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Hintergrund
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Produzieren von
L-Lysin durch das Kultivieren eines Mikroorganismus, der durch das
Modifizieren eines coryneformen Bakteriums erhalten wurde, das für die fermentative
Produktion von Aminosäuren
oder ähnlichem
verwendet wird, mit Hilfe einer Technik, die auf der Gentechnik
beruht.
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L-Lysin,
welches als Futtermittel-Zusatzstoff verwendet wird, wird für gewöhnlich mit
einem fermentativen Verfahren hergestellt, bei dem ein L-Lysin produzierender
Mutantenstamm verwendet wird, der zu den coryneformen Bakterien
gehört.
Zahlreiche L-Lysin produzierende Bakterien, die gegenwärtig bekannt
sind, sind solche, die durch künstliche
Mutationen, ausgehend von Wildtypstämmen, die zu den coryneformen
Bakterien gehören,
erzeugt wurden.
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Für coryneforme
Bakterien sind ein Vektorplasmid, das autonom in bakteriellen Zellen
replizierbar ist, und ein Medikamenten-Resistenz-Markergen hat,
offenbart (siehe US-Patent Nr. 4,514,502), und ein Verfahren zum
Einschleusen eines Gens in bakterielle Zellen (z. B. japanische
Patentanmeldungs-Offenlegung Nr. 2-207791). Ebenfalls offenbart
ist eine Möglichkeit
zum Züchten
eines L-Threonin oder L-Isoleucin produzierenden Bakteriums unter
Verwendung der oben beschriebenen Techniken (siehe US-Patent Nrn.
4,452,890 und 4,442,208). Für
das Züchten
von einem L-Lysin produzierenden Bakterium ist eine Technik bekannt,
bei der ein Gen, das an der L-Lysin-Biosynthese teilnimmt, in ein
Vektorplasmid eingeschleust ist, um das Gen in bakteriellen Zellen
zu amplifizieren (z. B. japanische Patentanmeldungs-Offenlegungsschrift
Nr. 56-160997).
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Bereits
bekannte Gene für
die L-Lysin-Biosynthese schließen
z. B. ein Dihydrodipicolinat-Reduktasegen (japanische Patentanmeldungs-Offenlegungsschrift
Nr. 7-75578) und ein Diaminopimelatdehydrogenasegen (S. Ishino et
al., Nucleic Acids. Res., 15, 3917 (1987)) ein, welche klonierte
Gene sind, die an der L-Lysin-Biosynthese teilhaben, sowie ein Phosphoenolpyruvatcarboxylasegen
(japanische Patentanmeldungs-Offenlegungsschrift Nr. 60-87788),
ein Dihydrodipicolinatsynthasegen (japanische Patentanmeldung Nr. 6-55149)
und ein Diaminopimelatdecarboxylasegen (japanische Patentanmeldungs-Offenlegungsschrift
Nr. 60-62994), deren Amplifizierung die L-Lysin-Produktionsfähigkeit
beeinflusst.
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Wie
oben beschrieben wurde, sind einige erfolgreiche Ergebnisse, um
die L-Lysin-Produktivität
zu verbessern, mit Hilfe der Amplifizierung von Genen der L-Lysin-Biosynthese
erhalten worden. Die Amplifizierung einiger Gene senkt jedoch die
Wachstumsgeschwindigkeit der Bakterien, obwohl die Amplifizierung
die L-Lysin-Produktivität
verbessert, was zu einer Senkung der L-Lysin-Produktionsrate führt.
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Es
ist von keinem Fall berichtet worden, bei dem beabsichtigt wurde,
das Wachstum durch das gleichzeitige Verstärken eines Gens für die L-Lysin-Biosynthese
zu verbessern. Unter den gegenwärtigen
Umständen
ist für
die coryneformen Bakterien kein Fall bekannt, bei dem es irgendjemandem
gelungen ist, die L-Lysin-Ausbeute, ohne das Wachstum zu begrenzen,
durch das Kombinieren einer Vielzahl an Genen für die L-Lysin-Biosynthese bemerkenswert
zu verbessern.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Ein
Ziel der vorliegenden Erfindung ist das Verbessern der L-Lysin-Produktionsfähigkeit,
ohne die Wachstumsgeschwindigkeit eines coryneformen Bakteriums
zu senken, indem eine Vielzahl an Genen die für L-Lysin-Biosynthese in Kombination in den coryneformen
Bakterien verstärkt
wird.
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Wenn
eine Zielsubstanz fermentativ unter Verwendung eines Mikroorganismus
produziert wird, sind die Produktionsgeschwindigkeit wie auch die
Ausbeute der Zielsubstanz, bezogen auf ein hinzugefügtes Material,
extrem wichtige Faktoren. Eine Zielsubstanz kann beträchtlich
günstiger
durch das Verstärken
der Produktionsgeschwindigkeit pro Unit der Fermentierausrüstung hergestellt
werden. Demgemäß ist es
industriell extrem wichtig, dass die fermentative Ausbeute und die
Produktionsgeschwindigkeit miteinander kompatibel sind. Die vorliegende
Erfindung schlägt
eine Lösung
für das
Problem vor, das oben beschrieben wurde, um fermentativ L-Lysin
unter Verwendung eines coryneformen Bakteriums herzustellen.
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Das
Prinzip der vorliegenden Erfindung beruht auf der Tatsache, dass
das Wachstum eines coryneformen Bakteriums verbessert werden kann,
und dass dessen L-Lysin-Produktionsgeschwindigkeit
durch das Verstärken
sowohl einer DNA-Sequenz, die für
eine Diaminopimelatdecarboxylase (die Diaminopimelatdecarboxylase
wird nachfolgend als "DDC" bezeichnet, und
das Gen, das für
das DDC-Protein kodiert, wird nachfolgend als "lysA",
falls notwendig, bezeichnet) und eine DNA-Sequenz, die für eine Diaminopimelatdehydrogenasegen
(die Diaminopimelatdehydrogenasege wird nachfolgend als "DDH", und das Gen, das
für ein DDH-Protein
kodiert, nachfolgend als "ddh", falls notwendig,
bezeichnet), verglichen mit einem Fall, bei dem diese DNA-Sequenzen
jeweils einzeln verstärkt
sind, zu verbessern.
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Das
bedeutet, dass die vorliegende Erfindung in einem Vektor liegt,
der in Zellen coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist, umfassend
sowohl eine DNA-Sequenz, die für eine
Diaminopimelatdehydrogenase und eine DNA-Sequenz, die für eine Diaminopimelatdecarboxylase
kodiert.
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In
einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein coryneformes
Bakterium zur Verfügung gestellt,
in dem die intrazelluläre
Aktivität
sowohl der Diaminopimelatdecarboxylase und der Diaminopimelatdehydrogenase
durch das Erhöhen
der Kopienanzahl der DNA-Sequenzen, die für diese Enzyme kodieren, unter
Verwendung eines starken Promotors oder einer Kombination daraus,
verstärkt
wird.
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In
noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zum Herstellen von L-Lysin zur Verfügung, das die Schritte des
Kultivierens des coryneformen Bakteriums umfasst, das oben beschrieben
wurde, in einem Medium, um zu ermöglichen, dass L-Lysin produziert
wird, und in der Kultur akkumuliert, und das Einsammeln des L-Lysins
aus der Kultur.
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Die
in der vorliegenden Erfindung betroffenen coryneformen Bakterien
sind eine Gruppe von Mikroorganismen, die in Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology, 8. Ausgabe, Seite 599 (1974) definiert sind, welche
aerobe Gram-positive non-acid-fast-Stäbchen sind, die keine Sporenbildungsfähigkeit
besitzen. Die coryneformen Bakterien schließen Bakterien ein, die zum
Genus Corynebacterum gehören,
Bakterien, die zum Genus Brevibacterium gehören, die bis dato in den Genus
Brevibacterium klassifiziert worden sind, aber als Bakterien, die
zum Genus Corynebacterum gegenwärtig
gehören,
zusammengefasst sind, und Bakterien, die zum Genus Brevibacterum
gehören,
die den Bakterien, die zum Genus Corynebacterum gehören, nahe
verwandt sind.
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Erfindungsgemäß kann die
L-Lysin-Produktionsfähigkeit
der coryneformen Bakterien verbessert werden, und die Wachstumsgeschwindigkeit
kann ebenfalls verbessert werden.
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Die
vorliegende Erfindung kann auf gewöhnliche L-Lysin-produzierende Bakterien
wie auch auf Stämme
mit hoher L-Lysin-Produktionsfähigkeit
angewendet werden.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 stellt ein Verfahren zur
Konstruktion des Plasmids p299LYSA dar, welches lysA trägt.
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2 stellt ein Verfahren zur
Konstruktion des Plasmids pLYSAB dar, das lysA und Brevi.-ori trägt.
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3 stellt ein Verfahren zur
Konstruktion des Plasmids pPK4D dar, das ddh und Brevi.-ori trägt.
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4 stellt ein Verfahren zur
Konstruktion des Plasmids p399DL dar, das ddh und lysA trägt.
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5 stellt ein Verfahren zur
Konstruktion des Plasmids pDL dar, das ddh, lysA und Brevi.-ori
trägt.
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6 stellt ein Verfahren zur
Herstellung der Plasmide p399AKYB und p399AK9B dar, die jeweils
mutiertes lysC tragen.
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7 stellt ein Verfahren zur
Konstruktion des Plasmids pDPRB dar, das dapB und Brevi.-ori trägt.
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8 stellt ein Verfahren zur
Konstruktion des Plasmids pDPSB dar, das dapA und Brevi.-ori trägt.
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9 stellt ein Verfahren zur
Konstruktion des Plasmids pCRCAB dar, das lysC, dapB und Brevi.-ori trägt.
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10 stellt ein Verfahren
zur Konstruktion des Plasmids pCB dar, das lysC, dapB und Brevi.-ori
trägt.
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11 stellt ein Verfahren
zur Konstruktion des Plasmids pAB dar, das dapA, dapB und Brevi.-ori trägt.
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12 stellt ein Verfahren
zur Konstruktion des Plasmids pCAB dar, das lysC, dapA, dapB und
Brevi.-ori trägt.
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13 stellt ein Verfahren
zur Konstruktion des Plasmids pCABL dar, das lysC, dapA, dapB, lysA
und Brevi.-ori trägt.
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14 stellt ein Verfahren
zur Konstruktion des Plasmids pCABDL dar, das lysC, dapA, dapB,
ddh, lysA und Brevi.-ori trägt.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung wird im Detail unten beschrieben.
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<1> Herstellung
von Genen für
die L-Lysin-Biosynthese, die für
die vorliegende Erfindung verwendet wurden
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Die
Gene für
die L-Lysin-Biosynthese, die in der vorliegenden Erfindung verwendet
wurden, können jeweils
durch das Herstellen chromosomaler DNA eines Bakteriums als DNA-Donor,
das Konstruieren einer chromosomalen DNA-Bibliothek unter Verwendung eines Plasmidvektors
oder ähnlichem,
das Selektionieren eines Stammes, der ein gewünschtes Gen beinhaltet, aus
der Bibliothek, und das Gewinnen der rekombinanten DNA, in die das
Gen insertiert wurde aus dem ausgewählten Stamm. Der DNA-Donor für das Gen
der L-Lysin-Biosynthese, das erfindungsgemäß verwendet wird, ist nicht
besonders beschränkt,
vorausgesetzt, dass das gewünschte
Gen für
die Lysin-Biosynthese ein Enzymprotein exprimiert, welches in Zellen
der coryneformen Bakterien funktioniert. Der DNA-Donor ist jedoch
bevorzugt ein coryneformes Bakterium.
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Sowohl
die Gene für
lysA und ddh, die aus coryneformen Bakterien stammen, haben bekannte
Sequenzen. Demgemäß können sie
durch das Durchführen
einer Amplifizierung mit dem Polymerase-Kettenreaktionsverfahren
PCR; siehe T. J. White et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) erhalten
werden.
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Jedes
der Gene der L-Lysin-Biosynthese, das in der vorliegenden Erfindung
verwendet wird, ist in Übereinstimmung
mit bestimmten Verfahren erhältlich,
die unten beispielhaft dargestellt werden.
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(1) Herstellung der Mutante
lysA
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lysA
kann vom Chromosom eines coryneformen Bakteriums durch das Herstellen
chromosomaler DNA beispielsweise in Übereinstimmung mit dem Verfahren
von Saito und Miura (H. Saito und K. Miura, Biochem. Biophys. Acta,
72, 619 (1963)), und durch das Amplifizieren von lysA in Übereinstimmung
mit dem Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (PCR; siehe T. J. White
et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) isoliert werden. Der DNA-Donor
ist nicht spezifisch begrenzt, er wird jedoch durch Brevibacterium
lactofermentum ATCC 13869 Stamm beispielhaft dargestellt.
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In
dem coryneformen Bakterium bildet lysA zusammen mit argS (Arginyl-tRNA-Synthasegen)
ein Operon, und lysA liegt stromabwärts des argS vor. Die Expression
von lysA wird durch einen Promotor reguliert, der stromaufwärts des
argS liegt (siehe Journal of Bacteriology, Nov., 7356–7362 (1993)).
DNA-Sequenzen dieser Gene sind aus Corynebacterum glutamicum (siehe
Molecular Microbiology, 4(11), 1819–1830 (1990); Molecular and
General Genetics, 212, 112–119
(1988)) bekannt, auf deren Grundlage DNA-Primer für eine PCR
hergestellt werden können.
Solche DNA-Primer werden spezifisch durch 23-mer DNA's dargestellt, mit Nukleotidsequenzen,
die in SEQ ID NO: 1 in der Sequenzliste gezeigt sind (entsprechend
den Nukleotidnummern 11 bis 33 in der Nukleotidsequenz, die in Molecular
Microbiology, 4(11), 1819–1830
(1990)) beschrieben ist, und SEQ ID NO: 2 (entsprechend den Nukleotidnummern
1370 bis 1392 in der Nukleotidsequenz, die in Molecular and General
Genetics, 212, 112–119
(1988) beschrieben ist.
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Im
später
beschriebenen Beispiel wurde ein DNA-Fragment, das einen Promotor, argS und
lysA enthält,
verwendet, um lysA zu verbessern. argS ist jedoch nicht essentiell
für die
vorliegende Erfindung. Es ist auch erlaubt, ein DNA-Fragment zu
verwenden, in dem lysA direkt stromabwärts des Promotors ligiert ist.
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Die
Nukleotidsequenz eines DNA-Fragments, das argS und lysA enthält, und
eine Aminosäuresequenz,
von der abgeleitet wird, dass sie durch die Nukleotidsequenz kodiert
wird, werden beispielhaft in der SEQ ID NO: 3 angegeben. Ein Beispiel
der Aminosäuresequenz,
die durch argS kodiert wird, ist in SEQ ID NO: 4 gezeigt, und ein
Beispiel einer Aminosäuresequenz,
die durch lysA kodiert wird, ist in SEQ ID NO: 5 gezeigt. Zusätzlich zu
den DNA-Fragmenten,
die für
diese Aminosäuresequenzen
kodieren, kann die vorliegende Erfindung gleichermaßen DNA-Fragmente
verwenden, die für
Aminosäuresequenzen
kodieren, die im wesentlichen die gleichen sind wie die Aminosäuresequenz,
die in SEQ ID NO: 5 gezeigt ist, das bedeutet, Aminosäuresequenzen
mit einer Mutation, die beispielsweise auf einer Substituierung,
Deletion oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren beruht,
vorausgesetzt, dass es keinen wesentlichen Einfluß auf die
DDC-Aktivität
gibt.
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DNA
kann in Übereinstimmung
mit einem gewöhnlichen
Verfahren unter Verwendung eines DNA-Synthese-Modells 380B synthetisiert werden, welches
von Applied Biosystems hergestellt wird, und unter Verwendung der
Phosphoamiditmethode (siehe Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859).
Eine PCR kann unter Verwendung eines DNA-Thermo-Cycler-Modells PJ2000 durchgeführt werden,
welcher von Takara Shuzo hergestellt wird, und durch das Verwenden
der Taq-DNA-Polymerase in Übereinstimmung
mit einem Verfahren, das durch den Lieferanten angegeben wird.
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Es
wird bevorzugt, dass durch PCR-amplifiziertes lysA mit einer Vektor-DNA
ligiert wird, die in Zellen von E. coli und/oder coryneformen Bakterien
autonom replizierbar ist, um rekombinante DNA herzustellen, und die
rekombinante DNA wird zuvor in E. coli-Zellen eingeschleust. Eine
solche Voraussetzung macht die folgenden Arbeitsschritte leicht.
Der in E. coli-Zellen autonom replizierbare Vektor ist bevorzugterweise
ein Plasmidvektor, welcher bevorzugt autonom replizierbar ist in
Zellen des Wirts, einschließlich
beispielsweise pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 und
RSF1010.
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Wenn
ein DNA-Fragment mit der Fähigkeit,
einem Plasmid zu erlauben, in coryneformen Bakterien autonom repliziert
zu werden, in diese Vektoren inseriert wird, können sie als sogenannte Shuttle-Vektoren verwendet
werden, die autonom sowohl in E. coli und coryneformen Bakterien
replizierbar sind.
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Ein
solcher Shuttle-Vektor schließt
die folgenden ein. Mikroorganismen, die jeden der Vektoren beinhalten
und die Zugangsnummern bei internationalen Hinterlegungsstellen
werden in Klammern gezeigt.
pHC4 | Escherichia
coli AJ12617 (FERM BP-3532) |
pAJ655 | Escherichia
coli AJ11882 (FERM BP-136) Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC
39135) |
pAJ1844 | Escherichia
coli AJ11883 (FERM BP-137) Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC
39136) |
pAJ611 | Escherichia
coli AJ11884 (FERM BP-138) |
pAJ3148 | Corynebacterium
glutamicum SR8203 (ATCC 39137) |
pAJ440 | Bacillus
subtilis AJ11901 (FERM BP-140). |
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Diese
Vektoren sind aus den hinterlegten Mikroorganismen wie folgt erhältlich.
Zellen, die in einer logarithmischen Wachstumsphase eingesammelt
wurden, wurden unter Verwendung von Lysozym und SDS lysiert, gefolgt
von der Trennung vom Lysat mit Hilfe einer Zentrifugation bei 30.000 × g, um
einen Überstand
zu gewinnen. Zu dem Überstand
wird Polyethylglycol hinzugegeben, gefolgt von einer Fraktionierung
und Reinigung mit Hilfe der Cesiumchlorid-Ethidiumbromid-Äquilibrierungs-Dichtegradienten-Zentrifugierung.
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E.
coli können
durch das Einschleusen eines Plasmids in Übereinstimmung mit beispielsweise
dem Verfahren von D. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326
(1979)) oder dem Verfahren, bei dem die Empfängerzellen mit Calciumchlorid
behandelt werden, um die Permeabilität für DNA zu erhöhen (M.
Mandel und A. Higa, J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) transformiert
werden.
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(2) Herstellung von ddh
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Ein
DNA-Fragment, das ddh enthält,
kann von dem Chromosom eines coryneformen Bakteriums mit Hilfe der
PCR hergestellt werden. Der DNA-Donor ist nicht spezifisch begrenzt,
er wird jedoch durch den Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869-Stamm
beispielhaft dargestellt.
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Das
DDH-Gen ist für
Corynebacterium glutamicum (S. Ishino et al., Nucleic Acids Res.,
15, 3917 (1987)) bekannt, und auf dieser Grundlage werden Primer
für eine
PCR hergestellt. Solche DNA-Primer werden spezifisch durch 20-mer
DNA's mit Nukleotidsequenzen
beispielhaft dargestellt, die in den SEQ ID Nrn. 6 und 7 in der
Sequenzliste gezeigt sind. Die Synthese der DNA, die PCR und die
Herstellung eines Plasmids, das das erhaltene ddh trägt, kann
auf die gleiche Weise durchgeführt
werden, wie das für
lysA oben beschriebene.
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Die
Nukleotidsequenz des DNA-Fragments, das ddh enthält, und eine Aminosäuresequenz,
die von der Nukleotidsequenz abgeleitet wird, sind in der SEQ ID
NO: 8 dargestellt.
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Nur
die Aminosäuresequenz
ist in SEQ ID NO: 9 gezeigt. Zusätzlich
zu den DNA-Fragmenten, die für diese
Aminosäuresequenz
kodieren, kann die vorliegende Erfindung gleichermaßen DNA-Fragmente verwenden,
die für
Aminosäuresequenzen
kodieren, die im wesentlichen die gleichen sind wie die Aminosäuresequenz,
die in SEQ ID NO: 9 gezeigt wird, das bedeutet, Aminosäuresequenzen
mit einer Mutation, die beispielsweise auf einer Substituierung,
Detektion oder Insertion von einer oder mehrerer Aminosäuren beruht, vorausgesetzt,
dass sie keinen wesentlichen Einfluß auf die DDH-Aktivität ausübt.
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<2> Rekombinante
DNA und coryneforme Bakterien der vorliegenden Erfindung
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Das
coryneforme Bakterium der vorliegenden Erfindung beinhaltet eine
DNA-Sequenz, die für
eine Diaminopimelatdecarboxylase (lysA) und eine DNA-Sequenz, die
für eine
Diaminopimelatdehydrogenase (ddh) kodiert, welche verstärkt sind.
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Der
Begriff "eine DNA-Sequenz
ist verstärkt" bezeichnet hier
die Tatsache, dass die intrazelluläre Aktivität eines Enzyms, das durch die
DNA-Sequenz kodiert wird, beispielsweise erhöht wird, indem die Kopienanzahl
eines Gens erhöht
wird, durch einen starken Promotor oder durch das Kombinieren dieser
Mittel.
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Das
coryneforme Bakterium, in das die DNA-Sequenzen, die oben beschrieben
wurden, eingeschleust wurden, ist ein L-Lysin-produzierendes coryneformes
Bakterium, wobei Beispiele hierfür
L-Lysin-produzierende Wildtypstämme
und künstliche
Mutantenstämme
und coryneforme Bakterien einschließen, die hinsichtlich ihrer
L-Lysin-Produktionsfähigkeit
durch Gentechnik verbessert wurden. Selbst wenn das Bakterium eine
niedrige L-Lysin-Produktionsfähigkeit
aufweist, kann die L-Lysin-Produktionsfähigkeit
durch das Verstärken
von lysA und ddh verbessert werden. Wenn das Bakterium eine hohe L-Lysin-Produktionsfähigkeit
besitzt, kann die L-Lysin-Produktionseffizienz
durch das Verstärken
von lysA und ddh noch mehr erhöht
werden.
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(1) L-Lysin-produzierende
Stämme,
die zu den coryneformen Bakterien gehören
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Beispiele
für das
coryneforme Bakterium, das verwendet wird, um lysA und ddh einzuschleusen, schließen beispielsweise
die folgenden Lysin-produzierenden
Stämme
ein:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870;
Corynebacterium
acetoglutamicum ATCC 15806;
Corynebacterium callunae ATCC 15991;
Corynebacterium
glutamicum ATCC 13032;
(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020;
(Brevibacterium
lactofermentum) ATCC 13869;
(Corynebacterium lilium) ATCC 15990;
(Brevibacterium
flavum) ATCC 14067;
Corynebacterium melassecola ATCC 17965;
Brevibacterium
saccharolyticum ATCC 14066;
Brevibacterium immariophilum ATCC
14068;
Brevibacterium roseum ATCC 13825;
Brevibacterium
thiogenitalis ATCC 19240;
Microbacterium ammoniaphilum ATCC
15354;
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).
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Neben
den oben beschriebenen bakteriellen Stämmen sind solche als Wirt verwendbar,
in denen lysA und ddh verstärkt
wurden, und schließen
beispielsweise Mutantenstämme
mit L-Lysin-Produktionsfähigkeit ein,
die von den zuvor erwähnten
Stämmen
abstammen. Solche artifiziellen Mutantenstämme schließen die folgenden ein: S-(2-Aminoethyl)-cystein
(nachfolgend als "AEC" abgekürzt), resistente
Mutantenstämme ((Brevibacterium
lacofermentum AJ11082 (NRRL B-11470); japanische Patentveröffentlichungen
Nrn. 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993,
61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 und 7-112438); Mutantenstämme, die
eine Aminosäure
für ihr
Wachstum benötigen,
wie beispielsweise L-Homoserin (japanische Patentveröffentlichungen
Nrn. 48-28078 und 56-6499); Mutantenstämme, die eine Resistenz gegenüber AEC
aufweisen und Aminosäuren
benötigen
wie beispielsweise L-Leucin, L-Homoserin, L-Prolin, L-Serin, L-Arginin,
L-Alinin, und L-Valin (US-Patente Nrn. 3,708,395 und 3,825,472);
L-Lysin-produzierende Mutantenstämme,
die eine Resistenz gegenüber
DL-α-Amino-ε-caprolactam
aufweisen, α-Aminolauryllactam,
Aspartatanaloga, Sulfamedikamenten, Chinoid und N-Lauroylleucin; L-Lysin-produzierende
Mutantenstämme,
die eine Resistenz gegenüber
Inhibitoren der Oxyaloacetatdecarbosylase oder Enzymen des Atemsystems
aufweisen (japanische Patentanmeldung-Offenlegungsschriften Nrn. 50-53588,
50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995
und 56-39778 und japanische Patentveröffentlichungen Nrn. 53-43591
und 53-'1833); L-Lysin
produzierende Mutantenstämme,
die Inositol oder Essigsäure
benötigen
(japanische Patentanmeldungs-Veröffentlichungen
Nrn'. 55-9784 und 56-8692);
L-Lysin produzierende Mutantenstämme,
die eine Empfindlichkeit gegenüber
Fluorpyruvatsäure oder
einer Temperatur von nicht weniger als 34°C aufweisen (japanische Patentveröffentlichungen
Nrn. 55-9783 und 53-86090); und Produktions-Mutantenstämme, die
zum Genus Brevibacterium oder Corynebacterium gehören, welche
eine Resistenz gegenüber
Ethylenglycol aufweisen und L-Lysin herstellen (US-Patent NO: 4,411,997).
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(2) L-Lysin-produzierende
coryneforme Bakterien mit L-Lysin-Produktionsfähigkeit, welche durch Genrekombination
gesteigert ist
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Die
L-Lysin-Produktionsgeschwindigkeit kann durch das Verstärken von
lysA und ddh weiter verbessert werden, falls das coryneforme Bakterium
hinsichtlich der L-Lysin-Produktionsfähigkeit durch Gentechnik gesteigert
worden ist, z. B. durch das Einschleusen eines Gens, das für ein Enzym
mit einer Mutation kodiert, die eine Desensibilisierung der Feedback-Inhibition
wobei der Wildtyp dieses Enzyms einer Feedback-Inhibierung der an
der L-Lysin-Biosynthese teilnehmenden Enzyme unterworfen wird, oder
durch das Verbessern eines Genes der L-Lysin-Biosynthese, das nicht
lysA und ddh ist.
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Das
coryneforme Bakterium, das hinsichtlich der L-Lysin-Produktionsfähigkeit
verstärkt
wurde, schließt
ein coryneformes Bakterium ein, das eine DNA-Sequenz beinhaltet,
die für
eine Aspartokinase kodiert, welche in ihrer Feedback-Inhibierung
durch L-Lysin und L-Threonin desensibilisiert ist (die Aspartokinase
wird nachfolgend als "AK" bezeichnet, eingehen,
das für
ein AK-Protein kodiert, wird nachfolgend als "lysC" bezeichnet,
und ein Gen, das für
ein AK-Protein kodiert, welches in der Feedback-Inhibierung durch
L-Lysin und L-Threonin desensibilisiert wird, falls notwendig),
und eine verstärkte
DNA-Sequenz, die für
eine Dihydrodipicolinatreduktase kodiert (die Dihydrodipicolinatreduktase
wird nachfolgend als "DDPR" bezeichnet, und
das Gen, das für
das DDPR- Protein
kodiert, wird, falls notwendig, nachfolgend als "dapB" bezeichnet),
und ein coryneformes Bakterium, das des Weiteren eine verstärkte DNA-Sequenz beherbergt,
die für
eine Dihydrodipicolinatsynthase kodiert (die Dihydrodipicolinatsynthase
wird nachfolgend als "DDPS" bezeichnet, und
das Gen, das für
das DDPS-Protein
kodiert, wird nachfolgend, falls notwendig, als "dapA" bezeichnet).
Jedes der Gene der L-Lysin-Biosynthese,
die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ist gemäß bestimmten Verfahren,
die unten beispielhaft dargestellt werden, erhältlich.
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(i) Herstellung des mutierten
lysC
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Ein
DNA-Fragment, das mutiertes lysC enthält, kann aus einem mutierten
Stamm in dem eine synergistische Feedback-Inhibierung der AK-Aktivität durch
L-Lysin oder L-Threonin wesentlich desensibilisiert ist, hergestellt
werden (internationale Veröffentlichung
Nr. WO 94/25605). Ein solcher Mutantenstamm kann beispielsweise
von einer Gruppe an Zellen erhalten werden, die von einem Wildtypstamm
des coryneformen Bakteriums stammen, der einer Mutationsbehandlung
unterworfen wurde, durch das Anwenden einer gewöhnlichen Mutationsbehandlung
wie beispielsweise ultravioletter Bestrahlung und einer Behandlung
mit einem Mutationsmittel wie beispielsweise N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin.
Die AK-Aktivität
kann durch das Verfahren gemessen werden, das von R. Miyajima et
al., The Journal of Biochemistry (1968), 63(2), 139–148 beschrieben
ist. Der als Mutantenstamm am meisten bevorzugte ist durch das L-Lysin-produzierende
Bakterium AJ3445 (FERM P-1944) repräsentiert, der aus einer Mutationsbehandlung
eines Wildtypstammes von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
abstammt (mit dem geänderten
gegenwärtigen
Namen Corynebacterium glutamicum).
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Alternativ
ist mutiertes lysC auch durch eine in vitro Mutationsbehandlung
von Plasmid-DNA erhältlich, die
Wildtyp lysC enthält.
In einem weiteren Aspekt ist eine spezifische Information. über eine
Mutation bekannt, um die synergistische Feedback-Inhibierung von AK durch L-Lysin und
L-Threonin (internationale Veröffentlichungsnummer
WO 94/25605). Demgemäß kann mutiertes
lysC auch aus Wildtyp lysC hergestellt werden, auf der Grundlage
der Information in Übereinstimmung
beispielsweise mit der ortspezifischen Mutagenesemethode.
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Das
DNA-Fragment, das lysC enthält,
kann aus dem Chromosom eines coryneformen Bakterium mit Hilfe einer
PCR hergestellt werden. DNA-Primer
werden durch Einzelstrang-DNA's
als 23-mer und 21-mer mit Nukleotidsequenzen, die in den SEQ ID
Nrn. 10 und 11 der Sequenzliste beispielhaft dargestellt sind, um
beispielsweise auf der Grundlage einer Sequenz, die für Corynebacterium
glutamicum lysC kodiert eine Region von ungefähr 1.643 bp zu erhalten (siehe
Molecular Microbiology (1991), 5(5), 1197–1204; Mol. Gen. Genet. (1990),
224, 317–324).
Die Synthese der DNA, die PCR und die Herstellung eines Plasmids,
das das erhaltene lysC trägt,
kann auf die gleiche Weise durchgeführt werden, wie die für lysA oben
beschriebenen.
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Wildtyp
lysC wird erhalten, wenn lysC von einem AK-Wildtypstamm isoliert
wird, während
mutiertes lysC erhalten wird, wenn lysC aus einem AK-Mutantenstamm
in Übereinstimmung
mit dem oben beschriebenen Verfahren isoliert wird.
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Ein
Beispiel für
eine Nukleotidsequenz eines DNA-Fragments, das Wildtyp lysC enthält, wird
in SEQ ID NO: 12 in der Sequenzliste gezeigt. Eine Aminosäuresequenz
der α-Untereinheit
des Wildtyp AK-Proteins wird von der Nukleotidsequenz abgeleitet,
und wird in der SEQ ID NO: 13 in der Sequenzliste zusammen mit der
DNA-Sequenz gezeigt. Nur die Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NO:
14 gezeigt. Eine Aminosäuresequenz
einer β-Untereinheit
des Wildtyp AK-Proteins wird aus der Nukleotidsequenz von DNA abgeleitet
und ist in SEQ ID NO: 15 in der Sequenzliste zusammen mit der DNA-Sequenz
gezeigt. Allein die Aminosäuresequenz
ist in SEQ ID NO: 16 gezeigt. In jeder der Untereinheiten wird GTP
als Initiationscodon verwendet, und die entsprechende Aminosäure wird
durch Methionin dargestellt. Diese Darstellung betrifft jedoch Methionin, Valin
oder Formylmethionin.
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Das
mutierte lysC, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird,
ist nicht spezifisch begrenzt, vorausgesetzt, dass es für ein AK
kodiert, bei dem die synergistische Feedback-Inhibierung durch L-Lysin
und L-Threonin desensibilisiert ist. Das mutierte lysC wird jedoch
durch eines beispielhaft dargestellt, das eine Mutation einschließt, wobei
der 279te Alaninrest, vom N-Terminus aus gezählt, in einen Aminosäurerest
verändert ist,
der nicht Alanin ist, und anders ist, als die saure Aminosäure in der α-Untereinheit,
und der 30te Alaninrest ist in einen Aminosäurerest verändert, der anders als Alanin
ist, und anders als der saure Aminosäurerest in der β-Untereinheit
in der Aminosäuresequenz
des Wildtyp AK. Die Aminosäuresequenz
des Wildtyp AK schließt
spezifisch die Aminosäuresequenz
ein, die in der SEQ ID NO: 14 in der Sequenzliste als α-Untereinheit
gezeigt ist, und die Aminosäuresequenz,
die in der SEQ ID NO: 14 in der Sequenzliste als β-Untereinheit gezeigt
ist.
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Die,
die als Aminosäurerest,
der nicht Alanin ist und ein anderer als der saure Aminosäurerest
ist, schließen
Threonin-, Arginin-, Cystein-, Phenylalanin-, Prolin-, Serin-, Tyrosin-
und Valinreste ein.
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Der
Codon, der einem Aminosäurerest
entspricht, welcher substituiert werden soll, ist nicht spezifisch in
seiner Art beschränkt,
vorausgesetzt, dass er für
einen Aminosäurerest
kodiert. Es wird vermutet, dass die Aminosäuresequenz des erhaltenen Wildtyp
AK in Abhängigkeit
vom Unterschied der bakteriellen Spezies und des Bakterienstammes
leicht verschieden sein kann. AK's,
die eine Mutation haben, die z. B. auf einer Substituierung, Deletion
oder Insertion von einer oder mehrerer Aminosäurereste an einer oder mehrerer
Positionen beruht, die für
die Enzymaktivität
irrelevant ist, wie oben beschrieben wurde, können ebenfalls in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. Andere AK's, die eine Mutation haben, die z. B.
einer Substituierung, Deletion oder Insertion eines oder mehrerer
Aminosäurereste
beruht, können
ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie keinen wesentlichen
Einfluss auf die AK-Aktivität und auf
die Desensibilisierung der synergistischen Feedback-Inhibierung
durch L-Lysin und L-Threonin ausüben.
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Der
Stamm AJ12691, der durch das Einschleusen des lysC-Plasmids p399AK9B
in den AJ12036-Stamm (FERM BP-734) als Wildtypstamm des Brevibacterium
lactofermentum erhalten wurde, wurde am 10. April 1992 unter der
Zugangsnummer FERM P-12918 beim National Institute of Bioscience
and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology
des Ministeriums für
Internationalen Handel und Industrie (postal code: 305, 1–3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) hinterlegt, und in eine internationale
Hinterlegung auf Grundlage des Budapester Vertrages vom 10. Februar
1995 übertragen, und unter
der Zugangsnummer FERM BP-4999 hinterlegt.
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(ii) Herstellung von dapB
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Das
DNA-Fragment, das dapB enthält,
kann aus dem Chromosom eines coryneformen Bakteriums mit Hilfe der
PCR hergestellt werden. Der DNA-Donor ist nicht spezifisch begrenzt,
jedoch wird er beispielhaft durch Brevibacterium lactofermentum
ATCC 13869 Stamm angegeben.
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Eine
DNA-Sequenz, die für
DDPR kodiert, ist aus Brevibacterium lactofermentum (Journal of
Bacteriology, 175(9), 2743–2749
(1993)) bekannt, und auf dieser Grundlage wurden DNA-Primer für die PCR
hergestellt. Solche DNA-Primer sind spezifisch durch die DNA's der 23-mere, die
jeweils in den Nukleotidsequenzen in SEQ ID Nrn. 21 und 22 in der
Sequenzliste beispielhaft wiedergegeben sind. Die Synthese der DNA,
die PCR und die Herstellung eines Plasmids, das das erhaltene dapB
trägt,
kann auf gleiche Weise wie für
lysC, wie oben beschrieben wurde, erreicht werden.
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Die
Nukleotidsequenz des DNA-Fragments, das dapB enthält, und
eine Aminosäuresequenz,
die von der Nukleotidsequenz abgeleitet wird, ist in SEQ ID NO:
23 gezeigt. Nur die Aminosäuresequenz
ist in der SEQ ID NO: 24 gezeigt. Zusätzlich zu den DNA-Fragmenten,
die für
diese Aminosäuresequenz
kodieren, kann die vorliegende Erfindung ebenfalls Fragmente verwenden,
die für Aminosäuresequenzen
kodieren, die im wesentlichen der in der SEQ ID NO: 24 gezeigten
Aminosäuresequenz
gleich sind, das bedeutet, Aminosäuresequenzen mit einer Mutation,
die z. B. auf einer Substituierung, Deletion oder Insertion von
einer oder mehreren Aminosäuren
beruhen, vorausgesetzt, dass es keinen wesentlichen Einfluss auf
die DDPR-Aktivität
gibt.
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Ein
Transformantenstamm AJ13107, der durch das Einschleusen eines Plasmids
pCRDAPB in den E. coli JM109-Stamm erhalten wird, welches das dapB
trägt,
welches im später
beschriebenen Beispiel erhalten wurde, ist international seit dem
26. Mai 1995 unter der Zugangsnummer FERM BP-5114 beim National
Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial
Science and Technology des Ministeriums für Internationalen Handel und
Industrie (postal code: 305, 1–3,
Higashi 1-chome, Tsukubashi, Ibaraki-ken, Japan) auf der Grundlage
des Budapester Vertrages hinterlegt.
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(iii) Herstellung von
dapA
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Ein
DNA-Fragment, das dapA enthält,
kann aus dem Chromosom eines coryneformen Bakteriums mit Hilfe von
PCR hergestellt werden. Der DNA-Donor ist nicht spezifisch begrenzt,
wird jedoch durch Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869-Stamm
beispielhaft angegeben.
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Die
DNA-Sequenz, die für
die DPS kodiert, ist aus Corynebacterium glutamicum bekannt (siehe
Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1990); EMBL accession Nr.
X53993) und auf dieser Grundlage können DNA-Primer für die PCR
hergestellt werden. Solche DNA-Primer sind spezifisch durch die
DNA's der 23-mere beispielhaft
angegeben, die die SEQ ID Nrn. 17 und 18 in der Sequenzliste haben.
Die Synthese der DNA, die PCR und die Herstellung eines Plasmids,
das das erhaltene dapA trägt,
kann auf die gleiche Weise durchgeführt werden, wie oben für lysC beschrieben
wurde.
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Die
Nukleotidsequenz des DNA-Fragments, das dapA enthält, und
eine Aminosäuresequenz,
die von dieser Nukleotidsequenz abgeleitet ist, sind beispielhaft
in der SEQ ID NO: 19 angegeben. Nur die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO:
20 angegeben. Zusätzlich
zu den DNA-Fragmenten, die für
diese Aminosäuresequenz
kodieren, kann die vorliegende Erfindung gleichermaßen DNA-Fragmente verwenden,
die für
Aminosäuresequenzen
kodieren, die im wesentlichen die gleichen sind wie die Aminosäuresequenz,
die in SEQ ID NO: 20 gezeigt ist, das bedeutet, Aminosäuresequenzen
mit einer Mutation, die beispielsweise auf einer Substitution, Deletion
oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren beruht, vorausgesetzt,
dass es keinen wesentlichen Einfluß auf die DDPS-Aktivität ausübt.
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Der
Transformantenstamm AJ13106, der durch das Einschleusen eines Plasmids
pCRDAPA erhalten wird, welches das dapA trägt, welches im Beispiel erst
später
beschrieben wird, erhalten wird, in E. coli JM109-Stamm ist international
seit dem 26. Mai 1995 unter der Zugangsnummer FERM BP-5113 beim
National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency
of Industrial Science and Technology des Ministeriums für Internationalen
Handel und Industrie (postal code: 305, 1–3, Higashi 1-chome, Tsukubashi-Ibaraki-ken,
Japan) gemäß dem Budapester
Vertrag hinterlegt worden.
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In
einer besonderen Ausführungsform
werden die Gene in einen Wirt unter Verwendung eines Plasmidvektors,
Transposons oder Phagenvektors oder ähnlicher eingeschleust, um
lysA und ddh in dem L-Lysin-produzierenden
coryneformen Bakterium, wie oben beschrieben wurde, zu verstärken. Nach
der Einschleusung wird erwartet, dass es in einem gewissen Ausmaß selbst
bei Verwendung eines Vektors vom low copy-Typ eine Steigerung gibt.
Es ist jedoch bevorzugt, einen Vektor vom multiple copy-Typ zu verwenden.
Ein solcher Vektor schließt
z. B. Plasmidvektoren, pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3148 und pAJ440,
die oben beschrieben wurden, ein. Daneben können Transposons, die aus coryneformen
Bakterien stammen, und in den Internationalen Veröffentlichungsnummern
WO 92/02627 und WO 93/18151; europäische Patentveröffentlichung
Nr. 445385; japanische offengelegte Patentveröffentlichung Nr. 6-46867; A.
A. Vertes et al., Mol. Microbiol., 11, 739–746 (1994); C. Bonamy et al.,
Mol. Microbiol., 14, 571–581
(1994); A. A. Vertes et al., Mol. Gen. Genet., 245, 397–405 (1994);
W. Jagar et al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1–6 (1995);
japanische offengelegte Patentveröffentlichung Nrn. 7-107976
und 7-327680 und ähnliche
beschrieben sind, verwendet werden.
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Ein
hinsichtlich des lysA und ddh gemäß der vorliegenden Erfindung
verstärktes
coryneformen Bakterium kann z. B. durch das Einschleusen in einen
Wirt coryneformen Bakterium einer rekombinanten DNA erhalten werden,
welche lysA und ddh enthält,
und autonom in coryneformen Bakterienzellen replizierbar ist. Die rekombinante
DNA kann z. B. durch das Inserieren von lysA und ddh in einen Vektor
erhalten werden, wie beispielsweise in einem Plasmidvektor, ein
Transposon oder einem Phagenvektor, wie oben beschrieben wurde.
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Jedes
der Gene lysA und ddh kann nacheinander in der Wirt eingeschleust
werden, indem jeweils verschiedene Vektoren verwendet werden. Alternativ
dazu können
zwei Arten von Genen zusammen unter Verwendung eines einzelnen Vektors
eingeschleust werden. Wenn verschiedene Vektoren verwendet werden, können die
Gene in jeder Reihenfolge eingeschleust werden, es wird jedoch bevorzugt,
Vektoren zu verwenden, die einen stabilen Teilungs- und Beinhaltungsmechanismus
in dem Wirt haben, und die in der Lage sind, miteinander gleichzeitig
zu existieren.
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In
einem Fall, in dem ein Plasmid als Vektor verwendet wird, kann die
rekombinante DNA in den Wirt gemäß einem
elektrischen Pulsverfahren (Sugimoto et al., japanische Patentanmeldungs-Offenlegungsschrift Nr.
2-207791). Die Amplifizierung des Gens, unter Verwendung eines Transposons,
kann durch das Einschleusen eines Plasmids in eine Wirtszelle durchgeführt werden,
welches ein Transposon trägt,
und das Induzieren der Tranposition des Transposons.
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Auch
wenn mutiertes lysC, dapA und dapB in das coryneforme Bakterium
eingeschleust werden, kann jedes der Gene nacheinander in den Wirt
eingeschleust werden, indem jeweils verschiedene Vektoren verwendet
werden, oder alternativ dazu können
zwei oder mehr Arten der Gene gemeinsam zusammen unter Verwendung
eines einzelnen Vektors eingeschleust werden.
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<3> Verfahren
zum Herstellen von L-Lysin
-
L-Lysin
kann effizient durch das Kultivieren des coryneformen Bakteriums,
das verstärkte
Gene für
die L-Lysin-Biosynthese enthält,
die oben beschrieben wurden, in einem geeigneten Medium, um zu ermöglichen, dass
L-Lysin produziert wird und in der Kultur angehäuft wird, und durch das Einsammeln
des L-Lysins aus der Kultur erzeugt werden.
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Ein
Medium, das verwendet werden kann, wird beispielhaft durch ein gewöhnliches
Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische
Ionen und gegebenenfalls weitere organische Bestandteile enthält Als Kohlenstoffquelle
ist es möglich,
Zucker, wie beispielsweise Glucose, Fructose, Sucrose, Molassen
und Stärkehydrolysate;
und organische Säuren
wie beispielsweise Fumarsäure,
Zitronensäure
und Bernsteinsäure
zu verwenden.
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Als
Stickstoffquelle ist es möglich,
anorganische Ammoniumsalze wie beispielsweise Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid
und Ammoniumphosphat, organischen Stickstoff wie beispielsweise
Sojabohnenhydrolysat, Ammoniumgas und wässrigen Harnstoff zu verwenden.
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Als
Quellen für
organische Spurenelemente ist es möglich, dass die benötigten Substanzen
wie beispielsweise Vitamin B1 und L-Homoserin
oder Hefeextrakt oder ähnliches
in geeigneten Mengen enthalten sind. Neben den obengenannten werden
Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Magnesiumionen usw.,
falls notwendig, in geringen Mengen hinzugegeben.
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Die
Kultivierung wird bevorzugt unter aeroben Bedingungen für ungefähr 30 bis
90 Stunden durchgeführt.
Die Kulturtemperatur wird bevorzugt auf 25°C bis 37°C kontrolliert, und der pH-Wert
ist während
der Kultivierung bevorzugt auf 5 bis 8 eingestellt. Anorganische
oder organische, saure oder alkalische Substanzen, oder Harnstoffgas
oder ähnliche
können
zur pH-Einstellung verwendet werden. L-Lysin kann aus der Kultur durch
das Kombinieren eines gewöhnlichen
Ionenaustauschharzverfahrens, ein Präzipitationsverfahren und andere
bekannte Verfahren eingesammelt werden.
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Beispiele
-
Die
vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Beispiele spezifischer
erklärt.
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Beispiel 1: Herstellung
von lysA aus Brevibacterium lactofermentum
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<1> Herstellung
von lysA und die Konstruktion des Plasmids, welches lysA trägt
-
Der
Wildtypstamm ATCC 13869 des Brevibacterium lactofermentum wurde
als Donor für
chromosomale DNA verwendet. Die chromosomale DNA wurde aus den ATCC
13869 Stamm gemäß einem
gewöhnlichen
Verfahren hergestellt. Das DNA-Fragment, das argS, lysA und einen
Promotor des Operons enthält,
welches diese enthält,
wurde von der chromosomalen DNA in Übereinstimmung mit einer PCR
amplifiziert. Als DNA-Primer, die für diese Amplifizierung verwendet
wurden, wurden synthetische DNA's
von 23-meren mit Nukleotidsequenzen, die in den SEQ ID NO: 1 und
2 in der Sequenzlichste gezeigt sind, verwendet, um auf der Grundlage
einer Sequenz, die aus Corynebacterium glutamicum bekannt ist (siehe
Molecular Microbiology, 4(11), 1819–1830 (1990); Molecular and
General Genetics, 212, 112–119
(1988)) eine Region von ungefähr 3,6
kb zu amplifizieren, welche für
Arginyl-tRNA-Synthase
und DDC kodiert.
-
DNA
wurde gemäß einem
gewöhnlichen
Verfahren unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätmodells 380B, welches von
Applied Biosystems hergestellt wird, synthetisiert, und indem die
Phosphoamiditmethode verwendet wurde (siehe Tetrahedron Letters
(1981), 22, 1859).
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Das
Gen wurde mittels PCR unter Verwendung eines DNA Thermal Cycler
Modell PJ2000 amplifiziert, welches von Takara Shuzo hergestellt
wird, und in dem die Taq-Polymerase
in Übereinstimmung
mit einem vom Lieferanten angegebenen Verfahren verwendet wurde.
pHSG399 wurde als Klonierungsvektor für das amplifizierte Genfragment
von 3.579 Bp verwendet. pHSG399 wurde mit dem Restriktionsenzym
SmaI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut, und wurde mit dem DNA-Fragment
ligiert, welches amplifiziertes lysA enthält. Ein Plasmid, das wie oben
beschrieben, erhalten wurde, welches lysA, das aus ATCC 13869 stammt,
wurde als p399LYSA bezeichnet.
-
Das
DNA-Fragment, das lysA enthält,
wurde durch das Verdauen des p399LYSA mit KpnI (hergestellt von
Takara Shuzo) und BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) extrahiert.
Dieses DNA-Fragment wurde mit pHSG299 ligiert, welches mit KpnI
und BamHI verdaut wurde. Das erhaltene Plasmid wurde als p299LYSA
bezeichnet. Das Konstruktionsverfahren von p299LYSA ist in 1 gezeigt.
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Das
DNA-Fragment (nachfolgend als "Brevi.-ori" bezeichnet) mit
der Fähigkeit,
ein Plasmid in Bakterien, die zum Genus Corynebacterium gehören, autonom
replizierbar zu machen, wurde in p299LYSA eingeschleust, um Plasmide
herzustellen, die lysA tragen, welches autonom in Bakterien, die
zum Genus Corynebacterium gehören,
replizierbar ist, Brevi.-ori wurde aus einem Plasmidvektor pHK4
hergestellt, welcher Brevi.-ori enthält und sowohl in Escherichia
coli und Bakterien, die zum Genus Corynebacterium gehören, autonom
replizierbar ist. pHK4 wurde durch das Verdauen von pHC4 mit KpnI
(hergestellt von Takara Shuzo) und BamHI (hergestellt von Takara
Shuzo) durch das Extrahieren des Brevi.-ori-Fragments, und das Ligieren
desselben mit pHSG298, welches ebenfalls mit KpnI und BamHI verdaut
worden ist (siehe japanisches Patent, Anmeldungs-Veröffentlichungsnummer
5-7491) hergestellt. pHK4 verleiht dem Wirt eine Kanamycinresistenz. Escherichia
coli HB101, welche pHK4 beinhalten, wurden als Escherichia coli
AJ13136 bezeichnet, und am 01. August 1995 unter der Zugangsnummer
FERM BP-5186 beim National Institute of Bioscience and Human Technology
der Agency of Industrial Science and Technology des Ministeriums
für Internationalen
Handel und Industrie (postal code: 305, 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, Japan) hinterlegt.
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pHK4
wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI verdaut und die durchtrennten
Enden wurden geglättet
(blunted). Die Blunt-end-Bildung wurde unter Verwendung des DNA-Blunting-Kit (hergestellt
von Takara Shuzo) in Übereinstimmung
mit einem angegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Blunt-end-Bildung
wurde ein phosphorylierter KpnI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo)
ligiert, um eine Modifikation zu ergeben, so dass das DNA-Fragment,
das dem Brevi.-ori-Teil entspricht, aus pHK4 nur durch einen Verdau
mit KpnI ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit KpnI
verdaut und das erzeugte Brevi.-ori DNA-Fragment wurde mit p299LYSA
ligiert, welches ebenfalls mit KpnI verdaut worden ist, um ein Plasmid
herzustellen, welches lysA trägt,
und das autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. Das
hergestellte Plasmid wurde als pLYSAB bezeichnet. Der Konstruktionsprozess
von pLYSAB wird in 2 gezeigt.
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<2> Bestimmung
der Nukleotidsequenz von lysA aus Brevibacterium lactofermentum
-
Es
wurde Plasmid-DNA aus p299LYSA hergestellt, und die Nukleotidsequenzbestimmung
wurde in Übereinstimmung
mit dem Verfahren von Sanger et al. (z. B. F. Sanger et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)) durchgeführt. Die bestimmte Nukleotidsequenz
und eine davon abgeleitete Aminosäuresequenz, die durch die Nukleotidsequenz
kodiert wird, werden in der SEQ ID NO: 3 gezeigt. Hinsichtlich der
Nukleotidsequenz werden eine Aminosäuresequenz, die durch argS
und eine Aminosäuresequenz,
die durch lysA kodiert werden, in SEQ ID NO: 4 bzw. 5 gezeigt.
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Beispiel 2: Herstellung
von ddh aus Brevibacterium lactofermentum
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Das
ddh-Gen wurde durch das Amplifizieren des ddh-Gens aus chromosomaler
DNA von Brevibacterium lactofermentum, ATCC 13869 in Übereinstimmung
mit dem PCR-Verfahren durch das Verwenden von zwei Oligonukleotidprimern
(SEQ ID Nrn. 6, 7) erhalten, welche auf der Grundlage einer bekannten
Nukleotidsequenz des ddh-Gens aus Corynabacterium glutamicum (S.
Ishino et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)) hergestellt
worden sind. Das erhaltene amplifizierte DNA-Fragment wurde mit EcoT22I und AvaI
verdaut, und die geschnittenen Enden wurden glatt gemacht. Danach
wurde das Fragment in die SmaI-Stelle von pMW119 inseriert, um das
Plasmid pDDH zu erhalten.
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Als
nächstes
wurde pDDH mit SalI und EcoRI verdaut, gefolgt von der Blunt end
Bildung. Danach wurde das erhaltene Fragment mit pUC18 ligiert,
welches mit SmaI verdaut worden ist. Das so erhaltene Plasmid wurde
als pUC18DDH bezeichnet.
-
Der
Brev.-ori wurde in pUC18DDH eingeschleust, um ein Plasmid herzustellen,
welches ein in coryneformen Bakterien autonom replizierbares ddh
trägt.
pHK4 wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI verdaut, und
die geschnittenen Enden wurden geglättet. Die Blunt end Bildung
wurde mit dem DNA-Blunting-Kit (hergestellt von Takara Shuzo) in Übereinstimmung
mit einem angegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Blut-end-Bildung
wurde ein phosphorylierter PstI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo)
ligiert, so dass es in die PstI-Stelle von pHSG299 inseriert wurde.
Das wie oben beschrieben konstruierte Plasmid wurde als pPK4 bezeichnet.
Als nächstes
wurde pUC18DDH mit XbaI und KpnI verdaut, und das erzeugte Fragment wurde
mit pPK4 ligiert, welches mit KpnI und XbaI verdaut worden ist.
So wurde ein Plasmid, welches ddh trägt, das in coryneformen Bakterien
autonom replizierbar ist, konstruiert. Dieses Plasmid wurde als
pPK4D bezeichnet. Der Konstruktionsprozess von pPK4D ist in 3 gezeigt.
-
Beispiel 3: Konstruktion
des Plasmids, das sowohl ddh als auch lysA trägt
-
Das
Plasmid pUC18DDH, das ddh trägt,
wurde mit EcoRI verdaut und dann geglättet und weiter mit Xba verdaut,
um ein DNA-Fragment
zu extrahieren, welches ddh enthält.
Dieses ddh-Fragment
wurde mit dem Plasmid p399LYSA ligiert, welches lysA trägt, und
welches mit BamHI verdaut wurde, und dann geglättet wurde und außerdem mit
Xba verdaut worden ist. Das erhaltene Plasmid wurde als p399DL bezeichnet.
Der Konstruktionsprozess von p399DL ist in 4 gezeigt.
-
Als
nächstes
wurde der Brevi.-ori in p399DL eingeschleust. pHK4 wurde mit XbaI
und BamHI verdaut, und die geschnittenen Enden wurden geglättet. Nach
der Blunt-end-Bildung wurde ein phosphorylierter XbaI-Linker ligiert,
um eine Modifizierung zu ergeben, so dass das DNA-Fragment, das
dem Brevi.-ori-Teil entspricht, aus pHK4 durch den Verdau nur mit
XbaI ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit XbaI verdaut
und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit p399DL ligiert,
welches ebenfalls mit XbaI verdaut worden ist, um ein Plasmid zu
konstruieren, das ddh und lysA trägt, und in coryneformen Bakterien
autonom replizierbar ist. Das konstruierte Plasmid wurde als pDL
bezeichnet. Der Konstruktionsprozess von pDL ist in 5 gezeigt.
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Beispiel 4: Herstellung
von mutiertem lysC, dapA und dapB aus Brevibacterium lactofermentum
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<1> Herstellung
von Wildtyp lysC-Gen und mutiertem lysC-Gen aus Brevibacterium lactofermentum
-
(1) Herstellung der Wildtyp
und mutierten lysC's
und die Herstellung von Plasmiden, die diese tragen
-
Der
Stamm Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und ein L-Lysin-produzierender
Mutantenstamm AJ3445 (FERM P-1944), welcher aus dem ATCC 13869-Stamm
durch eine Mutationsbehandlung erhalten wurde, wurde als chromosomale
DNA-Donoren verwendet. Der AJ3445-Stamm ist einer Mutierung unterworfen
worden, so dass lysC verändert
wurde, um eine wesentliche Desensibilisierung der gemeinsamen Inhibierung
durch Lysin und Threonin (Journal of Biochemistry, 68, 701–710 (1970))
zu beinhalten.
-
Das
DNA-Fragment, das lysC enthält,
wurde aus chromosomaler DNA in Übereinstimmung
mit dem PCR-Verfahren
(Polymerase-Kettenreaktion, siehe T. J. White et al., Trends Genet.,
5, 185 (1989)) amplifiziert. Hinsichtlich der DNA-Primer, die für die Amplifizierung
verwendet wurden, wurden einzelsträngige DNA's aus 23-meren und 21-meren mit den
Nukleotidsequenzen, die in den SEQ ID Nrn. 10 und 11 gezeigt sind,
synthetisiert, um eine Region von ungefähr 1.643 Bp zu amplifizieren,
die für
lysC kodieren, auf der Grundlage einer bekannten Sequenz aus Corynebacterium
glutamicum (siehe Molecular Microbiology (1991), 5(5), 1197–1204; und
Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317–324).
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Das
amplifizierte Genfragment von 1.643 kb wurde durch Agarosegelelektrophorese
bestätigt.
Danach wurde das Fragment aus dem Gel ausgeschnitten und in Übereinstimmung
mit einem gewöhnlichen
Verfahren gereinigt, und es wurde mit den Restriktionsenzymen NruI
(produziert von Takara Shuzo) und EcoRI (produziert von Takara Shuzo)
verdaut.
-
pHSG399
(siehe S. Takeshita et al., Gene (1987), 61, 63–74) wurde als Klonierungsvektor
für das Genfragment
verwendet. pHSG399 wurde mit den Restriktionsenzymen SmaI (hergestellt
von Takara Shuzo) und EcoRI verdaut, und es wurde mit dem amplifizierten
lysC-Fragment ligiert. Die DNA wurde unter Verwendung eines DNA-Ligationskits
(hergestellt von Takara Shuzo) in Übereinstimmung mit einem angegebenen Verfahren
ligiert. Auf diese Weise wurden Plasmide hergestellt, in denen die
lysC-Fragmente, die aus den Chromosomen von Brevibacterium lactofermentum
amplifiziert wurden, jeweils mit pHSG399 ligiert waren. Das Plasmid,
das lysC aus ATCC 13869 (Wildtypstamm) trägt, wurde als p399AKV bezeichnet,
und das Plasmid, das lysC aus AJ3463 (L-Lysin-produzierendes Bakterium) trägt, wurde
als p399AK9 bezeichnet.
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Der
Brevi.-ori wurde in die hergestellten p399AKY und p399AK9 jeweils
eingeschleust, um die Plasmide zu konstruieren, die lysC tragen,
welches in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist.
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pHK4
wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI (hergestellt von
Takara Shuzo) verdaut, und die geschnittenen Enden wurden geglättet. Die Blunt-end-Bildung
wurde unter Verwendung eines DNA-Blunting-Kits (hergestellt von
Takara Shuzo) in Übereinstimmung
mit einem angegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Blunt end Bildung
wurde ein phosphorylierter BamHI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo)
ligiert, um eine Modifizierung zu ergeben, so dass das DNA-Fragment, das dem
Brevi.-ori-Anteil entspricht, aus dem pHK4 durch einen Verdau nur
mit BamHI ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit BamHI
verdaut, und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit p399AKY und p399AK9
ligiert, welche ebenfalls mit BamHI verdaut worden sind, um Plasmide
herzustellen, die lysC tragen, und die in coryneformen Bakterien
autonom replizierbar ist.
-
Das
Plasmid, das das Wildtyp lysC-Gen trägt, welches aus p399AKY stammt,
wurde als p399AKYB, und das Plasmid, das das mutierte lysC-Gen trägt, welches
aus p399AK9 stammt, wurde als p399AK9B bezeichnet. Der Konstruktionsprozess
von p399AK9B und p399AKYB ist in 6 gezeigt.
Der Stamm AJ12691, der durch das Einschleusen des mutierten lysC-Plasmids
p399AK9B in einen Wildtypstamm des Brevibacterium lactofermentum
(AJ12036-Stamm, FERM BP-734) erhalten wurde, wurde am 10. April
1992 unter der Zugangsnummer FERM P-12918 beim National Institute
of Bioscience and Human Technology der Agency of Industrial Sience
and Technology des Ministeriums für Internationalen Handel und
Industrie (postal code: 305, 1–3,
Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) hinterlegt, in
eine internationale Hinterlegung, basierend auf dem Budapester Vertrag
am 10. Februar 1995 übertragen und
unter der Zugangsnummer FERM BP-4999 hinterlegt.
-
(2) Bestimmung der Nukleotidsequenz
des Wildtyp lysC und des mutierten lysC aus Brevibacterium lactofermentum
-
Das
Plasmid p399AKY, welches die Wildtyp lysC und das Plasmid p399AK9
trägt,
welches das mutierte lysC enthält,
wurden aus den entsprechenden Transformanten hergestellt, um die
Nukleotidsequenz des Wildtyps und des mutierten lysC zu bestimmen.
Die Nukleotidsequenzbestimmung wurde in Übereinstimmung mit einem Verfahren
von Sanger et al. (z. B. F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
74, 5463 (1977)) durchgeführt.
-
Die
Nukleotidsequenz des Wildtyp lysC, welche durch p399AKY kodiert
wird, ist in der SEQ ID NO: 12 in der Sequenzliste gezeigt. Andererseits
hatte die Nukleotidsequenz des mutierten lysC, welches durch p399AK9
kodiert wird, nur eine Mutationvon einem Nukleotid, wobei das 1051ste
G in ein A in der SEQ ID NO: 12 verändert wurde, verglichen mit
dem Wildtyp lysC. Es ist bekannt, dass lysC des Corynebacterium
glutamicum zwei Untereinheiten (α, β) hat, welche
in einem gleichen Leseraster auf dem gleichen DNA-Strang kodiert werden
(siehe J. Kalinowski et al., Molecular Microbiology (1991) 5(5),
1197–1204).
Von der Homologie aus beurteilt wird erwartet, dass das hier sequenzierte
Gen ebenfalls zwei Untereinheiten (α, β) hat, welche in einem identischen
Leseraster auf einen identischen DNA-Strang kodiert werden.
-
Die
Aminosäuresequenz
der α-Untereinheit
des Wildtyp AK-Proteins, welche von der Nukleotidsequenz der DNA
abgeleitet wird, ist in SEQ ID NO: 13 gezeigt, zusammen mit der
DNA-Sequenz. Nur
die Aminosäuresequenz
ist in SEQ ID NO: 14 gezeigt. Die Aminosäuresequenz der β-Untereinheit
des Wildtyp AK-Proteins, welches von der Nukleotidsequenz der DNA
abgeleitet wurde, ist in SEQ ID NO: 15 zusammen mit der DNA gezeigt.
-
In
SEQ ID NO: 16 ist nur die Aminosäuresequenz
gezeigt. Bei jeder der Untereinheiten wird GTG als Initiationscodon
verwendet, und die entsprechende Aminosäuresequenz ist durch Methionin
repräsentiert. Diese
Repräsentierung
betrifft jedoch Methionin, Valin oder Formylmethionin.
-
Andererseits
bedeutet die Mutation der Sequenz des mutierten lysC das auftreten
einer Aminosäurerest-Substitution,
so dass der 279ste Alaninrest der α-Untereinheit in einen Threoninrest
geändert
ist, und ein 30ter Alaninrest der β-Einheit in einen Threoninrest
in der Aminosäuresequenz
des Wildtyp AK-Proteins (SEQ ID Nrn. 14 und 16) geändert ist.
-
<2> Herstellung
von dapB aus Brevibacterium lactofermentum
-
(1) Herstellung von dapB
und Herstellung des Plasmids, das dapB trägt
-
Der
Wildtypstamm ATCC 13869 von Brevibacterium lactofermentum wurde
als chromosomaler DNA-Donor verwendet. Die chromosomale DNA des
ATCC 13869-Stammes
wurde in Übereinstimmung
mit einem gewöhnlichen
Verfahren hergestellt. Das DNA-Fragment,
das dapB enthält,
wurde aus der chromosomalen DNA in Übereinstimmung mit der PCR
amplifiziert. Hinsichtlich der DNA-Primer, die für die Amplifizierung verwendet
wurden, wurden DNA's
von 23-meren mit Nukleotidsequenzen, die in den SEQ ID Nrn. 21 und 22
der Sequenzliste jeweils gezeigt sind, synthetisiert, um eine Region
von ungefähr
2,0 kb zu amplifizieren, welche für DDPR kodiert, auf der Grundlage
der Sequenz, die für
Brevibacterium lactofermentum (siehe Journal of Bacteriology, 157(9),
2743–2749
(1993)) bekannt ist. Die Synthese der DNA und der PCR wurden auf gleiche
Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. pCR-Script (hergestellt
von Invitrogen) wurde als Klonierungsvektor für das amplifizierte Genfragment
von 2.001 Bp verwendet, und wurde mit dem amplifizierten dapB-Fragment
ligiert. So wurde ein Plasmid konstruiert, bei dem das dapB-Fragment von 2.001
bp, welches aus dem Chromosom von Brevibacterium lactofermentum
amplifiziert wurde, mit dem pCR-Script ligiert. Das wie oben beschrieben
erhaltene Plasmid, welches dapB, welches aus ATCC 13869 stammt,
beinhaltete, wurde als pCRDAPB bezeichnet. Ein Transformantenstamm
AJ13107, der durch das Einschleusen von pCRDAPB im E. coli JM109-Stamm
erhalten wurde, wurde international seit dem 26. Mai 1995 unter
der Zugangsnummer FERM BP-5114 beim National Institute of Bioscience
and Human Technology der Agency of Industrial Science and Technology
des Ministeriums für
Internationalen Handel und Industrie hinterlegt (postal code: 305,
1–3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) auf der Grundlage des
Budapester Vertrages.
-
Ein
DNA-Fragment von 1.101 bp, welches ein Strukturgen des DDPR enthält, wurde
durch den Verdau mit pCRDAPB mit EcoRV und SphI extrahiert. Dieses
Fragment wurde mit pHSG399, welches mit HincII und SphI verdaut
worden ist, ligiert, um ein Plasmid herzustellen. Das hergestellte
Plasmid wurde als p399DPR bezeichnet.
-
Der
Brevi.-ori wurde in das hergestellte p399DPR eingeschleust, um ein
Plasmid zu konstruieren, das das dapB trägt, welches in coryneformen
Bakterien autonom replizierbar ist. pHK4 wurde mit dem Restriktionsenzym
KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut, und die geschnittenen
Enden wurden geglättet.
Die Blunt-end-Bildung wurde unter Verwendung eines DNA-Bluntingkits
(hergestellt von Takara Shuzo) in Übereinstimmung mit dem angegebenen
Verfahren durchgeführt.
Nach der Blunt-end-Bildung wurde ein phosphorylierter BamHI-Linker
(hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifizierung zu
ergeben, so dass das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Anteil entspricht,
von pHK4 durch den Verdau nur mit BamHI ausgeschnitten werden kann.
Dieses Plasmid wurde mit BamHI verdaut, und das so erzeugte Brevi.-ori
DNA-Fragment wurde mit p399DPR ligiert, welches ebenfalls mit BamHI
verdaut worden ist, um ein Plasmid herzustellen, das dapB enthält, welches
autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. Das hergestellte
Plasmid wurde als pDPRB bezeichnet. Der Konstruktionsprozess von
pDPRB ist in 7 gezeigt.
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(2) Bestimmung der Nukleotidsequenz
von dapB aus Brevibacterium lactofermentum
-
Plasmid-DNA
wurde aus dem AJ13107-Stamm, der p399DPR beinhaltet, hergestellt,
und seine Nukleotidsequenz wurde auf gleiche Weise, wie im Beispiel
1 beschrieben, bestimmt. Die bestimmte Nukleotidsequenz, und eine
Aminosäuresequenz,
die von der Nukleotidsequenz abgeleitet wurde, sind in SEQ ID NO:
23 gezeigt. Nur die Aminosäuresequenz
ist in SEQ ID NO: 24 gezeigt.
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<3> Herstellung
von dapA aus Brevibacterium lactofermentum
-
(1) Herstellung von dapA
und Konstruktion des Plasmids, das dapA trägt
-
Der
Wildtypstamm Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde als
chromosomaler DNA-Donor verwendet. Die chromosomale DNA wurde aus
dem ATCC 13869-Stamm in Übereinstimmung
mit einem gewöhnlichen
Verfahren hergestellt. Das DNA-Fragment,
das dapA enthält,
wurde von der chromosomalen DNA in Übereinstimmung mit der pCR
amplifiziert. Als DNA-Primer, die für die Amplifizierung verwendet
wurden, wurden 23-mer DNA's
mit den Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID Nrn. 17 und 18 in der
Sequenzliste jeweils gezeigt sind, synthetisiert, um eine Region
von ungefähr
1,5 kb zu amplifizieren, die für
DDPS auf der Grundlage einer Sequenz, die für Corynebacterium glutamicum
(siehe Nucleic Acids Research, 18(21), 6421 (1990); EMBL accession
Nr. X53993) kodiert. Die Synthese der DNA und die PCR wurden auf
die gleiche Weise wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. pCR1000
(hergestellt von Invitrogen, siehe Bio/Technology, 9, 657–663 (1991))
wurde als Klonierungsvektor für
das amplifizierte Genfragment von 1.411 bp verwendet, und wurde
mit dem amplifizierten dapA-Fragment ligiert. Die Ligierung der
DNA wurde durch die Verwendung eines DNA-Ligationskits (hergestellt
von Takara Shuzo) in Übereinstimmung
mit einem angegebenen Verfahren hergestellt. So wurde ein Plasmid
konstruiert, in dem das dapA-Fragment von 1.411 bp, welches aus
dem Chromosom von Brevibacterium lactofermentum amplifiziert wurde,
mit dem pCR1000 ligiert war. Das wie oben beschrieben erhaltene
Plasmid, welches dapA beinhaltet, welches aus ATCC 13869 stammt,
wurde als pCRDAPA bezeichnet.
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Der
Transformantenstamm AJ13106, der durch das Einschleusen von pCRDAPA
in E. coli JM109-Stamm erhalten wurde, wurde international am 26.
Mai 1995 unter der Zugangsnummer FERM BP-5113 beim National Institute
of Bioscience and Human Technology der Agency of Industrial Science
and Technology des Ministeriums für Internationalen Handel und
Industrie (postal code: 305, 1–3,
Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) auf der Grundlage
des Budapester Vertrages hinterlegt.
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Brevi.-ori
wurde in das hergestellte pCRDAPA eingeschleust, um ein Plasmid
zu konstruieren, das dapA trägt,
welches autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. pHK4
wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI verdaut (hergestellt
von Takara Shuzo), und die geschnittenen Enden wurden geglättet. Die
Blunt-end-Bildung
wurde durch die Verwendung eines DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara
Shuzo) in Übereinstimmung
mit einem angegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Blunt-end-Bildung
wurde ein phosphorylierter SmaI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo)
ligiert, um eine Modifizierung zu ergeben, so dass das DNA-Fragment,
welches dem Brevi.-ori-Anteil entspricht, aus pHK4 durch den Verdau
nur mit SmaI ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit
SmaI verdaut, und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit
pCRDAPA ligiert, welches ebenfalls mit SmaI verdaut worden ist,
um ein Plasmid herzustellen, das dapA trägt, welches autonom in coryneformen
Bakterien replizierbar ist. Dieses Plasmid wurde als pDPSB bezeichnet.
Das Konstruktionsverfahren von pDPSB(Kmr) ist in 8 gezeigt.
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(2) Bestimmung der Nukleotidsequenz
von dapA aus Brevibacterium lactofermentum
-
Plasmid-DNA
wurde aus dem AJ13106-Stamm, der pCRDAPA beinhaltet, hergestellt,
und dessen Nukleotidsequenz wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel
1 beschrieben, bestimmt. Die ermittelte Nukleotidsequenz und eine
Aminosäuresequenz,
die von der Nukleotidsequenz abgeleitet wird, ist in SEQ ID NO:
19 gezeigt. Die SEQ ID Aminosäuresequenz
allein ist in SEQ ID NO: 20 gezeigt.
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<4> Konstruktion
eines Plasmids, das sowohl mutiertes LysC und dapA trägt
-
Ein
Plasmid, das mutiertes lysC, dapA und den Replikationsursprung der
coryneformen Bakterien trägt,
wurde von dem Plasmid pCRDAPA konstruiert, welche ein dapA trägt, und
von dem Plasmid p399AK9B, welcher mutiertes lysC und den Brevi.-ori
trägt.
p399AK9B wurde vollständig
mit SalI verdaut, und dann wurde es geglättet. Ein EcoRI-Linker wurde
hiermit ligiert, um ein Plasmid zu konstruieren, bei dem die SalI-Stelle
in eine EcoRI-Stelle modifiziert wurde. Das erhaltene Plasmid wurde
als p399AK9BSE bezeichnet. Das mutierte lysC und der Brevi.-ori
wurden als ein Fragment durch das Teilverdauen von p399AK9BSE mit
EcoRI ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde mit pCRDAPA ligiert,
welches mit EcoRI verdaut worden ist. Das erhaltene Plasmid wurde
als pCRCAB bezeichnet. Dieses Plasmid ist in E. coli und coryneformen
Bakterien autonom replizierbar und verleiht dem Wirt eine Kanamycin-Resistenz,
und das Plasmid trägt
sowohl mutiertes lysC und dapA. Das Konstruktionsverfahren von pCRCAB
ist in 9 gezeigt.
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<5> Konstruktion
des Plasmids, das sowohl mutiertes lysC und dap trägt
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Ein
Plasmid, das mutiertes lysC und dapB trägt, wurde aus dem Plasmid p399AK9
konstruiert, welches mutiertes lysC trägt, und dem Plasmid p399DPR,
welches dapB trägt.
Ein Fragment von 1.101 bp, welches das Strukturgen für DDPR trägt, wurde
durch das Verdauen von p399DPR mit EcoRV und SphI extrahiert, konstruiert.
Dieses Fragment wurde mit p399AK9 ligiert, welches mit SalI verdaut
worden ist und dann geglättet
wurde, und das weiter mit SphI verdaut worden ist, um ein Plasmid
zu konstruieren, das sowohl mutiertes lysC und dapB trägt. Dieses
Plasmid wurde als p399AKDDPR bezeichnet.
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Als
nächstes
wurde der Brevi.-ori in das erhaltene p399AKDDPR eingeschleust.
Das Plasmid pHK4, das den Brevi.-ori enthält, wurde mit einem Restriktionsenzym
KpnI verdaut (hergestellt von Takara Shuzo), und die geschnittenen
Enden wurden geglättet.
Die Blunt end Bildung wurde unter Verwendung des DNA-Bluntingkits (hergestellt
von Takara Shuzo) in Übereinstimmung
mit einem vorgegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Blunt end-Bildung
wurde ein phosphorylierter BamHI-Linker
(hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifizierung zu
ergeben, so dass das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Anteil entspricht,
aus pHK4 durch die Verdauung allein mit BamHI ausgeschnitten werden
kann. Dieses Plasmid wurde mit BamHI verdaut, und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment
wurde mit p399AKDDPR ligiert, welches ebenfalls mit BamHI verdaut
worden ist, um ein Plasmid zu konstruieren, das mutiertes lysC und
dapB trägt,
welche in coryneformen Bakterien autonom replizierbar sind. Das
konstruierte Plasmid wurde als pCB bezeichnet. Der Konstruktionsprozess
von pCB ist in 10 gezeigt.
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<6> Konstruktion
des Plasmids, das sowohl dapA und dapB trägt
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Das
Plasmid pCRDAPA, das dapA trägt,
wurde mit KpnI und EcoRI verdaut, um ein DNA-Fragment zu extrahieren,
das dapA enthält,
und das Fragment wurde mit dem Vektorplasmid pHSG399 ligiert, welches
mit KpnI und EcoRI verdaut worden ist. Das erhaltene Plasmid wurde
als p399DPS bezeichnet.
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Andererseits
wurde das Plasmid pCRDAPB, das dapB trägt, mit SacII und EcoRI verdaut,
um ein DNA-Fragment
zu extrahieren von 2,0 kb, welches eine Region enthält, die
für DDPR
kodiert, und das Fragment wurde mit p399DPS ligiert, welches mit
SacII und EcoRI verdaut worden ist, um ein Plasmid herzustellen, das
sowohl dapA und dapB trägt.
Das erhaltene Plasmid wurde als p399AB bezeichnet.
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Als
nächstes
wurde der Brevi.-ori in p399AB eingeschleust. pHK4, der den Brevi.-ori
trägt,
wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut (hergestellt von Takara
Shuzo), und die geschnittenen Enden wurden geglättet. Blunt-end-Bildung wurde
unter Verwendung eines DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara
Shuzo) in Übereinstimmung
mit einem angegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Blunt-end-Bildung
wurde ein phosporylierter KpnI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo)
ligiert, um eine Modifizierung zu ergeben, so dass das DNA-Fragment,
das dem Brevi.-ori-Anteil entspricht, nur mit dem Verdau von pHK4
mit KpnI ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit KpnI
verdaut, und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit p399AB
ligiert, welches ebenfalls mit KpnI verdaut worden ist, um ein Plasmid
zu konstruieren, das dapA und dapB trägt, die in coryneformen Bakterien
autonom replizierbar sind. Das konstruierte Plasmid wurde als pAB
bezeichnet. Der Konstruktionsprozess von pAB ist in 11 gezeigt.
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<7> Konstruktion
des Plasmids, das mutiertes lysC, dapA und dapB zusammen trägt
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p399DPS
wurde mit EcoRI und SphI verdaut, gefolgt von der Blunt-end-Bildung,
um ein dapA-Genfragment zu extrahieren. Dieses Fragment wurde mit
dem p399AK9 ligiert, welches mit SalI verdaut worden ist und geglättet wurde,
um ein Plasmid p399CA zu konstruieren, bei dem mutiertes lysC und
dapA gemeinsam vorhanden sind.
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Das
Plasmid pCRDAPB, das dapB trägt,
wurde mit EcoRI verdaut, und geglättet, gefolgt von dem Verdau
mit SacI, um ein DNA-Fragment von 2,0 kb zu extrahieren, welches
dapB umfasst. Das Plasmid p399CA, das dapA und mutiertes lysC trägt, wurde
mit SpeI verdaut und geglättet,
und danach wurde es mit SacI verdaut und mit dem extrahierten dapB-Fragment
ligiert, um ein Plasmid zu erhalten, das mutiertes lysC, dapA und
dapB trägt.
Dieses Plasmid wurde als p399CAB bezeichnet.
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Als
nächstes
wurde der Brevi.-ori in p399CAB eingeschleust. Das Plasmid pHK4,
welches den Brevi.-ori
trägt,
wurde mit einem Restriktionsenzym BamHI (hergestellt von Takara
Shuzo) verdaut, und die geschnittenen Enden wurden geglättet. Die
Blunt-end-Bildung
wurde durch das Verwenden von einem DNA-Blunting-Kit (hergestellt von Takara
Shuzo) in Übereinstimmung
mit einem angegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Blunt-end-Bildung
wurde ein phosphorylierter KpnI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo)
ligiert, um eine Modifizierung zu ergeben, so dass das DNA-Fragment,
das dem Brevi.-ori-Anteil entspricht, durch den Verdau nur mit KpnI
aus pHK4 ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit KpnI
verdaut, und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit p399CAB
ligiert, welches ebenfalls mit KpnI verdaut worden ist, um ein Plasmid
zu konstruieren, das mutiertes lysC, dapA und dapB zusammen trägt, welches autonom
in coryneformen Bakterien replizierbar ist. Das konstruierte Plasmid
wurde als pCAB bezeichnet. Der Konstruktionsprozess von pCAB ist
in 12 gezeigt.
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<8> Konstruktion
des Plasmids, das mutiertes lysC trägt, dapA, dapB und lysA zusammen
trägt
-
Das
Plasmid p299LYSA, das lysA trägt,
wurde mit KpnI und BamHI geschnitten und geglättet, und dann wurde das lysA-Genfragment
extrahiert. Dieses Fragment wurde mit pCAB ligiert, welches mit
HpaI verdaut worden ist (hergestellt von Takara Shuzo), und geglättet wurde,
um ein Plasmid zu konstruieren, das mutiertes lysC, dapA, dapB und
lysA zusammenträgt,
welches in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist. Das konstruierte
Plasmid wurde als pCABL bezeichnet. Der Konstruktionsprozess von
pCABL ist in 13 gezeigt.
Es ist anzumerken, dass das lysA-Genfragment in die HpaI-Stelle
in einem DNA-Fragment inseriert wurde, welches das dapB-Gen in pCABL
trägt,
jedoch ist die HpaI-Stelle stromaufwärts des Promotors des dapB-Gens
(Nukleotidnummern 611 bis 616 in der SEQ ID NO: 23) lokalisiert,
und das dapB-Gen ist nicht geteilt.
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<9> Konstruktion
eines Plasmids, das mutiertes lysC, dapA, dapB, ddh und lysA zusammen
trägt
-
pHSG299
wurde mit XbaI und KpnI verdaut, und wurde mit p399DL ligiert, das
ddh und lysA trägt,
welche mit XbaI und KpnI verdaut wurden. Das konstruierte Plasmid
wurde als p299DL bezeichnet. p299DL wurde mit XbaI und KpnI verdaut
und geglättet.
Nach der Blunt-end-Bildung wurde ein DNA-Fragment, das ddh und lysA
trägt,
extrahiert. Dieses DNA-Fragment wurde mit dem Plasmid pCAB ligiert,
welches mutiertes lysC, dapA und dapB zusammen trägt, welche
mit HpaI verdaut worden sind und blunt-ended wurden, um ein Plasmid
zu konstruieren, das mutiertes lysC, dapA, dapB, lysA und ddh zusammen
trägt,
welches in coryneformen Bakterien autonom replizierbar sind. Das
konstruierte Plasmid wurde als pCABDL bezeichnet. Der Konstruktionsprozess
von pCABDL ist in 14 gezeigt.
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Beispiel 5: Einschleusen
des Plasmids, das Gene für
die L-Lysin-Biosynthese trägt,
in L-Lysin produzierende Bakterien von Brevibacterium lactofermentum
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Die
Plasmide, die die Gene für
die L-Lysin-Biosynthese tragen, die wie oben beschrieben konstruiert wurden,
d. h. pLYSAB (Cmr), pPK4D (Cmr), p399AK9B (Cmr), pDPSB (Kmr), pDPRB
(Cmr), pCRCAB (Kmr), pAB (Cmr), pDL (Cmr), pCB (Cmr), pCAB(Cmr),
pCABL(Cmr) und pCABDL (Cmr) wurden in das L-Lysin produzierende
Bakterium AJ11082 (NRRL B-1470) des Brevibacterium lactofermentum
jeweils eingeschleust. Der AJ11082-Stamm hat die Eigenschaft der
REC-Resistenz. Die Plasmide wurden in Übereinstimmung mit einem elektrischen
Pulverfahren (Sugimoto et al., japanisches Patent, Anmeldungs-Veröffentlichungsnummer 2-207791)
eingeschleust. Transformanten wurden auf der Grundlage einer von
Medikamenten-Resistenzmarkern selektioniert, die von den jeweiligen
Plasmiden besessen werden. Die Transformanten wurden auf komplettem
Medium, enthaltend 5,5 μg/ml
Chloramphenicol selektioniert, wenn ein Plasmid, das ein Chloramphenicol-Resistenzgen
trägt,
eingeschleust wurde, oder die Transformanten wurden auf komplettem
Medium selektioniert, das 25 μg/ml
Kanamycin enthält,
wenn ein Plasmid, das ein Kanamycin-Resistenzgen trägt, eingeschleust
wurde.
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Beispiel 6: Produktion
von L-Lysin
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Jeder
der Transformanten, die im Beispiel 5 erhalten wurden, wurde in
einem L-Lysin-Produktionsmedium kultiviert, um die L-Lysin-Produktionsfähigkeit
zu evaluieren. Das L-Lysin-Produktionsmedium
hat die folgende Zusammensetzung.
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[L-Lysin-Produktionsmedium]
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Die
folgenden Bestandteile neben Calciumcarbonat (je l)wurden gelöst, um eine
Einstellung auf pH 8,0 mit KOH zu ergeben. Das Medium wurde bei
115°C für 15 min
sterilisiert und Calciumcarbonat (50 g), welches separat in trockenem
Zustand in heißer
Lust sterilisiert worden ist, wurde zu dem sterilisierten Medium
hinzugegeben.
-
-
Jede
der verschiedenen Arten der Transformanten und der Parentalstamm
wurden in das Medium inokuliert, welches die oben beschriebene Zusammensetzung
hat, um eine Kultivierung bei 31,5°C mit reciprokem Schütteln durchzuführen. Die
Menge an hergestelltem L-Lysin nach 40 oder 72 Stunden Kultivierung
und das Wachstum nach 72 Stunden (OD562)
sind in der Tabelle 1 gezeigt. In der Tabelle stellt lysC* mutiertes
lysC dar. Das Wachstum wurde quantitativ durch das Messen der OD
bei 560 nm nach 101facher Verdünnung
bestimmt.
-
Tabelle
1
Anhäufung
von L-Lysin nach der Kultivierung für 40 oder 72 Stunden
-
Wie
oben gezeigt wird, war die Menge an hergestelltem L-Lysin nach 72
Stunden Kultivierung größer als
oder gleich dem durch den Parentalstamm hergestellten, wenn lysA,
ddh, mutiertes lysC, dapA oder dapB einzeln verstärkt wurden,
jedoch war die Menge an hergestelltem L-Lysin nach 40 Stunden Kultivierung
geringer als die durch den Parentalstamm hergestellt. Das heißt, dass
die L-Lysin-Produktionsgeschwindigkeit bei einer Kultivierung für eine geringere
Dauer abgesenkt war. Gleichermaßen
war die Menge an produziertem L-Lysin nach 72 Stunden Kultivierung
größer als
die, durch den Parentalstamm hergestellte, wenn mutiertes lysC und
dapA, oder dapA und dapB in Kombination verstärkt wurden, jedoch war die
Menge an produziertem L-Lysin nach 40 Stunden Kultivierung geringer
als die, die vom Parentalstamm hergestellt wurde. Das bedeutet,
dass die L-Lysinproduktionsgeschwindigkeit gesenkt war.
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Wenn
andererseits nur lysA und ddh in Kombination verstärkt wurden,
war das Wachstum verbessert, die L-Lysin-Produktionsgeschwindigkeit wurde bei
der kurzen Kultivierungsdauer erfolgreich wieder hergestellt, und
die angehäufte
L-Lysinmenge war bei der Kultivierung über einen langen Zeitraum ebenfalls
verbessert.
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Auch
in dem Fall, dass ein Stamm, bei dem dapB zusammen mit mutiertem
lysC verstärkt
wurde, und im Fall, dass der Stamm in dem dapA wie auch diese Gene
gleichzeitig verstärkt
waren, war das Wachstum und die L-Lysin-Produktionsgeschwindigkeit
verbessert bzw. verstärkt,
verglichen mit dem Parentalstamm. Im Fall eines Stammes, bei dem
diese drei Gene gleichzeitig verstärkt wurden, wurden sowohl die
L-Lysin-Produktionsgeschwindigkeit
und die Menge akumulierten L-Lysins durch das weitere Verstärken von
lysA und ddh weiter verbessert.
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