DE10103509B4

DE10103509B4 - Phosphoserinphospatase-Gen der coryneformen Bakterien

Info

Publication number: DE10103509B4
Application number: DE10103509A
Authority: DE
Inventors: Mikiko Kawasaki Suga; Yoko Kawasaki Asakura; Masakazu Kawasaki Sugimoto; Hisao Kawasaki Ito
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2000-01-27
Filing date: 2001-01-26
Publication date: 2010-09-02
Anticipated expiration: 2021-01-27
Also published as: US20020038008A1; US6395528B1; US20060293513A1; US7029896B2; US7329523B2; FR2804961A1; FR2804961B1; DE10103509A1; US20030114656A1; US20020120122A1

Abstract

Protein, definiert durch (A) oder (B):
(A) Protein, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst; oder
(B) Protein, das eine Aminosäuresequenz, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer oder 2 bis 50 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst, und welches Phosphoserinphosphataseaktivität besitzt,
mit der Maßgabe, dass das Protein nicht die folgende Aminosäuresequenz hat:

Description

Diese Erfindung betrifft die DNA, die Phosphoserinphosphatase der coryneformen Bakterien codiert. Die DNA könnte in der mikrobiologischen Industrie beispielsweise zum Züchten von coryneformen Bakterien, die L-Serin produzieren, verwendet werden.
Als ein konventionelles Verfahren zur Herstellung von L-Serin durch Fermentation ist ein Verfahren bekannt, worin ein Bakterienstamm, der Glycin und Zucker zu L-Serin konvertieren kann, in einem Medium, enthaltend 30 g/l Glycin, verwendet wird, wobei höchstens 14 g/l L-Serin hergestellt werden. Die Konvertierungsausbeute beläuft sich auf 46% (K. Kubota, Agricultural Biological Chemistry, 49, 7–12 (1985)). Bei Verwendung eines Bakterienstammes, der Glycin und Methanol zu L-Serin konvertieren kann, lassen sich 53 g/l L-Serin aus 100 g/l Glycin herstellen (T. Yoshida et al., Journal of Fermentation and Bioengineering, Bd. 79, Nr. 2, 181–183, 1995). Aus einem Verfahren, bei dem Nocardia verwendet wird, ist bekannt, dass die L-Serin-Produktivität des Bakteriums verbessert werden kann, indem die Stämme gezüchtet werden, die gegen Serinhydroxamat, Azaserin usw. resistent sind ( JP 57-1235 A ). Diese Verfahren erfordern jedoch die Verwendung von Glycin, das ein Vorläufer von L-Serin ist, schliessen komplizierte Vorgänge ein und sind hinsichtlich der Kosten unvorteilhaft.
Ein Stamm, der L-Serin direkt aus einem Zucker fermentieren kann und bei dem der Vorläufer von L-Serin nicht zu dem Medium gegeben werden muss, ist Corynebacterium glutamicum, das gegen D-Serin, α-Methylserin, o-Methylserin, Isoserin, Serinhydroxamat und 3-Chloralanin resistent ist, jedoch L-Serin lediglich zu 0,8 g/l anreichert (Nogei Kagakukaishi, Bd. 48, Nr. 3, Seiten 201 bis 208, 1974). Entsprechend sind weitere Stammverbesserungen zur direkten Fermentation von L-Serin im industriellen Massstab notwendig.
Andererseits wurde hinsichtlich coryneformer Bakterien ein Vektorplasmid, das zur autonomen Replikation in der Zelle befähigt ist und ein Markergen besitzt, das gegen einen Wirkstoff resistent ist (vgl. US 4,514,502 ), und ein Verfahren zum Einführen eines Gens in eine Zelle ( JP 1990-207791 A ) offenbart. Diese Verfahren sind zum Züchten von Bakterien, die L-Aminosäuren produzieren, verwendet worden. Wie für L-Serin wurde gefunden, dass die L-Serin-Produktivität von coryneformen Bakterien, die L-Serin produzieren können, verbessert wird durch: Einführen eines Gens, das D-3-Phosphoglyceratdehydrogenase codiert, dessen Feedback-Hemmung durch L-Serin desensibilisiert ist, (serA-Gen) ( EP 0 943 687 A2 ) oder Amplifikation eines Gens, das Phosphoserinphosphatase (serB) oder Phosphoserintransaminase (serC) codiert ( EP 0 931 833 A2 ). Das serB-Gen in Escherichia coli (GenBank Zugang X03046, M30784), Hefe (GenBank Zugang U36473) und Helicobacter pylori (GenBank Zugang AF006039) war bekannt, jedoch nicht das serB-Gen der coryneformen Bakterien.
Angesichts des Vorstehenden ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, die DNA bereitzustellen, die die Phosphoserinphosphatase coryneformer Bakterien codiert.
Die Erfinder erhielten das DNA-Fragment aus einer Chromosomen-DNA-Bibliothek von Brevibacterium flavum, das den serB-Mangel von Escherichia coli komplementiert. Der offene Leserahmen, der Homologie mit dem bekannten serB-Gen von Escherichia coli besitzt, wurde aus dem DNA-Fragment subkloniert und in den serB-defizitären Mutantenstamm des oben genannten Escherichia coli eingefügt. Jedoch wurde der serB-Mangel nicht komplementiert. Es wurde gefunden, dass der serB-Mangel mit dem oben genannten ORF komplementiert wird, welcher unter Verwendung von lac-Promoter forciert exprimiert wurde. Dadurch wurde bestätigt, dass der oben genannte ORF ein serB-Homologes von Brevibacterium flavum war. Es zeigte sich, dass der oben genannte ORF keinen eigenen Promoter besass, da er ein Operon bildet.
Die vorliegende Erfindung wurde wie oben beschrieben gemacht und stellt Folgendes bereit, das auch den Ansprüchen entspricht:

1. Protein, definiert durch (A) oder (B): (A) Protein, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst; oder (B) Protein, das eine Aminosäuresequenz, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer oder 2 bis 50 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst, und welches Phosphoserinphosphataseaktivität besitzt, mit der Maßgabe, dass das Protein nicht die folgende Aminosäuresequenz hat:
2. DNA, die ein Protein gemäss (A) oder (B) codiert: (A) Protein, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst; oder (B) Protein, das eine Aminosäuresequenz, einschliesslich Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst, und welches Phosphoserinphosphataseaktivität besitzt, mit der Maßgabe, daß das Protein nicht die folgende Aminosäuresequenz hat:
3. DNA, die ein Protein mit Phosphoserinphosphataseaktivität codiert und eine Homologie von nicht weniger als 80% mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2 aufweist, mit der Maßgabe, dass die DNA nicht die folgende Nucleinsäuresequenz hat:
4. DNA gemäß Anspruch 2 oder 3, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die den Nukleotiden 210-1547 der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste entspricht.
5. Vektor umfassend die DNA gemäß mindestens einem der Ansprüche 2 bis 4.
6. Bakterienzelle umfassend eine DNA, die ein Protein mit Phosphoserinphosphataseaktivität kodiert, wobei die DNA ausgewählt ist aus einer (i) DNA, die ein Protein gemäß (A), (B) oder (C) kodiert: (A) Protein, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst; oder (B) Protein, das eine Aminosäuresequenz, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer oder 2 bis 50 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst, (C) Protein, das eine Homologie von nicht weniger als 80% mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr: 2 aufweist; oder (ii) DNA, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die den Nukleotiden 210-1547 der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr: 1 der Sequenzliste entspricht; wobei die Phosphoserinphosphataseaktivität erhöht wird durch Amplifizieren der Kopienanzahl der DNA gemäß (i) oder (ii) oder Modifikation der Expressionskontrollsequenz
7. Verfahren zur Herstellung von L-Serin, umfassend die Schritte: Kultivieren des Bakteriums gemäss Anspruch 6 in einem Medium zur Herstellung und Akkumulierung von L-Serin in dem Medium und Sammeln des L-Serins in dem Medium.
8. Verwendung eines Vektors, umfassend eine DNA, die ein Protein mit Phosphoserinphosphataseaktivität kodiert, wobei die DNA ausgewählt ist aus einer (i) DNA, die ein Protein gemäß (A), (B) oder (C) kodiert: (A) Protein, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst; oder (B) Protein, das eine Aminosäuresequenz, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer oder 2 bis 50 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst, (C) Protein, das eine Homologie von nicht weniger als 80% mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr: 2 aufweist; oder (ii) DNA, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die den Nukleotiden 210-1547 der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr: 1 der Sequenzliste entspricht; zur Herstellung von L-Serin.

Nachstehend wird die Erfindung genauer beschrieben.
Die erfindungsgemäße DNA kann erhalten werden durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion) unter Verwendung von sowohl chromosomaler DNA von Brevibacterium flavum, z. B. dem Brevibacterium flavum-Stamm ATCC 14067, als Matrize, als auch von einem Primer mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nrn. 3 und 4 der Sequenzliste. Da jeder dieser Primer eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle von EcoRI oder SalI in seinen 5'-Sequenzen besitzt, kann das Amplifizierungsprodukt, das mit diesen Restriktionsenzymen verdaut wurde, in einen Vektor mit EcoRI- und SalI-verdauten Enden insertiert werden.
Die Nukleotidsequenzen der oben genannten Primer wurden, basierend auf der Nukleotidsequenz des DNA-Fragments, das den serB-defizitären Mutantenstamm Escherichia coli ME8320 (thi, serB, zhi-1::Tn10) (erhältlich vom National Genetics Institute) komplementiert, entworfen. Durch Verwendung dieser Primer kann ein DNA-Fragment erhalten werden, das die codierende Region des serB-Homologen und seine flankierende Region (5'-nicht-translatierende Region von etwa 200 bp und 3'-nicht-translatierende Region von etwa 300 bp) enthält.
Die Nukleotidsequenz der codierenden Region der DNA der Erfindung, erhältlich wie oben beschrieben, und eine Aminosäuresequenz, die durch diese Sequenz codiert werden kann, sind in SEQ ID Nr. 1 gezeigt. Die Aminosäuresequenz für sich ist in SEQ ID Nr. 2 gezeigt. Die nicht von der Erfindung umfaßten DNA- und Aminosäuresequenzen sind in den Ansprüchen gezeigt.
Es zeigte sich, dass es sich beim oben genannten serB-Homologen um den offenen Leserahmen (ORF) handelt, der Homologie mit serB-Genen von Escherichia coli und Hefe (Saccharomyces cerevisiae) besitzt, das in dem DNA-Fragment existiert, das den serB-Mangel des Stamms ME8320 komplementiert. Das DNA-Fragment, das lang genug ist, um den ORF und den Promotor zu enthalten, wurde aus Brevibacterium flavum ATCC 14067 durch PCR unter Verwendung der oben genannten Primer mit den in der Sequenzliste gezeigten Nukleotidsequenzen SEQ ID Nrn. 3 und 4 erhalten. Es wurde in den Stamm ME8320 eingeführt, jedoch wurde der serB-Mangel des Stamms nicht komplementiert. Deshalb wurde zunächst angenommen, dass es sich bei dem oben genannten ORF nicht um das serB-Homolog handelt. Jedoch wurde der serB-Mangel mit dem oben genannten ORF komplementiert, welcher mit lac-Promotor ligiert und forciert exprimiert wurde. Es wurde also bestätigt, dass es sich bei dem oben genannten ORF um ein serB-Homologes handelt.
Des weiteren wurde der andere ORF gerade stromaufwärts des serB-Homologen im DNA-Fragment, das den serB-Mangel komplementiert, gefunden. Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass diese ORFs ein Operon bilden und es keine Promotorregion und dergleichen gerade stromaufwärts des serB-Homologen gibt.
Zuerst wurde versucht, ein serB-Homolog von Brevibacterium flavum durch Verwendung der Nukleotidsequenz des bekannten serB-Gens zu erhalten. Das heisst, die Erfinder beabsichtigten, die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz eines bekannten serB-Gens unter den anderen Spezies zu vergleichen, gut erhaltene Aminosäuresequenzregionen unter vielen Spezies zu suchen, PCR-Primer, basierend auf der Nukleotidsequenz der Region zu synthetisieren und serB-Homologe mit diesen Primern zu amplifizieren. Da jedoch sehr wenige dieser erhaltenen Regionen existieren, wurde vermutet, dass es schwierig ist, das Ziel-Gen durch PCR zu erhalten. Deshalb wurde ein Komplementationstest unter Verwendung von serB-defizitärem Mutantenstamm durchgeführt.
Während die DNA der Erfindung durch Klonen durch Komplementationstest unter Verwendung von serB-defizitären Mutanten und Subklonen durch PCR, wie oben beschrieben, erhalten wurde, kann sie auch aus einer chromosomalen DNA-Bibliothek von Brevibacterium flavum mittels Hybridisierung unter Verwendung eines Oligonukleotids als Sonde, hergestellt auf Basis der Nukleotidsequenz der DNA der Erfindung, erhalten werden.
Verfahren zur Konstruktion einer genomischen DNA-Bibliothek, Hybridisierung, PCR, Herstellung von Plasmid-DNA, Verdauung und Ligation von DNA, Transformation usw. sind in J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21 (1989), beschrieben.
Die DNA der Erfindung kann Phosphoserinphosphatase, einschliesslich Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer oder 2 bis 50, und bevorzugter 2–20 Aminosäuren in einer oder einer Vielzahl von Positionen, codieren, vorausgesetzt, dass die Aktivität der Phosphoserinphosphatase, die dadurch codiert wird, sich nicht verschlechtert. Weiterhin kann die DNA der Erfindung Phosphoserinphosphatase mit einer Homologie von nicht weniger als 80%, und am meisten bevorzugt nicht weniger als 90%, mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 codieren, vorausgesetzt dass die Aktivität der dadurch codierten Phosphoserinphosphatase sich nicht verschlechtert.
DNA, die das im wesentlichen gleiche Protein wie Phosphoserinphosphatase, wie oben beschrieben, codiert, wird z. B. erhalten durch Modifizierung der Nukleotidsequenz des Phosphoserinphosphatase-Gens, z. B. durch ortsspezifische Mutageneseverfahren, so dass ein oder mehrere Aminosäurereste in einer spezifischen Stelle des Gens Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion involvieren. DNA, die wie oben beschrieben modifiziert ist, kann z. B. durch die üblichen bekannten Mutationsbehandlungen erhalten werden. Die Mutationsbehandlung schliesst ein Verfahren zur Behandlung von DNA, die Phosphoserinphosphatase in vitro codiert, z. B. mit Hydroxylamin, und ein Verfahren zur Behandlung eines Mikroorganismus, z. B. eines Bakteriums, das zu der Gattung Escherichia gehört, das DNA, die Phosphoserinphosphatase codiert, beherbergt, mit ultravioletter Strahlung oder einem Mutationsmittel, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) und Salpetersäure, üblicherweise verwendet für die Mutationsbehandlung, ein.
Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion des Nukleotids, wie oben beschrieben, schliesst auch natürlich vorkommende Mutation (Mutant oder Variant) ein, z. B. der Unterschied in Stämmen, Spezies oder Genera der Mikroorganismen.
Die DNA, welche im wesentlichen das gleiche Protein wie Phosphoserinphosphatase codiert, wird durch Exprimieren von DNA mit einer wie oben beschriebenen Mutation in einer angemessenen Zelle und Untersuchung der Phosphoserinphosphataseaktivität des exprimierten Produkts erhalten.
Die DNA, die das im wesentlichen gleiche Protein wie Phosphoserinphosphatase codiert, wird auch durch Isolieren von DNA, die mit einem Primer, der z. B. die Nukleotidsequenz besitzt, die die Nukleotide 210-1547 der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 umfasst, und die ein Protein mit der Phosphoserinphosphataseaktivität codiert, aus DNA, die Phosphoserinphosphatase mit Mutation codiert, oder aus einer Zelle, die sie beherbergt, erhalten.
Es ist bevorzugt, dass die DNA der Erfindung mit Vektor-DNA ligiert ist, die sich autonom in Zellen von Escherichia coli und/oder coryneformen Bakterien vervielfältigt, um rekombinante DNA herzustellen, und die rekombinante DNA wird zuvor in Escherichia coli-Zellen eingeführt. Solche Voraussetzungen vereinfachen die folgenden Vorgänge. Der Vektor, der sich autonom in Escherichia coli-Zellen vervielfältigt, ist bevorzugt ein Plasmidvektor, der sich bevorzugt in Zellen eines Wirts, einschliesslich z. B. pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 und RSF1010, vervielfältigt.
Rekombinante DNA kann hergestellt werden durch Verwenden von Transposon [ WO92/02627 , WO93/18151 , EP 0 445 385 A , JP 1994-046867 A , A. A. Vertes et al., Mol. Microbiol., 11, 739–746 (1994), C. Bonamy et al., Mol. Microbiol., 14, 571–581 (1994), A. A. Vertes et al., Mol. Gen. Genet., 245, 397–405 (1994), W. Jagar et al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1–6 (1995), JP 1995-107976 A , JP 1995-327680 A , etc.], Phagenvektoren, Rekombination von Chromosomen [Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); S. Matsuyama und S. Mizushima, J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)], usw.
Wenn ein DNA-Fragment, das die Fähigkeit besitzt, ein Plasmid sich autonom in coryneformen Bakterien vervielfältigen zu lassen, in diese Vektoren eingefügt wird, können sie als ein sogenannter Shuttle-Vektor, der sich sowohl in Escherichia coli als auch in coryneformen Bakterien autonom vervielfältigt, verwendet werden.
Solch ein Shuttle-Vektor schliesst die folgenden ein. Mikroorganismen, die die jeweiligen Vektoren beherbergen, und die Hinterlegungs-Nrn. in internationalen Hinterlegungseinrichtungen sind in Klammern angeführt.
pHC4: Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532),
pAJ655: Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136),
Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135),
pAJ1844: Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137),
Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136),
pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138)
pAJ3148: Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137)
pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140),
Diese Vektoren sind von den hinterlegten Mikroorganismen wie folgt erhältlich. Zellen, die in einer logarithmischen Wachstumsphase gesammelt wurden, wurden durch Verwenden von Lysozym und SDS lysiert, anschliessend aus dem Lysat durch Zentrifugieren bei 30.000 g, um einen Überstand zu erhalten, zu dem Polyethylenglykol gegeben, abgetrennt, dann fraktioniert und gereinigt durch Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gleichgewichts-Dichtegradientenzentrifugation.
Escherichia coli kann transformiert werden durch Einführen eines Plasmids in Übereinstimmung mit z. B. einem Verfahren von D. A. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)) oder einem Verfahren, worin Rezipientenzellen mit Calciumchlorid behandelt werden, um die Permeabilität für DNA zu erhöhen (M. Mandel und A. Higa, J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).
Einführen von Plasmiden in coryneforme Bakterien zur Transformation kann durch das elektrische Pulsverfahren durchgeführt werden (Sugimoto et al., JP 1990-207791 A ).
Die Phosphoserinphosphatase kann durch Exprimieren der DNA der Erfindung unter Verwendung eines geeigneten Wirt-Vektor-Systems hergestellt werden.
Als Wirt für die Exprimierung der DNA dieser Erfindung können eine Vielzahl von prokaryotischen Zellen, einschliesslich Bakterien, die zu Corynebacterium, wie Brevibacterium flavum, Escherichia coli, Bacillus subtilis gehören, verschiedene eukaryotische Zellen, einschliesslich Saccharomyces visiae, tierische Zellen und Pflanzenzellen genannt werden. Unter diesen sind prokaryotische Zellen, insbesondere Escherichia coli und Bacillus subtilis bevorzugt.
Da die DNA der Erfindung keinen Promotor besitzt, muss zur Exprimierung des Gens ein Promotor, der in der Wirtszelle, wie lac, trp und P_L, funktioniert, stromaufwärts der DNA-Sequenz ligiert sein. Durch Verwenden eines Vektors, der einen Promotor als Vektor enthält, kann die Ligation des Gens zu sowohl dem Vektor als auch dem Promotor in einem Schritt durchgeführt werden. Als solch ein Vektor kann pMW219, enthaltend lacZ-Promotor (erhältlich von Nippon Gene) genannt werden.
Wenn die DNA stark exprimiert ist, wird das Plasmid, enthaltend die DNA der Erfindung, gelegentlich instabil. In solch einem Fall ist ein Vektor mit geringer Kopienzahl bevorzugt.
Die Transformation kann z. B. erreicht werden durch das Verfahren, worin Rezipientenzellen mit Calciumchlorid zur Erhöhung der Permeabilität für DNA behandelt werden, wie für den Stamm Escherichia coli K-12 beschrieben (M. Mandel, A. Higa, J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), oder durch das Verfahren, bei dem DNA in kompetente Zellen, hergestellt von Zellen in einer Wachstumsphase, wie für Bacillus subtilis beschrieben, eingeführt wird (C. H. Duncan, G. A. Wilson und F. E. Young, Gene 1, 153 (1977)). Es ist auch möglich, einen Protoplasten oder Sphäroplasten von DNA-rezipienten Zellen herzustellen, der DNA vollständig inkorporiert, und DNA in diesen einzuführen, wie es für Bacillus subtilis, Actinomycetes und Hefe bekannt ist [S. Change und S. N. Choen, Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); M. J. Bibb, J. M. Ward und O. A. Hopwood, Nature, 274, 398 (1978); A. Hinnen. J. B. Hicks und G. R. Fink, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1929 (1978)]. Das elektrische Pulsverfahren ist auch für coryneforme Bakterien wirksam ( JP 1990-207791 A ). Dieses Verfahren kann geeigneterweise von diesen in Abhängigkeit von der als Wirt zu verwendenden Zelle ausgewählt werden.
Die Phosphoserinphosphatase kann hergestellt werden durch Kultivieren der Zellen, in die die DNA dieser Erfindung auf solche Weise eingefügt wird, dass die DNA wie oben in einem Medium exprimiert werden kann, um Phosphoserinphosphatase in der Kultur herzustellen und zu akkumulieren, und Sammeln der Phosphoserinphosphatase aus der Kultur. Das Kulturmedium kann gemäss dem zu verwendenden Wirt ausgewählt werden.
Die Phosphoserinphosphatase, die wie oben beschrieben hergestellt wird, kann aus einem Zellextrakt oder Medium, wie benötigt, gereinigt werden durch Verwendung eines üblichen Reinigungsverfahrens für Enzyme, z. B. Ionenaustauscherchromatografie, Gelfiltrationschromatografie, Adsorptionschromatografie, Lösungsmittelpräzipitation, usw..
Ausserdem kann die DNA dieser Erfindung zum Züchten von L-Serin-produzierenden Bakterien, die zu coryneformen Bakterien oder dergleichen gehören, verwendet werden. Das heisst, durch Verleihen oder Erhöhen der Phosphoserinphosphataseaktivität durch Einfügen der DNA dieser Erfindung in ein Bakterium in einer Form, dass die DNA exprimiert werden kann, wird die L-Serin-Produktivität verliehen bzw. gesteigert. Ausserdem kann die Erhöhung der Phosphoserinphosphataseaktivität auch durch Amplifizieren der Kopienanzahl der serB-Homologen und Modifikation der Expressionskontrollsequenz, um die Expression des serB-Homologen im Chromosom des Brevibacterium flavum zu erhöhen, erreicht werden. Modifikation der Expressionskontrollsequenz in chromosomaler DNA wird z. B. durch Substitution starker Expressionskontrollsequenzen, wie Promotoren und dergleichen, in den entsprechenden Operons, die das serB-Homolog enthalten, durchgeführt ( JP 1989-215280 A ).
Beispiele des coryneformen Bakteriums, das zum Züchten des L-Aminosäure-produzierenden Bakteriums verwendet werden kann, schliessen z. B. die folgenden Wildtypstämme ein:
Corynebacterium acetoacidophilum (ATCC 13870),
Corynebacterium acetoglutamicum (ATCC 15806),
Corynebacterium callunae (ATCC 15991),
Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032),
Brevibacterium divaricatum (ATCC 14020),
Brevibacterium lactofermentum (ATCC 13869),
Corynebacterium lilium (ATCC 15990),
Brevibacterium flavus (ATCC 14067),
Corynebacterium melassecola (ATCC 17965),
Brevibacterium saccharolyticum (ATCC 14066),
Brevibacterium immariophilum (ATCC 14068),
Brevibacterium roseum (ATCC 13825),
Brevibacterium thiogenitalis (ATCC 19240),
Microbacterium ammoniaphilum (ATCC 15354),
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).
Mutantenstämme mit Resistenz gegen Azaserin oder β-(2-Thienyl)-DL-alanin ( EP 0 943 687 B ) können auch als Startstamm zum Züchten von L-Serin-produzierenden Bakterien verwendet werden.
Weiterhin kann die DNA der Erfindung in L-Serin-produzierende Bakterien mit anderen Genen von Enzymen, einschliesslich L-Serinbiosynthese, eingefügt werden. Solche Gene schliessen das Gen ein, das D-3-Phosphoglyceratdehydrogenase (serA) ( EP 0 943 687 B ), Phosphoserinphosphatase (serB) und Phosphoserintransaminase (serC) ( EP 0 931 833 B ) codiert. Statt serA kann das Mutanten-Gen, das D-3-Phosphoglyceratdehydrogenase codiert, dessen Feedback- Hemmung durch L-Serin desensibilisiert ist, verwendet werden ( EP 0 943 687 B ).
L-Serin kann direkt von Zuckern durch Kultivierung der Mikroorganismen, in die die DNA dieser Erfindung eingeführt ist, hergestellt werden in solch einer Form, dass die DNA exprimiert wird, und die eine L-Serin-produzierende Fähigkeit in einem Medium besitzen, um L-Serin in dem Medium zu akkumulieren, und Sammeln des L-Serins aus dem Medium. Ausserdem kann der Mikroorganismus, in den die DNA dieser Erfindung eingeführt ist, in einem Verfahren verwendet werden, zur Herstellung von L-Serin unter Verwendung von L-Serin-Vorläufern, wie Glycin und dergleichen, solange Phosphoserinphosphatase in dem Verfahren involviert ist.
Für die L-Serin-Herstellung unter Verwendung der Mikroorganismen, in die die DNA dieser Erfindung eingeführt ist, können folgende Medien verwendet werden. Es können übliche flüssige Medien, einschliesslich Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und wahlweise organische Spurennährstoffe, wie Aminosäuren, Vitamine usw., falls gewünscht, verwendet werden.
Als Kohlenstoffquelle verwendbar sind: Zucker, wie Glucose, Sucrose, Fructose, Galactose; verzuckerte Stärkelösung, Süsskartoffelmelassen, Zuckerrübenmelassen und Hightest-Melassen, die die oben genannten Zucker einschliessen; organische Säuren, wie Essigsäure; Alkohole, wie Ethanol; Glycerin usw..
Als Stickstoffquellen verwendbar sind: Ammoniakgas, wässriges Ammoniak, Ammoniumsalze, Harnstoff, Nitrate usw.. Ausserdem können organische Stickstoffquellen zur ergänzenden Verwendung z. B. Ölkuchen, Sojabohnenhydrolysatflüssigkeiten, zersetztes Kasein, andere Aminosäuren, Stärkezuckersiruplösung aus Mais, Hefe oder Hefeextrakte, Peptide, wie Pepton, usw. verwendet werden.
Als anorganische Ionen können wahlweise Phosphorionen, Magnesiumionen, Calciumionen, Eisenionen, Magnesiumionen usw. zugegeben werden.
Im Fall der Verwendung des Mikroorganismus der Erfindung, der Nährstoffe, wie Aminosäuren für sein Wachstum benötigt, sollten die benötigten Nährstoffe ergänzt werden.
Die Mikroorganismen werden üblicherweise unter aeroben Bedingungen bei pH 5 bis 8 und Temperaturen im Bereich von 25 bis 40°C inkubiert. Der pH des Kulturmediums wird bei einem vorherbestimmten Wert innerhalb der oben angegebenen Bereiche in Abhängigkeit von Anwesenheit oder Abwesenheit von anorganischen oder organischen Säuren, basischen Substanzen, Harnstoff, Calciumcarbonat, Ammoniumgas usw. gehalten. L-Serin kann aus der Fermentationsflüssigkeit gesammelt werden, z. B. durch Trennen und Entfernen der Zellen, Aussetzen einer Ionenaustauscherharzbehandlung, Konzentrationskühlungskristallisation, Membrantrennung und anderen bekannten Verfahren in irgendeiner geeigneten Kombination. Um Verunreinigungen zu entfernen, können Aktivkohleadsorption und Umkristallisation zur Reinigung verwendet werden.
Die Erfindung wird mit Bezug auf das folgende Beispiel genauer beschrieben.
(1) Herstellung der Brevibacterium flavum chromosomalen DNA-Bibliothek unter Verwendung eines Vektors hoher Kopienzahl:
Chromosome wurden aus Brevibacterium flavum (ATCC 14067) hergestellt und teilweise in etwa 4 bis 6 kb-Fragmente mit dem Restriktionsenzym Sau3AI verdaut. Das erhaltene Fragment wurde mit BamHI-verdautem pSAC ligiert, welches ein Shuttle-Vektor von Escherichia coli und coryneformen Bakterien ist.
pSAC4 wurde wie folgt hergestellt.
Um einen Vektor pHSG399 für Escherichia coli (Takara Shuzo) herzustellen, der sich in coryneformen Bakterienzellen autonom vervielfältigt, wurde ein Replikationsstartpunkt des zuvor erhaltenen Plasmids pHM1519, das sich in coryneformen Bakterienzellen autonom vervielfältigt (K. Miwa et al., Agric., Biol. Chem., 48 (1984), 2901–2903), in den Vektor eingeführt ( JP 1993-007491 A ). Genauer wurde pHM1519 mit Restriktionsenzymen BamHI und KnpI verdaut, um ein Genfragment, enthaltend den Replikationsstartpunkt, zu erhalten, und das erhaltene Fragment wurde unter Verwendung von Blunting Lit (hergestellt von Takara Shuzo) blunt-ended und in die SalI-Stelle des pHSG399 unter Verwendung eines SalI-Linkers (hergestellt von Takara Shuzo) insertiert, um pSAC4 zu erhalten.
Der oben genannte Ligationsreaktant wurde in TE-Puffer gelöst und Escherichia coli DH5α wurde unter Verwendung der Lösung durch Elektroporation transformiert. Zu der Transformationslösung wurde SOC-Medium (Zusammensetzung: 20 g/l Bactotrypton, 5 g/l Hefeextrakt, 0,5 g/l NaCl, 10 g/l Glucose) gegeben, 1 Stunde bei 37°C inkubiert und dann das gleiche Volumen von 2 × LB-Medium (enthaltend 40 mg/l Chloramphenicol, Zusammensetzung des LB-Mediums: 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% NaCl, 0,1% Glucose, pH 7) zugegeben und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Zu dem Kulturmedium wurde das gleiche Volumen von 4 × LB-Medium, enthaltend 40% Glycerin, gegeben und bei –80°C aufbewahrt.
Das oben genannte Kulturmedium wurde zu dem LB-Medium inokuliert und die Plasmide wurden von erhaltenen Zellen gesammelt. Die Plasmid-DNA wurde mit Ethanol präzipitiert und im serB-defizitären Mutantenstamm ME8320 (thi, serB, zhi-1::Tn10) (erhalten von National Gene Institute) durch Elektroporationsverfahren transformiert. Es wurde bestätigt, dass der ME8320-Stamm nicht in dem M9-Medium, enthaltend 140 mg/l Vitamin B₁, kleben konnte, aber in dem gleichen Medium, enthaltend 40 mg/l L-Serin kleben konnte.
Nach der Transformation wurden die Zellen gewaschen, auf der MP-Agarmedium, enthaltend 40 mg/l Vitamin B₁ und Chloramphenicol, aufgebracht und 3 bis 4 Tage bei 37°C inkubiert, um Kolonien zu bilden. Plasmide wurden aus jeder Kolonie gebildet und ihre Grösse durch Elektrophorese bestimmt. Als Ergebnis wurde eine bemerkenswerte Deletion gefunden. Es wurde vermutet, dass die hohe Expression des serB-Gens in der Zelle Plasmide instabil machte, so dass die Bibliothek unter Verwendung eines Vektors mit geringer Kopienzahl wiederherstellbar sein sollte.
(2) Herstellung der Brevibacterium flavum-Chromosombibliothek unter Verwendung eines Vektors mit geringer Kopienzahl und Klonen des serB-Gens:
Das Chromosom wurde von Brevibacterium flavum (ATCC 14067) hergestellt und mit Sau3AI verdaut. Die Reaktion wurde so eingestellt, dass das Zentrum der Verteilung in etwa 3 kbp oder mehr betrug. Etwa 200 μg des erhaltenen Verdau wurden durch Dichtegradientenzentrifugation mit 10 bis 40%-iger Sucrose abgetrennt und als 1 ml-Fraktionen mit AUTOMATIC LIQUID CHARGE-ER (Advantec) und MICRO TUBE PUMP (Eyela) gesammelt. Die Dichtegradientenzentrifugation wurde mit einem SW28-Rotor (Beckman) bei 10°C, 260.000 U/min für 26 Stunden durchgeführt. Die Fraktion, die die DNA-Fragmente enthielt, die im Zentrum der Verteilung etwa 3 bis 4 kbp oder mehr betrugen, wurde mit Ethanol präzipitiert und mit Microcon-50 (Millipore) gereinigt.
Die chromosomalen DNA-Fragmente, die wie oben beschrieben erhalten wurden, wurden mit dem Vektor mit geringer Kopienzahl pMW219 (Nippon Gene, BamHI-verdaut und dephosphoryliert) ligiert. Der Ligationsreaktant wurde in TE-Puffer gelöst und in Escherichia coli DH5α durch Elektroporation transformiert. Zu der Transformationslösung wurde SOC-Medium gegeben, 1 Stunde bei 37°C inkubiert und dann das gleiche Volumen von 2 × LB-Medium (enthaltend 25 mg/l Kanamycin) zugegeben und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Zu dem Kulturmedium wurde das gleiche Volumen von 4 × LB-Medium, enthaltend 40 Glycerin, gegeben und bei –80°C aufbewahrt.
Das vorstehend erwähnte Kulturmedium wurde zu LB-Medium inokuliert und kultiviert. Plasmide wurden aus erhaltenen Zellen gesammelt. Die Plasmid-DNA wurde mit Ethanol präzipitiert und in serB-defizitären Mutantenstamm ME8320 durch Elektroporationsverfahren transformiert. Nach der Transformation wurden die Zellen gewaschen, auf das M9-Agarmedium, enthaltend 25 mg/l Vitamin B₁ und Kanamycin, aufgebracht und 3 bis 4 Tage bei 37°C inkubiert, um Kolonien zu bilden. Jede Kolonie wurde auf das gleiche Medium und LB-Medium, enthaltend 25 mg/l Kanamycin, aufgebracht. Die Stämme, die auf dem Medium haften konnten, wurden ausgewählt und Plasmide wurden aus den ausgewählten Stämmen hergestellt.
Um die Nukleotidsequenz des insertierten Segments des erhaltenen Plasmids zu bestimmen, wurde von beiden Enden der multiklonalen Stelle des Vektors mit den Universalprimern die Sequenzierung gestartet. Die Sequenzierung wurde bis 300 bis 400 bp fortgeführt. Zum Schluss wurden etwa 5 kbp auf beiden Seiten der insertierten Fragmente sequenziert. Der offene Leserahmen wurde auf eine bestimmte Nukleotidsequenz abgesucht und ein ORF mit einer Homologie mit Phosphoserinphosphatase (codiert durch das serB-Gen) anderer bekannter Spezies wurde gefunden. Es gab verschiedene Regionen, die Homologie zeigten, jedoch betrug die Homologie zwischen dem ORF und bekannter serB 43% in der Aminosäuresequenz, 49,4% in der Nukleotidsequenz für Escherichia coli und 36,6% in der Aminosäuresequenz bzw. 50,9% in der Nukleotidsequenz für Saccharomyces cerevisiae. Nukleotid- und Aminosäuresequenzen wurden mit dem Genetics-Mac-Computerprogramm (Software Development Co., Tokyo, Japan) analysiert. Die Homologieanalyse wurde gemäss dem Verfahren von Lipman und Peason (Science, 227, 1435–1441 (1985) durchgeführt.
Die Nukleotidsequenz des ORF mit einer Homologie zwischen anderen bekannten serB-Genen und den flankierenden Regionen (SEQ ID Nr. 1) und die Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 2) codiert sein kann, sind in der Sequenzliste angeführt.
(3) Klonen des ORF, der Homologie mit serB besitzt:
Das chromosomale DNA-Fragment, das den ORF enthielt und etwa 200 bis 300 bp der stromaufwärtigen und stromabwärtigen Regionen des ORF wurden kloniert und Komplementationsversuche des serB-defizienten Stammes wurden durchgeführt, um zu bestätigen, dass der ORF, der die Homologie mit dem serB-Gen zeigte, tatsächlich serB-Gen war.
Die Primer mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 3 und 4 wurden entworfen, um die gewünschte DNA mit PCR zu erhalten. PCR wurde unter Verwendung dieser Primer und chromosomaler DNA, hergestellt von Brevibacterium flavum (ATCC 14067), als eine Matrize durchgeführt. Die PCR-Reaktion wurde in 30 Zyklen durchgeführt, wobei jeder bestand aus der Reaktion bei 98°C für 10 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 2 Minuten mit Pyrobest-DNA-Polymerase (Takara Shuzo). Das amplifizierte DNA-Fragment und der Vektor pMW219 wurden mit EcoRI und SalI verdaut und ligierten einander, was zum Plasmid pMW218BSB führte. Es wurde bestätigt, dass mit PCR durch Sequenzierung des amplifizierten Fragments kein Fehler eingefügt wird. Der oben genannte ORF wird in Rückwärtsrichtung in den lacZ-Promotor des Vektors insertiert.
pMW219BSB wurde in den ME8320-Stamm auf die gleiche Weise wie in (2) beschrieben eingefügt und auf LB-Medium, enthaltend 25 mg/l Kanamycin, aufgebracht. Gebildete Kolonien wurden durch 10 Stämme aufgenommen und diese wurden inokuliert und kultiviert in MP-Medium, jedoch wurde kein Wachstum gefunden.
(4) Forcierte Exprimierung des ORF, der Homologie mit serB besitzt:
Die Orientierung des insertierten Fragments in pMW219BSB wurde geändert, um in Vorwärtsrichtung plaziert werden zu können, um forciert exprimiert zu werden. Das erhaltene Plasmid wurde in den ME8320-Stamm eingeführt und auf LB-Medium, enthaltend 25 mg/l Kanamycin, aufgebracht. Die gebildeten Kolonien wuchsen auf dem minimalen Medium.
Gemäss dem oben genannten Resultat wurde demonstriert, dass der oben genannte ORF, der Homologie mit dem serB-Gen besitzt, die Fähigkeit aufweist, serB-Mangel von Escherichia coli zu komplementieren. Dadurch wurde bestätigt, dass der ORF ein serB-Homolog von Brevibacterium flavum ist.
Ein anderer ORF wurde gerade stromaufwärts des ORFs, der Homologie mit dem serB-Gen besitzt, im klonierten Fragment wie oben in (2) beschrieben, gefunden. Daraus wurde geschlossen, dass pMW219BSB serB-Mangel nicht komplementieren konnte, da diese ORFs Operonen darstellen, und es gab keine Promotorregion und dergleichen gerade stromaufwärts der ORFs, der eine Homologie mit dem serB-Gen besitzt.

Claims

Protein, definiert durch (A) oder (B): (A) Protein, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst; oder (B) Protein, das eine Aminosäuresequenz, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer oder 2 bis 50 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst, und welches Phosphoserinphosphataseaktivität besitzt, mit der Maßgabe, dass das Protein nicht die folgende Aminosäuresequenz hat:
DNA, die ein Protein gemäß (A) oder (B) codiert: (A) Protein, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst; oder (B) Protein, das eine Aminosäuresequenz, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer oder 2 bis 50 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst, und welches Phosphoserinphosphataseaktivität besitzt, mit der Maßgabe, dass das Protein nicht die folgende Aminosäuresequenz hat:
DNA, die ein Protein mit Phosphoserinphosphataseaktivität codiert und eine Homologie von nicht weniger als 80% mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2 aufweist, mit der Maßgabe, dass die DNA nicht die folgende Nucleinsäuresequenz hat:
DNA gemäß Anspruch 2 oder 3, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die den Nukleotiden 210-1547 der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 der Sequenzliste entspricht.
Vektor umfassend die DNA gemäß mindestens einem der Ansprüche 2 bis 4.
Bakterienzelle umfassend eine DNA, die ein Protein mit Phosphoserinphosphataseaktivität kodiert, wobei die DNA ausgewählt ist aus einer (i) DNA, die ein Protein gemäß (A), (B) oder (C) kodiert: (A) Protein, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst; oder (B) Protein, das eine Aminosäuresequenz, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer oder 2 bis 50 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst, (C) Protein, das eine Homologie von nicht weniger als 80% mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr: 2 aufweist; oder (ii) DNA, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die den Nukleotiden 210-1547 der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr: 1 der Sequenzliste entspricht; wobei die Phosphoserinphosphataseaktivität erhöht wird durch Amplifizieren der Kopienanzahl der DNA gemäß (i) oder (ii) oder Modifikation der Expressionskontrollsequenz
Verfahren zur Herstellung von L-Serin, umfassend die Schritte: Kultivieren des Bakteriums gemäss Anspruch 6 in einem Medium zur Herstellung und Akkumulierung von L-Serin in dem Medium und Sammeln des L-Serins in dem Medium.
Verwendung eines Vektors, umfassend eine DNA, die ein Protein mit Phosphoserinphosphataseaktivität kodiert, wobei die DNA ausgewählt ist aus einer (i) DNA, die ein Protein gemäß (A), (B) oder (C) kodiert: (A) Protein, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst; oder (B) Protein, das eine Aminosäuresequenz, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer oder 2 bis 50 Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 der Sequenzliste umfasst, (C) Protein, das eine Homologie von nicht weniger als 80% mit der Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr: 2 aufweist; oder (ii) DNA, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die den Nukleotiden 210-1547 der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr: 1 der Sequenzliste entspricht; zur Herstellung von L-Serin.