JPS61247392A - ２種またはより多くのアミノ酸を同時に産生できる組換え微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物中に１種またはより多くのアミノ酸を過
剰産生（ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）　、する方法
を指向する。殊に本発明は所望のアミノ酸が微生物中に
過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ　１ｏｎ）されるよ
うに宿主菌株のゲノムＤＮＡの改変および（または）選
択微生物をベクターで形質転換する方法を指向する。

実質的に純粋なムーアミノ酸は加水分解によりタンパク
資源例えばホエーおよび種々の発酵混合物から得ること
ができる。しかし、特定アミノ酸を得るため、一層典型
的な手順は発酵に微生物を利用することであり、それが
炭素源例えばグルコースを高濃度の単一アミノ酸に発酵
する。単一アミノ酸を過剰産生ずるそのような微生物が
知られており、アルスロバクタ−（＾ｒｔｈｒｏｂａｃ
ｔｏｒ）　、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　、カンジ
ダ（ｃａｎｄｉｄａ　）　、ブレビバクテリウム（Ｂｒ
ｅｖｌｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　、コリネバクテリウム（
ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）　、ミクロバクテ
リウム（旧ｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ＋）　、ミクロコ
ツカス（Ｍｉｃｒｏｃｃｕｓ　）　Ｓスタフィロコッカ
ス（Ｓｔａｐｈｙｌ−ｏｃｏｃｃｕｓ　）およびストレ
プトミセス（５ｔｒｅｐｔｏａ　−ｙｃｅｓ）の種が含
まれる。これらの微生物に一定アミノ酸を過剰産生させ
るため、ランダムな突然変異誘発に続いて困難な選択ス
クリーニングが行なわれる。多くのこれらの菌株の遺伝
現象は指向する菌株構築を可能にするぼど十分には理解
されていない。

２種のアミノ酸、殊にフェニルアラニンおよびトリプト
ファン〔シイオ（Ｓｈｉｉｏ）ほか、アグリカルチエラ
ル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー　（八ｇｒ
、Ｂｉｏｌ　　Ｃｈｅｗ　、）　　３７．　１９９１（
１９７３））並びにリシンおよびトレオニン（特許第３
．７３２，１４４号）を偶然に生ずる若干の住物が報告
されている。しかし、それぞれの微生物におけるそれら
の対のアミノ酸の産生の水準は低すぎて経済的に有用で
はない。

最近、組換えＤＮＡ手法を用い、すなわち、リジン、ト
レオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、グル
タメート、フェニルアラニンおよびアルギニンのそれぞ
れの過剰産生を可能にするＤＮＡフラグメントを含むプ
ラスミドで大ＵＡ閑（１！　、　ｃｏｌυを形質転換す
ることにより、大腸菌中にアミノ酸を過剰産生する微生
物が開発された。

例えば米国特許第４．３４Ｇ、１７０号、第、ｉ、３４
７，３１８号、第４．３７１．６１４号、第４，３８８
．４０５号、第４．３９１．９０７号、１＄　４．３，
９３．１３５号、第、１．４０７．９５２号および第４
．４３０．４３０号参照、しかし、古典的遺伝学および
分子生物学の両方を組合せた体系的な方法の使用はかつ
て行なわれなかった。

従って本発明の目的は微生物の発酵により１種またはよ
り多くのアミノ酸を過剰産生ずる方法を提供することで
ある。

さらに本発明の目的は微生物中の１種またはより多くの
アミノ酸の過剰産生を促進するＤＮＡベクターを提供す
ることである・。

本発明の他の目的は１種またはより多くのアミノ酸を過
剰産生ずる微生物の形質転換菌株を提供することである
。

本発明の他の目的は大Ｉｌ！菌微生物の発酵によりフェ
ニルアラニンを過剰産生ずる方法を提供することである
。

さらに本発明の目的は大腸菌微生物中にフェニルアラニ
ンの過剰産生を促進するＤＮＡベクターを提供すること
である。

本発明の他の目的はフェニルアラニンを過剰産生ずる微
生物の形質転換菌株を提供することである。

本発明のこれらおよび池の目的は次の好ましいｐＩｊ４
様の説明から明らかになろう。

本発明は微生物中に１種またはより多くのアミノ酸を過
剰産生じそれによりアミノ酸が経済的に有用な水準で発
現される方法を提供する。この方法には遺伝子増幅、遺
伝子発現（抑制およびアテニュエーシ田ンを含む）の調
節解除、フィードバック阻害耐性および副生物合成の阻
害が含まれる。

殊に、この方法には宿主菌株の染色体ＤＮＡ（ゲノム）
の改変および（または）少くとも１つの発現ベクター（
ｅ＋ｃｐｒｅｓｓｉｏｎ　　ｖｅｃｔｏｒ）による微生
物の形質転換が含まれ、次の結果を生ずる：（Ｉｌ＋　
　アミノ酸の生合成に必要な少くとも１つの酵素の過剰
発現、 伽）　アミノ酸の生合成に必要な少くとも１つの遺伝子
の突然変異誘発によるアミノ酸の発現のフィードバック
阻害の排除、従ってその発現がフィードバック阻害によ
り影響されない、（０）　　段階（ａｌにおける酵素の
発現を阻害または抑制する生成物を生ずる少くとも１つ
の遺伝子の不活性化、 （ｄｌ　　フェニルアラニン産出量を低下する副生成の
合成を可能にする遺伝子またはオペロンの不活性化。そ
のような副生物はチロシンおよびトリプトファンである
。

用いた「ベクター」という用語は分子中のヌクレオチド
配列が自然に産生される配列に等しくないように人によ
り修飾された任意のＤＮＡ分子を意味する。ベクターと
いう用語にはそのように修飾されたＤＮＡ分子のクロー
ンもまた含まれる。

「発現ベクター」という用語は宿主生物中の複製の自生
部位、転写開始部位および発現されるタンパク質をイン
コード（ｅｎｃｏｄｅ）する遺伝子を含むベクターであ
る。発現ベクターはまた通常適当な制御領域、例えばタ
ンパク質の発現を制御するプロモーターおよびターミネ
ータ−を含む。通常、発現ベクターはまた選択マーカー
例えば形質転換微生物に抗生物質耐性を与える配列を含
む。

「プラスミド」という用語はその普通に容認された意味
：　ＤＮＡの自生的に複製する閉環状フラグメント、を
有する。

「オペロン」という用語もまたその普通に容認された意
味、すなわち発現が１組の、通常プロモーター、オペレ
ーター、アテニュエーターおよびターミネータ−を含む
、要素により共同して制御される１つ以上のタンパク質
に対するコーディング領域を含むＤＮＡフラグメント、
を有する。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼにより認
識されてそれに結合され、それによりオペロンの遺伝子
コーディング領域の転写を生ずる領域である。オペレー
ター領域はリプレッサータンパク質に結合することが、
できそれにより転写を阻止するＤＮ’Ａセグメントであ
る。アテニュエーターはコーディング配列の出発直前に
位置する転写終結要素である。アテニュエーター領域は
２つの配置、終結モードおよび抗転写終結モード、で存
在することができる。ターミネータ−領域はＲＮＡポリ
メラーゼの放出を可能にし、それにより転写を終結する
。

□　　細菌、例えば大腸菌、中のアミノ酸に対する生合
成経路はかなりよく理解されている０本発明を実施する
ために、少くとも細菌中に特定のアミノ酸を生ずるのに
必要な主＃素、並びに微生物がアミノ酸の発現を抑制ま
たは阻害するために利用する種々の関節機構を確認する
ことが必要である。

さらに所望アミノ酸を分解する宿主微生物により産生さ
れる酵素について知ることが必要である。

細菌、例えば大腸菌、中のアミノ酸生合成経路の最近の
総説はアミノ酸：生合成および遺伝子調節（＾５ｉｎｏ
　ａｃｉｄｓ　：　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　　ａｎ
ｄ　ＧｅｎｅｔｉｃＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ）　　（ヘル
マンほか（Ｈｅｒｒ＠ａｎｎ　　＋　Ｋ　、Ｍ。

＆　　Ｓｏｍａｒｖｉｌｌｅ、　Ｒ、Ｌ　、　）　ｒｉ
ｍｓアジソンーウエスレー・パブリッシング社（＾ｄｄ
１ｓｏｎ　４ｅｓｌｅｙＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　　Ｃｏ
、　）　＋　１９８３）により与えられる。

本発明の好ましい態様において、組換えＤＮＡ手法によ
り大腸菌中にフェニルアラニンを産生ずる生合成経路に
修飾がなされ、大腸菌中にこのアミノ酸の過剰産生が生
ずる。

第１図を参照すると大腸菌の芳香族アミノ酸を生ずる経
路が示される。フェニルアラニンに対する経路の２つの
酵Ａ：　ＤＡＨＰシンセターゼ（ホスホ−２−ケト−３
−デオキシへブトネートアルドラーゼ）およびコリスメ
ートムターゼ−ブレフェネートデヒドラターゼ、の発現
および機能が調節される。遺伝子ａｒｏ　Ｆ　、　ａｒ
ｏＧおよびａｒｏｌｌは、それぞれがホスホエノールピ
ルビン酸（Ｐ　Ｅ　Ｐ）およびエツトロース−４−リン
酸（８４Ｐ）をＤＡＨＰ中へ凝縮するＤＡＨＰシンセタ
ーゼの３つのイソ酵素をインコード（ｅｎｃｏｄｅ）す
る。しかし、ａｒｏＰｓ　ａｒｏ　Ｇおよびａｒｏｌｌ
によりインコードされた酵素はそれぞれチロシン、フェ
ニルアラニンおよびトリプトファンにより阻害される。

過剰の千ロジン、フェニルアラニン、またはトリプトフ
ァンはまたそれぞれａｔｏｍＳａｒｏＧｓまたはａｒｏ
Ｈの発現を抑制する。遺伝子ｐｈｅ＾は酵素コリスメー
トムターゼ−プレフェネートデヒドラターゼをインコー
ドする。高濃度のフェニルアラニンはｐｈｅＡ遺伝子生
成物の機能を阻害し、また遺伝子自体の発現を抑制する
。従うて、大腸菌にフェニルアラニンを過剰産生させる
方策（ｓ　ｔｒａ　ｔｅｇｙ）はｔｙｒＡの突然変異に
よりチロシンの産生を阻止すること（非機能性タンパク
質を生ずる）、並びにともに高い遺伝子量、調節解除お
よびフィードバック耐性によるａｒｏＦおよびρｈｅ＾
の発現を増加することである。

この好ましい態様は大腸菌の細菌中の生合成経路に関連
して記載されるけれども、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
）　、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　
）、コリネバクテリア（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｔａ
）およびブレビバクテリア（ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒＪ
ａ　）の種を含む他の細菌の生合成経路の適当な修飾を
本発明により行なうことができる。

本発明による１つの観点は所望のアミノ酸の生合成に必
要な宿主生物の少くとも１つの酵素を過剰発現すること
である。好ましい態様におけるこれらの酵素の１つはＰ
ＥＰおよびＥ４Ｐを凝縮することによりフェニルアラニ
ン経路中へ炭素をシャトルする酵素であることができる
。大腸菌の場合に、ａｒｏ　Ｆ遺伝子の過剰発現が選ば
れる。この過剰発現はａｒｏＰ遺伝子を含むマルチコピ
ープラスミドベクターを宿主生物に導入することにより
達成される。これはゲノムＤＮＡ上のものおよびプラス
ミド上のものを含めａｒｏ　Ｆの多数の自律的複製源を
生ず−る。遺伝子をプラスミド中へ挿入する方法はよく
知られている。例えばバーシェフイールド（ＩＩｅｒｓ
Ｍ　１ｅｌｄ）ほか、（１９７４）プロシーディング・
オブ・ザ・ナシ一ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ　、　
）７１．３４５５参照。ａｒｏＦ遺伝子〔ズロースキー
（Ｚｕｒａｗｓｋｉ）ほか、（１９７８，プロシーディ
ング・オブ・ザ・ナシ一ナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、八ｃａｄ、５ｃｉ）　
＋　７５＋４２７２）により開示されたプラスミドから
サブクローンした〕を含むＢａａ　ＨＴ　−Ｂｇｌ　Ｉ
Ｉ　ＤＮＡフラ°グメントはｐＢＲ３２２およびその誘
導体、Ｃｏｔ８１およびそめ誘導体などのようなよく知
られたプラスミド中の適当な制限部位 （例えば、Ｂａ５ＨＩ）に挿入することができる。

プラスミドの細菌および他の微生物中への形質転換はよ
く知られている０例えば、プラスミドの細菌中への形質
転換はバーシェフイールド（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ）ほ
か、前掲、の方法により達成することができる。

ａｒｏＰの過剰発現は、それがＤＡＨＰシンセターゼ、
より多くの炭素を芳香族アミノ酸生合成経路に入らせる
酵素、の発現を住するので重要である。

また、ＤＡＨＰ合成は全く不安定であるので、遺伝子増
幅は分解した酵素分子の連続的な置換を可能にする。

修飾として、さらにＤＡＨＰシンセターゼの発現を増す
ために、発現が、リプレッサーとオペレーターとの間に
相互作用を許さないｔｙｒＲリプレッサーまたはａｒｏ
Ｆオペレーターにおける突然変異に基いて構成されるａ
ｒｏＰ遺伝子もまた選ぶことができる。フィードバック
耐性ａｒｏＦ遺伝子はチロシンの高濃度における、また
は千ロジン類似体例えば３−フルオロチロシンの存在下
の成長により選択される。

好ましい態様（フェニルアラニンが過剰発現される）に
おいて所望アミノ酸の生合成に必要な過剰発現できる他
の酵素はｐｈｅ　Ａ遺伝子である。これはｐｈｅ　Ａを
含むＤＮＡ分子をマルチコピープラスミド中へ挿入し、
プラスミドで大腸菌宿主を形質転換することによる遺伝
子増幅により達成することができる。しかし、若干の場
合に、全く完全なｐｈｅＡ遺伝子はプラスミド中へ挿入
されない。すなわち、アテニュエーターを調節解除し、
オペレーター・リプレッサー相互作用を消滅させるため
、および（または）　ｐｈｅＡ遺伝子をインコードする
フィードバック阻害耐性の酵素をフェニルアラニンによ
りｆ！！換するために遺伝子を修飾することができる。

例えば、ｐｈｅＡ遺伝子を含むＢｃｏＲＩ　−８ａｍＨ
Ｉフラグメンｌ−（ａｒｏＦ遺伝子と同じ超始）を初め
にマルチコピープラスミド、例えばρ、ＢＲ３２２上に
サブクローンすることができ、次いで特定１７−塩基対
Ｄ　Ｎ　Ａ　ｉｌｌ限フラグメントの切り出しによりア
テニュエーターを部分的に欠失することができる。

この切り出しの一般的方法は第２図〜第４図に示される
。

他の修飾として、ｐｈｅＡのオペレーター−リプレッサ
ー相互作用を、宿主菌株として活性リプレッサーを含ま
ない大腸菌を用いることにより消滅させることができる
。これはプラスミド中に含まれるρｈｅＡオペロン上の
オペレーター構成の突然変異を行うことにより、または
ｐｈｅＡコーディング領域およびアテニエエーターを、
オペレーターなしで、ｐｈｅＡの発現がａｒｏＦ遺伝子
プロモーターの制御下にあるようにａｒｏＰ遺伝子の末
端に接合することにより達成することができる。

本発明の第２の観点において、フィードバック耐性突然
変異を用いるので、所望アミノ酸の発現はフィードバッ
ク阻害により影響されない。好ましい態様において、こ
れは一定のフェニルアラニン類似体、例えばｍ−フルオ
ロ　フェニルアラニン、に対する耐性を用い、染色体ま
たはプラスミドを含むｐｈｅＡ遺伝子中のフィードバッ
ク耐性変異に対して選択することにより得られる。突然
変異が染色体上であればそのｐｈｅＡ遺伝子が次に分離
され、マルチコピープラスミド上に挿入される。

本発明の第３の観点は遺伝子の生成物が所望ア。

ミノ酸の産出を低下させる遺伝子を、必要な酵素の発現
を阻害または抑制することにより不活性化することであ
る。例えば、そのような生成物は第２の好ましくない生
成物への炭素流の転用を生じ、あるいは酵素の発現を阻
害または抑制することができ、それが所望のアミノ酸の
過剰産生を阻害する。第１図において、機能性ｔｙｒＡ
遺伝子の存在がチロシンの産生を生じ、それは、作られ
るプレフェネートのすべてが好ましい態様における所望
アミノ酸のフェニルアラニンに転化されはしないので好
ましくない。また細胞中の過剰のチロシンがａｒｏＦ発
現を抑制し、その遺伝子生成物を阻害する。

ｔｙｒＡ遺伝子の不活性化は直接またはｔｙｒＡ含有プ
ラスミド中間体で宿主生物のゲノムＤＮＡ上のトランス
ポゾン突然変異誘発により行なうことが好ましい、トリ
プトファンの産生はｔｒｐオペロンの不活性化により同
様に消滅させることができる。

ａｒｏＦ遺伝子およびｐｈｅ遺伝子を１つまたはより多
くのマルチコピープラスミドに挿入し、適当な大騙菌培
擲菌中へ形質転換することが好ましい。

細菌中に有用であるマルチコピープラスミド、例えばｐ
ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２Ｂなどを含めＣｏｌ　Ｅｌおよ
びその誘導体、はよく知られている。

部位特異性突然変異誘発はウオリス（Ｗａｌｌｉｃｅ　
）ほか、（１９８１）、ニュークリーク・アシズ・リサ
ーチ（Ｎｕｃ、＾ｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ　、　）　＋Ｌ３
６４７およびダルバデイ・マクファーランド（口ａｌｂ
ａｄｉｅ−Ｍｃ　　Ｆａｒｌａｎｄ　）ほか（１９８２
）、プロシーディング・オブ・ザ・ナシッナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａｃ
ａｄ　、Ｓｃｉ、　）　＋　７９＋６４０９により示さ
れた手順に従って行なうことができる。

典型的には、変異原物質で処理される部位（標的部位）
の周囲付近のヌクレオチド配列がまずＤＮＡ配列により
常法で確認される。次いでオリゴヌクレオチドが欠失ま
たはヌクレオチド（類）置換を含むことを除いて変異原
物質で処理される標的部位付近の配列に相補性である合
成オリゴヌクレオチドが調製される。オリゴヌクレオチ
ドは変異原物質で処理される遺伝子の部分を含むＤＮＡ
の一本鎖領域およびＤＮＡ重合により伸長されたオリゴ
ヌクレオチドに対してハイブリブリッド形成し完全な二
本鎖プラスミドを住する。従来の増幅手法により二本鎖
ＤＮＡは２形態の遺伝子を生じ、その１つは変異原物質
で処理されている（第４図参照）。変異原物質処理遺伝
子を含むコロニーはプローブとして機能する同じオリゴ
ヌクレオチドに対するハイブリッド形成により選択する
ことができる。　　　゛ トランスポゾン突然変異誘発は一般にトランスボゾン例
えばＴｎ　５またはＴｎｌＯを含むλファージの使用に
より行なうことができる。例えば宿主菌株中の変異原物
質で処理される遺伝子を含むプラスミドを、トランスポ
ゾンを含むラムダにより感染することができる。生ずる
コロニーは、耐薬品性（トランスホモン上のマーカー）
および制限エンドヌクレアーゼマツピングにより標的遺
伝子中のトランスボゾンの挿入について試験することが
できる。次いで変異遺伝子を第１プラスミドと不相容性
である第２プラスミドにより宿主の形質転換により宿主
細胞の染色体中へ入れることができる。

第２プラスミドおよびトランスボゾンを含むコロニーは
次いで第２プラスミドのマーカーおよび非機能性標的遺
伝子に対するスクリーニングにより見出すことができる
。これらのコロニーはゲノムＤＮＡ中に変異した標的遺
伝子を含む。トランスポゾンはまたトランスポゾンを含
むλファージで宿主菌株を感染することにより直接染色
体ＤＮＡ中へ挿入し、トランスボゾンの選択マーカーお
よび非機能性標的遺伝子の両方を含むコロニーを選択す
ることができる。

プラスミド上、および（または）ゲノムＤＮＡ中に存在
する標的遺伝子（類）を含む宿主細胞を確認する従来の
方法が利用される。ベクターに対するスクリーニングの
場合に、コロニーはまずべフター上に保持される一定の
選択マーカー、例えば抗生物質耐性の喪失および保有に
より確認される。さらに確認するには関連酵素（類）の
活性に対する個々のコロニーの検定が含まれる。これに
はフィードバック耐性酵素対阻害性酵素、酵素の発現の
抑制対抑制解除、および機能の喪失を識別する崗力が含
まれる。ベクター内のＤＮＡの適当なフラグメン］・は
従来の制限エンドヌクレアーゼマツピングにより、また
必要なときには従来のＤＮＡ配列分析により確認される
。

微生物例えば細口を培養する条件はよく知られ、当業者
により決定することができる。ＤＮＡの精製は従来の手
順により、例えばゲル電気泳動、ＨＰＬＣなどにより行
なうことができる。

本発明の方法により、所望のアミノ酸を予想外に高い濃
度に発現することができる。典型的な産生量初期に約５
０ｇ毎リットルのグルコースを含むブロス中、微生物リ
ットル当りアミノ酸１１．５ｇ以上であることができる
。

本発明の好ましい態様について説明したので以下は実施
例として提供され、本発明の範囲を制限するものではな
い。

実施例　１ プラスミドｐｈｅ１４、ｔｙｒ２５およびｐｈｅａｒｏ
２の構築プラスミドｐｈｅ　１４をプラスミドρｈｅＴ
５（ズロースキー（ＺｕｒａＨｓｋｉ）ほか、同書〕か
ら誘導し、殊にｐｈｅ　Ｔ　５からの２．１−ｋｂ　　
ｐｈｅＡ含有１！ｃｏＲＩ−Ｂａｍ　ＨＩフラグメント
を、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲｒおよびＢａａ　ＦＩ
　Ｉで制限したベクターｐＢＲ３２２中へ連結したく第
５図参照）。プラスミドｔｙｒ　２５もまたプラスミド
ｐｈｅ　Ｔ５から誘導し、殊にｐｈｅ　Ｔ５からの２．
８−ｋｂ　ｔｙｒ　Ａ含有Ｂａ１ｌＩＨＩフラグメント
を、エンドヌクレアーゼＢａｓ＋　ＨＩで制限したベク
ターρＢＲ３２２中へ連結した（第６図参照）。

プラスミドｐｈｅａｒｏ２は、ｔｙｒＡ遺伝子を含むＲ
ａｍ　ＨＩフラグメントを第７図に示した配向でプラス
ミドｐｈｅ　１４のＢａＩＩＨ［部位中へ連結すること
により構築した。

実施例　２ ｐｈｅ遺伝子のアテニュエーター領域の部分欠失ｐｈｅ
Ａ遺伝子のプロモーターおよびリーダー領域の制限地図
をズロースキー（ＺｕｒａＨｓｋｉ）はか（同書）によ
り開示されたヌクレオチド配列から演暉した。その末端
モード中のアテニュエーター領域の提二次構造（塩基７
１〜１４２）は第２図に示される。アテニュエーターの
塩基１２０〜１３７を欠失させ、欠失含有フラグメント
がオリゴヌクレオチドとしてｐｈｅＡオペロンの突然変
異に使用される。

第３図について説明すると、まずｐｈｅ　１４のＨｐａ
　Ｉｆダイジエスション（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　）から
の６３０−ｂｐフラグメント（実施例１参照）を調製し
て分離し、適当なフラグメントは大きさくアクリルアミ
ドゲル中の泳動）により、およびその制限エンドヌクレ
アーゼマツピングにより確認される。

このフラグメントをＨａｅ　ｍでダイジェストすると３
つのフラグメント：　４４０　ｂｐのＨｐａ　Ｉｆ　−
ＨａｅｌｌＩ、１７ｂｐの１ｌａｅ　Ｉ［−１１ａｅｎ
ｌ、および１７３ｂｐのＨａｅｎＩ−Ｈｉｅ　ＩＩ、が
生ずる。４４０−ｂｐおよび１７３−１）ｐのフラグメ
ントを精製し、それらのそれぞれのＨａｅ　ｍ端で連結
するとＨｐａ　ｆｆ　−ＨｐａＩ［６１３−ｂｐフラグ
メントが生ずる。　６１３−ｈｐフラグメントを次いで
ｐＢＲ３２２のＣ１ａ　Ｉ位置中へ連結すると、Ｉ（ｐ
ａ　ＩＩおよびＣ１ａ　ｒのそれぞれの伸長端が相補性
であるので６１３−ｂｐフラグメントは直接Ｃ１ａ　Ｌ
　５　’伸長端中へ連結できる。

変異したアテニュエーター領域を含む２２７−ｂｐ〕。

ラグメントを次にＨｈａ　１でベクターから切り出す。

次いで２２７−ｂｐフラグメントをオリゴヌクレオチド
プライマーとして第４図に例示するように遺伝子（例え
ばｐｈｅ　１４、ｐＭａｒｏ２　）を含む任意の適当な
ベクター中のｐｈｅＡ遺伝子の突然変異に用いる。

実施例　３ ａｒｏＦ遺伝子に対するｐｈｅＡコーディング領域の融
合ｐｈｅＡ遺伝子のアテニュエーターおよびオペレータ
ーを不活性化する別法として、ρｈｅＡ遺伝子のコーデ
ィング領域〔すなわち、プロモーター、オペレーターお
よびリーダー領域を欠く　（転写されるが翻訳されない
遺伝子の部分）〕をｐｈｅＡ遺伝子の発現がａｒｏＦプ
ロモーターの制御下にあるようにａｒｏＦ遺伝子に融合
するこ−とができる。ｐｈｅＡ遺伝子のリーダー領域は
十分に確認されている〔ズロースキー（Ｚｕｒａｗｓｋ
ｉ）ほか、同り、従って、Ｓｔｕ　Ｉによる制限はアテ
ニュエーター領域から下流の、しかし構造コーディング
領域の上流の遺伝子を切断する。第８図について説明す
ると、出発物質としてｐｈｅ＾コーディング領域を含む
１．４ｋｂ　　Ｓｔｕ　Ｉ−ＢａｌｗＨＩフラグメント
がプラスミドｐｈｅ　１４から精製される。ａｒｏＦ遺
伝子を含むプラスミドｔｙｒ　２５を次いでＮｄｅ　Ｉ
　　（ａｒｏＦコーディング領域内）　、Ｐｖｕ■　（
コーディング領域のカルボキシ末端付近）またはＢｇｌ
　ＩＩ　（コーディング領域の下流）で制限する。　Ｓ
ｔｕ　Ｉ　−Ｒａｎ　ＩＩ　Ｉ　　ｐｈｅＡを含むフラ
グメントを、必要なときにはリンカ−を用いて、これら
のベクターのそれぞれに連結する。それぞれの構築はｐ
ｈｅ＾およびａｒｏＦプロモーターからのａｒｏＦ遺伝
子の両方の発現を生じ、従ってオペロンは細胞中のチロ
シンの量により調節される。

ａｒｏＦのＮｄｅ　Ｅ位置をｐｈｅＡのＳｔａ　ｒに融
合する構築は機能性ａｒｏＦ遺伝子を生じないことが認
められる。

実施例　４ 宿主ゲノム中のｔｙｒＡオペロンの不活性化上記プラス
ミドに所望の結果を達成するために、宿主細胞はチロシ
ンに対する栄養要求性でなければならない、そうでない
と生ずるコリスメートの若干の部分がフェニルアラニン
生成よりもむしろチロシンに転用されよう、従って、ゲ
ノムｔｙｒＡ遺伝子を不活性化しなければならない。こ
れはＴａ２を含むλファージ〔ラムダｂ　２２１ｃ１８
５７：　：　Ｔａ２　。

デー・ベルブ（Ｄ　、Ｂｅｒｇ　）から〕を用いるトラ
ンスポゾン突然変異誘発によりなすことができる。

大腸菌菌株Ｗ３１１０　ｔｒｐ　Ｒｔｎａ＾をラムダニ
：Ｔａ２で感染し、カナマイシン耐性（トランスポゾン
Ｔｎ５マーカー）およびチロシン栄養要求性に対して選
択する０次いで選択菌株をｔｒｐ　２５　（これは機能
性ｔｙｒＡ遺伝子を含む）で形質転換する。相補性が生
ずれば栄養要求性を生ずる突然変異が所望のようにｔｙ
ｒ遺伝子中にある。トランスボゾンＴｎ５がｔｙｒ＾遺
伝子中に挿入されることを証明するため、相補性を示す
菌株から染色体ＤＮＡをエンドヌクレアーゼＢｃｏ　Ｒ
ｒまたはＢａｓ＋　ＨＩで制限し、生じたダイジェスト
（ｄｉｇｅｓｔ　）をゲル上で試験し、ＤＮＡをニトロ
セルロース上にプロットする。

ＤＮＡパターンはｔｙｒＡ遺伝子およびトランスボゾン
Ｔｎ５の領域に相当するＤＮＡフラグメントでプローブ
する。２つのプローブがゲノム上の同じ位置にハイブリ
ッド形成されていることを示すダイジェストはトランス
ポゾンＴｎ５が染色体ｔｙｒＡ遺伝子に挿入されたこと
を確認する。

適当に確認された菌株、例えば−３１１ｔｙｒ　Ｒｔｎ
ａ＾−ｔｙｒＡ：　：　Ｔａ２　　（またＲＴＣ３９と
称される）を次いで上記ベクターで形質転換しフェニル
アラニンを過剰産生ずる菌株を構築する。

実施例　５ ＲＴＣＱ中のｐｈｅａｒｏ２の発酵 プラスミドｐｈｅａｒｏ２を宿主ＲＴＣ９中へ形質転換
する。生じた産生菌株のフェニルアラニンを作る能力は
、１００　ｍｌの規定培地を入れた５００　ｍｌの三角
フラスコ中でそれを成長させることにより試験した。培
地は（毎リットル）グルコース５０ｇ、リン酸カリウム
０．５ｇ、塩化アンミニラム５．８ｇ、塩化第二鉄１０
■、塩化マグネシウム０．８ｇ、硫酸カリウム０．３６
ｇ、千ロジン８０曙、クエン酸ナトリウム１．５ｇ、炭
酸カルシウム４％および微量元素溶液０．１６ｍ１から
なる。　　（＃ｉｔ元素溶液はＮＨ４ＭｏＯ↑３μＭ、
１１３Ｂ０３　４００　μＭＳＣｕＳＯ４１０＃Ｍ、Ｍ
ｎＣ１ｚ　８０／ｊ　Ｍ　、　ＺｎＳＯ４１０／ｊ　Ｍ
である。）３７℃における４８〜６０時間の発酵時間で
典型的に９〜１０　ｇ／Ｉｔのフェニルアラニンの産生
を生ずる。

実施例　６ ａｒｏＦ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの指向した試
験管内突然変異誘発を亜硝酸〔ウオーバートン（！／Ｊ
ａｒｂｕｒＬｏｎ　）ほか、（１９８３）ニュークリー
ク・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　　Ｒｅ
ｓ　、　）ＩＬ　５８３７と同様の方法で〕、またはア
バルズアはか（＾ｂａｒｚｕａ　ａｎｄ　Ｍａｒｉａｎ
ｓ　）　（１９８４）　＊プロシーディング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　）　８１．２
０８０により記載されたと同様の方法でフラグメントに
沿うランダム地点における特異性ヌクレオチドの誤取込
を用いて行なう。後者の手順ではａｒｏＦを含むプラス
ミドがリボヌクレアーゼｒまたは制限エンドヌクレアー
ゼｌ１ｐａ　ＩＩで切り込まれ、次いでエキソヌクレア
ーゼ■に種々の時間限定暴露される。次いでチオ含有ヌ
クレオチドをＤＮＡ中へ誤取込みさせ、次にＤＮＡポリ
メラーゼ■で修復し、Ｔ２ＯＮ　Ａリガーゼで連結する
。フィードバック耐性ａｒｏＦ遺伝子生成物を含むコロ
ニーを次いで３−フルオロチロシン、チロシン類似体、
上の成長に対するそれらの能力に基いて分離する。

変異が実際にチロシンに対するフィードバック耐性を生
ずることがＤ　Ａ　ＩＩ　Ｐシンセターゼに対する酵素
検定により証明され、この場合にａｒｏＦインコード酵
素はもはやチロシンにより阻害されず、通常野生型対立
遺伝子は活性が１１１１Ｍチロシンにより９３％阻害さ
れる酵素をインコードする。

実施例　７ オペレーター構成のａｒｏＦ遺伝子を含むプラスミドの
構築 オペレーター構成の突然変異を得る手順は、オペレータ
ーおよびプロモーターを含むＤＮＡフラグメントが突然
変ｌ！６誘発にさらされたものであることを除いて実施
例６に記載された手順と同様である。スクリーニング手
法もまた同様、すなわち、３−フルオロチロシン上の成
長能力であるが、しかし酵素検定は異なる。この場合、
ａｒｏＦによりインコードされたＤＡＨＰシンセターゼ
の通常より多い量が培地中のチロシンの存在に無関係に
なされるが、しかし１　ｍＭのチロシンがやはりａｒｏ
Ｆ遺伝子生成物を阻害する。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐｈｅ　ｓ　ｉｒｐおよびｔｙｆが産生され調
節される大腸菌中の生化学経路の略図であり、第２図は
大腸菌中のｐｈｅＡ−アテニュエーター領域の配列であ
り、 第３図は大腸菌のｐｈｅＡ−アテニュエーターを不活性
化する方法の略図であり、 第４図はプラスミド上のｐｈｅＡ−アテニュエーターを
部位特異性突然変異誘発する階段の略図であり、 第５図はプラスミドｐｈｅ　１４の構築の略図であり、
第６ＷＪはプラスミドｔｙｒ　２５の構築の略図であり
、第７図はプラスミドｐｈｅａｒｏ２の構築の略図であ
り、 第８図はｐｈｅＡ遺伝子のコーディング領域をａｒｏＦ
に連結する構築の略図である。 コ コ ＾０ ψ １−　　　　ｄ 手続補正書く方式） ２・発明０名４°　　高誘誤社寺ｇ里門場、Ｈ，４４ｇ
−ｖ３、補正をする者 事件との関係　　出願人 名称　　　エンジニツクス　インコーホレーテッド４、
代理人 顆書に最初に添付した明細書の浄書 （内容に変更なし）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物の染色体ＤＮＡを改変する段階および（ま
   たは）前記微生物を少くとも１つの発現ベクターで形質
   転換する段階を含み、前記改変またはベクターが、 （ａ）前記アミノ酸の生合成に必要な少くとも１つの酵
   素の過剰発現、 （ｂ）前記アミノ酸の生合成に必要な少くとも１つの遺
   伝子の突然変異誘発による前記アミノ酸の発現のフィー
   ドバック阻害の排除、 および （ｃ）段階（ａ）における前記酵素の発現を阻害または
   抑制する生成物を生ずる少くとも１つの遺伝子の不活性
   化、 を生ずる微生物中のアミノ酸を過剰発現する方法。