CN100529082C - 含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的dna片段 - Google Patents

含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的dna片段 Download PDF

Info

Publication number
CN100529082C
CN100529082C CNB2006101154233A CN200610115423A CN100529082C CN 100529082 C CN100529082 C CN 100529082C CN B2006101154233 A CNB2006101154233 A CN B2006101154233A CN 200610115423 A CN200610115423 A CN 200610115423A CN 100529082 C CN100529082 C CN 100529082C
Authority
CN
China
Prior art keywords
plasmid
gene
dna fragmentation
sequence
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB2006101154233A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1944653A (zh
Inventor
水无涉
汤不二夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mitsubishi Kasei Corp
Original Assignee
Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsubishi Rayon Co Ltd filed Critical Mitsubishi Rayon Co Ltd
Publication of CN1944653A publication Critical patent/CN1944653A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100529082C publication Critical patent/CN100529082C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/69—Increasing the copy number of the vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供含有与质粒自主增殖相关的基因的DNA片段，以及作为含有与质粒自主增殖相关的基因的DNA片段，在该基因内至少存在一处可使质粒的拷贝数增加的突变点的DNA片段。含有具有与红球菌属细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段，在该基因内至少存在一处可使质粒的拷贝数增加的突变点的DNA片段，以及拥有在该基因内至少存在一处可使质粒的拷贝数增加的突变点的DNA片段的质粒。

Description

含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的DNA片段
本申请是申请日为2002年7月3日，申请号为02817314.7，发明名称为含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的DNA片段的分案申请。
技术领域
本发明涉及含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的DNA片段，进一步涉及作为含有具有与红球菌属细菌内质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段，在该基因内至少存在一处使质粒的拷贝数增加的突变点的DNA片段以及含有该DNA片段的多拷贝质粒载体。
背景技术
属于红球菌属的微生物作为微生物催化剂用于对腈进行水合，生产对应的酰胺类或酸已为人们所知，另外由于表现出非常多样的性质，如生产有关PCB(多氯联(二)苯)等的分解或原油的脱硫的酶，以及生产排水处理中使用的那样的生物表面活性剂等，所以在工业是非常有用的微生物。
另外属于紫红红球菌种(Rhodococcus rhodochrous)的微生物具有极高性能的腈水合活性已为人们所知，作为生物法制造丙烯酰胺的催化剂被用于工业上。
在这种状况下，人们从以前就期待红球菌属的宿主载体系的开发，并已经开发了几个。作为红球菌属细菌的工业上有用的质粒载体，可列举例如，紫红红球菌ATCC4276携带的质粒pRC001、紫红红球菌ATCC14349携带的质粒pRC002、紫红红球菌ATCC14348携带的质粒pRC003以及紫红红球菌IFO 3338携带的质粒pRC004(参照日本专利第2983602号公报)，以及由在大肠杆菌细胞内可复制增殖的质粒DNA区域和含有药剂抗性基因的DNA区域构成的复合质粒载体pK1、pK2、pK3和pK4(参照特开平5-64589号公报)、红串红球菌IFO12320携带的pRC020(参照特开平9-28379号公报)等。已知将有用基因导入以红球菌属细菌作为宿主的质粒载体之后，使该基因表达时，该有用基因的表达量大致与质粒载体的拷贝数成比例。然而，这些质粒在红球菌属细菌的细胞内的拷贝数为2～6左右，用于使外源基因高表达未必充分。
发明的公开
因此，通过将有用基因插入多拷贝质粒载体后导入细胞内，人们期待着能获得高的基因扩增效果。
本发明的目的在于提供来自在红球菌属细菌内可自主复制的质粒的、含有与质粒自主增殖有关的基因的DNA片段，以及作为来自在红球菌属细菌内可自主复制的质粒的，含有有关质粒自主增殖基因的DNA片段，在该基因内至少存在一处使质粒拷贝数增加的突变点的DNA片段。
本发明者们通过阐明含有具有与红球菌属细菌内质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA区域，获得在该基因内至少存在一处使质粒拷贝数增加的突变点的DNA片段，使得本发明完成。即，本发明涉及一种DNA片段，其含有具有与红球菌属细菌内质粒的自主增殖相关的功能的基因，该基因来源于质粒pRC001、pRC002、pRC003和pRC004，以及作为来自在红球菌属细菌内可自主复制的质粒的，含有与质粒自主增殖有关的基因的DNA片段，在该基因内至少存在一处使质粒拷贝数增加的突变点的DNA片段。
即，本发明如下构成：
(1)一种DNA片段，其包含具有与红球菌属(Rhodococcus)细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因，该基因来源于质粒pRC001、pRC002、pRC003和pRC004。
(2)(1)的DNA片段，大小为1.6kb，在末端含有限制性内切酶SplI和SacI切割位点。
(3)(1)的DNA片段，大小为1.7kb，在末端含有限制性内切酶SmaI和SacI切割位点。
(4)(1)的DNA片段，大小为1.9kb，在两末端含有限制性内切酶SmaI切割位点。
(5)(1)的DNA片段，大小为2.3kb，在两末端含有限制性内切酶SacI切割位点。
(6)(1)的DNA片段，其含有包含在pRC004中的具有与红球菌属(Rhodococcus)细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因，由序列1的碱基序列构成。
(7)(1)的DNA片段，其含有包含在pRC004中的具有与红球菌属细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因，由序列3的碱基序列构成。
(8)(1)的DNA片段，其含有包含在pRC004中的具有与红球菌属细菌中质粒的自主增殖相关的功能的基因，由序列7的碱基序列构成。
(9)(1)～(8)中的任一个DNA片段，其中至少存在一处可使质粒拷贝数增加的突变点。
(10)(9)的DNA片段，其是由存在一处可使质粒拷贝数增加的突变点的序列2的碱基序列构成的。
(11)(9)的DNA片段，其是由存在一处可使质粒拷贝数增加的突变点的序列4的碱基序列构成的。
(12)(9)的DNA片段，其是由存在一处可使质粒拷贝数增加的突变点的序列9的碱基序列构成的。
(13)拥有(9)～(12)中任一项记载的DNA片段的，可在红球菌属细菌内自主增殖并具有多个拷贝的质粒。以及
(14)拥有权利要求11中记载的DNA片段的，可在红球菌属细菌内自主增殖并具有多个拷贝的质粒pLK006。
所谓作为具有与红球菌属细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段，在该基因内至少存在一处可使质粒的拷贝数增加的突变点的DNA片段(以下称为多拷贝质粒DNA片段)指的是，作为含有具有与质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段，是与使用没有突变点的DNA片段制作的质粒载体的拷贝数相比，具有可使利用有突变点的DNA片段制作的质粒载体的拷贝数增加的作用的DNA片段。在本说明书中，称之为拷贝数的术语指的是1个细胞中的质粒分子数(存在的质粒数)，称之为多拷贝数的术语指的是作为含有具有有关质粒的自主增殖功能的基因的DNA片段，与使用没有突变点的DNA片段制作的质粒载体的拷贝数相比具有更多的拷贝数。
本发明的多拷贝质粒DNA片段可以从对在红球菌属细菌内自主增殖的质粒或含有具有与质粒的自主增殖相关的功能的基因的DNA片段进行适当的变异处理的产物中获得。
通常，将在红球菌属细菌内自主增殖的质粒或含有具有与质粒的自主增殖相关的功能的基因的DNA片段使用众所周知的方法插入到含有可成为标记的药剂抗性基因的载体质粒，例如含有卡那霉素抗性基因的pHSG298(宝酒造制造)、含有氯霉素抗性基因的pHSG398(宝酒造制造)、含有四环素抗性基因的pBR322(宝酒造制造)或含有氨苄青霉素抗性基因的pUC18(宝酒造制造)，通过电脉冲法使该载体质粒转化宿主红球菌属细菌，通过众所周知的方法、例如碱SDS方法等从得到的转化体中回收质粒DNA，通过限制性内切酶处理片段的解析等，可以确认目的DNA片段。
所谓适当的变异处理指的是，对象上述那样制作的质粒保持菌照射紫外线、X射线、γ射线等，或用N-甲基-N’-亚硝基胍等诱变剂进行处理。另外也可以利用在生物增殖时发生的自然突变。
或者，对在红球菌属细菌内自主增殖的质粒或含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的DNA片段直接、或做成单链DNA后，用肼、甲酸或亚硝酸进行处理，或通过包括选择适当的引物，在核苷酸类似物或锰离子存在下等进行PCR的诱发错误PCR等众所周知方法向DNA片段直接导入变异也是有效果的。通过这样的方法，由于可以集中将变异导入DNA序列的特定地方，例如可以将变异特异导入到本发明所公布那样的含有具有与质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段中。另外，合成含有具有与质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段也是可能的。
通过在利用各种浓度的药剂标记的选择下对拥有上述那样导入了变异的含有药剂标记基团的质粒载体的重组体进行培养，并选择药剂抗性浓度上升的菌株，可以得到质粒拷贝数上升的菌株。这样的菌株，由于拷贝数上升出现基因扩增效果，可以被认为是药剂抗性上升的菌株。从这样的菌株回收质粒可以得到多拷贝质粒DNA片段。
对于在实施了变异处理的在红球菌属细菌内进行自主增殖的质粒或含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的DNA片段的情况，插入含有适当的药剂抗性基因的上述质粒载体后，利用电脉冲转化宿主红球菌属细菌，通过在利用各种浓度的药剂标记的选择下进行培养，选择药剂抗性浓度上升的菌株，可以得到质粒拷贝数上升的菌株。
标记基因使用药剂抗性基因是简便的，而碱性磷酸酶、荧光素酶或lacZ基因等检测也可以使用简便的众所周知的方法。
拷贝数的解析可以根据例如Journal of Bacteriology，152，p.722(1982)记载的方法进行。即通过从细胞中提取染色体DNA和质粒DNA，求双方的分子数的比来进行。更简便的是对拥有无突变点的质粒的重组体和拥有突变点的质粒的重组体都同样进行培养，回收质粒，进行琼脂糖电泳，通过对经溴乙锭等染色后的密度测量分析，也可以比较拷贝数。
序列1给出了确定的来自紫红红球菌IFO3338的质粒pRC004碱基序列的结果。从碱基序列信息可以推定pRC004中有两个开放读码框(ORF)。一个是预料为被序列5所示的921碱基(从序列1碱基序列的第1142号碱基开始到2062号的碱基)编码的ORF(序列6给出了推定的氨基酸序列)，他与参与来自紫红红球菌NCIMB13064的质粒的pKA22和来自偶发分枝杆菌的pAL5000的质粒的复制的RepA蛋白质类似。另一个ORF是预料为被序列7所示的282碱基(从序列1碱基序列的第2052号开始到2333号的碱基)编码的ORF(序列8给出了推定的氨基酸序列)，他与被推定为来自红串红球菌NI86/21的质粒的pFAJ 2600的DNA结合性的质粒复制因子的ORF类似。然而，以上考察是基于基因类似性的结果，当然不能确定它们的功能，实际上为不具有功能的疑似基因(假基因)的可能性也很高。
本发明初次判明pRC004经Sp1I和SacI酶切生成的约1.6kb的DNA片段(序列3)是含有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域。
即，判明在pRC004经SmaI酶切生成的约1.9kb的DNA片段和经SacI酶切生成的约2.3kb的DNA片段中含有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域。对经SmaI酶切生成的约1.9kb的DNA片段用SacI切后生成的约1.7kb的DNA片段进一步研究时，判明在该DNA片段中也含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域。进一步判明，在将该约1.7kb的DNA片段用SplI切后生成的约1.6kb的DNA片段中，也含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域。
对末端含有上述限制性内切酶SplI和SacI切点的约1.6kb的DNA片段中存在的BamHI、Bg1II、SphI、XhoI识别部位分别用相应的限制性内切酶进行酶切后，再用klenow fragment等处理使之平末端化后进行自身连接时，由在红球菌属细菌内质粒自主增殖的功能丧失可以判明该区域实际上存在着可发挥功能的蛋白质性因子。
另外，通过在pRC004的该DNA片段中至少导入一处突变点可以使质粒的拷贝数增加的知识，正是本发明首次公布的内容。
即，通过使用向pRC004插入了含有可以起到标记功能的卡那霉素抗性基因的质粒载体的复合质粒载体，获得卡那霉素抗性提高了的变异体，本发明能够首次获得多拷贝变异质粒。
首次发现通过向这个含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域至少导入一处突变点可以得到多拷贝变异质粒的意义非常大，这就意味着以该发明为基础通过众所周知的方法可以很容易得到多拷贝变异质粒。
作为这样的多拷贝变异质粒的例子，可列举例如，在本发明中得到的质粒pLK006等。pLK006是在含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域中，序列3所示区域内1336号的鸟嘌呤碱基置换为胸腺嘧啶碱基后的变异体(序列4)。这相当于序列1碱基序列的2262号碱基。序列7碱基序列的211号的碱基，序列2和序列9分别表示在序列1和序列7的一个碱基中含有变异的序列。推定的ORF编码的氨基酸序列是序列8的第71位的甘氨酸变异(置换)为丝氨酸的序列(序列10)。
另外，质粒pLK006于2001年6月22日以保藏号FERM BP-8085保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6)。
而在本发明的DNA片段中也包括在严格条件下与该DNA杂交的，而且含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的DNA片段，或在严格条件下与该DNA杂交的，而且含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能、且存在至少一处使质粒的拷贝数增加的突变点的基因的DNA片段。这里所谓在严格条件下，指的是形成所谓的特异的杂化体，不形成非特异的杂化体的条件。该条件可列举例如，具有同源性高的DNA之间，例如具有至少60％或其以上、优选在80％或其以上、更优选95％或其以上同源性的DNA之间进行杂交，而同源性比它们低的DNA之间不杂交的条件，或者是在相当于作为通常sorthern杂交清洗条件的60℃、1×SSC、0.1％SSD、优选0.11×SSC、0.1％SDS盐浓度下进行杂交的条件。这样的DNA，例如利用位点特异变异法，通过改变本发明的DNA片段碱基序列可以获得。
附图的简单说明
图1是表示质粒pRC001、pRC002、pRC003和pRC004的限制性内切酶片段谱图。
实施发明的最佳形态
以下通过实施例对本发明进行更具体的说明，但下述的实施例并不限定本发明的技术范围。
实施例1
含有具有与pRC004在红球菌属细菌内进行质粒自主增殖相关功能的基因的DNA片段的制备
向从紫红红球菌IFO3338提取的质粒pRC004(1μg)中加入5units限制性内切酶SmaI或SacI，于37℃下反应1小时，对质粒DNA进行酶切。将限制性内切酶酶切的质粒溶液进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，分别切出SmaI切的产物中的约650bp、约1.9kb的DNA级分，用SacI切的产物中的约300bp、约2.3kb的DNA片段。
另外，向0.5μg的含有卡那霉素抗性基因的质粒载体pHSG299(宝酒造制造)加入5units限制性内切酶SmaI或SacI，于37℃下反应1小时，对质粒DNA进行酶切。向反应液中加入1/10量的1M-Tris-HCl(pH9.0)，与碱性磷酸酶(1unit)于65℃下反应1小时。将限制性内切酶酶切的质粒载体溶液进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，分别切出2.7kb的DNA片段。
DNA片段切出时，作为大小标志分子使用λ噬菌体DNA的HindIII消化物，算出DNA的大小。使用Gene clean kit(フナコシ(株))，从琼脂糖凝胶中回收DNA，溶解在TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，(pH8.0))中。
将含有各个DNA片段的溶液等量混合，加入终浓度达到1unit T4DNA连接酶、1mM ATP、10mM二硫苏糖醇、10mM MgCl2的各成分，于4℃下反应过夜。
将上述反应液加到大肠杆菌JM105株感受态细胞(宝酒造生产)中，于0℃下静置1小时后，于42℃下进行2分钟热处理，加2×YT培养基(0.5％NaCl、1％酵母提取物、1.6％胨)，于37℃下振荡1小时。涂布到含有25μg/ml卡那霉素、1mM IPTG(异丙基-β-吡喃半乳糖苷)、以及0.02％X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)的2×YT琼脂培养基上，于37℃下静置培养过夜。从出现的菌落中选择白色的菌落，在加入50μg/ml卡那霉素的2×YT培养基(3ml)中，于37℃下振荡培养8小时。
通过于15,000rpm下离心分离5分钟，回收菌体，悬浮于0.35ml STET溶液(8％蔗糖、5％TritonX-100，50mM EDTA，10mM Tris-HCl(pH8.0))中。加入溶菌酶液(10mg/ml)25μl，用Vortex搅拌3秒后，浸入到沸腾的水中50秒。通过于15,000ypm下离心分离15分钟，除去沉淀，得到上清。向上清中加入0.5ml的TE饱和酚∶氯仿(1∶1)液，搅拌后，于15,000rpm下离心分离5分钟，得到上层液。加乙醚0.5ml混合后，通过离心分离除去上层。加入异丙醇0.5ml、2.5M醋酸钠液(pH4.5)50μl，于-80℃下静置30分钟后，于15,000rpm下离心分离10分钟，得到沉淀。用70％乙醇洗净，进行减压干燥，溶解在0.1ml的TE缓冲液中。
使用上述那样制备的质粒溶液，用限制性内切酶SmaI或SacI切，确认目的DNA片段的插入。使用插入了各个DNA片段的质粒，以紫红红球菌ATCC12674作为宿主，利用电脉冲法进行转化。
利用电脉冲法的转化按照以下方法进行。通过离心机收集紫红红球菌ATCC12674菌株的对数增殖期的细胞，用冰冷的灭菌水洗3次，悬浮于灭菌水中。将上述质粒1μl和菌体悬浮液10μl混合，进行冰冷。将DNA和菌体加入到一个小池中，通过基因导入装置Gene Pulser(BIO RAD)用2.0kV、200OHMS进行电脉冲处理。将电脉冲处理液于冰冷下静置10分钟，于37℃下进行10分钟热激。加MYK培养基(0.5％多胨、0.3％细菌培养用酵母提取物、0.3％细菌培养用麦芽提取物、0.2％K2HPO4、0.2％KH2PO4)500μl，于30℃下静置5小时后，涂布到加入了50mg/l卡那霉素的MYK琼脂培养基上，于30℃下培养3天。
表1给出了使用的质粒和有无获得转化体。使用将pRC004的约1.9kb的SmaI酶切片段和约2.3kb的SacI片段插入到质粒载体pHSG299的质粒时，可以得到卡那霉素抗性的重组体。从得到的重组体提取质粒进行琼脂糖电泳分析时，可以得到与在各个转化中使用的质粒相同的分子量的质粒。
表1
  使用的质粒   有无获得卡那霉素抗性转化体
  SmaI 650bp+pHSG299   没有得到
  SmaI 1.9kb+pHSG299   获得
  SacI 300bp+pHSG299   没有得到
  SacI 2.3kb+pHSG299   获得
实施例2
与实施例1同样操作，向从紫红红球菌IFO3338提取的质粒pRC004(1μg)中加入5units限制性内切酶SmaI或SacI，反应1小时，对质粒DNA进行酶切。将限制性内切酶酶切的质粒溶液进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，切出约1.7kb的DNA片段。
另外，向0.5μg的含有卡那霉素抗性基因的质粒载体pHSG299(宝酒造制造)加入5units限制性内切酶SmaI和SacI，在37℃反应1小时，对质粒DNA进行酶切。向反应液中加入1/10量的1M-Tris-HCl(pH9.0)，与碱性磷酸酶(1unit)于65℃下反应1小时。将限制性内切酶酶切的质粒载体溶液进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，切出2.7kb的DNA片段。
将含有各个DNA片段的溶液等量混合，加入各个成分达到T4DNA连接酶1unit、1mM ATP、10mM二硫苏糖醇、10mM MgCl2，于4℃下反应过夜。
用上述反应液转化大肠杆菌JM105，获得插入了上述约1.7kb的DNA片段的质粒。使用得到的质粒，利用电脉冲法对紫红红球菌ATCC12674进行转化，可以得到卡那霉素抗性的转化体。
实施例3
向实施例2得到的质粒中加入5units限制性内切酶SplI和SmaI，于37℃下反应1小时，对质粒DNA进行酶切。通过乙醇沉淀回收酶切的质粒后，添加klenow fragment 5units，进行平末端化，加入各个成分达到1unit T4DNA连接酶、1mM ATP、10mM二硫苏糖醇、10mM MgCl2，于4℃下反应过夜。
使用上述反应液转化大肠杆菌JM105，获得插入了上述约1.6kb的DNA片段的质粒。使用得到的质粒，利用电脉冲法对紫红红球菌ATCC12674进行转化，可以获得卡那霉素抗性的转化体。
实施例4
多拷贝质粒DNA片段的获得
使用由质粒pRC004和质粒pHSG299构成的复合质粒载体pK4，利用电脉冲法对红球菌sp N775(以保藏号FERM BP-961于1986年1月10日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6))进行转化，通过对得到的转化体在10ml的MYK培养基中于30℃下培养1天后在净化台内照射紫外线，进行变异处理。将进行了变异处理的培养液涂布在含有50～400μg/ml卡那霉素的MYK琼脂培养基上，于30℃下培养3天。
对存活下来的菌落进行培养，回收质粒。用回收的质粒再转化红球菌sp N775，验证卡那霉素抗性浓度上升。显然可以得到数株卡那霉素浓度提高的重组体。由用得到的重组体之一的pLK006株和不含有突变点的复合载体pK4转化的重组体分别制备染色体和质粒DNA，对质粒的拷贝数进行比较时，发现经变异处理得到的pLK006与pK4相比拷贝数上升了约5倍。
上述微生物中，与本发明人等制作的基因重组体有关的微生物保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。
实施例5
突变点的确定
使用Pharmacia公司荧光测序仪ALFII确定了实施例3得到的多拷贝变异质粒pLK006的碱基序列。其结果得到了序列4所表示的碱基序列。序列2所示的区域内1336位的鸟嘌呤碱基变异(置换)为胸腺嘧啶碱基。
产业上的可利用性
通过将有用的基因导入本发明提供的以红球菌属细菌为宿主的多拷贝质粒载体，可以使有用基因的表达量提高。这样一来，有用基因的表达量提高的基因重组体在产业上是非常有用的。
本说明书中引用的所有刊物为其所有内容收入到本说明书的刊物。另外，同行应当容易理解在没有脱离附加的权利要求范围中记载的技术思想和发明的范围的范围内，本发明的种种变形以及变更都是可能的。本发明的意思是指本发明也包括这样的变形以及变更。
序列表
<110>三菱丽阳株式会社
<120>含有具有有关质粒自主增殖功能的基因的DNA片段
<130>PH-1601-PCT
<140>
<141>
<150>JP 2001/204628
<151>2001-07-05
<160>10
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>2582
<212>DNA
<213>紫红红球菌
<400>1
cgatggcaag ccaccgcgaa gcggtggcgc ggcagaacct cgttttgccc ctgaggaggt 60
gacgcgaatg catgaagcat gtcgcacttg cgcgccttgt cctgttatct gtaagatcga 120
cccctggtgt acctcgtgca cccaaaatca ggcccggtgg ttcctttgga cccgggcctt 180
cgttatttcc acgccagccc gagctccgcc cgctcgtgca agcgtcatgc tcttcgtccg 240
tgatcaagac ctccgaacct atggccggcc aaccccctcg ggttgcgtcg gcctgacccg 300
ttctagggcg tctacgcggc cgctttccca ctccgtccat accaaccccc gcaccaaagg  360
tccgggggtt ttttcatgcc cggattcggt cgcggctgcg cctcgacggt ctccggttgc  420
ccaaggaggc acccatgact tgctccacct gctcctcgcc tgcccccgaa ccgcgaccgt  480
cgcgcaaaga ggcggtccag caactcgcga tccgatcgct ggcgttcttg tttcgccact  540
gcacacgaat cgccctgaac gaagtggtcc aagaactgat ccgcatcaag ttcggcggtt  600
gaccgcggac gtgcacctgt agagcgggtt gcagcgagac accgatgaac cactctccgc  660
tgcctaggcg acccggttct ggaaagatca tcaccgagtg tccggcccca ccccctgcgg  720
gccggacact catctgtatg gcagcgtgcc tcccttcctg cccttcccac tgatcgtttc  780
ctcctgccaa aaatcgggac acacctcttg cagaagttct gacacccggg aaaggccggc  840
cgaaaggggg cgctcaccga ccactctgat cgagaagttc tgccgcaccc accagccgta  900
cccggccaac cttccgcagt cccagccgta cgaaacggtc tcgtgccact ccaccggccc  960
tggtgtcgat cgactacaaa ccaagatccc cacacacctc atgcactaaa gctgcgacca  1020
cgaagaacaa ggtggtccgg gtaagacgga agggagtttt cccaggaggg tcgccgaaac  1080
atctgacttg gttggcgtgt cctacataaa aaaattgatc ttgcgtgtga gggtgtcacg  1140
catggatatg agcgggggat ctctcagtgg ggactgggag cagttgtggc tgcctctgtg  1200
gccgctcgca acggacgatt tgttgcttgg ggtctaccgg atgcctcgcc aggatgcgct  1260
cgatcggcgc taccttgagg ccaatccgca ggcgctgagc aatctcctcg tcgtcgatgt  1320
cgatcatcca gacgcggcac tgcgggctct gtctgccgcc ggcaaccatc ccttgccgaa  1380
cgcgatcgtg gaaaacccgc gcaatggaca cgcacatgcg gtgtgggcat tgaccgaacc  1440
tttcacgcgc accgagtacg ccagacgtaa gccactcgct tatgccgcag cggtaaacga  1500
ggggctgcgt cgagctgtcg atggcgatgc cgcctattcg gggttgatga cgaagaaccc  1560
gactcactca gcctgggaca cacactggat ccacgccgag actcgatcgc tggcagatct  1620
cgaacatgac ctcggaaagc atatgccgcc accccggtgg cgacagagca aacgtcgtcg  1680
cgaagaccca gtcggactcg gacgtaattg catgctcttc gagacggcac gcacttgggc  1740
ataccgcgaa ttgcgttgcc attggggaga tcccgaaggt ttagggaaag caattcaggt  1800
cgaagccgca gaccttaacg ctgccttctc tgagcctttg ccggtaagcg aagtacgagc  1860
tatcgcagcc agcattcacc gctggatcgt caccaagtcc cgcatgtggg ccgatggccc  1920
tgcggtttac gaagccacct tcgtcgctat ccaatccgct cgcggacgca agatgacgga  1980
gaagaagcgc gaggccaatc gtcgccgtgc aacgaagtac gaccgcgacc tcgtgaggaa  2040
ggaggcgacc gatgggagct gagacgccgg cccggcgaac ccgcacagct cgcgaagtgg 2100
cggaacgaat cggtgcgtcc ccacgcacgg tgcggcgcat catcgcggag cctcgagctt 2160
catacgaagc tcgagcagct gaacgtcgaa agcaagtact cgaactccgt gcgagcggga 2220
tgaagctgcg tgagatcgcg gcggaggtag gtatgtcggt cggtggagta gggacgatcc 2280
tgcatcacgc ccgtaagacc gagcagtcta aggctgaagg agctatggca tgaacgacgc 2340
catatcggcc cgcatcactg caatgcaggc ccaactgacg gctgtacata ccgagctacg 2400
tgctctagcg gagctggtgg acatgcttga tgccgacgct ctcgatgctg agaccgaaga 2460
ttcagtgcgc gaagtgatcg actccctggc agacgctggg cgagctctag ctggcgccga 2520
cgagccgctc caggccgcaa ttcatcacgc ccggcgactg ccttagtcag cttctgtccg 2580
at                                                                2582
<210>2
<211>2582
<212>DNA
<213>紫红红球菌
<400>2
cgatggcaag ccaccgcgaa gcggtggcgc ggcagaacct cgttttgccc ctgaggaggt 60
gacgcgaatg catgaagcat gtcgcacttg cgcgccttgt cctgttatct gtaagatcga 120
cccctggtgt acctcgtgca cccaaaatca ggcccggtgg ttcctttgga cccgggcctt 180
cgttatttcc acgccagccc gagctccgcc cgctcgtgca agcgtcatgc tcttcgtccg 240
tgatcaagac ctccgaacct atggccggcc aaccccctcg ggttgcgtcg gcctgacccg 300
ttctagggcg tctacgcggc cgctttccca ctccgtccat accaaccccc gcaccaaagg 360
tccgggggtt ttttcatgcc cggattcggt cgcggctgcg cctcgacggt ctccggttgc 420
ccaaggaggc acccatgact tgctccacct gctcctcgcc tgcccccgaa ccgcgaccgt 480
cgcgcaaaga ggcggtccag caactcgcga tccgatcgct ggcgttcttg tttcgccact 540
gcacacgaat cgccctgaac gaagtggtcc aagaactgat ccgcatcaag ttcggcggtt 600
gaccgcggac gtgcacctgt agagcgggtt gcagcgagac accgatgaac cactctccgc 660
tgcctaggcg acccggttct ggaaagatca tcaccgagtg tccggcccca ccccctgcgg  720
gccggacact catctgtatg gcagcgtgcc tcccttcctg cccttcccac tgatcgtttc  780
ctcctgccaa aaatcgggac acacctcttg cagaagttct gacacccggg aaaggccggc  840
cgaaaggggg cgctcaccga ccactctgat cgagaagttc tgccgcaccc accagccgta  900
cccggccaac cttccgcagt cccagccgta cgaaacggtc tcgtgccact ccaccggccc  960
tggtgtcgat cgactacaaa ccaagatccc cacacacctc atgcactaaa gctgcgacca  1020
cgaagaacaa ggtggtccgg gtaagacgga agggagtttt cccaggaggg tcgccgaaac  1080
atctgacttg gttggcgtgt cctacataaa aaaattgatc ttgcgtgtga gggtgtcacg  1140
catggatatg agcgggggat ctctcagtgg ggactgggag cagttgtggc tgcctctgtg  1200
gccgctcgca acggacgatt tgttgcttgg ggtctaccgg atgcctcgcc aggatgcgct  1260
cgatcggcgc taccttgagg ccaatccgca ggcgctgagc aatctcctcg tcgtcgatgt  1320
cgatcatcca gacgcggcac tgcgggctct gtctgccgcc ggcaaccatc ccttgccgaa  1380
cgcgatcgtg gaaaacccgc gcaatggaca cgcacatgcg gtgtgggcat tgaccgaacc  1440
tttcacgcgc accgagtacg ccagacgtaa gccactcgct tatgccgcag cggtaaacga  1500
ggggctgcgt cgagctgtcg atggcgatgc cgcctattcg gggttgatga cgaagaaccc  1560
gactcactca gcctgggaca cacactggat ccacgccgag actcgatcgc tggcagatct  1620
cgaacatgac ctcggaaagc atatgccgcc accccggtgg cgacagagca aacgtcgtcg  1680
cgaagaccca gtcggactcg gacgtaattg catgctcttc gagacggcac gcacttgggc  1740
ataccgcgaa ttgcgttgcc attggggaga tcccgaaggt ttagggaaag caattcaggt  1800
cgaagccgca gaccttaacg ctgccttctc tgagcctttg ccggtaagcg aagtacgagc  1860
tatcgcagcc agcattcacc gctggatcgt caccaagtcc cgcatgtggg ccgatggccc  1920
tgcggtttac gaagccacct tcgtcgctat ccaatccgct cgcggacgca agatgacgga  1980
gaagaagcgc gaggccaatc gtcgccgtgc aacgaagtac gaccgcgacc tcgtgaggaa  2040
ggaggcgacc gatgggagct gagacgccgg cccggcgaac ccgcacagct cgcgaagtgg  2100
cggaacgaat cggtgcgtcc ccacgcacgg tgcggcgcat catcgcggag cctcgagctt  2160
catacgaagc tcgagcagct gaacgtcgaa agcaagtact cgaactccgt gcgagcggga  2220
tgaagctgcg tgagatcgcg gcggaggtag gtatgtcggt ctgtggagta gggacgatcc  2280
tgcatcacgc ccgtaagacc gagcagtcta aggctgaagg agctatggca tgaacgacgc  2340
catatcggcc cgcatcactg caatgcaggc ccaactgacg gctgtacata ccgagctacg  2400
tgctctagcg gagctggtgg acatgcttga tgccgacgct ctcgatgctg agaccgaaga 2460
ttcagtgcgc gaagtgatcg actccctggc agacgctggg cgagctctag ctggcgccga 2520
cgagccgctc caggccgcaa ttcatcacgc ccggcgactg ccttagtcag cttctgtccg 2580
at                                                                2582
<210>3
<211>1581
<212>DNA
<213>紫红红球菌
<400>3
cgtacgaaac ggtctcgtgc cactccaccg gccctggtgt cgatcgacta caaaccaaga 60
tccccacaca cctcatgcac taaagctgcg accacgaaga acaaggtggt ccgggtaaga 120
cggaagggag ttttcccagg agggtcgccg aaacatctga cttggttggc gtgtcctaca 180
taaaaaaatt gatcttgcgt gtgagggtgt cacgcatgga tatgagcggg ggatctctca 240
gtggggactg ggagcagttg tggctgcctc tgtggccgct cgcaacggac gatttgttgc 300
ttggggtcta ccggatgcct cgccaggatg cgctcgatcg gcgctacctt gaggccaatc 360
cgcaggcgct gagcaatctc ctcgtcgtcg atgtcgatca tccagacgcg gcactgcggg 420
ctctgtctgc cgccggcaac catcccttgc cgaacgcgat cgtggaaaac ccgcgcaatg 480
gacacgcaca tgcggtgtgg gcattgaccg aacctttcac gcgcaccgag tacgccagac 540
gtaagccact cgcttatgcc gcagcggtaa acgaggggct gcgtcgagct gtcgatggcg 600
atgccgccta ttcggggttg atgacgaaga acccgactca ctcagcctgg gacacacact 660
ggatccacgc cgagactcga tcgctggcag atctcgaaca tgacctcgga aagcatatgc 720
cgccaccccg gtggcgacag agcaaacgtc gtcgcgaaga cccagtcgga ctcggacgta 780
attgcatgct cttcgagacg gcacgcactt gggcataccg cgaattgcgt tgccattggg 840
gagatcccga aggtttaggg aaagcaattc aggtcgaagc cgcagacctt aacgctgcct 900
tctctgagcc tttgccggta agcgaagtac gagctatcgc agccagcatt caccgctgga 960
tcgtcaccaa gtcccgcatg tgggccgatg gccctgcggt ttacgaagcc accttcgtcg 1020
ctatccaatc cgctcgcgga cgcaagatga cggagaagaa gcgcgaggcc aatcgtcgcc 1080
gtgcaacgaa gtacgaccgc gacctcgtga ggaaggaggc gaccgatggg agctgagacg 1140
ccggcccggc gaacccgcac agctcgcgaa gtggcggaac gaatcggtgc gtccccacgc 1200
acggtgcggc gcatcatcgc ggagcctcga gcttcatacg aagctcgagc agctgaacgt 1260
cgaaagcaag tactcgaact ccgtgcgagc gggatgaagc tgcgtgagat cgcggcggag 1320
gtaggtatgt cggtcggtgg agtagggacg atcctgcatc acgcccgtaa gaccgagcag 1380
tctaaggctg aaggagctat ggcatgaacg acgccatatc ggcccgcatc actgcaatgc 1440
aggcccaact gacggctgta cataccgagc tacgtgctct agcggagctg gtggacatgc 1500
ttgatgccga cgctctcgat gctgagaccg aagattcagt gcgcgaagtg atcgactccc 1560
tggcagacgc tgggcgagct c                                           1581
<210>4
<211>1581
<212>DNA
<213>紫红红球菌
<400>4
cgtacgaaac ggtctcgtgc cactccaccg gccctggtgt cgatcgacta caaaccaaga 60
tccccacaca cctcatgcac taaagctgcg accacgaaga acaaggtggt ccgggtaaga 120
cggaagggag ttttcccagg agggtcgccg aaacatctga cttggttggc gtgtcctaca 180
taaaaaaatt gatcttgcgt gtgagggtgt cacgcatgga tatgagcggg ggatctctca 240
gtggggactg ggagcagttg tggctgcctc tgtggccgct cgcaacggac gatttgttgc 300
ttggggtcta ccggatgcct cgccaggatg cgctcgatcg gcgctacctt gaggccaatc 360
cgcaggcgct gagcaatctc ctcgtcgtcg atgtcgatca tccagacgcg gcactgcggg 420
ctctgtctgc cgccggcaac catcccttgc cgaacgcgat cgtggaaaac ccgcgcaatg 480
gacacgcaca tgcggtgtgg gcattgaccg aacctttcac gcgcaccgag tacgccagac 540
gtaagccact cgcttatgcc gcagcggtaa acgaggggct gcgtcgagct gtcgatggcg 600
atgccgccta ttcggggttg atgacgaaga acccgactca ctcagcctgg gacacacact 660
ggatccacgc cgagactcga tcgctggcag atctcgaaca tgacctcgga aagcatatgc 720
cgccaccccg gtggcgacag agcaaacgtc gtcgcgaaga cccagtcgga ctcggacgta 780
attgcatgct cttcgagacg gcacgcactt gggcataccg cgaattgcgt tgccattggg 840
gagatcccga aggtttaggg aaagcaattc aggtcgaagc cgcagacctt aacgctgcct 900
tctctgagcc tttgccggta agcgaagtac gagctatcgc agccagcatt caccgctgga 960
tcgtcaccaa gtcccgcatg tgggccgatg gccctgcggt ttacgaagcc accttcgtcg 1020
ctatccaatc cgctcgcgga cgcaagatga cggagaagaa gcgcgaggcc aatcgtcgcc 1080
gtgcaacgaa gtacgaccgc gacctcgtga ggaaggaggc gaccgatggg agctgagacg 1140
ccggcccggc gaacccgcac agctcgcgaa gtggcggaac gaatcggtgc gtccccacgc 1200
acggtgcggc gcatcatcgc ggagcctcga gcttcatacg aagctcgagc agctgaacgt 1260
cgaaagcaag tactcgaact ccgtgcgagc gggatgaagc tgcgtgagat cgcggcggag 1320
gtaggtatgt cggtctgtgg agtagggacg atcctgcatc acgcccgtaa gaccgagcag 1380
tctaaggctg aaggagctat ggcatgaacg acgccatatc ggcccgcatc actgcaatgc 1440
aggcccaact gacggctgta cataccgagc tacgtgctct agcggagctg gtggacatgc 1500
ttgatgccga cgctctcgat gctgagaccg aagattcagt gcgcgaagtg atcgactccc 1560
tggcagacgc tgggcgagct c                                           1581
<210>5
<211>921
<212>DNA
<213>紫红红球菌
<400>5
atggatatga gcgggggatc tctcagtggg gactgggagc agttgtggct gcctctgtgg 60
ccgctcgcaa cggacgattt gttgcttggg gtctaccgga tgcctcgcca ggatgcgctc 120
gatcggcgct accttgaggc caatccgcag gcgctgagca atctcctcgt cgtcgatgtc 180
gatcatccag acgcggcact gcgggctctg tctgccgccg gcaaccatcc cttgccgaac 240
gcgatcgtgg aaaacccgcg caatggacac gcacatgcgg tgtgggcatt gaccgaacct 300
ttcacgcgca ccgagtacgc cagacgtaag ccactcgctt atgccgcagc ggtaaacgag 360
gggctgcgtc gagctgtcga tggcgatgcc gcctattcgg ggttgatgac gaagaacccg 420
actcactcag cctgggacac acactggatc cacgccgaga ctcgatcgct ggcagatctc 480
gaacatgacc tcggaaagca tatgccgcca ccccggtggc gacagagcaa acgtcgtcgc 540
gaagacccag tcggactcgg acgtaattgc atgctcttcg agacggcacg cacttgggca 600
taccgcgaat tgcgttgcca ttggggagat cccgaaggtt tagggaaagc aattcaggtc 660
gaagccgcag accttaacgc tgccttctct gagcctttgc cggtaagcga agtacgagct 720
atcgcagcca gcattcaccg ctggatcgtc accaagtccc gcatgtgggc cgatggccct 780
gcggtttacg aagccacctt cgtcgctatc caatccgctc gcggacgcaa gatgacggag 840
aagaagcgcg aggccaatcg tcgccgtgca acgaagtacg accgcgacct cgtgaggaag 900
gaggcgaccg atgggagctg a                                           921
<210>6
<211>306
<212>PRT
<213>紫红红球菌
<400>6
Met Asp Met Ser Gly Gly Ser Leu Ser Gly Asp Trp Glu Gln Leu Trp
  1               5                  10                  15
Leu Pro Leu Trp Pro Leu Ala Thr Asp Asp Leu Leu Leu Gly Val Tyr
             20                  25                  30
Arg Met Pro Arg Gln Asp Ala Leu Asp Arg Arg Tyr Leu Glu Ala Asn
         35                  40                  45
Pro Gln Ala Leu Ser Asn Leu Leu Val Val Asp Val Asp His Pro Asp
     50                  55                  60
Ala Ala Leu Arg Ala Leu Ser Ala Ala Gly Asn His Pro Leu Pro Asn
 65                  70                  75                  80
Ala Ile Val Glu Asn Pro Arg Asn Gly His Ala His Ala Val Trp Ala
                 85                  90                  95
Leu Thr Glu Pro Phe Thr Arg Thr Glu Tyr Ala Arg Arg Lys Pro Leu
            100                 105                 110
Ala Tyr Ala Ala Ala Val Asn Glu Gly Leu Arg Arg Ala Val Asp Gly
        115                 120                 125
Asp Ala Ala Tyr Ser Gly Leu Met Thr Lys Asn Pro Thr His Ser Ala
    130                 135                 140
Trp Asp Thr His Trp Ile His Ala Glu Thr Arg Ser Leu Ala Asp Leu
145                 150                 155                 160
Glu His Asp Leu Gly Lys His Met Pro Pro Pro Arg Trp Arg Gln Ser
                165                 170                 175
Lys Arg Arg Arg Glu Asp Pro Val Gly Leu Gly Arg Asn Cys Met Leu
            180                 185                 190
Phe Glu Thr Ala Arg Thr Trp Ala Tyr Arg Glu Leu Arg Cys His Trp
        195                 200                 205
Gly Asp Pro Glu Gly Leu Gly Lys Ala Ile Gln Val Glu Ala Ala Asp
    210                 215                 220
Leu Asn Ala Ala Phe Ser Glu Pro Leu Pro Val Ser Glu Val Arg Ala
225                 230                 235                 240
Ile Ala Ala Ser Ile His Arg Trp Ile Val Thr Lys Ser Arg Met Trp
                245                 250                 255
Ala Asp Gly Pro Ala Val Tyr Glu Ala Thr Phe Val Ala Ile Gln Ser
            260                 265                 270
Ala Arg Gly Arg Lys Met Thr Glu Lys Lys Arg Glu Ala Asn Arg Arg
        275                 280                 285
Arg Ala Thr Lys Tyr Asp Arg Asp Leu Val Arg Lys Glu Ala Thr Asp
    290                 295                 300
Gly Ser
305
<210>7
<211>282
<212>DNA
<213>紫红红球菌
<400>7
atgggagctg agacgccggc ccggcgaacc cgcacagctc gcgaagtggc ggaacgaatc 60
ggtgcgtccc cacgcacggt gcggcgcatc atcgcggagc ctcgagcttc atacgaagct 120
cgagcagctg aacgtcgaaa gcaagtactc gaactccgtg cgagcgggat gaagctgcgt 180
gagatcgcgg cggaggtagg tatgtcggtc ggtggagtag ggacgatcct gcatcacgcc 240
cgtaagaccg agcagtctaa ggctgaagga gctatggcat ga                    282
<210>8
<211>93
<212>PRT
<213>紫红红球菌
<400>8
Met Gly Ala Glu Thr Pro Ala Arg Arg Thr Arg Thr Ala Arg Glu Val
  1               5                  10                  15
Ala Glu Arg Ile Gly Ala Ser Pro Arg Thr Val Arg Arg Ile Ile Ala
             20                  25                  30
Glu Pro Arg Ala Ser Tyr Glu Ala Arg Ala Ala Glu Arg Arg Lys Gln
         35                  40                  45
Val Leu Glu Leu Arg Ala Ser Gly Met Lys Leu Arg Glu Ile Ala Ala
     50                  55                  60
Glu Val Gly Met Ser Val Gly Gly Val Gly Thr Ile Leu His His Ala
 65                  70                  75                  80
Arg Lys Thr Glu Gln Ser Lys Ala Glu Gly Ala Met Ala
                 85                  90
<210>9
<211>282
<212>DNA
<213>紫红红球菌
<400>9
atgggagctg agacgccggc ccggcgaacc cgcacagctc gcgaagtggc ggaacgaatc 60
ggtgcgtccc cacgcacggt gcggcgcatc atcgcggagc ctcgagcttc atacgaagct 120
cgagcagctg aacgtcgaaa gcaagtactc gaactccgtg cgagcgggat gaagctgcgt 180
gagatcgcgg cggaggtagg tatgtcggtc tgtggagtag ggacgatcct gcatcacgcc 240
cgtaagaccg agcagtctaa ggctgaagga gctatggcat ga    282
<210>10
<211>93
<212>PRT
<213>紫红红球菌
<400>10
Met Gly Ala Glu Thr Pro Ala Arg Arg Thr Arg Thr Ala Arg Glu Val
  1               5                  10                  15
Ala Glu Arg Ile Gly Ala Ser Pro Arg Thr Val Arg Arg Ile Ile Ala
             20                  25                  30
Glu Pro Arg Ala Ser Tyr Glu Ala Arg Ala Ala Glu Arg Arg Lys Gln
         35                  40                  45
Val Leu Glu Leu Arg Ala Ser Gly Met Lys Leu Arg Glu Ile Ala Ala
     50                  55                  60
Glu Val Gly Met Ser Val Ser Gly Val Gly Thr Ile Leu His His Ala
 65                  70                  75                  80
Arg Lys Thr Glu Gln Ser Lys Ala Glu Gly Ala Met Ala
                 85                  90

Claims (8)

1.DNA片段，其包含序列7的碱基序列，其中存在能够增加红球菌属(Rhodococcus)细菌中质粒拷贝数的至少一个突变位点，所述DNA片段包含改变序列8的氨基酸序列中第71位甘氨酸的突变位点。
2.权利要求1的DNA片段，所述DNA片段包含在序列7的碱基序列中第211位处的突变位点。
3.权利要求1或2的DNA片段，所述DNA片段包含将序列8的氨基酸序列中第71位甘氨酸改变为丝氨酸的突变位点。
4.权利要求1至3中任意一项所述的DNA片段，其包含序列9的碱基序列。
5.权利要求1至4中任意一项所述的DNA片段，其包含序列4的碱基序列。
6.权利要求1至5中任意一项所述的DNA片段，其包含序列2的碱基序列。
7.质粒，其携带权利要求1至6中任意一项所述的DNA片段，能够在红球菌属细菌中自主增殖，并且能够以多个拷贝数存在。
8.质粒pLK006，其携带权利要求5的DNA片段，能够在红球菌属细菌中自主增殖，并且能够以多个拷贝数存在。
CNB2006101154233A 2001-07-05 2002-07-03 含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的dna片段 Expired - Fee Related CN100529082C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP204628/2001 2001-07-05
JP2001204628A JP4733298B2 (ja) 2001-07-05 2001-07-05 プラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むｄｎａ断片

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028173147A Division CN100503823C (zh) 2001-07-05 2002-07-03 含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的dna片段

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1944653A CN1944653A (zh) 2007-04-11
CN100529082C true CN100529082C (zh) 2009-08-19

Family

ID=19041064

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028173147A Expired - Fee Related CN100503823C (zh) 2001-07-05 2002-07-03 含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的dna片段
CNB2006101154233A Expired - Fee Related CN100529082C (zh) 2001-07-05 2002-07-03 含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的dna片段

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028173147A Expired - Fee Related CN100503823C (zh) 2001-07-05 2002-07-03 含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的dna片段

Country Status (5)

Country Link
US (1) US7557202B2 (zh)
EP (1) EP1411121B1 (zh)
JP (1) JP4733298B2 (zh)
CN (2) CN100503823C (zh)
WO (1) WO2003004639A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4570075B2 (ja) * 2004-08-12 2010-10-27 三菱レイヨン株式会社 ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来のプラスミドおよびその誘導体、並びに大腸菌−ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌シャトルベクター
US8389685B2 (en) 2008-03-25 2013-03-05 Kao Corporation Vector encoding a plasmid replication protein and use thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4920054A (en) * 1986-07-25 1990-04-24 Allelix, Inc. Shuttle vectors from rhodococcus equi
US4952500A (en) * 1988-02-01 1990-08-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cloning systems for Rhodococcus and related bacteria
JP2983602B2 (ja) * 1990-10-11 1999-11-29 三菱レイヨン株式会社 環状プラスミド
EP0502476B1 (en) 1991-03-04 2001-07-18 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Hybrid plasmid vectors containing genes encoding nitrile degrading enzymes and methods of producing amides and acids
JP3142349B2 (ja) * 1991-03-04 2001-03-07 輝彦 別府 複合プラスミドベクターおよび形質転換微生物
JP3142348B2 (ja) * 1991-03-04 2001-03-07 輝彦 別府 ニトリル分解酵素系の遺伝子を有する組換え体プラスミド、形質転換微生物、ならびに該形質転換微生物によるアミドおよび酸の製造法
FR2678947B1 (fr) * 1991-07-12 1993-11-05 Institut Recherche Agronomique Origine de replication plasmidique augmentant le nombre de copies du plasmide comprenant ladite origine.
US6949362B2 (en) 2000-12-12 2005-09-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Rhodococcus cloning and expression vectors

Also Published As

Publication number Publication date
EP1411121B1 (en) 2006-01-04
EP1411121A4 (en) 2004-08-04
WO2003004639A1 (fr) 2003-01-16
JP4733298B2 (ja) 2011-07-27
EP1411121A1 (en) 2004-04-21
JP2003009863A (ja) 2003-01-14
CN1944653A (zh) 2007-04-11
US7557202B2 (en) 2009-07-07
CN1551915A (zh) 2004-12-01
US20040248119A1 (en) 2004-12-09
CN100503823C (zh) 2009-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hani et al. Expression and characterization of Campylobacter jejuni benzoylglycine amidohydrolase (hippuricase) gene in Escherichia coli
CN107109422B (zh) 使用由两个载体表达的拆分的Cas9的基因组编辑
Jovanovic et al. Identification, nucleotide sequence, and characterization of PspF, the transcriptional activator of the Escherichia coli stress-induced psp operon
Venturi et al. Iron regulation of siderophore biosynthesis and transport in Pseudomonas putida WCS358: involvement of a transcriptional activator and of the Fur protein
Grinter A broad-host-range cloning vector transposable to various replicons
de Zamaroczy et al. Functional organization of the glnB-glnA cluster of Azospirillum brasilense
Hamblin et al. Evidence for two chemosensory pathways in Rhodobacter sphaeroides
Jones et al. Recombination between short direct repeats in a rec A host
Varon et al. Bacillus subtilis gtaB encodes UDP-glucose pyrophosphorylase and is controlled by stationary-phase transcription factor sigma B
CN107922931A (zh) 热稳定的Cas9核酸酶
Kodaira et al. The dnaX gene encodes the DNA polymerase III holoenzyme τ subunit, precursor of the γ subunit, the dnaZ gene product
Liang et al. Characterization of the ntrBC genes of Azospirillam brasilense Sp7: Their involvement in the regulation of nitrogenase synthesis and activity
Liu et al. Rapid sequencing of cloned DNA using a transposon for bidirectional priming: sequence of the Escherichia coli K-12 avtA gene
Murayama et al. vidence for Involvement ofEscherichia coliGenespmbA, csrAand a Previously Unrecognized GenetldD, in the Control of DNA Gyrase byletD (ccdB) of Sex Factor F
Kaijalainen et al. Restriction fragment length polymorphism analysis of Rhizobium galegae strains
Ovaa et al. Multiple outer membrane receptors for uptake of ferric pseudobactins in Pseudomonas putida WCS358
Cao et al. A newly identified, essential catalytic residue in a critical secondary structure element in the integrase family of site-specific recombinases is conserved in a similar element in eucaryotic type IB topoisomerases
Marugg et al. Genetic organization and transcriptional analysis of a major gene cluster involved in siderophore biosynthesis in Pseudomonas putida WCS358
JPH0838184A (ja) ロドコッカス属細菌由来カナマイシン耐性遺伝子
Berry et al. Induced plasmid-genome rearrangements in Rhizobium japonicum
Cook et al. Induction of anaerobic gene expression in Rhodobacter capsulatus is not accompanied by a local change in chromosomal supercoiling as measured by a novel assay
CN100529082C (zh) 含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的dna片段
Higgins et al. Primary structure and mapping of the hupA gene of Salmonella typhimurium
Loprasert et al. Characterization of a ferric uptake regulator (fur) gene from Xanthomonas campestris pv. phaseoli with unusual primary structure, genome organization, and expression patterns
Link et al. Inverted repeats surround the ribitol–arabitol genes of E. coli C

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: Tokyo, Japan, Japan

Patentee after: Mitsubishi Kasei Corporation

Address before: Tokyo, Japan, Japan

Patentee before: Mitsubishi Reiyon Co., Ltd.

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20090819

Termination date: 20180703