JP3520322B2 - 低温細菌由来の新規なプラスミドｐＰＳ１Ｍ２及びその誘導体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子操作技術に
関し、より詳細には、低温でよく生育する微生物を宿主
とし、その低温増殖機能や低温性酵素等生産物の利用を
目的とした遺伝子操作に有用なプラスミドに関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】低温細菌は、摂氏４−３０℃の温度範囲
で生育し、特に10℃以下の低温条件でも良好な増殖を示
す有用な微生物である。この低温細菌に対して、近年急
速に発達してきた遺伝子組換え技術を適用することが可
能になれば、その有用性は一層増大させることが期待で
きる。実際に、一部の低温細菌を宿主として用い、中温
性細菌の巨大プラスミドを接合伝達で導入したり（Kole
nc et al. (1988; AEM 54:638-641)、同様に中温性細菌
の広宿主域プラスミドを接合伝達で導入したり（Remaut
et al., 1999; pp. 1-16. In: Biotechnological Appl
ications of Cold-adapted Organisms. Ed. R. Margesi
n and F. Schinner, Springer)と、低温細菌を対象とし
た遺伝子組換え技術の開発が進められており、産業への
応用の試みが行われようとしている段階である。

【０００３】しかしながら、いずれのベクターも中温性
細菌由来のプラスミドを用いており、プラスミドのサイ
ズが大きく遺伝子操作には適さない。また、低温細菌へ
の導入も接合伝達法を用いているため、より一層煩雑な
操作が必要となる。さらに、異種の細菌由来のプラスミ
ドを用いているため、組換え低温細菌の安全性試験には
多大な労力が必要となることなど、中温性細菌由来のプ
ラスミドを低温細菌のベクターに用いることは、実用面
で多くの障害を有している。そのため、低温細菌が保有
する有用な機能や酵素等有用生産物の付加価値をさらに
向上させ産業利用を図る上では、まだ大きな限界が存在
している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、低温細菌で
利用可能なプラスミドで、低温細菌が元来保持し、プラ
スミドサイズが小型で、低温細菌内への導入が容易なプ
ラスミドを提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、南極海域
や日本海溝等より分離した低温細菌株について、その保
有するプラスミドの探索を行ったところ、日本海溝の海
底堆積物（Stn. PS1、水深 5,974 m：Maruyama et al.,
1997, Marine Biology, 128:705-711）より分離した低
温細菌Pseudoalteromonas sp. PS1M2株（受託番号FERM
P-17703）中に約３．１Ｋｂという比較的小さなサイズ
を持つプラスミドを見いだした。このプラスミドは図１
の制限酵素地図を有し、ＨｉｎｄIII、ＨａｅIII、Ｅｃ
ｏＲＩでそれぞれ１カ所の認識部位を有し、ＳｐｈＩ、
ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩの認識部位
を有しない。このプラスミドをｐＰＳ１Ｍ２と命名し
た。

【０００６】ｐＰＳ１Ｍ２が担う形質は不明であったの
で、選択マーカー遺伝子としてエリスロマイシン（Eryt
hromycin；以下Ｅｍと略称することがある。）耐性遺伝
子あるいはクロラムフェニコール（Chloramphenicol；
以下Ｃｍと略称することがある。）耐性遺伝子を連結
し、形質転換を試みたところ低温細菌Pseudoalteromona
s sp. PS1M2株において前記選択マーカー遺伝子が発現
する形質転換株を得ることに成功した。本発明は、上記
の知見に基づいて完成された。

【０００７】すなわち、本発明は、３１３８ｂｐの長さ
を持ち、下記の制限酵素地図を有することを特徴とする
環状二本鎖ＤＮＡプラスミドｐＰＳ１Ｍ２又はその誘導
体を提供する。

【０００８】

【化２】

【０００９】本明細書にいう「環状二本鎖ＤＮＡプラス
ミドｐＰＳ１Ｍ２の誘導体」とは、ｐＰＳ１Ｍ２に由来
するプラスミドであって、プラスミドベクターとしての
機能を保持する限りにおいて、ｐＰＳ１Ｍ２のＤＮＡの
一部が欠失、置換、挿入又は付加されたものを意味す
る。具体的には、プラスミドｐＰＳ１Ｍ２の複製に関与
しない領域（ＨｉｎｄIIIの認識部位を起点として、１
９５４塩基対から２５３５塩基対の領域と推定され
る。）の一部が欠失、置換、挿入又は付加されたものが
挙げられる。

【００１０】また、本発明は、環状二本鎖ＤＮＡプラス
ミドｐＰＳ１Ｍ２又はその誘導体に異種ＤＮＡを挿入し
たプラスミドを提供する。異種ＤＮＡとしては、選択マ
ーカー遺伝子、導入すべき形質を担う遺伝子、発現調節
に関与するＤＮＡ配列を挙げることができる。選択マー
カー遺伝子としては、クロラムフェニコール耐性遺伝
子、エリスロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺
伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイ
シン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などの薬
剤耐性遺伝子などを挙げることができる。導入すべき形
質を担う遺伝子としては、プロテアーゼ、リパーゼ、Ｄ
ＮＡ合成酵素、ＲＮＡ合成酵素、アミノ酸や有機酸合成
系に関与する酵素代謝合成酵素などの酵素の遺伝子など
を挙げることができる。発現調節に関与するＤＮＡ配列
としては、プロモーター、エンハンサー、各種リプレッ
サー遺伝子およびそれに対応するリプレッサー結合領域
などを挙げることができる。

【００１１】環状二本鎖ＤＮＡプラスミドｐＰＳ１Ｍ２
又はその誘導体に選択マーカー遺伝子を挿入した組換え
プラスミドの例としては、（１）環状二本鎖ＤＮＡプラ
スミドｐＰＳ１Ｍ２又はその誘導体のＨｉｎｄIII認識
部位又はそれ以外の部位に、大腸菌のクロラムフェニコ
ール耐性遺伝子を持つｐＨＳＧプラスミドを挿入した環
状二本鎖ＤＮＡプラスミド、（２）環状二本鎖ＤＮＡプ
ラスミドｐＰＳ１Ｍ２、その誘導体又は（１）の環状二
本鎖ＤＮＡプラスミドのいずれかにｐＤＧ６４７由来の
エリスロマイシン耐性遺伝子を挿入した環状二本鎖ＤＮ
Ａプラスミドを挙げることができる。

【００１２】さらに、本発明は、上記のプラスミドによ
り宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体を提供す
る。宿主細胞としては、種々の原核細胞（細菌など）お
よび真核細胞（動植物細胞など）を挙げることができる
が、Pseudoalteromonas属（具体的には、Pseudoalterom
onas sp. PS1M2株）、Vibrio属、Psychrobacter属など
の低温細菌、Escherichia coli、枯草菌、Pseudomonas
属細菌などの細菌をはじめとする微生物が宿主として好
ましい。

【００１３】本発明は、また、環状二本鎖ＤＮＡプラス
ミドｐＰＳ１Ｍ２を含有し、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
７７０３として工業技術院生命工学工業技術研究所（住
所：茨城県つくば市東１−１）に寄託されている（寄託
日：平成１２年１月２０日）Pseudoalteromonas sp. PS
1M2株を提供する。Pseudoalteromonas sp. PS1M2株は、
摂氏４−３０℃の温度範囲で生育し、特に10℃以下の低
温条件でも良好な増殖を示す有用な低温細菌である。さ
らにまた、本発明は、上記のプラスミドをベクターとし
て用いる遺伝子組換え法を提供する。

【００１４】

【発明の実施の形態】ｐＰＳ１Ｍ２を調製するには、Bi
rnboim,H.C and J.Doly, (1979) Nuc.Acid.Res., 7,15
13-1523に記載の方法にしたがって行えばよい。すなわ
ち、Pseudoalteromonas sp. PS1M2株を培地で培養し、
次いでこれを集菌して、大腸菌等を溶菌させる公知の方
法、例えば水酸化ナトリウムやドデシル硫酸ナトリウム
を用いて溶菌する。得られた溶菌物からは、例えばフェ
ノール抽出およびエチジウムブロミド存在下の塩化セシ
ウム密度勾配遠心法の如き通常用いられる方法によっ
て、プラスミドを分離・精製することができる。

【００１５】ｐＰＳ１Ｍ２をベクターとして用いること
により、宿主を形質転換することができる。宿主に用い
る低温細菌としては、Pseudoalteromonas sp. PS1M2株
が好ましく、特にPseudoalteromonas sp. PS1M2株から
元来保有しているｐＰＳ１Ｍ２を除去したPseudoaltero
monas sp. PS1M2-p株が最も好ましい。プラスミドを除
去した株を作成する方法としては、Ｒプラスミドの分子
遺伝学的実験法 中谷林太郎他、ｐ１７−１８、菜根出
版に記載の大腸菌等からプラスミドを除去する方法、す
なわちエチジウムブロミド存在下で培養することにより
プラスミドを選択的に除去する方法により得ることがで
きる。

【００１６】ｐＰＳ１Ｍ２に選択マーカー遺伝子などの
異種ＤＮＡを挿入した組換えプラスミドを導入する形質
転換の方法としては、当業者に公知の塩化カルシウム
法、プロトプラストーポリエチレングリコール法、エレ
クトロポレーション法などが挙げられ、特に限定はない
が、低温細菌を宿主とする場合はエレクトロポレーショ
ン法が最も好ましい。

【００１７】ｐＰＳ１Ｍ２の自律複製機能に関与する遺
伝子は、他のプラスミドと同様に、本発明プラスミドＤ
ＮＡの一部に担われていると考えられるので、本発明プ
ラスミドの中で複製に関与しない領域が欠失していた
り、あるいは別のＤＮＡが挿入又は付加されたようなプ
ラスミド誘導体も本発明プラスミドと同様な機能を有す
ると考えられる。それ故、本発明はｐＰＳ１Ｍ２そのも
ののみに限定されるのではなく、これを修飾して得られ
るプラスミドや、選択マーカー遺伝子や宿主に導入すべ
き形質を担う遺伝子などのＤＮＡ配列を本発明プラスミ
ドに挿入した組換えプラスミドをも包含するものであ
る。

【００１８】ｐＰＳ１Ｍ２をベクターとして宿主に導入
できる新たな形質としては、従来常温以上で活性を示す
酵素遺伝子、特にプロテアーゼ、リパーゼなどの酵素遺
伝子などが考えられ、必要に応じてプロモーターなどの
発現調節に関与する配列を組み込んでも良い。

【００１９】

【実施例】本発明を以下の実施例により具体的に説明す
る。これらの実施例は説明のためのものであって、本発
明の範囲を限定するものではない。 〔実施例１〕 プラスミドｐＰＳ１Ｍ２の調製Pseudoalteromonas sp. PS1M2株（受託番号ＦＥＲＭ
Ｐ−１７７０３：以下、PS1M2株と略称することがあ
る。）より、Birnboim,H.C and J.Doly, (1979)Nuc.Aci
d.Res., 7,1513-1523.の方法に準じた方法でｐＰＳ１Ｍ
２プラスミドＤＮＡを調製した。すなわち、PS1M2株を1
00ミリリットルの1/2 TZ培地（Maruyama, A. et al., 1
997, 前出）に植菌し、４℃で３日間培養して得られた
菌体について水酸化ナトリウムやドデシル硫酸ナトリウ
ムを用いて溶菌後、フェノール処理し、さらにエタノー
ルによりプラスミドＤＮＡを精製した。

【００２０】得られたプラスミドＤＮＡを各種制限酵素
（宝酒造（株））で切断し、得られたＤＮＡ断片の塩基
対長をアガロースゲル電気泳動により求めた結果、ｐＰ
Ｓ１Ｍ２はＨｉｎｄIII、ＨａｅIII、ＥｃｏＲＩの認識
部位をそれぞれ１カ所づつ持つ環状二本鎖ＤＮＡプラス
ミドであり、ｐＰＳ１Ｍ２全体の長さは約３１００塩基
対（ｂｐ）であった。また、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、Ｂａ
ｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩの認識部位は存在しなかっ
た。図１にｐＰＳ１Ｍ２の制限酵素地図を示す。配列表
の配列番号１に、常法により決定したｐＰＳ１Ｍ２の全
塩基配列を示す。

【００２１】〔実施例２〕 ｐＰＳ１Ｍ２への選択マー
カーＣｍおよびＥｍ耐性遺伝子の付与 Ｃｍ耐性遺伝子を担うｐＨＳＧ３９９（宝酒造（株）：
２２２７ｂｐ）をＨｉｎｄIIIで切断し、ｐＰＳ１Ｍ２
をＨｉｎｄIIIで切断したものを連結反応させた。連結
後の反応液を常法に従い、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造
（株））に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェ
ニコールを含むＬＢ培地（トリプトン １０ｇ、イース
トエキス ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ／１リットル）プレー
ト上で選択してＣｍ耐性の形質転換株を得た。得られた
形質転換株よりプラスミドを調製し、その制限酵素切断
パターンを解析したところ、ｐＨＳＧ３９９およびｐＰ
Ｓ１Ｍ２のいずれも含有しており、このプラスミドをｐ
３９２１Ｈと命名した。

【００２２】次に得られたｐ３９２１ＨをＳｍａＩで切
断し、Anne-Marie Guerout-Fleuryet al, (1995) Gen
e., 167, 335-336.に記載のエリスロマイシン耐性遺伝
子を担うｐＤＧ６４７をＢａｍＨＩで切断し平滑末端化
したものを連結反応させた。連結後の反応液を常法に従
い、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造（株））に形質転換
し、２０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＬＢ培地
プレート上で選択してＥｍ耐性の形質転換株を得た。得
られた形質転換株よりプラスミドを調製し、その制限酵
素切断パターンを解析したところ、ｐＨＳＧ３９９、ｐ
ＰＳ１Ｍ２およびエリスロマイシン耐性遺伝子のいずれ
も含有しており、このプラスミドをｐ３９２１ＨＥｒｍ
（全長約７０００ｂｐ）と命名した。図２に、ｐ３９２
１Ｈ及びｐ３９２１ＨＥｒｍの構築図及び制限酵素地図
を示す。

【００２３】〔実施例３〕 宿主低温細菌となるPseudo
alteromonas sp. PS1M2-p株の作成 宿主に用いる低温細菌として、Pseudoalteromonas sp.
PS1M2株から元来保有しているｐＰＳ１Ｍ２を除去した
株を作成した。プラスミドを除去した株を作成する方法
としては、Ｒプラスミドの分子遺伝学的実験法 中谷林
太郎他、ｐ１７−１８、菜根出版に記載の大腸菌等から
プラスミドを除去する方法に準じた方法を用いた。すな
わち、Pseudoalteromonas sp. PS1M2株を３０μｇ／ｍ
ｌのエチジウムブロミド存在下で培養することによりプ
ラスミドｐＰＳ１Ｍ２を除去した株を選択した。選択は
実施例１に記載の方法でプラスミドを調製しアガロース
ゲル電気泳動によりプラスミドＤＮＡの有無を指標に行
った。その結果、約３０００株のうち一つの株がプラス
ミドｐＰＳ１Ｍ２を保持していないことことから、この
株をPseudoalteromonas sp. PS1M2-p株（以下、PS1M2-p
株と略称することがある。）と命名した。

【００２４】〔実施例４〕 低温細菌Pseudoalteromona
s sp. PS1M2-p株へのプラスミドｐ３９２１ＨＥｒｍの
形質転換 低温細菌Pseudoalteromonas sp. PS1M2-p株へのプラス
ミドｐ３９２１ＨＥｒｍの形質転換は、Kato, J et al,
(1998) Appl.Environ.Microbiol., 64,2061-2064に記
載のエレクトロポレーション法に準じた方法により行っ
た。PS1M2-p株を１０ミリリットルのMaruyama,A et al,
(1997)に記載のマリン培地に植菌し、４℃で２日間培
養後、集菌し菌体を緩衝液（７ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５
２ｍＭ Ｓｕｃｒｏｓｅ、ｐＨ７．５に水酸化ナトリウ
ムで調整）で２回洗浄し、１００μｌの同緩衝液に懸濁
した。実施例２で調製したプラスミドｐ３９２１ＨＥｒ
ｍを１μｇを懸濁液に加え、ジーンパルサー（米国バイ
オラド社）を用いて電気パルス（５０μＦ、２．０Ｋ
Ｖ）を１回印加した。印加後、マリン培地を５ｍｌ加え
４℃で３日間培養後、適当量をエリスロマイシン２０μ
ｇ／ｍｌ含有のマリン培地プレートに塗布し、４℃で３
日間培養した。得られたエリスロマイシン耐性株より実
施例１に記載の方法でプラスミドを調製しアガロースゲ
ル電気泳動を行ったところ、いずれもｐ３９２１ＨＥｒ
ｍを含有していることが判明した。また、上記の実験を
選択にクロラムフェニコール（選択濃度：５０μｇ／ｍ
ｌ）を用いた場合で行ったところ、エリスロマイシンを
選択に用いた場合と同様な結果が得られた。このことか
ら本発明のプラスミドｐＰＳ１Ｍ２は、低温細菌Pseudo
alteromonas sp. PS1M2-p株用のベクターとして有用で
あることは明らかである。

【００２５】

【発明の効果】本発明のプラスミドｐＰＳ１Ｍ２は、摂
氏４−３０℃の温度範囲で生育し、特に10℃以下の低温
条件でも良好な増殖を示す有用な低温細菌Pseudoaltero
monassp. PS1M2株から分離されたものであることから、
低温細菌内で、熱に対して極めて不安定な蛋白質あるい
は低温条件下で活性を示す酵素などの遺伝子組換え技術
による高生産に極めて有用なベクターとして期待され
る。

【００２６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director-General of Agency of Industrial Science and Technology <120> Novel plasmid pPS1M2 from a psychrotrophic bacterium and derivativ es thereof <130> 11900294 <140> <141> <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 3138 <212> DNA <213> Pseudoalteromonas sp. <400> 1 aagcttttca tagtcgtttt gattaatgct tttgactcgt ttttgcttgc gcttaacttg 60 tcgtttaagc atttctggtg catctacagc agttagagga ttttttgtct cgttgattct 120 atcagcagat tttttaaagc ccttggcttg ctgttcgtat gctaaagcat tacgcagctt 180 acgccagtat gcaggtctat agtcaaatgc tgcatctttc aatgcgtctg tgattttctt 240 cggtgtaatg tcatcactag ctaatcgtgt tttgtaaaaa tgctcagcta gtttgatgta 300 atcagattgt gttttttcat tcataacaat ggatctcgtt ttaagtttaa attgtgatcc 360 atcgtcaaag agcctttgtc tgttcggtag tcgcttcact ttaaaaactc gcatgagaat 420 gctcattttc aaagttcgct cgtacactca caaacaaagg ggttctacac ccactccagt 480 cgcaagctcc ttgcggggtt tcgctcgtca tacttcctca acacccccat acttacatat 540 tttatcaata tgtaagtatg gtttcaagtg cgctaaaacc ctaaatacgt aaaacccgta 600 aattttaccg ttttacatat ttaaccagat gtgtaacaat ggtaaaaatt acaagattaa 660 ataaggtgta tcattatggg ttttattaca gatttagagc tgcaaatgga aattgaagca 720 gaggagtttg caaagctacc aaagggaaga acaagagaga ataactaaag aaaaaaaagc 780 ggaatccgaa agaataaaag caaaatttaa agcaaagtat gagtctaaaa aaaatgactg 840 aaattgaaaa attaattgag cttttaggtt ctgaatctgg tgatcgttgg cttgaattca 900 tggattacgt taatcaaaac ctcagtcata ttttgaaacg tggcaagcca aaagctgaag 960 atattgaaaa ctcaatcatt ggcaaagctg gctttaaaac gtggaaagaa tttatagaat 1020 ccccaaccgc acaaggcggt ttggcatgga atctatctac ttttgattcg tggaaacgtg 1080 cttattcaat cgtttgtaat tatccatttt tgagaaactt agagttatca gcgagtttta 1140 ttaatacgat ttaccgtgaa accaagccaa atttccctat ctctgaaagt gatttaacac 1200 gaatttctag tcgttagaga agaaaaagcc atagcaaacc aacaaaacaa gctaaaaatg 1260 gctgagaatc gctctcagga gcttttagag caacttaaag cgcatgaaca caccatagca 1320 ctacaacaac aagagataga cacattaaaa agccagttag cgcagggcgc agcccaagca 1380 gaacggcttt tgggaagtga aaaacgtgtt ggtgaactcg aaacactgtt aaaacttcaa 1440 tgaaaccgag ttaaacaaga ctaaaaattc gttaaaaaaa caagtcaaac aggcttgata 1500 gctatgaaaa catgggtttt ttagacaagc tgaaagcctt atttaactaa aggtcgctca 1560 attactggga ttttttgcta cgcaaaaccg cattgattta ctgtggaaaa atcagagatt 1620 ttacacacag caactcaaca ctactcccgg taatcactcc ccaatgcaca attatttttt 1680 gttttttatt agaactcgat tttttcaggg tgattgagga acgaaatcgc acttaaaaaa 1740 tgagtaagca agcgaagcgc ggtagtcggt tttcgtacct caaacctcac ttaataagat 1800 aataagaagg gaaattgctc cagcccttta aaataagggg ggtatttttc aaaacacaga 1860 cttgtaagct caacttcaag accaagcagg ctcaaaaata tagctttaca agctcaaaat 1920 taaactatat attgagcttt gcattccatt gttatgagat tcacaatctc aaaaaagagg 1980 tcgattttga gcttacaaag atataaagaa aatccatttc tcaaagatat ggagattaat 2040 acaagcaata aacaagttac tgttagcgca cttggaaaag ataacaatgt acttgttaac 2100 caaagcacag gtgagataag tggaacgtca gtagtgacgt acaaaaaggt tgatgatgct 2160 gaatttgtta agttatttag tgcaaacata gcactgactt ttgatttaaa atcagcaggg 2220 attaaaacat tttccgtttt aatttggatg gttcagcaca gggccattgg taaagaccaa 2280 gtaatccttg atcacatggc gcttgaagaa tggtgcgaag tacacgaacc aaaaagcata 2340 agccatgcaa catttaaacg tggcttaaac gagcttgaaa aagctaaaat catagcaaaa 2400 acaatgcgta aaggtactta tttcataaac cctaactttg tttttaatgg caatcgaatt 2460 gcattcacaa cagttataga gcgaggcaac aaagctaaaa atgaaaatca gcaagagttg 2520 cctttgggtg attaattaca tagaaaaatc actgtcatga tcattgtttt tatgatgttc 2580 gggcgcatta attttagtcg atttttcgtg attaactcta actagctttt gctgttcagc 2640 cagcgttatt gctggcttta cggctatttt tccgcttgct gttcgcttat caccgtacac 2700 gctgactgat ttagttgatt gatgacccat aatgtaagcc acttcaacac gacttaaacc 2760 actcgctttt aaatcagagc ctaattgatg cctaaagcta tatagcgtca tctgggcttt 2820 tctacgtggg aatgttgact tggttagtgt tgctaatcgc tcttgtattc tgtgcattat 2880 cccagtctta aaatcgcctg tatcgcctga tttcagtacg tctacagcct gactgatagc 2940 aaaacaatca ttgtaatcta acgtcaactt tctatctaaa cctctatcac ctttttcatt 3000 gatttttgcg cccttgatag tgatttcata gggcaaatca atctcaatat taagcatttc 3060 agcaggtcta cagcctgtta attctgcaat ggttaacgct gccctaagct caatatcatt 3120 agggtttagc ttgcttaa 3138

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＰＳ１Ｍ２の制限酵素地図である。各制限酵
素の認識部位をＨｉｎｄIIIを起点として、（ ）内は
ｂｐ単位で示した。また、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、Ｂａｍ
ＨＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩの認識部位は存在しなかっ
た。図中の太線矢印は、１９５４塩基対から２５３５塩
基対の領域で複製必須領域と推定される範囲を示す。

【図２】ｐ３９２１Ｈ及びｐ３９２１ＨＥｒｍの構築図
及び制限酵素地図である。

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１に記載された塩基配列からなる
   環状２本鎖ＤＮＡプラスミドｐＰＳ１Ｍ２、又はプラス
   ミドｐＰＳ１Ｍ２の自律複製機能を保持する限りにおい
   て、配列番号１に記載された塩基配列に一又は数個の欠
   失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなる環
   状二本鎖ＤＮＡプラスミド。」
2. 【請求項２】 請求項１記載の環状二本鎖ＤＮＡプラス
   ミドに異種ＤＮＡを挿入した組換えプラスミド。
3. 【請求項３】 異種ＤＮＡが選択マーカー遺伝子である
   請求項２記載の組換えプラスミド。
4. 【請求項４】 選択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子で
   ある請求項３記載の組換えプラスミド。
5. 【請求項５】 請求項１記載の環状二本鎖ＤＮＡプラス
   ミドのＨｉｎｄIII認識部位又はそれ以外の部位に、大
   腸菌のクロラムフェニコール耐性遺伝子を持つｐＨＳＧ
   プラスミドを挿入した環状二本鎖ＤＮＡプラスミド。
6. 【請求項６】 請求項１記載の環状二本鎖ＤＮＡプラス
   ミド又は請求項５記載の環状二本鎖ＤＮＡプラスミドの
   いずれかにｐＤＧ６４７由来のエリスロマイシン耐性遺
   伝子を挿入した環状二本鎖ＤＮＡプラスミド。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれかに記載のプラス
   ミドにより宿主細胞を形質転換して得られた形質転換
   体。
8. 【請求項８】 宿主細菌が低温細菌Pseudoalteromonas
   属に属する細菌である請求項７に記載の形質転換体。
9. 【請求項９】 宿主細菌がEscherichia coliに属する細
   菌である請求項７に記載の形質転換体。
10. 【請求項１０】 請求項１記載の環状二本鎖ＤＮＡプラ
    スミドｐＰＳ１Ｍ２を含有し、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
    １７７０３として工業技術院生命工学工業技術研究所に
    寄託されているPseudoalteromonas sp. PS1M2株。
11. 【請求項１１】 請求項１〜６のいずれかに記載のプラ
    スミドに、異種ＤＮＡを挿入して組換えベクターを調製
    し、該組換えベクターを用いて、宿主微生物を形質転換
    することを特徴とする、遺伝子組換え方法。