JPS63105688A - Ｌ−フエニルアラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネ
ート−７−ホスフェートシンクーゼ（以下Ｄ’Ｓと略す
）、コリスメートムターゼ（以下ＣＭと略す）およびプ
レフェネートデヒドラターゼ（以下ＰＤと略す）の合成
に関与する遺伝子（以下それぞれＤＳ遺伝子、ＣＭ遺伝
子、ＰＤ遺伝子と称すこともある）の全てを含むＤＮＡ
断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡをコリネバク
テリウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物
に保有させ、該微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−
フェニルアラニンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−フ
ェニルアラニンを採取することを特徴とするＬ−フェニ
ルアラニンの製造法に関する。従って、本発明はバイオ
インダストリーの産業分野に関し、特に医薬１食品工業
において有用なＬ−フェニルアラニンの製造分野に関す
る。

従来の技術 ］リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を用いた発酵法によるＬ−フェニルアラニン
の製造法としては、アミノ酸の栄養要求性変異やアミノ
酸のアナログに対する耐性変異あるいはそれらの変異を
併有する菌株を用いる方法が知られている〔農芸化学会
誌、５０．（１）ｐ、Ｒ７９（１９７６））。

一方、組換えＤＮＡ技術によるＬ−フェニルアラニンの
生産菌も作成されており、たとえばＤＳまたはＣＭおよ
びＰＤをコードする遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを導入
したＬ−フェニルアラニン生産菌などが知られている（
特開昭６０−２４１９２．特願昭６０−１０２１０１．
　特開昭６１−１２４３７５）。

発明が解決しようとする問題点および解決のための手段 近年、Ｌ−フェニルアラニンの需要が増大するにつれて
その製造法の改善が強く望まれている。

本発明者は、このような状況を考慮し、組換えＤＮＡ技
術を有効に活用し、すぐれたし−フェニルアラニン生産
菌を造成するため鋭意研究を重ねた。その結果、微生物
のＤＳ、ＣＭおよびＰＤの合成に関与する遺伝情報の全
てを含む組換え体ＤＮＡをコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属菌種に導入することにより、Ｌ−
フェニルアラニンの生産性が改良されることを見出し、
本発明を完成するに至った。微生物の遺伝子を含む組換
え体プラスミドＤＮＡを用いるＬ−フェニルアラニン生
産菌としては、前記のようにＤＳ遺伝子（特開昭６１−
１２４３７５＞またはＣＭ右よびＰＤ遺伝子（特開昭６
０−２４１９２．　特願昭６０−１０２１０１＞を用い
た例は知られているが、ＤＳ、ＣＭおよびＰＤ遺伝子を
併用した例は知られておらず、３種の遺伝子の増幅によ
りＬ−フェニルアラニンの生産性が一段と向上すること
は本発明により初めて見出されたものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明は、微生物の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−へプ
ッロソネート−７−ホスフェートシンターゼ、コリスメ
ートムターゼおよびプレフェネートデヒドラターゼの合
成に関与する遺伝情報の全てを含むＤＮＡ断片とベクタ
ーＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物を培
地に培養し、培養物中にＬ−フェニルアラニンを生成蓄
積させ、該培養物からＬ−フェニルアラニンを採取する
ことを特徴とするＬ−フェニルアラニンの製造法を提供
する。

該ＤＮＡ断片としては、エシェリシア属、コリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物に
由来するものがあげられる。

ＤＳ、ＣＭおよびＰＤをコードする各遺伝子の供給源と
なる微生物としては、芳香族アミノ酸の生合成において
自己栄養性の微生物であればいかなる微生物でもよい。

とりわけ、原核生物である細菌、たとえばエシェリシア
属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
に属する菌株のＤＳ、ＣＭおよびＰＤ遺伝子が望ましく
、とくにこれらの細菌から誘導された芳香族アミノ酸の
生産性変異株由来の遺伝子が好適である。

宿主微生物として用いるコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物としては、コリネ型
グルタミン酸生産菌として知られている微生物は全て用
いることができるが、好適には下記の菌株が用いられる
。

コリネバクテリウム・グルタミクム　　ＡＴＣＣ１３０
３２コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムへＴＣ
Ｃ１３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス　　八ＴＣＣ１３８
６８コリネバクテリウム・リリウム　　　　ＡＴＣＣ１
５９９０ブレビバクテリウム・ディバリカラム　ＡＴＣ
Ｃ１４０２０ブレビバクテリウム・フラブム　　　　Ａ
ＴＣＣ１４０６７ブレビバクテリウム・イマリオフィラ
ムＡＴＣＣ１４０６８プレヒハクテリウム・ラクトファ
ーメンクムＡＴＣＣ１３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス　ＡＴＣＣ１９２
４０これらの菌体から変異誘導されたＬ−フェニルアラ
ニン、Ｌ−）リプトファンまたはＬ−チロシン生産性菌
株はさらに好ましい宿主として用いることができる。こ
れら生産性変異株はアミノ酸要求性、アミノ酸アナログ
耐性あるいはこれを併有する菌株として取得することが
できる〔農芸化学会誌、ｌ旦、　（１）ｐ、Ｒ，７９（
１９７６））。

Ｌ−）リプトファンまたはＬ−チロシン生産性微生物を
宿主としたときは、Ｌ−）！ＪブトファンまたはＬ−チ
ロシンの生産がＬ−フェニルアラニンの生産に転換され
、Ｌ−フェニルアラニンを著量蓄積する菌株を得ること
ができる。Ｌ−トリプトファンまたはＬ−チロシン生産
菌に該組換え体ＤＮＡを導入することにより、著量のＬ
−フェニルアラニンが生産できることは本発明により初
めて見出されたものである。

該ＤＮＡを組み込むためのベクターとしては、コリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種中で自律
複製できるものであれば特に限定されないが、例えばｐ
ｃＧｌ　（特開昭５７−１３４５００）　。

ｐＣＧ２　（特開昭５８−３５１９７）、　　ｐＣＧ４
．　ｐｃＧｌｌ（いずれも特開昭５７−１８３７９９）
、　ｐｃＢ５４．ｐ（、Ｂ１０１　（いずれも特開昭５
８−１０５９９９）、　ｐｃＥ５１（特開昭６Ｏ−３４
１９７）およびｐＣＢ５２．　ｆｌｃＢ５３　Ｃいずれ
もモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクｘ
　（Ｍｏｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）１９６、　１７５
　（１９８４）　〕などのププラストを使用することが
できる。

ＤＳをコードする遺伝子を含む供与体ＤＮＡとベクター
ＤＮＡとの組換え体ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮＡを制
限酵素で切断した後、ＤＮＡ！Ｊガーゼで処理するか、
またはその切断末端をターミナルトランスフェラーゼや
ＤＮＡポリメラーゼなどで処理した後、ＤＮＡ　リガー
ゼを作用させて結合する常法〔メソッヅ・イン・エンチ
モロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）旦（１９７９）　：］により種々の組換え体混成物
とともに生成させることができる。この混成物を用いて
、ＤＳをコードする遺伝子の欠失したコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属の変異株を形質転換し
、欠損形質が相補された形質転換株を選択し、この形質
転換株の有するプラスミドを単離することによってＤＳ
をコードする遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを取得できる
。コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属微
生物の形質転換法としては、特開昭５７−１８６４９２
および特開昭５７−１８６４８９に開示されたプロトプ
ラストを用いる方法により実施することかできる。

同様にして、ＣＭおよびＰＤをコードする各遺伝子を含
む供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを
得ることができる（特開昭６Ｏ−２４１９２）。

すなわち、染色体ＤＮＡとベクターＤＮＡの組換え体混
成物を用いて、コリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属のＣＭおよびＰＤの両遺伝子が欠損したフェ
ニルアラニンおよびチロシン要求性変異株を形質転換し
、フェニルアラニンおよびチロシン非要求性となった形
質転換株からＣＭおよびＰＤをコードする各遺伝子を含
む組換え体ＤＮＡを取得できる。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌株
で直接組換え体ＤＮＡを選択する代わりに、例えば大腸
菌のように既に遺伝子組換え技術が確立している宿主−
ベクター系を用いることもできる。すなわち、供与体Ｄ
ＮＡとベクターＤＮＡの試験管内結合反応物を用いＤＳ
またはＣＭおよびＰＤをコードする遺伝子が欠損した大
腸菌の変異株を形質転換し、欠損形質が相補された形質
転換株を選択する。この形質転換株からクローン化した
ＤＮＡとコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属微生物のベクターＤＮＡとを取り出し、これを試験
管内で制限酵素で切断した後、ＤＮＡ！Ｊガーゼで再結
合反応させる。この反応物を用いてＤＳまたはＣＭおよ
びＰＤをコードする遺伝子の欠損したコリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属の変異株を形質転換し
、欠損形質が相補された形質転換株を選択する。この手
段によっても同様に目的の組換え体ＤＮＡを取得できる
（特願昭６Ｏ−１０２１０１）。

以上のようにして取得したＤＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片
とＣＭおよびＰＤ両遺伝子を含むＤＮＡ断片とをさらに
組み換えて３種の遺伝子を同時に含む組換え体ＤＮＡを
得ることができる。この組換え体ＤＮＡを宿主微生物に
導入することにより、３種の遺伝子を増幅することがで
きる。細胞内で共存できる別個のベクターＤＮＡに各々
の遺伝子を組み換え、それらの組換え体ＤＮＡを宿主微
生物に共有させても３種の遺伝子を増幅でき、同様なＬ
−フェニルアラニンを著量蓄積する菌株を得ることがで
きる。

上記の工程において、エシェリシア属、コリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属菌種の野生株の染色
体ＤＮＡを供与源とした場合には、野生型のＤＳ、ＣＭ
およびＰＤの各遺伝子を含む組換え体ＤＮＡとしてコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属微生物に
導入できる。しかしながら、コリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属菌種において、ＤＳおよびＣＭ
はフェニルアラニンおよびチロシンでフィードバック阻
害を受け、またＰＤはフェニルアラニンでフィードバッ
ク阻害を受けることが知られている〔アグリカルチュラ
ル・アンドやバイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉ
ｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　　３９　、３５１（１９
７５）　）。従って、この阻害から解除された変異型の
ＤＳ、ＣＭおよびＰＤをコードする遺伝子を有する組換
え体ＤＮＡを用いる方が、コリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に高いＬ−フェニルアラニン生産
能を付与できるので好ま１ま しい。変異型のＤＳ、ＣＭおよびＰＤ遺伝子を導入する
には、所望の変異を受けたＤＳ、ＣＭおよびＰＤ遺伝子
を有するエシェリシア属、コリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属の変異株の染色体ＤＮＡを供与源
として、野生型のＤＳ。

ＣＭおよびＰＤ遺伝子を得たのと同様な方法で組換え体
プラスミドを作製することにより果たされる。あるいは
上記変異株の染色体ＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換え
体プラスミドを用いて、野生型のＤＳ、ＣＭおよびＰＤ
を有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属菌種を形質転換し、フェニルアラニンのアナログ、
例えばパラ−フルオロフェニルアラニン（以下、ＰＦＰ
と略す）に耐性となった形質転換株を選択し、この形質
転換株の有するプラスミドを単離することによっても、
変異型のＤＳ、ＣＭまたはＰＤ遺伝子を含む組換え体プ
ラスミドを取得できる。あるいは野生型遺伝子を含む組
換え体プラスミドを保有する微生物を常法通り変異処理
し、フェニルアラニンアナログ耐性を付与するか、組換
え体プラスミドＤＮＡを例えばヒドロキシルアミン処理
によりｉｎ　ｖｉｔｒｏで変異を誘起し形質転換して変
異型のＤＳ、Ｃ・ＭおよびＰＤ遺伝子の全てを含む組換
え体プラスミドを作成し、これを使用することもできる
。野生型または変異型のＤＳ、ＣＭおよびＰＤ遺伝子の
全てを同時に含む組換え体プラスミドは、前記のような
プロトプラストを用いる形質転換法によりコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属微生物に導入でき
る。

これらの組換え体プラスミド保有株によるＬ−フェニル
アラニンの生産は、従来の発酵法によるアミノ酸の製造
に用いられる培養方法により行うことができる。すなわ
ち、該形質転換株を炭素源。

窒素源、無機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通
常の培地中、好気的条件下、温度、ｐＨなどを調節しつ
つ培養を行えば、培養物中にＬ−フェニルアラニンが生
成蓄積するのでこれを採取する。

炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シニークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
＃粉加水分解液、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコール
、ピルビン酸、フマール酸。

乳酸、酢酸などの各種有機酸が使用できる。さらに微生
物の資化性によって、炭化水素、アルコール類なども用
いられる。特に廃糖蜜は好適に用いられる。

窒素源としてはアンモニアまたは塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
などの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは尿
素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ−ア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカ
ー、カゼイン加水分解物、フィツシュミールまたはその
消化物。

踊加水分解物などの窒素含有有機物など種々のものが使
用可能である。

さらに無機物としては、リン酸第−水素カリウム、リン
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム。

塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム
、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなど
を使用する。微生物の生育に必要とするビタミン、アミ
ノ酸源などは、前記したような他の培地成分によって培
地に供給されれば特に加えなくてもよい。

培養は振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下
に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である。

培地のｐＨは中性付近に維持することが望ましい。培養
期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−フェニルアラニン
が蓄積する。培養終了後、菌体を除去して活性炭処理、
イオン交換樹脂処理などの公知の方法で培養液からＬ−
フェニルアラニンを回収する。

このようにしてＤＳ、ＣＭおよびＰＤ遺伝子の全てを含
む組換え体ＤＮＡを保有させたコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属菌株を用いることにより、高
い収率でＬ−フェニルアラニンを生産することができる
。

本明細書では、コリネバクテリウム・グルタミクムにＤ
Ｓ、ＣＭおよびＰＤ遺伝子の全てを含む組換え体ＤＮＡ
を導入し、Ｌ−フェニルアラニンの生産性の向上につい
て例示したが、代わりに他のコリネ型グルタミン酸生産
菌を用いても目的は達成される。

グルタミン酸高生産能を有するいわゆるコリネ型グルタ
ミン酸生産菌は、主な菌学的性質を同じくしているにも
かかわらず、産業上の重要性から、各研究者により、種
々の菌名が付されており、属名までも、コリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属など種々である。し
かしながら、これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成や
ＤＮＡの塩基組成か画一的であることから、同一の菌種
であることが指摘されていた。さらに、最近、これらの
菌種間には、７０〜８０％以上のＤＮＡの相同性がある
ことが明らかにされ、非常に近縁な微生物であることが
明白である〔コマツ　ワイ（Ｋｏｍａｔｓｕ　Ｙ、）ニ
レポート　オンザファーメンテイティブ　リサーチイン
スティチュート（Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆｔｈｅ　Ｆｅｒｍ
ｅｎｔａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕ
ｔｅ）、　Ｎｏ、５５゜１　、　（１９８０）およびス
ズキケイ０．カネコティ、、コマガタ　ケイ　（Ｓｕｚ
ｕｋｉ、　　Ｋ、、　　Ｋａｎｅｋｏ、　　Ｔ、、　　
ａｎｄＫｏｍａｇａｔａ、　Ｋ、）　：インターナショ
ナルジャーナルオンシステマティックバクテリオロジイ
（Ｉｎｔ。

Ｊ、５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、　３１．　
１３１　（１９８１）参照〕。

上記の事実を踏まえればコリネ型グルタミン酸生産菌全
般での効果が容易に類推される。その効果の有無は組換
え体ＤＮＡがコリネ型グルタミン酸生産菌全般で自律的
に複製し、ＤＳ、ＣＭおよびＰＤ遺伝子が形質発現でき
るか否かに係わり、コリネ型グルタミン酸生産菌間のＤ
ＮＡ相同性などにおける若干の相違は何ら関係ない。し
かるにこれらの菌種がプラスミドの複製と遺伝子発現に
係わる機能を等しく保持していることは、特開昭５７−
１８３７９９に開示したコリネバクテリウム・グルタミ
クム２２５−２５０株から分離され、スペクチノマイシ
ンおよび／またはストレプトマイシン耐性遺伝子を有す
るプラスミドｐＣＧ４がコリネバクテリウム属およびブ
レビバクテリウム属菌種などコリネ型グルタミン酸生産
菌内で同じく複製でき、またその耐性遺伝子が発現され
る（特開昭５７−１８６４９２）　　ことから明らかで
ある。従って、本発明のＤＳ、ＣＭおよびＰＤ遺伝子の
全てを含む組換え体ＤＮＡを導入することによるＬ−フ
ェニルアラニン生産菌の作製法を適用し得る菌種は、コ
リネバクテリウム・グルタミクムに限らずコリネバクテ
リウム属およびブレビバクテリウム属菌種を含むコリネ
型グルタミン酸生産菌全てが含まれる。

以下に本発明の実施例および参考例を示す。

実施例１ エシェリシア・コリに−１２のＤＳ、ＣＭおよびＰＤ遺
伝子の全てを含む組換え体プラスミドを保有する菌株に
よるフェニルアラニンの生産（１）エシェリシア・コリ
ＪＡ１９４株の染色体ＤＮＡ、プラスミドｐＰＨＢＡ１
およびベクターｐＢＲ３２２と、ｐｃＥｉ５１の調製 エシェリシア・コリに一１２株亜株ＪＡ１９４〔プロシ
ーディング・オン・ザ・ナショナル・アカデミイ・オン
・サイエンｙ、　（Ｐｒ、ｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
。

Ｓｃｉ、）、９４．４８７−４９１（１９７７））の染
色体ＤＮＡを以下の方法で調製した。

４００＋ｎｊ！のＬ−ｂｒｏｔｈ培地（バンド・トリフ
トン１０ｇ、バンド・イースト・エキス５ｇ、ＮａＣ１
５ｇを水１１に含み、Ｉ）８７．０に副整した培地、以
下ＬＢ培地と称す）に種培養２０ｍ１を接種して、３７
℃で振盪培養し、対数後期まで生育させた。培養液から
菌体を集菌し、集菌した菌体から斎藤らの方法〔バイオ
キミカ・工・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、八ｃｔａ）、　７２　。

６１９　　（１９６３）　）に従って高分子染色体ＤＮ
Ａを単離した。

プラスミドｐＰＨＥＡ１は本発明者が先に開発（特願昭
６Ｏ−１０２１０１）　したプラスミドで、エシェリシ
ア・コリのＣＭおよびＰＤ遺伝子ｐｈｅＡを含むＢｃｏ
ＲＩ　−３〕ｍＨＩ切断ＤＮＡ断片をエシェリシア・コ
リのプラスミドｐＢＲ３２２のＢｃｏＲＩ　−ＢａｍＨ
Ｉ切断部位に挿入させたプラスミドである（取得方法は
参考例に示す）。

ベクターとして用いるｐｃＢ５１　（特開昭５８１４２
８０４）は、コリネバクテリウム・グルタミクムのプラ
スミドｐｃＧ１　（特開昭５７−１３４５００）とエシ
ェリシア・コリのプラスミドルＧへ２２〔ジャーナル・
オン・バクテリオロジイ（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）
　　１４０．４００（１９７９）　）を連結させたプラ
スミドである。

ｐＰＨＥＡｌ、　ｐＢＲ３２２およびｐｃＢ５１は各々
を保有するエシェリシア・コ’Ｊ　ＪＡ１９４株の培養
菌体から次の方法で単離した。

ｐＰＩＩＢＡｌまたはｐＢＲ３２２の保有株はアンピシ
リン１００μｇ／ｍβ、　ｐｃＢ５１の保有株はカナマ
イシン２０μｇ／ｍＡを含む４００ｍｊｌ！ＬＢ培地に
それぞれの種培養２Ｏｎ＋ｊ！を接種し、６６０ｎｍに
おける吸光度（ＯＤ）（以下特記しないかぎり吸光度は
６６０ｎｍで測定）が約０．７になるまで生育させた。

菌体を集菌しＴＥＳ緩衝液（０，０，３Ｍ）’Ｊス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと略す”）
　、０．００５　Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウ
ム（以下ＢＤＴＡと略す）　、０．０５Ｍ　ＮａＣｊ！
、ｐＨ８，０〕で洗浄後、リゾチーム溶液（２５％ショ
糖、０、０５　Ｍ　）リス、０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣｊ！
、０．８ｍｇ／ｍβリゾチーム、ｐＨ８，０）１０　ｍ
ｌに懸濁し、３７℃で１時間反応させた。反応液に５　
Ｍ　ＮａＣＲ２，４ｍ　ｌ、０、５　Ｍ、　ＢＤＴＡ　
（＋）Ｈ８，５）　０．６　ｍｌｌ、　４％ラウリル硫
酸ナトリウムと０．７　Ｍ　ＮａＣｊ！からなる溶液４
．４ｍｊ！を順次添加し、緩やかに混和してから氷水上
に１５時間装いた。溶菌物を遠心管に移し、４℃で６０
分間６９．４００　Ｘ　ｇの遠心分離にかけ上澄液を回
収した。これに重量百分率１０％相当のポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）　６，０００（半井化学薬品社製）
を加え、静かに混和して溶解後、氷水上に置いた。１０
時間後、１，５００Ｘｇで１０分間遠心分離してペレッ
トを回収した。ＴＥＳ緩衝液５ｍｊ２を加えてペレット
を静かに再溶解してから１．５　ｍｇ／ｍｌエチジウム
ブロマイド２．Ｑｍｊ２を添加し、これに塩化セシウム
を加えて静かに溶解し、密度を１．５８０に合わせた。

この溶液を１８℃で１０５．０００Ｘｇ、４８時間超遠
心分離にかけ、紫外線照射下に検知される遠心チューブ
下方の密度の高い位置のバンドを遠心チューブの側面か
ら注射器で抜きとることによって、ｐＰＩＩＢＡｌ、　
ｐＢＲ３２２およびｐｃＢ５１プラスミドＤＮＡをそれ
ぞれ分離した。この分画液を等容量のイソプロピルアル
コール液〔容量百分率９０％イソプロピルアルコール、
１０％ＴＢＳ緩衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化セ
シウムを含む）〕で５回処理してエチジウムブロマイド
を抽出除去し、しかる後にＴＢＳ緩衝液に対して透析し
た。

（２）　　ａ　ｒ　ｏ　Ｇ遺伝子のクローニング上記（
１）で調製したプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ　３　Ｊ
ｌｇを含む制限酵素旧ｎｄＩ［Ｉ反応液（トリス１０ｍ
Ｍ。

Ｍｇ１２６ｍＭ、　ＮａＣｊ！　５０ｍＭ、　ｐＨ７，
５）　１００　μＲに５単位の旧ｎｃｌｌｌＩ（宝酒造
社製）を、またエシェリシア・コ’Ｊ　ＪＡ１９４株の
染色体ＤＮＡ３μｇを含む制限酵素旧ｎｄｌｌＩ反応液
１００μβに５単位のＨｉｎｃｌＩＩＩを加え、それぞ
れ３７℃で６０分間反応させた。両反応液に２ＭＮａＣ
βを５μｌおよび５単位のＳａｊ！Ｉ（宝酒造社製）を
加え、３７℃でさらに６０分間反応させた。反応後、６
５℃で１０分間加熱して反応を停止させた。両反応液を
混合後、この混合物にＴ４リガーゼ用緩衝液（トリス６
６０ｍＭ。

Ｍｇ１２６６ｍＭ、　　ジチオスレイトール１００ｍＭ
。

ｐＨ７，５）４０ｔ−ｔＬ　ＡＴＰ（５ｍＭ）４０ｔ−
ｔＬＴ４リガーゼ（宝酒造社製、１単位／μβ）１μβ
および水１１０μｌを加え、１２℃で１６時間反応させ
た。

このリガーゼ反応混合物を形質転換に供する。

形質転換に供する受容菌として、ＤＳをコードする遺伝
子を欠損したエシェリシア・コリＡ３３２４８株（ａｒ
ｏＦ３６３．　ａｒｏＧ３６５．　ａｒｏＨ３６７、、
ｔｈｉ、ｈｉｓ、ｐｒｏ、ａｒｇ。

ｉｌｖ、Ｔ６ｒ、　Ｆ−）　　（ジャーナル・オン・バ
タテリオロジイ（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　９３
　、２３７　（１９６７）　：］（ＦＯＲＭ　ＢＰ−８
６５）を用いた。本閑の一夜培養液を、ＬＢ培地に植菌
し、Ｍ、、ＤａｇｅｒＪらの方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）
、、　　６　、２３　　（１９７９）　）に従って、コ
ンピテントな細胞を調製した。

コンピテントな細胞１０９／ｍｊ２を含む液０．．２ｍ
Ａにリガーゼ反応混合物５０μｌを加え、水冷下１０分
間放置した。次いで３７℃で５分間熱処理した後、ＬＢ
培地２ｍｌを加え、３７℃で９０〜１２０分間静置した
。その後、菌体を生理食塩水で２回遠心洗浄後、各々５
０μｍ／ｍ１のヒスチジン、フロリン、アルギニン、イ
ソロイシン、バリンを含むＭ９平板培地（グルコース２
　ｇ　、　ＮＨ４Ｃｌ１　ｇ、　Ｎａ２ＨＰＯ４６ｇｔ
　ＫＨ２ＰＯ４３ｇｏ　Ｍｇ５Ｌ’　　７）＋２００．
１　ｇ、　ｃａｃＡｚ・２ＬＤ　１５ｍｇ−サイアミン
塩酸塩４ｍｇおよび寒天１５ｇを水１１に含み、ｐＨ７
，２に調整した培地）に塗布した。Ｍ９平板培地に生育
したコロニーを各々アンピシリン１００μｇ　／　ｍｊ
！　＋テトラサイクリン２０μｇ／ｍ１を含むＬＢ平板
培地に塗布し、アンピシリン含有培地で生育し、テトラ
サイクリン含有培地で生育しないコロニーを選択した。

このようにして選択したヒスチジン、プロリン。

アルギニン、イソロイシン、バリンを含むＭ９平板培地
で生育し、アンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性
の形質転換株より（１）と同様な方法で、プラスミドＤ
ＮＡを単離した。形質転換株の一株から得たプラスミド
ｐＡＲＯＧ１を各種制限酵素で消化後、アガロースゲル
電気泳動で解析した結果、ｐＢＲ３２２の旧ｎｄＩＩＩ
と５ａＡＩの間の領域に約６キロベース（以下Ｋｔｌと
略す）の旧ｎｄＩＩ［−３ａｊ！Ｉ切断ＤＮＡ断片が挿
入されたプラスミドであることが判明した。

さらに、このＨｉｎｄｎＩ−８ａｊ！　Ｉ切断ＤＮＡ断
片は、Ｗ、　Ｄ、　Ｄａｙｉｅｓらの報告している〔ヌ
クレイツク・アシッヅ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｃ
ｌｓ　ｌｅｓ、）旦、　４０４５（１９８２）　）　ａ
ｒｏＧ遺伝子と同一の制限酵素切断点を有しており（第
１図参照）、またｐＡＲＯＧｌを有するエシェリシア・
コリＡ３３２４８株はフェニルアラニン５００μｇ、／
ｒｎｌを含むＭ９平板培地でその生育がほぼ完全に阻害
されたことから、ｐＡＲＯＧｌに挿入されている約６Ｋ
ｌ］のＤＮＡ断片上にはエシェリシア・コリのａｒｏＧ
遺伝子が存在することが判明した。

（３）　　ａ　ｒｏ　ＧおよびｐｈｅＡ遺伝子をあわせ
持つ組換え体プラスミドの作成 ｐＡＲＯＧｌよりａｒｏＧ遺伝子部分のＤＮＡ断片を、
一方ｐＰＨＢＡ１よりｐｈｅＡ遺伝子部分のＤＮＡ断片
を取得し、両ＤＮＡ断片をｐｃＢ５１に連結する。

ｐＡＲＯＧ１プラスミドＤＮＡ３μｇを含む反応液（ト
リス１０ｍＭ、、　ＭｇＣＬ　　５ｍＭ、、　Ｎａｉ　
１００ｍＭ。

ｐＨ７，５）１００μＡに各５単位のＢｇ　Ｉ！ｎ、、
ｕｐａ　Ｉ（宝酒造社製）を、またｐＰＨＢ＾１プラス
ミドＤＮＡ３μｇを含む反応液（トリス１０ｍＭ、、　
ＭｇＣｊ！２６ｍＭ。

ＮａＣｊ！　１００ｍＭ、ｐＨ７，５）　１００１Ｕｅ
に各５単位のＳｃａ　１．、　Ｂａｍ１（Ｉ　（全酒造
社製）を加え、３７℃で６０分間反応させた。一方、ｐ
ｃＢ５１プラスミドＤＮＡ３μｇを含む反応液（トリス
１０ｍＭ、、　ＭｇＣｊ！２６ｍＭ、、　ＮａＣｊ！　
１００ｍＭ、、　Ｊ］Ｈ７，５）　１００μｊ２に５単
位のＥｃｏＲＶ　（全酒造社製）を加え、３７℃で６０
分間反応させた。反応後、いずれも６５℃で１０分間加
温して反応を停止させた。３種の反応液を混合し、Ｔ　
４１Ｊガーゼ用緩衝液４０μβ、Δ１゛Ｐ（５ｍＭ）　
　４０μβ、　Ｔ４リガーゼく全酒造社製。

１単位／μＡ）１μｌおよび水２０μｍを加え、１２℃
で１６時間反応させた。このリガーゼ反応混合物を用い
てエシェリシア・コリ八８５２４８株を（２）と同様な
方法で形質転換し、菌体を生理食塩水で２回遠心洗浄後
、各々５０μｇ／ｍ＋ｆｌのヒスチジン、フロリン、ア
ルギニン、イソロイシン、バリンを含むＭ９平板培地に
塗布した。Ｍ９平板培地に生育したコロニーをかき集め
、（１）と同様な方法でプラスミドＤＮＡを単離した。

さらに、単離したプラスミドＤＮＡを用いて、ｐｈｅ八
遺へ子を欠損したエシェリシア・コリＧ５２４５株　（
ｐｈｅＡ９０５．ａｒａＤ１３９．　　△　ＲａｃｌＪ
１６９．　　ΔｇｌｙＡ、５ｔｒＡ。

ｔｈｉ）　（ジー７　（Ｇｅｎｅ）、ユ４　、　６３　
　（１９８１）　）を（２）と同様な方法で形質転換し
た。５０μｇ／ｍｊ２のグリシンを含むＭ９平板培地に
生育したコロニーから、カナマイシン２０μｇ／ｍ１を
含有するＬＢ平板培地で生育するコロニーを選択した。

このようにして得た形質転換株より、（１）と同様な方
法でプラスミドＤＮＡを単離した。形質転換株の１株か
ら得たプラスミドｐＥａｒｏＧ　−ｐｈｅＡｌを各種制
限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動で解析した結
果、ｐｃｌＥ５１のＥｃｏＲＶ切断部位に約２．８Ｋｂ
のａｒｏＧ遺伝子を含むＢｇｌ　■−Ｈｐａ　Ｉ　　切
断ＤＮＡ断片および約２．５Ｋｂのｐｈｅ層責伝子を含
むＳｃａ　■−３ａｍＨＩ切断ＤＮＡ断片が挿入された
プラスミドであることが判明した（第１図参照）。

（４）　　ａ　ｒ　ｏ　Ｇ遺伝子にコードされるＤＳが
フェニルアラニンによる阻害から解除された変異プラス
ミドｐＥａｒｏＧ　−ｐｈｅＡ２の取得 （３）で得られたｐＥａｒｏＧ　−ｐｈｅＡｌを保有す
るエシェリシア・コリ八Ｂ５２４８株を、カナマイシン
２０μ８／ＩＴｌｌを含むＬＢ培地で対数増殖の後期ま
で増殖させた。菌体を５０ｍＭ）！Ｊス・マレイン酸緩
衝液（２０ｍＭ）リス、５ＱｍＭマレイン酸、　　ｐＨ
６，０）で２回遠心洗浄後、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン２００μｇ／ｍβを含む５０
ｍＭ）リス・マレイン酸緩衝液（ｐＨ６，０）中で、室
温で３０分間処理した。処理菌体を５０ｍＭ）！Ｊス・
マレイン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で２回遠心洗浄後、洗
浄菌体をカナマイシン２０μｇ／ｍβを含むＬＢ培地中
、３０℃で１６時間培養し、（１）と同様な方法でプラ
スミドＤＮＡを単離した。

単離したプラスミドを用い、エシェリシア・コＩＪ　Ａ
Ｂ３２４８株を（２）と同様な方法で形質転換した。形
質転換株の選択は、フェニルアラニン６ｍｇ／ｍβ。

ヒスチジン、プロリン、アルギニン、イソロイシン、バ
リンを各々５０μｇ／ｍβ含むＭ９平板培地上で行った
。出現したコロニーから、フェニルアラニン６ｍｇ／ｍ
β、ヒスチジン、プロリン、アルギニン、イソロイシン
、バリン各々５０μｇ／ｍｊ２を含むＭ９平板培地およ
びカナマイシン２０μｇ／＋ｍｌを含むＬＢ平板培地上
で生育できるコロニーを選択した。

このようにして得た形質転換株から単離したプラスミド
はエシェリシア・コリ八８３２４８株１ごフェニルアラ
ニン耐性を与えることができる。その−株から単離した
プラスミドをｐＥａｒｏＧ−ｐＨｅＡ２と命名した。

（５）　　ｐＢａｒｏＧ　−ｐｈｅ八２へ１こよるコリ
ネバクテリウム・グルタミクムの形質転換およびｐｈｅ
Ａ遺伝子にコードされるＣＭおよびＰＤがフェニルアラ
ニンによる阻害から解除された変異プラスミドｐ［Ｅａ
ｒｏＧ　−ｐｈｅＡ３の取得 コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３９Ｑ１９
（＾ＴＣＣ３１８３３から誘導したりゾチーム感受性変
異を有する菌株）の種培養４ｍ、ＣをＮＢ培地（粉末ブ
イヨン２０ｇ、酵母エキス５ｇを水１βに含み、ｐＨ７
，２に調整した培地）４０ｍβに植菌し、３０℃で振盪
培養した。○Ｄが０．６になった時点で集菌し、該細胞
をＲＣＧＰ培地〔グルコース５ｇ、カザミノ酸５ｇ、酵
母エキス２．５　ｇ、に２１＋ｐｏ４３．５　ｇ　。

ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ　、　Ｍｇｃβ２　・６Ｈ２００
，４１ｇ　、　Ｐｅ５ｏｓ・７Ｈ２０１０ｍｇ、　Ｍｎ
ＳＯ４１４−４−６ｆｔ２０２．　Ｚｎ５Ｏｎ・７Ｈ２
００，９ｍｇ、　（ＮＨ４）８ＭＯ７０２４・４）１２
００．０４　ｍｇ。

ビオチン３０μｇ、サイアミン塩酸塩２　ｍｇ　＋コハ
ク酸二ナトリウム１３５ｇ、ポリビニルピロリドン（分
子量１０，０００）　３０　ｇを水１βに含む培地〕に
１ｍｇ／ｍ、ｉ！のりゾチームを含む溶液（ｐＨ７，６
）１０ｍｊｌ！に約１０９細胞／ｍｊ！となるように懸
濁し、Ｌ型試験管に移して３０℃で５時間緩やかに振盪
反応してプロトプラスト化した。

このプロトプラスト菌液０．５ｍｌを小試験管にとり、
２．５００　Ｘ　ｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭＣ緩衝
液（ＭｇＣＣ１０ｍＭ、　ＣａＣｊ！２３０ｍＭ、　）
リス５０ｍＭ。

ショ糖４００ｍＭ、ｐＨ７，５）　１　ｍｊ！に再懸濁
して遠心洗浄後、ＴＳＭＣｔｔｉ液Ｑ、１ｍ、ｉ！に再
懸濁した。この菌液に２倍高濃度のＴＳＭＣ緩衝液と上
記ｐＥａｒｏＧ　−ｐｈｅＡ２　ＤＮＡ溶液の１対Ｎ混
合液１００μｐを加えて混和し、次いでＴＳＭＣ緩衝液
中に２０％ＰＥＧ６、０００を含む液０．８ｍｌを添加
して混合した。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２）　
　２ｍｌを添加し、２．５００×ｇで５分間遠心分離に
かけて上澄液を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍ
ｌのＲＣＧＰ培地に懸濁してから、０．２ｍｌをカナマ
イシン２００μ已／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地（ＲＣ
ＧＰ培地に１．４％寒天を含む培地、ｐＨ７，２）に塗
布し、３０℃で７日間培養した。

カナマイシン耐性の形質転換株の培養菌体から（１）と
同様な方法でプラスミドＤＮＡを単離した。

形質転換株の一株から得られたプラスミドの各種制限酵
素での切断解析により、ｐＢａｒｏＧ−ｐｈｅＡ２と同
一のプラスミドであることを確認した。

次に、ｐＢａｒｏＧ　−ｐｈｅＡ２を保有するコリネバ
クテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３９０１９をカナマ
イシン１０μｇ／ｍＩｌを含むＮＢ培地で対数増殖の後
期まで増殖させた。菌体を（４）と同様な方法により変
異処理し、該菌体から（１）と同様な方法でプラスミド
ＤＮＡを単離した。

単離したプラスミドを用い、コリネバクテリウム・グル
タミクムＡＴＣＣ３９０１９を前記と同様な方法で形質
転換した。カナマ・イシン２００μｇ、／１ｒｊ２を含
むＲＣＧＰ寒天培地上に生育したカナマイシン耐性コロ
ニーをかき集め、生理食塩水で２回遠心洗浄後、生理食
塩水１ｒｎｆｌに懸濁した。この菌液をＰＰＰ２０００
ｎｇ　／　ｍｊ？およびカナマイシン１０μｇ／ｍ１を
含有する最少寒天培地Ｍ１．（グルコース１０　ｇ、　
（Ｎ１１ｎ）ＩＩ２ＰＯ４１，ｇ、　ＫＣ＋！　　０．
２　ｇ。

Ｍｇ５Ｏ＜　ｌ　７Ｈ２００，２ｇ、　Ｐｅ５ｏ４・７
）１２０１０ｍｇ。

ＭｎＳＯ２・４〜６ｔｌＪ　０．２ｍｇ、　Ｚｎ５Ｏａ
　１７ｔ１２００．９ｍｇ。

ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，，４ｍｇ、　Ｎａ２１３４ｏ
７４ｏＨ２ｏ　　Ｏ，，０９ｍＬ（ｕｌＩ４）６ＭＯＴ
ｏ２４　・４１（２００，，０４ｍｇ、ビオチン５０■
。

ｐ−アミノ安息香酸２，５ｍｇ、サイアミン塩酸塩１ｍ
ｇ。

寒天１６ｇを水１１中に含み、ｐＨ７，２に調整した培
地〕上に再塗布して３０℃で５日間培養し、ＰＰＰおよ
びカナマイシンに耐性となった形質転換株を選択した。

その−株から分離したプラスミドをｐＨ！ａｒｏＧ　−
ｐｈｅＡ３　と命名した。

コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３９０１９
右よびｐＢａ、ｒｏＧ　−ｐｔ１ｅＡ３を保有する形質
転換株について、ＤＳ、ＣＭおよびＰＤ活性を測定した
。なお、ＤＳ活性の測定は、Ｐ、　Ｒ，５ｐｒｉｎａｖ
ａｓａｎとり、、Ｂ。

５ｐｒｉｎｓｏｎらの方法〔ジャーナル・オン・バイオ
ロジカル＝ケミストリー　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ
、　）、　２３４　。

７１６　（１９５９）　）に、また、ＣＭおよびＰＤ活
性の測定は、Ｒ，Ｇ、ＨｏＣｏｔｔｏｎとｌ？、Ｑｉｂ
ｓｏｎらの方法〔バイオキミカ・工・バイオフィジカ・
アクタ（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔ
ａ　）、　１００　、７６　　（１９６５）　）に従っ
た。

コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３９０］、
９のＤＳ、ＣＭおよびＰＤ活性をそれぞれ１としたとき
のｐＢａｒｏＧ−ｐｈｅＡ３を保有する形質転換株のＤ
Ｓ、ＣＭおよびＰＤの相対活性を第１表に示す。

また、ｐＢａｒｏＧ　−ｐｈｅＡｌ、　ｐＢａｒｏＧ　
−ｐｈｅ八２へた（まｐＥａｒｏＧ　−ｐｈｅ八３へ保
有する各形質転換株について、反応液にフェニルアラニ
ンを１００ｍＭ添加した時のＤＳ、ＣＭおよびＰＤ活性
を測定した。無添加時をそれぞれ１００としたときの相
対活性を第２表に示す。、 第１表 菌　　　　　　株　　　　　　　　　ＤＳ　　　　ＣＭ
　　　　ＰＤ＾ＴＣＣ３９０１９ コリネバクテリウム・グルタミクム　１６．０　　　ｇ
、９　　　Ｂ、２ＡＴＣＣ３９０１９／　ｐＥａｒｏＧ
　−ｐｈｅＡ３第　　　　　２　　　　　表 菌　　　　　　株　　　　　　　　　ＤＳ　　　　ＣＭ
　　　　ＰＤＡＴＣＣ３９０１９／ｐ［！ａｒｏＧ　−
ｐｈｅ八１へ　　コリネバクテリウム・グルタミクム　
　７４　６６　　７ＡＴＣＣ３９０１９／　ＩＩＢａｒ
ｏＧ　−ｐｈｅＡ２コリネバクテリウム・グルタミクム
　　７４　　８９　　８１ＡＴＣＣ３９０１９／　ＩＩ
ＥａｒｏＧ　−ｐｈｅＡ３（６）　　ｐＢａｒｏＧ−ｐ
ｈｅＡ３を保有する菌株によるフェニルアラニンの生産 フェニルアラニン生産性菌株コリネバクテリウム・グル
タミクムＫ　３８　（ＦＢＲＭ　ＢＰ−４５４）　（Ｐ
　Ｆ　Ｐおよびパラ−アミノフェニルアラニンの耐性形
質を有している〕、トリプトファン生産性菌株コリネバ
クテリウム・グルタミクムに−５５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−
８６４）　［フェニルアラニンおよびチロシン要求性で
、５−メチルトリプトファン、　トリプトファンハイド
ロキサメート、６−フルオロトリプトファン。

４−メチルトリプトファン、ＰＰＰ、パラ−アミノフェ
ニルアラニン、チロシンハイドロキサメートおよびフェ
ニルアラニンハイドロキサメートの耐性形質を有してい
る〕およびチロシン生産性菌株コリネバクテリウム・グ
ルタミクムに４３（ＦＥ！ＲＭＢＰ−４５７）　［：３
−アミノチロシン、パラ−アミノフェニルアラニン、Ｐ
ＰＰおよびチロシンハイドロキサメートの耐性形質を有
している〕をｐＥａｒｏＧ　−ｐｈｅＡ３を用いて形質
転換した。

形質転換には次のようにして調製されるプロトプラスト
を用いた。Ｋ、３８．に−５５およびに／１３株の種培
養４ｍＡをフェニルアラニンおよびチロシン各１００μ
ｇ、、７ｍｆｌを含む半合成培地ＳＳＭ〔グルコース２
０　ｇ　、　（ＮＬＬＳ０４１０ｇ　、尿素３ｇ。

酵母エキス１　ｇ　、　Ｋ）１２Ｐ［１４１ｇ　、　Ｍ
ｇＣＬ・６Ｈ２００，４ｇ＋　Ｐｅ５ｏ４Ｔ　７８２０
１０ｍｇ、　Ｍｎ５０４１４〜６８２００、２ｍｇ、　
Ｚｎ５Ｏ＜　・７Ｈ２００，９ｍｇ、　ＣｕＳＯ４・５
Ｈ２００、４ｍｇ＋　Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２００，
０９ｍｇ、　（ＮＨ４）６ＭＯＴＯ２４・４８２００．
０４　ｍｇ、ビオチン３０μｇ、サイアミン塩酸塩１ｍ
ｇを水１１に含みｐＨ７，２に調整した培地）４３ｍｊ
！に植菌して３０℃で振盪培養し、ＯＤが０．２になっ
た時点でペニシリンＧを０．５単位／ｍｊ！となるよう
に添加した。培養を継続し、ＯＤが０．６になった時点
で集菌し、該細胞を（５）と同様な方法によりリゾチー
ム処理してプロトプラスト化した。このプロトプラスト
を（５）と同様な方法により、Ｐ　Ｅ　Ｇ６ＧＯＱを介
してｐＥａｒｏＧ−ｐｈｅＡ３で形質転換し、カナマイ
シン耐性の形質転換株を得た。各株の形質転換株をＳＳ
Ｍ培地４Ｑｍｌで培養し、上記と同様にしてペニシリン
Ｇ処理をした後、集菌した培養菌体から、（１）と同様
な方法でプラスミドＤＮＡを単離した。これらのプラス
ミドの各種制限酵素での切断解析により、ｐＢａｒｏＧ
　−ｐｈｅＡ３　と同一のプラスミドであることを確認
した。

このようにして得られたｐＥａｒｏＧ　−ｐｈｅＡ３を
保有するに３８あるいはに−５５の形質転換株は各々コ
リネバクテリウム・グルタミクムに−６６（ＦＢＲＭ　
ＢＰ−１１２０）およびコリネバクテリウム・グルタミ
クムＫ　−６７（ＦＢＲＭ　ＢＰ−１１２１）　として
昭和６１年８月７日付で工業技術院微生物工業技術研究
所（微工研）に寄託されている。

形質転換株と各々の親株のフェニルアラニン。

チロシンおよびトリプトファン生産試験を次のように行
なった。

ＮＢ培地中で３０℃、１６時間振盪培養した種培養０．
５ｍβを５ｍｌの生産培地〔グルコース６０ｇ。

ＫＨ２ＰＯ４１ｇ　、　Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ　、　Ｍｇ５
Ｏ＜・７８２０１ｇ。

（ＮＨ４）　２ＳＯ４２０ｇ　、コーン・スチープ・リ
カー５ｇ。

Ｍｎ３０４１０ｍｇ、ビオチン３　Ｑ　μｇ、　ＣａＣ
Ｏ３２０ｇを水１ｐに含み、ｐＨ７，２に調整した培地
〕の入った試験管にそれぞれ接種し、３０℃で７２時間
振盪培養した。培養後、培養液１　ｍｊ２に６　ＮＮａ
０ｆｌ溶液を５０μβ加え、６５℃で５分間加熱し、析
出しているチロシンを完全に溶解させた後、培養枦液ヲ
ペーパークロマトグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色
後、比色定量してＬ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン
およびＬ−）リプトファンの生成量を測定した。

結果を第３表に示す。

第　　　　　３　　　　　表 ・グルタミクムに４３　　　　　０　　　　　　　５．
２　　　　　０実施例２ コリネバクテリウム・グルタミクムに３８のＤＳ、ＣＭ
およびＰＤ遺伝子の全てを含む組換え体プラスミドを保
有する菌株によるフェニルアラニンの生産 （１）コリネバクテリウム・グルタミクムに３８株の染
色体ＤＮＡ、プラスミドｐＣ３−ＣＭ２およびベクター
ｐｃｅ５３とｐｃｅ　１１５の調製ＮＢ培地で増殖した
コリネバクテリウム・グルタミクムに３８　（ＰＢＲＭ
　　ＢＰ−４５４）の種培養２０ｍ矛を４００ｍｊ！の
半合成培地ＳＳＭに接種して３０℃で振盪培養した。Ｏ
Ｄが０．２になった時点で培養液に０゜５単位／ｍ、ｉ
！の濃度となるようにペニシリンＧを添加した。さらに
培養を継続し、ＯＤが０．６になるまで生育させた。

培養液から菌体を集菌し、ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、リゾ
チーム溶液１０＋ｙ＋ｊｌ’に懸濁し、３７℃で４時間
反応を行った。集菌した菌体から実施例１の（１）と同
様な方法で高分子染色体ＤＮＡを単離した。

プラスミｌ−’ｐＣ３−ＣＭ　２は特°開昭［１Ｏ−２
４１９２に開示されたコリネバクテリウド・グルタミク
ムＫ　Ｙ９４５６　（ＣＭおよびＩ）　Ｄの両酵素活性
を欠損しており、フェニルアラニンおよびチロシンの要
求性を有している）〔アグリカルチュラル・アンド・バ
イオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ
。

Ｃｈｅｍ、）　３９．３３Ｈ１９７５）　）の欠損形質
を相補するコリネバクテリウム・グルタミクムに３８の
ＢａｍＨＩ切断ＤＮＡ断片をコリネバクテリウム属のプ
ラスミドｐｃＧ１１のＢｇｌ　ＴＩ切断部位に挿入させ
たプラスミドである。

ベクターとして用いるｐＣＢ５３は特開昭５７−１３４
５００に開示されたコリネバクテリウム・グルタミクム
のプラスミドｐＣＧ　１とエシェリシア・コリのプラス
ミドルＧへ２２〔ジャーナル・オン・バタテリオロジイ
（Ｊ、　１３ａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１　／Ｉ　０　、
　４００（１９７９）　）を和合連結させたプラスミド
である。詳しくはｐＣＧ　Ｉ上のＢｇβ■切断部位とｐ
ｃ＾２２」―に２カ所あるＢａｍＨＩ切断部位のうちテ
トラサイクリン耐性遺伝子内でない３ａｍＨＩ切断部位
とで、両制限酵素の同一接着末端を利用して連結したも
のである。ｐＣＢ５３はｐＧＡ２２由来のカナマイシン
耐性遺伝子などの選択マーカーを有し、制限酵素Ｓａｌ
　Ｉに対する切断部位は１カ所である。

同じく、ベクターとして用いるｐＣＧ　１１５は特開昭
５７−１３４５００に開示されたプラスミドｐｃＧ１１
のＢｇｌＩＩおよびｐｓｔ　Ｉ切断部位にＭ１３ｍｐ１
８ＲＰＤＮＡ　（全酒造社製）をＢａ１ＴＩｌ（Ｉおよ
びＰｓｔ　Ｉで切断して得たリンカ−を両者の同一接着
末端を利用して結合させたプラスミドである。ｐｃＧ１
１５は分子量約５．４ｋｂのプラスミドで、単一の制限
酵素切断部位としてＸｂａＩ、　Ｓａｊ？　ＩおよびＰ
ｓｔ　Ｉを有し、ストレプトマイシンおよび／またはス
ペクチノマイシン耐性の表現型を与える（第２図参照）
。

ｐ（１：Ｓ−ＣＭ２はコリネバクテリウム・グルタミク
ムＫ　３９　、（ＦＢＲＭ　ＢＰ−４５９）の培養菌体
から、ｐＣＢ５３およびｐｃｅ　１１５は各々を保有す
るコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３９０１
９（ＡＴＣＣ３１８３３から誘導したリゾチーム感受性
変異を有する菌株）の培養菌体から次の方法で単離した
。

コリネバクテリウム・グルタミクムに３９は、４００ｍ
ｌの３３Ｍ培地で３０℃で振盪培養し、上記と同様にし
てペニシリンＧ処理をした後、ＯＤが０．６になるまで
生育させた。また、Ｊ）ＣＢ５３あるいはｐＣＧ　１１
５を保有するコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣ
Ｃ３９０１９は、４００ｍｌのＮＢ培地で３０℃で振盪
培養し、ＯＤが約０．７になるまで生育させた。菌体を
集菌し、実施例１の（１）と同様な方法でプラスミドを
単離した。

（２）ＤＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニング上記
で調製したｐＣＢ５３プラスミドＤＮＡ３μｇを含む制
限酵素５ａｎＩ用反応液（トリス１０ｍＭ、ＭｇＣβ２
　６ｍＭ、　　ＮａＣｊ２１５０ｍＭ、ｐＨ７，５）　
６０μｌｌに６単位のＳａｊ！１．（全酒造社製）を添
加し、３７℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間加温
して反応を停止させた。一方、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムに３８株の染色体ＤＮＡ３μｇを含む５ａｊ
２Ｉ用反応液１４０．ｌｉ！に６単位の５ａＡＩを添加
し、３７℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間加温し
て反応を停止させた。

再反応物を混合し、１０倍濃度のＴ４リガーゼ用緩衝液
４（ＤＩＣ５ｍＭ　　ΔＴＰ　　４ＱμＡ。

Ｔ４リガーゼ（全酒造社製、１単位／μｆｆ）０．３ρ
および水１２０〃を加え、１２℃で１６時間反応させた
。

このリガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＡＴＣＣ３９０１９の形質転換に供した。

コリネバクテリウム・グルクミクムへＴＣＣ３９０１９
の種培養４ｍｊ２をＮＢ培地４０ｍｉ！に植菌し、３０
℃で振盪培養した。ＯＤが０．６になった時点で集菌し
、該細胞をＲＣＧＰ培地に１ｍｇ／＋ｎｊ！のりゾチー
ムを含む溶液（ｐ）１７．６　＞　１０　ｍｆｌに約１
０９細胞／ｍＪ２となるように懸濁し、Ｌ型試験管に移
して３０℃で５時間緩やかに振盪反応してプロトプラス
ト化した。

このプロトプラスト菌液Ｑ、５ｍＡを小試験管にとり、
２．．５００　Ｘｇで５分間遠心分離し、７３ＭＣ緩衝
液１ｍβに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ緩衝液Ｑ、
１ｍｊ！に再懸濁した。この菌液に・２倍高濃度の７３
ＭＣ緩衝液と上記リガーゼ反応液の１対１混合液１００
μ矛を加えて混和し、次いで７３ＭＣ緩衝液中に２０％
Ｐ　Ｅ　０６．０００を含む液０．８＋ｎｊ！を添加し
て混合した。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２）　２
　ｍｌｌを添加し、２．５００ｘｇで５分間遠心分離に
かけて上澄液を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍ
ｌのＲＣＧＰ培地に懸濁してから、この菌液Ｑ、２ｍＡ
をカナマイシン２００μｇ７ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培
地に塗布し、３０℃で７日間培養した。

寒天培地上に生育したコロニーをかき集め、生理食塩水
で２回遠心洗浄後、生理食塩水ｌ　ｍｌに懸濁した。こ
の菌液をＰＰＰ８００μｇ／ｍｊ２およびカナマイシン
１０μｇ／ｍｊ！を含有する最少寒天培地Ｍｌ上に再塗
布して３０℃で５日間培養し、ＰＰＰおよびカナマイシ
ンに耐性となった形質転換株を選択した。

これらの形質転換株をＮＢ培地で培養し、集菌した培養
菌体から、実施例１の（１）でｐＣＢ５３を単離したの
と同様な方法でプラスミドＤＮＡを単離した。形質転換
株の一株から得られ、ｐｃ’ｓ　１と命名したプラスミ
ドは、各種制限酵素による切断産物をアガロースゲル電
気泳動法で解析した結果、ｐＣＢ５３の５ａｉｌ切断部
位に約５．、７　ｋｂの５ａＩＩＤＮＡ断片が挿入され
た構造を有していることがわかった（第２図参照）。

コリネバクテリウム・グルタミクム八ＴＣＣ３９０１９
およびｐＣＤＳ　ｌを保有する形質転換株について、Ｄ
Ｓ活性を実施例１の（５）と同様な方法で測定した。

ＡＴＣＣ３９０１９株のＤＳ活性を１としたときのｐｃ
’ｓ　１を保有する形質転換株のＤＳ活性は８−１０倍
に増加しており、また、フェニルアラニンおよびチロシ
ンによる阻害を受ないことから、ｐｃ’ｓ　１に挿入さ
れている約６，７ｋｂのＤＮＡ断片上には、コリネバク
テリウム・グルタミクムに３８株由来のＯ３遺伝子が存
在することが判明した。

（３）ＣＭ遺伝子を含むＤＮＡ断片のサブクローニング 実施例２の（１）で調製したｐＣ３−ＣＭ２プラスミド
ＤＮＡ３μｇを含む制限酵素５ａｊ２Ｉ用反応液１００
μβに５単位の３ａＡＩ（全酒造社製）を加え、３７℃
で６０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停
止させた。また、ｐＣＢ５３プラスミドＤＮＡ３μｇを
含む制限酵素３ａｊｌ！Ｉ用反応液１００μＡに５単位
の５ａＡＩを加え、３７℃で６０分間反応後、６５℃で
１０分間加温して反応を停止させた。

両反応物を混合し、１０倍濃度のＴ４リガーゼ用緩衝液
４ＣＤ’Ｃ５ｍＭ　　ＡＴＰ４０μＡ、Ｔ４リガーゼ（
全酒造社製、１単位／μＡ）０．３μｌおよび水１２０
μｌを加え、１２℃で１６時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＫ　Ｙ９４５７　（ＣＭ活性を欠損しており、フ
ェニルアラニンおよびチロシンの要求性を有している）
〔アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）３９、
３３１　（１９７５）　）　（昭和６１年８月７日付で
微工研にＦＥＲＭ　ＢＰ−１１２３として寄託）の形質
転換に供した。

形質転換には次のようにして調製したプロトプラストを
用いた。Ｋ　Ｙ９４５７株の種培養４ｍｊ２をフ４フ ェニルアラニンおよびチロシン各１００μｇ／ｌｎｌを
含むＳＳＭ培地４０ｍｊｌ！に植菌して３０℃で振盪培
養した。ＯＤが０．２になった時点でペニシリンＧを０
．５単位７ｍＡとなるように添加し、培養を継続した。

ＯＤが０．６になった時点で集菌し、該細胞を実施例２
の（２）と同様な方法によりリゾチーム処理してプロト
プラスト化した。プロトプラストを上記リガーゼ反応混
合物を用いて実施例２の（２）と同様な方法により形質
転換した。カナマイシン２００μｇ／ｍＡを含むＲＣＧ
Ｐ寒天培地上に生育したカナマイシン耐性コロニーをか
き集め、生理食塩水で２回遠心洗浄後、生理食塩水１　
ｍＡに懸濁した。この菌液をカナマイシン１０μｇ／ｍ
ｊ！を含有する最少寒天培地Ｍｌ上に再塗布して３０℃
で３日間培養し、カナマイシン耐性で、フェニルアラニ
ンおよびチロシン非要求性となった形質転換株を選択し
た。これらの形質転換株を３５Ｍ培地で培養し、上記と
同様にして、ペニシリンＧ処理をした後、集菌した培養
菌体から、実施例Ｉの（１）でｐｃＢ５３を単離したの
と同様な方法でプラスミドＤＮＡを単離した。形質転換
株の一株から得たプラスミドｐｃｃＭ１を各種制限酵素
で消化後、アガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐ
Ｃ８５３の５ａｌＩ切断部位に約１．９　ｋｂの５ａｎ
ＩＤＮＡ断片が挿入された構造を有していることがわか
った（第２図参照）。

（４）ＰＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニング実施
例２の（１）で調製したｐＣ８５３のプラスミドＤＮＡ
３μｇを含む制限酵素Ｂａｍ）Ｉ　Ｉ用反応液（トリス
１０ｍＭ　　、　ＭｇＣｊＬ　　６ｍＭ　　、　ＮａＣ
ｊ！　１００ｍＲ１゜ｐＨ７，５）６０μｉ！に６単位
のＢａｍＨＩ（全酒造社製）を添加し、３７℃で６０分
間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止させた
。一方、コリネバクテリウム・グルタミクムに３８株の
染色体ＤＮＡ３．１！ｊｇを含むＢａｍＨＩ用反応液１
４０μｐに６単位のＢａｍ）ｌ　Ｉを添加し、３７℃で
６０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止
させた。

両反応物を混合し、１０倍濃度のＴ４１Ｊガーゼ用緩衝
液４０１１１．５ｍＭ　　ＡＴＰ４０．ｌｊｃ　Ｔ４リ
ガーゼ（宝酒造社製、１単位／μＡ）０．３μβおよび
水１２０μｌを加え、１２℃で１６時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物を用い、コリネバクテリウム・
グルタミクムＫ　Ｙ９１８２　（Ｐ　Ｄ活性を欠損して
おり、フェニルアラニンの要求性を有している）〔アグ
リカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　　３９
　。

３３１、　（１９７５）　’］を実施例２の（３）と同
様な方法により形質転換した。カナマイシン２００μｇ
／ｍｌ！を含むＲＣＧＰ寒天培地上に生育したカナマイ
シン耐性コロニーをかき集め、生理食塩水で２回遠心洗
浄後、生理食塩水１　ｍＡに懸濁した。この菌液をカナ
マイシン１０μｇ／ｍｊ！を含有する最少寒天培地Ｍｌ
上に再塗布して３０℃で３日間培養し、カナマイシン耐
性で、フェニルアラニン非要求性となった形質転換株を
選択した。これらの形質転換株を３５Ｍ培地で培養し、
ペニシリンＧ処理をした後、集菌した培養菌体から、実
施例１の（１）でｐｃ８５３を単離したのと同様な方法
でプラスミドＤＮＡを単離した。形質転換株の一株から
得たプラスミドｐｃＰＤ　ｉを各種制限酵素で消化後、
アガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐＣＢ５３の
Ｂａｍｔｌ　Ｉ切断部位に約４．９ｋｂのＢａｍＨＩＤ
ＮＡ断片が挿入された構造を有していることがわかった
（第３図参照）。

（５）ＤＳおよびＣＭ遺伝子をあわせ持つ組換え体プラ
スミドの作成 ｐＣＤＳ　１よりＤＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、一方
ｐＣＣＭ　１よりＣＭ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得し
、両ＤＮＡ断片をｐＣＧ　１１５に連結する。

ｐＣＤＳ　１　、ｐＣＣＭ　１、またはｐＣＧ　１１５
プラスミドＤＮＡをそれぞれ３μｇずつ含むＳａＡ’Ｉ
用反応液１００μｌにそれぞれ５単位の５ａＡＩ（宝酒
造社製）を加え、３７℃で６０分間反応後、６５℃で１
０分間加温して反応を停止させた。

３種の反応液を混合し、１０倍濃度のＴ４’Ｊガーゼ用
緩衝液４０１１１．５ｍＭ　　ＡＴＰ４０μＡ。

Ｔ４リガーゼ（全酒造社製、１単位／μｍ）１μｌおよ
び水２０μｌを加え、１２℃で１６時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物を用い、ＣＭ活性を欠損したコ
リネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９４５７（ＦＢＲ
Ｍ　ＢＰ−１１２３＞を実施例２の（３）と同様な方法
により形質転換した。スペクチノマイシン４００μｇ／
ｍβを含むＲＣＧＰ寒天培地上に生育したスペクチノマ
イシン耐性コロニーをかき集め、生理食塩水で２回遠心
洗浄後、生理食塩水１ｍｌに懸濁した。この菌液をＰＦ
Ｐ　３■／ｍｊ２およびスペクチノマイシン１００μｇ
／ｍｊ！を含有する最少寒天培地Ｍｌ上に再塗布して３
０℃で５日間培養し、スペクチノマイシンおよびＰＰＰ
耐性で、フェニルアラニンおよびチロシン非要求性とな
った形質転換株を選択した。これらの形質転換株から実
施例２の（３）と同様な方法でプラスミドＤＮＡを単離
した。形質転換株の一株から得たプラスミドｐＣＤＳ−
ＣＭ１を各種制限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳
動で解析した結果、ｐｃＧ１１５の５ａＡＩ切断部位に
約５．７ｋｂのＤＳ遺伝子を含むＳ’ａＡ　Ｉ　ＤＮＡ
断片および約ｉ、９ｋｂのＣＭ遺伝子を含むＳａβｌＤ
ＮＡ断片が挿入された構造を有していることがわかった
（第２図参照）。

（６）ＤＳ、ＣＭおよびＰＤ遺伝子の全てをあわせ持つ
組換え体プラスミドの作成 ｐｃＰＤ　１よりＰＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得し
、ｐＣＤＳ−ＣＭｌに連結する。

ｐＣＰＤ　１プラスミドＤＮＡ３μｇを含む３ａｍＨＩ
用反応液１００μβに５単位のＢａｍＨＩ　、（宝酒造
社製）を加え、３７℃で６０分間反応後、６５℃で１０
分間加温して反応を停止させた。また、ｐＣＤＳ　−Ｃ
ＭＩプラスミドＤＮＡ３μｇを含む８μｌｎ反応液（ト
リス１０ｍＭ、　ＭｇＣｊＬ　　６ｍＭ、　ＮａＣＡ　
１００ｍＭ。

ｐＨ７，５）１００μβに５単位のＢｇβ■（宝酒造社
製）を加え、３７℃で６０分間反応後、フェノール処理
により反応を停止させた。両反応物を混合し、２容のエ
タノールを加えて一２０℃で６時間放置後、沈殿したＤ
ＮＡを遠心回収し、ＴＥＳ緩衝液１００μｌに溶解した
。

この反応物に、１０倍濃度のＴ４リガーゼ用緩衝液２０
．ｃｌ、５ｍＭ　　ΔＴＰ２（］μ４！、’Ｔ４リガー
ゼ（全酒造社製、１単位／μｊｌ！　）　０．３μ！お
よび水６０μｌを加え、１２℃で１６時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物を用い、ＰＤ活性を欠損したコ
リネバクテリウム・グルタミクムＫＹ９１８２株を実施
例２の（３）と同様な方法により形質転換した。スペク
チノマイシン４００μｇ／ｍβを含むＲＣＧＰ寒天培地
上に生育したスペクチノマイシン耐性コロニーをかき集
め、生理食塩水で２回遠心洗浄後、生理食塩水１　ｍＲ
に懸濁した。この菌株をスペクチノマイシン１００μｇ
、／ｍ１を含有する最少寒天培地Ｍｌ上に再塗布して３
０℃で３日間培養し、スペクチノマイシン耐性で、フェ
ニルアラニン非要求性となった形質転換株を選択した。

これらの形質転換株から実施例２の（３）と同様な方法
でプラスミドＤＮＡを単離した。形質転換株の一株から
得たプラスミドｐｃＤｃＦ！　１を各種制限酵素で消化
後、アガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐＣＤＳ
−ＣＭ　１のＢｇβ■切断部位に約４．．９ｋｔｌのＰ
Ｄ遺伝子を含むＢａｍｔｌ　Ｉ　Ｄ　ＮΔ断片が挿入さ
れた構造を有していることがわかった（第３図参照）。

コリネバクテリウム・グルタミクム八ＴＣＣ３９０１９
およびｐｃＤｃＰ　１を保有する形質転換株について、
ＤＳ、ＣＭおよびＰＤ活性を実施例１の（５）と同様な
方法で測定した。コリネバクテリウム・グルタミクム八
ＴＣＣ３９０１９のＤＳ、ＣＭおよびＰＤ活性をそれぞ
れ１としたときのｐＣＤＣＰ　１を保有する形質転換株
のＤ’Ｓ、ＣＭおよびＰＤの相対活性を第４表に示す。

第　　　　４　　　　表 菌　　　　株　　　　　ＤＳ　　　　ＣＭ　　　　ＰＤ
（７）　　、　ｐｃＤｃＰ　１を保有する菌株によるフ
ェニルアラニンの生産 フェニルアラニン生産性菌株コリネバクテリウム・グル
タミクムＫ　３８　、（ＰＢＲＭ　８１’！−４５４）
、トリプトファン生産性菌株コリネバクテリウム・グル
クミクムに−５５、（ＦＥＲＭ　ＢＦ−８６４）右よび
チロシン生産性菌株コリネバクテリウム・グルタミクム
Ｋ　４３　、（ＦＢＲＭ　ＢＰ−４５７）をｐｃＤｃＰ
　１を用いて実施例２の（３）と同様な方法で形質転換
し、スペクチノマイシン耐性の形質転換株を得た。各株
の形質転換株から実施例２の（３）と同様な方法でプラ
スミドＤＮＡを単離した。これらのプラスミドの各種制
限酵素での切断解析によりｐＣＤＣＰ　１と同一のプラ
スミドであることを確δ忍した。

形質転換株と各々の親株のフェニルアラニン、チロシン
およびトリプトファン生産試験を実施例１の（６）と同
様な方法で行ない、ペーパークロマトグラフィーにより
Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンおよびＬ−）！Ｊ
ブトファンの生成量を測定した。

結果を第５表に示す。

第　　　　　５　　　　　表 ・グルタミクムＫ　３８　　　　　５．７　　　　　　
０　　　　　　０に３ｇ／ＩＩＣＤＣＰＩ Ｋ−５５／ｐＣ口ＣＰト グルタミクムに４３　　　　　０　　　　　　　５．２
　　　　　０に４３／ｐｃＤｃＰ１ 参考例 （１）エシェリシア・コリのＣＭおよびＰＤの遺伝子を
含むｐｈｅＡを組み込んだプラスミドＤＮＡの調製 特開昭６０−３４１９７に開示されたように、エシェリ
シア・コリの野生型のｐｈｅＡ遺伝子はエシェリシア・
コ！ＪＫ−１２株亜株ＪＡ１９４　、（プロシーディン
グ・オン・ザ・ナショナル・アカデミイ・オン・サイエ
ンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
）、、　９４，４８７（１９７７）　：］の染色体ＤＮ
Ａを供与源とし、ｐＢＲ３２２をベクターとして用いて
約４．．２ＫｂのＢｃｏＲＩ　−Ｈｉ口［］Ｉ切断片と
してクローニングした。この組換え体プラスミドｐＢａ
ｒｏＰ１は、ＢｃｏＲＩ、　ＢａｍＨＩ、　ＨｉｎｄＩ
ＩＩなどの各種制限酵素の切断部位を有し、プロウスキ
ーらがクローニングしたＤＮＡ断片〔プロシーディング
・オン・ザ・ナショナル・アカデミイ・オン・サイｘ　
７　ｘ　（Ｐｒｏｃ、、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　）ＩＪＳＡ、　７５　。

４２７１　（１９７８）　）との比較により、クローニ
ングしたＤＮΔ断片上にはｐｈｅＡ遺伝子とともに他の
遺伝子ａｒｏｆ７およびｔｙｒＡをも含むことが判明し
た。そこでｐＢａｒｏＰｌからｐｉｅＡ遺伝子のみを含
むＤＮＡ断片をサブクローニングするため、まずｐＥａ
ｒ：ｏＦ　１をその保有株エシェリシア・コリＡ３３２
４８株（この菌株の製造方法は特開昭６０−３４１９７
に記載されている）の培養菌体から、実施例１の（１）
と同様な方法で単離した。

（２）　　ｐ　ｈ　ｅへ遺伝子のサブクローン化上記で
調製したプラスミドｐＢａｒｏＦＩ　Ｄ　ＮΔより、ｐ
ｉｅＡ遺伝子部分のＤＮＡ断片を取得し、エシェリシア
・コリのベクターｐＢＲ３２２に連結する。

プラスミドｐＢａｒｏＦＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ　３μｇを含む
制限酵素反応液（１０ｍＭ）リス＋、　　５ｍＭ　Ｍｇ
ＣＬ、　１００ｍＭＮａＣｊ！、　　ｐＨ７，５）　１
００ＪＩＩｌに各５単位のＢｃｏＲ１および［ｌａｍＨ
Ｉ（全酒造社製）を加え、３７℃で６０分間反応させた
。また、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ３μｇを含む制限酵素反応
液１００μβに各５単位の　ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨ
Ｉを加え、３７℃で６０分間反応させた。反応後、６５
℃で１０分間加温して反応を停止させた。両反応液を混
合し、Ｔ４リガーゼ用緩衝液（６６０ｍＭ　　トリス、
、　６６ｍＭ　ＭｇＣ！２＋　　１００ｍＭジチオスレ
イトール＋、ｐＨ７，６）４０μｌ、ΔＴＰ（５ｍＭ）
　　４０１ｔｌｌ、　Ｔ４リガーゼ（全酒造社製。

１単位／μＡ）０．４μｍおよび水１２０μβを加え：
１２℃で１６時間反応させた。反応後、６５℃で１５分
間加温して反応を停止させた。

このリガーゼ反応混合物を用いて、エシェリシア・コリ
に１２株亜株Ｇ５２４５　（ｐｈｅＡ　９０５．　ａｒ
ａＤ１３９゜Δ１ａｃＵ１６９．△ｇｌｙＡ、　　ｓｔ
ｒ八、　　ｔｈｉ）　　［：ジーン（Ｇｅｎｅ）。

ユ４　、６３．　　（１９８１））を実施例１の（２）
と同様な方法で形質転換した。

菌体を生理食塩水で２回遠心洗浄後、５０μｇ／ｍβの
グリシンを含むＭ９平板培地に塗布した。

Ｍ９平板培地に生育したコロニーを各々アンピシリン１
００μｇ／ｍ、ｃ、テトラサイクリン２０μｇ／ｍｌを
含むＬＢ平板培地に塗布し、アンピシリン含有培地で生
育し、テトラサイクリン含有培地で生育しないコロニー
を選択した。

このようにして選択したグリシンを含むＭ９平板培地で
生育し、アンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性の
形質転換株より実施例１の（１）と同様な方法で、プラ
スミドＤＮＡを単離した。形質転換株の一株から得たプ
ラスミドｐＰＨＢＡ１を各種制限酵素で消化後、アガロ
ースゲル電気泳動で解析した結果、ｐＢＲ３２２のＢｃ
ｏＲＩと３ａｍＨＩの間の領域に、約１．８ＫｂのＥｃ
ｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ切断ＤＮＡ断片が挿入されたプラ
スミドであることが判明した。

発明の効果 本発明によれば、微生物のＤＳ、ＣＭおよびＰＤの遺伝
子の全てを含む組換え体ＤＮＡあるいはそれらの遺伝情
報が別個に担われている複数の組換え体ＤＮＡを保有さ
せることにより、コリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属菌種におけるＬ−フェニルアラニンの生産
性を付与あるいは向上させることができる。また、Ｉ、
−）リプトファンまたはＬ−チロシン生産性のコリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種に上記組
換え体ＤＮＡを保有させることにより、Ｌ−トリプトフ
ァンまたはＬ−チロシンの生産がＬ−フェニルアラニン
の生産へ代謝転換され、Ｌ−フェニルアラニンを著量蓄
積する菌株を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＢａｒｏＧ　−ｐｈｅＡｌの制限酵素切断地
図とその作製工程を示す。矢印は遺伝子の転写される方
向を示しである。 第２図はｐｃ’ｓ−ＣＭ　１の、第３図はｐｃｏｃｐ　
１の制限酵素切断地図とその作製工程を示す。太い実線
部分の染色体ＤＮＡ断片上にはＤＳ遺伝子が、斜線部分
の染色体ＤＮＡ断片上にはＣＭ遺伝子が、また点線部分
の染色体　ＤＮＡ断片上にはＰＤ遺伝子が含まれている
。 プラスミドの大きさはキロベース（Ｋｂ）で表示されて
いる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロ
   ソネート−７−ホスフェートシンターゼ、コリスメート
   ムターゼおよびプレフェネートデヒドラターゼの合成に
   関与する遺伝情報の全てを含むＤＮＡ断片とベクターＤ
   ＮＡとの組換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム
   属またはブレビバクテリウム属に属する微生物を培地に
   培養し、培養物中にＬ−フェニルアラニンを生成蓄積さ
   せ、該培養物からＬ−フェニルアラニンを採取すること
   を特徴とするＬ−フェニルアラニンの製造法。
2. （２）該ＤＮＡ断片がエシェリシア属、コリネバクテリ
   ウム属またはブレビバクテリウム属に属する微生物に由
   来することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
3. （３）コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属ま
   たはエシェリシア属に属する微生物由来の３−デオキシ
   −Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−ホスフェート
   シンターゼ、コリスメートムターゼおよびプレフェネー
   トデヒドラターゼの合成に関与する遺伝情報の全てを含
   み、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
   に属する微生物にフェニルアラニンのアナログに対する
   耐性を付与することができるＤＮＡ断片とベクターＤＮ
   Ａとが結合した組換え体ＤＮＡ。
4. （４）コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属ま
   たはエシェリシア属に属する微生物由来の３−デオキシ
   −Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−ホスフェート
   シンターゼ、コリスメートムターゼおよびプレフェネー
   トデヒドラターゼの合成に関与する遺伝情報の全てを含
   むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを保
   有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
   属に属する微生物。