JPH0838184A - ロドコッカス属細菌由来カナマイシン耐性遺伝子 - Google Patents

ロドコッカス属細菌由来カナマイシン耐性遺伝子

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JPH0838184A
JPH0838184A JP6201582A JP20158294A JPH0838184A JP H0838184 A JPH0838184 A JP H0838184A JP 6201582 A JP6201582 A JP 6201582A JP 20158294 A JP20158294 A JP 20158294A JP H0838184 A JPH0838184 A JP H0838184A
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    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria

Abstract

(57)【要約】 【構成】宿主微生物にカナマイシン耐性を付与する活性
を有し、配列番号：１で示されるアミノ酸配列またはそ
の一部の配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列を含む、ロドコッカス(Rhodococcus) 属細菌由来の
遺伝子ＤＮＡ。 【効果】本発明のカナマイシン耐性遺伝子は、ロドコッ
カス属細菌用ベクター、特に、ロドコッカス ロドクロ
ウス セルフクローニング用ベクターの構築に有用であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は微生物にカナマイシン耐
性を付与するロドコッカス(Rhodococcus) 属細菌由来の
遺伝子およびそれを含むプラスミドベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】ロドコッカス属に属する微生物はニトリ
ル類を水和または加水分解して対応するアミドまたは酸
類を生産するための微生物触媒として知られており（特
公昭4-4873号、特開昭62-91189号、特開平2-470 号およ
び同2-84198 号各公報参照）、特に、ロドコッカス ロ
ドクロウス(Rhodococcus rhodochrous) 種に属する微生
物が極めて高性能なニトリル水和活性を有する（特開平
2-470 号公報参照）。
【０００３】このような状況下、本発明者の一人らは、
先に、ロドコッカス属の宿主ベクター系の開発を行うべ
く、あるロドコッカス ロドクロウス種の菌株より潜在
性プラスミドを見い出し、複合プラスミドベクターを構
築した（特開平4-148685、同5-64589 および同5-68566
号各公報参照）。
【０００４】一方、より安全性の高いセルフクローニン
グ系の構築のためには、ロドコッカス属細菌由来のマー
カーとなり得る遺伝子の開発が必要である。しかしなが
ら、該薬剤耐性遺伝子としては、ロドコッカス ロドク
ロウス種細菌由来の亜砒酸耐性遺伝子およびカドミウム
耐性遺伝子〔Plasmid 23, 242-247 (1990)〕の存在が知
られているに過ぎない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ロドコ
ッカス属のセルフクローニング系の確立を目指し、ロド
コッカス属、特にロドコッカス ロドクロウス種細菌由
来の薬剤耐性遺伝子について鋭意検討を重ねた結果、新
たにカナマイシン耐性遺伝子を見い出し、本発明を完成
した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、微
生物にカナマイシン耐性を付与する活性を有し、配列番
号：１で示されるアミノ酸配列またはその一部の配列を
有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む、ロ
ドコッカス(Rhodococcus) 属細菌由来の遺伝子ＤＮＡ、
に関する。
【０００７】以下に、本発明を具体的に説明する。本発
明におけるＤＮＡ供与体微生物として、具体的には、ロ
ドコッカス ロドクロウス ATCC 12674 株から自然突然
変異により得られたカナマイシン耐性変異株 KM-02（工
業技術院生命工学工業技術研究所 受託番号 FERM P-1
4457) を挙げることができる。
【０００８】クローニングの際に用いるベクターとして
は、プラスミドベクター（例えば、大腸菌ベクター pTr
c99A、pUC18 等）、ファージベクター（例えば、λgt11
等）のいずれでもよく、また、宿主微生物としては、大
腸菌 JM109株、同 JM105株等およびロドコッカス ロド
クロウス ATCC 12674 株等が挙げられるが、特にこれら
に限定されるものではなく他の宿主微生物を用いること
もできる。
【０００９】カナマイシン耐性遺伝子を用いて作製した
プラスミドベクターにおいて、ロドコッカス属細菌で複
製増殖可能な領域を供与するプラスミドとしては、pRC0
01、pRC002、pRC003およびpRC004が挙げられるが、必ず
しもこれらに限定されるものではない。プラスミド pRC
001 、pRC002、pRC003およびpRC004は、それぞれ、ロド
コッカス ロドクロウス ATCC 4276、ATCC 14349、ATCC
14348およびIFO 3338由来であり、前記、特開平4-1486
85、同5-64589 および同5-68566 号各公報に記載されて
いる。
【００１０】
【実施例】次に実施例により本発明を更に具体的に説明
するが、下記の実施例は本発明の技術的範囲を限定する
ものではない。
【００１１】実施例１ KM-02 株のカナマイシン耐性遺伝子の大腸菌 JM109株へ
のクローニング
【００１２】(1) KM-02 株染色体ＤＮＡの調製とＤＮＡ
ライブラリーの作製：KM-02 株を 100mlのＭＹ培地(0.5
％ポリペプトン、 0.3％バクトイーストエキス、 0.3％
バクトモルトエキス）中、30℃にて振盪培養し、Saito
and Miura の方法〔Biochim. Biophys. Acta 72, 619
(1963) 〕により染色体ＤＮＡを分離した。この一部を
制限酵素Sau3AIで部分分解後、大腸菌ベクター pTrc99A
の BamHI部位に挿入し組換え体ＤＮＡのライブラリーを
作製した。
【００１３】(2) 形質転換体の作製および組換え体ＤＮ
Ａの選別：工程(1) で調製した組換え体ライブラリーに
よる形質転換体を、宿主微生物として大腸菌 JM109株を
用いて塩化カルシウム法により作製し、カナマイシン耐
性を示すようになったものを選別した。選別は以下のよ
うにして行った。
【００１４】カナマイシン塩酸塩（40μg/ml）とＩＰＴ
Ｇ（イソプロピル−β−チオガラクトシド）（1mM)を含
むＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、 0.5％バクト
イーストエキス、 0.5％ＮａＣｌ、 1.5％寒天）に作製
した形質転換体を塗布し、37℃にて一晩培養を行った。
出現したコロニーを取り、同寒天培地にストリークし、
生育することを確認した。
【００１５】こうして得られた形質転換体からプラスミ
ドＤＮＡをBirnboim and Doly の方法〔Nucleic Acid R
es. 7, 1513-1523 (1979) 〕により調製し、これをpKM0
01と名付けた。このプラスミドにより形質転換された大
腸菌組換え体、JM109/pKM001（工業技術院生命工学工業
技術研究所 受託番号 FERM P-14458) はＩＰＴＧ存在
下でカナマイシン耐性を示した。
【００１６】(3) 制限酵素地図の作製とカナマイシン耐
性遺伝子の位置の決定：工程(2) で得られたプラスミド
pKM001について制限酵素地図を作製した（図１）。その
後、pKM001からさらに小さなＤＮＡ断片を持つプラスミ
ドを作製した。これらのプラスミドによって工程(2) と
同様にして形質転換された株のカナマイシン耐性の有無
によって、目的遺伝子の含まれている箇所を決定した。
この過程で、プラスミドpKM002（図２）を作製した。
【００１７】(4) 塩基配列の決定：工程(3) で得られた
プラスミドpKM002のカナマイシン耐性遺伝子に関する部
分のＤＮＡの塩基配列をファルマシア社製蛍光シーケン
サーＡＬＦ II を用いて決定した（配列番号：３）。
【００１８】実施例２ ロドコッカス ロドクロウス由来カナマイシン耐性遺伝
子を用いた大腸菌−ロドコッカス属複合プラスミドベク
ターの作製 本発明者らの一人らが先に作製した複合プラスミドベク
ター pK4〔工業技術院生命工学工業技術研究所 受託番
号 微工研条寄第3731号(FERM BP-3731)：ロドコッカス
属プラスミドpRC004と大腸菌ベクターpHSG299 を連結し
たもの（特開平5-64589 号および同5-68566 号公報参
照）〕からpRC004全部とpHSG299 の一部を含む3.1kb Hi
ndIII 断片を得、これをpKM002に連結したプラスミドを
作製した。
【００１９】その結果、挿入断片の向きの異なる２種の
プラスミドが得られ、これらをそれぞれpKM003およびpK
M004と名付けた（図２）。これらのプラスミドはロドコ
ッカス属および大腸菌において機能する二つの複製開始
点を有する。これらのプラスミドを用いロドコッカス
ロドクロウス ATCC 12674を電気パルス法により形質転
換したところ、カナマイシン（75μg/ml）を含むＭＹ培
地で生育可能な形質転換体が得られた。形質転換体より
プラスミドを調製したところ導入したものと同様のプラ
スミドが得られた。ロドコッカス属細菌を宿主とした場
合には、カナマイシン耐性の発現にＩＰＴＧを必要とし
なかった。
【００２０】実施例３ ロドコッカス属細菌用ベクターの作製 複合プラスミドベクターpKM004を制限酵素KpnIで切断
し、4.3kb のKpnI断片を調製後セルフライゲーションを
行ったものを用い、ロドコッカス ロドクロウスATCC 1
2674株を電気パルス法により形質転換した。その結果、
実施例２に示したものと同程度のカナマイシン耐性を示
す形質転換体が得られた。本形質転換体よりプラスミド
を調製しpKM011と名付けた（図３）。
【００２１】
【発明の効果】本発明のロドコッカス属細菌由来カナマ
イシン耐性遺伝子はロドコッカス属細菌用ベクター、特
に、ロドコッカス ロドクロウス セルフクローニング
用ベクターの構築に有用である。
【００２２】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：１７１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ロドコッカス ロドクロウス(Rhodococcus rho
dochrous) 株名：KM-02 配列： Met Ser Asp Asn Gly Ser Gly Thr Thr Arg Pro Glu Gly Ala Pro Leu 1 5 10 15 Pro Arg Arg Ala Arg Ser Ser Arg Pro Ser Ala Gly Asn Ser Pro Ala 20 25 30 Pro Gly Arg Arg Ala Val Val Ala Lys Ser Arg Arg Arg Leu Ala Ala 35 40 45 Ala Pro Glu Ala Gly Thr Thr His Tyr Ser Ile Phe His Gly Asp Gln 50 55 60 Leu Ile Gly Phe Ile Gln Trp Tyr Glu Ala Glu Asp Asn Pro Asp Phe 65 70 75 80 Arg His Ala Gly Leu Asp Leu Phe Leu Asp Pro Asp Phe His Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Gly Arg Glu Ser Ile Arg Val Leu Cys Ala His Leu Ile Asp 100 105 110 Asp Leu Ala Phe His Arg Leu Val Ile Asp Pro Glu Val Asp Asn Ser 115 120 125 Val Ala Ile Ala Cys Tyr Arg Ser Val Gly Phe Lys Asp Val Gly Val 130 135 140 Met Arg Glu Tyr Ser Arg Asp Arg His Gly Val Trp Lys Asp Gly Leu 145 150 155 160 Leu Met Asp Leu Leu Ala Arg Glu Phe Ile Arg 165 170
【００２３】配列番号：２ 配列の長さ：５１６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ロドコッカス ロドクロウス(Rhodococcus rho
dochrous) 株名：KM-02 配列: ATG AGT GAC AAC GGC TCC GGA ACT ACG CGG CCC GAG GGT GCT CCT CTC 48 CCC CGT CGC GCC CGA TCA TCA CGC CCG TCT GCG GGC AAT TCA CCT GCA 96 CCC GGA CGT CGT GCA GTG GTG GCA AAA TCC CGA CGA CGA CTG GCT GCG 144 GCG CCA GAA GCC GGA ACC ACG CAC TAC AGC ATC TTC CAC GGC GAC CAA 192 CTG ATC GGC TTC ATC CAG TGG TAC GAA GCG GAA GAC AAC CCC GAC TTC 240 CGC CAC GCC GGG CTC GAC TTG TTC CTC GAT CCC GAC TTC CAC GGC CGA 288 GGG TTC GGT CGC GAA TCG ATT CGC GTG CTG TGT GCC CAC CTG ATC GAC 336 GAC CTC GCA TTC CAC CGT CTG GTC ATC GAC CCG GAG GTC GAC AAC TCC 384 GTC GCC ATC GCG TGC TAC CGA TCG GTG GGG TTC AAA GAC GTC GGG GTG 432 ATG CGC GAG TAT TCG CGA GAT CGC CAT GGT GTG TGG AAG GAC GGA CTG 480 CTG ATG GAT CTG CTC GCA CGG GAA TTC ATC CGC TGA 516
【００２４】配列番号：３ 配列の長さ：７４８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ロドコッカス ロドクロウス(Rhodococcus rho
dochrous) 株名：KM-02 配列: GGATCCGGGG TCGTCGCCCA CCAGGATGGT ACCCAAGCCG GGTGTGATGC CCTCTGCCTT 60 CGAGCGCTCA CCCGCACCTT CAGGTCTTCG AAGATTTCGT CGCGGGTAGC TTTGCCGTCG 120 AGGATCGTTG CAGTCACGGC GACCATTGTT CCAGGTTAGG GTCGATGAGT GACAACGGCT 180 CCGGAACTAC GCGGCCCGAG GGTGCTCCTC TCCCCCGTCG CGCCCGATCA TCACGCCCGT 240 CTGCGGGCAA TTCACCTGCA CCCGGACGTC GTGCAGTGGT GGCAAAATCC CGACGACGAC 300 TGGCTGCGGC GCCAGAAGCC GGAACCACGC ACTACAGCAT CTTCCACGGC GACCAACTGA 360 TCGGCTTCAT CCAGTGGTAC GAAGCGGAAG ACAACCCCGA CTTCCGCCAC GCCGGGCTCG 420 ACTTGTTCCT CGATCCCGAC TTCCACGGCC GAGGGTTCGG TCGCGAATCG ATTCGCGTGC 480 TGTGTGCCCA CCTGATCGAC GACCTCGCAT TCCACCGTCT GGTCATCGAC CCGGAGGTCG 540 ACAACTCCGT CGCCATCGCG TGCTACCGAT CGGTGGGGTT CAAAGACGTC GGGGTGATGC 600 GCGAGTATTC GCGAGATCGC CATGGTGTGT GGAAGGACGG ACTGCTGATG GATCTGCTCG 660 CACGGGAATT CATCCGCTGA TCGACTGGGA CGAGTTCGAA AGGACCGACA TCATGTTGCT 720 GGACAAGGAA TTCACGGCCA CCCTGCAG 748
【００２５】
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミド pKM001 の制限酵素地図
【図２】プラスミド pKM002 、pKM003およびpKM004の構
築図
【図３】プラスミド pKM011 の制限酵素地図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 宿主微生物にカナマイシン耐性を付与す
    る活性を有し、配列番号：１で示されるアミノ酸配列ま
    たはその一部の配列を有するポリペプチドをコードする
    ＤＮＡ配列を含む、ロドコッカス(Rhodococcus) 属細菌
    由来の遺伝子ＤＮＡ。
  2. 【請求項２】 ＤＮＡ配列が配列番号：２またはその一
    部の配列からなる請求項１記載の遺伝子ＤＮＡ。
  3. 【請求項３】 宿主微生物がロドコッカス属細菌または
    大腸菌(Escherichia coli)である請求項１または２記載
    の遺伝子ＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 請求項１〜請求項３のいずれか１項に記
    載の遺伝子ＤＮＡおよびロドコッカス属細菌で複製増殖
    可能なＤＮＡ領域を含むプラスミドベクター。
  5. 【請求項５】 ロドコッカス属細菌で複製増殖可能なＤ
    ＮＡ領域が、pRC001、pRC002、pRC003およびpRC004から
    選ばれるプラスミド由来である請求項４記載のプラスミ
    ドベクター。
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