JP4733298B2 - プラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むｄｎａ断片 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片に関し、さらに、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片であって、プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が該遺伝子内の少なくとも1カ所に存在するDNA断片および該DNA断片を有する多コピー数プラスミドベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ロドコッカス属に属する微生物は、ニトリル類を水和して対応するアミド類または酸を生産するための微生物触媒として知られており、また、PCB（ポリ塩化ビフェニル）等の分解あるいは原油の脱硫に関与する酵素を生産すること、さらには、排水処理に用いられるようなバイオサーファクタントを生産することなどの非常に多様な性質を示すことから、工業的に極めて有用な微生物であることが知られている。
またロドコッカス ロドクロウス種（Rhodococcus rhodochrous）に属する微生物が極めて高性能なニトリル水和活性を有することが知られており、バイオ法アクリルアミドの製造触媒として工業的に利用されている。
【０００３】
このような状況下、ロドコッカス属の宿主ベクター系の開発が以前から期待され、幾つか開発されている。ロドコッカス属細菌の工業的に有用なプラスミドベクターとしては、例えばロドコッカス ロドクロウス ATCC4276が保持するプラスミドpRC001、ロドコッカス ロドクロウス ATCC14349が保持するpRC002、ロドコッカス ロドクロウス ATCC14348が保持するpRC003およびロドコッカス ロドクロウス IFO 3338が保持するプラスミドpRC004（特許第2983602号公報参照）、および大腸菌細胞内で複製増殖可能なプラスミドDNA領域および薬剤耐性遺伝子を含むDNA領域を有してなる複合プラスミドベクターpK1、pK2、pK3およびpK4（特開平5-64589号公報参照）、ロドコッカス エリスロポリス IFO12320が保持するpRC020（特開平9-28379号公報参照）などが挙げられる。ロドコッカス属細菌を宿主とするプラスミドベクターに有用遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させる場合、その有用遺伝子の発現量はプラスミドベクターのコピー数にほぼ比例することが知られている。しかしながら、これらのプラスミドのロドコッカス属細菌の細胞内のコピー数は2〜6程度であり、外来遺伝子を高発現させるためには必ずしも充分なものではない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、多コピー数プラスミドベクターに有用遺伝子を挿入したものを細胞内に導入することにより高い遺伝子増幅効果が期待される。
本発明は、ロドコッカス属細菌内で自律複製し得るプラスミドに由来し、プラスミドの自律増殖に関する遺伝子を含むDNA断片、さらにはロドコッカス属細菌内で自律複製し得るプラスミドに由来し、プラスミドの自律増殖に関する遺伝子を含むDNA断片であって、プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が該遺伝子内の少なくとも1ヵ所に存在するDNA断片を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA領域を明らかにし、プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が該遺伝子内の少なくとも1カ所に存在するDNA断片を取得することにより本発明を完成させた。すなわち、本発明は、プラスミドpRC001、pRC002、pRC003およびpRC004から選ばれるプラスミドに由来し、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片、さらには、ロドコッカス属細菌内で自律複製し得るプラスミドに由来し、プラスミドの自律増殖に関する遺伝子を含むDNA断片であって、プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が該遺伝子内の少なくとも1カ所に存在するDNA断片、に関するものである。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１） プラスミドpRC001、pRC002、pRC003およびpRC004から選ばれるプラスミドに由来し、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片、
（２） 大きさが1.6kbであり、制限酵素SplIおよびSacI切断点を末端に有する（１）のDNA断片、
（３） 大きさが1.7kbであり、制限酵素SmaIおよびSacI切断点を末端に有する（１）のDNA断片、
（４） 大きさが1.9kbであり、制限酵素SmaI切断点を両末端に有する（１）のDNA断片、
（５） 大きさが2.3kbであり、制限酵素SacI切断点を両末端に有する（１）のDNA断片、
（６） pRC004に含まれ、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む、配列番号１の塩基配列からなる（１）のDNA断片、
（７） pRC004に含まれ、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む、配列番号３の塩基配列からなる（１）のDNA断片、
（８） pRC004に含まれ、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む、配列番号７の塩基配列からなる（１）のDNA断片、
（９） プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が少なくとも1カ所に存在する（１）〜（８）のいずれかのDNA断片、
（１０） プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が1カ所に存在する、配列番号２の塩基配列からなる（９）のDNA断片、
（１１） プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が1カ所に存在する、配列番号４の塩基配列からなる（９）のDNA断片、
（１２）プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が1カ所に存在する、配列番号９の塩基配列からなる（９）のDNA断片、
（１３） （９）〜（１２）のいずれかのDNA断片を保有する、ロドコッカス属細菌内で自立増殖し多コピー数存在し得るプラスミド、および
（１４） 請求項１１に記載のDNA断片を保有する、ロドコッカス属細菌内で自律増殖し多コピー数存在し得るプラスミドpLK006。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片であって、プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が該遺伝子内の少なくとも1カ所に存在するDNA断片（以下、多コピープラスミドDNA断片という）とは、プラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片であって、変異点を有さないDNA断片を用いて作成されたプラスミドベクターのコピー数と比較して、変異点を有するDNA断片を用いて作成されたプラスミドベクターのコピー数を増加させうる作用を有するDNA断片を意味する。本明細書においては、コピー数という術語は１細胞当たりのプラスミド分子数（プラスミドの存在数）を意味し、多コピー数という述語は、プラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片であって、変異点を有さないDNA断片を用いて作成されたプラスミドベクターのコピー数よりも多いコピー数を意味する。
【０００８】
本発明の多コピープラスミドDNA断片は、ロドコッカス属細菌内で自律増殖するプラスミドあるいはプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片を適当な変異処理したものの中から取得することができる。
通常は、ロドコッカス属細菌内で自律増殖するプラスミドあるいはプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片をマーカーとなりうる薬剤耐性遺伝子を有するベクタープラスミド、例えばカナマイシン耐性遺伝子を有するpHSG298（宝酒造製）、クロラムフェニコール耐性遺伝子を有するpHSG398（宝酒造製）、テトラサイクリン耐性遺伝子を有するpBR322（宝酒造製）あるいはアンピシリン耐性遺伝子を有するpUC18（宝酒造製）に公知の方法で挿入し、このベクタープラスミドを電気パルス法により宿主ロドコッカス属細菌に形質転換し、得られる形質転換体から公知の方法、例えばアルカリSDS法などによりプラスミドDNAを回収し、制限酵素処理断片の解析などにより目的DNA断片を確認することができる。
【０００９】
適当な変異処理とは、上記のようにして作成したプラスミド保持菌に、紫外線、Ｘ線、γ線などを照射させるか、あるいはN-メチル-N'-ニトロソグアニジンなどの変異剤で処理することなどである。また、生物が増殖する際に起こる自然突然変異を利用することも可能である。
【００１０】
あるいは、ロドコッカス属細菌内で自律増殖するプラスミドあるいはプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片を直接、あるいは1本鎖DNAにした後に、ヒドラジン、ギ酸あるいは亜硝酸で処理すること、または、適当なプライマーを選択して、ヌクレオチドアナログあるいはマンガンイオンの存在下などでPCRを行うことによるエラー誘発PCRなどを含む公知の方法によりDNA断片に直接変異を導入することも効果的である。この方法によれば、DNA配列の特定の場所に集中的に変異を導入することが可能なため、例えば本発明で開示しているようなプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片に特異的に変異を導入することが可能である。また、プラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片を合成することも可能である。
【００１１】
以上のようにして変異を導入した薬剤マーカー遺伝子を有するプラスミドベクターを保持する組換え体を各種濃度の薬剤マーカーによる選択下で培養して薬剤耐性濃度の上昇した菌株を選択することによりプラスミドコピー数の上昇したものを得ることができる。このような菌株は、コピー数上昇による遺伝子増幅効果により薬剤耐性濃度が上昇したものと考えることができる。このような菌株からプラスミドを回収して多コピープラスミドDNA断片を得ることができる。
【００１２】
変異処理を施したロドコッカス属細菌内で自律増殖するプラスミドあるいはプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片の場合には適当な薬剤耐性遺伝子を有する上述のプラスミドベクターを挿入した後、電気パルス法により宿主ロドコッカス属細菌に形質転換し、各種濃度の薬剤マーカーによる選択下で培養して薬剤耐性濃度の上昇した菌株を選択することによりプラスミドコピー数の上昇したものを得ることができる。
マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子を用いるのが簡便であるが、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼあるいはlacZ遺伝子など検出が簡便な公知の方法を使用することもできる。
【００１３】
コピー数の解析は、例えば Journal of Bacteriology, 152, p.722 (1982)に記載の方法に従い行うことができる。すなわち、細胞より染色体DNAおよびプラスミドDNAを抽出し、双方の分子数の比を求めることにより行うことができる。より簡便には、変異点を有しないプラスミドを保持する組換え体と変異点を有するプラスミドを保持する組換え体を全く同様に培養し、プラスミドを回収してアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロミドなどで染色した後デンシトメトリーにより分析することによりコピー数の比較を行うこともできる。
【００１４】
ロドコッカス ロドクロウス IFO 3338由来のプラスミドpRC004塩基配列を決定した結果を配列番号1に示す。塩基配列情報から、pRC004には２つのオープンリーディング フレーム(ORF)が推定された。１つは配列番号５に示される921塩基（配列番号１の塩基配列の1142番から2062番の塩基）にコードされると予想されるORFであり（配列番号６に推定されるアミノ酸配列を示す）、これは、ロドコッカス ロドクロウス NCIMB13064由来のプラスミドのpKA22およびマイコバクテリウム フォルツイタム由来のpAL5000のプラスミドの複製に関与するRep Aタンパクと類似している。もう１つは配列番号７に示される282塩基（配列番号１の塩基配列の2052番から2333番の塩基）にコードされると推定されるORFであり（配列番号８に推定されるアミノ酸配列を示す）、ロドコッカス エリスロポリス NI86/21由来のプラスミドpFAJ2600のDNA結合性のプラスミド複製因子と推定されているORFと類似している。しかしながら、以上の考察は遺伝子の類似性に基づくものであり、それらの機能を決定しているわけではなく、実際には機能していない疑似遺伝子（シュードジーン）の可能性も高い。
【００１５】
本発明により初めて、pRC004のSplIとSacIによる切断で生じる約1.6kbのDNA断片（配列番号３）が、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む領域であることが判明した。
すなわち、pRC004をSmaIで切断して生じた約1.9kbのDNA断片およびSacIで切断して生じた約2.3kbのDNA断片にロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む領域が含まれていることが判明した。さらにこのSmaIで切断して生じた約1.9kbのDNA断片をSacIで切断して生じた約1.7kbを調べたところ、このDNA断片にもロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む領域が含まれていることが判明した。さらにこの約1.7kbのDNA断片をSplIで切断することにより生じた約1.6kbのDNA断片にもロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む領域が含まれていることが判明した。
【００１６】
上記の制限酵素SplIおよびSacI切断点を末端に有する約1.6kbのDNA断片中に存在するBamHI、BglII、SphI、XhoI認識部位をそれぞれの制限酵素で切断してklenow fragmentなどで処理して末端平滑化してセルフライゲーションしたところ、ロドコッカス属細菌内でのプラスミドの自律増殖の機能が失われたことから、この領域に実際に機能しうるタンパク性の因子が存在することが判明した。
【００１７】
さらに、pRC004の該DNA断片における少なくとも１カ所の変異点の導入によりプラスミドのコピー数を増加させうるという知見は、本発明により初めて開示されたものである。
すなわち、pRC004にマーカーとして機能しうるカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターを挿入した複合プラスミドベクターを用いて、カナマイシン耐性度が向上した変異体を取得することにより、多コピー変異プラスミドを本発明により初めて取得することができた。
【００１８】
このロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む領域に変異点を少なくとも１カ所導入することにより多コピー変異プラスミドが得られることを初めて見いだした意義は大きく、この発明を基に公知の方法により容易に多コピー変異プラスミドが得られることを意味しているものと思われる。
【００１９】
このような多コピー変異プラスミドの例としては、本発明で得られたプラスミドpLK006などを挙げることができる。pLK006では、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む領域のうち、配列番号３に示される領域において1336番目のグアニン塩基がチミン塩基へ置換した変異体である（配列番号４）。これは、配列番号１の塩基配列の2262番目の塩基、配列番号７の塩基配列の211番目の塩基に相当し、配列番号２および配列番号９はそれぞれ配列番号１および配列番号７の１つの塩基において変異を有する配列を示している。推定されるORFのコードするアミノ酸配列は、配列番号８の71番目のグリシンがセリンに変異（置換）したものである（配列番号１０）。
なお、プラスミドpLK006は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号FERM P-18392として、平成13年6月22日に寄託されている。
【００２０】
また、本発明のDNA断片には、該DNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片、または該DNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有し、プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が少なくとも1ヵ所に存在する遺伝子を含むDNA断片も含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件は、相同性が高いDNA同士、例えば少なくとも60％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは95％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性の低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーション洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1%SSD、好ましくは、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。このようなDNAは、例えば部位特異的変異法によって、本発明のDNA断片の塩基配列を改変することによって得られる。
【００２１】
【実施例】
次に、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、下記の実施例は本発明の技術的範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕
pRC004のロドコッカス属細菌でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片の調製
ロドコッカス ロドクロウス IFO 3338から抽出したプラスミドpRC004(1μg)を制限酵素SmaIあるいはSacIを5units加え37℃、1時間反応させプラスミドDNAを切断した。制限酵素で切断したプラスミド液を0.7% アガロースゲル電気泳動に供し、SmaIで切断したものは、約650bp、約1.9kbのDNA画分を、SacIで切断したものは、約300bp、約2.3kbのDNA断片をそれぞれ切り出した。
【００２２】
一方、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドベクターpHSG299（宝酒造製）0.5μgを制限酵素SmaIあるいはSacIを5units加え37℃、1時間反応させプラスミドDNAを切断した。反応液に1M-Tris-HCl(pH9.0) を1/10量加え、アルカリホスファターゼ(1unit）と65℃、1時間反応させた。制限酵素で切断したプラスミドベクター液を0.7% アガロースゲル電気泳動に供し、それぞれ2.7kbのDNA断片を切り出した。
【００２３】
DNA断片の切り出しの際は、サイズマーカーとしてラムダファージDNAのHindIII消化物を用い、DNAのサイズを算出した。Gene clean kit（フナコシ（株))を用いてアガロースゲルよりDNAを回収しＴＥ緩衝液（10mMTris-HCl, １mMEDTA, (pH8.0)）に溶解した。
それぞれのDNA断片を含む液を等量ずつ混合し、T4DNAリガーゼ1unit, １mM ATP, 10mM ジチオスレイトール, 10mM MgCl2となるように各成分を加えて4℃、1夜反応させた。
【００２４】
大腸菌JM105株のコンピテントセル（宝酒造製）に上記反応液を加え、0℃、１時間静置後、42℃、2分間の熱処理を行い、2×YT培地（0.5％NaCl，1％イーストエキス、1.6％トリプトン）を加えて37℃、1時間振とうした。 25μｇ／mlカナマイシン、１mM IPTG（イソプロピル-β-ガラクトピラノシド）、および0.02％ X-gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド)を含む2×YT寒天培地に塗布し、37℃、1夜静置培養した。出現したコロニーより白色のコロニーを選択し、50μg/mlカナマイシン入りの2×YT培地（3ml）で37℃にて8時間振とう培養した。
【００２５】
15,000rpm、5分間の遠心分離により菌体を回収し、0.35ml STET溶液（8％シュークロース、0.５％ TritonX-100, 50mM EDTA, 10mM Tris-HCl(pH8.0))に懸濁した。リゾチーム液（10mg／ml）25μlを加え、Vortexで3秒間攪拌後、沸騰している湯に50秒間浸した。15,000rpm、15分間の遠心分離により沈澱を取り除き上清を得た。これにTE飽和フェノール：クロロホルム（1:1）液を0.5ml加え攪拌後、15,000rpm、5分遠心分離を行い、上層を得た。ジエチルエーテル0.5mlを加えて混合後、遠心分離を行い上層を除去した。イソプロパノール0.5ml、2.5M酢酸ナトリウム液 (pH4.5) 50μlを加え、−80℃、30分静置後15,000rpm、10分遠心分離を行い沈澱を得た。70％エタノールで洗浄し、減圧乾燥させ、0.１mlのTE緩衝液に溶解させた。
【００２６】
このようにして調製した上記プラスミド溶液を用いて、制限酵素SmaIあるいはSacIで切断して、目的のDNA断片が挿入されていることを確認した。それぞれのDNA断片が挿入されたプラスミドを用いて、電気パルス法によりロドコッカス ロドクロウス ATCC12674を宿主として形質転換を行った。
【００２７】
電気パルス法による形質転換は、以下の方法で行った。ロドコッカス ロドクロウス ATCC12674株の対数増殖期の細胞を遠心分離機により集菌し、氷冷した滅菌水にて3回洗浄し、滅菌水に懸濁した。上記のプラスミド1μlと菌体懸濁液10μlを混合し氷冷した。キュベットにDNAと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置Gene Pulser(BIO RAD)により2.0kV、200 OHMSで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下、10分間静置し、37℃で10分間ヒートショックを行い、MYK培地（0.5％ポリペプトン、0.3％バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、0.2％K2HPO4、0.2％KH2PO4)500μlを加え、30℃、5時間静置した後、50mg/Lカナマイシン入りMYK寒天培地に塗布し、30℃、3日間培養した。
【００２８】
表１に使用したプラスミドと形質転換体の取得の有無を示す。pRC004の約1.9kbのSmaI切断断片及び約2.3kbのSacI断片をプラスミドベクターpHSG299に挿入したプラスミドを用いた場合にカナマイシン耐性組換え体が得られた。得られた組換え体からプラスミドを抽出してアガロース電気泳動により分析したところそれぞれ形質転換に使用したプラスミドと同じ分子量を示すプラスミドが得られた。
【００２９】
【表１】
【００３０】
〔実施例２〕
実施例２と同様にしてロドコッカス ロドクロウス IFO 3338から抽出したプラスミドpRC004(1μg)を制限酵素SmaI及びSacIを5units加え37℃、1時間反応させプラスミドDNAを切断した。制限酵素で切断したプラスミド液を0.7% アガロースゲル電気泳動に供し、約1.7kbのDNA断片を切り出した。
【００３１】
一方、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドベクターpHSG299（宝酒造製）0.5μｇを制限酵素SmaI及びSacIを5units加え37℃、1時間反応させプラスミドDNAを切断した。反応液に1M-Tris-HCl(pH9.0) を1/10量加え、アルカリホスファターゼ(1unit）と65℃、１時間反応させた。制限酵素で切断したプラスミドベクター液を0.7% アガロースゲル電気泳動に供し、2.7kbのDNA断片を切り出した。
【００３２】
それぞれのDNA断片を含む液を等量ずつ混合し、T4DNAリガーゼ1unit, １mM ATP、 10mM ジチオスレイトール, 10mM MgCl2となるように各成分を加えて4℃、1夜反応させた。
上記反応液で大腸菌JM105を形質転換し、上記の約1.7kbのDNA断片の挿入されたプラスミドを取得した。得られたプラスミドを用いて電気パルス法によりロドコッカス ロドクロウス ATCC12674を形質転換したところカナマイシン耐性の形質転換体が取得できた。
【００３３】
〔実施例３〕
実施例２で得られたプラスミドを制限酵素SplIおよびSmaIを5units加え37℃、1時間反応させプラスミドDNAを切断した。切断したプラスミドをエタノール沈殿により回収した後、klenow fragment 5units添加して末端平滑化し、T4DNAリガーゼ1unit、1mM ATP,10mM ジチオスレイトール, 10mM MgCl2となるように各成分を加えて4℃、1夜反応させた。
【００３４】
上記反応液で大腸菌JM105を形質転換し、上記の約1.6kbのDNA断片の挿入されたプラスミドを取得した。得られたプラスミドを用いて電気パルス法によりロドコッカス ロドクロウス ATCC12674を形質転換したところカナマイシン耐性の形質転換体が取得できた。
【００３５】
〔実施例４〕
多コピープラスミドDNA断片の取得。
プラスミドpRC004とプラスミドpHSG299とからなる複合プラスミドベクターpK4を用いて、電気パルス法によりロドコッカス sp N775（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 寄託番号FERM BP-961）を形質転換した。得られた形質転換体を10mlのMYK培地で30℃にて1日培養したものをクリーンベンチ内で紫外線を照射することにより変異処理を行った。変異処理を行った培養液を50〜400μg/mlのカナマイシンを含むMYK寒天培地に塗布し、30℃、3日間培養した。
【００３６】
生育してきたコロニーを培養し、プラスミドを回収した。回収したプラスミドを用いてロドコッカス sp N775を再形質転換して、カナマイシン耐性濃度が上昇していることをチェックした。明らかにカナマイシン耐性濃度が向上している組換え体が数株得られた。得られた組換え体の一つであるpLK006株と変異点を有さない複合ベクターpK4で形質転換した組換え体とから各々、染色体及びプラスミドDNAを調製してプラスミドのコピー数を比較したところ変異処理により得られたpLK006はpK4と比べて約5倍コピー数が上昇していた。
上記微生物のうち、本発明者らにより作製された遺伝子組換え体に関しては、上記番号にて独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧 通産省工業技術院生命工学工業技術研究所）に寄託されている。
【００３７】
〔実施例５〕
変異点の決定。
実施例３により得られた多コピー変異プラスミドpLK006の塩基配列をファルマシア社蛍光シーケンサALFIIを用いて決定した。その結果、配列番号４に示される塩基配列が得られた。配列番号２に示される領域において1336番目のグアニン塩基がチミン塩基へと変異（置換）している。
【００３８】
【発明の効果】
本発明により提供されるロドコッカス属細菌を宿主とする多コピー数プラスミドベクターに有用遺伝子を導入することにより、有用遺伝子の発現量を向上させることが可能である。このようにして有用遺伝子の発現量が向上した遺伝子組換え体は産業上非常に有用である。
【００３９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドpRC001、pRC002、pRC003、pRC004の制限酵素断片地図を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、プラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片に関し、さらに、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片であって、プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が該遺伝子内の少なくとも1カ所に存在するDNA断片および該DNA断片を有する多コピー数プラスミドベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ロドコッカス属に属する微生物は、ニトリル類を水和して対応するアミド類または酸を生産するための微生物触媒として知られており、また、PCB（ポリ塩化ビフェニル）等の分解あるいは原油の脱硫に関与する酵素を生産すること、さらには、排水処理に用いられるようなバイオサーファクタントを生産することなどの非常に多様な性質を示すことから、工業的に極めて有用な微生物であることが知られている。
またロドコッカス ロドクロウス種（Rhodococcus rhodochrous）に属する微生物が極めて高性能なニトリル水和活性を有することが知られており、バイオ法アクリルアミドの製造触媒として工業的に利用されている。
【０００３】
このような状況下、ロドコッカス属の宿主ベクター系の開発が以前から期待され、幾つか開発されている。ロドコッカス属細菌の工業的に有用なプラスミドベクターとしては、例えばロドコッカス ロドクロウス ATCC4276が保持するプラスミドpRC001、ロドコッカス ロドクロウス ATCC14349が保持するpRC002、ロドコッカス ロドクロウス ATCC14348が保持するpRC003およびロドコッカス ロドクロウス IFO 3338が保持するプラスミドpRC004（特許第2983602号公報参照）、および大腸菌細胞内で複製増殖可能なプラスミドDNA領域および薬剤耐性遺伝子を含むDNA領域を有してなる複合プラスミドベクターpK1、pK2、pK3およびpK4（特開平5-64589号公報参照）、ロドコッカス エリスロポリス IFO12320が保持するpRC020（特開平9-28379号公報参照）などが挙げられる。ロドコッカス属細菌を宿主とするプラスミドベクターに有用遺伝子を導入して、該遺伝子を発現させる場合、その有用遺伝子の発現量はプラスミドベクターのコピー数にほぼ比例することが知られている。しかしながら、これらのプラスミドのロドコッカス属細菌の細胞内のコピー数は2〜6程度であり、外来遺伝子を高発現させるためには必ずしも充分なものではない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、多コピー数プラスミドベクターに有用遺伝子を挿入したものを細胞内に導入することにより高い遺伝子増幅効果が期待される。
本発明は、ロドコッカス属細菌内で自律複製し得るプラスミドに由来し、プラスミドの自律増殖に関する遺伝子を含むDNA断片、さらにはロドコッカス属細菌内で自律複製し得るプラスミドに由来し、プラスミドの自律増殖に関する遺伝子を含むDNA断片であって、プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が該遺伝子内の少なくとも1ヵ所に存在するDNA断片を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA領域を明らかにし、プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が該遺伝子内の少なくとも1カ所に存在するDNA断片を取得することにより本発明を完成させた。すなわち、本発明は、プラスミドpRC001、pRC002、pRC003およびpRC004から選ばれるプラスミドに由来し、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片、さらには、ロドコッカス属細菌内で自律複製し得るプラスミドに由来し、プラスミドの自律増殖に関する遺伝子を含むDNA断片であって、プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が該遺伝子内の少なくとも1カ所に存在するDNA断片、に関するものである。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１） プラスミドpRC001、pRC002、pRC003およびpRC004から選ばれるプラスミドに由来し、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片、
（２） 大きさが1.6kbであり、制限酵素SplIおよびSacI切断点を末端に有する（１）のDNA断片、
（３） 大きさが1.7kbであり、制限酵素SmaIおよびSacI切断点を末端に有する（１）のDNA断片、
（４） 大きさが1.9kbであり、制限酵素SmaI切断点を両末端に有する（１）のDNA断片、
（５） 大きさが2.3kbであり、制限酵素SacI切断点を両末端に有する（１）のDNA断片、
（６） pRC004に含まれ、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む、配列番号１の塩基配列からなる（１）のDNA断片、
（７） pRC004に含まれ、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む、配列番号３の塩基配列からなる（１）のDNA断片、
（８） pRC004に含まれ、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む、配列番号７の塩基配列からなる（１）のDNA断片、
（９） プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が少なくとも1カ所に存在する（１）〜（８）のいずれかのDNA断片、
（１０） プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が1カ所に存在する、配列番号２の塩基配列からなる（９）のDNA断片、
（１１） プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が1カ所に存在する、配列番号４の塩基配列からなる（９）のDNA断片、
（１２）プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が1カ所に存在する、配列番号９の塩基配列からなる（９）のDNA断片、
（１３） （９）〜（１２）のいずれかのDNA断片を保有する、ロドコッカス属細菌内で自立増殖し多コピー数存在し得るプラスミド、および
（１４） 請求項１１に記載のDNA断片を保有する、ロドコッカス属細菌内で自律増殖し多コピー数存在し得るプラスミドpLK006。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片であって、プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が該遺伝子内の少なくとも1カ所に存在するDNA断片（以下、多コピープラスミドDNA断片という）とは、プラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片であって、変異点を有さないDNA断片を用いて作成されたプラスミドベクターのコピー数と比較して、変異点を有するDNA断片を用いて作成されたプラスミドベクターのコピー数を増加させうる作用を有するDNA断片を意味する。本明細書においては、コピー数という術語は１細胞当たりのプラスミド分子数（プラスミドの存在数）を意味し、多コピー数という述語は、プラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片であって、変異点を有さないDNA断片を用いて作成されたプラスミドベクターのコピー数よりも多いコピー数を意味する。
【０００８】
本発明の多コピープラスミドDNA断片は、ロドコッカス属細菌内で自律増殖するプラスミドあるいはプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片を適当な変異処理したものの中から取得することができる。
通常は、ロドコッカス属細菌内で自律増殖するプラスミドあるいはプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片をマーカーとなりうる薬剤耐性遺伝子を有するベクタープラスミド、例えばカナマイシン耐性遺伝子を有するpHSG298（宝酒造製）、クロラムフェニコール耐性遺伝子を有するpHSG398（宝酒造製）、テトラサイクリン耐性遺伝子を有するpBR322（宝酒造製）あるいはアンピシリン耐性遺伝子を有するpUC18（宝酒造製）に公知の方法で挿入し、このベクタープラスミドを電気パルス法により宿主ロドコッカス属細菌に形質転換し、得られる形質転換体から公知の方法、例えばアルカリSDS法などによりプラスミドDNAを回収し、制限酵素処理断片の解析などにより目的DNA断片を確認することができる。
【０００９】
適当な変異処理とは、上記のようにして作成したプラスミド保持菌に、紫外線、Ｘ線、γ線などを照射させるか、あるいはN-メチル-N'-ニトロソグアニジンなどの変異剤で処理することなどである。また、生物が増殖する際に起こる自然突然変異を利用することも可能である。
【００１０】
あるいは、ロドコッカス属細菌内で自律増殖するプラスミドあるいはプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片を直接、あるいは1本鎖DNAにした後に、ヒドラジン、ギ酸あるいは亜硝酸で処理すること、または、適当なプライマーを選択して、ヌクレオチドアナログあるいはマンガンイオンの存在下などでPCRを行うことによるエラー誘発PCRなどを含む公知の方法によりDNA断片に直接変異を導入することも効果的である。この方法によれば、DNA配列の特定の場所に集中的に変異を導入することが可能なため、例えば本発明で開示しているようなプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片に特異的に変異を導入することが可能である。また、プラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片を合成することも可能である。
【００１１】
以上のようにして変異を導入した薬剤マーカー遺伝子を有するプラスミドベクターを保持する組換え体を各種濃度の薬剤マーカーによる選択下で培養して薬剤耐性濃度の上昇した菌株を選択することによりプラスミドコピー数の上昇したものを得ることができる。このような菌株は、コピー数上昇による遺伝子増幅効果により薬剤耐性濃度が上昇したものと考えることができる。このような菌株からプラスミドを回収して多コピープラスミドDNA断片を得ることができる。
【００１２】
変異処理を施したロドコッカス属細菌内で自律増殖するプラスミドあるいはプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片の場合には適当な薬剤耐性遺伝子を有する上述のプラスミドベクターを挿入した後、電気パルス法により宿主ロドコッカス属細菌に形質転換し、各種濃度の薬剤マーカーによる選択下で培養して薬剤耐性濃度の上昇した菌株を選択することによりプラスミドコピー数の上昇したものを得ることができる。
マーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子を用いるのが簡便であるが、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼあるいはlacZ遺伝子など検出が簡便な公知の方法を使用することもできる。
【００１３】
コピー数の解析は、例えば Journal of Bacteriology, 152, p.722 (1982)に記載の方法に従い行うことができる。すなわち、細胞より染色体DNAおよびプラスミドDNAを抽出し、双方の分子数の比を求めることにより行うことができる。より簡便には、変異点を有しないプラスミドを保持する組換え体と変異点を有するプラスミドを保持する組換え体を全く同様に培養し、プラスミドを回収してアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロミドなどで染色した後デンシトメトリーにより分析することによりコピー数の比較を行うこともできる。
【００１４】
ロドコッカス ロドクロウス IFO 3338由来のプラスミドpRC004塩基配列を決定した結果を配列番号1に示す。塩基配列情報から、pRC004には２つのオープンリーディング フレーム(ORF)が推定された。１つは配列番号５に示される921塩基（配列番号１の塩基配列の1142番から2062番の塩基）にコードされると予想されるORFであり（配列番号６に推定されるアミノ酸配列を示す）、これは、ロドコッカス ロドクロウス NCIMB13064由来のプラスミドのpKA22およびマイコバクテリウム フォルツイタム由来のpAL5000のプラスミドの複製に関与するRep Aタンパクと類似している。もう１つは配列番号７に示される282塩基（配列番号１の塩基配列の2052番から2333番の塩基）にコードされると推定されるORFであり（配列番号８に推定されるアミノ酸配列を示す）、ロドコッカス エリスロポリス NI86/21由来のプラスミドpFAJ2600のDNA結合性のプラスミド複製因子と推定されているORFと類似している。しかしながら、以上の考察は遺伝子の類似性に基づくものであり、それらの機能を決定しているわけではなく、実際には機能していない疑似遺伝子（シュードジーン）の可能性も高い。
【００１５】
本発明により初めて、pRC004のSplIとSacIによる切断で生じる約1.6kbのDNA断片（配列番号３）が、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む領域であることが判明した。
すなわち、pRC004をSmaIで切断して生じた約1.9kbのDNA断片およびSacIで切断して生じた約2.3kbのDNA断片にロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む領域が含まれていることが判明した。さらにこのSmaIで切断して生じた約1.9kbのDNA断片をSacIで切断して生じた約1.7kbを調べたところ、このDNA断片にもロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む領域が含まれていることが判明した。さらにこの約1.7kbのDNA断片をSplIで切断することにより生じた約1.6kbのDNA断片にもロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む領域が含まれていることが判明した。
【００１６】
上記の制限酵素SplIおよびSacI切断点を末端に有する約1.6kbのDNA断片中に存在するBamHI、BglII、SphI、XhoI認識部位をそれぞれの制限酵素で切断してklenow fragmentなどで処理して末端平滑化してセルフライゲーションしたところ、ロドコッカス属細菌内でのプラスミドの自律増殖の機能が失われたことから、この領域に実際に機能しうるタンパク性の因子が存在することが判明した。
【００１７】
さらに、pRC004の該DNA断片における少なくとも１カ所の変異点の導入によりプラスミドのコピー数を増加させうるという知見は、本発明により初めて開示されたものである。
すなわち、pRC004にマーカーとして機能しうるカナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターを挿入した複合プラスミドベクターを用いて、カナマイシン耐性度が向上した変異体を取得することにより、多コピー変異プラスミドを本発明により初めて取得することができた。
【００１８】
このロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む領域に変異点を少なくとも１カ所導入することにより多コピー変異プラスミドが得られることを初めて見いだした意義は大きく、この発明を基に公知の方法により容易に多コピー変異プラスミドが得られることを意味しているものと思われる。
【００１９】
このような多コピー変異プラスミドの例としては、本発明で得られたプラスミドpLK006などを挙げることができる。pLK006では、ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む領域のうち、配列番号３に示される領域において1336番目のグアニン塩基がチミン塩基へ置換した変異体である（配列番号４）。これは、配列番号１の塩基配列の2262番目の塩基、配列番号７の塩基配列の211番目の塩基に相当し、配列番号２および配列番号９はそれぞれ配列番号１および配列番号７の１つの塩基において変異を有する配列を示している。推定されるORFのコードするアミノ酸配列は、配列番号８の71番目のグリシンがセリンに変異（置換）したものである（配列番号１０）。
なお、プラスミドpLK006は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号FERM P-18392として、平成13年6月22日に寄託されている。
【００２０】
また、本発明のDNA断片には、該DNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片、または該DNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を有し、プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が少なくとも1ヵ所に存在する遺伝子を含むDNA断片も含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件は、相同性が高いDNA同士、例えば少なくとも60％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは95％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性の低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーション洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1%SSD、好ましくは、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。このようなDNAは、例えば部位特異的変異法によって、本発明のDNA断片の塩基配列を改変することによって得られる。
【００２１】
【実施例】
次に、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、下記の実施例は本発明の技術的範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕
pRC004のロドコッカス属細菌でプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むDNA断片の調製
ロドコッカス ロドクロウス IFO 3338から抽出したプラスミドpRC004(1μg)を制限酵素SmaIあるいはSacIを5units加え37℃、1時間反応させプラスミドDNAを切断した。制限酵素で切断したプラスミド液を0.7% アガロースゲル電気泳動に供し、SmaIで切断したものは、約650bp、約1.9kbのDNA画分を、SacIで切断したものは、約300bp、約2.3kbのDNA断片をそれぞれ切り出した。
【００２２】
一方、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドベクターpHSG299（宝酒造製）0.5μgを制限酵素SmaIあるいはSacIを5units加え37℃、1時間反応させプラスミドDNAを切断した。反応液に1M-Tris-HCl(pH9.0) を1/10量加え、アルカリホスファターゼ(1unit）と65℃、1時間反応させた。制限酵素で切断したプラスミドベクター液を0.7% アガロースゲル電気泳動に供し、それぞれ2.7kbのDNA断片を切り出した。
【００２３】
DNA断片の切り出しの際は、サイズマーカーとしてラムダファージDNAのHindIII消化物を用い、DNAのサイズを算出した。Gene clean kit（フナコシ（株))を用いてアガロースゲルよりDNAを回収しＴＥ緩衝液（10mMTris-HCl, １mMEDTA, (pH8.0)）に溶解した。
それぞれのDNA断片を含む液を等量ずつ混合し、T4DNAリガーゼ1unit, １mM ATP, 10mM ジチオスレイトール, 10mM MgCl2となるように各成分を加えて4℃、1夜反応させた。
【００２４】
大腸菌JM105株のコンピテントセル（宝酒造製）に上記反応液を加え、0℃、１時間静置後、42℃、2分間の熱処理を行い、2×YT培地（0.5％NaCl，1％イーストエキス、1.6％トリプトン）を加えて37℃、1時間振とうした。 25μｇ／mlカナマイシン、１mM IPTG（イソプロピル-β-ガラクトピラノシド）、および0.02％ X-gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド)を含む2×YT寒天培地に塗布し、37℃、1夜静置培養した。出現したコロニーより白色のコロニーを選択し、50μg/mlカナマイシン入りの2×YT培地（3ml）で37℃にて8時間振とう培養した。
【００２５】
15,000rpm、5分間の遠心分離により菌体を回収し、0.35ml STET溶液（8％シュークロース、0.５％ TritonX-100, 50mM EDTA, 10mM Tris-HCl(pH8.0))に懸濁した。リゾチーム液（10mg／ml）25μlを加え、Vortexで3秒間攪拌後、沸騰している湯に50秒間浸した。15,000rpm、15分間の遠心分離により沈澱を取り除き上清を得た。これにTE飽和フェノール：クロロホルム（1:1）液を0.5ml加え攪拌後、15,000rpm、5分遠心分離を行い、上層を得た。ジエチルエーテル0.5mlを加えて混合後、遠心分離を行い上層を除去した。イソプロパノール0.5ml、2.5M酢酸ナトリウム液 (pH4.5) 50μlを加え、−80℃、30分静置後15,000rpm、10分遠心分離を行い沈澱を得た。70％エタノールで洗浄し、減圧乾燥させ、0.１mlのTE緩衝液に溶解させた。
【００２６】
このようにして調製した上記プラスミド溶液を用いて、制限酵素SmaIあるいはSacIで切断して、目的のDNA断片が挿入されていることを確認した。それぞれのDNA断片が挿入されたプラスミドを用いて、電気パルス法によりロドコッカス ロドクロウス ATCC12674を宿主として形質転換を行った。
【００２７】
電気パルス法による形質転換は、以下の方法で行った。ロドコッカス ロドクロウス ATCC12674株の対数増殖期の細胞を遠心分離機により集菌し、氷冷した滅菌水にて3回洗浄し、滅菌水に懸濁した。上記のプラスミド1μlと菌体懸濁液10μlを混合し氷冷した。キュベットにDNAと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置Gene Pulser(BIO RAD)により2.0kV、200 OHMSで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下、10分間静置し、37℃で10分間ヒートショックを行い、MYK培地（0.5％ポリペプトン、0.3％バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、0.2％K2HPO4、0.2％KH2PO4)500μlを加え、30℃、5時間静置した後、50mg/Lカナマイシン入りMYK寒天培地に塗布し、30℃、3日間培養した。
【００２８】
表１に使用したプラスミドと形質転換体の取得の有無を示す。pRC004の約1.9kbのSmaI切断断片及び約2.3kbのSacI断片をプラスミドベクターpHSG299に挿入したプラスミドを用いた場合にカナマイシン耐性組換え体が得られた。得られた組換え体からプラスミドを抽出してアガロース電気泳動により分析したところそれぞれ形質転換に使用したプラスミドと同じ分子量を示すプラスミドが得られた。
【００２９】
【表１】
〔実施例２〕
実施例２と同様にしてロドコッカス ロドクロウス IFO 3338から抽出したプラスミドpRC004(1μg)を制限酵素SmaI及びSacIを5units加え37℃、1時間反応させプラスミドDNAを切断した。制限酵素で切断したプラスミド液を0.7% アガロースゲル電気泳動に供し、約1.7kbのDNA断片を切り出した。
【００３１】
一方、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドベクターpHSG299（宝酒造製）0.5μｇを制限酵素SmaI及びSacIを5units加え37℃、1時間反応させプラスミドDNAを切断した。反応液に1M-Tris-HCl(pH9.0) を1/10量加え、アルカリホスファターゼ(1unit）と65℃、１時間反応させた。制限酵素で切断したプラスミドベクター液を0.7% アガロースゲル電気泳動に供し、2.7kbのDNA断片を切り出した。
【００３２】
それぞれのDNA断片を含む液を等量ずつ混合し、T4DNAリガーゼ1unit, １mM ATP、 10mM ジチオスレイトール, 10mM MgCl2となるように各成分を加えて4℃、1夜反応させた。
上記反応液で大腸菌JM105を形質転換し、上記の約1.7kbのDNA断片の挿入されたプラスミドを取得した。得られたプラスミドを用いて電気パルス法によりロドコッカス ロドクロウス ATCC12674を形質転換したところカナマイシン耐性の形質転換体が取得できた。
【００３３】
〔実施例３〕
実施例２で得られたプラスミドを制限酵素SplIおよびSmaIを5units加え37℃、1時間反応させプラスミドDNAを切断した。切断したプラスミドをエタノール沈殿により回収した後、klenow fragment 5units添加して末端平滑化し、T4DNAリガーゼ1unit、1mM ATP,10mM ジチオスレイトール, 10mM MgCl2となるように各成分を加えて4℃、1夜反応させた。
【００３４】
上記反応液で大腸菌JM105を形質転換し、上記の約1.6kbのDNA断片の挿入されたプラスミドを取得した。得られたプラスミドを用いて電気パルス法によりロドコッカス ロドクロウス ATCC12674を形質転換したところカナマイシン耐性の形質転換体が取得できた。
【００３５】
〔実施例４〕
多コピープラスミドDNA断片の取得。
プラスミドpRC004とプラスミドpHSG299とからなる複合プラスミドベクターpK4を用いて、電気パルス法によりロドコッカス sp N775（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 寄託番号FERM BP-961）を形質転換した。得られた形質転換体を10mlのMYK培地で30℃にて1日培養したものをクリーンベンチ内で紫外線を照射することにより変異処理を行った。変異処理を行った培養液を50〜400μg/mlのカナマイシンを含むMYK寒天培地に塗布し、30℃、3日間培養した。
【００３６】
生育してきたコロニーを培養し、プラスミドを回収した。回収したプラスミドを用いてロドコッカス sp N775を再形質転換して、カナマイシン耐性濃度が上昇していることをチェックした。明らかにカナマイシン耐性濃度が向上している組換え体が数株得られた。得られた組換え体の一つであるpLK006株と変異点を有さない複合ベクターpK4で形質転換した組換え体とから各々、染色体及びプラスミドDNAを調製してプラスミドのコピー数を比較したところ変異処理により得られたpLK006はpK4と比べて約5倍コピー数が上昇していた。
上記微生物のうち、本発明者らにより作製された遺伝子組換え体に関しては、上記番号にて独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（旧 通産省工業技術院生命工学工業技術研究所）に寄託されている。
【００３７】
〔実施例５〕
変異点の決定。
実施例３により得られた多コピー変異プラスミドpLK006の塩基配列をファルマシア社蛍光シーケンサALFIIを用いて決定した。その結果、配列番号４に示される塩基配列が得られた。配列番号２に示される領域において1336番目のグアニン塩基がチミン塩基へと変異（置換）している。
【００３８】
【発明の効果】
本発明により提供されるロドコッカス属細菌を宿主とする多コピー数プラスミドベクターに有用遺伝子を導入することにより、有用遺伝子の発現量を向上させることが可能である。このようにして有用遺伝子の発現量が向上した遺伝子組換え体は産業上非常に有用である。
【００３９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドpRC001、pRC002、pRC003、pRC004の制限酵素断片地図を示す図である。
Claims (5)
- プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が1カ所に存在する、配列番号２の塩基配列からなるDNA断片。
- プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が1カ所に存在する、配列番号４の塩基配列からなる、請求項１に記載のDNA断片。
- プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が1カ所に存在する、配列番号９の塩基配列からなる、請求項１に記載のDNA断片。
- 請求項１〜３のいずれか1項に記載のDNA断片を保有する、ロドコッカス属細菌内で自立増殖し多コピー数存在し得るプラスミド。
- 請求項２に記載のDNA断片を保有する、ロドコッカス属細菌内で自律増殖し多コピー数存在し得る、受託番号がFERM P-18392である、プラスミドpLK006。
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