CN100503823C - 含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的dna片段 - Google Patents
含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的dna片段 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100503823C CN100503823C CNB028173147A CN02817314A CN100503823C CN 100503823 C CN100503823 C CN 100503823C CN B028173147 A CNB028173147 A CN B028173147A CN 02817314 A CN02817314 A CN 02817314A CN 100503823 C CN100503823 C CN 100503823C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plasmid
- gene
- dna fragmentation
- dna
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 130
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 72
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 title claims description 41
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title abstract description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 40
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 claims abstract description 7
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 73
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 73
- 101100412856 Mus musculus Rhod gene Proteins 0.000 claims description 36
- 101100242191 Tetraodon nigroviridis rho gene Proteins 0.000 claims description 36
- 241001478240 Coccus Species 0.000 claims description 25
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 19
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- 241000187693 Rhodococcus rhodochrous Species 0.000 claims description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 104
- 239000002585 base Substances 0.000 description 27
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000005314 correlation function Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000008676 import Effects 0.000 description 3
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 2
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 2
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 108010064696 N,O-diacetylmuramidase Proteins 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229920000297 Rayon Polymers 0.000 description 1
- 101710090029 Replication-associated protein A Proteins 0.000 description 1
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000003876 biosurfactant Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001739 density measurement Methods 0.000 description 1
- 238000006477 desulfuration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000023556 desulfurization Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 229960004249 sodium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000007669 thermal treatment Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本发明提供含有与质粒自主增殖相关的基因的DNA片段,以及作为含有与质粒自主增殖相关的基因的DNA片段,在该基因内至少存在一处可使质粒的拷贝数增加的突变点的DNA片段。含有具有与红球菌属细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段,在该基因内至少存在一处可使质粒的拷贝数增加的突变点的DNA片段,以及拥有在该基因内至少存在一处可使质粒的拷贝数增加的突变点的DNA片段的质粒。
Description
技术领域
本发明涉及含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的DNA片段,进一步涉及作为含有具有与红球菌属细菌内质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段,在该基因内至少存在一处使质粒的拷贝数增加的突变点的DNA片段以及含有该DNA片段的多拷贝质粒载体。
背景技术
属于红球菌属的微生物作为微生物催化剂用于对腈进行水合,生产对应的酰胺类或酸已为人们所知,另外由于表现出非常多样的性质,如生产有关PCB(多氯联(二)苯)等的分解或原油的脱硫的酶,以及生产排水处理中使用的那样的生物表面活性剂等,所以在工业是非常有用的微生物。
另外属于紫红红球菌种(Rhodococcus rhodochrous)的微生物具有极高性能的腈水合活性已为人们所知,作为生物法制造丙烯酰胺的催化剂被用于工业上。
在这种状况下,人们从以前就期待红球菌属的宿主载体系的开发,并已经开发了几个。作为红球菌属细菌的工业上有用的质粒载体,可列举例如,紫红红球菌ATCC4276携带的质粒pRC001、紫红红球菌ATCC14349携带的质粒pRC002、紫红红球菌ATCC14348携带的质粒pRC003以及紫红红球菌IFO 3338携带的质粒pRC004(参照日本专利第2983602号公报),以及由在大肠杆菌细胞内可复制增殖的质粒DNA区域和含有药剂抗性基因的DNA区域构成的复合质粒载体pK1、pK2、pK3和pK4(参照特开平5-64589号公报)、红串红球菌IFO12320携带的pRC020(参照特开平9-28379号公报)等。已知将有用基因导入以红球菌属细菌作为宿主的质粒载体之后,使该基因表达时,该有用基因的表达量大致与质粒载体的拷贝数成比例。然而,这些质粒在红球菌属细菌的细胞内的拷贝数为2~6左右,用于使外源基因高表达未必充分。
发明的公开
因此,通过将有用基因插入多拷贝质粒载体后导入细胞内,人们期待着能获得高的基因扩增效果。
本发明的目的在于提供来自在红球菌属细菌内可自主复制的质粒的、含有与质粒自主增殖有关的基因的DNA片段,以及作为来自在红球菌属细菌内可自主复制的质粒的,含有有关质粒自主增殖基因的DNA片段,在该基因内至少存在一处使质粒拷贝数增加的突变点的DNA片段。
本发明者们通过阐明含有具有与红球菌属细菌内质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA区域,获得在该基因内至少存在一处使质粒拷贝数增加的突变点的DNA片段,使得本发明完成。即,本发明涉及一种DNA片段,其含有具有与红球菌属细菌内质粒的自主增殖相关的功能的基因,该基因来源于质粒pRC001、pRC002、pRC003和pRC004,以及作为来自在红球菌属细菌内可自主复制的质粒的,含有与质粒自主增殖有关的基因的DNA片段,在该基因内至少存在一处使质粒拷贝数增加的突变点的DNA片段。
即,本发明如下构成:
(1)一种DNA片段,其包含具有与红球菌属(Rhodococcus)细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因,该基因来源于质粒pRC001、pRC002、pRC003和pRC004。
(2)(1)的DNA片段,大小为1.6kb,在末端含有限制性内切酶SplI和SacI切割位点。
(3)(1)的DNA片段,大小为1.7kb,在末端含有限制性内切酶SmaI和SacI切割位点。
(4)(1)的DNA片段,大小为1.9kb,在两末端含有限制性内切酶SmaI切割位点。
(5)(1)的DNA片段,大小为2.3kb,在两末端含有限制性内切酶SacI切割位点。
(6)(1)的DNA片段,其含有包含在pRC004中的具有与红球菌属(Rhodococcus)细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因,由序列1的碱基序列构成。
(7)(1)的DNA片段,其含有包含在pRC004中的具有与红球菌属细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因,由序列3的碱基序列构成。
(8)(1)的DNA片段,其含有包含在pRC004中的具有与红球菌属细菌中质粒的自主增殖相关的功能的基因,由序列7的碱基序列构成。
(9)(1)~(8)中的任一个DNA片段,其中至少存在一处可使质粒拷贝数增加的突变点。
(10)(9)的DNA片段,其是由存在一处可使质粒拷贝数增加的突变点的序列2的碱基序列构成的。
(11)(9)的DNA片段,其是由存在一处可使质粒拷贝数增加的突变点的序列4的碱基序列构成的。
(12)(9)的DNA片段,其是由存在一处可使质粒拷贝数增加的突变点的序列9的碱基序列构成的。
(13)拥有(9)~(12)中任一项记载的DNA片段的,可在红球菌属细菌内自主增殖并具有多个拷贝的质粒。以及
(14)拥有权利要求11中记载的DNA片段的,可在红球菌属细菌内自主增殖并具有多个拷贝的质粒pLK006。
所谓作为具有与红球菌属细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段,在该基因内至少存在一处可使质粒的拷贝数增加的突变点的DNA片段(以下称为多拷贝质粒DNA片段)指的是,作为含有具有与质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段,是与使用没有突变点的DNA片段制作的质粒载体的拷贝数相比,具有可使利用有突变点的DNA片段制作的质粒载体的拷贝数增加的作用的DNA片段。在本说明书中,称之为拷贝数的术语指的是1个细胞中的质粒分子数(存在的质粒数),称之为多拷贝数的术语指的是作为含有具有有关质粒的自主增殖功能的基因的DNA片段,与使用没有突变点的DNA片段制作的质粒载体的拷贝数相比具有更多的拷贝数。
本发明的多拷贝质粒DNA片段可以从对在红球菌属细菌内自主增殖的质粒或含有具有与质粒的自主增殖相关的功能的基因的DNA片段进行适当的变异处理的产物中获得。
通常,将在红球菌属细菌内自主增殖的质粒或含有具有与质粒的自主增殖相关的功能的基因的DNA片段使用众所周知的方法插入到含有可成为标记的药剂抗性基因的载体质粒,例如含有卡那霉素抗性基因的pHSG298(宝酒造制造)、含有氯霉素抗性基因的pHSG398(宝酒造制造)、含有四环素抗性基因的pBR322(宝酒造制造)或含有氨苄青霉素抗性基因的pUC18(宝酒造制造),通过电脉冲法使该载体质粒转化宿主红球菌属细菌,通过众所周知的方法、例如碱SDS方法等从得到的转化体中回收质粒DNA,通过限制性内切酶处理片段的解析等,可以确认目的DNA片段。
所谓适当的变异处理指的是,对象上述那样制作的质粒保持菌照射紫外线、X射线、γ射线等,或用N-甲基-N’-亚硝基胍等诱变剂进行处理。另外也可以利用在生物增殖时发生的自然突变。
或者,对在红球菌属细菌内自主增殖的质粒或含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的DNA片段直接、或做成单链DNA后,用肼、甲酸或亚硝酸进行处理,或通过包括选择适当的引物,在核苷酸类似物或锰离子存在下等进行PCR的诱发错误PCR等众所周知方法向DNA片段直接导入变异也是有效果的。通过这样的方法,由于可以集中将变异导入DNA序列的特定地方,例如可以将变异特异导入到本发明所公布那样的含有具有与质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段中。另外,合成含有具有与质粒自主增殖相关的功能的基因的DNA片段也是可能的。
通过在利用各种浓度的药剂标记的选择下对拥有上述那样导入了变异的含有药剂标记基团的质粒载体的重组体进行培养,并选择药剂抗性浓度上升的菌株,可以得到质粒拷贝数上升的菌株。这样的菌株,由于拷贝数上升出现基因扩增效果,可以被认为是药剂抗性上升的菌株。从这样的菌株回收质粒可以得到多拷贝质粒DNA片段。
对于在实施了变异处理的在红球菌属细菌内进行自主增殖的质粒或含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的DNA片段的情况,插入含有适当的药剂抗性基因的上述质粒载体后,利用电脉冲转化宿主红球菌属细菌,通过在利用各种浓度的药剂标记的选择下进行培养,选择药剂抗性浓度上升的菌株,可以得到质粒拷贝数上升的菌株。
标记基因使用药剂抗性基因是简便的,而碱性磷酸酶、荧光素酶或lacZ基因等检测也可以使用简便的众所周知的方法。
拷贝数的解析可以根据例如Journal of Bacteriology,152,p.722(1982)记载的方法进行。即通过从细胞中提取染色体DNA和质粒DNA,求双方的分子数的比来进行。更简便的是对拥有无突变点的质粒的重组体和拥有突变点的质粒的重组体都同样进行培养,回收质粒,进行琼脂糖电泳,通过对经溴乙锭等染色后的密度测量分析,也可以比较拷贝数。
序列1给出了确定的来自紫红红球菌IFO3338的质粒pRC004碱基序列的结果。从碱基序列信息可以推定pRC004中有两个开放读码框(ORF)。一个是预料为被序列5所示的921碱基(从序列1碱基序列的第1142号碱基开始到2062号的碱基)编码的ORF(序列6给出了推定的氨基酸序列),他与参与来自紫红红球菌NCIMB13064的质粒的pKA22和来自偶发分枝杆菌的pAL5000的质粒的复制的RepA蛋白质类似。另一个ORF是预料为被序列7所示的282碱基(从序列1碱基序列的第2052号开始到2333号的碱基)编码的ORF(序列8给出了推定的氨基酸序列),他与被推定为来自红串红球菌NI86/21的质粒的pFAJ2600的DNA结合性的质粒复制因子的ORF类似。然而,以上考察是基于基因类似性的结果,当然不能确定它们的功能,实际上为不具有功能的疑似基因(假基因)的可能性也很高。
本发明初次判明pRC004经SplI和SacI酶切生成的约1.6kb的DNA片段(序列3)是含有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域。
即,判明在pRC004经SmaI酶切生成的约1.9kb的DNA片段和经SacI酶切生成的约2.3kb的DNA片段中含有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域。对经SmaI酶切生成的约1.9kb的DNA片段用SacI切后生成的约1.7kb的DNA片段进一步研究时,判明在该DNA片段中也含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域。进一步判明,在将该约1.7kb的DNA片段用SplI切后生成的约1.6kb的DNA片段中,也含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域。
对末端含有上述限制性内切酶SplI和SacI切点的约1.6kb的DNA片段中存在的BamHI、Bg1II、SphI、XhoI识别部位分别用相应的限制性内切酶进行酶切后,再用klenow fragment等处理使之平末端化后进行自身连接时,由在红球菌属细菌内质粒自主增殖的功能丧失可以判明该区域实际上存在着可发挥功能的蛋白质性因子。
另外,通过在pRC004的该DNA片段中至少导入一处突变点可以使质粒的拷贝数增加的知识,正是本发明首次公布的内容。
即,通过使用向pRC004插入了含有可以起到标记功能的卡那霉素抗性基因的质粒载体的复合质粒载体,获得卡那霉素抗性提高了的变异体,本发明能够首次获得多拷贝变异质粒。
首次发现通过向这个含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域至少导入一处突变点可以得到多拷贝变异质粒的意义非常大,这就意味着以该发明为基础通过众所周知的方法可以很容易得到多拷贝变异质粒。
作为这样的多拷贝变异质粒的例子,可列举例如,在本发明中得到的质粒pLK006等。pLK006是在含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的区域中,序列3所示区域内1336号的鸟嘌呤碱基置换为胸腺嘧啶碱基后的变异体(序列4)。这相当于序列1碱基序列的2262号碱基、序列7碱基序列的211号的碱基,序列2和序列9分别表示在序列1和序列7的一个碱基中含有变异的序列。推定的ORF编码的氨基酸序列是序列8的第71位的甘氨酸变异(置换)为丝氨酸的序列(序列10)。
另外,质粒pLK006于2001年6月22日以保藏号FERM BP-8085保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6)。
而在本发明的DNA片段中也包括在严格条件下与该DNA杂交的,而且含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能的基因的DNA片段,或在严格条件下与该DNA杂交的,而且含有具有与在红球菌属细菌内有关质粒自主增殖功能、且存在至少一处使质粒的拷贝数增加的突变点的基因的DNA片段。这里所谓在严格条件下,指的是形成所谓的特异的杂化体,不形成非特异的杂化体的条件。该条件可列举例如,具有同源性高的DNA之间,例如具有至少60%或其以上、优选在80%或其以上、更优选95%或其以上同源性的DNA之间进行杂交,而同源性比它们低的DNA之间不杂交的条件,或者是在相当于作为通常sorthern杂交清洗条件的60℃、1×SSC、0.1% SSD、优选0.11×SSC、0.1% SDS盐浓度下进行杂交的条件。这样的DNA,例如利用位点特异变异法,通过改变本发明的DNA片段碱基序列可以获得。
附图的简单说明
图1是表示质粒pRC001、pRC002、pRC003和pRC004的限制性内切酶片段谱图。
实施发明的最佳形态
以下通过实施例对本发明进行更具体的说明,但下述的实施例并不限定本发明的技术范围。
实施例1
含有具有与pRC004在红球菌属细菌内进行质粒自主增殖相关功能的基因的DNA片段的制备
向从紫红红球菌IFO3338提取的质粒pRC004(1μg)中加入5units限制性内切酶SmaI或SacI,于37℃下反应1小时,对质粒DNA进行酶切。将限制性内切酶酶切的质粒溶液进行0.7%琼脂糖凝胶电泳,分别切出SmaI切的产物中的约650bp、约1.9kb的DNA级分,用SacI切的产物中的约300bp、约2.3kb的DNA片段。
另外,向0.5μg的含有卡那霉素抗性基因的质粒载体pHSG299(宝酒造制造)加入5units限制性内切酶SmaI或SacI,于37℃下反应1小时,对质粒DNA进行酶切。向反应液中加入1/10量的1M-Tris-HCl(pH9.0),与碱性磷酸酶(1unit)于65℃下反应1小时。将限制性内切酶酶切的质粒载体溶液进行0.7%琼脂糖凝胶电泳,分别切出2.7kb的DNA片段。
DNA片段切出时,作为大小标志分子使用λ噬菌体DNA的HindIII消化物,算出DNA的大小。使用Gene clean kit(フナコツ(株)),从琼脂糖凝胶中回收DNA,溶解在TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,(pH8.0))中。
将含有各个DNA片段的溶液等量混合,加入终浓度达到1unit T4DNA连接酶、1mM ATP、10mM二硫苏糖醇、10mM MgCl2的各成分,于4℃下反应过夜。
将上述反应液加到大肠杆菌JM105株感受态细胞(宝酒造生产)中,于0℃下静置1小时后,于42℃下进行2分钟热处理,加2×YT培养基(0.5% NaCl、1%酵母提取物、1.6%胨),于37℃下振荡1小时。涂布到含有25μg/ml卡那霉素、1mM IPTG(异丙基-β-吡喃半乳糖苷)、以及0.02% X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)的2×YT琼脂培养基上,于37℃下静置培养过夜。从出现的菌落中选择白色的菌落,在加入50μg/ml卡那霉素的2×YT培养基(3ml)中,于37℃下振荡培养8小时。
通过于15,000rpm下离心分离5分钟,回收菌体,悬浮于0.35ml STET溶液(8%蔗糖、5% Triton X-100,50mM EDTA,10mM Tris-HCl(pH8.0))中。加入溶菌酶液(10mg/ml)25μl,用Vortex搅拌3秒后,浸入到沸腾的水中50秒。通过于15,000ypm下离心分离15分钟,除去沉淀,得到上清。向上清中加入0.5ml的TE饱和酚:氯仿(1:1)液,搅拌后,于15,000rpm下离心分离5分钟,得到上层液。加乙醚0.5ml混合后,通过离心分离除去上层。加入异丙醇0.5ml、2.5M醋酸钠液(pH4.5)50μl,于-80℃下静置30分钟后,于15,000rpm下离心分离10分钟,得到沉淀。用70%乙醇洗净,进行减压干燥,溶解在0.1ml的TE缓冲液中。
使用上述那样制备的质粒溶液,用限制性内切酶SmaI或SacI切,确认目的DNA片段的插入。使用插入了各个DNA片段的质粒,以紫红红球菌ATCC12674作为宿主,利用电脉冲法进行转化。
利用电脉冲法的转化按照以下方法进行。通过离心机收集紫红红球菌ATCC12674菌株的对数增殖期的细胞,用冰冷的灭菌水洗3次,悬浮于灭菌水中。将上述质粒1μl和菌体悬浮液10μl混合,进行冰冷。将DNA和菌体加入到一个小池中,通过基因导入装置Gene Pulser(BIO RAD)用2.0kV、200 OHMS进行电脉冲处理。将电脉冲处理液于冰冷下静置10分钟,于37℃下进行10分钟热激。加MYK培养基(0.5%多胨、0.3%细菌培养用酵母提取物、0.3%细菌培养用麦芽提取物、0.2% K2HPO4、0.2% KH2PO4)500μl,于30℃下静置5小时后,涂布到加入了50mg/l卡那霉素的MYK琼脂培养基上,于30℃下培养3天。
表1给出了使用的质粒和有无获得转化体。使用将pRC004的约1.9kb的SmaI酶切片段和约2.3kb的SacI片段插入到质粒载体pHSG299的质粒时,可以得到卡那霉素抗性的重组体。从得到的重组体提取质粒进行琼脂糖电泳分析时,可以得到与在各个转化中使用的质粒相同的分子量的质粒。
表1
使用的质粒 | 有无获得卡那霉素抗性转化体 |
SmaI650bp+pHSG299 | 没有得到 |
SmaI1.9kb+pHSG299 | 获得 |
SacI300bp+pHSG299 | 没有得到 |
SacI2.3kb+pHSG299 | 获得 |
实施例2
与实施例1同样操作,向从紫红红球菌IFO3338提取的质粒pRC004(1μg)中加入5units限制性内切酶SmaI或SacI,反应1小时,对质粒DNA进行酶切。将限制性内切酶酶切的质粒溶液进行0.7%琼脂糖凝胶电泳,切出约1.7kb的DNA片段。
另外,向0.5μg的含有卡那霉素抗性基因的质粒载体pHSG299(宝酒造制造)加入5units限制性内切酶SmaI和SacI,在37℃反应1小时,对质粒DNA进行酶切。向反应液中加入1/10量的1M-Tris-HCl(pH9.0),与碱性磷酸酶(1unit)于65℃下反应1小时。将限制性内切酶酶切的质粒载体溶液进行0.7%琼脂糖凝胶电泳,切出2.7kb的DNA片段。
将含有各个DNA片段的溶液等量混合,加入各个成分达到T4DNA连接酶1unit、1mM ATP、10mM二硫苏糖醇、10mM MgCl2,于4℃下反应过夜。
用上述反应液转化大肠杆菌JM105,获得插入了上述约1.7kb的DNA片段的质粒。使用得到的质粒,利用电脉冲法对紫红红球菌ATCC12674进行转化,可以得到卡那霉素抗性的转化体。
实施例3
向实施例2得到的质粒中加入5units限制性内切酶SplI和SmaI,于37℃下反应1小时,对质粒DNA进行酶切。通过乙醇沉淀回收酶切的质粒后,添加klenow fragment 5units,进行平末端化,加入各个成分达到1unit T4DNA连接酶、1mM ATP、10mM二硫苏糖醇、10mM MgCl2,于4℃下反应过夜。
使用上述反应液转化大肠杆菌JM105,获得插入了上述约1.6kb的DNA片段的质粒。使用得到的质粒,利用电脉冲法对紫红红球菌ATCC12674进行转化,可以获得卡那霉素抗性的转化体。
实施例4
多拷贝质粒DNA片段的获得
使用由质粒pRC004和质粒pHSG299构成的复合质粒载体pK4,利用电脉冲法对红球菌sp N775(以保藏号FERM BP-961于1986年1月10日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6))进行转化,通过对得到的转化体在10ml的MYK培养基中于30℃下培养1天后在净化台内照射紫外线,进行变异处理。将进行了变异处理的培养液涂布在含有50~400μg/ml卡那霉素的MYK琼脂培养基上,于30℃下培养3天。
对存活下来的菌落进行培养,回收质粒。用回收的质粒再转化红球菌sp N775,验证卡那霉素抗性浓度上升。显然可以得到数株卡那霉素浓度提高的重组体。由用得到的重组体之一的pLK006株和不含有突变点的复合载体pK4转化的重组体分别制备染色体和质粒DNA,对质粒的拷贝数进行比较时,发现经变异处理得到的pLK006与pK4相比拷贝数上升了约5倍。
上述微生物中,与本发明人等制作的基因重组体有关的微生物保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。
实施例5
突变点的确定
使用Pharmacia公司荧光测序仪ALFII确定了实施例3得到的多拷贝变异质粒pLK006的碱基序列。其结果得到了序列4所表示的碱基序列。序列2所示的区域内1336位的鸟嘌呤碱基变异(置换)为胸腺嘧啶碱基。
产业上的可利用性
通过将有用的基因导入本发明提供的以红球菌属细菌为宿主的多拷贝质粒载体,可以使有用基因的表达量提高。这样一来,有用基因的表达量提高的基因重组体在产业上是非常有用的。
本说明书中引用的所有刊物为其所有内容收入到本说明书的刊物。另外,同行应当容易理解在没有脱离附加的权利要求范围中记载的技术思想和发明的范围的范围内,本发明的种种变形以及变更都是可能的。本发明的意思是指本发明也包括这样的变形以及变更。
序列表
<110>三菱丽阳株式会社
<120>含有具有有关质粒自主增殖功能的基因的DNA片段
<130>PH-1601-PCT
<140>
<141>
<150>JP 2001/204628
<151>2001-07-05
<160>10
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>2582
<212>DNA
<400>1
<210>2
<211>2582
<212>DNA
<400>2
<210>3
<211>1581
<212>DNA
<400>3
<210>4
<211>1581
<212>DNA
<400>4
<210>5
<211>921
<212>DNA
<400>5
<210>6
<211>306
<212>PRT
<400>6
<210>7
<211>282
<212>DNA
<400>7
<210>8
<211>93
<212>PRT
<400>8
<210>9
<211>282
<212>DNA
<400>9
<210>10
<211>93
<212>PRT
<400>10
Claims (2)
1.来自紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)IFO 3338的如序列1所示的质粒pRC004中含有的DNA片段,所述DNA片段大小约为1.6kb,并且在所述DNA片段末端具有限制性内切酶SpH和SacI的切割位点。
2.来自紫红红球菌IFO 3338的如序列1所示的质粒pRC004中含有的DNA片段,所述DNA片段含有具有与红球菌属(Rhodococcus)细菌中质粒自主增殖相关的功能的基因,且所述DNA片段由序列3的碱基序列构成。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP204628/2001 | 2001-07-05 | ||
JP2001204628A JP4733298B2 (ja) | 2001-07-05 | 2001-07-05 | プラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むdna断片 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB2006101154233A Division CN100529082C (zh) | 2001-07-05 | 2002-07-03 | 含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的dna片段 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1551915A CN1551915A (zh) | 2004-12-01 |
CN100503823C true CN100503823C (zh) | 2009-06-24 |
Family
ID=19041064
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB2006101154233A Expired - Fee Related CN100529082C (zh) | 2001-07-05 | 2002-07-03 | 含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的dna片段 |
CNB028173147A Expired - Fee Related CN100503823C (zh) | 2001-07-05 | 2002-07-03 | 含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的dna片段 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB2006101154233A Expired - Fee Related CN100529082C (zh) | 2001-07-05 | 2002-07-03 | 含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的dna片段 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7557202B2 (zh) |
EP (1) | EP1411121B1 (zh) |
JP (1) | JP4733298B2 (zh) |
CN (2) | CN100529082C (zh) |
WO (1) | WO2003004639A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4570075B2 (ja) * | 2004-08-12 | 2010-10-27 | 三菱レイヨン株式会社 | ロドコッカス(Rhodococcus)属細菌由来のプラスミドおよびその誘導体、並びに大腸菌−ロドコッカス(Rhodococcus)属細菌シャトルベクター |
US8389685B2 (en) | 2008-03-25 | 2013-03-05 | Kao Corporation | Vector encoding a plasmid replication protein and use thereof |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4920054A (en) * | 1986-07-25 | 1990-04-24 | Allelix, Inc. | Shuttle vectors from rhodococcus equi |
US4952500A (en) | 1988-02-01 | 1990-08-28 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Cloning systems for Rhodococcus and related bacteria |
JP2983602B2 (ja) * | 1990-10-11 | 1999-11-29 | 三菱レイヨン株式会社 | 環状プラスミド |
JP3142349B2 (ja) * | 1991-03-04 | 2001-03-07 | 輝彦 別府 | 複合プラスミドベクターおよび形質転換微生物 |
JP3142348B2 (ja) * | 1991-03-04 | 2001-03-07 | 輝彦 別府 | ニトリル分解酵素系の遺伝子を有する組換え体プラスミド、形質転換微生物、ならびに該形質転換微生物によるアミドおよび酸の製造法 |
DE69231939T2 (de) * | 1991-03-04 | 2002-04-04 | Mitsubishi Rayon Co | Hybrid-Plasmid-Vektoren, die für Nitril-abbauende Enzyme kodierende Gene enthalten und Verfahren zur Herstellung von Amiden und Säuren |
FR2678947B1 (fr) * | 1991-07-12 | 1993-11-05 | Institut Recherche Agronomique | Origine de replication plasmidique augmentant le nombre de copies du plasmide comprenant ladite origine. |
US6949362B2 (en) | 2000-12-12 | 2005-09-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Rhodococcus cloning and expression vectors |
-
2001
- 2001-07-05 JP JP2001204628A patent/JP4733298B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-07-03 EP EP02743796A patent/EP1411121B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-03 CN CNB2006101154233A patent/CN100529082C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-03 CN CNB028173147A patent/CN100503823C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-03 US US10/482,156 patent/US7557202B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-03 WO PCT/JP2002/006732 patent/WO2003004639A1/ja active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Improvement of Desulfurization Activity inRhodococcuserythropolis KA2-5-1 by Genetic Engineering. Kazuaki Hirasawa et al.Biosci.Biotechnol.Biochem,Vol.65 No.2. 2001 |
Improvement of Desulfurization Activity inRhodococcuserythropolis KA2-5-1 by Genetic Engineering. Kazuaki Hirasawa et al.Biosci.Biotechnol.Biochem,Vol.65 No.2. 2001 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2003004639A1 (fr) | 2003-01-16 |
US7557202B2 (en) | 2009-07-07 |
JP2003009863A (ja) | 2003-01-14 |
CN1944653A (zh) | 2007-04-11 |
EP1411121B1 (en) | 2006-01-04 |
JP4733298B2 (ja) | 2011-07-27 |
EP1411121A4 (en) | 2004-08-04 |
US20040248119A1 (en) | 2004-12-09 |
EP1411121A1 (en) | 2004-04-21 |
CN100529082C (zh) | 2009-08-19 |
CN1551915A (zh) | 2004-12-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5981281A (en) | Method for knockout mutagenesis in Streptococcus pneumoniae | |
AU2020223370B2 (en) | Enzymes with RuvC domains | |
US10913941B2 (en) | Enzymes with RuvC domains | |
Hamblin et al. | Evidence for two chemosensory pathways in Rhodobacter sphaeroides | |
CN107922931A (zh) | 热稳定的Cas9核酸酶 | |
CN116096892A (zh) | 具有RuvC结构域的酶 | |
Liu et al. | Rapid sequencing of cloned DNA using a transposon for bidirectional priming: sequence of the Escherichia coli K-12 avtA gene | |
Young et al. | Nucleotide sequence and genetic analysis of the type Ib trimethoprim-resistant, Tn 4132-encoded dihydrofolate reductase | |
Cao et al. | A newly identified, essential catalytic residue in a critical secondary structure element in the integrase family of site-specific recombinases is conserved in a similar element in eucaryotic type IB topoisomerases | |
CN100503823C (zh) | 含有具有与质粒自主增殖相关功能的基因的dna片段 | |
Casale et al. | Cytoplasmic L-asparaginase: isolation of a defective strain and mapping of ansA | |
Dong et al. | A single digestion, single-stranded oligonucleotide mediated PCR-independent site-directed mutagenesis method | |
Yasunobu et al. | Propagation of phage Mu in IHF-dencient Escherichia coli in the absence of the H-NS histone-like protein | |
Higgins et al. | Primary structure and mapping of the hupA gene of Salmonella typhimurium | |
WO2023076952A1 (en) | Enzymes with hepn domains | |
US20220220460A1 (en) | Enzymes with ruvc domains | |
Szeverényi et al. | Detection and analysis of transpositionally active head-to-tail dimers in three additional Escherichia coli IS elements | |
CN1946844B (zh) | 通过利用两个染色体外元件在原核细胞中产生重组基因 | |
Grønstad et al. | Physical map of alkaliphilic Bacillus firmus OF4 and detection of a large endogenous plasmid | |
Rong et al. | Engineering large fragment insertions into the chromosome of Escherichia coli | |
CN117203332A (zh) | 具有ruvc结构域的酶 | |
JPH07107981A (ja) | 新規dna断片 | |
CN118019843A (zh) | Ii类v型crispr系统 | |
GB2617659A (en) | Enzymes with RUVC domains | |
CN116615547A (zh) | 用于对货物核苷酸序列转座的系统和方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: Tokyo, Japan, Japan Patentee after: Mitsubishi Kasei Corporation Address before: Tokyo, Japan, Japan Patentee before: Mitsubishi Reiyon Co., Ltd. |
|
CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20090624 Termination date: 20180703 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |