JPH0611230B2 - 新規組換え体プラスミド - Google Patents
新規組換え体プラスミドInfo
- Publication number
- JPH0611230B2 JPH0611230B2 JP60129508A JP12950885A JPH0611230B2 JP H0611230 B2 JPH0611230 B2 JP H0611230B2 JP 60129508 A JP60129508 A JP 60129508A JP 12950885 A JP12950885 A JP 12950885A JP H0611230 B2 JPH0611230 B2 JP H0611230B2
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- JP
- Japan
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- ddh
- plasmid
- dna
- restriction enzyme
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、メソーの，ε−ジアミノピメリン酸の定量測
定、リジン生合成酵素としてリジンの発酵生産などに有
用なメソーα，ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素（EC
1.4.1.16以下ＤＤＨと略す）をコードする遺伝子（以下
ＤＤＨ遺伝子という）を含む組換え体プラスミドおよび
該組換え体プラスミドを含む微生物によるＤＤＨの製造
法に関する。該プラスミドは、ＤＤＨ活性の増強された
Ｌーリジン生産菌の育種などにも利用される。
定、リジン生合成酵素としてリジンの発酵生産などに有
用なメソーα，ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素（EC
1.4.1.16以下ＤＤＨと略す）をコードする遺伝子（以下
ＤＤＨ遺伝子という）を含む組換え体プラスミドおよび
該組換え体プラスミドを含む微生物によるＤＤＨの製造
法に関する。該プラスミドは、ＤＤＨ活性の増強された
Ｌーリジン生産菌の育種などにも利用される。
従来の技術 ＤＤＨは、コリネ型グルタミン酸生産菌類およびバチル
ス属細菌に存在することが知られている酵素であり、次
の反応を触媒する〔アグリカルチュラル・バイオロジカ
ル・ケミストリィ(Agricultural Biological Chemistr
y),４８巻，２５５７頁，１９８４年参照〕。
ス属細菌に存在することが知られている酵素であり、次
の反応を触媒する〔アグリカルチュラル・バイオロジカ
ル・ケミストリィ(Agricultural Biological Chemistr
y),４８巻，２５５７頁，１９８４年参照〕。
メソーα，ε−ジアミノピメリン酸＋NADP+＋H2O α−アミノ−ε−ケトピメリン酸＋NADPH＋NH4 + 従来、ＤＤＨ遺伝子を組み込んだ組換え体プラスミドな
らびに該組換え体プラスミドを組み込んだ微生物による
ＤＤＨの製造については知られていない。
らびに該組換え体プラスミドを組み込んだ微生物による
ＤＤＨの製造については知られていない。
発明が解決しようとする問題点 本ＤＤＨは、メソーα，ε−ジアミノピメリン酸に特異
的に作用し、ジアミノピメリン酸の他の構造異性体には
作用しないのでメソーα，ε−ジアミノピメリン酸の酵
素的定量測定に利用されるが、従来知られている微生物
による酵素の生成量は微量であるので非常に高価となっ
ていた。
的に作用し、ジアミノピメリン酸の他の構造異性体には
作用しないのでメソーα，ε−ジアミノピメリン酸の酵
素的定量測定に利用されるが、従来知られている微生物
による酵素の生成量は微量であるので非常に高価となっ
ていた。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、コリネ型グルタミン酸生産菌またはバチ
ルス属細菌からＤＤＨ遺伝子を取り出し、これをプラス
ミドに組み込んで組換え体プラスミドを作製し、該プラ
スミドを微生物に導入して得られる形質転換体を培養す
ることにより著量のＤＤＨを製造することができること
を見出し本発明を完成した。
ルス属細菌からＤＤＨ遺伝子を取り出し、これをプラス
ミドに組み込んで組換え体プラスミドを作製し、該プラ
スミドを微生物に導入して得られる形質転換体を培養す
ることにより著量のＤＤＨを製造することができること
を見出し本発明を完成した。
発明の構成 本発明は、ＤＤＨ遺伝子を含む組換え体プラスミド及び
該組換え体プラスミドを組み込んだ微生物によるＤＤＨ
の製造法を提供する。
該組換え体プラスミドを組み込んだ微生物によるＤＤＨ
の製造法を提供する。
コリネ型グルタミン酸生産菌において、ＤＤＨはＬ−リ
ジン生合成経路（第１表）上重要な酵素と考えられてい
る。
ジン生合成経路（第１表）上重要な酵素と考えられてい
る。
ＤＤＨ遺伝子は、コリネ型グルタミン酸生産菌類はもし
くはバチルス属細菌の染色体ＤＮＡから得ることができ
る。これらの、ＤＮＡの供与菌は野性株であっても変異
株であってもよい。
くはバチルス属細菌の染色体ＤＮＡから得ることができ
る。これらの、ＤＮＡの供与菌は野性株であっても変異
株であってもよい。
ＤＤＨ遺伝子は、供与菌からの染色体ＤＮＡの抽出、該
ＤＮＡの部分切断、特定プラスミドへの遺伝子ＤＮＡ断
片の導入、該組換えプラスミドを用いるＬ−α−アミノ
−ε−ケトピメリン酸からメソーα，ε−ジアミノピメ
リン酸に至るリジン生合成酵素類（第１表の酵素Ａ，
Ｂ，Ｃ，ＤまたはＤＤＨのいずれか）またはそれらの組
合せの欠損に由来するメソーα，ε−ジアミノピメリン
酸要求性微生物変異株の形質転換、該要求性が相補され
た形質転換株の選択による工程でクローン化される。
ＤＮＡの部分切断、特定プラスミドへの遺伝子ＤＮＡ断
片の導入、該組換えプラスミドを用いるＬ−α−アミノ
−ε−ケトピメリン酸からメソーα，ε−ジアミノピメ
リン酸に至るリジン生合成酵素類（第１表の酵素Ａ，
Ｂ，Ｃ，ＤまたはＤＤＨのいずれか）またはそれらの組
合せの欠損に由来するメソーα，ε−ジアミノピメリン
酸要求性微生物変異株の形質転換、該要求性が相補され
た形質転換株の選択による工程でクローン化される。
本明細書において、コリネ型グルタミン酸生産菌とは、
コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロ
バクテリウム属などに属する一群のグルタミン酸生産菌
をいう（「発酵と工業」第４０巻，１２０頁，１９８２
年参照）。例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC 13032,コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ
ムATCC 13870,ブレビバクテリウム・フラブムATCC 1406
7,ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムATCC 138
69,ミクロバクテリウム・アンモニアフィルムATCC 1535
4およびそれらの誘導株をあげることができる。バチル
ス属細菌としては、バチルス・スフェリカスATCC 10208
が代表株としてあげられる。
コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロ
バクテリウム属などに属する一群のグルタミン酸生産菌
をいう（「発酵と工業」第４０巻，１２０頁，１９８２
年参照）。例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC 13032,コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ
ムATCC 13870,ブレビバクテリウム・フラブムATCC 1406
7,ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムATCC 138
69,ミクロバクテリウム・アンモニアフィルムATCC 1535
4およびそれらの誘導株をあげることができる。バチル
ス属細菌としては、バチルス・スフェリカスATCC 10208
が代表株としてあげられる。
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC 21543〔本菌は
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC 13032（野性
株）から誘導されたホモセリン要求性、ロイシン要求
性、ペニシリン耐性、チアリジン耐性のリジン生産菌で
ある〕から得られるＤＤＨ遺伝子ＤＮＡは約5.３キロベ
ース（以下Kbという）、および2.７Kbの制限酵素EcoRI
ＤＮＡ断片の連結物である（第１図参照）。
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC 13032（野性
株）から誘導されたホモセリン要求性、ロイシン要求
性、ペニシリン耐性、チアリジン耐性のリジン生産菌で
ある〕から得られるＤＤＨ遺伝子ＤＮＡは約5.３キロベ
ース（以下Kbという）、および2.７Kbの制限酵素EcoRI
ＤＮＡ断片の連結物である（第１図参照）。
バチルス・スフェリカスATCC 10208から得られるＤＤＨ
遺伝子ＤＮＡは、約１0.４Ｋｂの制限酵素HindIIIＤＮ
Ａ断片である。該ＤＮＡは、制限酵素PstＩにより3.９K
bと6.５Kbとに切断される（第２図参照）。
遺伝子ＤＮＡは、約１0.４Ｋｂの制限酵素HindIIIＤＮ
Ａ断片である。該ＤＮＡは、制限酵素PstＩにより3.９K
bと6.５Kbとに切断される（第２図参照）。
上述のＤＤＨ遺伝子ＤＮＡを得るための形質転換に用い
る受容菌は、上述のＬ−リジン生合成酵素類の欠損に起
因するメソーα，ε−ジアミノピメリン酸要求変異株で
ありかつ用いたベクターの複製に好適なものであればい
ずれの微生物であってもよい。本願発明においては、大
腸菌由来のベクターを用いているので、受容菌としては
それが複製可能な大腸菌Ｋ−１２由来のメソーα，ε−
ジアミノピメリン酸要求変異株ＡＴ９８２〔本菌は、Ｎ
−サクシニル−α，ε−ジアミノピメリン酸アミノトラ
ンスフェラーゼ（以下ＳＤＡＴと略す）欠損変異株であ
る〕が用いられる。これらの受容菌は、使用する前に実
施例１に示した方法で制限酵素活性を低下せしめる変異
を施して用いれば好ましい結果が得られる。
る受容菌は、上述のＬ−リジン生合成酵素類の欠損に起
因するメソーα，ε−ジアミノピメリン酸要求変異株で
ありかつ用いたベクターの複製に好適なものであればい
ずれの微生物であってもよい。本願発明においては、大
腸菌由来のベクターを用いているので、受容菌としては
それが複製可能な大腸菌Ｋ−１２由来のメソーα，ε−
ジアミノピメリン酸要求変異株ＡＴ９８２〔本菌は、Ｎ
−サクシニル−α，ε−ジアミノピメリン酸アミノトラ
ンスフェラーゼ（以下ＳＤＡＴと略す）欠損変異株であ
る〕が用いられる。これらの受容菌は、使用する前に実
施例１に示した方法で制限酵素活性を低下せしめる変異
を施して用いれば好ましい結果が得られる。
これらの受容菌はＤＤＨ遺伝子ＤＮＡを有するベクター
を用いて形質転換された際にベクター上のＤＤＨ遺伝子
ＤＮＡの有する情報を発現する。特に、ベクターとして
マルチコピープラスミドを用いてＤＤＨ遺伝子ＤＮＡを
挿入する際には、該ＤＮＡが著しく増加し菌体中のＤＤ
Ｈ活性が著しく増加する。このようにして得た形質転換
株の保有するＤＤＨ遺伝子ＤＮＡは、他の適当なベクタ
ーに再度組み換えて、例えばコリネ型グルタミン酸生産
菌に属する受容菌に導入することもできる。
を用いて形質転換された際にベクター上のＤＤＨ遺伝子
ＤＮＡの有する情報を発現する。特に、ベクターとして
マルチコピープラスミドを用いてＤＤＨ遺伝子ＤＮＡを
挿入する際には、該ＤＮＡが著しく増加し菌体中のＤＤ
Ｈ活性が著しく増加する。このようにして得た形質転換
株の保有するＤＤＨ遺伝子ＤＮＡは、他の適当なベクタ
ーに再度組み換えて、例えばコリネ型グルタミン酸生産
菌に属する受容菌に導入することもできる。
再度の組換えに用いるベクターとしては、コリネ型グル
タミン酸生産菌において複製でき、ＤＤＨ遺伝子ＤＮＡ
を受容菌へ持ち込みその形質を転換することができるも
のであれば、いずれも用いられる。
タミン酸生産菌において複製でき、ＤＤＨ遺伝子ＤＮＡ
を受容菌へ持ち込みその形質を転換することができるも
のであれば、いずれも用いられる。
例えば本発明者らの開発にかかるｐＣＧ１，ｐＣＧ２，
ｐＣＧ４，ｐＣＧ１１，ｐＣＥ５４，あるいはｐＣＢ１
０１が好ましい。これらのベクターの調製法は特開昭57
-134500,特開昭57-183779,特開昭58-35197および特開昭
58-105999に記載されている。
ｐＣＧ４，ｐＣＧ１１，ｐＣＥ５４，あるいはｐＣＢ１
０１が好ましい。これらのベクターの調製法は特開昭57
-134500,特開昭57-183779,特開昭58-35197および特開昭
58-105999に記載されている。
これらのプラスミドは、これを保有するコリネ型グルタ
ミン酸生産菌（ブレビバクテリウム属あるいはコリネバ
クテリウム属）に属する微生物の細胞から、特開昭57-1
34500に記載した方法に従って単離することができる。
ミン酸生産菌（ブレビバクテリウム属あるいはコリネバ
クテリウム属）に属する微生物の細胞から、特開昭57-1
34500に記載した方法に従って単離することができる。
ベクタープラスミドにＤＤＨ遺伝子ＤＮＡを挿入するに
は、適当な制限酵素によりプラスミドを切断し、常法に
よりその中へ適当な遺伝子ＤＮＡを連結することによっ
て行うことができる。
は、適当な制限酵素によりプラスミドを切断し、常法に
よりその中へ適当な遺伝子ＤＮＡを連結することによっ
て行うことができる。
ＤＤＨ遺伝子ＤＮＡを有する組換えプラスミドをコリネ
型グルタミン酸生産菌に属する受容菌に取り込ませるに
は、特開昭57-186492および特開昭57-186489に記載の方
法すなわち、受容菌株のプロトプラスト化細胞を形質転
換する方法が利用される。
型グルタミン酸生産菌に属する受容菌に取り込ませるに
は、特開昭57-186492および特開昭57-186489に記載の方
法すなわち、受容菌株のプロトプラスト化細胞を形質転
換する方法が利用される。
組換えプラスミドは、コリネ型グルタミン酸生産菌をス
ペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン
あるいはクロラムフェニコールなどの薬剤の耐性菌に形
質転換するので、ＤＤＨ遺伝子ＤＮＡを挿入したプラス
ミドを含む形質転換株は、その薬剤耐性を試験すること
によって容易に同定することができる。
ペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン
あるいはクロラムフェニコールなどの薬剤の耐性菌に形
質転換するので、ＤＤＨ遺伝子ＤＮＡを挿入したプラス
ミドを含む形質転換株は、その薬剤耐性を試験すること
によって容易に同定することができる。
このようにして得たＤＤＨ遺伝子ＤＮＡを含む組換え体
プラスミドを導入した微生物は通常の培地に培養して、
ＤＤＨを培養物中に蓄積させることができる。
プラスミドを導入した微生物は通常の培地に培養して、
ＤＤＨを培養物中に蓄積させることができる。
培地は炭素源、窒素源および無機イオン類さらに必要に
応じてビタミン類、アミノ酸類、有機酸類などの有機栄
養源の少量を含有する通常の培地が使用できる。
応じてビタミン類、アミノ酸類、有機酸類などの有機栄
養源の少量を含有する通常の培地が使用できる。
炭素源としてはグルコース、シュークロース、ラクトー
ス、でんぷん、でんぷん加水分解物、廃糖蜜などが利用
される。窒素源としてはガス状アンモニア、液状アンモ
ニア、アンモニウム化合物、尿素その他の含窒素化合物
を用いることができる。
ス、でんぷん、でんぷん加水分解物、廃糖蜜などが利用
される。窒素源としてはガス状アンモニア、液状アンモ
ニア、アンモニウム化合物、尿素その他の含窒素化合物
を用いることができる。
微生物細胞中のＤＤＨ活性の検出は、アグリカルチュラ
ル・バイオロジカル・ケミストリィ（Agricultural Bio
logical Chemistry），48巻，2557〜2560頁，1984年に
記載の方法によって、メソーα，ε−ジアミノピメリン
酸を基質とし、ＮＡＤＰを補酵素とする反応系を用い
て、３４０ｎｍの波長の変化を追跡する方法、あるいは
菌体抽出物をゲル電気泳動にかけた後、活性染色する方
法によって行うことができる。
ル・バイオロジカル・ケミストリィ（Agricultural Bio
logical Chemistry），48巻，2557〜2560頁，1984年に
記載の方法によって、メソーα，ε−ジアミノピメリン
酸を基質とし、ＮＡＤＰを補酵素とする反応系を用い
て、３４０ｎｍの波長の変化を追跡する方法、あるいは
菌体抽出物をゲル電気泳動にかけた後、活性染色する方
法によって行うことができる。
培養は、pH５〜９、温度２０〜４０℃で１〜４０時間通
気攪拌培養することによって行う。
気攪拌培養することによって行う。
培養物からのＤＤＨの採取は、菌体破砕液を遠心分離、
透析後、ＤＥＡＥ−セファセル、セファデックスＧ−１
５０などのカラムクロマトグラフィーを用いる常法によ
って行うことができる。
透析後、ＤＥＡＥ−セファセル、セファデックスＧ−１
５０などのカラムクロマトグラフィーを用いる常法によ
って行うことができる。
以下本発明の実施例を述べる。
実施例1.
ＳＤＡＴ欠損変異と宿主特異的制
限欠損変異をあわせて持つ大腸菌Ｋ１２亜株ＴＭ１３５
の造成： 大腸菌の宿主・ベクター系を用いてコリネバクテリウム
・グルタミクムおよびバチルス・スフェリカスのＤＤＨ
遺伝子ＤＮＡを容易にクローン化するために、宿主特異
的制限欠損変異（以下hsdR2と略す）とＳＤＡＴ欠損変
異（以下dap D4と略す）とをあわせ持つクローニング用
宿主菌の造成を次のように行った。
ＳＤＡＴ欠損変異と宿主特異的制
限欠損変異をあわせて持つ大腸菌Ｋ１２亜株ＴＭ１３５
の造成： 大腸菌の宿主・ベクター系を用いてコリネバクテリウム
・グルタミクムおよびバチルス・スフェリカスのＤＤＨ
遺伝子ＤＮＡを容易にクローン化するために、宿主特異
的制限欠損変異（以下hsdR2と略す）とＳＤＡＴ欠損変
異（以下dap D4と略す）とをあわせ持つクローニング用
宿主菌の造成を次のように行った。
制限欠損変異を有する大腸菌Ｋ１２株WA802〔昭和60年
２月25日付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工
研）にEscherichia coli K12 WA802 FERM BP-718として
寄託；F-metB1 hsd R2；ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)，16
巻，118頁，1966年〕から２５μｇ／mlのリファンピシ
ンに耐性となった自然突然変異株ＲＦ８２を誘導した。
次に、ＲＦ８２株とＳＤＡＴ欠損変異株K12 AT982〔昭
和60年４月19日付で微工研にEscherichia coli K12 AT9
82 FERM BP-770として寄託；Hfr dap D4；ジャーナル・
オブ・バクテリオロジイ(Journal of Bacteriology)，1
05巻，844頁，1971年〕とをジアミノピメリン酸５０μ
ｇ／mlを含むＬ培地〔バクトトリプトン（Difco社製）
１％、酵母エキス（大伍栄養社製）0.５％，食塩0.５
％，pH７にＮａＯＨで中和〕中で３７℃の温度条件下で
３時間静置培養した。
２月25日付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工
研）にEscherichia coli K12 WA802 FERM BP-718として
寄託；F-metB1 hsd R2；ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)，16
巻，118頁，1966年〕から２５μｇ／mlのリファンピシ
ンに耐性となった自然突然変異株ＲＦ８２を誘導した。
次に、ＲＦ８２株とＳＤＡＴ欠損変異株K12 AT982〔昭
和60年４月19日付で微工研にEscherichia coli K12 AT9
82 FERM BP-770として寄託；Hfr dap D4；ジャーナル・
オブ・バクテリオロジイ(Journal of Bacteriology)，1
05巻，844頁，1971年〕とをジアミノピメリン酸５０μ
ｇ／mlを含むＬ培地〔バクトトリプトン（Difco社製）
１％、酵母エキス（大伍栄養社製）0.５％，食塩0.５
％，pH７にＮａＯＨで中和〕中で３７℃の温度条件下で
３時間静置培養した。
生理食塩水で２回遠心洗滌後、リファンピシン２５μｇ
／ml、ジアミノピメリン酸５０μｇ／mlを含むＭ９最小
寒天培地（グルコース２ｇ、ＮH4Ｃｌ１ｇ、Ｎa2ＨＰO4
６ｇ、ＫH2ＰO4 ３ｇ、ＭｇＳO4・７H2Ｏ 0.１ｇ、
ＣａＣl2・２H2Ｏ１５mg、チアミン・ＨＣｌ ４mgおよ
び寒天１５ｇ、水１、pH7.２）に塗布し、３７℃で５
日間培養後生育してくるコロニーの中からリファンピシ
ン耐性でメチオニン非要求性となった接合体を選択し
た。
／ml、ジアミノピメリン酸５０μｇ／mlを含むＭ９最小
寒天培地（グルコース２ｇ、ＮH4Ｃｌ１ｇ、Ｎa2ＨＰO4
６ｇ、ＫH2ＰO4 ３ｇ、ＭｇＳO4・７H2Ｏ 0.１ｇ、
ＣａＣl2・２H2Ｏ１５mg、チアミン・ＨＣｌ ４mgおよ
び寒天１５ｇ、水１、pH7.２）に塗布し、３７℃で５
日間培養後生育してくるコロニーの中からリファンピシ
ン耐性でメチオニン非要求性となった接合体を選択し
た。
このような接合体の中からジアミノピメリン酸要求性を
示しかつ制限欠損変異を有している株を選んだ。
示しかつ制限欠損変異を有している株を選んだ。
制限欠損変異の有無は修飾機能の欠損した大腸菌ATCC 3
3525（r-，m-）上で増殖したλファージ〔大腸菌ATCC 1
0798（λファージ溶原菌）から調製〕の平板効率をもっ
て判定した。すなわち、ＷＡ８０２株と同等の平板効率
を示した株を制限欠損変異を有する接合体であるとし
た。
3525（r-，m-）上で増殖したλファージ〔大腸菌ATCC 1
0798（λファージ溶原菌）から調製〕の平板効率をもっ
て判定した。すなわち、ＷＡ８０２株と同等の平板効率
を示した株を制限欠損変異を有する接合体であるとし
た。
このようにして得られたジアミノピメリン酸要求性でか
つ制限欠損変異型の接合体の代表株がＴＭ１３５（昭和
60６月13日付で微工研にEscherichia coli TM135 FERM
BP-814として寄託）である。
つ制限欠損変異型の接合体の代表株がＴＭ１３５（昭和
60６月13日付で微工研にEscherichia coli TM135 FERM
BP-814として寄託）である。
実施例2. コリネバクテリウム・グルタミクムのＤＤＨ遺伝子のク
ローン化 クローニングは大腸菌の宿主・ベクター系にて実施す
る。ベクターとして使用したｐＢＲ３２２プラスミドは
市販品（宝酒造社製）を用いた。供与体ＤＮＡたる染色
体ＤＮＡはコリネバクテリウム・グルタミクムATCC 215
43から特開昭58-126789実施例第１項に記載の方法に従
って単離した。
ローン化 クローニングは大腸菌の宿主・ベクター系にて実施す
る。ベクターとして使用したｐＢＲ３２２プラスミドは
市販品（宝酒造社製）を用いた。供与体ＤＮＡたる染色
体ＤＮＡはコリネバクテリウム・グルタミクムATCC 215
43から特開昭58-126789実施例第１項に記載の方法に従
って単離した。
ｐＢＲ３２２ＤＮＡ ４μｇおよびコリネバクテリウム
・グルタミクムATCC 21543の染色体ＤＮＡ８μｇを含む
制限酵素ＥｃｏＲＩ用反応液（１０mMトリス塩酸緩衝
液、７mM ＭｇＣｌ２、１００mMＮａＣｌ、pH7.５）１
２０μに１２単位のＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を添加
し、３７℃の温度条件下で６０分間反応後、６５℃で１
０分間加温して反応を停止した。該反応消化物にＴ４リ
ガーゼ用反応液（６６０mMトリス塩酸緩衝液、６６mM
ＭｇＣｌ２、１００mMジチオスレイトール、ｐＨ7.６）
３０μ、５mM ＡＴＰ ３０μ、Ｔ４リガーゼ（宝
酒造社製）0.３単位および水１２０μを加え、１２℃
で１６時間反応させた。
・グルタミクムATCC 21543の染色体ＤＮＡ８μｇを含む
制限酵素ＥｃｏＲＩ用反応液（１０mMトリス塩酸緩衝
液、７mM ＭｇＣｌ２、１００mMＮａＣｌ、pH7.５）１
２０μに１２単位のＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を添加
し、３７℃の温度条件下で６０分間反応後、６５℃で１
０分間加温して反応を停止した。該反応消化物にＴ４リ
ガーゼ用反応液（６６０mMトリス塩酸緩衝液、６６mM
ＭｇＣｌ２、１００mMジチオスレイトール、ｐＨ7.６）
３０μ、５mM ＡＴＰ ３０μ、Ｔ４リガーゼ（宝
酒造社製）0.３単位および水１２０μを加え、１２℃
で１６時間反応させた。
このリガーゼ反応物を前述の大腸菌ＴＭ１３５株の形質
転換に供した。ＴＭ１３５株のコンピテントセルはダジ
ェルト（Dagert）らの方法〔ジーン（Gene）、第６巻，
23頁，1979年〕で調製した。
転換に供した。ＴＭ１３５株のコンピテントセルはダジ
ェルト（Dagert）らの方法〔ジーン（Gene）、第６巻，
23頁，1979年〕で調製した。
すなわち、ジアミノピメリン酸５０μｇ／mlを補ったＬ
培地５０mlにＴＭ１３５株を植菌し、東京光電社製比色
計で６６０ｎｍにおける吸光度（以下O.D.と略す）が0.
５になるまで３７℃で培養した。培養液を氷水中で１０
分間冷却後、菌体を遠心集菌し、冷却した0.１Ｍ塩化カ
ルシウム２０mlに懸濁して、０℃にて２０分間静置し
た。その後菌体を遠心集菌し、0.１Ｍ塩化カルシウム溶
液0.５mlに再懸濁し、０℃で１８時間放置した。該菌液
４００μに、前記リガーゼ反応物２００μを添加
混合し、０℃に１０分間置いてから３７℃で５分間加温
した。次いで、ジアミノピメリン酸５０μｇ／mlを含む
Ｌ培地９mlを添加し、３７℃で２時間振盪培養した。生
理食塩水を用いて、２回遠心洗滌後、アンピシリン５０
μg／mlを添加したＭ９最少寒天培地上に塗布し、３７
℃で３日間培養した。出現したアンピシリン耐性でかつ
ジアミノピメリン酸非要求性の形質転換株につきアンピ
シリン50μｇ／mlを含むＬ寒天平板培地上で単集楽分離
を行った。
培地５０mlにＴＭ１３５株を植菌し、東京光電社製比色
計で６６０ｎｍにおける吸光度（以下O.D.と略す）が0.
５になるまで３７℃で培養した。培養液を氷水中で１０
分間冷却後、菌体を遠心集菌し、冷却した0.１Ｍ塩化カ
ルシウム２０mlに懸濁して、０℃にて２０分間静置し
た。その後菌体を遠心集菌し、0.１Ｍ塩化カルシウム溶
液0.５mlに再懸濁し、０℃で１８時間放置した。該菌液
４００μに、前記リガーゼ反応物２００μを添加
混合し、０℃に１０分間置いてから３７℃で５分間加温
した。次いで、ジアミノピメリン酸５０μｇ／mlを含む
Ｌ培地９mlを添加し、３７℃で２時間振盪培養した。生
理食塩水を用いて、２回遠心洗滌後、アンピシリン５０
μg／mlを添加したＭ９最少寒天培地上に塗布し、３７
℃で３日間培養した。出現したアンピシリン耐性でかつ
ジアミノピメリン酸非要求性の形質転換株につきアンピ
シリン50μｇ／mlを含むＬ寒天平板培地上で単集楽分離
を行った。
純化した形質転換株からアン（An）らの方法〔ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジイ(Journal of Bacteriolog
y)，140巻，400頁，1979年〕によりプラスミドを単離し
た。このプラスミドを数種の制限酵素で消化した後、ア
ガロースゲル電気泳動で解析した結果、該プラスミドは
pBR 322の唯一のＥｃｏＲＩ切断部位に5.３Kbおよび2.
７Kbの２つのＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片が挿入された構造
を有していることがわかった。このプラスミドをｐＤＤ
３と命名した（第１図参照）。
ル・オブ・バクテリオロジイ(Journal of Bacteriolog
y)，140巻，400頁，1979年〕によりプラスミドを単離し
た。このプラスミドを数種の制限酵素で消化した後、ア
ガロースゲル電気泳動で解析した結果、該プラスミドは
pBR 322の唯一のＥｃｏＲＩ切断部位に5.３Kbおよび2.
７Kbの２つのＥｃｏＲＩ ＤＮＡ断片が挿入された構造
を有していることがわかった。このプラスミドをｐＤＤ
３と命名した（第１図参照）。
ｐＤＤ３を保有する大腸菌の培養菌体からの粗抽出液中
にはＤＤＨ活性があることが活性染色法で確認された。
プラスミド非保有株の粗酵素抽出液中にはＤＤＨ活性は
検出されなかった。このことから、ｐＤＤ３プラスミド
上にはコリネバクテリウム・グルタミクム由来のＤＤＨ
遺伝子がクローン化されていることがわかる。
にはＤＤＨ活性があることが活性染色法で確認された。
プラスミド非保有株の粗酵素抽出液中にはＤＤＨ活性は
検出されなかった。このことから、ｐＤＤ３プラスミド
上にはコリネバクテリウム・グルタミクム由来のＤＤＨ
遺伝子がクローン化されていることがわかる。
実施例3. バチルス・スフェリカスのＤＤＨ遺伝子のクローン化： 前記と同様、クローン化には大腸菌の宿主・ベクター系
を利用する。ベクターとしてはpBR322プラスミドを用い
る。供与体ＤＮＡとしてはバチルス・スフェリカスATCC
10208から斉藤−三浦（Ｓａｉｔｏ−Ｍｉｕｒａ）の方
法〔バイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ（Biochimi
ca et Biophysica Acta），72巻，619頁，1963年〕によ
って調製した染色体ＤＮＡを用いる。
を利用する。ベクターとしてはpBR322プラスミドを用い
る。供与体ＤＮＡとしてはバチルス・スフェリカスATCC
10208から斉藤−三浦（Ｓａｉｔｏ−Ｍｉｕｒａ）の方
法〔バイオキミカ・バイオフィジカ・アクタ（Biochimi
ca et Biophysica Acta），72巻，619頁，1963年〕によ
って調製した染色体ＤＮＡを用いる。
pBR322ＤＮＡ ４μｇおよびバチルス・スフェリカスAT
CC 10208の染色体ＤＮＡ ８μｇを含む制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII用反応液（10mMトリス塩酸緩衝液、７mM ＭｇＣ
ｌ２，５０mM ＮａＣｌ，pH7.５）１２０μに１２単
位のＨｉｎｄIII（宝酒造社製）を添加し、３７℃で６
０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止し
た。次に、該反応消化物に前項と同様の方法でＴ４リガ
ーゼを作用させた。
CC 10208の染色体ＤＮＡ ８μｇを含む制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII用反応液（10mMトリス塩酸緩衝液、７mM ＭｇＣ
ｌ２，５０mM ＮａＣｌ，pH7.５）１２０μに１２単
位のＨｉｎｄIII（宝酒造社製）を添加し、３７℃で６
０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止し
た。次に、該反応消化物に前項と同様の方法でＴ４リガ
ーゼを作用させた。
このリガーゼ反応物を用いて、ＴＭ１３５株の形質転換
を行った。形質転換および形質転換体の選択は前項と同
様の方法で行った。出現したアンピシリン耐性でかつジ
アミノピメリン酸非要求性の形質転換株につき５０μｇ
／mlのアンピシリンを含むＬ寒天平板培地上で単集落分
離を行った。
を行った。形質転換および形質転換体の選択は前項と同
様の方法で行った。出現したアンピシリン耐性でかつジ
アミノピメリン酸非要求性の形質転換株につき５０μｇ
／mlのアンピシリンを含むＬ寒天平板培地上で単集落分
離を行った。
純化した形質転換株の培地菌体から前記のアン（An）ら
の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。このプラスミド
ＤＮＡを制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動により
解析した結果、同プラスミドはpBR322の唯一のＨｉｎｄ
III制限酵素切断部位に約１０KbのＨｉｎｄIIIＤＮＡ断
片が挿入された構造を有していることがわかった。この
プラスミドをｐＤＤ１０と命名した（第２図参照）。
の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。このプラスミド
ＤＮＡを制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動により
解析した結果、同プラスミドはpBR322の唯一のＨｉｎｄ
III制限酵素切断部位に約１０KbのＨｉｎｄIIIＤＮＡ断
片が挿入された構造を有していることがわかった。この
プラスミドをｐＤＤ１０と命名した（第２図参照）。
得られた形質転換株の菌体破砕粗酵素液中には、活性染
色法でＤＤＨ活性が検出され、ｐＤＤ１０プラスミド上
にバチルス・スフェリカス由来のＤＤＨ遺伝子が存在す
ることが確認された。
色法でＤＤＨ活性が検出され、ｐＤＤ１０プラスミド上
にバチルス・スフェリカス由来のＤＤＨ遺伝子が存在す
ることが確認された。
実施例4. プラスミドｐＤＤ８の作製： コリネバクテリウム・グルタミクム由来のクローン化Ｄ
ＤＨ遺伝子をコリネ型グルタミン酸生産菌中に保持せし
めるために、実施例２で作製したプラスミドｐＤＤ３
を、コリネバクテリウム・グルタミクムのベクタープラ
スミドｐＣＧ１１と組み換え、シャトルプラスミドｐＤ
Ｄ８を以下の工程で誘導した。
ＤＨ遺伝子をコリネ型グルタミン酸生産菌中に保持せし
めるために、実施例２で作製したプラスミドｐＤＤ３
を、コリネバクテリウム・グルタミクムのベクタープラ
スミドｐＣＧ１１と組み換え、シャトルプラスミドｐＤ
Ｄ８を以下の工程で誘導した。
先ず、プラスミドｐＣＧ１１を、それを保有する菌株
（コリネバクテリウム・グルタミクムATCC39022）から
特開昭57-134500実施例１ 第１項に記載の方法に従っ
て単離した。ｐＣＧ１１およびｐＤＤ３プラスミドＤＮ
Ａを各々４μｇ含む制限酵素ＰｓｔＩ用反応液〔２０mM
トリス塩酸緩衝液、１０mM ＭｇＣｌ２，５０mM（Ｎ
H4）２ＳＯ４，0.０１％ウシ血清アルブミン（シグマ社
製）、pH7.２〕１２０μにＰｓｔＩ制限酵素（宝酒造
社製）８単位をを添加し、３７℃で６０分間反応させ
た。これを、６５℃で１０分間加温して反応を停止させ
た後、Ｔ４リガーゼ用緩衝液３０μ、５mM ＡＴＰ
３０μ、Ｔ４リガーゼ0.３単位およびH2Ｏ １２０μ
を加え、１２℃で１６時間反応させた。次に、該リガ
ーゼ反応生成物を用いて、実施例２に示した方法で、Ｔ
Ｍ１３５株を形質転換した。すなわち、スペクチノマイ
シン１００μｇ／mlを含むＭ９寒天平板培地上に出現し
た形質転換株の１株について、同一組成の寒天平板上で
単集落分離を行い、得られる純化株の培養菌体から前記
のアン（An）らの方法でプラスミドＤＮＡを単離した。
該プラスミドＤＮＡの構造を制限酵素切断とアガロース
ゲル電気泳動により調べた結果、該プラスミドはｐＤＤ
３プラスミド内のpBR322ＤＮＡ部分上に存在するＰｓｔ
Ｉ切断部位にｐＣＧ１１プラスミドが挿入された構造を
有していた。該プラスミドをｐＤＤ８と命名した（第１
図参照）。
（コリネバクテリウム・グルタミクムATCC39022）から
特開昭57-134500実施例１ 第１項に記載の方法に従っ
て単離した。ｐＣＧ１１およびｐＤＤ３プラスミドＤＮ
Ａを各々４μｇ含む制限酵素ＰｓｔＩ用反応液〔２０mM
トリス塩酸緩衝液、１０mM ＭｇＣｌ２，５０mM（Ｎ
H4）２ＳＯ４，0.０１％ウシ血清アルブミン（シグマ社
製）、pH7.２〕１２０μにＰｓｔＩ制限酵素（宝酒造
社製）８単位をを添加し、３７℃で６０分間反応させ
た。これを、６５℃で１０分間加温して反応を停止させ
た後、Ｔ４リガーゼ用緩衝液３０μ、５mM ＡＴＰ
３０μ、Ｔ４リガーゼ0.３単位およびH2Ｏ １２０μ
を加え、１２℃で１６時間反応させた。次に、該リガ
ーゼ反応生成物を用いて、実施例２に示した方法で、Ｔ
Ｍ１３５株を形質転換した。すなわち、スペクチノマイ
シン１００μｇ／mlを含むＭ９寒天平板培地上に出現し
た形質転換株の１株について、同一組成の寒天平板上で
単集落分離を行い、得られる純化株の培養菌体から前記
のアン（An）らの方法でプラスミドＤＮＡを単離した。
該プラスミドＤＮＡの構造を制限酵素切断とアガロース
ゲル電気泳動により調べた結果、該プラスミドはｐＤＤ
３プラスミド内のpBR322ＤＮＡ部分上に存在するＰｓｔ
Ｉ切断部位にｐＣＧ１１プラスミドが挿入された構造を
有していた。該プラスミドをｐＤＤ８と命名した（第１
図参照）。
ｐＤＤ８保有株においてもｐＤＤ３保有株と同様に、Ｄ
ＤＨの産生があることが、活性染色法で確認された。
ＤＨの産生があることが、活性染色法で確認された。
実施例5. ｐＤＤ８プラスミドのコリネバクテリウム・グルタミク
ムへの導入： ｐＤＤ８プラスミドを用いて、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムのＬ−リジン生産菌ATCC 21543の形質転換を
行った。ATCC 21543の種培養液0.１mlをＬ−ホモセリン
５０μｇ／mlとＬ−ロイシン １００μｇ／mlを含む１
０mlのＳＳＭ培地〔グルコース２０ｇ、（ＮH4)２ＳO4
10ｇ、尿素３ｇ、酵母エキス１ｇ、ＫH2ＰO4 １ｇ、
ＭｇＣl2・６H2Ｏ 0.４ｇ、ＦｅＳO4・７H2Ｏ １０m
g，ＭｎＳO4・４〜６H2Ｏ 0.２mg、ＺｎＳO4・７H2Ｏ
0.９mg、ＣｕＳＯ４．５H2Ｏ 0.４mg、Ｎa2B4O7・１
０H2Ｏ 0.０９mg、（ＮH4）６Ｍo7O24・４H2Ｏ 0.０
４mg、ビオチン ３０μｇ、チアミン・ＨＣｌ １mg、
水１、pH7.２〕に接種し３０℃で振盪培養した。O.D.
が0.１５になった時点で0.５単位／mlになるようにペニ
シリンＧを添加した。さらに培養を続けO.D.が0.６にな
ったところで集菌し１mg／mlのリゾチームを含む２mlの
ＲＣＧＰ培地〔グルコース５ｇ、カザミノ酸５ｇ、酵母
エキス2.５ｇ、K2ＨＰO4 3.５ｇ、ＫH2ＰO4 1.５ｇ、
ＭｇＣl2・６H2Ｏ 0.４１ｇ、ＦｅＳO4・７H2Ｏ １０
mg，ＭｎＳO4・４〜６H2Ｏ ２mg、ＺｎＳO4・７H2Ｏ
0.９mg、（ＮH4）６Ｍo7O24・４H2Ｏ 0.０４mg、ビオ
チン ３０μｇ、チアミン・ＨＣｌ ２mgコハク酸二ナ
トリウム１３５ｇ、ポリビニルピロリドン（分子量10,0
00）３０ｇ、水１、pH7.２〕に懸濁し、３０℃で１４
時間緩やかに振盪して細胞をプロトプラスト化した。こ
のプロトプラスト菌液１mlを2,５００×ｇで１５分間遠
心分離し、得られるプロトプラストの沈澱をＴＳＭＣ緩
衝液〔１０ｍＭ ＭｇＧｌ２、30mM ＣａＣｌ２、50mM
トリス塩酸緩衝液pH7.5）、400mM 蔗糖〕１mlに懸濁し
て遠心洗滌後ＴＳＭＣ緩衝液0.１mlに再懸濁した。この
懸濁液に、ｐＤＤ８プラスミドＤＮＡ２０μを混和
し、次いで20%(W/V)のポリエチレングリコール（ＰＥＧ
と略す）6,０００を含むＴＳＭＣ緩衝液0.８mlを添加し
て混合した。３分後、これにＲＣＧＰ培地２mlを添加
し、2.５００×ｇで５分間遠心分離にかけてプロトプラ
ストを沈降させた。得られたプロトプラストの沈澱を１
mlのＲＣＧＰ培地に懸濁し３０℃で２時間緩やかに振盪
培養した。次いでこのプロトプラスト懸濁液0.１mlを、
スペクチノマイシン４００μｇ／mlを含むＲＣＧＰ寒天
培地（寒天1.４％を添加したＲＣＧＰ培地）に塗布し、
３０℃で６日間培養した。
ムへの導入： ｐＤＤ８プラスミドを用いて、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムのＬ−リジン生産菌ATCC 21543の形質転換を
行った。ATCC 21543の種培養液0.１mlをＬ−ホモセリン
５０μｇ／mlとＬ−ロイシン １００μｇ／mlを含む１
０mlのＳＳＭ培地〔グルコース２０ｇ、（ＮH4)２ＳO4
10ｇ、尿素３ｇ、酵母エキス１ｇ、ＫH2ＰO4 １ｇ、
ＭｇＣl2・６H2Ｏ 0.４ｇ、ＦｅＳO4・７H2Ｏ １０m
g，ＭｎＳO4・４〜６H2Ｏ 0.２mg、ＺｎＳO4・７H2Ｏ
0.９mg、ＣｕＳＯ４．５H2Ｏ 0.４mg、Ｎa2B4O7・１
０H2Ｏ 0.０９mg、（ＮH4）６Ｍo7O24・４H2Ｏ 0.０
４mg、ビオチン ３０μｇ、チアミン・ＨＣｌ １mg、
水１、pH7.２〕に接種し３０℃で振盪培養した。O.D.
が0.１５になった時点で0.５単位／mlになるようにペニ
シリンＧを添加した。さらに培養を続けO.D.が0.６にな
ったところで集菌し１mg／mlのリゾチームを含む２mlの
ＲＣＧＰ培地〔グルコース５ｇ、カザミノ酸５ｇ、酵母
エキス2.５ｇ、K2ＨＰO4 3.５ｇ、ＫH2ＰO4 1.５ｇ、
ＭｇＣl2・６H2Ｏ 0.４１ｇ、ＦｅＳO4・７H2Ｏ １０
mg，ＭｎＳO4・４〜６H2Ｏ ２mg、ＺｎＳO4・７H2Ｏ
0.９mg、（ＮH4）６Ｍo7O24・４H2Ｏ 0.０４mg、ビオ
チン ３０μｇ、チアミン・ＨＣｌ ２mgコハク酸二ナ
トリウム１３５ｇ、ポリビニルピロリドン（分子量10,0
00）３０ｇ、水１、pH7.２〕に懸濁し、３０℃で１４
時間緩やかに振盪して細胞をプロトプラスト化した。こ
のプロトプラスト菌液１mlを2,５００×ｇで１５分間遠
心分離し、得られるプロトプラストの沈澱をＴＳＭＣ緩
衝液〔１０ｍＭ ＭｇＧｌ２、30mM ＣａＣｌ２、50mM
トリス塩酸緩衝液pH7.5）、400mM 蔗糖〕１mlに懸濁し
て遠心洗滌後ＴＳＭＣ緩衝液0.１mlに再懸濁した。この
懸濁液に、ｐＤＤ８プラスミドＤＮＡ２０μを混和
し、次いで20%(W/V)のポリエチレングリコール（ＰＥＧ
と略す）6,０００を含むＴＳＭＣ緩衝液0.８mlを添加し
て混合した。３分後、これにＲＣＧＰ培地２mlを添加
し、2.５００×ｇで５分間遠心分離にかけてプロトプラ
ストを沈降させた。得られたプロトプラストの沈澱を１
mlのＲＣＧＰ培地に懸濁し３０℃で２時間緩やかに振盪
培養した。次いでこのプロトプラスト懸濁液0.１mlを、
スペクチノマイシン４００μｇ／mlを含むＲＣＧＰ寒天
培地（寒天1.４％を添加したＲＣＧＰ培地）に塗布し、
３０℃で６日間培養した。
得られたスペクチノマイシン耐性形質転換株ＲＬＣ−９
から、特開昭57-134500、実施例１、第１項に記載の方
法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。単離したプラ
スミドは制限酵素で切断後アガロースゲル電気泳動で解
析した結果、形質転換に用いたｐＤＤ８と同じ構造をし
ていることが確認された（第１図参照）。さらに、ATCC
21543株にくらべて、ｐＤＤ８を導入した株ではＤＤＨ
活性が著しく高いことがわかった（第２表）。
から、特開昭57-134500、実施例１、第１項に記載の方
法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。単離したプラ
スミドは制限酵素で切断後アガロースゲル電気泳動で解
析した結果、形質転換に用いたｐＤＤ８と同じ構造をし
ていることが確認された（第１図参照）。さらに、ATCC
21543株にくらべて、ｐＤＤ８を導入した株ではＤＤＨ
活性が著しく高いことがわかった（第２表）。
また、プラスミドｐＤＤ８保有菌の菌体破砕粗抽出液中
には、活性染色で、親株であるATCC 21543株のそれと同
一の挙動を示しかつ親株よりも著しく強いＤＤＨ活性を
認めた。
には、活性染色で、親株であるATCC 21543株のそれと同
一の挙動を示しかつ親株よりも著しく強いＤＤＨ活性を
認めた。
実施例6. 種菌として前述のプラスミドｐＤＤ８保有株ＲＬＣ−９
を用い、種培地〔廃糖蜜（糖換算）５％、大豆粕分解物
（固形物換算）２％、コーン・スチープ・リカー１％、
ＫH2ＰO4 0.０５％、K2ＨＰO4 0.０５％、ＭｇＳO4・
７H2Ｏ 0.０２５％、ＦｅＳO4・７H2Ｏ １０μｇ／
、ＭｎＣl2・４〜６H2Ｏ １０μｇ／、尿素0.３
％、チアミン・ＨＣｌ １００μｇ／、ビオチン５０
μｇ／、Ｌ−ロイシン１００μｇ／ml、スペクチノマ
イシン１００μｇ／ml、pH7.２〕５０mlを含む３００ml
容三角フラスコに接種し、３０℃、２１０ｒｐｍの振盪
条件下でロータリーシューカー上で２４時間振盪培養し
た。得られた種培養液を集めて３００mlとし、これを2.
７の上記と同一組成の種培地を含む５容ジャーファ
ーメンターに接種し、６００ｒｐｍのの回転数、３／
minの通気条件、３０℃の温度条件下で、アンモニア水
でpHを.０に維持しつつ２４時間通気攪拌培養した。得
られた種培養液1.８を１７の生育培地（グルコース
１０％、硫安３％、ＫH2ＰO4 0.１％、ＭｇＳO4・７H2
Ｏ 0.０４％、ＦｅＳO4・７H2Ｏ１０mg／、ＭｎＣl2
・４〜６H2Ｏ １０μｇ／、ビオチン５００μｇ／
、チアミン・ＨＣｌ ２００μｇ／、パントテン酸
カルシウム５００μｇ／、ニコチン酸５００μｇ／
、コーン・スチープ・リカー0.２％、Ｌ−ロイシン２
００μｇ／ml、Ｌ−スレオニン２００μｇ／ml、Ｌ−メ
チオニン１００μｇ／ml、スペクチノマイシン１００μ
ｇ／ml）を含む３０容ジャーファーメンターに接種
し、４００ｒｐｍの回転数、１８／minの通気、３０
℃の温度条件下でアンモニア水でpHを7.０に維持しつつ
３０時間培養した。
を用い、種培地〔廃糖蜜（糖換算）５％、大豆粕分解物
（固形物換算）２％、コーン・スチープ・リカー１％、
ＫH2ＰO4 0.０５％、K2ＨＰO4 0.０５％、ＭｇＳO4・
７H2Ｏ 0.０２５％、ＦｅＳO4・７H2Ｏ １０μｇ／
、ＭｎＣl2・４〜６H2Ｏ １０μｇ／、尿素0.３
％、チアミン・ＨＣｌ １００μｇ／、ビオチン５０
μｇ／、Ｌ−ロイシン１００μｇ／ml、スペクチノマ
イシン１００μｇ／ml、pH7.２〕５０mlを含む３００ml
容三角フラスコに接種し、３０℃、２１０ｒｐｍの振盪
条件下でロータリーシューカー上で２４時間振盪培養し
た。得られた種培養液を集めて３００mlとし、これを2.
７の上記と同一組成の種培地を含む５容ジャーファ
ーメンターに接種し、６００ｒｐｍのの回転数、３／
minの通気条件、３０℃の温度条件下で、アンモニア水
でpHを.０に維持しつつ２４時間通気攪拌培養した。得
られた種培養液1.８を１７の生育培地（グルコース
１０％、硫安３％、ＫH2ＰO4 0.１％、ＭｇＳO4・７H2
Ｏ 0.０４％、ＦｅＳO4・７H2Ｏ１０mg／、ＭｎＣl2
・４〜６H2Ｏ １０μｇ／、ビオチン５００μｇ／
、チアミン・ＨＣｌ ２００μｇ／、パントテン酸
カルシウム５００μｇ／、ニコチン酸５００μｇ／
、コーン・スチープ・リカー0.２％、Ｌ−ロイシン２
００μｇ／ml、Ｌ−スレオニン２００μｇ／ml、Ｌ−メ
チオニン１００μｇ／ml、スペクチノマイシン１００μ
ｇ／ml）を含む３０容ジャーファーメンターに接種
し、４００ｒｐｍの回転数、１８／minの通気、３０
℃の温度条件下でアンモニア水でpHを7.０に維持しつつ
３０時間培養した。
得られた培養液を遠心分離して菌体を集め、0.８５％の
食塩水で洗滌後再び遠心分離して集菌した。集めた菌体
のうち３５０ｇ（湿菌体重量）を５０mMのリン酸カリウ
ム緩衝液（pH7.４）に懸濁してダイナミル菌体摩砕機で
菌体を破砕し、7,０００ｒｐｍの回転数で３０分間遠心
分離した。得られた上澄にプロタミン３ｇを加え３０分
間攪拌後同様に遠心分離した。得られた上澄に、６０％
飽和になるように硫安を添加して塩析し、遠心分離をし
て沈澱を集め、これを５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH
7.４）４５０mlに溶解してこれを同じ組成の緩衝液に対
して透析した。透析残液に５０mMのリン酸カリウム緩衝
液（pH7.４）を加えて１０００mlとし、ＤＥＡＥ−セフ
ァセル（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製）を充
填したカラム（２×４２cm）に通して蛋白質を吸着させ
た後、１０mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.４）を用い、
ＮａＣｌ 0.１５Ｍから0.５Ｍの塩濃度勾配により１２
０ml／hrの溶出速度で溶出して、２２mlずつの分画に集
めた。得られた分画のうちNo.５５〜６５にＤＤＨ活性
を認めたのでこれらを集めた。かくして得られた活性画
分を限外過して濃縮し、これをセファデックスＧ−１
５０（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製）を充填
したカラム（２×４０cm）に通塔して蛋白質をこれに吸
着せしめた。次に、１０％グリセリンを含む１０mMリン
酸カリウム緩衝液（pH7.４）で３０ml／hrの溶出速度で
溶出し、６mlずつの分画に集めた。得られた分画のう
ち、No.３８〜４１にＤＤＨ活性を認めたのでこれらを
集め、これを精製ＤＤＨとしてその酵素的性質を調べ
た。
食塩水で洗滌後再び遠心分離して集菌した。集めた菌体
のうち３５０ｇ（湿菌体重量）を５０mMのリン酸カリウ
ム緩衝液（pH7.４）に懸濁してダイナミル菌体摩砕機で
菌体を破砕し、7,０００ｒｐｍの回転数で３０分間遠心
分離した。得られた上澄にプロタミン３ｇを加え３０分
間攪拌後同様に遠心分離した。得られた上澄に、６０％
飽和になるように硫安を添加して塩析し、遠心分離をし
て沈澱を集め、これを５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH
7.４）４５０mlに溶解してこれを同じ組成の緩衝液に対
して透析した。透析残液に５０mMのリン酸カリウム緩衝
液（pH7.４）を加えて１０００mlとし、ＤＥＡＥ−セフ
ァセル（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製）を充
填したカラム（２×４２cm）に通して蛋白質を吸着させ
た後、１０mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.４）を用い、
ＮａＣｌ 0.１５Ｍから0.５Ｍの塩濃度勾配により１２
０ml／hrの溶出速度で溶出して、２２mlずつの分画に集
めた。得られた分画のうちNo.５５〜６５にＤＤＨ活性
を認めたのでこれらを集めた。かくして得られた活性画
分を限外過して濃縮し、これをセファデックスＧ−１
５０（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製）を充填
したカラム（２×４０cm）に通塔して蛋白質をこれに吸
着せしめた。次に、１０％グリセリンを含む１０mMリン
酸カリウム緩衝液（pH7.４）で３０ml／hrの溶出速度で
溶出し、６mlずつの分画に集めた。得られた分画のう
ち、No.３８〜４１にＤＤＨ活性を認めたのでこれらを
集め、これを精製ＤＤＨとしてその酵素的性質を調べ
た。
その結果、得られたＤＤＨは第３表に示すような酵素的
性質を示した。
性質を示した。
本発明の効果 本発明の方法によって、ＤＤＨをコードする遺伝子を含
む組換えプラスミドを得ることができる。該プラスミド
を利用して例えばコリネ型グルタミン酸生産菌のＤＤＨ
活性を増強したり、大腸菌にＤＤＨ活性を与えたりする
ことができるので、安価に大量にＤＤＨを製造すること
ができる。また、コリネ型グルタミン酸生産菌から誘導
されるＬ−リジン生産菌あるいはメソ−α，ε−ジアミ
ノピメリン酸生産菌でのＤＤＨ活性の増強にともなうＬ
−リジンあるいはメソ−α，ε−ジアミノピメリン酸の
生成収率の向上、生成速度の向上が期待される。
む組換えプラスミドを得ることができる。該プラスミド
を利用して例えばコリネ型グルタミン酸生産菌のＤＤＨ
活性を増強したり、大腸菌にＤＤＨ活性を与えたりする
ことができるので、安価に大量にＤＤＨを製造すること
ができる。また、コリネ型グルタミン酸生産菌から誘導
されるＬ−リジン生産菌あるいはメソ−α，ε−ジアミ
ノピメリン酸生産菌でのＤＤＨ活性の増強にともなうＬ
−リジンあるいはメソ−α，ε−ジアミノピメリン酸の
生成収率の向上、生成速度の向上が期待される。
第１図はプラスミドｐＤＤ８の造成工程を示す。 第２図はｐＤＤ１０の造成工程を示す。 図中の記号は下記酵素の切断部位を示す。 Ｐ：ＰｓｔＩ Ｂ：Ｂｇ１II Ｅ：ＥｃｏＲＩ Ｈ：ＨｉｎｄIII
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (1)
- 【請求項１】コリネバクテリウム属微生物の染色体ＤＮ
Ａに由来し、制限酵素Ｂｇ１IIによる二つの切断部位、
制限酵素ＰｓｔＩおよび制限酵素ＥｃｏＲＩによる各々
一つの切断部位を有し、両端に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断
部位を有し、かつ約8.0Kbの大きさであるＤＮＡ断片ま
たはバチルス属微生物の染色体ＤＮＡに由来し、制限酵
素ＰｓｔＩによる切断部位を有し、両端に制限酵素Ｈｉ
ｎｄIII切断部位を有し、かつ約10.4Kbの大きさである
ＤＮＡ断片上に存在しており、メソーα，ε−ジアミノ
ピメリン酸脱水素酵素をコードする遺伝子を含む組換え
体プラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60129508A JPH0611230B2 (ja) | 1985-06-14 | 1985-06-14 | 新規組換え体プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60129508A JPH0611230B2 (ja) | 1985-06-14 | 1985-06-14 | 新規組換え体プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61289887A JPS61289887A (ja) | 1986-12-19 |
| JPH0611230B2 true JPH0611230B2 (ja) | 1994-02-16 |
Family
ID=15011222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60129508A Expired - Lifetime JPH0611230B2 (ja) | 1985-06-14 | 1985-06-14 | 新規組換え体プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0611230B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4035855B2 (ja) * | 1996-06-05 | 2008-01-23 | 味の素株式会社 | Ｌ−リジンの製造法 |
-
1985
- 1985-06-14 JP JP60129508A patent/JPH0611230B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61289887A (ja) | 1986-12-19 |
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