JPH0731476A - コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するｄｎａ断片 - Google Patents
コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するｄｎａ断片Info
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- JPH0731476A JPH0731476A JP5183595A JP18359593A JPH0731476A JP H0731476 A JPH0731476 A JP H0731476A JP 5183595 A JP5183595 A JP 5183595A JP 18359593 A JP18359593 A JP 18359593A JP H0731476 A JPH0731476 A JP H0731476A
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- dna fragment
- fragment
- plasmid
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
染色体から単離されたジアミノペラルゴン酸アミノトラ
ンスフェラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼをコ
ードする遺伝子に由来する２８５塩基対より成るプロモ
ーター機能を有するＤＮＡ。 【効果】 このプロモーター機能を有するＤＮＡ断片
を、タンパク質をコードする構造遺伝子とともにプラス
ミドベクターに組み込み宿主コリネ型細菌に導入した時
に、該構造遺伝子が高発現する。
染色体から単離されたジアミノペラルゴン酸アミノトラ
ンスフェラーゼ及びデスチオビオチンシンセターゼをコ
ードする遺伝子に由来する２８５塩基対より成るプロモ
ーター機能を有するＤＮＡ。 【効果】 このプロモーター機能を有するＤＮＡ断片
を、タンパク質をコードする構造遺伝子とともにプラス
ミドベクターに組み込み宿主コリネ型細菌に導入した時
に、該構造遺伝子が高発現する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はコリネ型細菌内のジアミ
ノペラルゴン酸アミノトランスフェラーゼ及びデスチオ
ビオチンシンセターゼをコードする遺伝子に由来するコ
リネ型細菌内でプロモーター機能を有する新規なＤＮＡ
を含むＤＮＡ断片に関する。
ノペラルゴン酸アミノトランスフェラーゼ及びデスチオ
ビオチンシンセターゼをコードする遺伝子に由来するコ
リネ型細菌内でプロモーター機能を有する新規なＤＮＡ
を含むＤＮＡ断片に関する。
【０００２】
【従来の技術】ブレビバクテリウム属細菌を含むコリネ
型細菌は、アミノ酸、有機酸、プリンヌクレオチド等を
生産する工業的に有用な微生物であるが、組換えＤＮＡ
技術の導入による菌株の育種改良は、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）等に比べて遅れ
ている。特に、プラスミドベクターに挿入された構造遺
伝子のコリネ型細菌内での発現のために必要なプロモー
ターの構造に関する知見は極めて少く、コリネ型細菌を
宿主として用いて構造遺伝子を発現させようとする場合
にはかなり問題となっている。
型細菌は、アミノ酸、有機酸、プリンヌクレオチド等を
生産する工業的に有用な微生物であるが、組換えＤＮＡ
技術の導入による菌株の育種改良は、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）等に比べて遅れ
ている。特に、プラスミドベクターに挿入された構造遺
伝子のコリネ型細菌内での発現のために必要なプロモー
ターの構造に関する知見は極めて少く、コリネ型細菌を
宿主として用いて構造遺伝子を発現させようとする場合
にはかなり問題となっている。
【０００３】一方、本発明者らは先にコリネ型細菌染色
体からビオチン生合成に関与するジアミノペラルゴン酸
アミノトランスフェラーゼ及びデスチオビオチンシンセ
ターゼをコードする遺伝子を単離し提案した（特願平３
−１７４７５７号明細書参照）。
体からビオチン生合成に関与するジアミノペラルゴン酸
アミノトランスフェラーゼ及びデスチオビオチンシンセ
ターゼをコードする遺伝子を単離し提案した（特願平３
−１７４７５７号明細書参照）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の主たる目的
は、プラスミドベクターに挿入された構造遺伝子をコリ
ネ型細菌内で確実に発現せしめるようなプロモーター機
能を有する新規なＤＮＡ断片を取得することである。
は、プラスミドベクターに挿入された構造遺伝子をコリ
ネ型細菌内で確実に発現せしめるようなプロモーター機
能を有する新規なＤＮＡ断片を取得することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、コリネ型
細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡを鋭意検索し
た結果、本発明らが先に提案したコリネ型細菌内のジア
ミノペラルゴン酸アミノトランスフェラーゼ及びデスチ
オビオチンシンセターゼをコードする遺伝子（以下これ
を「ｂｉｏＡｂｉｏＤ」ということがある；特願平３−
１７４７５７号明細書参照）上流の２８５ｂｐのＤＮＡ
がコリネ型細菌内でプロモーター機能を有することを見
いだし、本発明を完成するに至った。
細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡを鋭意検索し
た結果、本発明らが先に提案したコリネ型細菌内のジア
ミノペラルゴン酸アミノトランスフェラーゼ及びデスチ
オビオチンシンセターゼをコードする遺伝子（以下これ
を「ｂｉｏＡｂｉｏＤ」ということがある；特願平３−
１７４７５７号明細書参照）上流の２８５ｂｐのＤＮＡ
がコリネ型細菌内でプロモーター機能を有することを見
いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、コリネ型細菌内のジ
アミノペラルゴン酸アミノトランスフェラーゼ及びデス
チオビオチンシンセターゼをコードする遺伝子（ｂｉｏ
ＡｂｉｏＤ）に由来するコリネ型細菌内でプロモーター
機能を有する後記配列表の配列番号：１に示される２８
５ｂｐの塩基配列を含むＤＮＡ断片である。以下、本発
明についてさらに詳細に説明する。
アミノペラルゴン酸アミノトランスフェラーゼ及びデス
チオビオチンシンセターゼをコードする遺伝子（ｂｉｏ
ＡｂｉｏＤ）に由来するコリネ型細菌内でプロモーター
機能を有する後記配列表の配列番号：１に示される２８
５ｂｐの塩基配列を含むＤＮＡ断片である。以下、本発
明についてさらに詳細に説明する。
【０００７】本明細書において、「プロモーター機能を
有するＤＮＡ」とは、遺伝子の転写を開始するためにＲ
ＮＡポリメラーゼが特異的に結合するＤＮＡ上の領域で
あって、タンパク質をコードする構造遺伝子とともにプ
ラスミドベクターに組み込まれ宿主コリネ型細菌に導入
された時に、該構造遺伝子の発現強度の増加作用を有す
るＤＮＡを意味する。
有するＤＮＡ」とは、遺伝子の転写を開始するためにＲ
ＮＡポリメラーゼが特異的に結合するＤＮＡ上の領域で
あって、タンパク質をコードする構造遺伝子とともにプ
ラスミドベクターに組み込まれ宿主コリネ型細菌に導入
された時に、該構造遺伝子の発現強度の増加作用を有す
るＤＮＡを意味する。
【０００８】本発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ
は、通常はコリネ型細菌内のｂｉｏＡｂｉｏＤを含むＤ
ＮＡ断片から得ることができる。上記ｂｉｏＡｂｉｏＤ
を含むＤＮＡ断片の供給源となる微生物は、コリネ型細
菌であれば特に限定されるものではないが、一般的に
は、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１４９７）およびその由来株、ブレビバク
テリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７
１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６、ブ
レビバクテリウム・デバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４０
２０、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎ
ｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グ
ルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕ
ｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１等が有利に使用さ
れる。
は、通常はコリネ型細菌内のｂｉｏＡｂｉｏＤを含むＤ
ＮＡ断片から得ることができる。上記ｂｉｏＡｂｉｏＤ
を含むＤＮＡ断片の供給源となる微生物は、コリネ型細
菌であれば特に限定されるものではないが、一般的に
は、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１４９７）およびその由来株、ブレビバク
テリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７
１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６、ブ
レビバクテリウム・デバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４０
２０、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎ
ｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グ
ルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕ
ｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１等が有利に使用さ
れる。
【０００９】これらの供給源微生物からｂｉｏＡｂｉｏ
Ｄを含むＤＮＡ断片を調製するための基本操作の一例を
述べれば次のとおりである。上記ｂｉｏＡｂｉｏＤを含
む断片は、上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９
７）の染色体上に存在し、この染色体を適当な制限酵素
で切断することにより生ずる切断断片の中から以下に述
べる方法で分離、取得することができる。
Ｄを含むＤＮＡ断片を調製するための基本操作の一例を
述べれば次のとおりである。上記ｂｉｏＡｂｉｏＤを含
む断片は、上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９
７）の染色体上に存在し、この染色体を適当な制限酵素
で切断することにより生ずる切断断片の中から以下に述
べる方法で分離、取得することができる。
【００１０】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩを
用いて、ＤＮＡ断片の大きさが約２０〜３０ｋｂになる
ように部分分解する。得られたＤＮＡ断片をコスミドベ
クター例えばｐＷＥ１５に挿入し、このコスミドを、λ
ＤＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉ
ｔを用いる形質導入により、ｂｉｏＡあるいはｂｉｏＤ
の欠損した大腸菌変異株（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ ９４，ｐ２０６５−２
０６６，１９６７及びＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ １１２、ｐ８３０−８３
９、１９７２参照）に導入する。この大腸菌変異株を、
ビオチンを含まない選択培地に塗沫する。
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩを
用いて、ＤＮＡ断片の大きさが約２０〜３０ｋｂになる
ように部分分解する。得られたＤＮＡ断片をコスミドベ
クター例えばｐＷＥ１５に挿入し、このコスミドを、λ
ＤＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｋｉ
ｔを用いる形質導入により、ｂｉｏＡあるいはｂｉｏＤ
の欠損した大腸菌変異株（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ ９４，ｐ２０６５−２
０６６，１９６７及びＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ １１２、ｐ８３０−８３
９、１９７２参照）に導入する。この大腸菌変異株を、
ビオチンを含まない選択培地に塗沫する。
【００１１】得られる形質転換株よりコスミドＤＮＡを
抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来の
ｂｉｏＡｂｉｏＤを含む断片を確認・取得することがで
きる。かくして得られるｂｉｏＡｂｉｏＤを含む断片
は、大きさが約２０〜３０ｋｂと大きく、実用的でない
ので、さらに短かい断片に特定化する必要がある。
抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来の
ｂｉｏＡｂｉｏＤを含む断片を確認・取得することがで
きる。かくして得られるｂｉｏＡｂｉｏＤを含む断片
は、大きさが約２０〜３０ｋｂと大きく、実用的でない
ので、さらに短かい断片に特定化する必要がある。
【００１２】次に、上記で得られたｂｉｏＡｂｉｏＤを
含む断片を含むコスミドを適当な制限酵素を用いて切断
し、得られるＤＮＡ断片を、大腸菌で複製可能なベクタ
ープラスミドに挿入しこのベクタープラスミドを通常用
いられる形質転換法、例えば、塩化カルシウム法あるい
は電気パルス法による形質転換により、前記ｂｉｏＡあ
るいはｂｉｏＤの欠損した大腸菌変異株に導入する。こ
の大腸菌変異株を、ビオチンを含まない選択培地に塗沫
する。
含む断片を含むコスミドを適当な制限酵素を用いて切断
し、得られるＤＮＡ断片を、大腸菌で複製可能なベクタ
ープラスミドに挿入しこのベクタープラスミドを通常用
いられる形質転換法、例えば、塩化カルシウム法あるい
は電気パルス法による形質転換により、前記ｂｉｏＡあ
るいはｂｉｏＤの欠損した大腸菌変異株に導入する。こ
の大腸菌変異株を、ビオチンを含まない選択培地に塗沫
する。
【００１３】得られる形質転換株よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のｂｉｏＡｂｉｏＤを含む断片を確認・取得することが
できる。このようにして得られるｂｉｏＡｂｉｏＤを含
む断片の一つは、前記ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩの
部分分解により切り出し、さらにそれを、制限酵素Ｓａ
ｌＩで切り出すことによって得られる大きさが約４．０
ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のｂｉｏＡｂｉｏＤを含む断片を確認・取得することが
できる。このようにして得られるｂｉｏＡｂｉｏＤを含
む断片の一つは、前記ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩの
部分分解により切り出し、さらにそれを、制限酵素Ｓａ
ｌＩで切り出すことによって得られる大きさが約４．０
ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。
【００１４】この約４．０ｋｂのｂｉｏＡｂｉｏＤを含
むＤＮＡ断片を、各種の制限酵素で切断したときの認識
部位数及び切断断片の大きさを下記表１に示す。なお、
本明細書において、制限酵素による「認識部位数」は、
ＤＮＡ断片又はプラスミドを、過剰の制限酵素の存在下
で完全分解し、それらの分解物をそれ自体既知の方法に
従い１％アガロースゲル電気泳動および４％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な断片の数から
決定した値を採用した。
むＤＮＡ断片を、各種の制限酵素で切断したときの認識
部位数及び切断断片の大きさを下記表１に示す。なお、
本明細書において、制限酵素による「認識部位数」は、
ＤＮＡ断片又はプラスミドを、過剰の制限酵素の存在下
で完全分解し、それらの分解物をそれ自体既知の方法に
従い１％アガロースゲル電気泳動および４％ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能な断片の数から
決定した値を採用した。
【００１５】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λ ｐｈａ
ｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断して得ら
れる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上で
の泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒ
ア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７
４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅIIIで切断し
て得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリル
アミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、
切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさ
を算出する。プラスミドの大きさは、切断断片それぞれ
の大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片の大き
さの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについて
は、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果
を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさ
については４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て得られる結果を採用した。
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λ ｐｈａ
ｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断して得ら
れる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上で
の泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒ
ア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７
４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅIIIで切断し
て得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリル
アミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、
切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさ
を算出する。プラスミドの大きさは、切断断片それぞれ
の大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片の大き
さの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについて
は、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果
を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさ
については４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て得られる結果を採用した。
【００１６】
【表１】 表１ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＢａｍＨＩ １ ０．８， ３．２ Ｄｒａ II １ １．２， ２．８ Ｓａｃ Ｉ １ １．８， ２．２ Ｘｈｏ Ｉ １ １．３， ２．７
【００１７】上記表１中、２．７ｋｂのＸｈｏＩ切断断
片もまたジアミノペラルゴン酸アミノトランスフェラー
ゼ及びデスチオビオチンシンセターゼをコードする機能
を有していることが確認されており、ｂｉｏＡｂｉｏＤ
は、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３染色体
ＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで切り出すこと
によって得られる大きさが約２．７ｋｂのＤＮＡ断片中
に含まれるものと考えられる。
片もまたジアミノペラルゴン酸アミノトランスフェラー
ゼ及びデスチオビオチンシンセターゼをコードする機能
を有していることが確認されており、ｂｉｏＡｂｉｏＤ
は、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３染色体
ＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで切り出すこと
によって得られる大きさが約２．７ｋｂのＤＮＡ断片中
に含まれるものと考えられる。
【００１８】以上に詳述した大きさが約４．０ｋｂのｂ
ｉｏＡｂｉｏＤを含むＤＮＡ断片の制限酵素切断点を図
１に示す。上記したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の染色体を、制限酵素ＳａｌＩを用いて切り出
すことにより得られる大きさが約４．０ｋｂのＤＮＡ断
片を用いて、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１８また
はｐＵＣ１９を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法
（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ
ｎ法）（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５４６３，
１９７７）により決定することができる。このようにし
て決定した塩基配列中に４２３個のアミノ酸をコードす
る１２６９塩基対より成るｂｉｏＡオープンリーディン
グフレームおよび２２４個のアミノ酸をコードする６７
２塩基対より成るｂｉｏＤオープンリーディングフレー
ムが存在し（特願平３−１７４７５７号明細書参照）、
該オープンリーディングフレームの上流部分がプロモー
ター機能を有すると考えられた。
ｉｏＡｂｉｏＤを含むＤＮＡ断片の制限酵素切断点を図
１に示す。上記したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の染色体を、制限酵素ＳａｌＩを用いて切り出
すことにより得られる大きさが約４．０ｋｂのＤＮＡ断
片を用いて、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１８また
はｐＵＣ１９を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法
（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ
ｎ法）（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５４６３，
１９７７）により決定することができる。このようにし
て決定した塩基配列中に４２３個のアミノ酸をコードす
る１２６９塩基対より成るｂｉｏＡオープンリーディン
グフレームおよび２２４個のアミノ酸をコードする６７
２塩基対より成るｂｉｏＤオープンリーディングフレー
ムが存在し（特願平３−１７４７５７号明細書参照）、
該オープンリーディングフレームの上流部分がプロモー
ター機能を有すると考えられた。
【００１９】次に、該オープンリーディングフレームの
上流部分のプロモーター機能を有すると考えられるＤＮ
Ａ領域上の上流および下流の配列に相当する適当な塩基
配列、例えば後記配列表の配列番号：２および配列番
号：３に示される塩基配列を化学合成し、これをプライ
マーＤＮＡとして用いて、プロモーター機能を有すると
考えられるＤＮＡ領域を増幅することができる。プライ
マーＤＮＡの合成は、例えばベックマン社製ＤＮＡ合成
機Ｓｙｓｔｅｍ−１ Ｐｌｕｓを用いて合成でき、ＤＮ
Ａ領域の増幅は、例えばＤＮＡサーマルサイクラー４０
８型（宝酒造社製）を用いてＮａｔｕｒｅ，３２４，ｐ
１６３（１９８６年）に記載の方法により行うことがで
きる。かくして得られる増幅ＤＮＡ断片がコリネ型細菌
内でプロモーター機能を有することは、該ＤＮＡ断片を
コリネ型細菌内で自律増殖可能なプロモーター検出用ベ
クターに組み込むことによって確認することができる。
上流部分のプロモーター機能を有すると考えられるＤＮ
Ａ領域上の上流および下流の配列に相当する適当な塩基
配列、例えば後記配列表の配列番号：２および配列番
号：３に示される塩基配列を化学合成し、これをプライ
マーＤＮＡとして用いて、プロモーター機能を有すると
考えられるＤＮＡ領域を増幅することができる。プライ
マーＤＮＡの合成は、例えばベックマン社製ＤＮＡ合成
機Ｓｙｓｔｅｍ−１ Ｐｌｕｓを用いて合成でき、ＤＮ
Ａ領域の増幅は、例えばＤＮＡサーマルサイクラー４０
８型（宝酒造社製）を用いてＮａｔｕｒｅ，３２４，ｐ
１６３（１９８６年）に記載の方法により行うことがで
きる。かくして得られる増幅ＤＮＡ断片がコリネ型細菌
内でプロモーター機能を有することは、該ＤＮＡ断片を
コリネ型細菌内で自律増殖可能なプロモーター検出用ベ
クターに組み込むことによって確認することができる。
【００２０】「コリネ型細菌内で自律増殖可能なプロモ
ーター検出用ベクター」としては、例えば、コリネ型細
菌内で自律増殖可能なＤＮＡ断片（ａ）と、プロモータ
ーが欠失している発現されるべきタンパク質をコードす
る構造遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｂ）（以下これを「発
現されるべき遺伝子」と略称することがある）とを保有
するプラスミドであれば特に制限はない。このプラスミ
ド検出用ベクターの具体例としては、コリネ型細菌内で
自律増殖可能なＤＮＡ断片（ａ）としてブレビバクテリ
ウム・スタチオニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）ＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２５１５）由来のプラスミドｐＢＹ５０３を制限酵
素ＫｐｎＩで切り出すことによって得られる約６ｋｂの
ＤＮＡ断片、プロモーターが欠失している発現されるべ
きタンパク質をコードする構造遺伝子を含むＤＮＡ断片
（ｂ）としてエシェリヒア・コリのトランポゾンＴｎ９
由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子であるクロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を
コードする遺伝子を保有するプラスミドｐＰＲ３（特開
平３−１４７７９２号明細書参照）を挙げることができ
る。
ーター検出用ベクター」としては、例えば、コリネ型細
菌内で自律増殖可能なＤＮＡ断片（ａ）と、プロモータ
ーが欠失している発現されるべきタンパク質をコードす
る構造遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｂ）（以下これを「発
現されるべき遺伝子」と略称することがある）とを保有
するプラスミドであれば特に制限はない。このプラスミ
ド検出用ベクターの具体例としては、コリネ型細菌内で
自律増殖可能なＤＮＡ断片（ａ）としてブレビバクテリ
ウム・スタチオニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）ＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２５１５）由来のプラスミドｐＢＹ５０３を制限酵
素ＫｐｎＩで切り出すことによって得られる約６ｋｂの
ＤＮＡ断片、プロモーターが欠失している発現されるべ
きタンパク質をコードする構造遺伝子を含むＤＮＡ断片
（ｂ）としてエシェリヒア・コリのトランポゾンＴｎ９
由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子であるクロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を
コードする遺伝子を保有するプラスミドｐＰＲ３（特開
平３−１４７７９２号明細書参照）を挙げることができ
る。
【００２１】次に、上記プラスミド検出用ベクターを用
てプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検出法を述べ
る。先ず、上記プラスミド検出用ベクターを、それ自体
既知の通常用いられる形質転換法、例えば電気パルス法
〔Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４，４４３，（１９９
０）参照〕等で前記コリネ型細菌、例えばブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９
７）へ導入し、形質転換株を適当な培地で培養し、プロ
モーターが欠失している発現されるべき遺伝子（ｂ）が
発現しないことを確認しておく。ここで、プロモーター
が欠失している発現されるべき遺伝子（ｂ）の発現の有
無および発現強度の測定は、該遺伝子（ｂ）が薬剤耐性
遺伝子である場合はその薬剤を含有する選択培地で培養
し、形質転換株の薬剤感受性を調べることで容易に行う
ことができる。また発現の有無および発現強度は、形質
転換株を通常用いられる培地で培養し、培地中の発現さ
れるべき遺伝子（ｂ）の発現産物を、該遺伝子の発現産
物の性質を利用して調べることもできる。
てプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検出法を述べ
る。先ず、上記プラスミド検出用ベクターを、それ自体
既知の通常用いられる形質転換法、例えば電気パルス法
〔Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４，４４３，（１９９
０）参照〕等で前記コリネ型細菌、例えばブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９
７）へ導入し、形質転換株を適当な培地で培養し、プロ
モーターが欠失している発現されるべき遺伝子（ｂ）が
発現しないことを確認しておく。ここで、プロモーター
が欠失している発現されるべき遺伝子（ｂ）の発現の有
無および発現強度の測定は、該遺伝子（ｂ）が薬剤耐性
遺伝子である場合はその薬剤を含有する選択培地で培養
し、形質転換株の薬剤感受性を調べることで容易に行う
ことができる。また発現の有無および発現強度は、形質
転換株を通常用いられる培地で培養し、培地中の発現さ
れるべき遺伝子（ｂ）の発現産物を、該遺伝子の発現産
物の性質を利用して調べることもできる。
【００２２】次に、発現されるべき遺伝子（ｂ）がコリ
ネ型細菌内で発現していないことが確認できたプラスミ
ド検出用ベクター、例えばｐＰＲ３の発現されるべきＣ
ＡＴ遺伝子の上流部位を適当な制限酵素、例えばＢａｍ
ＨＩで解裂し、該部位に前記ｂｉｏＡｂｉｏＤを含むＤ
ＮＡ断片由来の増幅ＤＮＡをＤＮＡリガーゼ処理により
連絡し、コリネ型細菌へ電気パルス法等により導入す
る。得られる形質転換株を培養し、前記した発現される
べき遺伝子（ｂ）の確認法により、形質転換株の該遺伝
子の発現の有無及び強度を調べることにより、挿入され
たＤＮＡ断片のプロモーター機能を確認することができ
る。
ネ型細菌内で発現していないことが確認できたプラスミ
ド検出用ベクター、例えばｐＰＲ３の発現されるべきＣ
ＡＴ遺伝子の上流部位を適当な制限酵素、例えばＢａｍ
ＨＩで解裂し、該部位に前記ｂｉｏＡｂｉｏＤを含むＤ
ＮＡ断片由来の増幅ＤＮＡをＤＮＡリガーゼ処理により
連絡し、コリネ型細菌へ電気パルス法等により導入す
る。得られる形質転換株を培養し、前記した発現される
べき遺伝子（ｂ）の確認法により、形質転換株の該遺伝
子の発現の有無及び強度を調べることにより、挿入され
たＤＮＡ断片のプロモーター機能を確認することができ
る。
【００２３】かくして得られる本発明のプロモーター機
能を有するＤＮＡ断片としては、後記配列表の配列番
号：１に示される２８５塩基対より成るＤＮＡを挙げる
ことができる。上記した後記配列表の配列番号：１に示
される塩基配列を包含して成る本発明のプロモーター機
能を有するＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色体Ｄ
ＮＡから分離されたｂｉｏＡｂｉｏＤを含むＤＮＡ断片
に由来するもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成
装置、例えばベックマン社製Ｓｙｓｔｅｍ−１ Ｐｌｕ
ｓを用いて合成されたものであってもよい。
能を有するＤＮＡ断片としては、後記配列表の配列番
号：１に示される２８５塩基対より成るＤＮＡを挙げる
ことができる。上記した後記配列表の配列番号：１に示
される塩基配列を包含して成る本発明のプロモーター機
能を有するＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色体Ｄ
ＮＡから分離されたｂｉｏＡｂｉｏＤを含むＤＮＡ断片
に由来するもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成
装置、例えばベックマン社製Ｓｙｓｔｅｍ−１ Ｐｌｕ
ｓを用いて合成されたものであってもよい。
【００２４】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから増幅して得られ
る本発明のＤＮＡ断片は、プロモーター機能を実質的に
損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩
基と置換されていてもよく又は削除されていてもよく、
或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基
配列の一部が転位されているものであってもよく、これ
らの誘導体のいずれもが、本発明のプロモーター機能を
有するＤＮＡ断片に包含されるものである。
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから増幅して得られ
る本発明のＤＮＡ断片は、プロモーター機能を実質的に
損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩
基と置換されていてもよく又は削除されていてもよく、
或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基
配列の一部が転位されているものであってもよく、これ
らの誘導体のいずれもが、本発明のプロモーター機能を
有するＤＮＡ断片に包含されるものである。
【００２５】
【実施例】次に実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。しかしながら、下記の実施例は本発明について
具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、
これによって本発明の範囲は何ら限定されるものではな
い。
明する。しかしながら、下記の実施例は本発明について
具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、
これによって本発明の範囲は何ら限定されるものではな
い。
【００２６】実施例１ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のジア
ミノペラルゴン酸アミノトランスフェラーゼ及びデスチ
オビオチンシンセターゼをコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片（ｂｉｏＡｂｉｏＤ断片）のクローン化 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ
4 ７ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ 4 ０．５ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4
０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2
Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ・４〜６Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ、酵母
エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μ
ｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留
水１リットル〕１リットルに、ブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を対
数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体
を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ
ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプ
ロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるよ
うに添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル
硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加
し、５０℃で６時間保温して容菌した。この溶菌液に、
等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で
１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，
０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を
分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加し
た後、２倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層と
エタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきと
り、７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られ
たＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静
置し、以後の実験に用いた。
ミノペラルゴン酸アミノトランスフェラーゼ及びデスチ
オビオチンシンセターゼをコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片（ｂｉｏＡｂｉｏＤ断片）のクローン化 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ
4 ７ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ 4 ０．５ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4
０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2
Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4 ・４〜６Ｈ2 Ｏ ６ｍｇ、酵母
エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μ
ｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留
水１リットル〕１リットルに、ブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）を対
数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体
を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ
ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプ
ロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるよ
うに添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル
硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加
し、５０℃で６時間保温して容菌した。この溶菌液に、
等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で
１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，
０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を
分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加し
た後、２倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層と
エタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきと
り、７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られ
たＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静
置し、以後の実験に用いた。
【００２７】（Ｂ）組換え体の創製 上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡ９０μｌを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ
１ｕｎｉｔを用い、３７℃で２０分間反応させ部分分解
した。この部分分解ＤＮＡにコスミドｐＷＥ１５（スト
ラタジーン社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した後、
脱リン酸化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍ
Ｍ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 及びＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終
濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
−２３３の全ＤＮＡ９０μｌを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ
１ｕｎｉｔを用い、３７℃で２０分間反応させ部分分解
した。この部分分解ＤＮＡにコスミドｐＷＥ１５（スト
ラタジーン社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した後、
脱リン酸化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍ
Ｍ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 及びＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終
濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。
【００２８】（Ｃ）ビオチン生合成に関与する酵素をコ
ードする遺伝子を含むコスミドの選抜 上記（Ｂ）項で得たコスミド混液を用い、前記エシェリ
ヒア・コリＲ８７３（ｂｉｏＡ４）株を形質導入し、ア
ンピシリン５０ｍｇを含む選択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ4 ７
ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １ｇ、
ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１ｇ、カザミノ酸１０ｇ、
グルコース２ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１リットルに溶
解〕に塗沫した。なお形質導入には、宝酒造より販売さ
れているλ ＤＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐａｃｋａｇ
ｉｎｇ Ｋｉｔを用いて行った。培地上の生育株を常法
により、液体培養し、培養液よりコスミドＤＮＡを抽出
し、該コスミドを制限酵素により切断し、アガロースゲ
ル電気泳動を用いて調べたところ、コスミドｐＷＥ１５
の長さ８．８ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約３０ｋｂ
のＤＮＡ断片が認められた。本コスミドをｐＷＥ１５−
ｂｉｏＡと命名した。
ードする遺伝子を含むコスミドの選抜 上記（Ｂ）項で得たコスミド混液を用い、前記エシェリ
ヒア・コリＲ８７３（ｂｉｏＡ４）株を形質導入し、ア
ンピシリン５０ｍｇを含む選択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ4 ７
ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １ｇ、
ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１ｇ、カザミノ酸１０ｇ、
グルコース２ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１リットルに溶
解〕に塗沫した。なお形質導入には、宝酒造より販売さ
れているλ ＤＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐａｃｋａｇ
ｉｎｇ Ｋｉｔを用いて行った。培地上の生育株を常法
により、液体培養し、培養液よりコスミドＤＮＡを抽出
し、該コスミドを制限酵素により切断し、アガロースゲ
ル電気泳動を用いて調べたところ、コスミドｐＷＥ１５
の長さ８．８ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約３０ｋｂ
のＤＮＡ断片が認められた。本コスミドをｐＷＥ１５−
ｂｉｏＡと命名した。
【００２９】（Ｄ）ｂｉｏＡｂｉｏＤ断片のプラスミド
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIへのサブクローニング 上記（Ｃ）項で得たコスミドｐＷＥ１５−ｂｉｏＡに含
まれるＤＮＡ挿入断片は約３０ｋｂと大きく、実用的で
ないので、得られた断片のうち必要な部分だけに小型化
するために、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（ス
トラタジーン社より市販）へジアミノペラルゴン酸アミ
ノトランスフェラーゼ及びデスチオビオチンシンセター
ゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡｂｉｏＤ）を含むＤＮ
Ａ断片を下記のとおりサブクローニングした。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIへのサブクローニング 上記（Ｃ）項で得たコスミドｐＷＥ１５−ｂｉｏＡに含
まれるＤＮＡ挿入断片は約３０ｋｂと大きく、実用的で
ないので、得られた断片のうち必要な部分だけに小型化
するために、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（ス
トラタジーン社より市販）へジアミノペラルゴン酸アミ
ノトランスフェラーゼ及びデスチオビオチンシンセター
ゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＡｂｉｏＤ）を含むＤＮ
Ａ断片を下記のとおりサブクローニングした。
【００３０】上記（Ｃ）項で得たコスミドｐＷＥ１５−
ｂｉｏＡを制限酵素ＳａｌＩで切断したものと、プラス
ミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIを制限酵素ＳａｌＩで切
断したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉ
ｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度であ
る）、１２℃で１５時間反応させ、結合させた。
ｂｉｏＡを制限酵素ＳａｌＩで切断したものと、プラス
ミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIを制限酵素ＳａｌＩで切
断したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉ
ｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度であ
る）、１２℃で１５時間反応させ、結合させた。
【００３１】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）に従いエシ
ェリヒア・コリＲ８７３（ｂｉｏＡ４）株を形質転換
し、アンピシリン５０ｍｇを含む選択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ
4 ７ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4１
ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１ｇ、カザミノ酸１０
ｇ、グルコース２ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１リットル
に溶解〕に塗沫した。
シウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）に従いエシ
ェリヒア・コリＲ８７３（ｂｉｏＡ４）株を形質転換
し、アンピシリン５０ｍｇを含む選択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ
4 ７ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4１
ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１ｇ、カザミノ酸１０
ｇ、グルコース２ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１リットル
に溶解〕に塗沫した。
【００３２】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔIIの長さ３．９５ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ４．
０ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。このプラスミド
を用い、上記方法に従い前記エシェリヒア・コリＲ８７
７（ｂｉｏＤ１９）株を形質転換し、アンピシリン５０
ｍｇを含む選択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2 ＰＯ
4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ ０．１ｇ、カザミノ酸１０ｇ、グルコース２ｇ
及び寒天１６ｇを蒸留水１リットルに溶解〕に塗沫し
た。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔIIの長さ３．９５ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ４．
０ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。このプラスミド
を用い、上記方法に従い前記エシェリヒア・コリＲ８７
７（ｂｉｏＤ１９）株を形質転換し、アンピシリン５０
ｍｇを含む選択培地〔Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2 ＰＯ
4 ２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 １ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ ０．１ｇ、カザミノ酸１０ｇ、グルコース２ｇ
及び寒天１６ｇを蒸留水１リットルに溶解〕に塗沫し
た。
【００３３】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、エシェリヒア・コリＲ８７７（ｂ
ｉｏＡ４）株の形質転換体から得られたプラスミドと全
く同様に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIの長さ
２．９５ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約４．０ｋｂの
挿入ＤＮＡ断片が認められた。長さ約４．０ｋｂのＤＮ
Ａ断片を各種の制限酵素で切断したときの制限酵素認識
部位数および切断断片の大きさは、前記表１に示したと
おりであった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を
図１に示す。また上記で得られたプラスミドを各種制限
酵素で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結
果を下記の表２に示す。
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、エシェリヒア・コリＲ８７７（ｂ
ｉｏＡ４）株の形質転換体から得られたプラスミドと全
く同様に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIの長さ
２．９５ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約４．０ｋｂの
挿入ＤＮＡ断片が認められた。長さ約４．０ｋｂのＤＮ
Ａ断片を各種の制限酵素で切断したときの制限酵素認識
部位数および切断断片の大きさは、前記表１に示したと
おりであった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を
図１に示す。また上記で得られたプラスミドを各種制限
酵素で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結
果を下記の表２に示す。
【００３４】
【表２】 表２ プラスミドｐＢＳ−ｂｉｏＡＤ４ 制限酵素 認識部位数 切断断片の大きさ（ｋｂ） ＨｉｎｄIII １ ６．９５ ＸｈｏＩ ２ ４．２５， ２．７ ＢａｍＨＩ ２ ３．７５， ３．２ 上記の制限酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＢ
Ｓ−ｂｉｏＡＤ４と命名した。
Ｓ−ｂｉｏＡＤ４と命名した。
【００３５】以上の結果より、制限酵素ＳａｌＩで切り
出される、ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフェラ
ーゼとデスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝
子を含む長さ４．０ｋｂのＤＮＡ断片を得ることができ
た。
出される、ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフェラ
ーゼとデスチオビオチンシンセターゼをコードする遺伝
子を含む長さ４．０ｋｂのＤＮＡ断片を得ることができ
た。
【００３６】実施例２ｂｉｏＡ及びｂｉｏＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配
列の決定 （Ａ）デレーションミュータントの作製 実施例１で得られたプラスミドｐＢＳ−ｂｉｏＡＤ４
（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIのＳａｌＩサイトに４．０
ｋｂの断片が挿入されたプラスミド）３０μｇを制限酵
素ＸｂａＩを用いて３７℃、１時間反応により切断し
た。この反応液を７５℃で１５分間加熱して制限酵素を
失活させたのち、１ｍＭ ｔｈｉｏ−ｄＮＴＰを２μ
ｌ、クレノー断片（ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）
５ｕｎｉｔｓを加え、室温で１０分間反応した。反応液
と同量のフェノール／クロロホルム（１：１）で切断断
片を抽出したのち、２．５倍量のエタノールを加えＤＮ
Ａを沈殿させた。遠心分離後、真空乾燥しＤＮＡを回収
した。このＤＮＡを溶解し、制限酵素ＥｃｏＲＩを用い
て３７℃、１時間反応により切断した。この溶液と同量
のフェノール／クロロホルム（１：１）でＤＮＡ断片を
抽出したのち、２．５倍量のエタノールを加えＤＮＡを
沈殿させ、遠心分離後、真空乾燥し、ＤＮＡを回収し
た。得られたＤＮＡを１００μｌのＥｘｏIII バッファ
ー〔５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０），１００
ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１０ｍＭβ−メ
ルカプトエタノール〕に溶解した。このＤＮＡ溶液に１
８０ｕｎｉｔｓのエキソヌクレアーゼIII を加え、ボル
テックスにて撹拌し、３７℃にて反応した。この溶液を
１分毎に１０μｌずつ、予め準備した１００μｌのＭＢ
ヌクレアーゼバッファー〔４０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ
４．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０％グリセロール〕
中へ順次加え、６５℃、５分間の処理によりエキソヌク
レアーゼIII を失活させた後、３７℃にもどし、５０ｕ
ｎｉｔｓのＭｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼを加え、３
０分間反応した。同量の１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ−１
ｍＭ ＥＤＴＡ飽和フェノールで１回、上清をクロロホ
ルム／イソアミルアルコール（２４：１）で１回ＤＮＡ
をそれぞれ抽出した。上清に、２．５倍量のエタノール
を加え、遠心分離にて沈殿を回収し、７０％エタノール
で洗浄したのち真空乾燥した。得られたＤＮＡを５０μ
ｌのクレノーバッファー〔７ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５），０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，２０ｍＭ ＮａＣ
ｌ，７ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，０．１ｍＭｄＮＴＰｓ〕に溶
解させた後、２ｕｎｉｔｓのクレノー断片を加え、３７
℃、１５分間反応した。この溶液に２．５倍量のエタノ
ールを加え、遠心分離にて沈殿を回収し、７０％エタノ
ールで洗浄後、真空乾燥した。得られたＤＮＡを４０μ
ｌのＴＥバッファーに溶解し、１０ｍＭジチオスレイト
ール，１ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 およびＴ
４ＤＮＡリガーゼ５ｕｎｉｔｓの各成分を添加し、１２
℃で１５時間反応させ結合した。得られたＤＮＡ混合物
を用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造社製）
を形質転換し、アンピシリンを５０μｌ／ｍｌ含むＬＢ
培地〔１０ｇトリプトン，５ｇ酵母抽出物，５ｇ Ｎａ
Ｃｌ，１６ｇ ａｇａｒ／１ｌ〕に塗沫した。生育した
コロニーよりプラスミドを抽出し、インサートＤＮＡの
大きさをしらべ、インサートの大きさが２００ｂｐから
４ｋｂまで約２５０ｂｐおきに２０クローンを選抜し
た。同様にして逆方向のクローンについても２０クロー
ン選抜した。
列の決定 （Ａ）デレーションミュータントの作製 実施例１で得られたプラスミドｐＢＳ−ｂｉｏＡＤ４
（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIのＳａｌＩサイトに４．０
ｋｂの断片が挿入されたプラスミド）３０μｇを制限酵
素ＸｂａＩを用いて３７℃、１時間反応により切断し
た。この反応液を７５℃で１５分間加熱して制限酵素を
失活させたのち、１ｍＭ ｔｈｉｏ−ｄＮＴＰを２μ
ｌ、クレノー断片（ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）
５ｕｎｉｔｓを加え、室温で１０分間反応した。反応液
と同量のフェノール／クロロホルム（１：１）で切断断
片を抽出したのち、２．５倍量のエタノールを加えＤＮ
Ａを沈殿させた。遠心分離後、真空乾燥しＤＮＡを回収
した。このＤＮＡを溶解し、制限酵素ＥｃｏＲＩを用い
て３７℃、１時間反応により切断した。この溶液と同量
のフェノール／クロロホルム（１：１）でＤＮＡ断片を
抽出したのち、２．５倍量のエタノールを加えＤＮＡを
沈殿させ、遠心分離後、真空乾燥し、ＤＮＡを回収し
た。得られたＤＮＡを１００μｌのＥｘｏIII バッファ
ー〔５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０），１００
ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１０ｍＭβ−メ
ルカプトエタノール〕に溶解した。このＤＮＡ溶液に１
８０ｕｎｉｔｓのエキソヌクレアーゼIII を加え、ボル
テックスにて撹拌し、３７℃にて反応した。この溶液を
１分毎に１０μｌずつ、予め準備した１００μｌのＭＢ
ヌクレアーゼバッファー〔４０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ
４．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０％グリセロール〕
中へ順次加え、６５℃、５分間の処理によりエキソヌク
レアーゼIII を失活させた後、３７℃にもどし、５０ｕ
ｎｉｔｓのＭｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼを加え、３
０分間反応した。同量の１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ−１
ｍＭ ＥＤＴＡ飽和フェノールで１回、上清をクロロホ
ルム／イソアミルアルコール（２４：１）で１回ＤＮＡ
をそれぞれ抽出した。上清に、２．５倍量のエタノール
を加え、遠心分離にて沈殿を回収し、７０％エタノール
で洗浄したのち真空乾燥した。得られたＤＮＡを５０μ
ｌのクレノーバッファー〔７ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５），０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，２０ｍＭ ＮａＣ
ｌ，７ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，０．１ｍＭｄＮＴＰｓ〕に溶
解させた後、２ｕｎｉｔｓのクレノー断片を加え、３７
℃、１５分間反応した。この溶液に２．５倍量のエタノ
ールを加え、遠心分離にて沈殿を回収し、７０％エタノ
ールで洗浄後、真空乾燥した。得られたＤＮＡを４０μ
ｌのＴＥバッファーに溶解し、１０ｍＭジチオスレイト
ール，１ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 およびＴ
４ＤＮＡリガーゼ５ｕｎｉｔｓの各成分を添加し、１２
℃で１５時間反応させ結合した。得られたＤＮＡ混合物
を用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造社製）
を形質転換し、アンピシリンを５０μｌ／ｍｌ含むＬＢ
培地〔１０ｇトリプトン，５ｇ酵母抽出物，５ｇ Ｎａ
Ｃｌ，１６ｇ ａｇａｒ／１ｌ〕に塗沫した。生育した
コロニーよりプラスミドを抽出し、インサートＤＮＡの
大きさをしらべ、インサートの大きさが２００ｂｐから
４ｋｂまで約２５０ｂｐおきに２０クローンを選抜し
た。同様にして逆方向のクローンについても２０クロー
ン選抜した。
【００３７】（Ｂ）ディデオキシ（ｄｉｄｅｏｘｙ）法
によるデレーションミュータントの塩基配列の決定 上記で得られた菌体を白金耳で１０ｍｌの２×ＴＹ培地
〔１６ｇトリプトン，８ｇ酵母抽出物，５ｇ ＮａＣｌ
／１ｌ〕に植菌し、１５０μｇ／ｍｌになるようにアン
ピシリンを添加した。３７℃でＯ．Ｄ．が０．３になる
まで生育させた後、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を１
０8 ／ｍｌになるように添加した。３７℃で１時間培養
した後、２５分の１量を新しい１０ｍｌの２×ＴＹ培地
に植菌し、カナマイシンを７０μｇ／ｍｌになるように
添加し、３７℃で１２時間培養した。培養液１．５ｍｌ
をエッペンドルフチューブに分注し、遠心し菌体をのぞ
き、上清の１．２ｍｌを新しいエッペンドルフチューブ
にうつした。２００μｌのＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液〔２０
％ＰＥＧ，２．５Ｍ ＮａＣｌ〕を加え室温で１５分間
静置した。遠心により上清をのぞき沈殿を回収した。沈
殿を１００μｌのＴＥバッファーに懸濁し、５０μｌの
ＴＥ飽和フェノールを加えＤＮＡを抽出した。上清に、
１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム２５０μｌのエタノール
を加えＤＮＡを沈殿として回収した。真空乾燥させ、３
０μｌのＴＥバッファーに溶解した。シーケンスの反応
にはシーケナーゼＶｅｒ．２．０ＤＮＡシーケンシング
キット（東洋紡製）を用いた。４つのシーケンスレーン
用にまず１つのチューブの中で、アニーリング、及びラ
ベリングを行なった。エッペンドルフチューブに１μｌ
のプライマー，２μｌのシーケンス用バッファー，７μ
ｌの上記で調製したＤＮＡ溶液を入れ、よく混合し５５
℃で１時間反応した。４倍に希釈したラベリング反応液
を２μｌ加え、さらに１μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ，５μ
Ｃｉのα−35ＳｄＣＴＰ，２μｌの希釈シーケナーゼを
加え、３７℃で５分間反応した。Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ用のタ
ーミネーションミックスを十本のチューブに２．５μｌ
ずつ分注し、ラベリング反応が終了した反応液を３．５
μｌずつ分注した。３７℃で５分間反応した後、反応停
止液を４μｌずつ添加した。各反応液を３μｌずつゲル
にのせ、１５００Ｖで４時間電気泳動を行ない、Ｘ線フ
ィルムにてバンドを検出した。塩基配列決定の結果、図
１において、ＳａｃＩの上流１３２ｂｐからＢａｍＨＩ
の下流１００ｂｐまでにｂｉｏＡをコードしていると考
えられるオープンリーディングフレーム、ＢａｍＨＩの
下流に７ｂｐからＳａｌＩの３４ｂｐ上流にｂｉｏＤを
コードしていると考えられるオープンリーディングフレ
ーム（特願平３−１７４７５７号明細書参照）、さら
に、ＳａｃＩの上流４２９ｂｐから１３３ｂｐのあいだ
にプロモーター機能を有すると考えられる後記配列表の
配列番号：１に示す２８５塩基対の領域が存在してい
た。
によるデレーションミュータントの塩基配列の決定 上記で得られた菌体を白金耳で１０ｍｌの２×ＴＹ培地
〔１６ｇトリプトン，８ｇ酵母抽出物，５ｇ ＮａＣｌ
／１ｌ〕に植菌し、１５０μｇ／ｍｌになるようにアン
ピシリンを添加した。３７℃でＯ．Ｄ．が０．３になる
まで生育させた後、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を１
０8 ／ｍｌになるように添加した。３７℃で１時間培養
した後、２５分の１量を新しい１０ｍｌの２×ＴＹ培地
に植菌し、カナマイシンを７０μｇ／ｍｌになるように
添加し、３７℃で１２時間培養した。培養液１．５ｍｌ
をエッペンドルフチューブに分注し、遠心し菌体をのぞ
き、上清の１．２ｍｌを新しいエッペンドルフチューブ
にうつした。２００μｌのＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液〔２０
％ＰＥＧ，２．５Ｍ ＮａＣｌ〕を加え室温で１５分間
静置した。遠心により上清をのぞき沈殿を回収した。沈
殿を１００μｌのＴＥバッファーに懸濁し、５０μｌの
ＴＥ飽和フェノールを加えＤＮＡを抽出した。上清に、
１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム２５０μｌのエタノール
を加えＤＮＡを沈殿として回収した。真空乾燥させ、３
０μｌのＴＥバッファーに溶解した。シーケンスの反応
にはシーケナーゼＶｅｒ．２．０ＤＮＡシーケンシング
キット（東洋紡製）を用いた。４つのシーケンスレーン
用にまず１つのチューブの中で、アニーリング、及びラ
ベリングを行なった。エッペンドルフチューブに１μｌ
のプライマー，２μｌのシーケンス用バッファー，７μ
ｌの上記で調製したＤＮＡ溶液を入れ、よく混合し５５
℃で１時間反応した。４倍に希釈したラベリング反応液
を２μｌ加え、さらに１μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ，５μ
Ｃｉのα−35ＳｄＣＴＰ，２μｌの希釈シーケナーゼを
加え、３７℃で５分間反応した。Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ用のタ
ーミネーションミックスを十本のチューブに２．５μｌ
ずつ分注し、ラベリング反応が終了した反応液を３．５
μｌずつ分注した。３７℃で５分間反応した後、反応停
止液を４μｌずつ添加した。各反応液を３μｌずつゲル
にのせ、１５００Ｖで４時間電気泳動を行ない、Ｘ線フ
ィルムにてバンドを検出した。塩基配列決定の結果、図
１において、ＳａｃＩの上流１３２ｂｐからＢａｍＨＩ
の下流１００ｂｐまでにｂｉｏＡをコードしていると考
えられるオープンリーディングフレーム、ＢａｍＨＩの
下流に７ｂｐからＳａｌＩの３４ｂｐ上流にｂｉｏＤを
コードしていると考えられるオープンリーディングフレ
ーム（特願平３−１７４７５７号明細書参照）、さら
に、ＳａｃＩの上流４２９ｂｐから１３３ｂｐのあいだ
にプロモーター機能を有すると考えられる後記配列表の
配列番号：１に示す２８５塩基対の領域が存在してい
た。
【００３８】実施例３プロモーター機能を有するＤＮＡ断片の単離 （Ａ）ＤＮＡ領域の増幅に使用するプライマーＤＮＡの
合成 実施例２において決定したｂｉｏＡｂｉｏＤを含むＤＮ
Ａ断片の配列をもとに、ＳａｃＩサイトの上流４２９ｂ
ｐから１３３ｂｐの配列番号：１に示される２８５塩基
対の領域を増幅してクローニングするために、５′→
３′プライマーとして、５′−ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＧＴ
ＣＣＴＧＴＴＧＣＴＴＧＧＧＴＴＴＧ−３′（配列番
号：２）、３′→５′プライマーとして、５′−ＣＣＧ
ＧＡＴＣＣＴＴＴＣＣＴＣＣＧＴＣＡＣＴＴＧＧＴＴＴ
−３′（配列番号：３）の２８ｍｅｒをベックマン社製
ＤＮＡ合成機Ｓｙｓｔｅｍ−１ｐｌｕｓを用いて合成し
た。
合成 実施例２において決定したｂｉｏＡｂｉｏＤを含むＤＮ
Ａ断片の配列をもとに、ＳａｃＩサイトの上流４２９ｂ
ｐから１３３ｂｐの配列番号：１に示される２８５塩基
対の領域を増幅してクローニングするために、５′→
３′プライマーとして、５′−ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＧＴ
ＣＣＴＧＴＴＧＣＴＴＧＧＧＴＴＴＧ−３′（配列番
号：２）、３′→５′プライマーとして、５′−ＣＣＧ
ＧＡＴＣＣＴＴＴＣＣＴＣＣＧＴＣＡＣＴＴＧＧＴＴＴ
−３′（配列番号：３）の２８ｍｅｒをベックマン社製
ＤＮＡ合成機Ｓｙｓｔｅｍ−１ｐｌｕｓを用いて合成し
た。
【００３９】（Ｂ）プロモーター機能を有する断片の増
幅 反応液〔５０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ
（ｐＨ８．８），１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１００μｇ
／ｍｌゼラチン，２００μＭｄＮＴＰｓ，２５０ｐｍｏ
ｌプライマー〕に、２．５ｕｎｉｔｓのＴａｑポリメラ
ーゼ、１ｎｇのＤＮＡを添加し、ディネーチャー９４℃
１分間、アニーリング３７℃、２分間、ポリメライゼー
ション７２℃、３分間の反応を、ＤＮＡサーマルサイク
ラー４０８型（宝酒造社製）で２５回くりかえすことに
よりＤＮＡ断片を増幅させた。増幅ＤＮＡ断片の確認は
４％アガロースゲル電気泳動により２８５塩基対のＤＮ
Ａ断片を視認することにより行なった。
幅 反応液〔５０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ
（ｐＨ８．８），１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１００μｇ
／ｍｌゼラチン，２００μＭｄＮＴＰｓ，２５０ｐｍｏ
ｌプライマー〕に、２．５ｕｎｉｔｓのＴａｑポリメラ
ーゼ、１ｎｇのＤＮＡを添加し、ディネーチャー９４℃
１分間、アニーリング３７℃、２分間、ポリメライゼー
ション７２℃、３分間の反応を、ＤＮＡサーマルサイク
ラー４０８型（宝酒造社製）で２５回くりかえすことに
よりＤＮＡ断片を増幅させた。増幅ＤＮＡ断片の確認は
４％アガロースゲル電気泳動により２８５塩基対のＤＮ
Ａ断片を視認することにより行なった。
【００４０】実施例４プロモーター機能を有するＤＮＡ断片のプラスミドｐＰ
Ｒ３への導入 特開平３−１４７７９２号明細書の記載に基いて調製し
たプラスミドｐＰＲ３０．５μｇに制限酵素ＢａｍＨＩ
（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃で１時間反応させ、プラスミ
ドＤＮＡを完全に分解した。
Ｒ３への導入 特開平３−１４７７９２号明細書の記載に基いて調製し
たプラスミドｐＰＲ３０．５μｇに制限酵素ＢａｍＨＩ
（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃で１時間反応させ、プラスミ
ドＤＮＡを完全に分解した。
【００４１】実施例３で調製したプロモーター機能を有
するＤＮＡ断片とプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、制
限酵素を不活化するために６５℃で１０分間加熱処理し
た後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍ
Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
１．０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ及びＴ
４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強化
し、１６℃で１５時間保温した。この溶液を用いてエシ
ェリヒア・コリＨＢ１０１のコンピテントセル（宝酒造
社製）を形質転換した。
するＤＮＡ断片とプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、制
限酵素を不活化するために６５℃で１０分間加熱処理し
た後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍ
Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、
１．０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ及びＴ
４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強化
し、１６℃で１５時間保温した。この溶液を用いてエシ
ェリヒア・コリＨＢ１０１のコンピテントセル（宝酒造
社製）を形質転換した。
【００４２】形質転換株は５０μｇ／ｍｌ（最終濃度）
のカナマイシンを含むＬ培地〔トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、蒸留水１ｌ、ｐＨ７．
２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得られ
た。これら生育株のプラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法
〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ；“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ”（１９８２）９０〜９１参照〕により抽出し
た。
のカナマイシンを含むＬ培地〔トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、蒸留水１ｌ、ｐＨ７．
２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得られ
た。これら生育株のプラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法
〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ；“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ”（１９８２）９０〜９１参照〕により抽出し
た。
【００４３】得られたプラスミドは電気パルス法により
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）プラスミド除去株へ形質転換し、ア
ルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。このプ
ラスミドの制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ等
の制限酵素による切断パターンによってｐＰＲ３に前記
増幅ＤＮＡが組み込まれていることを確認し、このプラ
スミドを“ｐＰＲ３−ｂｉｏＡ”と命名した。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）プラスミド除去株へ形質転換し、ア
ルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。このプ
ラスミドの制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ等
の制限酵素による切断パターンによってｐＰＲ３に前記
増幅ＤＮＡが組み込まれていることを確認し、このプラ
スミドを“ｐＰＲ３−ｂｉｏＡ”と命名した。
【００４４】実施例５プロモーター強度の測定： 実施例４でｐＰＲ３に挿入し
たプロモーターの強度を、クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の活性を測定すること
によって調べた。
たプロモーターの強度を、クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の活性を測定すること
によって調べた。
【００４５】ｐＰＲ３を保有するブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３株とｐＰＲ３−ｂｉｏＡを保有す
るブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株をそれ
ぞれ、実施例１の（Ａ）項に記載の半合成培地Ａ培地に
カナマイシンを５０μｇ／ｍｌ加えた培地１０ｍｌの入
った試験管で一晩前培養し、その培養液を上記の培地１
００ｍｌの入った三角フラスコで約６時間培養後集菌
し、ＣＡＴの活性測定に用いた。ＣＡＴの活性はＷ．
Ｖ．Ｓｈａｗらの方法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
Ｊａｎ．（１９６８）２８〜３６参照〕により測定し
た。その結果、ｐＰＲ３−ｂｉｏＡを有するＭＪ−２３
３株は、プロモーターの挿入されていないｐＰＲ３を有
するＭＪ−２３３株の約１０倍のＣＡＴ活性をもってい
た。
フラバムＭＪ−２３３株とｐＰＲ３−ｂｉｏＡを保有す
るブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株をそれ
ぞれ、実施例１の（Ａ）項に記載の半合成培地Ａ培地に
カナマイシンを５０μｇ／ｍｌ加えた培地１０ｍｌの入
った試験管で一晩前培養し、その培養液を上記の培地１
００ｍｌの入った三角フラスコで約６時間培養後集菌
し、ＣＡＴの活性測定に用いた。ＣＡＴの活性はＷ．
Ｖ．Ｓｈａｗらの方法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
Ｊａｎ．（１９６８）２８〜３６参照〕により測定し
た。その結果、ｐＰＲ３−ｂｉｏＡを有するＭＪ−２３
３株は、プロモーターの挿入されていないｐＰＲ３を有
するＭＪ−２３３株の約１０倍のＣＡＴ活性をもってい
た。
【００４６】
配列番号：１ 配列の長さ：２８５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ブレビバクテリウム フラバム（Brevibacteri
um flavum ） 株名：ＭＪ２３３ 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐｒｏｍｏｔｅｒ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： AGTCCTGTTG CTTGGGTTTG ATCAAGGCCT AATCCACCGG CTGCAACATC AAAATACAGG 60 TAGTACACCA AGAGTGCTTG CATGCCGTAG AAGCTGAATC GCTCCCACAT TTCAATACTG 120 ATTATTGAGG TTGCGCTTTT GAACCTAACC CGTTGATCCA GTTGGACCAT GACTTCTCCT 180 AACAGAAAGC TGCGGCAATG AAAAACACTT AGTGCCAAAA ATTGAACACT GTTCAATTAA 240 CCTATTACAC TGCACATATG CAACCAAACC AAGTGACGGA GGAAA 285
um flavum ） 株名：ＭＪ２３３ 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐｒｏｍｏｔｅｒ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： AGTCCTGTTG CTTGGGTTTG ATCAAGGCCT AATCCACCGG CTGCAACATC AAAATACAGG 60 TAGTACACCA AGAGTGCTTG CATGCCGTAG AAGCTGAATC GCTCCCACAT TTCAATACTG 120 ATTATTGAGG TTGCGCTTTT GAACCTAACC CGTTGATCCA GTTGGACCAT GACTTCTCCT 180 AACAGAAAGC TGCGGCAATG AAAAACACTT AGTGCCAAAA ATTGAACACT GTTCAATTAA 240 CCTATTACAC TGCACATATG CAACCAAACC AAGTGACGGA GGAAA 285
【００４７】配列番号：２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： CCGGATCCAG TCCTGTTGCT TGGGTTTG 28
【００４８】配列番号：３ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： CCGGATCCTT TCCTCCGTCA CTTGGTTT 28
【図１】大きさが約４．０ｋｂのジアミノペラルゴン酸
アミノトランスフェラーゼ及びデスチオビオチンシンセ
ターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素
による切断点地図、および塩基配列決定のための戦略
図。
アミノトランスフェラーゼ及びデスチオビオチンシンセ
ターゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素
による切断点地図、および塩基配列決定のための戦略
図。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13）
Claims (1)
- 【請求項１】 コリネ型細菌内のジアミノペラルゴン酸
アミノトランスフェラーゼ及びデスチオビオチンシンセ
ターゼをコードする遺伝子に由来するコリネ型細菌内で
プロモーター機能を有する下記の塩基配列： AGTCCTGTTG CTTGGGTTTG ATCAAGGCCT AATCCACCGG CTGCAACATC AAAATACAGG 60 TAGTACACCA AGAGTGCTTG CATGCCGTAG AAGCTGAATC GCTCCCACAT TTCAATACTG 120 ATTATTGAGG TTGCGCTTTT GAACCTAACC CGTTGATCCA GTTGGACCAT GACTTCTCCT 180 AACAGAAAGC TGCGGCAATG AAAAACACTT AGTGCCAAAA ATTGAACACT GTTCAATTAA 240 CCTATTACAC TGCACATATG CAACCAAACC AAGTGACGGA GGAAA 285 を含むＤＮＡ断片。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5183595A JPH0731476A (ja) | 1993-07-26 | 1993-07-26 | コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するｄｎａ断片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5183595A JPH0731476A (ja) | 1993-07-26 | 1993-07-26 | コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するｄｎａ断片 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0731476A true JPH0731476A (ja) | 1995-02-03 |
Family
ID=16138573
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5183595A Pending JPH0731476A (ja) | 1993-07-26 | 1993-07-26 | コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するｄｎａ断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0731476A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1702980A1 (en) | 1999-07-01 | 2006-09-20 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum gene encoding Hpr of phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system |
| US7273721B2 (en) | 1999-06-25 | 2007-09-25 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in membrane synthesis and membrane transport |
| US7393675B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-07-01 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
| US7410766B2 (en) | 1999-07-01 | 2008-08-12 | Basf Se | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| US7439050B2 (en) | 1999-06-25 | 2008-10-21 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding diaminopimelate epimerase |
-
1993
- 1993-07-26 JP JP5183595A patent/JPH0731476A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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