, sowie einen Genstruktur enthaltenden Vektor und eine transformierte Zelle, die die Genstruktur enthält. Es wurde gefunden, daß die Sekretionsrate der Aminosäure pro Zeiteinheit erhöht ist. Außerdem scheiden derart transformierte Wirtszellen einen erhöhten Anteil der entsprechenden Aminosäure ins Kulturmedium aus.

Description

B e s c h r e i b u n g
Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren mittels rekombinanter Mikroorganismen mit erhöhter Sekretionsrate
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, ein Transportgen nach Anspruch 8, Vektoren nach Anspruch 9 und 10 sowie transformierte Zellen nach den Ansprüchen 11 bis 15.
Aminosäuren sind von großem wirtschaftlichen Interesse, wobei der Bedarf an Aminosäuren weiterhin zunimmt. So wird beispielsweise L-Tryptophan als Medikament und als Zusatz zu Futtermitteln benötigt; für L-Tyrosin besteht ebenfalls Bedarf als Medikament sowie als Rohstoff in der pharmazeutischen Industrie. L-Phenylalanin wird insbesondere zur Herstellung des Süßstoffes Aspartam benötigt. Neben der Isolierung aus natürlichen Materialien ist die biotechnologische Herstellung die einzige Methode, um Aminosäuren in der gewünschten optisch aktiven Form unter wirtschaftlich vertretbaren Bedingungen zu erhalten. Die biotechnologische Herstellung erfolgt entweder enzymatisch oder durch mikrobielle Fermentation. Die mikrobielle Herstellung hat den Vorteil, daß einfache und preisgünstige Rohstoffe eingesetzt werden können. Da die Biosynthese der Aminosäuren, in der Zelle aber in vielfacher Weise kontrolliert wird, sind bereits vielfältige Versuche zur Steigerung der Produktbildung unternommen worden. So wurden z.B. AminosäureAnaloga eingesetzt, um die Regulation der Biosynthese auszuschalten. Beispielsweise ist ein Verfahren beschrieben, bei dem Corynebacterium-Stämme benutzt werden, die gegen L-Tyrosin-und L-Phenylalanin-Analoga resistent sind (Jap. Patent Application Nr. 19037/1976 und Nr. 39517/1978). Ebenso ist ein Prozeß beschrieben, bei dem gegen das L-Tryptophan-Analogon 5-Methyltryptophan resistente Mikroorganismen eingesetzt werden.
Des weiteren sind durch rekombinante DNA-Techniken konstruierte Mikroorganismen bekannt, bei denen ebenfalls die Regulation der Biosynthese aufgehoben ist, indem die Gene, die für die nicht mehr feed-back inhibierbaren Schlüsselenzyme kodieren, kloniert und exprimiert werden. So ist z.B. ein rekombinantes, L-Tyrosin produzierendes Bakterium mit plasmidkodierter, feed-back resistenter 3-Desoxy-D-arabino-hepturosonate-7-phosphatsynthase und feed-back resistenter Chorismatmutase beschrieben (Jap. Patent Application Nr. 34197/1985). Ebenso ist ein rekombinantes, L-Phenylalanin produzierendes Bakterium mit feed-back resistenter Prephenatdehydrogenase bekannt (Jap. Patent Application Nr. 124375/1986, European Patent Application Nr.
0 488 424).
Weitere Versuche zur Erhöhung der Aminosäureproduktion zielen auf eine verbesserte Bereitstellung der zellulären Primärmetabolite des Zentralstoffwechsels. So ist bekannt, daß die durch rekombinante Techniken erreichte Überexpression der Transketolase eine verbesserte Produktbildung von L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Phenylalanin ermöglicht (European Patent Application
Nr. 0 600 463). Weiterhin führt die Reduktion der Phos- phoenolpyruvatcarboxylase-Aktivität in Corynebacterium zur verbesserten Bildung aromatischer Aminosäuren
(European Patent Application Nr. 0 331 145).
Diese vielfältigen Versuche zur Produktivitätssteigerung sind insgesamt darauf gerichtet, die Limitation der cytosolischen Synthese der Aminosäuren zu überwinden. Als eine weitere Limitation kommt grundsätzlich aber auch der Export der im Zellinneren gebildeten Aminosäuren ins Kulturmedium in Betracht. Daher gibt es bereits Ansätze, diesen Export und damit die Wirtschaftlichkeit der Aminosäureproduktion zu verbessern. So hat man die Zellpermeabilität bei Corynebacterium durch Biotinmangel, Detergenz- oder Penicillinbehandlung erhöht. Diese Ausschleusehilfen waren jedoch ausschließlich bei der Glutamatproduktion erfolgreich, während die Synthese anderer Aminosäuren auf diese Weise nicht verbessert werden konnte. Andererseits sind aber auch bereits Bakterienstämme entwickelt worden, bei denen die Aktivität des Sekretionssystems aufgrund chemischer oder physikalischer Mutation erhöht ist. Es wurde dadurch beispielsweise ein Corynebacterium glutamicum-Stamm erhalten, der sich durch eine verbesserte Sekretionsaktivität insbesondere für die L- Lysinproduktion eignet (Deutsche Patentschrift Nr.
42 03 320).
Die biochemischen Grundlagen zum Export von Aminosäuren sind bisher nur zum Teil verstanden (FEMS Microbiol. Rev. (1994) 13: 75-79); insbesondere konnten noch keine, für Aminosäure-Exportproteine kodierenden Gene für rekombinante Techniken zur Verbesserung des Aminosäure- Exports bereitgestellt werden. Demgegenüber sind Gene, die die Aufnahme von Aminosäuren aus dem Kulturmedium ins Zellinnere vermitteln, gut bekannt (Arch. Microbiol. (1994) 162: 1-13). Beispielsweise wird bei Corynebacterium die Glutamataufnähme durch das gluABCD kodierte, primär aktive System katalysiert (J. Bacteriol. (1995) 177: 1152-1158) und die Lysinaufnahme durch das lysI-Protein (Mol. Microbiol. (1991) 5: 2995-3005). Auch ist ein DNA-Fragment beschrieben, das die Aufnahme der aromatischen Aminosäuren vermittelt (J. Ferment. Bioeng. (1994) 78: 420-425).
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das es erlaubt, die Sekretion zellintern gebildeter Aminosäuren gezielt zu erhöhen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein Transportgen, das für ein Protein zur Aufnahme einer Aminosäure kodiert, aus einem Mikroorganismen-Stamm isoliert, kloniert und anschließend in eine Wirtszelle, die die entsprechende Aminosäure produziert, transformiert wird. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß bei solchen Transformanden die Sekretionsrate, d.h. der Export der Aminosäure pro Zeiteinheit, erhöht ist, obwohl das klonierte und transformierte Transportgen nicht für den Export, sondern für die Aufnahme der entsprechenden Aminosäure verantwortlich ist. Auch scheiden derart transformierte Wirtszellen einen erhöhten Anteil der entsprechenden Aminosäure ins Kulturmedium aus.
Die Isolierung, Klonierung und Transformation des entsprechenden Transportgens erfolgt nach gängigen Methoden: Im Falle der Klonierung eines Transportgens aus Corynebacterium eignet sich beispielsweise die Methode der homologen Komplementation oder auch der heterologen Komplementation von aufnahmedefekten Escherichia coliMutanten. Vorzugsweise gelangen Vektoren mit niedriger Kopienzahl zum Einsatz, da eine Überexpression von Transportgenen toxisch sein kann (P. Natl. Acad. Sei., USA (1979) 76: 4360-4364). Falls keine direkte Klonierung des Strukturgens möglich ist, kann zunächst auch die Insertion von Vektorsequenzen in das Transportgen erfolgen, um es dann über "plasmid-rescue" in Form inaktiver Fragmente zu isolieren. Ferner sind eine Vielzahl von Sequenzen bekannt, die für Membranproteine un bekannter Funktion kodieren, so daß zunächst das Transportgen durch funktioneile Analyse zu identifizieren ist, um es dann zur Verbesserung der Aminosäureproduktion einzusetzen.
Für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich insbesondere Gene aus Corynebacterium, z.B. C. glutamicum ATCC 13032 oder C. glutamicum ssp. flavum DSM 2041 oder auch C. glutamicum ssp. lactofermentum DSM 2042. Für die Herstellung von aromatischen Aminosäuren nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eignet sich insbesondere das aus C. glutamicum ATCC 13032 isolierte Gen für die Aufnahme aromatischer Aminosäuren mit der Gensequenz gemäß Tabelle 1.
Nach Isolierung der Gene und deren in vitro-Rekombination mit bekannten Vektoren, wie z.B.pEKO, pEC5, pJC1, pWST1, erfolgt die Transformation der die entsprechende Aminosäure produzierenden Wirtszelle durch Elektroporation (FEMS Microbiol. Lett. (1989) 65: 299-304) oder Konjugation (J. Bacteriol. (1990) 172: 1663-1666). Als Wirtszellen werden bevorzugt solche Aminosäure-produzierenden Stämme, insbesondere aus der Gattung Corynebacterium, eingesetzt, in denen die an der Synthese der entsprechenden Aminosäure beteiligten Enzyme dereguliert sind und/oder die einen erhöhten Anteil an Zentralstoffwechselmetaboliten bereitstellen. Ausführungsbeispiel
a) Klonierung eines Transportgens
Plasmid pJCdapEBamHI-3.4 (Microbiology, UK (1994) 140: 3349-3356) enthält chromosomale DNA aus C. glutamicum ATCC13032. Nach Anzucht in LB bei 37 °C wurde dieses Plasmid aus E. coli DH5 mittels alkalischer Lyse isoliert (Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Das Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und Bstl nach Angaben des Herstellers geschnitten, und das resultierende 276 bp großes DNA Fragment (orf5int1, Figur 1) mit dem in C.glutamicum nicht replizierenden Plasmid pEMl (J. Bacteriol. (1991) 173: 4510-4516) ligiert. Das resultierende Plasmid pEMorf5intl wurde durch Konjugation nach
C. glutamicum ATCC13032 übertragen (J. Bacteriol.
(1990) 172: 1663-1666), wodurch der neue Stamm
C. glutamicum: :orf5int1, mit dem im Chromosom inaktivierten Genort ORF5, entstand. C. glutamicum::orf5inti wurde über Nacht auf LB Medium bei 30°C angezogen, die Zellen aus 60 ml wurden durch Abzentrifugation geerntet, und mittels alkalischer Lyse, nach Vorinkubation mit 0,5 ml Lysozym (20 mg Lysozym/10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA pH 8) wurde die chromosomale DNA dieses Stammes isoliert. Diese DNA wurde mit HindIII restringiert, ligiert mit T4-Ligase, und benutzt um E. coli DH5 damit zu transformieren, wobei auf pEM1 eigene Kanamycin resistenz selektioniert wurde. Die erhaltenen Klone wur den durch Hybridisierung und Restriktion analysiert, und so schließlich Plasmid pUCorf5c3.9 (Figur 1) erhalten. Von diesem Plasmid wurde orf5cl.4 zusammen mit orf5nl.6 in pJC1 ligiert, so daß Plasmid pJCorf5 ent- stand. Dieses Plasmid wurde durch Elektroporation nach C. glutamicum ATCC13032 transferriert. Zusätzlich zu C. glutamicum::orf5int1, wurde C. glutamicum: :orf5int2 konstruiert, indem pJCorf5 mit dem Restriktionsenzym Seal behandelt wurde, und das resultierende 609 bp gro- ße Fragment zusammen mit SalI-geschnittenen und mit
Klenow-Polymerase behandeltem Plasmid pEM1 ligiert wurde. Durch Konjugation wurde so der Stamm C. glutamicum: :orf5int2 hergestellt.
b) Identifizierung eines Transportgens
Die drei Stämme C. glutamicum pJCorf5, C. glutami cum: :orf5int2, und der Wildtyp von C. glutamicum wurden über Nacht auf BHI Komplexmedium (Difco 0502-08-5B) bei 30°C angezogen. Sie wurden anschließend durch Zentrifugation geerntet, mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 gewaschen, und in Minimalmedium CGXII (J. Bacteriol. (1993) 175: 5595-5603) ohne Stickstoffquelle, aber mit 4% Glukose übertragen. Nach drei Stunden Inkubation bei 30°C wurden die Zellen erneut durch Zentrifugation geerntet, mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 gewaschen, und in Minimalmedium CGXII wiederum ohne Stickstoffquelle mit 4% Glukose übertragen. Davon wurden 9 Kolben hergestellt. Je drei der Kolben enthielten zusätzlich L-Alanin, Aminobuttersäure , L-Arginin, L- Asparagin, L-Aspartat , oder L-Aspartat, L-Glutamat, L-Glutamin, L-Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Leucin, oder L-Lysin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin, L-Valin (alle Aminosäuren jeweils ImM) . In je einen Satz der Kolben wurde einer der drei Stämme übertragen. Die Kolben wurden bei 30°C inkubiert, und nach 24 Stunden die verbliebenen Aminosäuren mittels Hochdruckflüssigchromatographie nach Vorsäulenderivatisierung durch ortho-Phthaldehyd (J. Chromatograph. (1983) 266: 471-482) quantifiziert. L-Leucin, L-Threonin, L-Alanin, Aminobuttersäure, L-Asparagin, L-Aspartat, L-Glutamat, L-Glutamin, L-Serin, und L-Isoleucin waren durch den Wildtyp von C.
glutamicum vollständig verbraucht, L-Valin, L-Arginin, L-Histidin, L-Methionin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Threonin, und L-Tryptophan zu etwa 50%, L-Glycin, L-Arginin, L- Lysin zu etwa 20%. Große Unterschiede bei der Aufnahme von L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L- Tryptophan, und L-Histidin zeigten sich zwischen den drei Stämmen. Die Aufnahme wurde deswegen mit der identischen Verfahrensweise für die drei Stämme, aber jeweils eine der drei aromatischen Aminosäuren allein verfolgt. Wie aus Figur 2 hervorgeht, erfolgt durch
C. glutamicum pJCorf5 eine verstärkte Aufnahme der drei aromatischen Aminosäuren gegenüber C. glutamicum. Damit ist ORF5 als das aromatische Aminosäureaufnahmegen con C. glutamicum identifiziert. Entsprechend zeigt die In sertionsmutante C. glutamicum::orf5int2 eine verringerte Aufnahme von L-Tyrosin und L-Tryptophan. c) Erhöhte Produktbildung durch das Transportgen
Der Wildtyp von C. glutamicum und C. glutamicum
pJCorf5, wurde über Nacht auf BHI Komplexmedium bei 30°C angezogen. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 gewaschen, und damit, mit einer Anfangs OD von 10 (am Zeiss Spektralphotometer PM6) das Minimalmedium CGXII ohne Stickstoffquelle, aber 4% Glukose und 1 mM Dipeptid Tyr-Phe enthaltend, beimpft. Zum Zeitpunkt 0, und nach ein und zwei Stunden Inkubation bei 30°C wurden Proben zur Dipeptid und Aminosäureanalyse entnommen. Diese wurden wiederum mittels Hochdruckflüssigchromatographie nach Vorsäulenderivatisierung durch ortho-Phthaldehyd quantifiziert. Bereits nach einer Stunde war alles Dipeptid, wegen der bekannten effizienten Peptidaufnahmesysteme im Medium verschwunden (J. Gen. Microbiol. (1993) 139: 3115-3122). Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, war aber die externe Akkumulation von L-Tyrosin stark verbessert.
Figure imgf000013_0001
d) Erhöhte Exportrate durch das Transportgen
Die zwei Stämme C. glutamicum pJCorf5 und C. glutamicum wurden auf BHI Komplexmedium angezogen, mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 gewaschen, und damit das Minimalmedium CGXII (J. Bacteriol. (1993) 175: 5595-5603) ohne Stickstoffquelle, aber 4% Glukose und 1 mM Dipeptid Tyr-Phe enthaltend, beimpft. Direkt nach dem Beimpfen, und in Abständen von 5 bis 10 Minuten wurden Aliqouts von 200 μl entnommen, die in Beckmann Zentrifugenvials gegeben wurden, die 30 μl, 20% HClO4 und 65 μl Silikonöl der Dichte 1,04 enthielten, und direkt in der Beckmann Zentrifuge für 1,25 Minuten zentrifugiert wurden. Anschließend wurden die Bechmann vials wie beschrieben (Methods Enzymology (1967) 10: 680-684) zur Quantifizierung der cytosolischen und der externen Aminosäurekonzentrationen aufgearbeitet. Wie Figur 3 zeigt, erfolgt durch das beschriebene Verfahren mit Hilfe des Transportgens bei C. glutamicum pJCorf5 eine wesentlich höhere Exportrate von L-Tyrosin als beim Ausgangsstamm, so daß es zu einer erhöhten Akkumulation kommt. Die Exportrate ist bei C. glutamicum pJCorf5 trotz der gleichzeitig bedingten niedrigeren cytosolischer L-Tyrosinkonzentration erhöht, was die Effizienz des Transportgens zur verbesserten Aminosäureproduktion durch das Aufnahmegen belegt.
Die Figuren 1 bis 3 zeigen im einzelnen:
Figur 1: Übersicht über den dapE, aroP locus von Corynebacterium glutamicum. Der Ausgangsklon um ORF5 zu isolieren ist in der Abbildung oben gezeigt. Anhand der erstellten Sequenz wurde schließlich das chromosomale 3.9 kb HindIII -EcoRI Fragment (orf5c3.9) isoliert.
Durch funktioneile Studien mit rekonstituiertem und Plasmid-codiertem ORF5 wurde dieser ORF als Gen aroP von C. glutamicum identifiziert, das das allgemeine Aufnahmesystem für aromatische Aminosäuren codiert. Ausgewählte Restriktionsschnittstellen des Chromosoms und solche, die für die jeweiligen Konstruktionen zur Klonierung und funktionellen Identifizierung wichtig waren, sind angegeben. Die Abkürzungen sind: B, BamHI; Bg, BglII ; Bs, BstEI; E, EcoRV; H, HindIII; Sa, SalI; Sc, SacI; X, XhoI . Figur 2 : Identifikation von aroP durch direkten Nachweis der Aufnahme aromatischer Aminosäuren durch den Wildtyp von C. glutamicum (■), sowie die aroP - Defektmutante (∇), und den Stamm C. glutamicum paroP (▲) mit plasmidcodiertem, überexprimiertem aroP.
Figur 3: Erhöhte Tyrosinsexkretion durch den aroP- Uberexprimierer (■) im Vergleich zur aroP-Defektmutante (▲). Die ebenfalls angegeben cytosolischen Tyrosinkonzentrationen zeigen zusätzlich die verstärkte Exportaktivität des aroP-Überexprimierers an.
Figure imgf000016_0001

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren, bei dem ein für ein Protein zur Aufnahme einer Aminosäure kodierendes Transportgen aus einem Mikroorganismen-Stamm isoliert, kloniert und in eine, die entsprechende Aminosäure produzierende Wirtszelle transformiert wird, wonach nach Expression des Transportgens die Sekretionsrate der Aminosäure erhöht ist und die Wirtszelle einen erhöhten Anteil an Aminosäure ins Medium ausscheidet.
2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von aromatischen Aminosäuren.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß das Transportgen aus einem Mikroorganismen- Stamm der Gattung Corynebacterium stammt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß als Wirtszelle für die Transformation ein Mikroorganismus aus der Gattung Corynebacterium eingesetzt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß als Wirtszelle für die Transformation ein Mikroorganismus eingesetzt wird, in dem die an der Synthese der entsprechenden Aminosäure beteiligten Enzyme dereguliert sind.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß als Wirtszelle für die Transformation ein Mikroorganismus eingesetzt wird, der einen erhöhten
Anteil an Zentralstoffwechselmetaboliten enthält.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß für die Klonierung und Transformation des
Transportgens ein Vektor mit niedriger Kopienzahl eingesetzt wird.
8. Transportgen gemäß Tabelle 1, wobei die Tabelle 1 Bestandteil dieses Anspruches ist,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß das Transportgen in einer Genstruktur enthalten ist.
9. Vektor, enthaltend eine Genstruktur nach
Anspruch 8.
10. Vektor nach Anspruch 9 mit niedriger Kopienzahl.
11. Transformierte Zelle, enthaltend eine Genstruktur nach Anspruch 8.
12. Transformierte Zelle, enthaltend einen Vektor nach Anspruch 9 oder 10.
13. Transformierte Zelle nach Anspruch 11 oder 12,
d a du r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß sie der Gattung Corynebacterium angehört.
14. Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 11 bis 13,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß in dieser die an der Synthese der entsprechenden Aminosäure beteiligten Enzyme dereguliert sind.
15. Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 11 bis 14,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß sie einen erhöhten Anteil an Zentralstoffwechselmetaboliten enthält.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1484410A1 (de) * 2003-06-05 2004-12-08 Ajinomoto Co., Ltd. Fermentierungsverfahren und gentechnisch veränderte Bakterien mit einer erhöhten Aufnahme von Substraten und Nebenprodukten
JP2005013229A (ja) * 2003-06-05 2005-01-20 Ajinomoto Co Inc 目的物質の製造法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4061769B2 (ja) * 1999-03-25 2008-03-19 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸の製造法
MXPA03001026A (es) * 2000-08-04 2003-09-22 Genencor Int Incremento de la produccion industrial por aumentar el transporte de substratos.
US6720168B2 (en) 2000-08-04 2004-04-13 Genencor International, Inc. 2,5-DKG permeases
US7229811B2 (en) 2001-08-03 2007-06-12 Genencor International, Inc. 2,5-diketo-D-gluconic acid (2,5-DKG) permeases
KR102464883B1 (ko) * 2020-12-11 2022-11-09 씨제이제일제당 주식회사 신규한 감마-아미노부티르산 퍼미에이즈 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0600463A2 (de) * 1992-12-03 1994-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan, L-Tyrosine oder L-Phenylalamin

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2578488B2 (ja) * 1988-03-04 1997-02-05 協和醗酵工業株式会社 アミノ酸の製造法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0600463A2 (de) * 1992-12-03 1994-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan, L-Tyrosine oder L-Phenylalamin

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.WEHRMANN ET AL.: "Functional analysis of sequences adjacent to dapE of Corynebacterium glutamicum reveals the presence of aroP, which encodes the aromatic amino acid reporter", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 177, no. 20, October 1995 (1995-10-01), pages 5991 - 5993, XP000608713 *
M.IKEDA UND R. KATSUMATA: "Transport of aromatic amino acids and its influence on overproduction of the amino acids in Corynebacterium glutamicum", JOURNAL OF FERMENTATION AND BIOENGINEERING, vol. 78, no. 6, 1994, pages 420 - 425, XP000608032 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1484410A1 (de) * 2003-06-05 2004-12-08 Ajinomoto Co., Ltd. Fermentierungsverfahren und gentechnisch veränderte Bakterien mit einer erhöhten Aufnahme von Substraten und Nebenprodukten
JP2005013229A (ja) * 2003-06-05 2005-01-20 Ajinomoto Co Inc 目的物質の製造法
US7335496B2 (en) 2003-06-05 2008-02-26 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance

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