JP4495429B2 - ロドコッカス属細菌の形質転換方法 - Google Patents

Description

本発明は、ロドコッカス属細菌の形質転換方法に関する。

ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌（以下、「ロドコッカス属細菌」ともいう）は、その物理的強度や酵素等を細胞内に多量蓄積する能力から、産業的に有用な微生物触媒として知られ、ニトリル類の酵素的水和または加水分解によるアミドまたは酸の生産等に利用されている（特許文献１および２参照）。例として、アクリルアミドの工業的生産におけるロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株の使用が挙げられ、このような工業触媒酵素を含む細菌を遺伝子組換え法により改良する試みがなされている（特許文献３〜５参照）。さらに、ロドコッカス属細菌の遺伝子操作を効率的に促進するために、ロドコッカス属細菌用の宿主−ベクター系の開発が進められており、新規なプラスミドの探索（特許文献６〜８参照）やベクターの開発（特許文献９〜１１および非特許文献１参照）なども行われている。

ロドコッカス属細菌の形質転換方法としては、電気パルス法（特許文献１２〜１５参照）やプロトプラスト法（非特許文献２および３参照）が知られており、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４をはじめとして、多くの形質転換体が得られている。また、形質転換効率を向上させる試みも行われており、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）の電気パルス法による形質転換においては、グリセロールとＴｗｅｅｎ８０を添加して培養して得られたコンピテントセルを用いることにより、形質転換効率が向上することが示されている（非特許文献４）。

しかしながら、上記手法によりすべてのロドコッカス属細菌の形質転換が可能というわけではなく、菌株により効率が極めて低いものや全く不可能なものも多く存在した。そのため、宿主としては産業上有用であるにもかかわらず、形質転換効率が極めて低いために、遺伝子組換え技術の適用が困難であるという問題があった。

以上のように、ロドコッカス属細菌の形質転換効率を向上させるため、より簡易にかつ十分な形質転換効率を達成できる形質転換方法が望まれている。

特開平２−４７０号公報 特開平３−２５１１９２号公報 特開平４−２１１３７９号公報 特開平６−２５２９６号公報 特開平６−３０３９７１号公報 特開平４−１４８６８５号公報 特開平４−３３０２８７号公報 特開平７−２５５４８４号公報 特開平５−６４５８９号公報 特開平８−５６６６９号公報 米国特許第４，９２０，０５４号 特開平１０−２４８５７８号公報 特開平９−２８３８０号公報 特開平８−５６６６９号公報 特開平５−６８５６６号公報 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，第１７０巻，６３８−６４５頁，１９８８年 Ｊ Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第３８（２）巻，１０１−６頁，１９９８年 Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１７０（２）巻，６３８−４５頁，１９８８年 Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ，第６０（２）巻，２７７−２７９頁，１９９８年

そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、形質転換効率が優れたロドコッカス属細菌の形質転換方法を提供することを目的とする。

上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、形質転換しようとするロドコッカス属細菌とは異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌から調製したＤＮＡを用いて形質転換を行うことによって、高効率にロドコッカス属細菌を形質転換できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、下記の工程を含む、ロドコッカス属細菌の形質転換方法に関する。
（ａ）プラスミドＤＮＡを含む、形質転換の対象となるロドコッカス属細菌とは異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌を調製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で調製した細菌からプラスミドＤＮＡを調製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）により調製したプラスミドＤＮＡを用いて形質転換対象ロドコッカス属細菌株を形質転換する工程。

上記形質転換方法においては、工程（ａ）は、例えば、プラスミドＤＮＡを用いて異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌を形質転換することにより行うことができる。

また、上記形質転換対象ロドコッカス属細菌は、ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）であることが好ましい。さらに、異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌としては、例えばロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１７８９４、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１９１４０、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ３３２５８、ロドコッカス ｓｐ Ｎ７７４、およびロドコッカス・エリスロポリスＳＫ９２が挙げられる。

また上記形質転換方法において、形質転換対象ロドコッカス属細菌は、グリシン、ペニシリンＧまたはイソニコチン酸ヒドラジドで処理されていることが好ましい。さらに形質転換は、例えば電気パルス法を用いて行うことができる。

上記形質転換方法において、形質転換は、例えば、ロドコッカス属細菌内で自律複製可能で、かつ薬剤耐性遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを用い、該薬剤の存在下で宿主細菌を培養し、形質転換体を選択することを含むものである。ここで、上記薬剤としてはカナマイシンが挙げられる。

本発明により、ロドコッカス属細菌の形質転換方法が提供される。本発明に係る形質転換方法により得られたロドコッカス属細菌の形質転換体は、導入したＤＮＡの効果により新たな性質を有することが可能である。

以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るロドコッカス属細菌の形質転換方法は、形質転換しようとするロドコッカス属細菌とは異なるロドコッカス属細菌またはその類縁株からプラスミドＤＮＡを調製し、そのプラスミドＤＮＡを用いて形質転換対象ロドコッカス属細菌を形質転換することによって、ロドコッカス属細菌における形質転換効率を高めるものである。

１．形質転換対象のロドコッカス属細菌
本発明に係る形質転換方法の形質転換の対象となるロドコッカス属細菌（本明細書中、「形質転換対象ロドコッカス属細菌」ともいう）は、特に限定されるものではなく、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、ロドコッカス・ロドニ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｎｉｉ）、 ロドコッカス・コラリヌス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ）、ロドコッカス・ルブロペルチンクタス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｒｏｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ）、ロドコッカス・コプロフィラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）、ロドコッカス・グロベルルス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）、ロドコッカス・クロロフェノリカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ）、ロドコッカス・ルテウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、ロドコッカス・アイシェンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ａｉｃｈｉｅｎｓｉｓ）、ロドコッカス・チュブエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｃｈｕｂｕｅｎｓｉｓ）、ロドコッカス・マリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｓ）、ロドコッカス・ファシエンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｓｃｉｎｅｓ）等が挙げられる。特に、本発明に係る形質転換方法は、現在までに形質転換体が得られていないロドコッカス属細菌にも適用可能であり、有効である。そのようなロドコッカス属細菌の例としては、ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ４２７３株、ＡＴＣＣ１５９０５株、ＡＴＣＣ２１１９７株、ＡＴＣＣ１４８９４株などが挙げられる。ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓｅ Ｊ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、昭和６２年９月１８日に寄託されている。形質転換対象ロドコッカス属細菌には、上述したような菌株（例えばロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株）に変異剤処理や紫外線照射等によって変異を導入した変異株なども含まれる。ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ４２７３株、ＡＴＣＣ１５９０５株、ＡＴＣＣ２１１９７株およびＡＴＣＣ１４８９４株は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから容易に入手可能である。

本発明に係る形質転換方法によれば、上述したロドコッカス属細菌に効率的にＤＮＡを導入し、形質転換することが可能となる。

２．プラスミドＤＮＡの調製
本発明の形質転換方法においては、形質転換対象ロドコッカス属細菌とは異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌（本明細書中、「異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌」ともいう）からプラスミドＤＮＡを調製する。当該異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌は、形質転換対象ロドコッカス属細菌と菌株の種類が異なる限り特に限定されるものではない。例えば、ロドコッカス・ロドクロウス、ロドコッカス・エリスロポリス、ロドコッカス・エクイ、ロドコッカス・ロドニ、ロドコッカス・コラリヌス、ロドコッカス・ルブロペルチンクタス、ロドコッカス・コプロフィラス、ロドコッカス・グロベルルス、ロドコッカス・クロロフェノリカス、ロドコッカス・ルテウス、ロドコッカス・アイシェンシス、ロドコッカス・チュブエンシス、ロドコッカス・マリス、ロドコッカス・ファシエンス等が挙げられる。また、ロドコッカス属細菌の類縁菌としては、ゴルドナ・テラエ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｔｅｒｒａｅ）、ゴルドナ・スプチ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐｕｔｉ）、ゴルドナ・ルブロペルチンクタス（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｒｕｂｒｏｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ）等が挙げられる。本発明に係る形質転換方法においては、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４株、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１７８９４株、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１９１４０株、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ３３２５８株、ロドコッカス ｓｐ Ｎ７７４株、ロドコッカス・エリスロポリスＳＫ９２株が好ましい。ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２７６４株、ＡＴＣＣ１７８９５株、およびＡＴＣＣ１９１４０株は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから容易に入手可能であり、ロドコッカス ｓｐ Ｎ７７４株は受託番号ＦＥＰＭ Ｐ−１９３６として、ロドコッカス・エリスロポリスＳＫ９２株は受託番号ＦＥＰＭ ＢＰ−３３２４として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されており、容易に入手可能である。

本発明に係る形質転換方法において、形質転換に使用するプラスミドＤＮＡは、異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌から調製する。従って、プラスミドＤＮＡは、異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌に元来存在するものである場合には、直接単離することによって調製することができる。また、プラスミドＤＮＡが存在しないものである場合には、プラスミドＤＮＡを用いて異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌を形質転換した後、プラスミドＤＮＡを含むこととなったその異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌から、該プラスミドＤＮＡを単離することによって調製することができる。

プラスミドＤＮＡは、形質転換しようとするＤＮＡをコードするものであれば、天然から単離されるＤＮＡであってもよいし、あるいは、合成ＤＮＡ、または遺伝子工学的手法も用いて産生されたＤＮＡであってもよい。

ロドコッカス属細菌で使用するのに好ましいＤＮＡとしては、例えばｐＫ１、ｐＫ２、ｐＫ３およびｐＫ４（特許文献９参照）、ならびにｐＳＪ０２３およびｐＳＪ００２（特許文献１２参照）等が挙げられる。これらのプラスミドＤＮＡは、ロドコッカス属細菌で自律複製が可能な領域と、薬剤耐性遺伝子としてカナマイシン遺伝子を含んでいるため、形質転換に使用するために好ましい。

プラスミドＤＮＡが異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌に存在しない場合には、プラスミドＤＮＡを用いて異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌を形質転換する。形質転換手法は、当業者に公知の方法であれば特に限定されるものではない。

形質転換する宿主細菌に導入するためのＤＮＡは、アルカリ−ＳＤＳ法で調製したものが使用でき、好ましくは不純物の少ない高純度なＤＮＡを使用する。プラスミドＤＮＡを高純度に精製する方法としては、密度勾配遠心法、市販精製キットを使用することができる。密度勾配遠心法は、例えばＣｓＣｌやＣＦ_３ＣＯＯＣｓを使用して、１００，０００Ｇで２〜４８時間で遠心した後、目的とするＤＮＡのバンドを抽出することにより、プラスミドＤＮＡを精製することができる。

使用する宿主細菌は、細胞壁の構造を変化させることにより、プラスミドＤＮＡの導入効率を高めることが可能である。細胞壁の構造を変化させる方法としては、培養時にグリシン、ペニシリンＧまたはイソニコチン酸ヒドラジドで処理する方法が好ましい。このようにして調製した宿主細菌はコンピテントセルと呼ばれる。

ペニシリンＧは、細菌の細胞壁ペプチドグリカンの網目状構造形成を阻害して、溶菌に導く機能を有する。ロドコッカス属細菌の形質転換手法においても、宿主細菌をペニシリンＧを添加した培地中で培養することにより形質転換効率を向上させた例が知られている（特許文献１４参照）。またグリシンは、グラム陽性細菌の細胞壁にＤ−アラニンに代わって取り込まれ、ペプチドグリカンの架橋構造を弛緩し、細胞壁が不安定になるので、多くのグラム陽性細菌の形質転換およびプロトプラストに使用されている（Ｗ．Ｈｅｍｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１１６，１０２９−１０５３（１９７３）参照）。さらに、グリシンとペニシリンＧ処理は併用することが可能である。具体的には、宿主細菌を適当な培地に植菌し、対数増殖期初期にグリシンおよび／またはペニシリンＧを適量添加する。添加するグリシンの濃度としては０．１〜１０％が好ましく、ペニシリンＧの濃度としては０．０１〜１０μｇ／ｍｌが好ましい。イソニコチン酸ヒドラジドは、細胞壁のミコール酸生合成を阻害する機能を有するため、グラム陽性菌の形質転換に使用される（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７６，７３０９−７３１９（１９９４））。使用する濃度は、１〜５ｍｇ／ｍｇが好ましい。薬剤を添加する量と時期に関しては、使用する宿主細菌の種類により異なるため、種々の濃度と添加時期について予備検討を行い、適当なものを設定するのが好ましい。薬剤を添加した後さらに培養を続け、遠心分離で培養液を除いて数回滅菌水で洗浄したものがコンピテントセルとなる。コンピテントセルを懸濁する溶媒としては、滅菌水や、浸透圧を調整するためのシュークロースを含んだ緩衝液が使用できる（非特許文献４）。

以上のように調製したプラスミドＤＮＡと宿主細菌を使用して形質転換を行う。形質転換手法は、当業者に公知の形質転換手法であれば特に限定されるものではない。例えば、電気パルス法を使用し、適量のプラスミドＤＮＡとコンピテントセルを混合してキュベットに入れ、電気パルスを印加する。電気パルスの印加条件は、電圧として１０〜２５ＫＶ／ｃｍ、好ましくは２０ＫＶ／ｃｍ、抵抗値として５０〜４００Ω、好ましくは１００−２００Ωを使用する。電気パルスを印加した後、３７℃で数分ヒートショックを行い、その後、適当な培地を適量加え、約３０℃にて数時間培養を行う。この培養を行うことにより、上述のように薬剤添加によって変化した細胞壁が正常な構造に回復すると共に、プラスミド由来の薬剤耐性遺伝子の発現が起こる。この培養時間は、１時間以上が好ましく、１２時間以上がより好ましい。

形質転換を確認するためのマーカー薬剤または選択培地の薬剤としては、形質転換体の取得が可能であり、かつ、宿主細菌と形質転換体を区別することができるものであれば特に制限されないが、例えばカナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、トリメトプリム、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等が挙げられる。

薬剤の濃度は、形質転換体を効率よく取得するためには、選択培地に対して必要最少量とすることが好ましい。この濃度は、各種濃度の薬剤を含む寒天培地に宿主細菌をプレートし、コロニーの生育の有無を調べることによって設定することができる。例えば、プラスミドＤＮＡとしてｐＫ１、ｐＫ２、ｐＫ３、ｐＫ４、ｐＳＪ０２３、ｐＳＪ００２などを使用する場合には、カナマイシン濃度は１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜５０μｇ／ｍｌである。

上記形質転換により、プラスミドＤＮＡを含む異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌を調製することができる。

以上のようにして調製された異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌から、プラスミドＤＮＡを調製する。プラスミドＤＮＡは、細菌からＤＮＡを抽出する方法であれば任意の方法を使用して調製することができる。例えば、プラスミドＤＮＡはアルカリ−ＳＤＳ法で調製することできる。また、上述した手法などにより、好ましくは不純物の少ない高純度なＤＮＡを調製する。

３．形質転換対象ロドコッカス属細菌の形質転換
上述のように異なるロドコッカス属細菌またはその類縁菌から調製したプラスミドＤＮＡを用いて、形質転換対象ロドコッカス属細菌を形質転換する。形質転換は、前項「２．プラスミドＤＮＡの調製」に記載のようにして、任意の手法により行うことができる。また、形質転換を行う際には、プラスミドＤＮＡの導入効率を高めるために細胞壁の構造を変化させたり、形質転換体の効率的な選抜のためにマーカー薬剤遺伝子と選択培地を使用してもよい。これらの手順は、前項「２．プラスミドＤＮＡの調製」に記載のように実施することができる。

以上のようにプラスミドＤＮＡを用いて形質転換を行うことによって、ロドコッカス属細菌の形質転換効率を高め、さらには従来は形質転換体が得られていなかったロドコッカス属細菌の形質転換体を得ることが可能となる。またこのようにして得られたロドコッカス属細菌の形質転換体は、導入したＤＮＡの効果により新たな性質を有するため、産業上有用である。

以下に記載する実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株へのＤＮＡ導入
（１）プラスミドＤＮＡの調製
本実施例に使用するＤＮＡ ｐＫ４は、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４／ｐＫ４株に導入されて、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３７３１号として、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されている。

ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４／ｐＫ４株を、１００ｍｌのＭＹ培地（ポリペプトン０．５％、バクトイーストエキス０．３％、マルツエキス０．３％、グルコース１％、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）に植菌した。２４時間培養した後に終濃度２％となるように滅菌した２０％グリシン溶液を添加し、さらに２４時間培養した。その後、遠心分離により菌体を回収し、菌体を４０ｍｌのＴＥＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）−１０ｍＭ ＮａＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１２．５％シュークロース、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍｇ／ｍｌリゾチームを含む溶液１１ｍｌに懸濁し、３７℃にて３時間振盪した。これに１ｍｌの１０％ＳＤＳを加え、室温で穏やかに１時間振盪し、さらに１ｍｌの５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）を添加し、氷中で１時間静置した。その後、４℃にて１０，０００Ｇで１時間遠心し上清を得た。これに５倍量のエタノールを加え、−２０℃で３０分静置した後、１０，０００Ｇで２０分間遠心した。沈澱物を３０ｍｌの７０％エタノールで洗浄した後、１００μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、ＤＮＡ溶液を得た。

次にＤＮＡの精製を行った。得られたＤＮＡ溶液に７００μｌの滅菌水と３μｌのエチジウムブロマイド（１０μｇ／ｍｌ）を加え攪拌した。このＤＮＡ溶液を卓上遠心機で遠心分離を行い、不溶物を取り除いた。不溶物を取り除いたＤＮＡ溶液を遠心チューブに入れ、さらに８００μｌのトリフルオロ酢酸セシウム（和光純薬）を加え懸濁した。これを２５℃で５時間かけて１００，０００Ｇで超遠心分離（ＢｅｃｋｍａｎＴＬ−１００）を行った。遠心分離後、遠心チューブに紫外線を照射しながらＤＮＡを抽出し、イソアミルアルコール処理を行ってエチジウムブロマイドを除去した。これを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、ＤＮＡの存在を確認した。

（２）Ｊ−１株コンピテントセルの調製
１０ｍｌのＭＹＫＧ培地（ポリペプトン０．５％、バクトイーストエキス０．３％、マルツエキス０．３％、ＫＨ_２ＰＯ_４０．２％、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．２％、グルコース１％）にロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株を植菌し、３０℃で培養した。１５〜１７時間後、終濃度２％となるように滅菌した２０％グリシン溶液を添加し、さらに２４時間培養した。この培養液を１％グリシンを含んだ１０ｍｌのＭＹＫＧ培地に２％植菌し、さらに３０℃で４８時間培養を行った。この培養液を滅菌水で３回洗浄し、最後に滅菌水５００μｌに再懸濁した。これをコンピテントセルとして用いた。

（３）形質転換
前項（１）で調製したＤＮＡ（ｐＫ４）１μｌと前項（２）で調製したＪ−１株コンピテントセル１０μｌを混合し、３０分間氷冷した。キュベットにＤＮＡと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ）により２０ＫＶ／ｃｍ、１００Ωで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下１０分静置し、３７℃で１０分間ヒートショックを行い、ＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ_２ＨＰＯ_４、０．２％ＫＨ_２ＰＯ_４）５００μｌを加え、３０℃にて２４時間静置した後、１０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃にて３日間培養した。コロニー数はプレート上に生育したコロニー数を示す。

また、比較対照として大腸菌ＪＭ１０９株由来のＤＮＡを用いて形質転換を行った。ＪＭ１０９株由来のＤＮＡは、大腸菌形質転換体ＪＭ１０９／ｐＫ４（特許文献１５に記載の通りに調製した）をＬＢ培地（ＮａＣｌ１％、トリプトン０．５％、酵母エキス０．５％、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）で１２時間３７℃で培養し、Ｆｌｅｘｉ Ｐｒｅｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてｐＫ４を調製した。

これらのコロニーは、前項（１）に示す方法で調製したｐＫ４が導入された形質転換体であることを確認した。
このように、ＪＭ１０９株由来のＤＮＡでは形質転換体が得られなかったのに対し、ＡＴＣＣ１２６７４形質転換体から調製したＤＮＡを用いることにより、ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株の形質転換体が得られた。

形質転換に使用するＤＮＡの検討
（１）プラスミドＤＮＡの調製
実施例１で調製したプラスミドＤＮＡを用いて種々の宿主細菌を形質転換した。
ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１７８９５株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。ＤＮＡ（ｐＫ４）１μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合し、氷冷した。キュベットにＤＮＡと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ）により２０ＫＶ／ｃｍ、２００Ωで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下１０分静置し、３７℃で１０分間ヒートショックを行い、ＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ_２ＨＰＯ_４、０．２ ＫＨ_２ＰＯ_４）５００μｌを加え、３０℃にて５時間静置した後、５０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃にて３日間培養した。このようにして得られたコロニーをＡＴＣＣ１７８９５／ｐＫ４として用いた。

ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１７８９５株、ＡＴＣＣ１９１４０株、ロドコッカス ｓｐ Ｎ７７４株、およびロドコッカス・エリスロポリスＳＫ９２株を用いて同様の操作を行い、４種の形質転換体（ＡＴＣＣ１７８９５／ｐＫ４、ＡＴＣＣ１９１４０／ｐＫ４、Ｎ７７４／ｐＫ４、およびＳＫ９２／ｐＫ４）を得た。
次に得られた形質転換体から実施例１（１）の方法に従いＤＮＡの調製を行った。

（２）形質転換
前項（１）で調製したＤＮＡを使用し、実施例１の（３）と同様の操作を行ってロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株に形質転換した。選択プレートのカナマイシン濃度は１０μｇ／ｍｌを使用し、比較対照として大腸菌ＪＭ１０９株から調製したＤＮＡを用いてロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株を形質転換した。表２に結果を示した。

これらのコロニーは、実施例１の（１）に示す方法でＤＮＡを調製したｐＫ４が導入された形質転換体であることを確認した。
このように、大腸菌ＪＭ１０９株由来のＤＮＡではロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株の形質転換体が得られなかったのに対し、ＡＴＣＣ１２６７４形質転換体から調製したＤＮＡを用いることにより、ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株の形質転換体が得られた。

Ｊ−１株へのＤＮＡ導入
（１）プラスミドＤＮＡ ｐＳＪ０２３の調製
本実施例で使用するｐＳＪ０２３は、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３に導入されて、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６１０８として独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されている。

ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３を、１００ｍｌのＭＹ培地（ポリペプトン０．５％、バクトイーストエキス０．３％、マルツエキス０．３％、グルコース１％、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）に植菌した。２４時間培養した後に、終濃度２％となるように滅菌した２０％グリシン溶液を添加し、さらに２４時間培養した。その後、遠心分離により菌体を回収し、菌体を４０ｍｌのＴＥＮＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）−１０ｍＭ ＮａＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１２．５％シュークロース、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍｇ／ｍｌリゾチームを含む溶液１１ｍｌに懸濁し、３７℃にて３時間振盪した。

ＤＮＡの調製には、Ｈｉｓｐｅｅｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ ｃａｔ．Ｎｏ．１２６４３）を用い、取り扱い説明書に従って操作した。調製したＤＮＡは、０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、ＤＮＡの存在を確認した。

（２）Ｊ−１株コンピテントセルの調製
１０ｍｌのＭＹＫＧ培地（ポリペプトン０．５％、バクトイーストエキス０．３％、マルツエキス０．３％、ＫＨ_２ＰＯ_４０．２％、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．２％、グルコース１％）にロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株を植菌し、３０℃で２４時間培養した。

この培養液を０．１μｇ／ｍｌのペニシリンＧを含んだ１０ｍｌのＭＹＫＧ培地に２％植菌し、さらに３０℃で２４時間培養を行った。この培養液を滅菌水で３回洗浄し、最後に滅菌水５００μｌに再懸濁した。これをコンピテントセルとして用いた。

（３）形質転換
前項（１）で調製したＤＮＡ（ｐＳＪ０２３）と前項（２）で作製したコンピテントセルを用い、その他は実施例１と同様の操作を行った。選択プレートのカナマイシン濃度は１０μｇ／ｍｌを使用し、比較対照として大腸菌ＪＭ１０９株から調製したＤＮＡを用いた。表３に結果を示した。

このように、大腸菌ＪＭ１０９株由来のＤＮＡではロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株の形質転換体が得られなかったのに対し、ロドコッカス属細菌から調製したＤＮＡを用いることにより、ロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株の形質転換体が得られた。

本発明により、ロドコッカス属細菌の形質転換方法が提供される。本発明に係る形質転換方法により得られたロドコッカス属細菌の形質転換体は、導入したＤＮＡの効果により新たな性質を付与することが可能である。

Claims (7)

1. 下記の工程：
   （ａ）プラスミドＤＮＡを含む、形質転換の対象となるロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）またはその変異株とは異なるロドコッカス属細菌を調製する工程、
   （ｂ）工程（ａ）で調製した細菌からプラスミドＤＮＡを調製する工程、
   （ｃ）工程（ｂ）により調製したプラスミドＤＮＡを用いて形質転換対象のロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株又はその変異株を形質転換する工程
   を含む、ロドコッカス属細菌の形質転換方法。
2. 工程（ａ）が、プラスミドＤＮＡを用いて異なるロドコッカス属細菌を形質転換することにより行われる、請求項１記載の形質転換方法。
3. 異なるロドコッカス属細菌が、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１７８９５、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ１９１４０、ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ３３２５８、ロドコッカス ｓｐ Ｎ７７４、またはロドコッカス・エリスロポリスＳＫ９２である、請求項１又は２記載の形質転換方法。
4. 形質転換対象の細菌が、グリシン、ペニシリンＧまたはイソニコチン酸ヒドラジドで処理されているものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の形質転換方法。
5. 形質転換が電気パルス法を用いて行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の形質転換方法。
6. 形質転換が、ロドコッカス属細菌内で自律複製可能で、かつ薬剤耐性遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを用い、該薬剤の存在下で宿主細菌を培養し、形質転換体を選択することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の形質転換方法。
7. 薬剤がカナマイシンである、請求項６記載の形質転換方法。