JPH07107976A - 挿入配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 配列番号１に示される配列を有することを特
徴とする挿入配列遺伝子。 【効果】 本発明によれば、挿入変異株の作成・遺伝子
マッピング・プロモーター検索・遺伝情報の挿入・特定
遺伝子の破壊等に利用可能な、コリネ型細菌由来の新規
な挿入配列が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コリネ型細菌由来の新
規なＤＮＡ塩基配列を有する挿入配列に関する。トラン
スポゾン、挿入配列のような転位因子は、原核細胞・真
核細胞において見いだされる。転位因子は、染色体上の
いろいろの部位に転位・挿入することが可能であり、こ
の能力によって、これら転位因子を遺伝子解析の有効な
手段として用いることができる。利用の例としては、挿
入変異株の作製・遺伝子マッピング・プロモーター検索
・遺伝情報の挿入・特定遺伝子の破壊等が挙げられ、産
業上有用な因子として利用可能である。

【０００２】

【従来の技術】微生物における転位配列の１つである挿
入配列には、いくつかの特徴がある。それらは、およそ
１〜２kbの大きさを有しており、その両端にはインヴァ
ーテッドリピート（逆方向反復配列）が存在している。
また、微生物染色体に挿入されるときには、ターゲット
となる配列の重複が生じる。微生物の挿入配列は、大腸
菌由来のもの〔Mol. Gen. Genet. Vol.122, 267-277(19
73) 〕、赤痢菌由来のもの〔J. Bacteriol. Vol.172, 4
090-4099(1990)〕、酢酸菌由来のもの〔Mol. Microbio
l. Vol.9, 211-218(1993)〕、マイコプラズマ由来のも
の〔同誌 Vol.7, 577-584(1993) 〕等において良く研究
されているが、コリネ型細菌由来の挿入配列に関する従
来の知見は無い。

【０００３】微生物由来の転位因子を単離する手法とし
ては、枯草菌由来のｓａｃＢ遺伝子産物を利用する方法
が知られている〔J. Bacteriol. Vol.164, 918-921(198
5);J. Bacteriol. Vol.174, 5462-5465(1992)〕。すな
わち、ｓａｃＢ遺伝子産物は培地中のシュークロースに
よって誘導生産され、本遺伝子を有する大腸菌をシュー
クロースを含有する培地で培養すると、本遺伝子の発現
により、大腸菌は溶菌し、生育阻害をおこすことが知ら
れている〔Mol. Gen. Genet. Vol.191, 138-144(1983)
〕。そこで、ｓａｃＢ遺伝子を有するプラスミドで大
腸菌を形質転換し、シュークロースを含有するプレート
上に生育可能になった大腸菌からプラスミドを抽出する
と、このプラスミド上のｓａｃＢ遺伝子が欠失もしくは
挿入変異を起こしているものが得られる。この挿入変異
をおこしたものより転位因子を単離することができる。
同様に、コリネ型細菌においても、ｓａｃＢ遺伝子は生
育阻害を引き起こすことが知られており〔J. Bacterio
l. Vol.174, 5462-5465(1992)〕、この性質によりコリ
ネ型細菌由来の転位因子を単離することが可能である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】コリネ型細菌由来の転
位因子に関する従来の報告はなく、コリネ型細菌染色体
上の遺伝情報を簡便な手法を用いて解析することは困難
であった。特にコリネ型細菌のように産業上重要な微生
物において、転位因子を単離することは、遺伝子解析研
究を加速させることができ、有用性が高い。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、ｓａｃＢ遺伝
子を利用する方法により、転位因子の１つである新規な
配列番号１に示される配列を有する挿入配列を単離する
ことに成功し、本発明を完成するに至った。かくして本
発明によれば、コリネバクテリウム・グルタミカム(Cor
ynebacterium glutamicum)由来の後記配列表の配列番号
１に示されるＤＮＡ塩基配列を有することを特徴とする
挿入配列が提供される。以下、本発明についてさらに詳
細に説明する。

【０００６】本発明の「挿入配列」とは、コリネ型細菌
染色体上に存在しており、染色体上もしくはプラスミド
上に転位することが可能なＤＮＡ塩基配列を意味するも
のである。本発明の挿入配列（以下、これを「Ａ断片」
と略称することがある）を、供給源微生物であるコリネ
型細菌から調製するための基本操作の一例を述べれば次
のとおりである：Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えば
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１
株の染色体上に存在し、本菌株を、枯草菌由来のｓａｃ
Ｂ遺伝子を有し、コリネ型細菌内で複製可能なプラスミ
ド、例えばプラスミドｐＣＲＹ３０−ｓａｃＢを用いて
形質転換し、シュークロースを含有するプレート上に塗
抹し、生育してくるシュークロース耐性株よりプラスミ
ドを抽出することにより、分離取得することができる。

【０００７】先ず、枯草菌、例えばマールバーグ(Marbu
rg) 株〔Biochem. Biophys. Res. Commun., 119, 795-8
00(1984)〕の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを鋳型として、既知のｓａｃＢおよびｓａ
ｃＲ（ｓａｃＢ遺伝子の発現制御遺伝子）遺伝子を含む
領域をＰＣＲ法により増幅単離する。該増幅ＤＮＡ断片
を大腸菌・コリネ型細菌のシャトルベクターに導入し、
このベクターを用いて大腸菌（エシェリヒア・コリ）Ｊ
Ｍ１０９（宝酒造より市販）を形質転換し、形質転換体
を取得する。得られる形質転換体よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、本プラスミドを用いてコリネ型細菌、例えば
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１
を形質転換し、シュークロースを含有するプレート上に
生育してくるシュークロース耐性株よりプラスミドを抽
出する。これらのプラスミドのうち、もとのプラスミド
よりサイズが大きくなっているものを選択し、本プラス
ミドのｓａｃＢおよびｓａｃＲ遺伝子領域に挿入されて
いるＤＮＡ断片を単離することにより、Ａ断片を分離取
得することができる。

【０００８】このようにして得られるＡ断片の一つとし
ては、上記コリネ型細菌、例えばコリネバクテリウム・
グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１株の染色体ＤＮＡ上に
存在し、大きさが約１．５kbの断片を挙げることができ
る。この約１．５kbの挿入配列を、各種の制限酵素で切
断したときの認識部位数および切断断片の大きさを下記
第１表に示す。

【０００９】

【表１】

【００１０】また、本発明のＡ断片の機能については、
例えば、もともとコリネ型細菌染色体上に存在し、形質
転換に用いたプラスミド上には存在しなかったＤＮＡ断
片が、ある条件下において、染色体上からプラスミド上
に転位してくる現象を観察することによって証明でき
る。また逆に、プラスミド上に転位した挿入配列を染色
体上に転位させることによってＡ断片の機能をさらに確
認することができる。なお、本明細書において、制限酵
素による「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミド
を制限酵素で完全消化し、それらの消化物をそれ自体既
知の方法に従って１％アガロースゲル電気泳動および５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な
断片の数から決定した値を採用した。

【００１１】また、「切断断片の大きさ」およびプラス
ミドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合
には、大腸菌のラムダファージ（λphage ）のＤＮＡを
制限酵素ＨｉｎｄIII で切断して得られる分子量既知の
ＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での泳動距離で描か
れる標準線に基づき、また、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を用いる場合には、大腸菌のファイ・エックス１
７４ファージ（φｘ１７４phage ）のＤＮＡを制限酵素
ＨａｅIII で切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片
の同一ポリアクリルアミドゲル上での泳動距離で描かれ
る標準線に基づき、切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各
ＤＮＡ断片の大きさを算出する。プラスミドの大きさ
は、切断断片のそれぞれの大きさを加算して求める。な
お、各ＤＮＡ断片の大きさの決定において、１kb以上の
断片の大きさについては、１％アガロースゲル電気泳動
によって得られる結果を採用し、約０．１kbから１kb未
満の断片の大きさについては４％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動によって得られる結果を採用した。

【００１２】一方、上記のコリネバクテリウム・グルタ
ミカムＡＴＣＣ３１８３１の染色体ＤＮＡ由来の挿入配
列の塩基配列は、プラスミドｐＵＣ１１８またはｐＵＣ
１１９（宝酒造製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵
素法〔dideoxy chain termination 法、Sanger, F. et.
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.74, 5463(197
7)〕により決定することができる。このようにして決定
した上記約１．５kbのＤＮＡ断片の塩基配列を有する挿
入配列は、後記配列表の配列番号１に示す配列を有する
ものである。

【００１３】上記の塩基配列を包含する本発明のＡ断片
は、天然のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離されたも
ののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えば
アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)社
製３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成
されたものであってもよい。

【００１４】また、前記の如くコリネバクテリウム・グ
ルタミカムＡＴＣＣ３１８３２の染色体ＤＮＡから取得
される本発明の挿入配列は、前記挿入配列の機能を実質
的に損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他
の塩基と置換されていてもよく又は削除されていてもよ
く、或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに
塩基配列の一部が転位されているものであってもよく、
これらの誘導体のいずれもが、本発明の挿入配列に包含
されるものである。

【００１５】ここで、本発明のＡ断片の単離に用いる枯
草菌由来のｓａｃＢ遺伝子を有しコリネ型細菌内で複製
可能なプラスミド、例えばプラスミドｐＣＲＹ３０−ｓ
ａｃＢの構築方法、該プラスミドで形質転換しうるコリ
ネ型細菌、該形質転換体の培養法等について述べる。先
ず、ｓａｃＢおよびｓａｃＲ遺伝子領域が導入可能な大
腸菌・コリネ型細菌のシャトルベクターとしては、例え
ば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミド
ｐＣＲＹ３０；特開平２−２７６５７５号公報に記載の
プラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２
ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３
ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミ
ドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７
９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９
５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２
９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１およ
びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に
記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載
のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載の
ｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を用いることができる。

【００１６】上記プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス (Brevibacterium stationis) ＩＦＯ１２１４４（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２５１５）からプラスミドｐＢＹ５０３
（このプラスミドの詳細については特開平１−９５７８
５号公報参照）ＤＮＡを抽出し、制限酵素ＸｈｏＩでプ
ラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を含む大きさが約
４．０kbのＤＮＡ断片（複製機能領域）を切り出し、制
限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで大きさが約２．１kb
のプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断
片（安定化機能領域）を切り出す。これらの両断面をプ
ラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ−Ｋ
ｐｎＩ部位およびＳａｌＩ部位に組み込むことにより、
プラスミドベクターｐＣＲＹ３０を調製することができ
る。

【００１７】次に、上記大腸菌・コリネ型細菌のシャト
ルベクターへのｓａｃＢおよびｓａｃＲ遺伝子領域の導
入は、例えば、プラスミドベクター中に１個所だけ存在
する制限酵素部位を該制限酵素で開裂し、該断片および
開裂したシャトルベクターを必要に応じてＳ１ヌクレア
ーゼで処理して平滑末端とするか、または適当なアダプ
ターＤＮＡの存在下で、ＤＮＡリガーゼ処理でそれらを
連結させることにより行うことができる。

【００１８】上記プラスミドｐＣＲＹ３０へのｓａｃＢ
およびｓａｃＲ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片の導入は、
該遺伝子領域を切断しない制限酵素、例えばＢａｍＨＩ
サイトを、ＰＣＲ法により該遺伝子領域を増幅させると
きに使用するプライマーの末端にこの制限酵素部位を付
加しておき、該遺伝子領域の増幅ＤＮＡ断片を制限酵素
ＢａｍＨＩで処理したものと、プラスミドｐＣＲＹ３０
を制限酵素ＢａｍＨＩで開裂させたものをＤＮＡリガー
ゼで連結させることにより行うことができる。このプラ
スミドを用いて、前記のとおり大腸菌（エシェリヒア・
コリ）ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換し、形質転
換体を取得し、該形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽
出することにより、本発明のＡ断片の単離に用いる枯草
菌由来のｓａｃＢ遺伝子を有しコリネ型細菌内で複製増
殖可能なプラスミドを構築することができる。

【００１９】このようにして構築される、プラスミドｐ
ＣＲＹ３０に大きさが約２．０kbのｓａｃＢおよびｓａ
ｃＲ遺伝子領域が導入された組換えプラスミドを、ｐＣ
ＲＹ３０−ｓａｃＢと命名した。プラスミドｐＣＲＹ３
０−ｓａｃＢの作製方法の詳細については、後記実施例
１で説明する。

【００２０】上記枯草菌由来のｓａｃＢ遺伝子を有しコ
リネ型細菌内で複製増殖可能なプラスミドで形質転換し
うる宿主コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム・
グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１、ブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）
およびその由来株、ブレビバクテリウム・アンモニアゲ
ネス (Brevibacterium ammoniagenes)ＡＴＣＣ６８７
１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６；ブ
レビバクテリウム・デバリカタム (Brevibacterium div
aricatum) ＡＴＣＣ１４０２０；ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム (Brevibacterium lactofermentu
m)ＡＴＣＣ１３８６９等を宿主コリネ型細菌として用い
ることができる。これらコリネ型細菌の中で、本発明の
Ａ断片の単離には、コリネバクテリウム・グルタミカム
ＡＴＣＣ３１８３１を宿主として用いるのが最も好まし
い。

【００２１】上記宿主コリネ型細菌の前記組換えプラス
ミドによる形質転換は、それ自体既知の方法、例えばCa
lvin, N. M. and Hanawalt, P. C., Journal of Bacter
iology, 170, 2796(1988); Ito, K., Nishida, T. and
Izaki. K., Agricultural and Biological Chemistry,
52, 293(1988) 等の文献に記載の方法により、例えば宿
主微生物にパルス波を通電〔Satoh, Y. et al., Journa
l of Industrial Microbiology, 5 , 159(1990)参照〕す
ることにより行うことができる。

【００２２】かくして得られる形質転換体を、前記のと
おり、シュークロースを２〜１５％含有するプレート上
に塗抹して培養し、生育してくる各シュークロース耐性
株を液体培養し、培養物よりそれ自体既知の通常用いら
れる方法、例えばアルカリ−ＳＤＳ法等によりプラスミ
ドを抽出し、該プラスミドを適当な制限酵素により解析
し、もとのプラスミドよりサイズが大きいプラスミドを
選択し、該プラスミドのｓａｃＢおよびｓａｃＲ遺伝子
領域に挿入されているＤＮＡ断片を単離することにより
本発明のＡ断片を分離取得することができる。

【００２３】ここで上記形質転換体の培養は炭素源、窒
素源、無機塩等を含む通常の栄養培地で行うことがで
き、炭素源としては、シュークロースを用いる。窒素源
としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等をそれぞれ単
独もしくは混合して用いる。また、無機塩としては、例
えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫
酸マグネシウム等を用いる。この他にペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ
酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加
することができる。

【００２４】培養は、通常、通気攪拌や振盪等（液体培
養の場合）の好気条件下に、約２５℃〜約３５℃の温度
で行うことができる。培養途中のpHは７〜８付近とする
ことができ、培養中のpH調整は酸又はアルカリを添加し
て行うことができる。培養開始時の炭素源濃度は、５〜
１２容量％である。

【００２５】かくして得られる培養物を、前記のとおり
シュークロースを２〜１５％含有するプレート上に塗抹
して３３℃で１〜３日間培養することにより、Ａ断片が
導入されたシュークロース耐性株を取得することができ
る。

【００２６】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。

【００２７】実施例１ ｓａｃＢおよびｓａｃＲ遺伝子領域を有するコリネ型細
菌内で複製可能なプラスミドの構築 （Ａ）枯草菌の全ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ
₄ ７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄０．５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５
ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ６mg、
ＭｎＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂ Ｏ ６mg、酵母エキス２．５
ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μg 、塩酸チアミ
ン２００μg 、グルコース２０ｇ、蒸留水１リットル〕
１リットルに、前記枯草菌マールバーグ(Marburg) 株を
対数増殖期前期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌
体を、１０mg／mlのリゾチームを含む１０mMＮａＣｌ−
２０mMトリス緩衝液（pH８．０）−１mMＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ溶液１５mlに懸濁した。次にプロテナーゼＫを、最終
濃度が１００μg ／mlになるように添加し、３７℃で１
時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃
度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温
して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロ
ロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪
した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、
１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウム
を０．３M となるように添加した後、２倍量のエタノー
ルをゆっくりと加えた。水層とエタノール層との間に存
在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノール
で洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０mMトリ
ス緩衝液（pH７．５）−１mMＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ml
を加え、４℃で一晩静置し、鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ
に使用した。

【００２８】（Ｂ）プライマーの選択 枯草菌のｓａｃＢおよびｓａｃＲ遺伝子領域の塩基配列
は既に決定されている〔Mol. Gen. Genet. Vol.200, 22
0-228(1985) 〕。この配列をもとに、ｓａｃＢおよびｓ
ａｃＲ全遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を増幅可能な下記
の１対のプライマーを選択し、アプライド・バイオシス
テムズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ
シンセサイザーを用いて合成した。なお、これらのプラ
イマーの末端には、制限酵素ＢａｍＨＩの認識部位を付
加してある。 （ａ−１）5'- CCAGGATCCG ATCCTTTTTA ACCCATCAC-3' （配列番号２） （ｂ−１）5'- CCCGGATCCA AAAGGTTAGG AATACGGTT-3' （配列番号３） （配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシ
ン、Ｔはチミンを示す。）このプライマーを用いて上記
（Ａ）で調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行
うと、ｓａｃＢおよびｓａｃＲ遺伝子領域が存在する限
り、約２．０kbの反応産物が得られると期待される。

【００２９】（Ｃ）ＰＣＲ反応（ｓａｃＢおよびｓａｃ
Ｒ遺伝子領域の増幅） 実際のＰＣＲ反応は、パーキンエルマーシータス社製の
ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて下記の条件で行っ
た。 反応液： ５０mMＫＣｌ １０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．４） １．５mMＭｇＣｌ₂ 鋳型ＤＮＡ ５μｌ 上記（Ｂ）で作製したプライマー 各々０．２５μＭ ｄＮＴＰｓ 各々２００μM ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製） ２．５units 以上を混合し、１００μl とした。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程：３７℃ １２０秒 エクステンション過程：７２℃ １８０秒 以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。

【００３０】（Ｄ）反応物の検出 上記（Ｃ）で生成した反応液１０μl を２％アガロース
ゲルにより電気泳動を行って大きさが約２．０kbの増幅
ＤＮＡ断片の検出を行った。

【００３１】（Ｅ）ｐＣＲＹ３０の構築 プラスミドベクターｐＣＲＹ３０は、特開平３−２１０
１８４号公報に記載の方法により調製した。

【００３２】（Ｆ）ｐＣＲＹ３０−ｓａｃＢの構築 上記（Ｃ）で得た大きさが約２．０kbの増幅ＤＮＡ断片
を含む反応液１０μlと上記（Ｅ）で得たｐＣＲＹ３０
０．５μg を混合し、制限酵素ＢａｍＨＩ５units を
混合し、３７℃で１時間反応させて完全に消化した。６
５℃で１５分間処理し、酵素を失活させた後、５０mMト
リス緩衝液（pH７．６）、１０mMジチオスレイトール、
１mMＡＴＰ、１０mMＭｇＣｌ₂ およびＴ４ＤＮＡリガー
ゼ１unitの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度で
ある）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。得られ
たプラスミド混液を用い、塩化カルシウム法〔J. Mol.
Biol., Vol.53,159(1970)〕によりエシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５
０mgを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキスト
ラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水
１リットルに溶解〕に塗抹した。この培地上の生育株を
常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを
抽出し、該プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩにより切断
し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＣＲ
Ｙ３０の長さ８．６kbのＤＮＡ断片に加え、大きさが約
２．０kbの挿入断片が認められた。この組換えプラスミ
ドをｐＣＲＹ３０−ｓａｃＢと命名した。プラスミドｐ
ＣＲＹ３０−ｓａｃＢの制限酵素切断点地図を図１に示
す。

【００３３】実施例２ コリネバクテリウム・グルタミカム由来の挿入配列の単
離 （Ａ）ｓａｃＢ耐性株の単離 上記実施例１で調製したプラスミドＤＮＡをコリネ型細
菌に導入し、該細胞を形質転換した。用いた宿主コリネ
型細菌は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ
３１８３１、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）のプラスミドｐＢＹ５０
２除去株である。形質転換には電気パルス法を用いた。
前記コリネ型細菌を１００mlのＡ培地〔組成：尿素２
ｇ、硫酸アンモニウム７ｇ、リン酸一カリウム０．５
ｇ、リン酸二カリウム０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ
０．５ｇ、ＭｎＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂Ｏ ６mg、ＦｅＳ
Ｏ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ６mg、酵母エキス１ｇ、カザミノ酸１
ｇ、ビオチン２００μg 、塩酸チアミン１００μg を脱
イオン水に溶解して１リットルとする（pH７．４）〕で
対数増殖初期まで培養した後、ペニシリンＧを１unit/m
l となるように添加してさらに２時間振盪培養した。培
養菌体を遠心分離にて集め、２０mlのパルス用溶液〔組
成：２７２mMシュークロース、７mMＫＨ₂ ＰＯ₄、１mM
ＭｇＣｌ₂ ；pH７．４〕にて洗浄した。再度、遠心分離
にて菌体を集め、５mlのパルス用溶液に懸濁し、０．７
５mlの細胞と上記（Ａ）で得られたプラスミド溶液５０
μl とを混合し、氷中にて２０分間静置した。ジーンパ
ルサー（バイオラド社製）を用いて、２５００ボルト２
５μF に設定し、パルスを印加後氷中に２０分間静置し
た。全量を３０℃にて１時間培養した後、１０％シュー
クロース、カナマイシン５０μg ／mlを含むＡ寒天培地
に塗抹した。３０℃で２日間培養した。

【００３４】（Ｂ）挿入配列の単離 出現したシュークロース耐性およびカナマイシン耐性株
より、プラスミドを特開平１−９５７８５号公報記載の
方法にて調製した。このプラスミドを各種制限酵素で切
断し、その大きさを確認したところ、２株において、形
質転換に用いたプラスミドより約１．５kb大きくなった
プラスミドが存在した。また、制限酵素による解析によ
り、該大きさが約１．５kbの挿入配列は、ｓａｃＢ遺伝
子の中に存在しており、ｓａｃＢ遺伝子産物を不活性化
していることが判明した。

【００３５】実施例３ コリネバクテリウム・グルタミカム由来の挿入配列の塩
基配列決定 実施例２で得られた大きさが約１．５kbの挿入配列を特
定するために、その塩基配列を、ｐＵＣ１１８またはｐ
ＵＣ１１９（宝酒造製）を用いるジデオキシヌクレオチ
ド法により図２に示した戦略図に従って決定した。この
結果、配列番号１に記載の配列が明らかとなった。本配
列上には、４３６アミノ酸からなるオープンリーディン
グフレーム（ＯＲＦ）が存在した。この挿入配列の両端
には２４bpからなるインヴァーテッドリピート、および
ターゲット配列である８bpのダイレクトリピートが存在
した。この大きさが約１．５kbの挿入配列を、各種の制
限酵素で切断したときの認識部位数および切断断片の大
きさは、前記第１表のとおりであった。その制限酵素切
断点地図を図２に示す。

【００３６】実施例４ （ａ）挿入配列の存在の確認 単離した挿入配列をプローブとして、コリネバクテリウ
ム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１、ブレビバクテリ
ウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９
７）の染色体ＤＮＡに対して、サザンハイブリダイゼー
ションを行った。プローブは、ランダムラベリングキッ
ト（宝酒造より市販）を用いて作製した。サザンハイブ
リダイゼーションは、常法〔“Molecular Cloning ”,
Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) 〕の通り
行った。この結果、該挿入配列は、コリネバクテリウム
・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１由来の染色体とハイ
ブリダイズすることがわかった。すなわち、本発明の挿
入配列は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ
３１８３１染色体中に存在し、染色体上からプラスミド
上に転位することが可能であることを示している。ま
た、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１４９７）由来の染色体とはハイブリダイ
ズせず、今回ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）からの形質転換体から
は挿入配列を単離できなかった結果と一致する。

【００３７】（ｂ）転位機能検出プラスミドの作製 上記で得られた大きさが約１．５kbの挿入配列を、決定
した配列をもとに、両末端と相補的で、かつＢａｍＨＩ
サイトを有するオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲ法
により増幅した。得られたＤＮＡ断片とプラスミドｐＨ
ＳＧ３９８（宝酒造製）を混合し、制限酵素ＢａｍＨＩ
５units を混合し、３７℃で１時間反応させ、完全に
消化した。６５℃で１５分間処理し、酵素を失活させた
後、５０mMトリス緩衝液（pH７．６）、１０mMジチオス
レイトール、１mMＡＴＰ、１０mMＭｇＣｌ₂ およびＴ４
ＤＮＡリガーゼ１unitの各成分を添加し（各成分の濃度
は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合さ
せた。得られたプラスミド混液を用い、塩化カルシウム
法〔J. Mol. Biol., Vol.53,159(1970)〕によりエシェ
リヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造より市販）を形質転換
し、クロラムフェニコール５０mgを含む培地〔トリプト
ン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５
ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１リットルに溶解〕に塗抹
した。この培地上の生育株を常法により液体培養し、培
養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制
限酵素ＢａｍＨＩにより切断し、挿入断片を確認した。
この結果、プラスミドｐＨＳＧ３９８の大きさが２．７
kbのＤＮＡ断片に加え、大きさが約１．５kbの挿入断片
が認められた。次に、同様にして、構築したプラスミド
を、本プラスミドを１ケ所で切断する制限酵素ＮｈｅＩ
で切断し、カナマイシン耐性遺伝子カセット（ファルマ
シア製）を挿入し、クロラムフェニコールとカナマイシ
ンの両薬剤に耐性で、かつ挿入配列を有するプラスミド
ｐＨＳＧ−Ｔｎ−Ｋｍを作製した。

【００３８】尚、ＮｈｅＩサイトは、約１．５kbの挿入
配列の末端付近に存在し、約１．５kbのＤＮＡ断片にコ
ードされるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を
破壊しない。従って、コリネ型細菌内で増殖可能な複製
領域を有しない本プラスミドを用いて、コリネ型細菌を
形質転換し、カナマイシン耐性を指標に形質転換体を取
得すると、本プラスミドがコリネ型細菌染色体に挿入さ
れた株が得られる。このうち、クロラムフェニコール感
受性の株は、挿入配列部分のみが染色体上に転位し、ｐ
ＨＳＧ−Ｔｎ−Ｋｍ全体がはいったものではないと判断
でき、本発明で得られたＡ断片が、染色体上へ転位可能
であることを示す。

【００３９】（ｃ）転位の確認 プラスミドｐＨＳＧ−Ｔｎ−Ｋｍをコリネ型細菌に導入
し、該細胞を形質転換した。用いた宿主コリネ型細菌
は、本挿入配列をもたないブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）のプラス
ミドｐＢＹ５０２除去株である。形質転換には上記記載
の電気パルス法を用いた。カナマイシン耐性株１５０株
が得られた。このうち、８株のみがクロラムフェニコー
ル耐性を示したが、残りは、クロラムフェニコール感受
性であった。このことは、プラスミドｐＨＳＧ−Ｔｎ−
Ｋｍ上に存在する挿入配列がカナマイシン耐性遺伝子と
共に、染色体上に転位したことを示している。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：1469 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： Genomic DNA 起源 生物名：コリネバクテリウム グルタミカム (Coryneb
acterium glutamicum) 株名： ATCC 31831 配列の特徴 特徴を表す記号： insertion seq 存在位置：1-1469 特徴を決定した方法： E 配列 CCTTTTGCGG CCCTTCCGGT TTTGGGGTAC ATCACAGAAC CTGGGCTAGC GGTGTAGACC 60 CGAAAATAAA CGAGCCTTTT GTCAGGGTTA AGGTTTAGGT ATCTAAGCTA ACCAAACACC 120 AACAAAAGGC TCTACCC ATG AAG TCT ACC GGC AAC ATC ATC GCT GAC ACC 170 Met Lys Ser Thr Gly Asn Ile Ile Ala Asp Thr 1 5 10 ATC TGC CGC ACT GCG GAA CTA GGA CTC ACC ATC ACC GGC GCT TCC GAT 218 Ile Cys Arg Thr Ala Glu Leu Gly Leu Thr Ile Thr Gly Ala Ser Asp 15 20 25 GCA GGT GAT TAC ACC CTG ATC GAA GCA GAC GCA CTC GAC TAC ACC TCC 266 Ala Gly Asp Tyr Thr Leu Ile Glu Ala Asp Ala Leu Asp Tyr Thr Ser 30 35 40 ACC TGC CCA GAA TGC TCC CAA CCT GGG GTG TTT CGT AAT CAC ACC CAC 314 Thr Cys Pro Glu Cys Ser Gln Pro Gly Val Phe Arg Asn His Thr His 45 50 55 CGG ATG CTC ATT GAT TTA CCC ATC GTC GGG TTT CCC ACC AAA CTG TTT 362 Arg Met Leu Ile Asp Leu Pro Ile Val Gly Phe Pro Thr Lys Leu Phe 60 65 70 75 ATC CGT CTA CCT CGC TAC CGC TGC ACC AAC CCC ACA TGT AAG CAA AAG 410 Ile Arg Leu Pro Arg Tyr Arg Cys Thr Asn Pro Thr Cys Lys Gln Lys 80 85 90 TAT TTC CAA GCA GAA CTA AGC TGC GCT GAC CAC GGT AAA AAG GTC ACC 458 Tyr Phe Gln Ala Glu Leu Ser Cys Ala Asp His Gly Lys Lys Val Thr 95 100 105 CAC CGG GTC ACC CGC TGG ATT TTA CAA CGC CTT GCT ATT GAC CGG ATG 506 His Arg Val Thr Arg Trp Ile Leu Gln Arg Leu Ala Ile Asp Arg Met 110 115 120 AGT GTT CAC GCA ACC GCG AAA GCA CTT GGG CTA GGG TGG GAT TTA ACC 554 Ser Val His Ala Thr Ala Lys Ala Leu Gly Leu Gly Trp Asp Leu Thr 125 130 135 TGC CAA CTA GCC CTC GAT ATG TGC CGT GAG CTG GTC TAT AAC GAT CCT 602 Cys Gln Leu Ala Leu Asp Met Cys Arg Glu Leu Val Tyr Asn Asp Pro 140 145 150 155 CAC CAT CTT GAT GGA GTG TAT GTC ATT GGG GTG GAT GAG CAT AAG TGG 650 His His Leu Asp Gly Val Tyr Val Ile Gly Val Asp Glu His Lys Trp 160 165 170 TCA CAT AAT AGG GCT AAG CAT GGT GAT GGG TTT GTC ACC GTG ATT GTC 698 Ser His Asn Arg Ala Lys His Gly Asp Gly Phe Val Thr Val Ile Val 175 180 185 GAT ATG ACC GGG CAT CGG TAT GAC TCA CGG TGT CCT GCC CGG TTA TTA 746 Asp Met Thr Gly His Arg Tyr Asp Ser Arg Cys Pro Ala Arg Leu Leu 190 195 200 GAT GTC GTC CCA GGT CGT AGT GCT GAT GCT TTA CGG TCT TGG CTT GGC 794 Asp Val Val Pro Gly Arg Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ser Trp Leu Gly 205 210 215 TCC CGC GGT GAA CAG TTC CGC AAT CAG ATA CGG ATC GTG TCC ATG GAT 842 Ser Arg Gly Glu Gln Phe Arg Asn Gln Ile Arg Ile Val Ser Met Asp 220 225 230 235 GGA TTC CAA GGC TAC GCC ACA GCA AGT AAA GAA CTC ATT CCT TCT GCT 890 Gly Phe Gln Gly Tyr Ala Thr Ala Ser Lys Glu Leu Ile Pro Ser Ala 240 245 250 CGT CGC GTG ATG GAT CCA TTC CAT GTT GTG CGG CTT GCT GGT GAC AAG 938 Arg Arg Val Met Asp Pro Phe His Val Val Arg Leu Ala Gly Asp Lys 255 260 265 CTC ACC GCC TGC CGG CAA CGC CTC CAG CGG GAG AAA TAC CAG CGT CGT 986 Leu Thr Ala Cys Arg Gln Arg Leu Gln Arg Glu Lys Tyr Gln Arg Arg 270 275 280 GGT TTA AGC CAG GAT CCG TTG TAT AAA AAC CGG AAG GCT TTG TTG ACC 1034 Gly Leu Ser Gln Asp Pro Leu Tyr Lys Asn Arg Lys Ala Leu Leu Thr 285 290 295 ACG CAC AAG TGG TTG AGT CCT CGT CAG CAA GAA AGC TTG GAG CAG TTG 1082 Thr His Lys Trp Leu Ser Pro Arg Gln Gln Glu Ser Leu Glu Gln Leu 300 305 310 315 TGG GCG TAT GAC AAA GAC TAC GGG GTG TTA AAG CTT GCG TGG CTT GCG 1130 Trp Ala Tyr Asp Lys Asp Tyr Gly Val Leu Lys Leu Ala Trp Leu Ala 320 325 330 TAT CAG GCG ATT ATT GAT TGT TAT CAG ATG GGT AAT AAG CGT GAA GCG 1178 Tyr Gln Ala Ile Ile Asp Cys Tyr Gln Met Gly Asn Lys Arg Glu Ala 335 340 345 AAA AAG AAA ATG CGG ACC ATT ATT GAT CAG CTT CGG GTG TTG AAG GGG 1226 Lys Lys Lys Met Arg Thr Ile Ile Asp Gln Leu Arg Val Leu Lys Gly 350 355 360 CCG AAT AAG GAA CTC GCG CAG TTG GGT CGT AGT TTG TTT AAA CGA CTT 1274 Pro Asn Lys Glu Leu Ala Gln Leu Gly Arg Ser Leu Phe Lys Arg Leu 365 370 375 GGT GAT GTG TTG GCG TAT TTC GAT GTT GGT GTC TCC AAC GGT CCG GTC 1322 Gly Asp Val Leu Ala Tyr Phe Asp Val Gly Val Ser Asn Gly Pro Val 380 385 390 395 GAA GCG ATC AAC GGA CGG TTG GAG CAT TTG CGT GGG ATT GCT CTA GGT 1370 Glu Ala Ile Asn Gly Arg Leu Glu His Leu Arg Gly Ile Ala Leu Gly 400 405 410 TTC CGT AAT TTG AAC CAC TAC ATT CTG CGG TGC CTT ATC CAT TCA GGG 1418 Phe Arg Asn Leu Asn His Tyr Ile Leu Arg Cys Leu Ile His Ser Gly 415 420 425 CAG TTG GTC CAT AAG ATC AAT GCA CTC TAA AA CAGGAAGAGC CCCTTTTGC 1469 Gln Leu Val His Lys Ile Asn Ala Leu Stop 430 435 配列番号：２ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCAGGATCCG ATCCTTTTTA ACCCATCAC 29 配列番号：３ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCCGGATCCA AAAGGTTAGG AATACGGTT 29

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の挿入配列の単離に用いるプラスミドｐ
ＣＲＹ３０−ｓａｃＢの制限酵素切断点地図。

【図２】本発明の挿入配列の制限酵素切断点地図および
塩基配列決定のための戦略図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示される配列を有すること
   を特徴とする挿入配列。