KR100343424B1 - 로도코커스속세균유래카나마이신내성유전자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 숙주미생물에 카나마이신내성을 부여하고, 배열번호 No.1로 표시되는 아미노산배열 또는 그 일부의 배열을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA배열을 함유한 로도코커스속 세균유래 DNA에 관한 것이다. 본 발명의 카나마이신내성 유전자는 로도코커스속 세균용 벡터, 특히 로드코커스 로도크러스 셀프 클로닝용 벡터의 구축에 유용하다.

Description

로도코커스속 세균 유래 카나마이신내성 유전자
본 발명은 미생물에 카나마이신 내성을 부여하는 로도코커스(Rhodococcus)속 세균 유래의 유전자 및 그것을 함유한 플라스미드 벡터에 관한 것이다.
로도코커스속에 속하는 세균은 니트릴류를 수화 또는 가수분해하여 대응하는 아미드 또는 산류를 생산하기 위한 미생물촉매로서 알려져 있으며 (일본국 특허공고공보 제 4873/92호, 일본특허공개공보 제91189/87호, 제470/90호 및 제84198/90호), 특히 로도코커스 로도크러스(Rhodococcus rhodochrous)종에 속하는 미생물이 매우 고성능의 니트릴 수화활성을 갖는다 (일본국 특허공개공보 제470/90호).
이와 같은 상황하에서 본 발명자중의 한 사람은 로도코커스속의 숙주-벡터계를 개발하기 위하여 어떤 로도코커스 로도크러스종의 균주로부터 잠재성 플라스미드를 발견하여, 혼성(hybrid) 플라스미드 벡터를 구축하였다(일본국 특허 공개공보제 148685/92호, 제64589/93호 및 제68566/93호).
한편 보다 안전성이 높은 셀프클로닝계(self-cloning system)의 구축을 위해서는 로도코커스속 세균유래의 마커(maker)유전자의 개발이 필요하다. 그러나 그러한 약제내성 유전자로서는 로도코커스 로도크러스종 세균유래의 아비산내성 유전자 및 카드뮴내성 유전자(플라스미드 23,242-247(1990))의 존재가 알려져 있을 뿐이다.
본 발명자들은 로도코커스속의 셀프클로닝계의 확립을 목표로 하여, 로도코커스속, 특히 로도코커스 로도크러스종 세균유래의 약제내성 유전자에 대하여 예의 검토를 거듭한 결과, 새로히 본 발명의 카나마이신내성 유전자를 발견하였다.
즉 본 발명은 숙주미생물에 카나마이신내성을 부여하는, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 그 일부의 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 서열을 함유한 로도코커스속 세균유래 DNA에 관한 것이다.
본 발명의 DNA공여체로서 로도코커스 로도크러스 ATCC 12674주로 부터 자연돌연변이에 의해 얻어진 카나마이신내성 변이주 KM-02(일본국 공업기술원 생명공학 공업기술연구소 수탁번호 FERM BP-5137)를 들 수가 있다.
본 발명의 클로닝에 사용하는 벡터로서는 pTrc99A,pUC18등의 대장균 벡터(E.colivector)에 제한되지 않는 플라스미드 벡터 및 λgt11등의 파이지 벡터(phage vector)를 들 수 있다. 숙주 미생물로서는 대장균 JM109, 대장균 JM105, 및 로도코커스 로도크러스 ATCC 12674를 들 수 있으나, 반드시 이것에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 카나마이신내성 유전자를 사용하여 작제한 플라스미드 벡터로서 로도코커스속 세균에서 복제증식 가능한 영역을 공여하는 플라스미드로서는 pRC001, pRC002, pRC003 및 pRC004를 들 수 있으나, 반드시 이들에 한정되는 것은 아니다. 플라스미드 pRC001, pRC002, pRC003 및 pRC004는 각각 로도코커스 로도크러스 ATCC 4276, ATCC 14349, ATCC14348 및 IFO 3338 유래이며, 상기 일본국 특허공개공보 제 148685/92호, 제64589/93호 및 제68566/93호에 각각 기재되어 있다.
실시예
다음 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 하기의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예1
변이주 KM-02 카나마이신 내성유전자의 대장균 JM109로의 클로닝
(1) KM-02주로부터의 염색체(genomic) DNA의 제조와 DNA 라이브러리의 제조
KM-02주를 100㎖의 MY배지(0.5%폴리펩톤, 0.3%박토 이스트 엑기스(Bacto-yeast extract), 0.3%박토 말트 엑기스(Bacto-malt extract))중에서 30℃로 진탕 배양하고, Saito and Miura의 방법(Biochim. Biophys, Acta 72,619(1963)에 의해 염색체 DNA를 분리 하였다. 이 분리된 DNA의 일부를 제한효소Sau3AI로 부분 분해후에 대장균 벡터 pTrc99A의BamHI부위에 삽입하여 재조합 DNA 라이브러리를 제조하였다.
(2) 형질전환체의 제조 및 재조합 DNA의 선별
공정(1)에서 제조한 재조합 DNA 라이브러리를 사용하여 대장균 JM109를 염화칼슘법에 의해 형질전환하고, 카나마이신내성을 가진 형질전환체를 다음과 같은 방법으로 선별 하였다.
상기와 같이 얻어진 형질전환체를 40㎍/㎖의 카나마이신염산염과 1mM IPTG(이소프로필-β-티오갈락토시드)를 함유한 LB한천배지(1%박토 트립톤, 0.5%박토 이스트엑기스, 0.5NaC1, 1.5%한천)에 도포하고, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 출현한 콜로니(colonies)를 취해 동일한 한천배지에 도포하여 생육함을 확인하였다.
이렇게 얻어진 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 Birnboim and Doly의 방법(Nucleic Acid Res. 7,1513-1523(1979))에 의해 제조하고, 이것을 pKM001이라 명명하였다. 이 플라스미드를 대장균에 재도입하고, 얻어진 카나마이신내성의 형질전환체를 JM109/pKM001라 명명하고, 일본국 공업기술원 생명공학 공입기술연구소 수탁번호 FERM BP-5138로 기탁하였다. 대장균 JM109/pKM001은 IPTG의 존재하에 카나마이신내성을 나타내었다.
(3) pKM001의 제한효소지도 작성과 카나마이신내성 유전자 위치의 결정
공정(2)에서 얻어진 플라스미드 pKM001의 제한효소 지도를 작성하였다 (제1도). 그 후에 플라스미드 pKM001를 이용하여 더 작은 DNA단편을 갖는 플라스미드를 작제하였다. 이들 플라스미드에 의해 공정(2)와 동일한 방식으로 형질전환체의 카나마이신 내성의 유무에 따라 목적유전자가 함유되어 있는 영역을 결정하였다. 이 과정 중에 플라스미드 pKM002(제2도)를 제조 하였다.
(4) 염기서열의 결정
플라스미드 pKM002의 카나마이신내성 유전자의 염기서열을 Pharmacia사제 형광 시퀀서 ALF II을 사용하여 결정하였다(서열번호 3).
실시예2
로도코커스 로도크러스유래 카나마이신내성 유전자를 갖는 혼성(대장균-로더코커스)플라스미드 벡터의 제조
본 발명자중의 한 사람이 이전에 로도코커스유래 플라스미드 pRC004와 대장균 벡터 pHSG299를 연결함으로써 제조하여, 일본국 공업기술원 생명공학 공업기술연구소 수탁번호 FERM BP3731로 기탁한 혼성 플라스미드 벡터 pK4(일본국 특허공개공보 제 64589/93호 및 68566/93호)로 부터 pRC004의 전부와 pHSG299의 일부를 함유한 3.1kbHindIII단편을 얻고, 이 단편을 플라스미드 pKM002와 연결하였다.
그 결과, 삽입 단편의 방향이 다른 2종의 플라스미드가 얻어지고, 이들을 각각 pKM003 및 pKM004라 명명하였다(제2도). 이들 플라스미드는 로도코커스속 및 대장균 둘다에서 복제한다. 이들 플라스미드를 사용한 로도코커스 로도크러스 ATCC 12674를 전기 펄스법(electroporation)에 의해 형질전환 한 결과, 카나마이신 75㎍/㎖를 함유한 MY에서 생육 가능한 형질전환체가 얻어졌다. 형질전환체로부터 플라스미드를 수득한 결과, 도입한 것과 동일한 플라스미드가 수득되었다. 로도코커스속 세균을 숙주로 한 경우에는 카나마이신내성의 발현에 IPTC를 필요로 하지 않았다.
실시예3
로도코커스속 세균용 벡터의 제조
혼성 플라스미드 벡터 pKM004를 제한효소KpnI로 절단하여 4.3kb의KpnI 단편을 제조한 후, 자체연결(self-ligated)한 것을 사용하여, 로도코커스 로도크러스 ATCC 12674주를 전기펄스법에 의해 형질전환하였다. 그 결과, 실시예2에 나타낸 것과 같은 정도의 카나마이신내성을 나타내는 형질전화체가 수득되었다. 이 형질전환체로부터 플라스미드를 수득하여 pkM011이라 명명하였다(제3도).
서열표
서열번호 : 1
길이 : 171
서열의 형 : 아미노산
토폴로지 : 직쇄형상
서열종류 : 단백질
기원
세균명 : 로도코커스 로도크러스
주 명 : KM-02
제1도는 플라스미드 pKM001의 제한 효소지도.
제2도는 플라스미드 pKM002, pKM003 및 pKM004의 구축도.
제3도는 플라스미드 pKM011의 제한 효소지도.

Claims (6)

  1. 숙주미생물에 카나마이신내성을 부여하고, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 그 일부의 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 함유한 로도코커스속 세균 유래 DNA.
  2. 제1항에 있어서, DNA 서열이 서열번호 2 또는 그 일부의 서열로 된 DNA.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 숙주미생물이 로도코커스속 세균 또는 대장균(Escherichia coli)인 DNA.
  4. 제1항 또는 제2항 기재의 DNA 및 로도코커스속 세균에서 복제증식 가능한 영역을 포함하는 플라스미드 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 로도코커스속 세균에서 복제증식 가능한 DNA영역이 pRC001, pRC002, pRC003 및 pRC004로 된 군으로부터 선택한 플라스미드 유래인 플라스미드 벡터.
  6. 제3항 기재의 DNA 및 로도코커스속 세균에서 복제증식 가능한 영역을 포함하는 플라스미드 벡터.
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