JPH0731478A - コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するｄｎａ断片 - Google Patents
コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するｄｎａ断片Info
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- JPH0731478A JPH0731478A JP5183597A JP18359793A JPH0731478A JP H0731478 A JPH0731478 A JP H0731478A JP 5183597 A JP5183597 A JP 5183597A JP 18359793 A JP18359793 A JP 18359793A JP H0731478 A JPH0731478 A JP H0731478A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
から単離されたアスパルターゼをコードする遺伝子に由
来する１８８塩基対より成るプロモーター機能を有する
ＤＮＡ断片。 【効果】 このプロモーター機能を有するＤＮＡ断片
を、タンパク質をコードする構造遺伝子とともにプラス
ミドベクターに組み込み宿主コリネ型細菌に導入した時
に、該構造遺伝子が高発現する。
から単離されたアスパルターゼをコードする遺伝子に由
来する１８８塩基対より成るプロモーター機能を有する
ＤＮＡ断片。 【効果】 このプロモーター機能を有するＤＮＡ断片
を、タンパク質をコードする構造遺伝子とともにプラス
ミドベクターに組み込み宿主コリネ型細菌に導入した時
に、該構造遺伝子が高発現する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はコリネ型細菌内のアスパ
ルターゼをコードする遺伝子に由来するコリネ型細菌内
でプロモーター機能を有する新規なＤＮＡを含むＤＮＡ
断片に関する。
ルターゼをコードする遺伝子に由来するコリネ型細菌内
でプロモーター機能を有する新規なＤＮＡを含むＤＮＡ
断片に関する。
【０００２】
【従来の技術】ブレビバクテリウム属細菌を含むコリネ
型細菌は、アミノ酸、有機酸、プリンヌクレオチド等を
生産する工業的に有用な微生物であるが、組換えＤＮＡ
技術の導入による菌株の育種改良は、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）等に比べて遅れ
ている。特に、プラスミドベクターに挿入された構造遺
伝子のコリネ型細菌内での発現のために必要なプロモー
ターの構造に関する知見は極めて少く、コリネ型細菌を
宿主として用いて構造遺伝子を発現させようとする場合
にはかなり問題となっている。
型細菌は、アミノ酸、有機酸、プリンヌクレオチド等を
生産する工業的に有用な微生物であるが、組換えＤＮＡ
技術の導入による菌株の育種改良は、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）等に比べて遅れ
ている。特に、プラスミドベクターに挿入された構造遺
伝子のコリネ型細菌内での発現のために必要なプロモー
ターの構造に関する知見は極めて少く、コリネ型細菌を
宿主として用いて構造遺伝子を発現させようとする場合
にはかなり問題となっている。
【０００３】一方、本発明者らは先にコリネ型細菌染色
体より、フマル酸とアンモニアからＬ−アスパラギン酸
への変換反応を触媒する酵素、すなわちアスパルターゼ
（ＥＣ．４．３．１．１）をコードする遺伝子ＤＮＡを
単離し提案した（特開平５−３０９７７号明細書参
照）。
体より、フマル酸とアンモニアからＬ−アスパラギン酸
への変換反応を触媒する酵素、すなわちアスパルターゼ
（ＥＣ．４．３．１．１）をコードする遺伝子ＤＮＡを
単離し提案した（特開平５−３０９７７号明細書参
照）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の主たる目的
は、プラスミドベクターに挿入された構造遺伝子をコリ
ネ型細菌内で確実に発現せしめるようなプロモーター機
能を有する新規なＤＮＡ断片を取得することである。
は、プラスミドベクターに挿入された構造遺伝子をコリ
ネ型細菌内で確実に発現せしめるようなプロモーター機
能を有する新規なＤＮＡ断片を取得することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、コリネ型
細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡを鋭意検索し
た結果、本発明者らが先に提案したアスパルターゼをコ
ードする遺伝子（特開平５−３０９７７号明細書参照）
上流の１８８ｂｐのＤＮＡがコリネ型細菌内でプロモー
ター機能を有することを見い出し本発明を完成するに至
った。
細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡを鋭意検索し
た結果、本発明者らが先に提案したアスパルターゼをコ
ードする遺伝子（特開平５−３０９７７号明細書参照）
上流の１８８ｂｐのＤＮＡがコリネ型細菌内でプロモー
ター機能を有することを見い出し本発明を完成するに至
った。
【０００６】すなわち、本発明は、コリネ型細菌内のア
スパルターゼをコードする遺伝子に由来するコリネ型細
菌内でプロモーター機能を有する後記配列表の配列番
号：１に示される１８８ｂｐの塩基配列を含むＤＮＡ断
片である。以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。本明細書において、「プロモーター機能を有するＤ
ＮＡ」とは、遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリ
メラーゼが特異的に結合するＤＮＡ上の領域であって、
タンパク質をコードする構造遺伝子とともにプラスミド
ベクターに組み込まれ宿主コリネ型細菌に導入された時
に、該構造遺伝子の発現強度の増加作用を有するＤＮＡ
を意味する。
スパルターゼをコードする遺伝子に由来するコリネ型細
菌内でプロモーター機能を有する後記配列表の配列番
号：１に示される１８８ｂｐの塩基配列を含むＤＮＡ断
片である。以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。本明細書において、「プロモーター機能を有するＤ
ＮＡ」とは、遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリ
メラーゼが特異的に結合するＤＮＡ上の領域であって、
タンパク質をコードする構造遺伝子とともにプラスミド
ベクターに組み込まれ宿主コリネ型細菌に導入された時
に、該構造遺伝子の発現強度の増加作用を有するＤＮＡ
を意味する。
【０００７】本発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ
断片は、コリネ型細菌内のアスパルターゼをコードする
遺伝子に由来するものであり、該遺伝子を含むＤＮＡ断
片から得ることができる。上記アスパルターゼをコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、これを「Ａ断片」
と略称することがある）の供給源となる微生物は、コリ
ネ型細菌であれば特に限定されるものではないが、一般
的には、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）およびその由来株；ブレ
ビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６
８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４
６；ブレビバクテリウム・デバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ
１４０２０；ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒ
ｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９；コリネバクテリウ
ム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１等が有利に
使用される。
断片は、コリネ型細菌内のアスパルターゼをコードする
遺伝子に由来するものであり、該遺伝子を含むＤＮＡ断
片から得ることができる。上記アスパルターゼをコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片（以下、これを「Ａ断片」
と略称することがある）の供給源となる微生物は、コリ
ネ型細菌であれば特に限定されるものではないが、一般
的には、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）およびその由来株；ブレ
ビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６
８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４
６；ブレビバクテリウム・デバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ
１４０２０；ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒ
ｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９；コリネバクテリウ
ム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１等が有利に
使用される。
【０００８】これらの供給源微生物からＡ断片を調製す
るための基本的操作の一例を述べれば次のとおりであ
る。すなわち、Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えばブ
レビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−
１４９７）株の染色体上に存在し、この染色体を適当な
制限酵素で切断することにより生ずる切断断片の中から
以下に述べる方法で分離、取得することができる。
るための基本的操作の一例を述べれば次のとおりであ
る。すなわち、Ａ断片は、上記コリネ型細菌、例えばブ
レビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−
１４９７）株の染色体上に存在し、この染色体を適当な
制限酵素で切断することにより生ずる切断断片の中から
以下に述べる方法で分離、取得することができる。
【０００９】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩを
用いて、ＤＮＡ断片の大きさが約２０〜３０ｋｂになる
ように部分分解する。得られたＤＮＡ断片をコスミドベ
クター、例えばｐＷＥ１５に挿入し、このコスミドを、
λＤＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋ
ｉｔを用いる形質導入により、アスパルターゼ遺伝子が
欠損した大腸菌変異株（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎ
ｅｒａｌ Ｍｉｃｌｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３０，ｐ１２
７１−１２７８，１９８４参照）に導入する。この大腸
菌変異株をＬ−グルタミン酸を単一炭素源とする培地に
塗沫する。
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩを
用いて、ＤＮＡ断片の大きさが約２０〜３０ｋｂになる
ように部分分解する。得られたＤＮＡ断片をコスミドベ
クター、例えばｐＷＥ１５に挿入し、このコスミドを、
λＤＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋ
ｉｔを用いる形質導入により、アスパルターゼ遺伝子が
欠損した大腸菌変異株（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎ
ｅｒａｌ Ｍｉｃｌｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３０，ｐ１２
７１−１２７８，１９８４参照）に導入する。この大腸
菌変異株をＬ−グルタミン酸を単一炭素源とする培地に
塗沫する。
【００１０】得られる形質転換株よりコスミドＤＮＡを
抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来の
Ａ断片を確認・取得することができる。かくして得られ
るＡ断片は、大きさが約２０〜３０ｋｂと大きく、実用
的でないので、さらに短かい断片に特定化する必要があ
る。
抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来の
Ａ断片を確認・取得することができる。かくして得られ
るＡ断片は、大きさが約２０〜３０ｋｂと大きく、実用
的でないので、さらに短かい断片に特定化する必要があ
る。
【００１１】次に、上記で得られたＡ断片を含むコスミ
ドを適当な制限酵素を用いて切断し、得られるＤＮＡ断
片を、大腸菌で複製可能なベクタープラスミドに挿入し
このベクタープラスミドを通常用いられる形質転換法、
例えば、塩化カルシウム法、電気パルス法による形質転
換により、前記アスパルターゼが欠損した大腸菌変異株
に導入し、この大腸菌変異株をＬ−グルタミン酸を単一
炭素源とする培地に塗沫する。
ドを適当な制限酵素を用いて切断し、得られるＤＮＡ断
片を、大腸菌で複製可能なベクタープラスミドに挿入し
このベクタープラスミドを通常用いられる形質転換法、
例えば、塩化カルシウム法、電気パルス法による形質転
換により、前記アスパルターゼが欠損した大腸菌変異株
に導入し、この大腸菌変異株をＬ−グルタミン酸を単一
炭素源とする培地に塗沫する。
【００１２】得られる形質転換株よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のＡ断片を確認・取得することができる。このようにし
て得られるＡ断片の一つは、前記ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａ
ｕ３ＡＩの部分分解により切り出し、さらにそれを制限
酵素ＥｃｏＲＩで切り出すことによって得られる大きさ
が約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のＡ断片を確認・取得することができる。このようにし
て得られるＡ断片の一つは、前記ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａ
ｕ３ＡＩの部分分解により切り出し、さらにそれを制限
酵素ＥｃｏＲＩで切り出すことによって得られる大きさ
が約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。
【００１３】この約２．４ｋｂのアスパルターゼをコー
ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、各種の制限酵素で切
断したときの認識部位数及び切断断片の大きさを下記表
１に示す。なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、制限
酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体
既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および４
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な
断片の数から決定した値を採用した。
ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、各種の制限酵素で切
断したときの認識部位数及び切断断片の大きさを下記表
１に示す。なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、制限
酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそれ自体
既知の方法に従い１％アガロースゲル電気泳動および４
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な
断片の数から決定した値を採用した。
【００１４】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λ ｐｈａ
ｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断して得ら
れる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上で
の泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒ
ア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７
４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅIIIで切断し
て得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリル
アミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、
切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさ
を算出する。プラスミドの大きさは、切断断片それぞれ
の大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片の大き
さの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについて
は、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果
を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさ
については４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て得られる結果を採用した。
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λ ｐｈａ
ｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断して得ら
れる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上で
の泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒ
ア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７
４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅIIIで切断し
て得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリル
アミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、
切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさ
を算出する。プラスミドの大きさは、切断断片それぞれ
の大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片の大き
さの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについて
は、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果
を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさ
については４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て得られる結果を採用した。
【００１５】
【表１】 表１ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＡｖａＩ １ １．７， ０．７ ＣｌａＩ １ １．３， １．１ ＨｉｎｄIII ２ １．７， ０．３５， ０．３５
【００１６】上記したブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切り
出すことにより得られる大きさが約２．４ｋｂのＤＮＡ
断片については、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１１
８またはｐＵＣ１１９を用いるジデオキシヌクレオチド
酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｏｎ法）（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５
４６３，１９７７）により決定することができる。この
ようにして決定した上記約２．４ｋｂのＤＮＡ断片の塩
基配列中に５２６個のアミノ酸をコードする１５７８の
塩基対から成るオープンリーディングフレームが存在し
（特開平５−３０９７７号明細書参照）、該オープンリ
ーディングフレームの上流部分がプロモーター機能を有
すると考えられた。
Ｊ−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切り
出すことにより得られる大きさが約２．４ｋｂのＤＮＡ
断片については、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１１
８またはｐＵＣ１１９を用いるジデオキシヌクレオチド
酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｏｎ法）（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５
４６３，１９７７）により決定することができる。この
ようにして決定した上記約２．４ｋｂのＤＮＡ断片の塩
基配列中に５２６個のアミノ酸をコードする１５７８の
塩基対から成るオープンリーディングフレームが存在し
（特開平５−３０９７７号明細書参照）、該オープンリ
ーディングフレームの上流部分がプロモーター機能を有
すると考えられた。
【００１７】次に、該オープンリーディングフレームの
上流部分のプロモーター機能を有すると考えられるＤＮ
Ａ領域の上流および下流の配列に相当する適当な塩基配
列、例えば後記配列表の配列番号：２および配列番号：
３に示される塩基配列を化学合成し、これをプライマー
ＤＮＡとして用いて、プロモーター機能を有すると考え
られるＤＮＡ領域を増幅することができる。プライマー
ＤＮＡの合成は、例えばベックマン社製ＤＮＡ合成機Ｓ
ｙｓｔｅｍ−１ Ｐｌｕｓを用いて合成でき、ＤＮＡ領
域の増幅は、例えばＤＮＡサーマルサイクラー４０８型
（宝酒造社製）を用いてＮａｔｕｒｅ，３２４，ｐ１６
３（１９８６年）に記載の方法により行うことができ
る。
上流部分のプロモーター機能を有すると考えられるＤＮ
Ａ領域の上流および下流の配列に相当する適当な塩基配
列、例えば後記配列表の配列番号：２および配列番号：
３に示される塩基配列を化学合成し、これをプライマー
ＤＮＡとして用いて、プロモーター機能を有すると考え
られるＤＮＡ領域を増幅することができる。プライマー
ＤＮＡの合成は、例えばベックマン社製ＤＮＡ合成機Ｓ
ｙｓｔｅｍ−１ Ｐｌｕｓを用いて合成でき、ＤＮＡ領
域の増幅は、例えばＤＮＡサーマルサイクラー４０８型
（宝酒造社製）を用いてＮａｔｕｒｅ，３２４，ｐ１６
３（１９８６年）に記載の方法により行うことができ
る。
【００１８】かくして得られる増幅ＤＮＡをコリネ型細
菌内で自律増殖可能なプロモーター検出用ベクターに組
み込むことによって該増幅ＤＮＡのプロモーター機能を
確認することができる。「コリネ型細菌内で自律増殖可
能なプロモーター検出用ベクター」としては、例えば、
コリネ型細菌内で自律増殖可能なＤＮＡ断片（ａ）と、
プロモーターが欠失している発現されるべきタンパク質
をコードする構造遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｂ）（以下
これを「発現されるべき遺伝子」と略称することがあ
る）とを保有するプラスミドであれば特に制限はない。
このプラスミド検出用ベクターの具体例としては、コリ
ネ型細菌内で自律増殖可能なＤＮＡ断片（ａ）としてブ
レビバクテリウム・スタチオニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）ＩＦＯ１２１４４
（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）由来のプラスミドｐＢＹ
５０３を制限酵素ＫｐｎＩで切り出すことによって得ら
れる約６ｋｂのＤＮＡ断片、プロモーターが欠失してい
る発現されるべきタンパク質をコードする構造遺伝子を
含むＤＮＡ断片（ｂ）としてエシェリヒア・コリのトラ
ンポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子
であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子を保有するプラスミド
ｐＰＲ３（特開平３−１４７７９２号明細書参照）を挙
げることができる。
菌内で自律増殖可能なプロモーター検出用ベクターに組
み込むことによって該増幅ＤＮＡのプロモーター機能を
確認することができる。「コリネ型細菌内で自律増殖可
能なプロモーター検出用ベクター」としては、例えば、
コリネ型細菌内で自律増殖可能なＤＮＡ断片（ａ）と、
プロモーターが欠失している発現されるべきタンパク質
をコードする構造遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｂ）（以下
これを「発現されるべき遺伝子」と略称することがあ
る）とを保有するプラスミドであれば特に制限はない。
このプラスミド検出用ベクターの具体例としては、コリ
ネ型細菌内で自律増殖可能なＤＮＡ断片（ａ）としてブ
レビバクテリウム・スタチオニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）ＩＦＯ１２１４４
（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１５）由来のプラスミドｐＢＹ
５０３を制限酵素ＫｐｎＩで切り出すことによって得ら
れる約６ｋｂのＤＮＡ断片、プロモーターが欠失してい
る発現されるべきタンパク質をコードする構造遺伝子を
含むＤＮＡ断片（ｂ）としてエシェリヒア・コリのトラ
ンポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子
であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子を保有するプラスミド
ｐＰＲ３（特開平３−１４７７９２号明細書参照）を挙
げることができる。
【００１９】次に、上記プラスミド検出用ベクターを用
てプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検出法を述べ
る。先ず、上記プラスミド検出用ベクターを、それ自体
既知の通常用いられる形質転換法、例えば電気パルス法
〔Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４，４４３，（１９９
０）参照〕等で前記コリネ型細菌、例えばブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９
７）へ導入し、形質転換株を適当な培地で培養し、プロ
モーターが欠失している発現されるべき遺伝子（ｂ）が
発現しないことを確認しておく。ここで、プロモーター
が欠失している発現されるべき遺伝子（ｂ）の発現の有
無および発現強度の測定は、該遺伝子（ｂ）が薬剤耐性
遺伝子である場合はその薬剤を含有する選択培地で培養
し、形質転換株の薬剤感受性を調べることで容易に行う
ことができる。また発現の有無および発現強度は、形質
転換株を通常用いられる培地で培養し、培地中の発現さ
れるべき遺伝子（ｂ）の発現産物を、該遺伝子の発現産
物の性質を利用して調べることもできる。
てプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検出法を述べ
る。先ず、上記プラスミド検出用ベクターを、それ自体
既知の通常用いられる形質転換法、例えば電気パルス法
〔Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４，４４３，（１９９
０）参照〕等で前記コリネ型細菌、例えばブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９
７）へ導入し、形質転換株を適当な培地で培養し、プロ
モーターが欠失している発現されるべき遺伝子（ｂ）が
発現しないことを確認しておく。ここで、プロモーター
が欠失している発現されるべき遺伝子（ｂ）の発現の有
無および発現強度の測定は、該遺伝子（ｂ）が薬剤耐性
遺伝子である場合はその薬剤を含有する選択培地で培養
し、形質転換株の薬剤感受性を調べることで容易に行う
ことができる。また発現の有無および発現強度は、形質
転換株を通常用いられる培地で培養し、培地中の発現さ
れるべき遺伝子（ｂ）の発現産物を、該遺伝子の発現産
物の性質を利用して調べることもできる。
【００２０】次に、発現されるべき遺伝子（ｂ）がコリ
ネ型細菌内で発現していないことが確認できたプラスミ
ド検出用ベクター、例えばｐＰＲ３の発現されるべきＣ
ＡＴ遺伝子の上流部位を適当な制限酵素、例えばＢａｍ
ＨＩで解裂し、該部位に前記Ａ断片由来の増幅ＤＮＡを
ＤＮＡリガーゼ処理により連絡し、コリネ型細菌へ電気
パルス法等により導入する。得られる形質転換株を培養
し、前記した発現されるべき遺伝子（ｂ）の確認法によ
り、形質転換株の該遺伝子の発現の有無及び強度を調べ
ることにより、挿入されたＤＮＡ断片のプロモーター機
能を確認することができる。
ネ型細菌内で発現していないことが確認できたプラスミ
ド検出用ベクター、例えばｐＰＲ３の発現されるべきＣ
ＡＴ遺伝子の上流部位を適当な制限酵素、例えばＢａｍ
ＨＩで解裂し、該部位に前記Ａ断片由来の増幅ＤＮＡを
ＤＮＡリガーゼ処理により連絡し、コリネ型細菌へ電気
パルス法等により導入する。得られる形質転換株を培養
し、前記した発現されるべき遺伝子（ｂ）の確認法によ
り、形質転換株の該遺伝子の発現の有無及び強度を調べ
ることにより、挿入されたＤＮＡ断片のプロモーター機
能を確認することができる。
【００２１】かくして得られる本発明のプロモーター機
能を有するＤＮＡ断片としては、後記配列表の配列番
号：１に示される１８８塩基対より成るＤＮＡを挙げる
ことができる。上記した後記配列表の配列番号：１に示
される塩基配列を包含して成る本発明のプロモーター機
能を有するＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色体Ｄ
ＮＡから分離されたＡ断片に由来するもののみならず、
通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばベックマン社製
Ｓｙｓｔｅｍ−１ Ｐｌｕｓを用いて合成されたもので
あってもよい。
能を有するＤＮＡ断片としては、後記配列表の配列番
号：１に示される１８８塩基対より成るＤＮＡを挙げる
ことができる。上記した後記配列表の配列番号：１に示
される塩基配列を包含して成る本発明のプロモーター機
能を有するＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色体Ｄ
ＮＡから分離されたＡ断片に由来するもののみならず、
通常用いられるＤＮＡ合成装置、例えばベックマン社製
Ｓｙｓｔｅｍ−１ Ｐｌｕｓを用いて合成されたもので
あってもよい。
【００２２】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから増幅して得られ
る本発明のＤＮＡ断片は、プロモーター機能を実質的に
損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩
基と置換されていてもよく又は削除されていてもよく、
或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基
配列の一部が転位されているものであってもよく、これ
らの誘導体のいずれもが、本発明のプロモーター機能を
有するＤＮＡ断片に包含されるものである。
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから増幅して得られ
る本発明のＤＮＡ断片は、プロモーター機能を実質的に
損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩
基と置換されていてもよく又は削除されていてもよく、
或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基
配列の一部が転位されているものであってもよく、これ
らの誘導体のいずれもが、本発明のプロモーター機能を
有するＤＮＡ断片に包含されるものである。
【００２３】
【実施例】次に実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。しかしながら、下記の実施例は本発明について
具体的認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、こ
れによって本発明の範囲は何ら限定されるものではな
い。
明する。しかしながら、下記の実施例は本発明について
具体的認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、こ
れによって本発明の範囲は何ら限定されるものではな
い。
【００２４】実施例１ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のプロ
モーター機能を有するＤＮＡ断片およびアスパルターゼ
構造遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）のクローン化 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ
4 ７ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ 4 ０．５ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4
０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2
Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ４〜６Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ、酵母
エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μ
ｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留
水１ｌ〕１ｌに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を対数増殖期後期
まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／
ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ
・２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫ
を、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、
３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウ
ムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で
６時間保温して容菌した。この溶菌液に、等量のフェノ
ール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆる
やかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、
２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸
ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量
のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層
の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エ
タノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ
・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後の
実験に用いた。
モーター機能を有するＤＮＡ断片およびアスパルターゼ
構造遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）のクローン化 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ
4 ７ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ 4 ０．５ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4
０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2
Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ４〜６Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ、酵母
エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μ
ｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留
水１ｌ〕１ｌに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を対数増殖期後期
まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／
ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ
・２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫ
を、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、
３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウ
ムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で
６時間保温して容菌した。この溶菌液に、等量のフェノ
ール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆる
やかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、
２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸
ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量
のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層
の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エ
タノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ
・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後の
実験に用いた。
【００２５】（Ｂ）組換え体の創製 上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡ９０μｌを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ
１ｕｎｉｔを用い、３７℃で２０分間反応させ部分分解
した。この部分分解ＤＮＡにコスミドｐＷＥ１５（スト
ラタジーン社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した後、
脱リン酸化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍ
Ｍ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 及びＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終
濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
−２３３の全ＤＮＡ９０μｌを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ
１ｕｎｉｔを用い、３７℃で２０分間反応させ部分分解
した。この部分分解ＤＮＡにコスミドｐＷＥ１５（スト
ラタジーン社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した後、
脱リン酸化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍ
Ｍ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 及びＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終
濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
【００２６】（Ｃ）Ａ断片を含むコスミドの選抜 上記遺伝子の選抜に用いたアスパルターゼ欠損大腸菌変
異株は、エシェリヒア・コリＪＲＧ１１７４（ａｓｐＡ
２３）である〔（ ）内はアスパルターゼ遺伝子型（Ｇ
ｅｎｏｔｙｐｅ）を示す、またこの菌株の詳細および取
得方法については、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒ
ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３０，ｐ１２７１
−１２７８（１９８４）参照〕。
異株は、エシェリヒア・コリＪＲＧ１１７４（ａｓｐＡ
２３）である〔（ ）内はアスパルターゼ遺伝子型（Ｇ
ｅｎｏｔｙｐｅ）を示す、またこの菌株の詳細および取
得方法については、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒ
ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３０，ｐ１２７１
−１２７８（１９８４）参照〕。
【００２７】上記（Ｂ）項で得たコスミド混液を用い、
前記エシェリヒア・コリＪＲＧ１１７４株を形質導入
し、アンピシリン５０ｍｇを含む選択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ
4 ７ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4
１ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．１ｇ、Ｌ−グルタミン
酸ナトリウム塩３０ｍＭ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに
溶解〕に塗沫した。なお形質導入には、宝酒造より販売
されているλ ＤＮＡｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐａｃｋａｇ
ｉｎｇ Ｋｉｔを用いて行った。培地上の生育株を常法
により、液体培養し、培養液よりコスミドＤＮＡを抽出
し、該コスミドを制限酵素により切断し、アガロースゲ
ル電気泳動を用いて調べたところ、コスミドｐＷＥ１５
の長さ８．８ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約３０ｋｂ
のＤＮＡ断片が認められた。本コスミドをｐＷＥ１５−
Ａｓｐと命名した。
前記エシェリヒア・コリＪＲＧ１１７４株を形質導入
し、アンピシリン５０ｍｇを含む選択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ
4 ７ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4
１ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．１ｇ、Ｌ−グルタミン
酸ナトリウム塩３０ｍＭ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに
溶解〕に塗沫した。なお形質導入には、宝酒造より販売
されているλ ＤＮＡｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐａｃｋａｇ
ｉｎｇ Ｋｉｔを用いて行った。培地上の生育株を常法
により、液体培養し、培養液よりコスミドＤＮＡを抽出
し、該コスミドを制限酵素により切断し、アガロースゲ
ル電気泳動を用いて調べたところ、コスミドｐＷＥ１５
の長さ８．８ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約３０ｋｂ
のＤＮＡ断片が認められた。本コスミドをｐＷＥ１５−
Ａｓｐと命名した。
【００２８】（Ｄ）コリネ型細菌内でプロモーター機能
を有するＤＮＡ断片およびアスパルターゼ構造遺伝子を
含むＤＮＡ断片（Ａ断片）のプラスミドｐＨＳＧ３９９
へのサブクローニング 上記（Ｃ）項で得たコスミドｐＷＥ１５−Ａｓｐに含ま
れるＤＮＡ挿入断片は約３０ｋｂと大きく、実用的でな
いので、得られた断片のうち必要な部分だけに小型化す
るために、プラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造より市
販）へアスパルターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片を下記のとおりサブクローニングした。
を有するＤＮＡ断片およびアスパルターゼ構造遺伝子を
含むＤＮＡ断片（Ａ断片）のプラスミドｐＨＳＧ３９９
へのサブクローニング 上記（Ｃ）項で得たコスミドｐＷＥ１５−Ａｓｐに含ま
れるＤＮＡ挿入断片は約３０ｋｂと大きく、実用的でな
いので、得られた断片のうち必要な部分だけに小型化す
るために、プラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造より市
販）へアスパルターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片を下記のとおりサブクローニングした。
【００２９】上記（Ｃ）項で得たコスミドｐＷＥ１５−
Ａｓｐを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したものと、プラス
ミドｐＨＳＧ３９９を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したも
のを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１
０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2 及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成
分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１２℃
で１５時間反応させ、結合させた。
Ａｓｐを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したものと、プラス
ミドｐＨＳＧ３９９を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したも
のを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１
０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2 及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成
分を添加し（各成分の濃度は最終濃度である）、１２℃
で１５時間反応させ、結合させた。
【００３０】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）によりエシ
ェリヒア・コリＪＲＧ１１７４（ａｓｐＡ２３）株を形
質転換し、クロラムフェニコール５０ｍｇを含む選択培
地〔Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ
4 ）2 ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１
ｇ、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム３０ｍＭ及び寒天１６
ｇを蒸留水１ｌに溶解〕に塗沫した。
シウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）によりエシ
ェリヒア・コリＪＲＧ１１７４（ａｓｐＡ２３）株を形
質転換し、クロラムフェニコール５０ｍｇを含む選択培
地〔Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ
4 ）2 ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１
ｇ、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム３０ｍＭ及び寒天１６
ｇを蒸留水１ｌに溶解〕に塗沫した。
【００３１】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＨＳＧ３９９の長さ
２．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約２．４ｋｂの挿
入ＤＮＡ断片が認められた。各種の制限で切断したとき
の、長さ約２．４ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素認識部位
数および切断断片の大きさは前記表１に示したとおりで
あった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に
示す。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＨＳＧ３９９の長さ
２．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約２．４ｋｂの挿
入ＤＮＡ断片が認められた。各種の制限で切断したとき
の、長さ約２．４ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素認識部位
数および切断断片の大きさは前記表１に示したとおりで
あった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に
示す。
【００３２】また上記で得たプラスミドを各種制限酵素
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の表２に示す。
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の表２に示す。
【００３３】
【表２】 表２ プラスミドｐＨＳＧ３９９−Ａｓｐ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＡｖａＩ ２ ３．６， １．０ ＣｌａＩ １ ４．６ ＥｃｏＲＩ ２ ２．４， ２．２ 上記の制限酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＨ
ＳＧ３９９−Ａｓｐと命名した。
ＳＧ３９９−Ａｓｐと命名した。
【００３４】以上により、コリネ型細菌内でプロモータ
ー機能を有するＤＮＡ断片およびアスパルターゼ構造遺
伝子を含む大きさが約２．４ｋｂのＤＮＡ断片（Ｅｃｏ
ＲＩ断片）を得ることができた。
ー機能を有するＤＮＡ断片およびアスパルターゼ構造遺
伝子を含む大きさが約２．４ｋｂのＤＮＡ断片（Ｅｃｏ
ＲＩ断片）を得ることができた。
【００３５】実施例２コリネ型細菌内でプロモーター機能を有する断片および
アスパルターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列
の決定 実施例１の（Ｄ）で得られた大きさが約２．４ｋｂのコ
リネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片お
よびアスパルターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片につい
て、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１１８またはｐＵ
Ｃ１１９を用いるジヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘ
ｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）（Ｓａｎ
ｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ７４，５４６３，１９７７）によ
り図１に示した戦略図に従って決定した。その塩基配列
中のオープンリーディングフレームの存在から、アスパ
ルターゼ構造遺伝子は５２６アミノ酸をコードする１５
７８塩基対より構成され、該オープンリーディングフレ
ームの上流部分にプロモーター機能を有すると考えられ
る後記配列表の配列番号：１に示される１８８塩基対よ
りなる配列が存在した。
アスパルターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列
の決定 実施例１の（Ｄ）で得られた大きさが約２．４ｋｂのコ
リネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡ断片お
よびアスパルターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片につい
て、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１１８またはｐＵ
Ｃ１１９を用いるジヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘ
ｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）（Ｓａｎ
ｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ７４，５４６３，１９７７）によ
り図１に示した戦略図に従って決定した。その塩基配列
中のオープンリーディングフレームの存在から、アスパ
ルターゼ構造遺伝子は５２６アミノ酸をコードする１５
７８塩基対より構成され、該オープンリーディングフレ
ームの上流部分にプロモーター機能を有すると考えられ
る後記配列表の配列番号：１に示される１８８塩基対よ
りなる配列が存在した。
【００３６】実施例３プロモーター機能を有するＤＮＡ断片の単離 （Ａ）ＤＮＡ領域の増幅に使用するプライマーＤＮＡの
合成 実施例２において決定したアスパルターゼ構造遺伝子上
流の１８８ｂｐの配列を基に、該領域のみを特異的に増
幅するために下記のプライマーＤＮＡを合成した（アン
ダーライン部分はＢａｍＨＩ部位）。
合成 実施例２において決定したアスパルターゼ構造遺伝子上
流の１８８ｂｐの配列を基に、該領域のみを特異的に増
幅するために下記のプライマーＤＮＡを合成した（アン
ダーライン部分はＢａｍＨＩ部位）。
【００３７】５′−ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＡＣＧＣ
ＣＡＴＣＡＴＧＧＡＴ−３′（配列番号：２） ５′−ＣＣＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＡＧＴＴＧＡＡＧＧＡ
ＡＡＴＣ−３′（相補鎖；配列番号：３） プライマーＤＮＡの合成はベックマン社製ＤＮＡ合成機
Ｓｙｓｔｅｍ−１ｐｌｕｓを用いて行った。
ＣＡＴＣＡＴＧＧＡＴ−３′（配列番号：２） ５′−ＣＣＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＡＧＴＴＧＡＡＧＧＡ
ＡＡＴＣ−３′（相補鎖；配列番号：３） プライマーＤＮＡの合成はベックマン社製ＤＮＡ合成機
Ｓｙｓｔｅｍ−１ｐｌｕｓを用いて行った。
【００３８】（Ｂ）プロモーター機能を有するＤＮＡ断
片の増幅 反応液〔５０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ
（ｐＨ８．８），１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１００μｇ
／ｍｌゼラチン，２００μＭｄＮＴＰｓ，２５０ｐｍｏ
ｌプライマー〕に、２．５ｕｎｉｔｓのＴａｑポリメラ
ーゼ、１ｎｇのＤＮＡを添加し、ディネーチャー９４℃
１分間、アニーリング３７℃、２分間、ポリメライゼー
ション７２℃３分間の反応を、ＤＮＡサーマルサイクラ
ー４０８型（宝酒造社製）で２５回繰り返すことにより
ＤＮＡ断片を増幅させた。増幅ＤＮＡ断片の確認は４％
アガロースゲル電気泳動により１８８ｂｐのＤＮＡ断片
を視認することにより行なった。
片の増幅 反応液〔５０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ
（ｐＨ８．８），１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１００μｇ
／ｍｌゼラチン，２００μＭｄＮＴＰｓ，２５０ｐｍｏ
ｌプライマー〕に、２．５ｕｎｉｔｓのＴａｑポリメラ
ーゼ、１ｎｇのＤＮＡを添加し、ディネーチャー９４℃
１分間、アニーリング３７℃、２分間、ポリメライゼー
ション７２℃３分間の反応を、ＤＮＡサーマルサイクラ
ー４０８型（宝酒造社製）で２５回繰り返すことにより
ＤＮＡ断片を増幅させた。増幅ＤＮＡ断片の確認は４％
アガロースゲル電気泳動により１８８ｂｐのＤＮＡ断片
を視認することにより行なった。
【００３９】実施例４プロモーター機能を有するＤＮＡ断片のプラスミドｐＰ
Ｒ３への導入 特開平３−１４７７９２号明細書の記載に基いて調製し
たプラスミドｐＰＲ３０．５μｇに制限酵素ＢａｍＨＩ
（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃で１時間反応させ、プラスミ
ドＤＮＡを完全に分解した。
Ｒ３への導入 特開平３−１４７７９２号明細書の記載に基いて調製し
たプラスミドｐＰＲ３０．５μｇに制限酵素ＢａｍＨＩ
（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃で１時間反応させ、プラスミ
ドＤＮＡを完全に分解した。
【００４０】実施例３で調製したプロモーター機能を有
するＤＮＡ断片とプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、制
限酵素を不活化するために６５℃で１０分間加熱処理し
た後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍ
Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
１．０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ及びＴ
４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強化
し、１６℃で１５時間保温した。この溶液を用いてエシ
ェリヒア・コリＨＢ１０１のコンピテントセル（宝酒造
社製）を形質転換した。
するＤＮＡ断片とプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、制
限酵素を不活化するために６５℃で１０分間加熱処理し
た後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍ
Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
１．０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ及びＴ
４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強化
し、１６℃で１５時間保温した。この溶液を用いてエシ
ェリヒア・コリＨＢ１０１のコンピテントセル（宝酒造
社製）を形質転換した。
【００４１】形質転換株は５０μｇ／ｍｌ（最終濃度）
のカナマイシンを含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、蒸留水１ｌ、ｐＨ７．
２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得られ
た。これら生育株のプラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法
〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ；“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ”（１９８２）９０〜９１参照〕により抽出し
た。
のカナマイシンを含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、蒸留水１ｌ、ｐＨ７．
２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得られ
た。これら生育株のプラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法
〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ；“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ”（１９８２）９０〜９１参照〕により抽出し
た。
【００４２】得られたプラスミドは電気パルス法によ
り、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミド除去株へ形質転換
し、アルカリ−ＳＤＳ法を用いてプラスミドを抽出し
た。このプラスミドの制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、
ＳａｃＩ等の制限酵素による切断パターンによってｐＰ
Ｒ３に前記増幅ＤＮＡが組み込まれていることを確認
し、このプラスミドを“ｐＰＲ３−Ａｓｐ”と命名し
た。
り、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１４９７）プラスミド除去株へ形質転換
し、アルカリ−ＳＤＳ法を用いてプラスミドを抽出し
た。このプラスミドの制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、
ＳａｃＩ等の制限酵素による切断パターンによってｐＰ
Ｒ３に前記増幅ＤＮＡが組み込まれていることを確認
し、このプラスミドを“ｐＰＲ３−Ａｓｐ”と命名し
た。
【００４３】実施例５プロモーター強度の測定： 実施例４でｐＰＲ３に挿入し
たプロモーターの強度を、クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の活性を測定すること
によって調べた。
たプロモーターの強度を、クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の活性を測定すること
によって調べた。
【００４４】ｐＰＲ３を保有するブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３株とｐＰＲ３−Ａｓｐを保有する
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株をそれぞ
れ、実施例１の（Ａ）項に記載の半合成培地Ａ培地にカ
ナマイシンを５０μｇ／ｍｌ加えた培地１０ｍｌの入っ
た試験管で一晩前培養し、その培養液を上記の培地１０
０ｍｌの入った三角フラスコで約６時間培養後集菌し、
ＣＡＴの活性測定に用いた。ＣＡＴの活性はＷ．Ｖ．Ｓ
ｈａｗらの方法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｊａ
ｎ．（１９６８）２８〜３６参照〕により測定した。そ
の結果、ｐＰＲ３−Ａｓｐを有するＭＪ−２３３株は、
プロモーターの挿入されていないｐＰＲ３を有するＭＪ
−２３３株の約２５倍のＣＡＴ活性をもっていた。
フラバムＭＪ−２３３株とｐＰＲ３−Ａｓｐを保有する
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株をそれぞ
れ、実施例１の（Ａ）項に記載の半合成培地Ａ培地にカ
ナマイシンを５０μｇ／ｍｌ加えた培地１０ｍｌの入っ
た試験管で一晩前培養し、その培養液を上記の培地１０
０ｍｌの入った三角フラスコで約６時間培養後集菌し、
ＣＡＴの活性測定に用いた。ＣＡＴの活性はＷ．Ｖ．Ｓ
ｈａｗらの方法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｊａ
ｎ．（１９６８）２８〜３６参照〕により測定した。そ
の結果、ｐＰＲ３−Ａｓｐを有するＭＪ−２３３株は、
プロモーターの挿入されていないｐＰＲ３を有するＭＪ
−２３３株の約２５倍のＣＡＴ活性をもっていた。
【００４５】
配列番号：１ 配列の長さ：１８８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム 株名：ＭＪ２３３ 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐｒｏｍｏｔｅｒ 存在位置：１−１８８ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： GCTAACGCCA TCATGGATAA GCTTGCTGGA CTCGGCGCTG AAGCCATCCT GGCTTCTGAA 60 ATCCGCATCG CCCGCATCTA GTTTTAACTA CCCCCGAAAA TGTAGTGGGG TAGTTCCACA 120 CTGCCTCTTA CAAGTACGTA GGATAATCCA CAGCACCATC GTGATTTCCT TCAACTTGTG 180 AGAGGCAG 188
【００４６】配列番号：２ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： CCGGATCCGC TAACGCCATC ATGGAT
【００４７】配列番号：３ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： CCGGATCCCA CAAGTTGAAG GAAATC
【図１】コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するＤ
ＮＡおよびアスパルターゼ構造遺伝子を含む大きさが約
２．４ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図、および
塩基配列決定のための戦略図。
ＮＡおよびアスパルターゼ構造遺伝子を含む大きさが約
２．４ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図、および
塩基配列決定のための戦略図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 コリネ型細菌内のアスパルターゼをコー
ドする遺伝子に由来するコリネ型細菌内でプロモーター
機能を有する下記の塩基配列： GCTAACGCCA TCATGGATAA GCTTGCTGGA CTCGGCGCTG AAGCCATCCT GGCTTCTGAA 60 ATCCGCATCG CCCGCATCTA GTTTTAACTA CCCCCGAAAA TGTAGTGGGG TAGTTCCACA 120 CTGCCTCTTA CAAGTACGTA GGATAATCCA CAGCACCATC GTGATTTCCT TCAACTTGTG 180 AGAGGCAG 188 を含むＤＮＡ断片。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5183597A JPH0731478A (ja) | 1993-07-26 | 1993-07-26 | コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するｄｎａ断片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5183597A JPH0731478A (ja) | 1993-07-26 | 1993-07-26 | コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するｄｎａ断片 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0731478A true JPH0731478A (ja) | 1995-02-03 |
Family
ID=16138603
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5183597A Pending JPH0731478A (ja) | 1993-07-26 | 1993-07-26 | コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するｄｎａ断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0731478A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1702980A1 (en) | 1999-07-01 | 2006-09-20 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum gene encoding Hpr of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system |
| US7273721B2 (en) | 1999-06-25 | 2007-09-25 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in membrane synthesis and membrane transport |
| US7393675B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-07-01 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
| US7410766B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-08-12 | Basf Se | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| US7439050B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-10-21 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding diaminopimelate epimerase |
-
1993
- 1993-07-26 JP JP5183597A patent/JPH0731478A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7273721B2 (en) | 1999-06-25 | 2007-09-25 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in membrane synthesis and membrane transport |
| US7393675B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-07-01 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
| US7439050B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-10-21 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding diaminopimelate epimerase |
| EP1702980A1 (en) | 1999-07-01 | 2006-09-20 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum gene encoding Hpr of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system |
| US7410766B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-08-12 | Basf Se | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| US7425435B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-09-16 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
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