JP3550766B2 - 自律複製配列を有するｄｎａ断片、その塩基配列、及びその利用 - Google Patents
自律複製配列を有するｄｎａ断片、その塩基配列、及びその利用 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、コリネ型細菌染色体に由来する自律複製配列を有するＤＮＡ断片及びそれが導入された環状ＤＮＡに関する。
染色体に由来する自律複製配列を有するＤＮＡ領域（以下これを「ａｒｓ（Ａｕｔｏｍｏｎｏｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）領域」ということがある）とは、染色体の複製開始に必要とされるＤＮＡ領域又はその一部のＤＮＡ領域を意味するものである。コリネ型細菌染色体に由来するａｒｓ領域を含むＤＮＡ断片を適当な薬剤耐性マーカーとなりうるベクターと連結することにより、コリネ型細菌内で１〜２コピーの低コピー数で存在し、自律複製可能な環状ＤＮＡを造成することができる。この低コピー数ベクターは、高発現化により細胞に悪影響を与える遺伝子のクローニング等に有効である。
【０００２】
【従来の技術】
微生物由来の自律複製配列を有する配列を含む領域であるａｒｓ領域は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）由来のもの〔プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、７４、５４５８ 〜 ５４６２ （１９７７）参照〕、シュードモナス・プチダ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のもの〔モレキュラー・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．）、２１５、３８１ 〜 ３８７ （１９７９）参照〕、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）由来のもの〔エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、 ４、３３４５〜３３５０ （１９８５） 参照〕、マイクロコッカッス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）由来のもの〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、９３、７３〜７８ （１９９０） 参照〕、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｏｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）由来のもの〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ）、１７４ 、２６８８〜２６９３ （１９９２） 参照〕等がよく研究されている。
【０００３】
しかしながら、産業上重要なコリネ型細菌由来のａｒｓ領域については本発明者らの知る限り、従来の報告例はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、コリネ型細菌内に低コピー数で存在し自律複製するベクターの造成に利用可能な、コリネ型細菌染色体由来のａｒｓ領域を含むＤＮＡ断片を提供するためになされたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、コリネ型細菌染色体に由来する自律複製配列を有する領域（ａｒｓ領域）を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片が導入されたコリネ型細菌内で自律複製可能な環状ＤＮＡ及び該環状ＤＮＡベクターで形質転換されたコリネ型細菌を提供するものである。
【０００６】
本発明のａｒｓ領域ＤＮＡ断片を用いることにより、コリネ型細菌内で自律複製し、低コピー数、すなわち１〜２コピー数で存在しうる環状ＤＮＡを造成することができる。この環状ＤＮＡベクターは、プラスミドベクター、ファージベクターと同様に遺伝子のクローニング等に有効である。また、特に宿主細胞に悪影響を与える遺伝子のクローニング等に利用可能であると考えられる。
【０００７】
以下に、本発明の断片について詳細に説明する。
本発明のａｒｓ領域を含むＤＮＡ断片（以下これを「ａｒｓ領域ＤＮＡ断片」ということがある）は、その塩基配列が決定された後においては合成することも可能であるが、通常はコリネ型細菌染色体からクローニングされる。
【０００８】
ここで、「コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ ｂａｃｔｅｒｉａ ）」とはバージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔（Ｂａｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ） 、８ 、５９９ （１９７４） 〕に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有さない桿菌を意味し、その具体例として、例えばブレビバクテリウム・アンモニアゲネス （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ） ＡＴＣＣ ６８７１、ブレビバクテリウム・デイバリカタム （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ） ＡＴＣＣ １４０２０、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ） ＡＴＣＣ １３８６９ 、ブレビバクテリウム・リネンス （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｎｅｎｓ） ＡＴＣＣ ９１７４、ブレビバクテリウム・フラバム （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ） ＡＴＣＣ １３８２６ 、ブレビバクテリウム・フラバム （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ） ＭＪ−２３３ （ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７） 、コリネバクテリウム・グルタミカム （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ） ＡＴＣＣ １３０３２、同ＡＴＣＣ １３０６０、コリネバクテリウム・リリウム （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ） ＡＴＣＣ １５９９０、コリネバクテリウム・メラセコラ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ＡＴＣＣ １７９６５ 等を挙げることができる。
【０００９】
これらコリネ型細菌に属する微生物の中で、ａｒｓ領域ＤＮＡ断片の供給源としては、殊にブレビバクテリウム・フラバム （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）およびその由来株が有利に利用される。
本発明のａｒｓ領域ＤＮＡ断片は、上記コリネ型細菌染色体上に存在し、コリネ型細菌から抽出した染色体ＤＮＡ（特開平４−２７８０８８、実施例２参照）を鋳型として適当なプライマーを選択して、ＰＣＲ反応により増幅させることにより、取得することができる。
【００１０】
微生物染色体の自律複製配列を有するＤＮＡ領域であるａｒｓ領域は、微生物染色体の複製開始点（ｏｒｉＣ）を含み、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）由来のもの〔プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、７４、５４５８ 〜 ５４６２ （１９７７）参照〕、シュードモナス・プチダ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のもの〔モレキュラー・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．）、２１５、３８１ 〜 ３８７ （１９７９）参照〕、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）由来のもの〔エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、 ４、３３４５〜３３５０ （１９８５） 参照〕、マイクロコッカッス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）由来のもの〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、９３、７３〜７８ （１９９０） 参照〕等がよく研究されており、塩基配列が決定されている。これら４種の微生物のａｒｓ領域のＤＮＡ塩基配列の解析の結果、ａｒｓ領域と考えられる領域はｒｐｍＨ遺伝子とｄｎａＮ遺伝子の間に挟まれる形で存在するｄｎａＡ遺伝子の近傍に存在することが示されている。そこで、これら４種の微生物のＤＮＡ塩基配列より推定されるＤｎａＡ、ＲｐｍＨおよびＤｎａＮタンパク質アミノ酸配列間で保存されている領域、特にＤＮＡ塩基配列においても特に保存されている領域を検討し、適当なプライマーを設計し、コリネ型細菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、ａｒｓ領域を増幅し、取得することができる。
【００１１】
このようにして得られるａｒｓ領域ＤＮＡ断片の１つは、前記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、ｒｐｍＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計されたプライマー、例えば下記ＲＰＭＨ−１及びｄｎａＮ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計されたプライマー、例えば下記ＤＮＡＮ−１の２種のプライマーを用いて、ＰＣＲ反応により増幅させることによって得られる大きさが約３．５ｋｂのＤＮＡ断片（以下これを「Ｃ断片」ということがある）をあげることができる。
【００１２】
（配列中、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、ＫはＴ又はＧ、ＳはＧ又はＣ、ＭはＣ又はＡ、ＶはＡ、Ｇ、又はＣ、ＢはＧ、Ｃ又はＴ、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示す。ここでＡはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃ はシトシン、Ｔはチミンを示す。）このａｒｓ領域ＤＮＡ断片を、各種の制限酵素で切断した時の認識部位数及び切断断片の大きさを第１表に、その制限酵素切断点地図を図１に示す。
【００１３】
【表１】
第１表 大きさが約３．５ｋｂのＤＮＡ断片
制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ）
ＥｃｏＲＩ ３ １．１、１．０、０．９、０．５
ＨｉｎｄＩＩＩ ４ １．８、１．４、０．１６、０．０７、０．０７
ＳａｌＩ １ ２．３、１．２
【００１４】
なお、本明細書において、制限酵素による「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、制限酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な断片の数から決定した値を採用した。
【００１５】
また、「切断断片の大きさ」及びプラスミドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切断ＤＮＡ断片の各ＤＮＡ断片の大きさを算出する。
【００１６】
上記した大きさが約３．５ｋｂの増幅ＤＮＡ断片は、そのままａｒｓ領域ＤＮＡ断片として利用することができるが、更に次に述べる方法により複製に必要なＤＮＡ領域に縮小化後に利用することもできる。
すなわち、前記したとおり、ａｒｓ領域は、ｄｎａＡ遺伝子の上流及び下流にそれぞれｒｐｍＨ遺伝子とｄｎａＮ遺伝子に挟まれる形で存在しており、ｄｎａＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計された適当なプライマーと、前記したｒｐｍＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計された適当なプライマー及びｄｎａＮ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計された適当なプライマーをそれぞれ用いて、前記ＭＪ−２３３株染色体ＤＮＡまたは大きさが約３．５ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を鋳型として、ＰＣＲ法により、ｄｎａＡ遺伝子の上流及び下流に存在するｏｒｉＣ領域部分ＤＮＡ断片を増幅することにより、縮小化されたｏｒｉＣ領域を取得することができる。
【００１７】
上記で用いるｄｎａＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計された適当なプライマーとしては、例えば、下記ＤＮＡＡ−３及びＤＮＡＡ−４の２種のプライマーを挙げることができる。
（配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃ はシトシン、Ｔはチミンを示す。）
【００１８】
かくして得られる縮小化されたｏｒｉＣ領域の部分ＤＮＡ断片としては、例えば、上記ＲＰＭＨ−１とＤＮＡＡ−３の２種のプライマーを用いて増幅される大きさ約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（以下これを「Ａ断片」ということがある）、このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩで分解して得られる大きさが約１．２ｋｂのＤＮＡ断片（以下これを「Ｄ断片」ということがある）、上記ＤＮＡＡ−４とＤＮＡＮ−２の２種のプライマーを用いて増幅される大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。
【００１９】
これら大きさが約１．７ｋｂ、約１．２ｋｂ及び約１．５ｋｂのｏｒｉＣ領域部分ＤＮＡ断片を各種の制限酵素で切断した時の認識部位数及び切断断片の大きさを第２表〜第４表及び図２〜図３にそれぞれ示す。
【００２０】
【表２】
第２表 大きさが約１．７ｋｂのＤＮＡ断片
制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ）
ＢａｍＨＩ ０ １．７
ＥｃｏＲＩ ２ １．０、１．５、０．２
ＨｉｎｄＩＩＩ ２ １．４、０．２、０．１
ＳａｌＩ １ １．２、０．５
【００２１】
【表３】
第３表 大きさが約１．２ｋｂのＤＮＡ断片
制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ）
ＢａｍＨＩ ０ １．２
ＥｃｏＲＩ １ ０．７、０．５
ＨｉｎｄＩＩＩ ０ １．２
ＳａｌＩ ０ １．２
【００２２】
【表４】
第４表 大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片
制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ）
ＢａｍＨＩ １ １．２、０．３
ＥｃｏＲＩ １ ０．９、０．６
ＨｉｎｄＩＩＩ ２ １．２、０．２、０．１
ＰｖｕＩＩ ２ ０．７ ０．５ ０．３
ＳａｌＩ ０ １．５
ＸｈｏＩ １ ０．９、０．６
【００２３】
上記ＤＮＡ断片は、その塩基配列をジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ 法）〔Ｓａｎｇｅｒ Ｆ． ｅｔ ａｌ．、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、７４、５４６３、（１９７７）〕等により決定することができる。
このようにして決定した上記大きさ約３．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｃ断片）の配列を後記配列表の配列番号１に示す。この配列中に存在するオープンリーディングフレームから、ｄｎａＡ遺伝子は、配列中のアミノ酸番号１からアミノ酸番号４６３までのアミノ酸配列をコードするものであることが明らかとなった。上記の複製開始領域を含むＤＮＡ断片は、天然の細菌染色体ＤＮＡ、例えばコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばベックマン社製システム−１プラス（Ｓｙｓｔｅｍ−１ Ｐｌｕｓ）を用いて合成されたものであってもよい。
また、前記の如くブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３等の細菌染色体から取得される本発明のＤＮＡ断片は、コリネ型細菌等の細胞内での複製開始能実質的に損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていても、削除されていてもよく、新たに塩基が挿入されていてもよく、あるいは塩基配列の一部が転移されているものであってもよく、さらにそれらの塩基配列にハイブリダイズする塩基配列であってもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明の染色体複製開始領域を含むＤＮＡ断片に包含されるものである。
【００２４】
上記ａｒｓ領域ＤＮＡ断片を用いて環状ＤＮＡベクターの構築に用いる場合、ｄｎａＡ遺伝子の上流及び下流に由来する２種のＤＮＡ断片、すなわち上記大きさが約１．７ｋｂ又は１．２ｋｂのＤＮＡ断片及び大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を用いることも可能である。
【００２５】
環状ＤＮＡベクターの構築に用いられる前記ａｒｓ領域ＤＮＡ断片に導入されるマーカーＤＮＡ断片としては、コリネ型細菌内でマーカーとして働く遺伝子を含有しているものであれば特に制限はなく、カナマイシン耐性遺伝子を保有するプラスミドｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ２９９（宝酒造製）、クロラムフェニコール耐性遺伝子を保有するプラスミドｐＨＳＧ３９８、ｐＨＳＧ３９９（宝酒造製）等が好適に使用される。
【００２６】
上記マーカーＤＮＡ断片の前記ａｒｓ領域ＤＮＡ断片への導入は、例えば、まずプラスミドｐＨＳＧ２９８を適当な制限酵素により解裂させ、それに前記したａｒｓ領域ＤＮＡ断片を連結酵素処理により結合させることにより行なう。ａｒｓ領域ＤＮＡ断片が部分ＤＮＡ断片である場合は、前記したｄｎａＡ遺伝子の上流及び下流に存在するａｒｓ領域部分ＤＮＡ断片が導入された各プラスミドからａｒｓ領域部分ＤＮＡ断片を切り出すか又はプラスミドを解裂し、連結酵素処理により結合させることにより行なう。
【００２７】
このようにして構築される環状ＤＮＡベクターとしては、例えば、大きさが２．７ｋｂのプラスミドｐＨＳＧ２９８ＤＮＡ断片にｄｎａＡ遺伝子の上流に存在する大きさが１．２ｋｂのＤＮＡ断片および、ｄｎａＡ遺伝子の下流に存在する大きさが１．５ｋｂのＤＮＡ断片が挿入された環状ＤＮＡベクターｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣを挙げることができる。この環状ＤＮＡベクターｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣの構築方法の詳細は後記実施例２で述べる。
【００２８】
本発明による環状ＤＮＡベクターで形質転換し得る微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９９）等が挙げられる。
【００２９】
これらの微生物の他に、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ） ＡＴＣＣ ６８７１、同 ＡＴＣＣ １３７４５ 、同 ＡＴＣＣ １３７４６ 、ブレビバクテリウム・デイバリカタム （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ） ＡＴＣＣ １４０２０、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ） ＡＴＣＣ １３８６９ 、コリネバクテリウム・グルタミカム （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ） ＡＴＣＣ ３１８３１等を宿主微生物として用いることもできる。
【００３０】
尚、宿主としてブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株由来の菌株を用いる場合、本菌株が保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３ー３６７８７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合があるので、そのような場合には、本菌株よりプラスミドｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプラスミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例えば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠失させることも可能であるし、人為的に除去することも可能である〔バクテリオロジカル・レビュー（Ｂａｃｔ． Ｒｅｖ．） 、３６、３６１ 〜４０５ （１９７２）参照〕。
【００３１】
上記コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３への前記プラスミドの形質転換（前記プラスミドの導入）は、ＤＮＡ受容菌にパルス波を通電することにより〔Ｓａｔｏｈ Ｙ． ｅｔ ａｌ． 、ジャーナル・オブ・インダストリアル・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ） 、５ 、１５９ （１９９０） 参照〕行なうことができる。
【００３２】
かくして得られる形質転換株を選択圧下で培養し、生成するコロニーを取得することにより、本発明の環状ＤＮＡベクターで形質転換されたコリネ型細菌を得ることができる。
上記の方法で形質転換して得られる環状ＤＮＡベクターを保有するコリネ型細菌としては、例えば、前記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣを保有するブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ｏｒｉＣ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３０３）を挙げることができる。
【００３３】
本発明の上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣ中に存在する環状ＤＮＡベクター（ｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣ）の確認は、例えば、該形質転換株及び比較として親株、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３のＤＮＡ抽出液を、常法〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ） 、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕に従いゲノミックスサザンハイブリダイゼーションに供し、ａｒｓ領域の検出を行うことにより可能である。この時プローブとしては、前期のＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を、ランダムラベルキット（宝酒造より市販）等によりラベルしたものを用いることができる。また、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＯｒｉＣより得られたＤＮＡ抽出液、および、比較例として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３のＤＮＡ抽出液を鋳型とし、前期４種の微生物のＤＮＡ塩基配列より推定されるＤｎａＡ、ＲｐｍＨおよびＤｎａＮタンパク質アミノ酸配列間で保存されている領域、特にＤＮＡ塩基配列においても特に保存されている領域をもとに設計したプライマーを用い、前述の方法に従ってＰＣＲ反応を行い、得られた反応液をアガロースゲル電気泳動により解析することによりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣ中に存在する環状ＤＮＡベクター（ｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣ）を確認することができる。
【００３４】
【実施例】
以上に本発明を説明してきたが、下記の実施例によりさらに具体的に説明する。
参考例１ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のｄｎａＡ遺伝子断片の一部（ｄｎａＡ断片）のクローン化
【００３５】
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全ＤＮＡの抽出
半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ７ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１１〕１ｌに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲに使用した。
【００３６】
（Ｂ）ＰＣＲプライマーの設計
ｄｎａＡ遺伝子は原核生物では、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）由来のもの〔プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、７４、５４５８ 〜 ５４６２ （１９７７）参照〕、シュードモナス・プチダ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のもの〔モレキュラー・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．）、２１５、３８１ 〜 ３８７ （１９７９）参照〕、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）由来のもの〔エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、 ４、３３４５〜３３５０ （１９８５） 参照〕、マイクロコッカス・ルテウス由来のもの〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、９３、７３〜７８ （１９９０） 参照〕がよく研究されており、塩基配列が決定されている。これら５種の微生物のｄｎａＡ塩基配列より推定されるＤｎａＡタンパク質アミノ酸配列間で保存されている領域、特にＤＮＡ塩基配列においても特に保存されている領域を検討し、下記の２つのプライマーを設計し、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。
【００３７】
（配列中、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、ＭはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示し、ここでＡはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃ はシトシン、Ｔはチミンを示す。）
【００３８】
これら２つのプライマーを用いて上記（Ａ）で調製した染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体上のｄｎａＡ遺伝子部分の増幅により、約５００ｂｐのＰＣＲ反応産物が得られると期待される。
【００３９】
（Ｃ）ＰＣＲ反応
実際のＰＣＲ反応はパーキンエルマーシータス社製のＤＮＡサーマルサイクラーを用いて下記の条件で行った。
反応液：
５０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
鋳型ＤＮＡ ５μｌ
上記（Ｂ）で作製したプライマー 各々０．２５μＭ
ｄＮＴＰｓ 各々２００μＭ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ２．５ｕｎｉｔｓ
以上を混合し、１００μｌとした。
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程：３７℃ １２０秒
エクステンション過程：７２℃ １８０秒
以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。
【００４０】
（Ｄ）反応物の検出
上記（Ｃ）で生成した反応液１０μｌを２％アガロースゲルにより電気泳動を行ったところ約５００ｂｐの断片が検出された。
【００４１】
（Ｅ）増幅断片のクローン化
上記（Ｃ）項で得た反応液３μｌとＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ（ＰＲＯＭＥＧＡより市販）１μｌを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
【００４２】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５３、１５９ （１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１１に溶解〕に塗抹した。
【００４３】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔの長さ３．０ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約５００ｂｐの挿入断片が認められた。
【００４４】
（Ｆ）増幅断片の塩基配列の決定
参考例１の（Ｅ）項で得られた長さが約５００ｂｐの増幅断片について、その塩基配列をジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｚｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）〔Ｓａｎｇｅｒ Ｆ． ｅｔ ａｌ．、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ ）、７４、５４６３（１９７７）〕により決定した。
【００４５】
塩基配列決定の結果、該挿入断片はマイクロコッカス・ルテウス由来のｄｎａＡ断片の一部（ＰＣＲに使用したプライマーによって挟まれる領域）と高いホモロジーを示し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のｄｎａＡ断片の一部をクローニングしたことを確認した。
【００４６】
実施例１ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のａｒｓ領域ＤＮＡ断片のクローン化
（Ａ）ＰＣＲプライマーの設計
微生物染色体の複製に必要とされるＤＮＡ領域であるａｒｓ領域は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）由来のもの〔プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、７４、５４５８ 〜 ５４６２ （１９７７）参照〕、シュードモナス・プチダ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のもの〔モレキュラー・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．）、２１５、３８１ 〜 ３８７ （１９７９）参照〕、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）由来のもの〔エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、 ４、３３４５〜３３５０ （１９８５） 参照〕、マイクロコッカス・ルテウス由来のもの〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、９３、７３〜７８ （１９９０） 参照〕がよく研究されており塩基配列が決定されている。これら４種の微生物のａｒｓ領域のＤＮＡ塩基配列の解析の結果、ａｒｓ領域と考えられる領域はｒｐｍＨ遺伝子とｄｎａＮ遺伝子の間に挟まれる形で存在するｄｎａＡ遺伝子の近傍に存在することが示されている。そこで、これら４種の微生物のＤＮＡ塩基配列より推定されるＲｐｍＨおよびＤｎａＮタンパク質アミノ酸配列間で保存されている領域、特にＤＮＡ塩基配列においても特に保存されている領域を検討し、ｒｐｍＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計した下記プライマーＲＰＭＨ−１及びｄｎａＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計した下記プライマーＤＮＡＮ−１の２つのプライマーを設計し、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。
【００４７】
（配列中、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴ、ＫはＴ又はＧ、ＳはＧ又はＣ、ＭはＣ又はＡ、ＶはＡ、Ｇ、又はＣ、ＢはＧ、Ｃ又はＴ、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示す。
【００４８】
ここでＡはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示す。） なお、ＲＰＭＨ−１の５’末端にはクローニングサイトとして制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位を、ＤＮＡＮ−１の５’末端にはクローニングサイトとして制限酵素ＳａｌＩ認識部位をを付加した。
【００４９】
また、参考例１の（Ｆ）で明らかになったｄｎａＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列をもとに、下記の２つのプライマーを設計し、上記と同様に合成した。
（配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示す。）なお、ＤＮＡＡ−３の５’末端にはクローニングサイトとして制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位を、ＤＮＡＡ−４の５’末端にはクローニングサイトとして制限酵素ＳａｌＩ認識部位を付加した。
【００５０】
これら４つのプライマーを用いて参考例１の（Ａ）で調製した染色体を鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーＲＰＭＨ−１とＤＮＡＮ−１により全ｄｎａＡ遺伝子を含むｏｒｉＣ領域全体が、ＲＰＭＨ−１とＤＮＡＡ−３によりｄｎａＡ遺伝子上流領域が、ＤＮＡＡ−４とＤＮＡＮ−１によりｄｎａＡ遺伝子下流領域がＰＣＲ反応産物として得られると期待される。
【００５１】
（Ｂ）ＰＣＲ反応
参考例の（Ｃ）の方法に従いＰＣＲ反応を行った。
（Ｃ）反応物の検出
上記（Ｂ）で生成した反応液１０μｌを２％アガロースゲルにより電気泳動を行ったところ、プライマーＲＰＭＨ−１とＤＮＡＮ−１により約３．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｃ断片）の増幅が、ＲＰＭＨ−１とＤＮＡＡ−３により約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（Ａ断片）の増幅が、ＤＮＡＡ−４とＤＮＡＮ−１により約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｂ断片）の増幅が検出された。また、プライマーＲＰＭＨ−１とＤＮＡＮ−１により増幅した約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を鋳型としてＰＣＲをおこなった場合、染色体を鋳型として用いた場合と同じように、プライマーＲＰＭＨ−１とＤＮＡＡ−３により約１．７ｋｂのＤＮＡ断片が、ＤＮＡＡ−４とＤＮＡＮ−１により約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が検出された。
【００５２】
プライマーＲＰＭＨ−１とＤＮＡＮ−１により増幅された大きさが約３．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｃ断片）、プライマーＲＰＭＨ−１とＤＮＡＡ−３により増幅された大きさが約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（Ａ断片）、このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩにより切断して得られる大きさが約１．２ｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ断片）、プライマーＤＮＡＡ−４とＤＮＡＮ−１により増幅された大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｂ断片）のそれぞれを各種制限酵素で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果は、前記第１表〜第３表に示した通りであった。これらＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図及び各ＤＮＡ断片の相互関連を図１〜図３に示す。
【００５３】
（Ｄ）増幅ＤＮＡ断片のクローン化
上記（Ｃ）項で得られたＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断したものに、制限酵素ＢａｍＨＩで切断したカナマイシン耐性プラスミドｐＨＳＧ２９８を混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
【００５４】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５３、１５９ （１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１１に溶解〕に塗抹した。
【００５５】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、大きさが２．７ｋｂのプラスミドｐＨＳＧ２９８のＤＮＡ断片に加え、大きさ約１．７ｋｂの挿入ＤＮＡ断片（Ａ断片）が認められた。このプラスミドをｐＨＳＧ２９８−Ａ１と命名した。
【００５６】
また、上記（Ｃ）項で得られたＢ断片を、前記の方法に従いｐＧＥＭ−Ｔ（ＰＲＯＭＥＧＡより市販）にクローニングした。得られたプラスミドを制限酵素ＳａｌＩにより切断し、挿入断片を確認した。この結果、大きさが約３．０ｋｂのプラスミドｐＧＥＭ−ＴＤＮＡ断片に加え、大きさが約１．５ｋｂの挿入断片（Ｂ断片）が認められた。このプラスミドをｐＧＥＭ−Ｂ１と命名した。
【００５７】
（Ｅ）増幅ＤＮＡ断片の塩基配列の決定
上記（Ｄ）項で得られたプラスミドｐＨＳＧ２９８−Ａ１及びｐＧＥＭ−Ｂ１に含まれるＡ断片およびＢ断片について、その塩基配列をジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｚｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）〔Ｓａｎｇｅｒ Ｆ． ｅｔ ａｌ．、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ ）、７４、５４６３（１９７７）〕により決定した。
【００５８】
塩基配列決定の結果、Ａ断片は一方にｒｐｍＨ遺伝子のＮ末領域と、他方にマイクロコッカス・ルテウス由来のｄｎａＡ遺伝子の一部と高いホモロジーを示し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のｄｎａＡ断片の一部及びその上流領域をクローニングしたことを確認した。また、Ｂ断片は一方にｄｎａＮ遺伝子のＮ末領域と、他方にマイクロコッカス・ルテウス由来のｄｎａＡ遺伝子の一部と高いホモロジーを示し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のｄｎａＡ断片の一部及びその下流領域をクローニングしたことを確認した。
【００５９】
実施例２ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３染色体由来の環状ＤＮＡベクターの作成
実施例１の（Ｄ）項で得られたプラスミドｐＨＳＧ２９８−Ａ１をＳａｌＩにより切断すると、ｐＨＳＧ２９８とＡ断片の一部（大きさが約１．２ｋｂのＤ断片）を含む４．２ｋｂのＤＮＡ断片と、Ａ断片の残りの一部分の約０．５ｋｂのＤＮＡ断片とに別れる（図１参照）。この、ｐＨＳＧ２９８とＡ断片の一部（Ｄ断片）を含む４．２ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＧＥＭ−Ｂ１をＢａｍＨＩにより切断することにより得られる１．５ｋｂのＢ断片を上記の方法によりＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。
【００６０】
上記の如く調製されたＤＮＡ混液を用い、電気パルス法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０２除去株を形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に塗抹し３０℃で２〜３日間培養した。出現したカナマイシン耐性株より、常法によりベクターＤＮＡを抽出し、該ベクターを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩにより切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、大きさが２．７ｋｂのプラスミドｐＨＳＧ２９８ＤＮＡ断片に加え、大きさが約１．２ｋｂのＤ断片および、大きさが約１．５ｋｂのＢ断片が認められた。
【００６１】
本環状ＤＮＡベクターをｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣと命名した。得られた環状ＤＮＡベクターを各種制限酵素で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を下記の第５表に示す。また環状ＤＮＡベクターｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣの制限酵素切断点地図を図４に示す。
【００６２】
【表５】
第５表
制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ）
ＢａｍＨＩ ２ ３．９、１．５
ＥｃｏＲＩ ３ ３．６、１．３、０．５
ＨｉｎｄＩＩＩ ４ ３．６、１．２、０．５、０．１
ＳａｌＩ ２ ３．９、１．５
ＸｈｏＩ １ ５．４
【００６３】
得られた環状ＤＮＡベクターを用いて、電気パルス法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０２除去株を形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に塗抹し３０℃で２〜３日間培養したところ、多数の形質転換株が得られ、得られた環状ＤＮＡベクターはコリネ型細菌内でａｒｓ領域ＤＮＡ断片として複製していることが確認された。
【００６４】
なお、環状ＤＮＡベクターｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣにより形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣは、茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究所に、平成４年１１月２４日付で：微工研菌寄第１３３０３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３０３）として寄託されている。
【００６５】
実施例３ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣ中に存在する環状ＤＮＡベクター（ｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣ）の確認およびコピー数の測定
上記参考例１（Ａ）項の方法に従い、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣより全ＤＮＡを抽出した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣより得られたＤＮＡ抽出溶液、および、比較例として、参考例１（Ａ）項で得られたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３のＤＮＡ抽出溶液を、常法に従い〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ）、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）〕ゲノミックサザンハイブリダイゼーションに供し、ａｒｓ領域の検出を行った。この時プローブとしては、実施例１の（Ｃ）で得られたＡ断片を、ランダムラベルキット（宝酒造より市販）によりラベルしたものを用いた。
【００６６】
この結果、染色体由来と考えられるバンドの他に環状ＤＮＡベクター（ｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣ）由来と考えられるバンドが検出された。両者のバンドの濃さの比較より１細胞当たりの環状ＤＮＡベクターのコピー数は、１〜２と考えられた。
【００６７】
また、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣより得られたＤＮＡ抽出溶液、および、比較例として、実施例１（Ａ）項で得られたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３のＤＮＡ抽出溶液を鋳型とし、実施例１の（Ａ）項で用いたＲＰＭＨ−１およびＤＮＡＮ−１をプライマーとして用い、前述の方法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた反応液をアガロース電気泳動により解析したところ、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３のＤＮＡ抽出溶液を鋳型としたＰＣＲ反応液からは、約３．５ｋｂのＤＮＡ断片のみが検出されるのに対し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣのＤＮＡ抽出溶液を鋳型とした反応液からは、約３．５ｋｂのＤＮＡ断片の他に、約２．７ｋｂの環状ＤＮＡベクター由来と考えられるＤＮＡ断片が検出された。
【００６８】
実施例４ ａｒｓ領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
上記実施例１の（Ｃ）項で得られたａｒｓ領域を含む大きさ約３．５ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を下記の操作により決定し、また、このＤＮＡ断片上に存在するｄｎａＡ遺伝子の存在部位を特定した。
まず、大きさ約３．５ｋｂのＤＮＡ断片溶液 １４μｌを制限酵素Ｓａｕ３Ａ〓を用いて３７℃で１〜５分間処理してＤＮＡ断片を部分分解した。次に、クローニングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造製）を制限酵素ＢａｍＨ〓で切断した。得られたベクター断片と部分分解ＤＮＡ断片とを混合し、この混合液にそれぞれ最終濃度が５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．６），１０ｍＭ ジオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔとなるように各成分を添加し、ベクター断片と部分分解ＤＮＡ断片とを結合させた。
【００６９】
上記と同様に大きさ約３．５ｋｂのＤＮＡ断片溶液 １４μｌを制限酵素Ｔａｑ〓 ５０ｕｎｉｔと５〜８分間反応させて部分分解ＤＮＡ断片を調製した。 クローニングベクターｐＵＣ１１８を制限酵素Ａｃｃ〓で切断した後、これを上記と同様にして部分分解ＤＮＡと結合させた。
【００７０】
得られたプラスミド混液を用い、常法［Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５３， １５９（１９７０）参照］によりエシエリヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリンを５０μｇ含む前記のＬ培地に塗抹した。
上記培地に生育した菌株を常法に従い液体培養し、得られた培養物よりプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラスミドＤＮＡを用いて、ベクターｐＵＣ１１８に挿入された部分分解ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシヌクレオチド酵素法［ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ， Ｓａｎｇｅｒ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７４， ５４６３（１９７７）参照］により決定した。
【００７１】
具体的には、上記培養物より抽出したプラスミドＤＮＡをパーキン・エルマー社製カタリスト８００モレキュラー・バイオロジー・ラボステーション（ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｓｔａｔｉｏｎ ； Ｐｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてプロトコールに従い反応させた後、パーキン・エルマー社製 ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサーにより各々のプラスミドの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。そして、これらの個々の配列の連結は、パーキン・エルマー社製のシークエンス解析ソフト インヘリット（ＩＮＨＥＲＩＴ）を用いて行い、大きさ約３．５ｋｂのＤＮＡ断片の全塩基配列を決定した。その配列を後記配列表の配列番号：１に示す。
決定した塩基配列中にはオープンリーディングフレームの存在が認められ（塩基番号８８０〜２４５１；５２４アミノ酸）、既知のマイクロコッカス・ルテウス由来のｄｎａＡ遺伝子〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、９３、７３〜７８ （１９９０） 参照〕との相同性の比較により、それがブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３のｄｎａＡ遺伝子であることが判明した。さらに、ｄｎａＡ遺伝子の上流にｒｐｍＨ遺伝子の一部が（塩基番号３２〜９）存在し、ｄｎａＡ遺伝子の下流にはｄｎａＮ遺伝子の一部分（塩基番号２９７８〜３５１４）が存在していることが確認された。このことより、ａｒｓ領域は、ｄｎａＡ遺伝子およびｒｐｍＨ遺伝子の間、および、ｄｎａＡ遺伝子およびｄｎａＮ遺伝子の間の領域に存在することが確認された。
【発明の効果】
本発明により、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３染色体に由来するａｒｓ領域を含むＤＮＡ断片が提供される。本発明のＤＮＡ断片を用いて造成される環状ＤＮＡベクターは、コリネ型細菌内で低コピー数で存在し、自律複製可能であり、該環状ＤＮＡベクターを用いることにより、高コピー数存在すると宿主コリネ型細菌に悪影響を与える遺伝子等のクローニングが可能となる。
【００７２】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３５２１
鎖の数：二本鎖
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
起源
生物名：ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）
株名：ＭＪ−２３３
配列の特徴：
特徴を表す記号：ＲＥＰ
存在位置：１〜３５２１
特徴を決定した方法：Ｅ
【００７３】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の大きさが約３．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｃ断片）の制限酵素切断点地図並びに該ＤＮＡ断片と大きさが約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（Ａ断片）、大きさが約１．２ｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ断片）及び大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｂ断片）との相互関係を示す図。
【図２】本発明の大きさが約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（Ａ断片）および大きさが約１．２ｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ断片）の制限酵素切断片地図
【図３】本発明の大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｂ断片）の制限酵素切断片地図
【図４】本発明のプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣの制限酵素切断片地図
【産業上の利用分野】
本発明は、コリネ型細菌染色体に由来する自律複製配列を有するＤＮＡ断片及びそれが導入された環状ＤＮＡに関する。
染色体に由来する自律複製配列を有するＤＮＡ領域（以下これを「ａｒｓ（Ａｕｔｏｍｏｎｏｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）領域」ということがある）とは、染色体の複製開始に必要とされるＤＮＡ領域又はその一部のＤＮＡ領域を意味するものである。コリネ型細菌染色体に由来するａｒｓ領域を含むＤＮＡ断片を適当な薬剤耐性マーカーとなりうるベクターと連結することにより、コリネ型細菌内で１〜２コピーの低コピー数で存在し、自律複製可能な環状ＤＮＡを造成することができる。この低コピー数ベクターは、高発現化により細胞に悪影響を与える遺伝子のクローニング等に有効である。
【０００２】
【従来の技術】
微生物由来の自律複製配列を有する配列を含む領域であるａｒｓ領域は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）由来のもの〔プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、７４、５４５８ 〜 ５４６２ （１９７７）参照〕、シュードモナス・プチダ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のもの〔モレキュラー・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．）、２１５、３８１ 〜 ３８７ （１９７９）参照〕、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）由来のもの〔エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、 ４、３３４５〜３３５０ （１９８５） 参照〕、マイクロコッカッス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）由来のもの〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、９３、７３〜７８ （１９９０） 参照〕、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｏｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）由来のもの〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ）、１７４ 、２６８８〜２６９３ （１９９２） 参照〕等がよく研究されている。
【０００３】
しかしながら、産業上重要なコリネ型細菌由来のａｒｓ領域については本発明者らの知る限り、従来の報告例はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、コリネ型細菌内に低コピー数で存在し自律複製するベクターの造成に利用可能な、コリネ型細菌染色体由来のａｒｓ領域を含むＤＮＡ断片を提供するためになされたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、コリネ型細菌染色体に由来する自律複製配列を有する領域（ａｒｓ領域）を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片が導入されたコリネ型細菌内で自律複製可能な環状ＤＮＡ及び該環状ＤＮＡベクターで形質転換されたコリネ型細菌を提供するものである。
【０００６】
本発明のａｒｓ領域ＤＮＡ断片を用いることにより、コリネ型細菌内で自律複製し、低コピー数、すなわち１〜２コピー数で存在しうる環状ＤＮＡを造成することができる。この環状ＤＮＡベクターは、プラスミドベクター、ファージベクターと同様に遺伝子のクローニング等に有効である。また、特に宿主細胞に悪影響を与える遺伝子のクローニング等に利用可能であると考えられる。
【０００７】
以下に、本発明の断片について詳細に説明する。
本発明のａｒｓ領域を含むＤＮＡ断片（以下これを「ａｒｓ領域ＤＮＡ断片」ということがある）は、その塩基配列が決定された後においては合成することも可能であるが、通常はコリネ型細菌染色体からクローニングされる。
【０００８】
ここで、「コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ ｂａｃｔｅｒｉａ ）」とはバージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔（Ｂａｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ） 、８ 、５９９ （１９７４） 〕に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有さない桿菌を意味し、その具体例として、例えばブレビバクテリウム・アンモニアゲネス （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ） ＡＴＣＣ ６８７１、ブレビバクテリウム・デイバリカタム （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ） ＡＴＣＣ １４０２０、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ） ＡＴＣＣ １３８６９ 、ブレビバクテリウム・リネンス （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｎｅｎｓ） ＡＴＣＣ ９１７４、ブレビバクテリウム・フラバム （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ） ＡＴＣＣ １３８２６ 、ブレビバクテリウム・フラバム （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ） ＭＪ−２３３ （ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７） 、コリネバクテリウム・グルタミカム （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ） ＡＴＣＣ １３０３２、同ＡＴＣＣ １３０６０、コリネバクテリウム・リリウム （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ） ＡＴＣＣ １５９９０、コリネバクテリウム・メラセコラ （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ） ＡＴＣＣ １７９６５ 等を挙げることができる。
【０００９】
これらコリネ型細菌に属する微生物の中で、ａｒｓ領域ＤＮＡ断片の供給源としては、殊にブレビバクテリウム・フラバム （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）およびその由来株が有利に利用される。
本発明のａｒｓ領域ＤＮＡ断片は、上記コリネ型細菌染色体上に存在し、コリネ型細菌から抽出した染色体ＤＮＡ（特開平４−２７８０８８、実施例２参照）を鋳型として適当なプライマーを選択して、ＰＣＲ反応により増幅させることにより、取得することができる。
【００１０】
微生物染色体の自律複製配列を有するＤＮＡ領域であるａｒｓ領域は、微生物染色体の複製開始点（ｏｒｉＣ）を含み、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）由来のもの〔プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、７４、５４５８ 〜 ５４６２ （１９７７）参照〕、シュードモナス・プチダ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のもの〔モレキュラー・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．）、２１５、３８１ 〜 ３８７ （１９７９）参照〕、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）由来のもの〔エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、 ４、３３４５〜３３５０ （１９８５） 参照〕、マイクロコッカッス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）由来のもの〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、９３、７３〜７８ （１９９０） 参照〕等がよく研究されており、塩基配列が決定されている。これら４種の微生物のａｒｓ領域のＤＮＡ塩基配列の解析の結果、ａｒｓ領域と考えられる領域はｒｐｍＨ遺伝子とｄｎａＮ遺伝子の間に挟まれる形で存在するｄｎａＡ遺伝子の近傍に存在することが示されている。そこで、これら４種の微生物のＤＮＡ塩基配列より推定されるＤｎａＡ、ＲｐｍＨおよびＤｎａＮタンパク質アミノ酸配列間で保存されている領域、特にＤＮＡ塩基配列においても特に保存されている領域を検討し、適当なプライマーを設計し、コリネ型細菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、ａｒｓ領域を増幅し、取得することができる。
【００１１】
このようにして得られるａｒｓ領域ＤＮＡ断片の１つは、前記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、ｒｐｍＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計されたプライマー、例えば下記ＲＰＭＨ−１及びｄｎａＮ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計されたプライマー、例えば下記ＤＮＡＮ−１の２種のプライマーを用いて、ＰＣＲ反応により増幅させることによって得られる大きさが約３．５ｋｂのＤＮＡ断片（以下これを「Ｃ断片」ということがある）をあげることができる。
【００１２】
【００１３】
【表１】
第１表 大きさが約３．５ｋｂのＤＮＡ断片
制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ）
ＥｃｏＲＩ ３ １．１、１．０、０．９、０．５
ＨｉｎｄＩＩＩ ４ １．８、１．４、０．１６、０．０７、０．０７
ＳａｌＩ １ ２．３、１．２
【００１４】
なお、本明細書において、制限酵素による「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、制限酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な断片の数から決定した値を採用した。
【００１５】
また、「切断断片の大きさ」及びプラスミドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切断ＤＮＡ断片の各ＤＮＡ断片の大きさを算出する。
【００１６】
上記した大きさが約３．５ｋｂの増幅ＤＮＡ断片は、そのままａｒｓ領域ＤＮＡ断片として利用することができるが、更に次に述べる方法により複製に必要なＤＮＡ領域に縮小化後に利用することもできる。
すなわち、前記したとおり、ａｒｓ領域は、ｄｎａＡ遺伝子の上流及び下流にそれぞれｒｐｍＨ遺伝子とｄｎａＮ遺伝子に挟まれる形で存在しており、ｄｎａＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計された適当なプライマーと、前記したｒｐｍＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計された適当なプライマー及びｄｎａＮ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計された適当なプライマーをそれぞれ用いて、前記ＭＪ−２３３株染色体ＤＮＡまたは大きさが約３．５ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を鋳型として、ＰＣＲ法により、ｄｎａＡ遺伝子の上流及び下流に存在するｏｒｉＣ領域部分ＤＮＡ断片を増幅することにより、縮小化されたｏｒｉＣ領域を取得することができる。
【００１７】
上記で用いるｄｎａＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計された適当なプライマーとしては、例えば、下記ＤＮＡＡ−３及びＤＮＡＡ−４の２種のプライマーを挙げることができる。
【００１８】
かくして得られる縮小化されたｏｒｉＣ領域の部分ＤＮＡ断片としては、例えば、上記ＲＰＭＨ−１とＤＮＡＡ−３の２種のプライマーを用いて増幅される大きさ約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（以下これを「Ａ断片」ということがある）、このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩで分解して得られる大きさが約１．２ｋｂのＤＮＡ断片（以下これを「Ｄ断片」ということがある）、上記ＤＮＡＡ−４とＤＮＡＮ−２の２種のプライマーを用いて増幅される大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。
【００１９】
これら大きさが約１．７ｋｂ、約１．２ｋｂ及び約１．５ｋｂのｏｒｉＣ領域部分ＤＮＡ断片を各種の制限酵素で切断した時の認識部位数及び切断断片の大きさを第２表〜第４表及び図２〜図３にそれぞれ示す。
【００２０】
【表２】
第２表 大きさが約１．７ｋｂのＤＮＡ断片
制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ）
ＢａｍＨＩ ０ １．７
ＥｃｏＲＩ ２ １．０、１．５、０．２
ＨｉｎｄＩＩＩ ２ １．４、０．２、０．１
ＳａｌＩ １ １．２、０．５
【００２１】
【表３】
第３表 大きさが約１．２ｋｂのＤＮＡ断片
制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ）
ＢａｍＨＩ ０ １．２
ＥｃｏＲＩ １ ０．７、０．５
ＨｉｎｄＩＩＩ ０ １．２
ＳａｌＩ ０ １．２
【００２２】
【表４】
第４表 大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片
制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ）
ＢａｍＨＩ １ １．２、０．３
ＥｃｏＲＩ １ ０．９、０．６
ＨｉｎｄＩＩＩ ２ １．２、０．２、０．１
ＰｖｕＩＩ ２ ０．７ ０．５ ０．３
ＳａｌＩ ０ １．５
ＸｈｏＩ １ ０．９、０．６
【００２３】
上記ＤＮＡ断片は、その塩基配列をジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ 法）〔Ｓａｎｇｅｒ Ｆ． ｅｔ ａｌ．、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、７４、５４６３、（１９７７）〕等により決定することができる。
このようにして決定した上記大きさ約３．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｃ断片）の配列を後記配列表の配列番号１に示す。この配列中に存在するオープンリーディングフレームから、ｄｎａＡ遺伝子は、配列中のアミノ酸番号１からアミノ酸番号４６３までのアミノ酸配列をコードするものであることが明らかとなった。上記の複製開始領域を含むＤＮＡ断片は、天然の細菌染色体ＤＮＡ、例えばコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばベックマン社製システム−１プラス（Ｓｙｓｔｅｍ−１ Ｐｌｕｓ）を用いて合成されたものであってもよい。
また、前記の如くブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３等の細菌染色体から取得される本発明のＤＮＡ断片は、コリネ型細菌等の細胞内での複製開始能実質的に損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換されていても、削除されていてもよく、新たに塩基が挿入されていてもよく、あるいは塩基配列の一部が転移されているものであってもよく、さらにそれらの塩基配列にハイブリダイズする塩基配列であってもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明の染色体複製開始領域を含むＤＮＡ断片に包含されるものである。
【００２４】
上記ａｒｓ領域ＤＮＡ断片を用いて環状ＤＮＡベクターの構築に用いる場合、ｄｎａＡ遺伝子の上流及び下流に由来する２種のＤＮＡ断片、すなわち上記大きさが約１．７ｋｂ又は１．２ｋｂのＤＮＡ断片及び大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を用いることも可能である。
【００２５】
環状ＤＮＡベクターの構築に用いられる前記ａｒｓ領域ＤＮＡ断片に導入されるマーカーＤＮＡ断片としては、コリネ型細菌内でマーカーとして働く遺伝子を含有しているものであれば特に制限はなく、カナマイシン耐性遺伝子を保有するプラスミドｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ２９９（宝酒造製）、クロラムフェニコール耐性遺伝子を保有するプラスミドｐＨＳＧ３９８、ｐＨＳＧ３９９（宝酒造製）等が好適に使用される。
【００２６】
上記マーカーＤＮＡ断片の前記ａｒｓ領域ＤＮＡ断片への導入は、例えば、まずプラスミドｐＨＳＧ２９８を適当な制限酵素により解裂させ、それに前記したａｒｓ領域ＤＮＡ断片を連結酵素処理により結合させることにより行なう。ａｒｓ領域ＤＮＡ断片が部分ＤＮＡ断片である場合は、前記したｄｎａＡ遺伝子の上流及び下流に存在するａｒｓ領域部分ＤＮＡ断片が導入された各プラスミドからａｒｓ領域部分ＤＮＡ断片を切り出すか又はプラスミドを解裂し、連結酵素処理により結合させることにより行なう。
【００２７】
このようにして構築される環状ＤＮＡベクターとしては、例えば、大きさが２．７ｋｂのプラスミドｐＨＳＧ２９８ＤＮＡ断片にｄｎａＡ遺伝子の上流に存在する大きさが１．２ｋｂのＤＮＡ断片および、ｄｎａＡ遺伝子の下流に存在する大きさが１．５ｋｂのＤＮＡ断片が挿入された環状ＤＮＡベクターｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣを挙げることができる。この環状ＤＮＡベクターｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣの構築方法の詳細は後記実施例２で述べる。
【００２８】
本発明による環状ＤＮＡベクターで形質転換し得る微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９９）等が挙げられる。
【００２９】
これらの微生物の他に、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ） ＡＴＣＣ ６８７１、同 ＡＴＣＣ １３７４５ 、同 ＡＴＣＣ １３７４６ 、ブレビバクテリウム・デイバリカタム （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ） ＡＴＣＣ １４０２０、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ） ＡＴＣＣ １３８６９ 、コリネバクテリウム・グルタミカム （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ） ＡＴＣＣ ３１８３１等を宿主微生物として用いることもできる。
【００３０】
尚、宿主としてブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株由来の菌株を用いる場合、本菌株が保有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３ー３６７８７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合があるので、そのような場合には、本菌株よりプラスミドｐＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプラスミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例えば、継代培養を繰り返すことにより自然に欠失させることも可能であるし、人為的に除去することも可能である〔バクテリオロジカル・レビュー（Ｂａｃｔ． Ｒｅｖ．） 、３６、３６１ 〜４０５ （１９７２）参照〕。
【００３１】
上記コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３への前記プラスミドの形質転換（前記プラスミドの導入）は、ＤＮＡ受容菌にパルス波を通電することにより〔Ｓａｔｏｈ Ｙ． ｅｔ ａｌ． 、ジャーナル・オブ・インダストリアル・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ） 、５ 、１５９ （１９９０） 参照〕行なうことができる。
【００３２】
かくして得られる形質転換株を選択圧下で培養し、生成するコロニーを取得することにより、本発明の環状ＤＮＡベクターで形質転換されたコリネ型細菌を得ることができる。
上記の方法で形質転換して得られる環状ＤＮＡベクターを保有するコリネ型細菌としては、例えば、前記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣを保有するブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ｏｒｉＣ（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３０３）を挙げることができる。
【００３３】
本発明の上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣ中に存在する環状ＤＮＡベクター（ｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣ）の確認は、例えば、該形質転換株及び比較として親株、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３のＤＮＡ抽出液を、常法〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ） 、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕に従いゲノミックスサザンハイブリダイゼーションに供し、ａｒｓ領域の検出を行うことにより可能である。この時プローブとしては、前期のＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を、ランダムラベルキット（宝酒造より市販）等によりラベルしたものを用いることができる。また、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＯｒｉＣより得られたＤＮＡ抽出液、および、比較例として、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３のＤＮＡ抽出液を鋳型とし、前期４種の微生物のＤＮＡ塩基配列より推定されるＤｎａＡ、ＲｐｍＨおよびＤｎａＮタンパク質アミノ酸配列間で保存されている領域、特にＤＮＡ塩基配列においても特に保存されている領域をもとに設計したプライマーを用い、前述の方法に従ってＰＣＲ反応を行い、得られた反応液をアガロースゲル電気泳動により解析することによりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣ中に存在する環状ＤＮＡベクター（ｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣ）を確認することができる。
【００３４】
【実施例】
以上に本発明を説明してきたが、下記の実施例によりさらに具体的に説明する。
参考例１ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のｄｎａＡ遺伝子断片の一部（ｄｎａＡ断片）のクローン化
【００３５】
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全ＤＮＡの抽出
半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ７ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１１〕１ｌに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲに使用した。
【００３６】
（Ｂ）ＰＣＲプライマーの設計
ｄｎａＡ遺伝子は原核生物では、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）由来のもの〔プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、７４、５４５８ 〜 ５４６２ （１９７７）参照〕、シュードモナス・プチダ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のもの〔モレキュラー・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．）、２１５、３８１ 〜 ３８７ （１９７９）参照〕、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）由来のもの〔エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、 ４、３３４５〜３３５０ （１９８５） 参照〕、マイクロコッカス・ルテウス由来のもの〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、９３、７３〜７８ （１９９０） 参照〕がよく研究されており、塩基配列が決定されている。これら５種の微生物のｄｎａＡ塩基配列より推定されるＤｎａＡタンパク質アミノ酸配列間で保存されている領域、特にＤＮＡ塩基配列においても特に保存されている領域を検討し、下記の２つのプライマーを設計し、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。
【００３７】
【００３８】
これら２つのプライマーを用いて上記（Ａ）で調製した染色体を鋳型としてＰＣＲを行うと、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体上のｄｎａＡ遺伝子部分の増幅により、約５００ｂｐのＰＣＲ反応産物が得られると期待される。
【００３９】
（Ｃ）ＰＣＲ反応
実際のＰＣＲ反応はパーキンエルマーシータス社製のＤＮＡサーマルサイクラーを用いて下記の条件で行った。
反応液：
５０ｍＭ ＫＣｌ
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
鋳型ＤＮＡ ５μｌ
上記（Ｂ）で作製したプライマー 各々０．２５μＭ
ｄＮＴＰｓ 各々２００μＭ
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ２．５ｕｎｉｔｓ
以上を混合し、１００μｌとした。
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程：３７℃ １２０秒
エクステンション過程：７２℃ １８０秒
以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。
【００４０】
（Ｄ）反応物の検出
上記（Ｃ）で生成した反応液１０μｌを２％アガロースゲルにより電気泳動を行ったところ約５００ｂｐの断片が検出された。
【００４１】
（Ｅ）増幅断片のクローン化
上記（Ｃ）項で得た反応液３μｌとＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ（ＰＲＯＭＥＧＡより市販）１μｌを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
【００４２】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５３、１５９ （１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１１に溶解〕に塗抹した。
【００４３】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔの長さ３．０ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約５００ｂｐの挿入断片が認められた。
【００４４】
（Ｆ）増幅断片の塩基配列の決定
参考例１の（Ｅ）項で得られた長さが約５００ｂｐの増幅断片について、その塩基配列をジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｚｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）〔Ｓａｎｇｅｒ Ｆ． ｅｔ ａｌ．、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ ）、７４、５４６３（１９７７）〕により決定した。
【００４５】
塩基配列決定の結果、該挿入断片はマイクロコッカス・ルテウス由来のｄｎａＡ断片の一部（ＰＣＲに使用したプライマーによって挟まれる領域）と高いホモロジーを示し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のｄｎａＡ断片の一部をクローニングしたことを確認した。
【００４６】
実施例１ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のａｒｓ領域ＤＮＡ断片のクローン化
（Ａ）ＰＣＲプライマーの設計
微生物染色体の複製に必要とされるＤＮＡ領域であるａｒｓ領域は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）由来のもの〔プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、７４、５４５８ 〜 ５４６２ （１９７７）参照〕、シュードモナス・プチダ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のもの〔モレキュラー・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．）、２１５、３８１ 〜 ３８７ （１９７９）参照〕、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）由来のもの〔エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、 ４、３３４５〜３３５０ （１９８５） 参照〕、マイクロコッカス・ルテウス由来のもの〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、９３、７３〜７８ （１９９０） 参照〕がよく研究されており塩基配列が決定されている。これら４種の微生物のａｒｓ領域のＤＮＡ塩基配列の解析の結果、ａｒｓ領域と考えられる領域はｒｐｍＨ遺伝子とｄｎａＮ遺伝子の間に挟まれる形で存在するｄｎａＡ遺伝子の近傍に存在することが示されている。そこで、これら４種の微生物のＤＮＡ塩基配列より推定されるＲｐｍＨおよびＤｎａＮタンパク質アミノ酸配列間で保存されている領域、特にＤＮＡ塩基配列においても特に保存されている領域を検討し、ｒｐｍＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計した下記プライマーＲＰＭＨ−１及びｄｎａＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列に基づいて設計した下記プライマーＤＮＡＮ−１の２つのプライマーを設計し、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて合成した。
【００４７】
【００４８】
ここでＡはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示す。） なお、ＲＰＭＨ−１の５’末端にはクローニングサイトとして制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位を、ＤＮＡＮ−１の５’末端にはクローニングサイトとして制限酵素ＳａｌＩ認識部位をを付加した。
【００４９】
また、参考例１の（Ｆ）で明らかになったｄｎａＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列をもとに、下記の２つのプライマーを設計し、上記と同様に合成した。
【００５０】
これら４つのプライマーを用いて参考例１の（Ａ）で調製した染色体を鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーＲＰＭＨ−１とＤＮＡＮ−１により全ｄｎａＡ遺伝子を含むｏｒｉＣ領域全体が、ＲＰＭＨ−１とＤＮＡＡ−３によりｄｎａＡ遺伝子上流領域が、ＤＮＡＡ−４とＤＮＡＮ−１によりｄｎａＡ遺伝子下流領域がＰＣＲ反応産物として得られると期待される。
【００５１】
（Ｂ）ＰＣＲ反応
参考例の（Ｃ）の方法に従いＰＣＲ反応を行った。
（Ｃ）反応物の検出
上記（Ｂ）で生成した反応液１０μｌを２％アガロースゲルにより電気泳動を行ったところ、プライマーＲＰＭＨ−１とＤＮＡＮ−１により約３．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｃ断片）の増幅が、ＲＰＭＨ−１とＤＮＡＡ−３により約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（Ａ断片）の増幅が、ＤＮＡＡ−４とＤＮＡＮ−１により約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｂ断片）の増幅が検出された。また、プライマーＲＰＭＨ−１とＤＮＡＮ−１により増幅した約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を鋳型としてＰＣＲをおこなった場合、染色体を鋳型として用いた場合と同じように、プライマーＲＰＭＨ−１とＤＮＡＡ−３により約１．７ｋｂのＤＮＡ断片が、ＤＮＡＡ−４とＤＮＡＮ−１により約１．５ｋｂのＤＮＡ断片が検出された。
【００５２】
プライマーＲＰＭＨ−１とＤＮＡＮ−１により増幅された大きさが約３．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｃ断片）、プライマーＲＰＭＨ−１とＤＮＡＡ−３により増幅された大きさが約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（Ａ断片）、このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩにより切断して得られる大きさが約１．２ｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ断片）、プライマーＤＮＡＡ−４とＤＮＡＮ−１により増幅された大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｂ断片）のそれぞれを各種制限酵素で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果は、前記第１表〜第３表に示した通りであった。これらＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図及び各ＤＮＡ断片の相互関連を図１〜図３に示す。
【００５３】
（Ｄ）増幅ＤＮＡ断片のクローン化
上記（Ｃ）項で得られたＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断したものに、制限酵素ＢａｍＨＩで切断したカナマイシン耐性プラスミドｐＨＳＧ２９８を混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
【００５４】
得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５３、１５９ （１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１１に溶解〕に塗抹した。
【００５５】
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、大きさが２．７ｋｂのプラスミドｐＨＳＧ２９８のＤＮＡ断片に加え、大きさ約１．７ｋｂの挿入ＤＮＡ断片（Ａ断片）が認められた。このプラスミドをｐＨＳＧ２９８−Ａ１と命名した。
【００５６】
また、上記（Ｃ）項で得られたＢ断片を、前記の方法に従いｐＧＥＭ−Ｔ（ＰＲＯＭＥＧＡより市販）にクローニングした。得られたプラスミドを制限酵素ＳａｌＩにより切断し、挿入断片を確認した。この結果、大きさが約３．０ｋｂのプラスミドｐＧＥＭ−ＴＤＮＡ断片に加え、大きさが約１．５ｋｂの挿入断片（Ｂ断片）が認められた。このプラスミドをｐＧＥＭ−Ｂ１と命名した。
【００５７】
（Ｅ）増幅ＤＮＡ断片の塩基配列の決定
上記（Ｄ）項で得られたプラスミドｐＨＳＧ２９８−Ａ１及びｐＧＥＭ−Ｂ１に含まれるＡ断片およびＢ断片について、その塩基配列をジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｚｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）〔Ｓａｎｇｅｒ Ｆ． ｅｔ ａｌ．、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ ）、７４、５４６３（１９７７）〕により決定した。
【００５８】
塩基配列決定の結果、Ａ断片は一方にｒｐｍＨ遺伝子のＮ末領域と、他方にマイクロコッカス・ルテウス由来のｄｎａＡ遺伝子の一部と高いホモロジーを示し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のｄｎａＡ断片の一部及びその上流領域をクローニングしたことを確認した。また、Ｂ断片は一方にｄｎａＮ遺伝子のＮ末領域と、他方にマイクロコッカス・ルテウス由来のｄｎａＡ遺伝子の一部と高いホモロジーを示し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のｄｎａＡ断片の一部及びその下流領域をクローニングしたことを確認した。
【００５９】
実施例２ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３染色体由来の環状ＤＮＡベクターの作成
実施例１の（Ｄ）項で得られたプラスミドｐＨＳＧ２９８−Ａ１をＳａｌＩにより切断すると、ｐＨＳＧ２９８とＡ断片の一部（大きさが約１．２ｋｂのＤ断片）を含む４．２ｋｂのＤＮＡ断片と、Ａ断片の残りの一部分の約０．５ｋｂのＤＮＡ断片とに別れる（図１参照）。この、ｐＨＳＧ２９８とＡ断片の一部（Ｄ断片）を含む４．２ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＧＥＭ−Ｂ１をＢａｍＨＩにより切断することにより得られる１．５ｋｂのＢ断片を上記の方法によりＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。
【００６０】
上記の如く調製されたＤＮＡ混液を用い、電気パルス法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０２除去株を形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に塗抹し３０℃で２〜３日間培養した。出現したカナマイシン耐性株より、常法によりベクターＤＮＡを抽出し、該ベクターを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩにより切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて調べたところ、大きさが２．７ｋｂのプラスミドｐＨＳＧ２９８ＤＮＡ断片に加え、大きさが約１．２ｋｂのＤ断片および、大きさが約１．５ｋｂのＢ断片が認められた。
【００６１】
本環状ＤＮＡベクターをｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣと命名した。得られた環状ＤＮＡベクターを各種制限酵素で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を下記の第５表に示す。また環状ＤＮＡベクターｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣの制限酵素切断点地図を図４に示す。
【００６２】
【表５】
第５表
制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ）
ＢａｍＨＩ ２ ３．９、１．５
ＥｃｏＲＩ ３ ３．６、１．３、０．５
ＨｉｎｄＩＩＩ ４ ３．６、１．２、０．５、０．１
ＳａｌＩ ２ ３．９、１．５
ＸｈｏＩ １ ５．４
【００６３】
得られた環状ＤＮＡベクターを用いて、電気パルス法によりブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０２除去株を形質転換し、カナマイシン２５μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に塗抹し３０℃で２〜３日間培養したところ、多数の形質転換株が得られ、得られた環状ＤＮＡベクターはコリネ型細菌内でａｒｓ領域ＤＮＡ断片として複製していることが確認された。
【００６４】
なお、環状ＤＮＡベクターｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣにより形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣは、茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究所に、平成４年１１月２４日付で：微工研菌寄第１３３０３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３３０３）として寄託されている。
【００６５】
実施例３ ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣ中に存在する環状ＤＮＡベクター（ｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣ）の確認およびコピー数の測定
上記参考例１（Ａ）項の方法に従い、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣより全ＤＮＡを抽出した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣより得られたＤＮＡ抽出溶液、および、比較例として、参考例１（Ａ）項で得られたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３のＤＮＡ抽出溶液を、常法に従い〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ）、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）〕ゲノミックサザンハイブリダイゼーションに供し、ａｒｓ領域の検出を行った。この時プローブとしては、実施例１の（Ｃ）で得られたＡ断片を、ランダムラベルキット（宝酒造より市販）によりラベルしたものを用いた。
【００６６】
この結果、染色体由来と考えられるバンドの他に環状ＤＮＡベクター（ｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣ）由来と考えられるバンドが検出された。両者のバンドの濃さの比較より１細胞当たりの環状ＤＮＡベクターのコピー数は、１〜２と考えられた。
【００６７】
また、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣより得られたＤＮＡ抽出溶液、および、比較例として、実施例１（Ａ）項で得られたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３のＤＮＡ抽出溶液を鋳型とし、実施例１の（Ａ）項で用いたＲＰＭＨ−１およびＤＮＡＮ−１をプライマーとして用い、前述の方法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた反応液をアガロース電気泳動により解析したところ、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３のＤＮＡ抽出溶液を鋳型としたＰＣＲ反応液からは、約３．５ｋｂのＤＮＡ断片のみが検出されるのに対し、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＯｒｉＣのＤＮＡ抽出溶液を鋳型とした反応液からは、約３．５ｋｂのＤＮＡ断片の他に、約２．７ｋｂの環状ＤＮＡベクター由来と考えられるＤＮＡ断片が検出された。
【００６８】
実施例４ ａｒｓ領域を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
上記実施例１の（Ｃ）項で得られたａｒｓ領域を含む大きさ約３．５ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を下記の操作により決定し、また、このＤＮＡ断片上に存在するｄｎａＡ遺伝子の存在部位を特定した。
まず、大きさ約３．５ｋｂのＤＮＡ断片溶液 １４μｌを制限酵素Ｓａｕ３Ａ〓を用いて３７℃で１〜５分間処理してＤＮＡ断片を部分分解した。次に、クローニングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造製）を制限酵素ＢａｍＨ〓で切断した。得られたベクター断片と部分分解ＤＮＡ断片とを混合し、この混合液にそれぞれ最終濃度が５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．６），１０ｍＭ ジオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔとなるように各成分を添加し、ベクター断片と部分分解ＤＮＡ断片とを結合させた。
【００６９】
上記と同様に大きさ約３．５ｋｂのＤＮＡ断片溶液 １４μｌを制限酵素Ｔａｑ〓 ５０ｕｎｉｔと５〜８分間反応させて部分分解ＤＮＡ断片を調製した。 クローニングベクターｐＵＣ１１８を制限酵素Ａｃｃ〓で切断した後、これを上記と同様にして部分分解ＤＮＡと結合させた。
【００７０】
得られたプラスミド混液を用い、常法［Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５３， １５９（１９７０）参照］によりエシエリヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリンを５０μｇ含む前記のＬ培地に塗抹した。
上記培地に生育した菌株を常法に従い液体培養し、得られた培養物よりプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラスミドＤＮＡを用いて、ベクターｐＵＣ１１８に挿入された部分分解ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシヌクレオチド酵素法［ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ， Ｓａｎｇｅｒ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７４， ５４６３（１９７７）参照］により決定した。
【００７１】
具体的には、上記培養物より抽出したプラスミドＤＮＡをパーキン・エルマー社製カタリスト８００モレキュラー・バイオロジー・ラボステーション（ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｓｔａｔｉｏｎ ； Ｐｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてプロトコールに従い反応させた後、パーキン・エルマー社製 ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサーにより各々のプラスミドの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。そして、これらの個々の配列の連結は、パーキン・エルマー社製のシークエンス解析ソフト インヘリット（ＩＮＨＥＲＩＴ）を用いて行い、大きさ約３．５ｋｂのＤＮＡ断片の全塩基配列を決定した。その配列を後記配列表の配列番号：１に示す。
決定した塩基配列中にはオープンリーディングフレームの存在が認められ（塩基番号８８０〜２４５１；５２４アミノ酸）、既知のマイクロコッカス・ルテウス由来のｄｎａＡ遺伝子〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、９３、７３〜７８ （１９９０） 参照〕との相同性の比較により、それがブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３のｄｎａＡ遺伝子であることが判明した。さらに、ｄｎａＡ遺伝子の上流にｒｐｍＨ遺伝子の一部が（塩基番号３２〜９）存在し、ｄｎａＡ遺伝子の下流にはｄｎａＮ遺伝子の一部分（塩基番号２９７８〜３５１４）が存在していることが確認された。このことより、ａｒｓ領域は、ｄｎａＡ遺伝子およびｒｐｍＨ遺伝子の間、および、ｄｎａＡ遺伝子およびｄｎａＮ遺伝子の間の領域に存在することが確認された。
【発明の効果】
本発明により、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３染色体に由来するａｒｓ領域を含むＤＮＡ断片が提供される。本発明のＤＮＡ断片を用いて造成される環状ＤＮＡベクターは、コリネ型細菌内で低コピー数で存在し、自律複製可能であり、該環状ＤＮＡベクターを用いることにより、高コピー数存在すると宿主コリネ型細菌に悪影響を与える遺伝子等のクローニングが可能となる。
【００７２】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３５２１
鎖の数：二本鎖
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
起源
生物名：ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）
株名：ＭＪ−２３３
配列の特徴：
特徴を表す記号：ＲＥＰ
存在位置：１〜３５２１
特徴を決定した方法：Ｅ
【００７３】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の大きさが約３．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｃ断片）の制限酵素切断点地図並びに該ＤＮＡ断片と大きさが約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（Ａ断片）、大きさが約１．２ｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ断片）及び大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｂ断片）との相互関係を示す図。
【図２】本発明の大きさが約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（Ａ断片）および大きさが約１．２ｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ断片）の制限酵素切断片地図
【図３】本発明の大きさが約１．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｂ断片）の制限酵素切断片地図
【図４】本発明のプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉＣの制限酵素切断片地図
Claims (11)
- 大きさが３．５ｋｂであり、下記表に記載する制限酵素で切断した場合、下記表に記載する認識部位数と切断断片の大きさを示す、コリネ型細菌染色体に由来する自律複製配列を有するＤＮＡ断片。
制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb)
ＥｃｏＲＩ ３ １．１、１．０、０．９、０．５
ＨｉｎｄＩＩＩ ４ １．８、１．４、０．１６、０．０７、０．０７
ＳａｌＩ １ ２．３、１．２ - 大きさが１．７ｋｂであり、下記表に記載する制限酵素で切断した場合、下記表に記載する認識部位数と切断断片の大きさを示す、コリネ型細菌染色体に由来する自律複製配列を有するＤＮＡ領域の部分ＤＮＡ断片。
制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb)
ＢａｍＨＩ ０ １．７
ＥｃｏＲＩ ２ １．０、０．８、０．２
ＨｉｎｄＩＩＩ ２ １．４、０．２、０．１
ＳａｌＩ １ １．２、０．５ - 大きさが１．２ｋｂであり、下記表に記載する制限酵素で切断した場合、下記表に記載する認識部位数と切断断片の大きさを示す、コリネ型細菌染色体に由来する自律複製配列を有するＤＮＡ領域の部分ＤＮＡ断片。
制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb)
ＢａｍＨＩ ０ １．２
ＥｃｏＲＩ １ ０．７、０．５
ＨｉｎｄＩＩＩ ０ １．２
ＳａｌＩ ０ １．２ - 大きさが１．５ｋｂであり、下記表に記載する制限酵素で切断した場合、下記表に記載する認識部位数と切断断片の大きさを示す、コリネ型細菌染色体に由来する自律複製配列を有するＤＮＡ領域の部分ＤＮＡ断片。
制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ(kb)
ＢａｍＨＩ １ １．２、０．３
ＥｃｏＲＩ １ ０．９、０．６
ＨｉｎｄＩＩＩ ２ １．２、０．２、０．１
ＰｖｕＩＩ ２ ０．７、０．５、０．３
ＳａｌＩ ０ １．５
ＸｈｏＩ １ ０．９，０．６ - 請求項１に記載のＤＮＡ断片を保有する、コリネ型細菌内で自律複製可能な環状ＤＮＡ。
- 請求項２又は３に記載のＤＮＡ断片及び請求項４に記載のＤＮＡ断片を保有する、コリネ型細菌内で自律複製可能な環状ＤＮＡ。
- 請求項５又は６に記載の環状ＤＮＡにより形質転換されたコリネ型細菌。
- 配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片。
- 配列番号１に記載の塩基配列において、１から数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、コリネ型細菌内で複製可能な環状ＤＮＡとして機能しうるＤＮＡ断片。
- 請求項８又は９に記載のＤＮＡ断片を保有するコリネ型細菌内で自律複製可能な環状ＤＮＡ。
- 請求項１０に記載の環状ＤＮＡにより形質転換されたコリネ型細菌。
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