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Diese
Erfindung betrifft die DNA, die Phosphoserinphosphatase der coryneformen
Bakterien codiert. Die DNA könnte
in der mikrobiologischen Industrie beispielsweise zum Züchten von
coryneformen Bakterien, die L-Serin produzieren, verwendet werden.
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Als
ein konventionelles Verfahren zur Herstellung von L-Serin durch
Fermentation ist ein Verfahren bekannt, worin ein Bakterienstamm,
der Glycin und Zucker zu L-Serin konvertieren kann, in einem Medium,
enthaltend 30 g/l Glycin, verwendet wird, wobei höchstens
14 g/l L-Serin hergestellt werden. Die Konvertierungsausbeute beläuft sich
auf 46% (K. Kubota, Agricultural Biological Chemistry, 49, 7–12 (1985)).
Bei Verwendung eines Bakterienstammes, der Glycin und Methanol zu
L-Serin konvertieren kann, lassen sich 53 g/l L-Serin aus 100 g/l
Glycin herstellen (T. Yoshida et al., Journal of Fermentation and
Bioengineering, Bd. 79, Nr. 2, 181–183, 1995). Aus einem Verfahren,
bei dem Nocardia verwendet wird, ist bekannt, dass die L-Serin-Produktivität des Bakteriums
verbessert werden kann, indem die Stämme gezüchtet werden, die gegen Serinhydroxamat,
Azaserin usw. resistent sind (
JP 57-1235 A ). Diese Verfahren erfordern jedoch
die Verwendung von Glycin, das ein Vorläufer von L-Serin ist, schliessen
komplizierte Vorgänge
ein und sind hinsichtlich der Kosten unvorteilhaft.
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Ein
Stamm, der L-Serin direkt aus einem Zucker fermentieren kann und
bei dem der Vorläufer
von L-Serin nicht zu dem Medium gegeben werden muss, ist Corynebacterium
glutamicum, das gegen D-Serin, α-Methylserin,
o-Methylserin, Isoserin, Serinhydroxamat und 3-Chloralanin resistent
ist, jedoch L-Serin lediglich zu 0,8 g/l anreichert (Nogei Kagakukaishi,
Bd. 48, Nr. 3, Seiten 201 bis 208, 1974). Entsprechend sind weitere
Stammverbesserungen zur direkten Fermentation von L-Serin im industriellen
Massstab notwendig.
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Andererseits
wurde hinsichtlich coryneformer Bakterien ein Vektorplasmid, das
zur autonomen Replikation in der Zelle befähigt ist und ein Markergen
besitzt, das gegen einen Wirkstoff resistent ist (vgl.
US 4,514,502 ), und ein Verfahren zum
Einführen
eines Gens in eine Zelle (
JP 1990-207791 A ) offenbart. Diese Verfahren
sind zum Züchten
von Bakterien, die L-Aminosäuren
produzieren, verwendet worden. Wie für L-Serin wurde gefunden, dass
die L-Serin-Produktivität
von coryneformen Bakterien, die L-Serin produzieren können, verbessert
wird durch: Einführen
eines Gens, das D-3-Phosphoglyceratdehydrogenase codiert, dessen Feedback-Hemmung
durch L-Serin desensibilisiert ist, (serA-Gen) (
EP 0 943 687 A2 ) oder Amplifikation
eines Gens, das Phosphoserinphosphatase (serB) oder Phosphoserintransaminase
(serC) codiert (
EP
0 931 833 A2 ). Das serB-Gen in Escherichia coli (GenBank
Zugang X03046, M30784), Hefe (GenBank Zugang U36473) und Helicobacter
pylori (GenBank Zugang AF006039) war bekannt, jedoch nicht das serB-Gen
der coryneformen Bakterien.
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Angesichts
des Vorstehenden ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, die DNA bereitzustellen,
die die Phosphoserinphosphatase coryneformer Bakterien codiert.
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Die
Erfinder erhielten das DNA-Fragment aus einer Chromosomen-DNA-Bibliothek von
Brevibacterium flavum, das den serB-Mangel von Escherichia coli
komplementiert. Der offene Leserahmen, der Homologie mit dem bekannten
serB-Gen von Escherichia coli besitzt, wurde aus dem DNA-Fragment
subkloniert und in den serB-defizitären Mutantenstamm des oben
genannten Escherichia coli eingefügt. Jedoch wurde der serB-Mangel
nicht komplementiert. Es wurde gefunden, dass der serB-Mangel mit
dem oben genannten ORF komplementiert wird, welcher unter Verwendung
von lac-Promoter forciert exprimiert wurde. Dadurch wurde bestätigt, dass
der oben genannte ORF ein serB-Homologes von Brevibacterium flavum
war. Es zeigte sich, dass der oben genannte ORF keinen eigenen Promoter
besass, da er ein Operon bildet.
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Die
vorliegende Erfindung wurde wie oben beschrieben gemacht und stellt
Folgendes bereit, das auch den Ansprüchen entspricht:
- 1. Protein, definiert durch (A) oder (B):
(A) Protein,
das eine Aminosäuresequenz
der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst; oder
(B) Protein,
das eine Aminosäuresequenz,
einschließlich
Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer
oder 2 bis 50 Aminosäuren
in der Aminosäuresequenz
der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst, und welches Phosphoserinphosphataseaktivität besitzt,
mit
der Maßgabe,
dass das Protein nicht die folgende Aminosäuresequenz hat:
- 2. DNA, die ein Protein gemäss
(A) oder (B) codiert:
(A) Protein, das eine Aminosäuresequenz
der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst; oder
(B) Protein,
das eine Aminosäuresequenz,
einschliesslich Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder
Inversion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz
der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst, und welches Phosphoserinphosphataseaktivität besitzt,
mit
der Maßgabe,
daß das
Protein nicht die folgende Aminosäuresequenz hat:
- 3. DNA, die ein Protein mit Phosphoserinphosphataseaktivität codiert
und eine Homologie von nicht weniger als 80% mit der Aminosäuresequenz
in SEQ ID Nr. 2 aufweist, mit der Maßgabe, dass die DNA nicht die
folgende Nucleinsäuresequenz
hat:
- 4. DNA gemäß Anspruch
2 oder 3, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die den Nukleotiden
210-1547 der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste
entspricht.
- 5. Vektor umfassend die DNA gemäß mindestens einem der Ansprüche 2 bis
4.
- 6. Bakterienzelle umfassend eine DNA, die ein Protein mit Phosphoserinphosphataseaktivität kodiert,
wobei die DNA ausgewählt
ist aus einer
(i) DNA, die ein Protein gemäß (A), (B) oder (C) kodiert:
(A)
Protein, das eine Aminosäuresequenz
der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst; oder
(B) Protein,
das eine Aminosäuresequenz,
einschließlich
Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer
oder 2 bis 50 Aminosäuren
in der Aminosäuresequenz
der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst,
(C) Protein, das
eine Homologie von nicht weniger als 80% mit der Aminosäuresequenz
in SEQ ID Nr: 2 aufweist;
oder
(ii) DNA, die eine Nukleotidsequenz
umfasst, die den Nukleotiden 210-1547 der Nukleotidsequenz der SEQ ID
Nr: 1 der Sequenzliste entspricht;
wobei die Phosphoserinphosphataseaktivität erhöht wird
durch Amplifizieren der Kopienanzahl der DNA gemäß (i) oder (ii) oder Modifikation
der Expressionskontrollsequenz
- 7. Verfahren zur Herstellung von L-Serin, umfassend die Schritte:
Kultivieren des Bakteriums gemäss
Anspruch 6 in einem Medium zur Herstellung und Akkumulierung von
L-Serin in dem Medium und Sammeln des L-Serins in dem Medium.
- 8. Verwendung eines Vektors, umfassend eine DNA, die ein Protein
mit Phosphoserinphosphataseaktivität kodiert, wobei die DNA ausgewählt ist
aus einer
(i) DNA, die ein Protein gemäß (A), (B) oder (C) kodiert:
(A)
Protein, das eine Aminosäuresequenz
der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst; oder
(B) Protein,
das eine Aminosäuresequenz,
einschließlich
Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer
oder 2 bis 50 Aminosäuren
in der Aminosäuresequenz
der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst,
(C) Protein, das
eine Homologie von nicht weniger als 80% mit der Aminosäuresequenz
in SEQ ID Nr: 2 aufweist;
oder
(ii) DNA, die eine Nukleotidsequenz
umfasst, die den Nukleotiden 210-1547 der Nukleotidsequenz der SEQ ID
Nr: 1 der Sequenzliste entspricht;
zur Herstellung von L-Serin.
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Nachstehend
wird die Erfindung genauer beschrieben.
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Die
erfindungsgemäße DNA kann
erhalten werden durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion) unter Verwendung
von sowohl chromosomaler DNA von Brevibacterium flavum, z. B. dem Brevibacterium
flavum-Stamm ATCC 14067, als Matrize, als auch von einem Primer
mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nrn. 3 und 4 der Sequenzliste.
Da jeder dieser Primer eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle von
EcoRI oder SalI in seinen 5'-Sequenzen
besitzt, kann das Amplifizierungsprodukt, das mit diesen Restriktionsenzymen verdaut
wurde, in einen Vektor mit EcoRI- und SalI-verdauten Enden insertiert werden.
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Die
Nukleotidsequenzen der oben genannten Primer wurden, basierend auf
der Nukleotidsequenz des DNA-Fragments, das den serB-defizitären Mutantenstamm
Escherichia coli ME8320 (thi, serB, zhi-1::Tn10) (erhältlich vom
National Genetics Institute) komplementiert, entworfen. Durch Verwendung
dieser Primer kann ein DNA-Fragment erhalten werden, das die codierende
Region des serB-Homologen und seine flankierende Region (5'-nicht-translatierende
Region von etwa 200 bp und 3'-nicht-translatierende
Region von etwa 300 bp) enthält.
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Die
Nukleotidsequenz der codierenden Region der DNA der Erfindung, erhältlich wie
oben beschrieben, und eine Aminosäuresequenz, die durch diese
Sequenz codiert werden kann, sind in SEQ ID Nr. 1 gezeigt. Die Aminosäuresequenz
für sich
ist in SEQ ID Nr. 2 gezeigt. Die nicht von der Erfindung umfaßten DNA- und
Aminosäuresequenzen
sind in den Ansprüchen
gezeigt.
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Es
zeigte sich, dass es sich beim oben genannten serB-Homologen um den
offenen Leserahmen (ORF) handelt, der Homologie mit serB-Genen von
Escherichia coli und Hefe (Saccharomyces cerevisiae) besitzt, das
in dem DNA-Fragment
existiert, das den serB-Mangel des Stamms ME8320 komplementiert.
Das DNA-Fragment, das lang genug ist, um den ORF und den Promotor
zu enthalten, wurde aus Brevibacterium flavum ATCC 14067 durch PCR
unter Verwendung der oben genannten Primer mit den in der Sequenzliste gezeigten
Nukleotidsequenzen SEQ ID Nrn. 3 und 4 erhalten. Es wurde in den
Stamm ME8320 eingeführt, jedoch
wurde der serB-Mangel des Stamms nicht komplementiert. Deshalb wurde
zunächst
angenommen, dass es sich bei dem oben genannten ORF nicht um das
serB-Homolog handelt. Jedoch wurde der serB-Mangel mit dem oben
genannten ORF komplementiert, welcher mit lac-Promotor ligiert und
forciert exprimiert wurde. Es wurde also bestätigt, dass es sich bei dem
oben genannten ORF um ein serB-Homologes handelt.
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Des
weiteren wurde der andere ORF gerade stromaufwärts des serB-Homologen im DNA-Fragment, das
den serB-Mangel komplementiert, gefunden. Aus diesen Ergebnissen
ist ersichtlich, dass diese ORFs ein Operon bilden und es keine
Promotorregion und dergleichen gerade stromaufwärts des serB-Homologen gibt.
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Zuerst
wurde versucht, ein serB-Homolog von Brevibacterium flavum durch
Verwendung der Nukleotidsequenz des bekannten serB-Gens zu erhalten.
Das heisst, die Erfinder beabsichtigten, die Nukleotidsequenz und
die Aminosäuresequenz
eines bekannten serB-Gens unter den anderen Spezies zu vergleichen, gut
erhaltene Aminosäuresequenzregionen
unter vielen Spezies zu suchen, PCR-Primer, basierend auf der Nukleotidsequenz
der Region zu synthetisieren und serB-Homologe mit diesen Primern
zu amplifizieren. Da jedoch sehr wenige dieser erhaltenen Regionen
existieren, wurde vermutet, dass es schwierig ist, das Ziel-Gen durch
PCR zu erhalten. Deshalb wurde ein Komplementationstest unter Verwendung
von serB-defizitärem
Mutantenstamm durchgeführt.
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Während die
DNA der Erfindung durch Klonen durch Komplementationstest unter
Verwendung von serB-defizitären Mutanten
und Subklonen durch PCR, wie oben beschrieben, erhalten wurde, kann
sie auch aus einer chromosomalen DNA-Bibliothek von Brevibacterium flavum
mittels Hybridisierung unter Verwendung eines Oligonukleotids als
Sonde, hergestellt auf Basis der Nukleotidsequenz der DNA der Erfindung,
erhalten werden.
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Verfahren
zur Konstruktion einer genomischen DNA-Bibliothek, Hybridisierung, PCR, Herstellung
von Plasmid-DNA,
Verdauung und Ligation von DNA, Transformation usw. sind in J. Sambrook,
E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1.21 (1989), beschrieben.
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Die
DNA der Erfindung kann Phosphoserinphosphatase, einschliesslich
Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer
oder 2 bis 50, und bevorzugter 2–20 Aminosäuren in einer oder einer Vielzahl
von Positionen, codieren, vorausgesetzt, dass die Aktivität der Phosphoserinphosphatase,
die dadurch codiert wird, sich nicht verschlechtert. Weiterhin kann
die DNA der Erfindung Phosphoserinphosphatase mit einer Homologie
von nicht weniger als 80%, und am meisten bevorzugt nicht weniger
als 90%, mit der Aminosäuresequenz
SEQ ID Nr. 2 codieren, vorausgesetzt dass die Aktivität der dadurch
codierten Phosphoserinphosphatase sich nicht verschlechtert.
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DNA,
die das im wesentlichen gleiche Protein wie Phosphoserinphosphatase,
wie oben beschrieben, codiert, wird z. B. erhalten durch Modifizierung
der Nukleotidsequenz des Phosphoserinphosphatase-Gens, z. B. durch
ortsspezifische Mutageneseverfahren, so dass ein oder mehrere Aminosäurereste
in einer spezifischen Stelle des Gens Substitution, Deletion, Insertion,
Addition oder Inversion involvieren. DNA, die wie oben beschrieben
modifiziert ist, kann z. B. durch die üblichen bekannten Mutationsbehandlungen
erhalten werden. Die Mutationsbehandlung schliesst ein Verfahren
zur Behandlung von DNA, die Phosphoserinphosphatase in vitro codiert,
z. B. mit Hydroxylamin, und ein Verfahren zur Behandlung eines Mikroorganismus,
z. B. eines Bakteriums, das zu der Gattung Escherichia gehört, das
DNA, die Phosphoserinphosphatase codiert, beherbergt, mit ultravioletter
Strahlung oder einem Mutationsmittel, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
(NTG) und Salpetersäure, üblicherweise
verwendet für
die Mutationsbehandlung, ein.
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Substitution,
Deletion, Insertion, Addition oder Inversion des Nukleotids, wie
oben beschrieben, schliesst auch natürlich vorkommende Mutation
(Mutant oder Variant) ein, z. B. der Unterschied in Stämmen, Spezies
oder Genera der Mikroorganismen.
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Die
DNA, welche im wesentlichen das gleiche Protein wie Phosphoserinphosphatase
codiert, wird durch Exprimieren von DNA mit einer wie oben beschriebenen
Mutation in einer angemessenen Zelle und Untersuchung der Phosphoserinphosphataseaktivität des exprimierten
Produkts erhalten.
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Die
DNA, die das im wesentlichen gleiche Protein wie Phosphoserinphosphatase
codiert, wird auch durch Isolieren von DNA, die mit einem Primer,
der z. B. die Nukleotidsequenz besitzt, die die Nukleotide 210-1547
der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 umfasst, und die ein Protein
mit der Phosphoserinphosphataseaktivität codiert, aus DNA, die Phosphoserinphosphatase
mit Mutation codiert, oder aus einer Zelle, die sie beherbergt,
erhalten.
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Es
ist bevorzugt, dass die DNA der Erfindung mit Vektor-DNA ligiert
ist, die sich autonom in Zellen von Escherichia coli und/oder coryneformen
Bakterien vervielfältigt,
um rekombinante DNA herzustellen, und die rekombinante DNA wird
zuvor in Escherichia coli-Zellen eingeführt. Solche Voraussetzungen
vereinfachen die folgenden Vorgänge.
Der Vektor, der sich autonom in Escherichia coli-Zellen vervielfältigt, ist
bevorzugt ein Plasmidvektor, der sich bevorzugt in Zellen eines
Wirts, einschliesslich z. B. pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399,
pHSG398 und RSF1010, vervielfältigt.
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Rekombinante
DNA kann hergestellt werden durch Verwenden von Transposon [
WO92/02627 ,
WO93/18151 ,
EP 0 445 385 A ,
JP 1994-046867 A , A.
A. Vertes et al., Mol. Microbiol., 11, 739–746 (1994), C. Bonamy et al.,
Mol. Microbiol., 14, 571–581
(1994), A. A. Vertes et al., Mol. Gen. Genet., 245, 397–405 (1994), W.
Jagar et al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1–6 (1995),
JP 1995-107976 A ,
JP 1995-327680 A ,
etc.], Phagenvektoren, Rekombination von Chromosomen [Experiments
in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972);
S. Matsuyama und S. Mizushima, J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)],
usw.
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Wenn
ein DNA-Fragment, das die Fähigkeit
besitzt, ein Plasmid sich autonom in coryneformen Bakterien vervielfältigen zu
lassen, in diese Vektoren eingefügt
wird, können
sie als ein sogenannter Shuttle-Vektor, der sich sowohl in Escherichia
coli als auch in coryneformen Bakterien autonom vervielfältigt, verwendet werden.
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Solch
ein Shuttle-Vektor schliesst die folgenden ein. Mikroorganismen,
die die jeweiligen Vektoren beherbergen, und die Hinterlegungs-Nrn.
in internationalen Hinterlegungseinrichtungen sind in Klammern angeführt.
pHC4:
Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532),
pAJ655: Escherichia
coli AJ11882 (FERM BP-136),
Corynebacterium glutamicum SR8201
(ATCC 39135),
pAJ1844: Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137),
Corynebacterium
glutamicum SR8202 (ATCC 39136),
pAJ611: Escherichia coli AJ11884
(FERM BP-138)
pAJ3148: Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC
39137)
pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140),
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Diese
Vektoren sind von den hinterlegten Mikroorganismen wie folgt erhältlich.
Zellen, die in einer logarithmischen Wachstumsphase gesammelt wurden,
wurden durch Verwenden von Lysozym und SDS lysiert, anschliessend
aus dem Lysat durch Zentrifugieren bei 30.000 g, um einen Überstand
zu erhalten, zu dem Polyethylenglykol gegeben, abgetrennt, dann
fraktioniert und gereinigt durch Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gleichgewichts-Dichtegradientenzentrifugation.
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Escherichia
coli kann transformiert werden durch Einführen eines Plasmids in Übereinstimmung
mit z. B. einem Verfahren von D. A. Morrison (Methods in Enzymology,
68, 326 (1979)) oder einem Verfahren, worin Rezipientenzellen mit
Calciumchlorid behandelt werden, um die Permeabilität für DNA zu
erhöhen
(M. Mandel und A. Higa, J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).
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Einführen von
Plasmiden in coryneforme Bakterien zur Transformation kann durch
das elektrische Pulsverfahren durchgeführt werden (Sugimoto et al.,
JP 1990-207791 A ).
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Die
Phosphoserinphosphatase kann durch Exprimieren der DNA der Erfindung
unter Verwendung eines geeigneten Wirt-Vektor-Systems hergestellt werden.
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Als
Wirt für
die Exprimierung der DNA dieser Erfindung können eine Vielzahl von prokaryotischen
Zellen, einschliesslich Bakterien, die zu Corynebacterium, wie Brevibacterium
flavum, Escherichia coli, Bacillus subtilis gehören, verschiedene eukaryotische
Zellen, einschliesslich Saccharomyces visiae, tierische Zellen und
Pflanzenzellen genannt werden. Unter diesen sind prokaryotische
Zellen, insbesondere Escherichia coli und Bacillus subtilis bevorzugt.
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Da
die DNA der Erfindung keinen Promotor besitzt, muss zur Exprimierung
des Gens ein Promotor, der in der Wirtszelle, wie lac, trp und PL, funktioniert, stromaufwärts der
DNA-Sequenz ligiert
sein. Durch Verwenden eines Vektors, der einen Promotor als Vektor
enthält,
kann die Ligation des Gens zu sowohl dem Vektor als auch dem Promotor
in einem Schritt durchgeführt
werden. Als solch ein Vektor kann pMW219, enthaltend lacZ-Promotor
(erhältlich
von Nippon Gene) genannt werden.
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Wenn
die DNA stark exprimiert ist, wird das Plasmid, enthaltend die DNA
der Erfindung, gelegentlich instabil. In solch einem Fall ist ein
Vektor mit geringer Kopienzahl bevorzugt.
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Die
Transformation kann z. B. erreicht werden durch das Verfahren, worin
Rezipientenzellen mit Calciumchlorid zur Erhöhung der Permeabilität für DNA behandelt
werden, wie für
den Stamm Escherichia coli K-12 beschrieben (M. Mandel, A. Higa,
J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), oder durch das Verfahren, bei dem
DNA in kompetente Zellen, hergestellt von Zellen in einer Wachstumsphase,
wie für
Bacillus subtilis beschrieben, eingeführt wird (C. H. Duncan, G.
A. Wilson und F. E. Young, Gene 1, 153 (1977)). Es ist auch möglich, einen Protoplasten
oder Sphäroplasten
von DNA-rezipienten
Zellen herzustellen, der DNA vollständig inkorporiert, und DNA
in diesen einzuführen,
wie es für
Bacillus subtilis, Actinomycetes und Hefe bekannt ist [S. Change und
S. N. Choen, Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); M. J. Bibb, J.
M. Ward und O. A. Hopwood, Nature, 274, 398 (1978); A. Hinnen. J.
B. Hicks und G. R. Fink, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1929 (1978)].
Das elektrische Pulsverfahren ist auch für coryneforme Bakterien wirksam
(
JP 1990-207791
A ). Dieses Verfahren kann geeigneterweise von diesen in
Abhängigkeit
von der als Wirt zu verwendenden Zelle ausgewählt werden.
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Die
Phosphoserinphosphatase kann hergestellt werden durch Kultivieren
der Zellen, in die die DNA dieser Erfindung auf solche Weise eingefügt wird,
dass die DNA wie oben in einem Medium exprimiert werden kann, um
Phosphoserinphosphatase in der Kultur herzustellen und zu akkumulieren,
und Sammeln der Phosphoserinphosphatase aus der Kultur. Das Kulturmedium
kann gemäss
dem zu verwendenden Wirt ausgewählt werden.
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Die
Phosphoserinphosphatase, die wie oben beschrieben hergestellt wird,
kann aus einem Zellextrakt oder Medium, wie benötigt, gereinigt werden durch
Verwendung eines üblichen
Reinigungsverfahrens für
Enzyme, z. B. Ionenaustauscherchromatografie, Gelfiltrationschromatografie,
Adsorptionschromatografie, Lösungsmittelpräzipitation,
usw..
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Ausserdem
kann die DNA dieser Erfindung zum Züchten von L-Serin-produzierenden
Bakterien, die zu coryneformen Bakterien oder dergleichen gehören, verwendet
werden. Das heisst, durch Verleihen oder Erhöhen der Phosphoserinphosphataseaktivität durch
Einfügen
der DNA dieser Erfindung in ein Bakterium in einer Form, dass die
DNA exprimiert werden kann, wird die L-Serin-Produktivität verliehen
bzw. gesteigert. Ausserdem kann die Erhöhung der Phosphoserinphosphataseaktivität auch durch
Amplifizieren der Kopienanzahl der serB-Homologen und Modifikation
der Expressionskontrollsequenz, um die Expression des serB-Homologen im Chromosom
des Brevibacterium flavum zu erhöhen,
erreicht werden. Modifikation der Expressionskontrollsequenz in
chromosomaler DNA wird z. B. durch Substitution starker Expressionskontrollsequenzen,
wie Promotoren und dergleichen, in den entsprechenden Operons, die
das serB-Homolog enthalten, durchgeführt (
JP 1989-215280 A ).
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Beispiele
des coryneformen Bakteriums, das zum Züchten des L-Aminosäure-produzierenden
Bakteriums verwendet werden kann, schliessen z. B. die folgenden
Wildtypstämme
ein:
Corynebacterium acetoacidophilum (ATCC 13870),
Corynebacterium
acetoglutamicum (ATCC 15806),
Corynebacterium callunae (ATCC
15991),
Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032),
Brevibacterium
divaricatum (ATCC 14020),
Brevibacterium lactofermentum (ATCC
13869),
Corynebacterium lilium (ATCC 15990),
Brevibacterium
flavus (ATCC 14067),
Corynebacterium melassecola (ATCC 17965),
Brevibacterium
saccharolyticum (ATCC 14066),
Brevibacterium immariophilum
(ATCC 14068),
Brevibacterium roseum (ATCC 13825),
Brevibacterium
thiogenitalis (ATCC 19240),
Microbacterium ammoniaphilum (ATCC
15354),
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).
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Mutantenstämme mit
Resistenz gegen Azaserin oder β-(2-Thienyl)-DL-alanin
(
EP 0 943 687 B )
können
auch als Startstamm zum Züchten
von L-Serin-produzierenden Bakterien verwendet werden.
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Weiterhin
kann die DNA der Erfindung in L-Serin-produzierende Bakterien mit anderen
Genen von Enzymen, einschliesslich L-Serinbiosynthese, eingefügt werden.
Solche Gene schliessen das Gen ein, das D-3-Phosphoglyceratdehydrogenase (serA)
(
EP 0 943 687 B ),
Phosphoserinphosphatase (serB) und Phosphoserintransaminase (serC)
(
EP 0 931 833 B )
codiert. Statt serA kann das Mutanten-Gen, das D-3-Phosphoglyceratdehydrogenase
codiert, dessen Feedback- Hemmung
durch L-Serin desensibilisiert ist, verwendet werden (
EP 0 943 687 B ).
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L-Serin
kann direkt von Zuckern durch Kultivierung der Mikroorganismen,
in die die DNA dieser Erfindung eingeführt ist, hergestellt werden
in solch einer Form, dass die DNA exprimiert wird, und die eine
L-Serin-produzierende Fähigkeit
in einem Medium besitzen, um L-Serin in dem Medium zu akkumulieren,
und Sammeln des L-Serins aus dem Medium. Ausserdem kann der Mikroorganismus,
in den die DNA dieser Erfindung eingeführt ist, in einem Verfahren
verwendet werden, zur Herstellung von L-Serin unter Verwendung von
L-Serin-Vorläufern,
wie Glycin und dergleichen, solange Phosphoserinphosphatase in dem
Verfahren involviert ist.
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Für die L-Serin-Herstellung
unter Verwendung der Mikroorganismen, in die die DNA dieser Erfindung eingeführt ist,
können
folgende Medien verwendet werden. Es können übliche flüssige Medien, einschliesslich Kohlenstoffquellen,
Stickstoffquellen, anorganische Salze und wahlweise organische Spurennährstoffe,
wie Aminosäuren,
Vitamine usw., falls gewünscht,
verwendet werden.
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Als
Kohlenstoffquelle verwendbar sind: Zucker, wie Glucose, Sucrose,
Fructose, Galactose; verzuckerte Stärkelösung, Süsskartoffelmelassen, Zuckerrübenmelassen
und Hightest-Melassen,
die die oben genannten Zucker einschliessen; organische Säuren, wie
Essigsäure;
Alkohole, wie Ethanol; Glycerin usw..
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Als
Stickstoffquellen verwendbar sind: Ammoniakgas, wässriges
Ammoniak, Ammoniumsalze, Harnstoff, Nitrate usw.. Ausserdem können organische
Stickstoffquellen zur ergänzenden
Verwendung z. B. Ölkuchen,
Sojabohnenhydrolysatflüssigkeiten,
zersetztes Kasein, andere Aminosäuren,
Stärkezuckersiruplösung aus
Mais, Hefe oder Hefeextrakte, Peptide, wie Pepton, usw. verwendet
werden.
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Als
anorganische Ionen können
wahlweise Phosphorionen, Magnesiumionen, Calciumionen, Eisenionen,
Magnesiumionen usw. zugegeben werden.
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Im
Fall der Verwendung des Mikroorganismus der Erfindung, der Nährstoffe,
wie Aminosäuren
für sein Wachstum
benötigt,
sollten die benötigten
Nährstoffe
ergänzt
werden.
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Die
Mikroorganismen werden üblicherweise
unter aeroben Bedingungen bei pH 5 bis 8 und Temperaturen im Bereich
von 25 bis 40°C
inkubiert. Der pH des Kulturmediums wird bei einem vorherbestimmten
Wert innerhalb der oben angegebenen Bereiche in Abhängigkeit
von Anwesenheit oder Abwesenheit von anorganischen oder organischen
Säuren,
basischen Substanzen, Harnstoff, Calciumcarbonat, Ammoniumgas usw. gehalten.
L-Serin kann aus der Fermentationsflüssigkeit gesammelt werden,
z. B. durch Trennen und Entfernen der Zellen, Aussetzen einer Ionenaustauscherharzbehandlung,
Konzentrationskühlungskristallisation, Membrantrennung
und anderen bekannten Verfahren in irgendeiner geeigneten Kombination.
Um Verunreinigungen zu entfernen, können Aktivkohleadsorption und
Umkristallisation zur Reinigung verwendet werden.
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Die
Erfindung wird mit Bezug auf das folgende Beispiel genauer beschrieben.
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(1) Herstellung der Brevibacterium flavum
chromosomalen DNA-Bibliothek unter Verwendung eines Vektors hoher
Kopienzahl:
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Chromosome
wurden aus Brevibacterium flavum (ATCC 14067) hergestellt und teilweise
in etwa 4 bis 6 kb-Fragmente mit dem Restriktionsenzym Sau3AI verdaut.
Das erhaltene Fragment wurde mit BamHI-verdautem pSAC ligiert, welches
ein Shuttle-Vektor von Escherichia coli und coryneformen Bakterien
ist.
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pSAC4
wurde wie folgt hergestellt.
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Um
einen Vektor pHSG399 für
Escherichia coli (Takara Shuzo) herzustellen, der sich in coryneformen Bakterienzellen
autonom vervielfältigt,
wurde ein Replikationsstartpunkt des zuvor erhaltenen Plasmids pHM1519,
das sich in coryneformen Bakterienzellen autonom vervielfältigt (K.
Miwa et al., Agric., Biol. Chem., 48 (1984), 2901–2903),
in den Vektor eingeführt
(
JP 1993-007491
A ). Genauer wurde pHM1519 mit Restriktionsenzymen BamHI
und KnpI verdaut, um ein Genfragment, enthaltend den Replikationsstartpunkt,
zu erhalten, und das erhaltene Fragment wurde unter Verwendung von
Blunting Lit (hergestellt von Takara Shuzo) blunt-ended und in die
SalI-Stelle des
pHSG399 unter Verwendung eines SalI-Linkers (hergestellt von Takara Shuzo)
insertiert, um pSAC4 zu erhalten.
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Der
oben genannte Ligationsreaktant wurde in TE-Puffer gelöst und Escherichia
coli DH5α wurde
unter Verwendung der Lösung
durch Elektroporation transformiert. Zu der Transformationslösung wurde SOC-Medium
(Zusammensetzung: 20 g/l Bactotrypton, 5 g/l Hefeextrakt, 0,5 g/l
NaCl, 10 g/l Glucose) gegeben, 1 Stunde bei 37°C inkubiert und dann das gleiche
Volumen von 2 × LB-Medium
(enthaltend 40 mg/l Chloramphenicol, Zusammensetzung des LB-Mediums:
1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% NaCl, 0,1% Glucose, pH 7) zugegeben
und 2 Stunden bei 37°C
inkubiert. Zu dem Kulturmedium wurde das gleiche Volumen von 4 × LB-Medium,
enthaltend 40% Glycerin, gegeben und bei –80°C aufbewahrt.
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Das
oben genannte Kulturmedium wurde zu dem LB-Medium inokuliert und
die Plasmide wurden von erhaltenen Zellen gesammelt. Die Plasmid-DNA
wurde mit Ethanol präzipitiert
und im serB-defizitären
Mutantenstamm ME8320 (thi, serB, zhi-1::Tn10) (erhalten von National
Gene Institute) durch Elektroporationsverfahren transformiert. Es
wurde bestätigt,
dass der ME8320-Stamm nicht in dem M9-Medium, enthaltend 140 mg/l Vitamin
B1, kleben konnte, aber in dem gleichen
Medium, enthaltend 40 mg/l L-Serin kleben konnte.
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Nach
der Transformation wurden die Zellen gewaschen, auf der MP-Agarmedium,
enthaltend 40 mg/l Vitamin B1 und Chloramphenicol,
aufgebracht und 3 bis 4 Tage bei 37°C inkubiert, um Kolonien zu
bilden. Plasmide wurden aus jeder Kolonie gebildet und ihre Grösse durch
Elektrophorese bestimmt. Als Ergebnis wurde eine bemerkenswerte
Deletion gefunden. Es wurde vermutet, dass die hohe Expression des
serB-Gens in der Zelle Plasmide instabil machte, so dass die Bibliothek
unter Verwendung eines Vektors mit geringer Kopienzahl wiederherstellbar
sein sollte.
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(2) Herstellung der Brevibacterium flavum-Chromosombibliothek
unter Verwendung eines Vektors mit geringer Kopienzahl und Klonen
des serB-Gens:
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Das
Chromosom wurde von Brevibacterium flavum (ATCC 14067) hergestellt
und mit Sau3AI verdaut. Die Reaktion wurde so eingestellt, dass
das Zentrum der Verteilung in etwa 3 kbp oder mehr betrug. Etwa
200 μg des
erhaltenen Verdau wurden durch Dichtegradientenzentrifugation mit
10 bis 40%-iger Sucrose abgetrennt und als 1 ml-Fraktionen mit AUTOMATIC
LIQUID CHARGE-ER (Advantec) und MICRO TUBE PUMP (Eyela) gesammelt.
Die Dichtegradientenzentrifugation wurde mit einem SW28-Rotor (Beckman)
bei 10°C, 260.000
U/min für
26 Stunden durchgeführt.
Die Fraktion, die die DNA-Fragmente enthielt, die im Zentrum der Verteilung
etwa 3 bis 4 kbp oder mehr betrugen, wurde mit Ethanol präzipitiert
und mit Microcon-50 (Millipore) gereinigt.
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Die
chromosomalen DNA-Fragmente, die wie oben beschrieben erhalten wurden,
wurden mit dem Vektor mit geringer Kopienzahl pMW219 (Nippon Gene,
BamHI-verdaut und dephosphoryliert) ligiert. Der Ligationsreaktant
wurde in TE-Puffer gelöst
und in Escherichia coli DH5α durch
Elektroporation transformiert. Zu der Transformationslösung wurde
SOC-Medium gegeben, 1 Stunde bei 37°C inkubiert und dann das gleiche Volumen
von 2 × LB-Medium
(enthaltend 25 mg/l Kanamycin) zugegeben und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Zu
dem Kulturmedium wurde das gleiche Volumen von 4 × LB-Medium,
enthaltend 40 Glycerin, gegeben und bei –80°C aufbewahrt.
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Das
vorstehend erwähnte
Kulturmedium wurde zu LB-Medium inokuliert und kultiviert. Plasmide
wurden aus erhaltenen Zellen gesammelt. Die Plasmid-DNA wurde mit
Ethanol präzipitiert
und in serB-defizitären Mutantenstamm
ME8320 durch Elektroporationsverfahren transformiert. Nach der Transformation
wurden die Zellen gewaschen, auf das M9-Agarmedium, enthaltend 25 mg/l Vitamin
B1 und Kanamycin, aufgebracht und 3 bis
4 Tage bei 37°C
inkubiert, um Kolonien zu bilden. Jede Kolonie wurde auf das gleiche
Medium und LB-Medium, enthaltend 25 mg/l Kanamycin, aufgebracht.
Die Stämme,
die auf dem Medium haften konnten, wurden ausgewählt und Plasmide wurden aus
den ausgewählten
Stämmen
hergestellt.
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Um
die Nukleotidsequenz des insertierten Segments des erhaltenen Plasmids
zu bestimmen, wurde von beiden Enden der multiklonalen Stelle des
Vektors mit den Universalprimern die Sequenzierung gestartet. Die
Sequenzierung wurde bis 300 bis 400 bp fortgeführt. Zum Schluss wurden etwa
5 kbp auf beiden Seiten der insertierten Fragmente sequenziert.
Der offene Leserahmen wurde auf eine bestimmte Nukleotidsequenz abgesucht
und ein ORF mit einer Homologie mit Phosphoserinphosphatase (codiert
durch das serB-Gen) anderer bekannter Spezies wurde gefunden. Es
gab verschiedene Regionen, die Homologie zeigten, jedoch betrug
die Homologie zwischen dem ORF und bekannter serB 43% in der Aminosäuresequenz,
49,4% in der Nukleotidsequenz für
Escherichia coli und 36,6% in der Aminosäuresequenz bzw. 50,9% in der
Nukleotidsequenz für
Saccharomyces cerevisiae. Nukleotid- und Aminosäuresequenzen wurden mit dem
Genetics-Mac-Computerprogramm
(Software Development Co., Tokyo, Japan) analysiert. Die Homologieanalyse
wurde gemäss dem
Verfahren von Lipman und Peason (Science, 227, 1435–1441 (1985)
durchgeführt.
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Die
Nukleotidsequenz des ORF mit einer Homologie zwischen anderen bekannten
serB-Genen und den flankierenden Regionen (SEQ ID Nr. 1) und die
Aminosäuresequenz,
die durch die Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 2) codiert sein kann,
sind in der Sequenzliste angeführt.
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(3) Klonen des ORF, der Homologie mit
serB besitzt:
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Das
chromosomale DNA-Fragment, das den ORF enthielt und etwa 200 bis
300 bp der stromaufwärtigen
und stromabwärtigen
Regionen des ORF wurden kloniert und Komplementationsversuche des
serB-defizienten Stammes wurden durchgeführt, um zu bestätigen, dass
der ORF, der die Homologie mit dem serB-Gen zeigte, tatsächlich serB-Gen war.
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Die
Primer mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 und 4 wurden entworfen,
um die gewünschte
DNA mit PCR zu erhalten. PCR wurde unter Verwendung dieser Primer
und chromosomaler DNA, hergestellt von Brevibacterium flavum (ATCC
14067), als eine Matrize durchgeführt. Die PCR-Reaktion wurde in
30 Zyklen durchgeführt,
wobei jeder bestand aus der Reaktion bei 98°C für 10 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden
und 72°C
für 2 Minuten
mit Pyrobest-DNA-Polymerase
(Takara Shuzo). Das amplifizierte DNA-Fragment und der Vektor pMW219
wurden mit EcoRI und SalI verdaut und ligierten einander, was zum
Plasmid pMW218BSB führte.
Es wurde bestätigt,
dass mit PCR durch Sequenzierung des amplifizierten Fragments kein
Fehler eingefügt
wird. Der oben genannte ORF wird in Rückwärtsrichtung in den lacZ-Promotor des Vektors
insertiert.
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pMW219BSB
wurde in den ME8320-Stamm auf die gleiche Weise wie in (2) beschrieben
eingefügt und
auf LB-Medium, enthaltend 25 mg/l Kanamycin, aufgebracht. Gebildete
Kolonien wurden durch 10 Stämme
aufgenommen und diese wurden inokuliert und kultiviert in MP-Medium,
jedoch wurde kein Wachstum gefunden.
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(4) Forcierte Exprimierung des ORF, der
Homologie mit serB besitzt:
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Die
Orientierung des insertierten Fragments in pMW219BSB wurde geändert, um
in Vorwärtsrichtung plaziert
werden zu können,
um forciert exprimiert zu werden. Das erhaltene Plasmid wurde in
den ME8320-Stamm eingeführt
und auf LB-Medium,
enthaltend 25 mg/l Kanamycin, aufgebracht. Die gebildeten Kolonien
wuchsen auf dem minimalen Medium.
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Gemäss dem oben
genannten Resultat wurde demonstriert, dass der oben genannte ORF,
der Homologie mit dem serB-Gen besitzt, die Fähigkeit aufweist, serB-Mangel
von Escherichia coli zu komplementieren. Dadurch wurde bestätigt, dass
der ORF ein serB-Homolog von Brevibacterium flavum ist.
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Ein
anderer ORF wurde gerade stromaufwärts des ORFs, der Homologie
mit dem serB-Gen besitzt, im klonierten Fragment wie oben in (2)
beschrieben, gefunden. Daraus wurde geschlossen, dass pMW219BSB serB-Mangel
nicht komplementieren konnte, da diese ORFs Operonen darstellen,
und es gab keine Promotorregion und dergleichen gerade stromaufwärts der
ORFs, der eine Homologie mit dem serB-Gen besitzt.