JPH0556782A

JPH0556782A - 遺伝子発現調節ｄｎａ

Info

Publication number: JPH0556782A
Application number: JP3221885A
Authority: JP
Inventors: Ryoichi Katsumata; 瞭一勝亦; Yutaka Takano; 裕高野
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1991-09-02
Filing date: 1991-09-02
Publication date: 1993-03-09
Anticipated expiration: 2015-04-24
Also published as: CA2077308A1; EP0530765B1; EP0530765A2; DE69217144D1; US5700661A; DE69217144T2; EP0530765A3; KR100221343B1; ATE148500T1; JP3036912B2; US5439822A; KR930006155A; TW260709B; CA2077308C

Abstract

(57)【要約】【目的】遺伝子発現調節ＤＮＡおよびそれを用いたタ
ンパク質の製造法を提供する。【構成】コリネ型細菌のイソクエン酸リアーゼ（ＩＣ
Ｌ）遺伝子に由来するＤＮＡであって、タンパク質をコ
ードする構造遺伝子とともにベクターＤＮＡに組み込ま
れ、宿主コリネ型細菌に導入されたときに、該構造遺伝
子の発現を調節する作用を有するＤＮＡおよびそれを用
いて有用タンパク質を効率よく製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はコリネ型グルタミン酸生
産菌に由来するＤＮＡであって、構造遺伝子の発現を調
節する作用を有する新規ＤＮＡおよびそれを利用して有
用蛋白質を効率よく生産する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】組換えＤＮＡ技術が発展し、異種生物の
作る有用なポリペプチドを各種微生物に生産させること
が可能となっている。しかし、外来遺伝子にもとづいて
生産される遺伝子産物が宿主にとって有害である場合、
宿主の増殖初期から該外来遺伝子を発現させると宿主は
死滅あるいは増殖阻害を受け、該遺伝子産物を多量に作
らせることが困難である。このような不都合を回避する
ためには、宿主微生物の増殖が終了した後に、外来遺伝
子の発現を誘導する発現系が必要となる。宿主として最
もよく使われている大腸菌では、特定の化合物あるいは
物理的条件に応答して作動するプロモーターを利用した
遺伝子の誘導発現系〔Goeddel, D., et.al.,プロシーデ
ィング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス (Proc. Natl. Acad. Sci.) U.S.A., 76 ,106
(1979)、 Edman, J. C., et. al.,ネイチャー(Nature),
291, 503(1981)、 Shimatake, H., et. al.,ネイチャー
(Nature), 292 , 128(1981)〕が確立されており、この
系を用いて多岐にわたる有用蛋白質が生産されている。

【０００３】一方、組換えＤＮＡ技術は各種のアミノ酸
およびプリンヌクレオチド等の発酵生産に使用されてい
るコリネ型細菌にも適用可能であり、工業的に実績のあ
るこれらの菌種で有用蛋白質を生産させるための検討が
行われている。これまでに、コリネ型グルタミン酸生産
菌で機能するプロモーター検出用ベクターを用いて、レ
ポーター遺伝子を構成的に発現させる該菌種のプロモー
ターが得られている（特開昭63−273469）が、発現を制
御できるプロモーターについては知られていない。コリ
ネ型細菌で人為的に外来遺伝子の発現を調節する方法に
ついては、前述した大腸菌において外来遺伝子の発現を
誘導できる大腸菌のプロモーターをそのままコリネ型グ
ルタミン酸生産菌に適用し、該菌種でクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を誘導発現させ
た例がある（特開昭62−151184）。しかし、この発現方
法は大腸菌を宿主とした場合に比べて遺伝子産物の蓄積
量が少なく十分に強力な発現方法とは言い難い。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、コリネ型細菌
において有用遺伝子産物を効率よく生産させるために
は、該宿主で機能し人為的に構造遺伝子の発現を調節で
きる作用を有するＤＮＡを取得する必要がある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、コリネ型
グルタミン酸生産菌において培地などの環境条件によっ
て発現が調節される遺伝子を鋭意検索した結果、該菌種
の有するイソクエン酸リアーゼ（以下ＩＣＬと表す）遺
伝子の発現が、培地中の炭素源をグルコース、シューク
ロース、マルトース等の糖質にしたときに抑制され、培
地中の炭素源を酢酸、乳酸、エタノール等の非糖質にし
たときまたは糖質非存在培地で誘導され、その発現レベ
ルが極めて高いことを見出した。この遺伝子に着目して
ＩＣＬ遺伝子をコードするＤＮＡ断片をクローン化し、
該遺伝子の発現を調節する作用を有するＤＮＡの塩基配
列を決定したところ、該ＤＮＡは新規なＤＮＡであるこ
とおよびこれを用いて所望の遺伝子をコリネ型細菌で効
率よく発現させることができることを見出し、これに基
づいて本発明を完成するに至った。

【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明
は、コリネ型細菌のＩＣＬ遺伝子に由来するＤＮＡであ
って、タンパク質をコードする構造遺伝子とともにベク
ターＤＮＡに組み込まれ、宿主コリネ型細菌に導入され
たときに、該構造遺伝子の発現を調節する作用を有する
ＤＮＡ（以下、ＩＣＬプロモーターと表す）、および該
ＩＣＬプロモーターとタンパク質をコードする構造遺伝
子とがベクターＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡを含
む形質転換体を培地に培養し、培養物中に該タンパク質
を生成蓄積させ、該培養物から該タンパク質を採取する
ことを特徴とするタンパク質の製造法に関する。

【０００７】上記のＩＣＬプロモーターは、構造遺伝子
の発現が培地中の炭素源を糖質にしたときに抑制され、
培地中の炭素源を非糖質にしたときまたは糖質非存在培
地で誘導されるという発現制御特性を有している。本発
明のＩＣＬプロモーターおよびＩＣＬ構造遺伝子を含む
ＤＮＡは、コリネ型細菌のうちグルタミン酸生産性を有
し、分類学上近縁性の高いいわゆるコリネ型グルタミン
酸生産菌から分離採取することができる。コリネ型グル
タミン酸生産菌であればいずれも使用できるが、好適に
は下記の菌株が用いられる。

【０００８】コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１３８７０コリネバクテリウム・アセトグルタミクムＡＴＣＣ１５８０６コリネバクテリウム・カルナエＡＴＣＣ１５９９１コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６８コリネバクテリウム・メラセコーラＡＴＣＣ１７９６５コリネバクテリウム・リリウムＡＴＣＣ１５９９０ブレビバクテリウム・イマリオフィラムＡＴＣＣ１４０６８ブレビバクテリウム・サッカロリティクムＡＴＣＣ１４０６６ブレビバクテリウム・チオゲニタリスＡＴＣＣ１９２４０ブレビバクテリウム・ディバリカツムＡＴＣＣ１４０２０ブレビバクテリウム・フラブムＡＴＣＣ１４０６７ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９ブレビバクテリウム・ロゼウムＡＴＣＣ１３８２５ミクロバクテリウム・アンモニアフィラムＡＴＣＣ１５３５４

【０００９】コリネ型グルタミン酸生産菌からの染色体
ＤＮＡの抽出は、例えば特開昭58−126789に記載の方
法、あるいはこれに準じた方法によって行われる。この
染色体ＤＮＡからＩＣＬ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を
単離するには、適当な制限酵素で処理した染色体ＤＮＡ
を、同じ制限酵素あるいは同じ接着末端を生じさせる制
限酵素で処理したプラスミドあるいはファージＤＮＡに
組み込んだ後、該組換えＤＮＡで微生物を形質転換し、
目的のＤＮＡ断片を含む組換えＤＮＡを含有するクロー
ンを分離することによって達成される。

【００１０】例えば、形質転換宿主として大腸菌を、ベ
クターとしてプラスミドを使用する場合には、コロニー
ハイブリダイゼーション〔Hanahan, D. et. al., ジー
ン(Gene), 10, 63(1980)〕を用い、ＩＣＬのアミノ酸配
列の一部をコードする合成ＤＮＡと対合するＤＮＡ断片
を含有する形質転換体を検出することによって、ＩＣＬ
遺伝子を含むＤＮＡ断片をプラスミドベクター上に有す
るクローンを分離することができる。プローブとして使
う合成ＤＮＡは、例えばＩＣＬを分離後、Ｎ末端部分の
アミノ酸配列を決定し、その配列に対応するポリヌクレ
オチドを公知の方法〔M. H. Caruther et.al.,ケミカル
・シンセシス・オブ・タイトル・ジーン・フラグメンツ
( Chemical Synthesis of Gene Fragments ) a Laborat
orymanual, Verlag, Chemie(1982)〕で化学合成したも
のを用いればよい。この大腸菌でのクローン化に要する
一連の基本操作は公知であり、モレキュラー・クローニ
ング(Molecular Cloning)(1982)コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Labora
tory)編著に詳しく記載されている。

【００１１】上記の方法で得られたクローン化断片が、
ＩＣＬプロモーターおよびＩＣＬをコードする構造遺伝
子を保持するかどうかは、コリネ型グルタミン酸生産菌
に導入することによって確認することができる。そのた
めに、クローン化断片を挿入した上記大腸菌プラスミド
にコリネ型グルタミン酸生産菌で自律複製できるベクタ
ーを連結するか、あるいはクローン化断片を該コリネ型
グルタミン酸生産菌用ベクターに組み込んだ組換えＤＮ
Ａを作成する。これらの組換えＤＮＡは、invitro で組
換えた後、コリネ型グルタミン酸生産菌を形質転換し、
目的の構造を有するプラスミドを含有する形質転換体を
得ることによって調製できる。なお、コリネ型グルタミ
ン酸生産菌用ベクターとしては、該菌種において自律複
製能を有するものであればいかなるものでもよく、例え
ばｐＣＧ１（特開昭57−134500）、ｐＣＧ２（特開昭58
−35197 ）、ｐＣＧ４（特開昭57−183799）、ｐＡＭ３
３０（特開昭58−67699 ）、ｐＡＧ１、ｐＡＧ３、ｐＡ
Ｇ１４、ｐＡＧ５０（特開昭62−166890）あるいはそれ
らから誘導されるプラスミドが使用可能である。コリネ
型グルタミン酸生産菌からプラスミドを調製するには、
例えば特開昭57−134500に記載された方法が用いられ
る。また、コリネ型グルタミン酸生産菌の形質転換は、
プロトプラストを使用する方法（例えば特開昭57−1864
92）あるいはエレクトロポレーション法〔アプライド・
ミクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー(App
l.Microbiol.Biotechnol.) ，30, 283(1989) 〕によっ
て行われる。

【００１２】上記で調製した組換えＤＮＡでコリネ型グ
ルタミン酸生産菌のＩＣＬ活性欠損変異株を形質転換
し、該形質転換株がＩＣＬ合成能を獲得していれば、ク
ローン化断片上にＩＣＬ遺伝子が存在することを確認す
ることができる。ＩＣＬ活性を保有する野生株を形質転
換した場合にも、形質転換体が酢酸、乳酸、エタノール
等の非糖質を培地中の炭素源として培養したとき、また
は糖質非存在培地で培養したときに宿主自体より高レベ
ルのＩＣＬ活性を発現することを指標にしてＩＣＬ遺伝
子の存在が確認される。これらの形質転換体からプラス
ミドを抽出し、制限酵素で切断後、アガロースゲル電気
泳動によって挿入されたＩＣＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片
を単離することができる。

【００１３】このＩＣＬ遺伝子含有ＤＮＡ断片をサブク
ローン化し、各種の縮小化断片を含む欠失プラスミドの
ＩＣＬ活性付与能あるいは増幅能を調べることによりＩ
ＣＬ遺伝子の存在をさらに限定することができる。ＩＣ
Ｌ遺伝子を含むＤＮＡ断片塩基配列はジデオキシヌクレ
オチド合成鎖停止法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー(J.Mol.Biol.)，94, 441(1975) 〕ある
いはマキサム・ギルバート法〔プロシーディング・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Pro
c.Natl.Acad.Sci.), 74 ,560(1977) 〕などの方法を用
いて決定できる。ＤＮＡ塩基配列上でＩＣＬのＮ末端ア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を見出すことによっ
て、解読されるオープンリーディングフレームが推定さ
れる。オープンリーディングフレームの存在に基づき、
ＩＣＬプロモーター活性を含む領域はそのオープンリー
ディングフレームの上流に存在していることがわかる。

【００１４】このような解析によって、例えば実施例に
示したコリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032 の
場合、該菌株のＩＣＬプロモーター活性は配列番号３に
示すＤＮＡ塩基配列のうち、第１番目から第５１３番目
までの配列に含まれていると特定することができる。本
発明のＩＣＬプロモーター活性は、このＤＮＡ配列に限
定されず、プロモーター活性を損なわない範囲で一部を
削除あるいは改変しても構わない。

【００１５】ＩＣＬプロモーター活性を有するＤＮＡ断
片の下流に、各種構造遺伝子さらに転写を終止させるタ
ーミネーターを配したＤＮＡを前述のコリネ型グルタミ
ン酸生産菌で自律複製できるプラスミドに組み込むこと
により、発現ベクターが得られる。ターミネーターとし
ては、ＩＣＬ遺伝子のターミネーターが好ましいが、コ
リネ型グルタミン酸生産菌の他の遺伝子のターミネータ
ーあるいは大腸菌および枯草菌遺伝子由来のρ−因子非
依存性のターミネーター〔アニュアル・レビュー・オブ
・ジェネティックス(Ann. Rev. Genet.), 13 , 319(197
9)〕も使用できる。構造遺伝子としては、β−ガラク
トシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ、ＩＣＬなどの酵素類、あるいはインシュリ
ン、成長ホルモン、α−，β−またはγ−インターフェ
ロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などの生
理活性蛋白質が挙げられる。

【００１６】上記の発現ベクターで宿主を形質転換し、
該形質転換体を培養することによって、目的とする遺伝
子産物を取得することができる。宿主としては、前記の
コリネ型グルタミン酸生産菌が好ましいが、その他のコ
リネ型細菌も使用することができる。培地中の炭素源と
して酢酸、乳酸などの非糖質を用い、その他に窒素源、
無機物、ビタミンなどを含有する培地で形質転換体を培
養することによって、目的の遺伝子産物を培地中に蓄積
させることができる。あるいは形質転換体をグルコー
ス、シュークロース、マルトースなどの糖質を炭素源と
して含む培地でまず増殖させ、糖質が消費されたところ
で、上記の非糖質炭素源を添加または糖質非存在培地を
用いて、さらに培養を継続しても遺伝子産物を取得する
ことができる。

【００１７】培養は通気あるいは攪拌しながら好気的条
件下で行う。通常、培養中、培地のｐＨを中性付近に維
持することが好ましい。培養温度、時間などの条件は宿
主微生物の増殖および形質転換体の遺伝子産物の産生が
最高になるように設定されるが、一般に温度は１５〜４
０℃、時間は４〜７２時間が好適である。培養物中に蓄
積された遺伝子産物は、公知の方法、例えば機械的破砕
法、あるいは溶菌酵素を用いる方法などによって、菌体
を破砕して抽出される。抽出液から目的の遺伝子産物を
分離精製するには、通常用いられる蛋白質の精製方法、
例えば沈澱剤による沈澱法、透析法、電気泳動法、イオ
ン交換樹脂などによるクロマトグラフ法、ゲル濾過法、
抗体カラムを用いる方法などを組み合わせて行うことが
できる。

【００１８】以下に、実施例を挙げて更に具体的に本発
明を説明する。

【００１９】

【実施例】

実施例１コリネ型グルタミン酸生産菌のＩＣＬ遺伝子
の発現様式コリネ型グルタミン酸生産菌であるコリネバクテリウム
・グルタミクムATCC13032 、コリネバクテリウム・アセ
トアシドフィラムATCC13870 、コリネバクテリウム・カ
ルナエATCC15991 、コリネバクテリウム・ハーキュリス
ATCC13868 、コリネバクテリウム・リリウムATCC15990
、ブレビバクテリウム・イマリオフィラムATCC14068
、ブレビバクテリウム・ディバリカツムATCC14020 、
ブレビバクテリウム・フラブムATCC14067 、ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムATCC13655 およびミク
ロバクテリウム・アンモニアフィラムATCC15354 各一白
金耳をＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス５
ｇ、グルコース１０ｇを水１リットルに含みｐＨ7.２に
調整した培地）に植菌し、３０℃で１６時間振とう培養
し増殖させた。この種培養液0.８mlを、酢酸を炭素源と
する半合成培地ＭＡＹＥ培地〔酢酸アンモニウム２０
ｇ、(NH₄)₂SO₄１０ｇ、尿素３ｇ、酵母エキス１ｇ、KH
₂PO₄１ｇ、MgSO₄・7H₂O 0.４ｇ、FeSO₄・7H₂O ２mg、
MnSO₄・4H₂O ２mg、ビオチン６０μｇ、サイアミン塩酸
塩２mg、NaCl５０mgを水１リットルに含みｐＨ7.２に調
整した培地〕およびシュークロースを炭素源とするＭＳ
ＹＥ培地〔シュークロース２０ｇ、(NH₄)₂SO₄１０ｇ、
尿素３ｇ、酵母エキス１ｇ、KH₂PO₄１ｇ、MgSO₄・7H₂O
0.４ｇ、FeSO₄・7H₂O ２mg、MnSO₄・4H₂O ２mg、ビオ
チン６０μｇ、サイアミン塩酸塩２mg、NaCl２０mgを水
１リットリに含みｐＨ7.２に調整した培地〕にそれぞれ
接種し、３０℃にて１６時間培養した。

【００２０】菌体を集菌し、１００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ7.０）で２回洗浄後、同緩衝液５mlに懸濁した。
菌液を氷冷しながら超音波破砕器（ＴＯＭＹ社製ペンシ
ル型ソニック）で１５分間破砕処理した。処理液を４℃
にて１０分間遠心（14000 ×g)し、上清を細胞抽出液と
して回収した。

【００２１】この細胞抽出液中のＩＣＬ活性を、イソク
エン酸を基質として生成するグリオキシル酸を定量する
方法〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J.Bioch
em.), 64, 355(1968) 〕によって測定した。予め３０℃
に保温した反応液〔Tris-HCl0.14M(pH7.5)、MgSO₄・7H₂
O ２０mM、グルタチオン２０mM〕2.０mlに、蛋白量３０
μｇに相当する細胞抽出液と２０μl の0.４Ｍイソクエ
ン酸溶液を加えて反応を開始し、３０℃で１０分間反応
させた。反応液に１mlの0.５Ｍシュウ酸溶液を加えて反
応を停止させた。さらに0.５mlの１％フェニルヒドラジ
ン溶液を加えて７０℃、１０分間加熱後、氷水中で５分
間冷却した。次いで、２mlの濃塩酸と0.５mlの0.５％フ
ェリシアン化カリウム溶液を加えて発色させ、日立比色
計（モデル１００−２０）で５２０nmの吸光度を測定し
た。１分間に１μmol のグリオキシル酸の生成を触媒す
る酵素活性を１単位（Ｕ）とし、蛋白質１mg当りの比活
性を算出し、その結果を表１に示した。蛋白量は、プロ
ティン・アッセイキット（バイオラッド社製）を用いて
定量した。

【００２２】その結果、いずれの菌株においても、ＭＳ
ＹＥ培地で培養した菌体にはＩＣＬ活性は微弱かあるい
は検出されなかったが、ＭＡＹＥ培地で培養した菌体に
は高レベルのＩＣＬ活性が認められた。グルコース、マ
ルトース、グルコン酸などの糖質を炭素源とした培地で
培養した場合にも、シュークロース含有培地の場合と同
様にＩＣＬ活性は微弱かあるいは検出されなかった。炭
素源として乳酸、エタノール、ピルビン酸などの非糖質
を含む培地で培養した時には、酢酸含有培地の場合と同
レベルのＩＣＬ活性が検出された。

【００２３】以上の結果から、試験に用いた全てのコリ
ネ型グルタミン酸生産菌のＩＣＬ遺伝子は培地中、糖質
を炭素源として培養したときには発現抑制され、非糖質
炭素源で培養したときに誘導発現されることが判明し
た。上記の各種細胞抽出液をラムリィの方法〔ネイチャ
ー(Nature), 227 ,680(1970)〕によるSDS-ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（SDS-PAGE) で解析した。１５μｇ
相当の蛋白質を含む細胞抽出液を１０％アクリルアミド
ゲルに載せ、電気泳動後、ゲルを染色液（クマシーブル
ーR250 0.１％、メタノール５０％）で染色し、次いで
脱色液（メタノール４０％、酢酸１０％）で脱色して、
染色された蛋白質を観察した。

【００２４】その結果、上記グルタミン酸生産菌中一例
を除いた全ての菌株において、ＭＡＹＥ培地で培養した
菌体中には、約４８キロダルトン(kDa) の大きさを有す
るＩＣＬ蛋白が著量存在することが確認された。一方、
コリネバクテリウム・カルナエATCC15991 についてもＭ
ＡＹＥ培地で培養した菌体中にのみＩＣＬ蛋白の著量生
成が認められたが、その蛋白質のサイズは約５２kDa で
あった。しかし、いずれの菌株の場合も、ＭＳＹＥ培地
で培養した菌体中には４８kDa あるいは５２kDa のＩＣ
Ｌ蛋白は殆ど存在していなかった。

【００２５】さらに、生成した４８kDa あるいは５２kD
a のＩＣＬ蛋白の全菌体蛋白に占める割合を求めるため
に、一次元のデンシトメーター（島津製作所社製 model
UV265 ）を用いて染色ゲルを一方向に走査し、色素濃
度の分布を可視吸収 (560nm)の度合いで測定した。その
結果、ＭＡＹＥ培地で培養した菌体中に、４８kDa ある
いは５２kDa のＩＣＬ蛋白が全菌体蛋白の５〜１０％相
当量占めることが分かった。なお、ＭＳＹＥ培地で培養
した菌体中にはこれらの蛋白質の存在は殆ど検出されな
かった。

【００２６】また、上記の各種細胞抽出液をコリネバク
テリウム・グルタミクムATCC13032のＩＣＬ蛋白に対す
る抗体を用いたウエスタン・ブロット法〔Towbin, H.,
プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス(Proc.Natl. Acad. Sci.) U.S.A.,
76, 4350(1979)〕による解析を行った。上記で調製した
各種コリネ型グルタミン酸生産菌の細胞抽出液をSDS-ポ
リアクリルアミドゲルに載せ、泳動を行った後、ゲルの
上にブロッティング緩衝液〔２５mM Tris-HCl、192mM
グリシン( pH8.3 ) 〕に浸したメンブランフィルター
（クリアブロットＰ膜、アトー社製）を置いた。これを
ブロッティング緩衝液に浸した濾紙（ワットマン社製 3
MM）ではさんで、転写装置（アトー社製）にセットし、
１８０mA定電流で１時間転写を行った。転写後、フィル
ターを１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含むＴＢＳ緩
衝液〔２０mM Tris-HCl 、0.5M NaCl( pH7.5 )〕に浸し
室温で１時間置いた。

【００２７】一方、コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032 をＭＡＹＥ培地で生育させた菌体の細胞抽出
液をSDS-ポリアクリルアミドゲルに載せ泳動を行った
後、ゲルから４８kDa 蛋白質に相当する位置を切取り、
0.０５％Tween20 を含むＴＢＳ緩衝液に懸濁した。この
懸濁液の上清を分取し、マウスに注射してポリクローナ
ル抗体（４８kDa 蛋白質抗体）を作製した。

【００２８】上記の転写処理したフィルターを４８kDa
蛋白質抗体および１％ＢＳＡを含むＴＢＳ緩衝液に浸
し、４℃に一晩置いた。さらに、フィルターを0.05％Tw
een20を含むＴＢＳ緩衝液で３回洗った後、抗マウスIgG
-ペルオキシダーゼ（ダコ社製）および１％ＢＳＡを含
むＴＢＳ緩衝液に室温で振とうしながら浸した。１時間
後、フィルターを0.０５％Tween20 を含むＴＢＳ緩衝液
で洗浄した。このフィルターを４−クロロ−１−ナフト
ール（バイオラッド社製）６０mgを溶かした２０mlのメ
タノールと、６０μｌの過酸化水素水を含む１００mlの
ＴＢＳ緩衝液とを混ぜた液に浸し発色反応を行った。４
８kDa 蛋白質抗体は、コリネバクテリウム・グルタミク
ムATCC13032 だけでなく、コリネバクテリウム・アセト
アシドフィラムATCC13870 、コリネバクテリウム・ハー
キュリスATCC13868 、コリネバクテリウム・リリウムAT
CC15990 、ブレビバクテリウム・イマリオフィラムATCC
14068 、ブレビバクテリウム・ディバリカツムATCC1402
0 、ブレビバクテリウム・フラブムATCC14067 、ブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13655 、ミク
ロバクテリウム・アンモニアフィラムATCC15354 の４８
kDa のＩＣＬ蛋白質およびコリネバクテリウム・カルナ
エATCC15991 の５２kDa のＩＣＬ蛋白質と反応した。こ
のことから、これら蛋白質が同一あるいは極めて類似性
のあることがわかった。

【００２９】実施例２コリネバクテリウム・グルタミ
クムATCC13032 のＩＣＬ遺伝子のクローニング（１）ＩＣＬ蛋白質のＮ末端アミノ酸配列の決定コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032 の細胞抽
出液には、４８kDa 付近にその他の蛋白質が殆ど検出さ
れないので、SDS-PAGEで４８kDa のＩＣＬ蛋白を分離
後、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。

【００３０】実施例１と同様に、ＭＡＹＥ培地で培養し
たコリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032 の菌体
抽出液を調製し、その３μl をSDS-PAGEにかけた。泳動
後、ゲルを転写用緩衝液〔１０mM3- シクロヘキシルア
ミノ-1- プロパンスルホン酸、１０％メタノール(pH11.
0)〕に室温で５分間浸した。トービンらの方法〔プロシ
ーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス( Proc.Natl. Acad. Sci.) U.S.A., 76 ,
4530(1979) 〕に従ってゲルの蛋白を予めメタノールに
浸したPVDF膜 (Millipore 社製、0.45μm ポアサイズ)
に転写した。PVDF膜を脱イオン水で５分間洗浄後、クマ
シー染色液（0.１％クマシーブルー R250 、50% メタノ
ール) 中で５分間染色し、次いで脱色液（40% メタノー
ル、10%酢酸) に５分間浸して脱色した。さらに、PVDF
膜を脱イオン水に 5分間浸して洗浄した後、風乾した。
この膜上で染色された４８kDa のＩＣＬ蛋白を切り出
し、マツダイラらの方法〔ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.), 262 , 10035
(1987) 〕に従い、Ｎ末端アミノ酸配列の決定を行っ
た。

【００３１】すなわち、膜上に転写されたＩＣＬ蛋白質
を用いてプロテインシークエンサー（アプライド・バイ
オシステム社製 model 470)によるエドマン分解を行
い、該蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を分析した結果、配
列番号１で表されるアミノ酸配列が同定された。

【００３２】（２）オリゴヌクレオチドプローブの合成上記で決定したアミノ酸配列に対応する塩基配列（配列
番号２）を有するオリゴヌクレオチドを、アプライド・
バイオシステム社製オリゴヌクレオチド合成機（Model
38OA) を用いたホスホラミダイト法〔M. H. Caruther e
t. al.ケミカル・シンセシス・オブ・タイトル・ジーン
・フラグメンツ(Chemical Synthesis ofGene Fragment
s), a Laboratory manual, Verlag, Chemi(1982)〕に
より合成した。

【００３３】この５０mer オリゴヌクレオチドプローブ
を〔γ³²〕ＡＴＰ（アマシャム3000Ci/mmol)を用いて5'
-ラベル化した。0.２μｇのプローブＤＮＡを含む１５
μｌのキナーゼ緩衝液〔50mM Tris-HCl 、10mM MgC
l₂、５mM DTT, 0.1mM EDTA(pH 7.6)〕に１０単位のＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を添加し、
３７℃で３０分間反応させた。さらに、フェノール抽出
した反応液をセファデックスＧ５０を用いたゲル濾過に
供し、5'末端がラベル化されたプローブを得た。

【００３４】（３）コロニーハイブリダイゼーション法
によるＩＣＬ遺伝子含有断片のクローニングＮＢ培地で培養したコリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032 の種培養液0.８mlを４０mlＳＳＭ培地〔グル
コース20g 、(NH₄)₂SO₄10g 、尿素 3g 、酵母エキス 1
g 、KH₂PO₄1g、MgSO₄・7H₂O 0.4g 、FeSO₄・7H₂O 2m
g 、MnSO₄・4H₂O 2mg 、ビオチン60μg 、サイアミン塩
酸塩 2mg、NaCl 50mg を水 1リットルに含みpH7.2 に調
整した培地〕に接種して３０℃で振とう培養した。日立
比色計（model 100-20) で６６０nmにおける吸光度（O
D）を測定し、ＯＤが0.２になった時点で培養液へ0.５
単位／mlの濃度となるようにペニシリンＧを添加した。
さらに、培養を継続し、ＯＤが0.６になるまで生育させ
た。培養液から菌体を集菌し、ＴＥＳ緩衝液〔0.03M Tr
is-HCl、0.005M EDTA、0.05M NaCl(pH8.0) 〕で洗浄
後、リゾチーム液〔25% シュークロース、0.1M NaCl 、
0.05M Tris-HCl、0.8mg/mlリゾチーム(pH8.0) 〕１０ml
に懸濁し、３７℃で２時間保温した。集菌した菌体から
サイトウらの方法〔バイオケミカ・エト・バイオフィジ
カ・アクタ(Biochem. Biophys. Acta.),72, 619(1963)
〕に従って高分子染色体ＤＮＡを単離した。一方、ｐ
ＵＣ１９（宝酒造社製）を保有するE.coli ATCC33694か
ら常法に従ってビルボイムらの方法〔ヌクレイック・ア
シッド・リサーチ(Nucleic.Acids. Res.), 7,1513(197
9) 〕によりｐＵＣ１９を調製した。

【００３５】コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13
032 の染色体ＤＮＡ５μｇを含む緩衝液Ｂ〔10mM Tris-
HCl (pH7.5) 、50mM NaCl 、10mM MgCl₂、1mM DTT 〕9
8μlに20単位のHind IIIを添加し、３７℃で２時間反応
させた。一方、ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ１μｇを含
む緩衝液Ｂ４8.５μｌに５単位のHind IIIを添加し３
７℃で１時間反応させた。これら反応物を混合した後、
フェノール抽出、エタノール沈澱を行ってＤＮＡを回収
した。このＤＮＡ全量をライゲーション緩衝液〔20mM T
ris-HCl (pH7.6) 、10mM MgCl₂、10mM DTT、1mM ATP
〕５９μｌに溶解し、さらに３５０単位のＴ４リガー
ゼを添加後、１６℃で１５時間反応させ連結処理した。

【００３６】このＤＮＡ反応液を用いてダジェルトらの
方法〔ジーン(Gene), 6 , 23(1979) 〕によりE.coli A
TCC33694を形質転換した。アンピシリン１００μｇ／ml
を含有するＬＢプレート〔1%トリプトン、0.5%酵母エキ
ス、0.5%NaCl (pH7.4) 〕上にニトロセルロースフィル
ター(Gelman Science 社製、Bio Trace^TMNT) をかぶ
せ、その表面に形質転換細胞を塗布した。プレートを３
７℃にて１６時間置いた後、フィルター上に形成された
コロニーを２枚のニトロセルロースフィルターにレプリ
カし、計３枚のフィルターをアンピシリン１００μｇ／
mlを含有するＬＢプレート上に移して３７℃で６時間増
殖させた。レプリカした２枚のニトロセルロースフィル
ターを、さらに２５０μｇ／mlのクロラムフェニコール
および１００μｇ／mlのアンピシリンを含有するＬＢプ
レートに移し、３７℃で１６時間培養後、0.5M NaOH
液、1.0M Tris-HCl (pH7.5) 液、1.5M NaCl-0.5MTris-H
Cl(pH7.5)液および 2×SSC 液〔0.3M NaCl 、0.03M Na₃
-citrate (pH7.0)〕を浸したワットマン 3MM 濾紙の上
に逐次移してゆき、コロニーから露出したＤＮＡを変性
させた。さらに風乾後、８０℃で３時間加熱して、フィ
ルター上にＤＮＡを固定させた。一方、残りの１枚のフ
ィルターはプレートに乗せたまま４℃で保存した。

【００３７】遺伝子ライブラリーが固定化されたレプリ
カフィルターを、３×SSC 液〔0.45M NaCl、0.045M Na₃
-citrate (pH7.0)〕中で６５℃で３０分間浸した後、１
×デンハルト液（0.2%フィコール、0.2%ポリビニルピロ
リドン、0.2%BSA ）中に移して６５℃で１時間置いた。
フィルターをプレハイブリダイゼーション緩衝液〔１×
デンハルト液、１M NaCl、50mM Tris-HCl (pH8.0) 、10
mM EDTA 、0.1%SDS 、100 μg/ml変性サケ精子ＤＮＡ〕
が入ったポリプロピレン製の袋に入れ６５℃で３時間前
処理した後、放射ラベルされた５０mer オリゴヌクレオ
チドプローブ〔実施例２（２）〕0.２μｇを加え、４０
℃で１６時間ハイブリダイゼーション処理した。フィル
ターをいずれも６×SSC 液〔0.9M NaCl 、0.09M Na₃-ci
trate、(pH7.0) 〕中で、順次、４℃で５分間処理を２
回、５２℃で３０分間処理を２回、４℃で５分間処理を
２回ずつ行い洗浄した。フィルターを風乾後、Ｘ線フィ
ルム（フジフィルム社製）に密着させ感光させた。

【００３８】このようにして、約8500株のクローンの中
からハイブリダイズするコロニーを１個見出した。さら
に、このコロニーに対応する保存プレート上から単集落
分離されたクローンについて再試験した結果、6.0 キロ
ベース(kb)のHindIII 断片をｐＵＣ１９のHindIII 部位
に挿入した構造を有していた。このプラスミドをpKT4と
命名した。

【００３９】実施例３ＩＣＬ遺伝子増幅株におけるＩ
ＣＬ遺伝子の発現（１）コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032(pK
T10)のＩＣＬ遺伝子の発現前記のクローン化断片上にＩＣＬ遺伝子が含まれること
を明らかにするために、ｐＫＴ４をコリネ型細菌のベク
ターｐＣＧ１１６（特開平1-265892)に挿入した。ｐＣ
Ｇ１１６は、ｐＣＧ１１６を保有するコリネバクテリウ
ム・グルタミクムATCC13032 の培養菌体から次の方法で
単離した。スペクチノマイシン 100μg/mlを含有するＮ
Ｂ培地で増殖させたｐＣＧ１１６を保有するコリネバク
テリウム・グルタミクムATCC13032 の種培養液８mlを、
スペクチノマイシン 100μg/mlを含有する 400ml SSM培
地に接種し、３０℃にて振とう培養した。ＯＤが0.２に
なった時点で、培養液へ0.５単位／mlの濃度となるよう
にペニシリンＧを添加した。さらに、培養を継続し、Ｏ
Ｄが0.６になるまで生育させた。菌体を集菌しＴＥＳ緩
衝液で洗浄後、リゾチーム液１０mlに懸濁し３７℃で４
時間反応させた。反応液に5M NaCl 2.4ml 、0.5M EDTA
(pH8.5) 0.６ml、4%ラウリル硫酸ナトリウムおよび0.７
M NaClからなる溶液4.４mlを順次添加し、穏やかに混和
してから氷水上に１５分間置いた。溶菌物を遠心管に移
し、４℃で６０分間、69,400×ｇの遠心分離にかけ上清
液を回収した。これに重量百分率１０％相当のポリエチ
レングリコール(PEG 6000)を加え、静かに混和して溶解
後氷水上に置いた。１０時間後、1,500 ×ｇで10分間遠
心分離してペレットを回収した。ＴＥＳ緩衝液５mlを加
えてペレットを再溶解してから1.５mg／mlエチジウムブ
ロマイド2.０mlを添加し、さらに塩化セシウム7.５ｇを
加えて静かに溶解し密度を1580に合わせた。この溶液を
105,000 ×ｇ、１８℃で４８時間超遠心分離にかけ、紫
外線照射下に検知される遠心チューブ下方の密度の高い
バンドを遠心チューブ側面から注射器で抜き取ることに
よって、ｐＣＧ１１６プラスミドＤＮＡを分離した。こ
の分画液を等容量のイソプロピルアルコール液（容量百
分率 90% イソプロピルアルコール、10%TES緩衝液) で
５回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その
後にＴＥＳ緩衝液に対して透析した。

【００４０】ｐＣＧ１１６プラスミドＤＮＡ１μｇを
含む緩衝液Ｃ〔１０mM Tris-HCl(pH7.5)、１００mM NaC
l 、１０mM MgCl₂、1mM ＤＴＴ〕１９μｌに５単位の
ＢａｍＨＩを添加し、３７℃で１時間反応させた。一
方、実施例２（３）で用いた方法によりE.coli ATCC33
694 形質転換体の培養菌体から単離したｐＫＴ４プラス
ミドＤＮＡ１μｇを含む緩衝液４９μｌに５単位のＢａ
ｍＨＩを添加し、３７℃で１時間反応させた。これら両
反応液を0.８％アガロースゲル電気泳動で分離した後、
ＤＮＡ回収精製キット（旭硝子社製）を用いて各々6.５
kbおよび8.７kbの断片として回収した。両ＤＮＡ断片
を、常法のリガーゼ処理により連結した。このリガーゼ
反応液を用いて、実施例２（３）に従ってE.coli ATCC3
3694を形質転換し、スペクチノマイシン２５μｇを含む
ＬＢプレート上でスペクチノマイシン耐性形質転換体を
分離した。該形質転換体のうち、１つの形質転換体から
第２図に示すプラスミドｐＫＴ１０を単離した。

【００４１】ｐＫＴ１０ＤＮＡ１μｇをコリネバクテ
リウム・グルタミクムATCC13032 のプロトプラスト形質
転換〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacte
riol.), 159 ,306(1984) 〕に供した。プロトプラスト
は、次のように調製した。ＮＢ培地で増殖させたATCC13
032 株の種培養液0.８mlを４０mlＳＳＭ培地に接種して
振とう培養した。ＯＤが0.２になった時点で、培養液へ
0.５単位／mlの濃度となるようペニシリンＧを添加し
た。さらに、培養を継続し、ＯＤが0.６になるまで生育
させた。培養液から菌体を集菌し、１０mlのＲＣＧＰ培
地〔グルコース5g、カザミノ酸5g、酵母エキス2.5g、K₂
HPO₄3.5g、KH₂PO₄1.5g、MgCl₂・6H₂O 0.41g 、FeSO₄
・7H₂O 10mg 、MnSO₄・4〜6H₂O 2mg 、ZnSO₄・7H₂O 0.
9 mg、(NH₄)₆Mn₇O₂₄・4H₂O 0.04mg、ビオチン30μg 、
サイアミン塩酸塩 2mg、コハク酸ナトリウム 135g 、ポ
リビニルピロリドン（分子量 10000) 30g を水１リット
ルに含みpHを7.４に調整した培地〕に１mg／mlのリゾチ
ームを含む溶液(pH7.6) に懸濁した後、３０℃で１６時
間静置してプロトプラスト化した。このプロトプラスト
菌液を 2,500×ｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭＣ緩衝液
〔10mM MgCl₂、30mM CaCl₂、50mM Tris-HCl 、400mM
シュークロース(pH7.5) 〕１mlに懸濁して遠心洗浄後、
ＴＳＭＣ緩衝液0.１mlに再懸濁した。この懸濁液に、上
記に調製したｐＫＴ１０プラスミドＤＮＡ液１０μｌを
加えて混和し、次いでＴＳＭＣ緩衝液中に20％PEG 6000
を含む液 0.8mlを添加して混和した。さらに、氷水中で
２０分間、３７℃で３分間置いた後、 2,500×ｇで５分
間遠心分離にかけて上清液を除去した。沈澱したプロト
プラストを１mlのＲＣＧＰ培地に懸濁した後、この菌株
0.２mlをスペクチノマイシン４００μｇ／mlを含むＲＣ
ＧＰプレートに塗布し、３０℃で７日間の培養を行い形
質転換体を得た。形質転換体に含有されるプラスミドを
制限酵素切断解析した結果、形質転換体はｐＫＴ１０を
有することが確認された。

【００４２】また、同様にして、公知の方法〔ジャーナ
ル・オブ・ジェネラル・アプライド・ミクロバイオロジ
ー(J.Appl.Microbiol.)，15 , 27 (1969)〕に従って、
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032 から酢酸
非資化性変異株として取得したＩＣＬ欠損変異株を、ｐ
ＫＴ１０プラスミドＤＮＡ液を用いて形質転換した。ｐ
ＫＴ１０の導入された該ＩＣＬ欠損変異株は、酢酸を炭
素源とするＭＡ培地〔酢酸アンモニウム20g 、(NH₄)₂SO
₄10g 、尿素 3g 、KH₂PO₄1g、MgSO₄・7H₂O0.4g、FeSO
₄・7H₂O 2mg 、MnSO₄・4H₂O 2mg 、ビオチン 60 μg 、
サイアミン塩酸塩 2mg、NaCl 50 mgを水１リットルに含
みpH7.2 に調整した培地〕での増殖能を獲得し、ATCC13
032(pKT10)株と同レベルのＩＣＬ活性を有していた。こ
のことから、ｐＫＴ１０上に存在するコリネバクテリウ
ム・グルタミクムATCC13032 由来の6.0kb HindIIIＤＮ
Ａ断片は、ＩＣＬ遺伝子を含むことが確認された。

【００４３】コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13
032 およびATCC13032(pKT10)を、シュークロースを炭素
源とするＭＳＹＥ培地および酢酸を炭酸源とするＭＡＹ
Ｅ培地で３０℃、１６時間培養し、集菌後細胞抽出液を
調製した。この細胞抽出液中のＩＣＬ活性を、実施例１
に記載した方法で測定した。結果を表１に示した。コリ
ネバクテリウム・グルタミクムATCC13032 の場合と同様
にATCC13032(pKT10)においてもＭＡＹＥ培地で培養した
菌体が高いＩＣＬ活性を示し、その活性レベルはATCC13
032 に比べて約６倍高かった。

【００４４】両株の細胞抽出液を用いてSDS-ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で解析したところ、ＭＡＹＥ培地
で培養した菌体にのみ多量の４８kDa のＩＣＬ蛋白が検
出された。コリネバクテリウム・グルタミクムATCC1303
2(pKT10)の該蛋白質産生量は、全細胞蛋白質の約33％に
相当し、ATCC13032 株に比べて５〜６倍多かった。以上
の結果から、ＩＣＬ遺伝子は、コピー数を上げたときに
も同様に発現調節されることが判明した。

【００４５】（２）その他の宿主でのＩＣＬ遺伝子の増
幅発現前記の実施例３（１）と同様な方法で、表１に示すコリ
ネ型細菌１０菌種にｐＫＴ１０を導入した。ただし、ブ
レビバクテリウム・アンモニアゲネスATCC6872へのプラ
スミドｐＫＴ１０の導入は、特開昭63−185372に記載さ
れた方法に従って行った。すなわち、ＮＢ培地で培養し
た本菌の種培養液0.８mlを４０mlＧIII培地〔グルコー
ス15g 、(NH₄)₂SO₄8g、尿素 1.2g、酵母エキス 1.2g、
KH₂PO₄0.5g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄・7H₂O 0.1g、FeSO₄
・7H₂O 2mg、ZnSO₄・7H₂O 1mg、MnSO₄・4〜6H₂O 1mg、
ビオチン 0.1mg、サイアミン塩酸塩 2mg、パントテン酸
カルシウム 10mg、アデニン 100mg、グアニン 100mgを
水 1リットルに含みpH7.2に調整した培地〕に接種し、
３０℃にて振とう培養した。対数増殖期の初期（菌体濃
度10⁸個／ml) に0.3 単位／mlとなるようにペニシリン
Ｇを添加し、さらに３時間培養を続けた。培養液から3,
000rpm、１０分間の遠心分離により細胞を回収し、ＧII
I 培地で洗浄後、Ｐ３高張液〔NaCl 70mM 、MgCl₂5mM
、CaCl₂5mM、Tris-HCl 25mM 、D-ソルビトール1.6M (p
H7.6)〕に 2.0mg／mlリゾチームおよび 0.6mg／mlアク
ロモペプチダーゼを含有する溶液１０mlに懸濁し、３０
℃、１６時間静置してプロトプラストを調製した。この
ようにして調製したプロトプラストを用いて、実施例３
（１）に従って形質転換体を得た。

【００４６】得られた形質転換体をＭＳＹＥ培地および
ＭＡＹＥ培地で培養し、その細胞抽出液中のＩＣＬ活性
を測定した。なお、ブレビバクテリウム・アンモニアゲ
ネスATCC6872およびATCC6872 (pKT10)のＩＣＬ活性は、
ＭＳＹＥ培地で培養した菌体および該菌体をＭＡＹＥ培
地に懸濁し、３０℃、１６時間インキュベートした菌体
の細胞抽出液を用いて測定した。表１の結果が示すよう
に、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032 (pKT
10) の場合と同様に、いずれのｐＫＴ１０形質転換体に
ついてもＭＡＹＥ培地で培養あるいはインキュベートし
た菌体に高レベルのＩＣＬ活性が検出された。

【００４７】

【表１】

【００４８】実施例４ＩＣＬ遺伝子含有断片の解析（１）クローン化ＤＮＡ断片の制限酵素地図プラスミドｐＫＴ４ＤＮＡ１μｇを１０〜１２単位の
各制限酵素(AflII、AluI、BglII、ClaI、HindIII、Hpa
I、NcoI、NruI、SmaI、SphI、StuI、XhoI) 単独または
２種類を組み合わせて３７℃（SmaI以外の酵素) あるい
は３０℃（SmaI)で1 時間反応した。反応液を0.８％ア
ガロースゲル電気泳動あるいは５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけ、生成した切断片のサイズを測定す
ることにより、クローン化された6.０kbのHindIII ＤＮ
Ａ断片が第１図に示す制限酵素地図からなる構造をもつ
ことがわかった。

【００４９】（２）サブクローニング 6.０kb HindIII−ＤＮＡ断片上にクローン化されたＩＣ
Ｌ遺伝子の所在を特定するために、いくつかの領域をサ
ブクローン化した。ｐＫＴ４プラスミド２μｇを含む緩
衝液Ｃ４８μｌに１０単位のＨｉｎｄIII とＸｈｏＩ
を加えて、３７℃で２時間反応させた。一方、ｐＵＣ１
９２μｇを含む緩衝液Ｃ１８μｌに１０単位のＨｉ
ｎｄIII とＸｈｏＩを加えて、３７℃で２時間反応させ
た。これら両反応液を0.８％アガロースゲル電気泳動法
で分離した後、ＤＮＡ回収精製キットを用いて各々1.９
kbおよび2.７kbの断片として回収した。両ＤＮＡ断片
を、常法のリガーゼ処理により連結した。この反応液を
E.coli ATCC33694の形質転換に供し、プラスミドｐＫＴ
５を得た。さらに、ＫｐｎＩで切断したｐＫＴ５ＤＮＡ
を、同じ制限酵素で切断したコリネバクテリウム・グル
タミクムベクタープラスミドｐＣＧ１１６ＤＮＡと連結
し、プラスミドｐＫＴ１３を作製した。また、ｐＫＴ４
からＳｍａＩ−ＢｇｌII 2.2kb断片、ＨｐａＩ−Ｂｇｌ
II 2.1kb断片及びＳｔｕＩ−ＢｇｌII 1.2kb断片を分取
後、各々ｐＣＧ１１６のＳｍａＩ−ＢａｍＨＩリンカー
サイトに挿入連結し、プラスミドｐＫＴ１９、ｐＫＴ２
０、ｐＫＴ２１を作製した。これらのプラスミド上にク
ローン化されたＤＮＡ断片を第３図に示した。

【００５０】これらのプラスミドＤＮＡでコリネバクテ
リウム・グルタミクムATCC13032 を形質転換した。形質
転換株をＭＡＹＥ培地で培養し、得られた菌体のＩＣＬ
活性を測定した（第３図）。ｐＫＴ１９保有株とｐＫＴ
２０保有株はｐＫＴ１０保有株と同レベルの高活性を有
していたが、ｐＫＴ１３保有株およびｐＫＴ２１保有株
は宿主とほぼ同レベルの活性しか与えなかった。これら
の結果からＩＣＬ遺伝子は、第３図の上方に矢印で示し
た2.1kb ＨｐａＩ−ＢｇｌIIＤＮＡ断片内に位置づけら
れた。

【００５１】（３）ＩＣＬ遺伝子領域の塩基配列ＩＣＬをコードするＨｐａＩ−ＢｇｌII 2.1kbＤＮＡ断
片を、その断片上に存在する制限酵素サイトで切断し、
対応する制限酵素で切断したプラスミドｐＵＣ１１８、
ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）に挿入連結した。このよう
にして調製したプラスミドを用いてメッシングらのＭ１
３チェインターミネーション改良法〔メソッド・イン・
エンザイモロジー(Methods in Enzymology), 101 , 20
(1983)〕に従って塩基配列を決定した。結果を配列番号
３で表されるＤＮＡ塩基配列およびＩＣＬ構造遺伝子に
対応するアミノ酸配列で示す。この塩基配列中には、実
施例２（１）に示したＮ末端１８アミノ酸残基のうち１
７アミノ酸のコドンに対応する配列を含む４３１アミノ
酸残基からなるオープンリーディングフレーム(1293bp)
が見出された。従って、ＩＣＬプロモーター活性はＡＴ
Ｇ上流のＤＮＡ配列に特定された。また、ストップコド
ンＴＡＧから２７bp下流には、転写終結に機能すると考
えられる配列（配列番号３で示されるＤＮＡ塩基配列の
1833〜1846および1850〜1863の位置) が存在していた。

【００５２】実施例５コリネ型グルタミン酸生産菌に
おけるＩＣＬ遺伝子の相同性実施例２（１）および（２）に記載したＩＣＬのＮ末端
アミノ酸配列に対応する５０mer オリゴヌクレオチドあ
るいは５' 非翻訳領域であるＨｐａＩ−ＡｆｌII 0.5kb
断片（配列番号３）をプローブとして、各種コリネ型グ
ルタミン酸生産菌の染色体ＤＮＡ断片との相同性をリー
ドらのサザンハイブリダイゼーション法〔ヌクレイック
・アシッド・リサーチ(Nucleic. Acid. Res.), 13 , 72
07(1985)〕に従って調べた。

【００５３】ＨｐａＩ−ＡｆｌII 0.5kb断片を調製する
ために、プラスミドｐＫＴ１０（第２図、第３図）２μ
ｇを含む緩衝液Ｅ〔10mM Tris-HCl (pH7.5) 、40mM KC
l、10mM MgCl₂、1mM DTT 〕４９μl に１０単位のＡｆ
ｌIIを添加した後、３７℃で１時間反応させ、さらに３
μｌの1MKClおよび１０単位のＨｐａＩを添加し、３７
℃で１時間反応させた。この反応液を1.2%アガロースゲ
ルに載せ電気泳動後、ＤＮＡ回収精製キットを用いてＨ
ｐａＩ−ＡｆｌII 0.5kb断片として回収した。５０mer
オリゴヌクレオチドは実施例2(2)に従い５' 末端をラベ
ル化し、ＨｐａＩ−ＡｆｌII 0.5kb断片はニックトラン
スレーションキット（宝酒造社製）を用いて〔³²Ｐ〕で
ラベル化した。

【００５４】コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13
032 、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムATCC
13870 、コリネバクテリウム・カルナエATCC15991 、コ
リネバクテリウム・ハーキュリスATCC13868 、ブレビバ
クテリウム・ディバリカツムATCC14020 、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムATCC13655 、ミクロバク
テリウム・アンモニアフィラムATCC15354 から実施例２
（３）に記載した方法に従って染色体ＤＮＡを調製し
た。各々の染色体ＤＮＡ５μｇを含む緩衝液Ｂ９８μｌ
に２０単位のＨｉｎｄIII を添加し、３７℃で２時間反
応した。これら反応液１０μｌをそれぞれ0.８％アガロ
ースゲルに載せ電気泳動を行った。泳動後のゲルを0.25
M ＨＣｌ中に浸し１５分間振とうした後、脱イオン水で
すすぎ、0.4M ＮａＣｌをしみこませた濾紙（ワットマ
ン3MM ）の上に置いた。ゲルの上にナイロンフィルター
（BIO-RAD 社製ゼータプローブメンブレン) 、濾紙お
よび適当な重しを逐次乗せてゆき、ゲルの下から濾紙越
しに0.4M ＮａＯＨを供給してＤＮＡをフィルター上に
転写した。フィルターを６×SSC で洗浄し、風乾してハ
イブリダイゼーション実験に供した。このフィルター
を、プレハイブリダイゼーション溶液（６×SSC 、0.01
M EDTA、1%フィコール、1%ポリビニルピロリドン、1%牛
血清アルブミン、0.5%SDS 、10mg／ml変性サケ精子DNA
）２０mlに１０mg／mlサケ精子変性ＤＮＡ溶液 0.2ml
を加えた溶液に浸し、６８℃で３時間加熱した。フィル
ターを、プレハイブリダイゼーション溶液２０mlにラベ
ル化した各々のプローブ 0.2μg を加えたハイブリダイ
ゼーション溶液に移した。50mer オリゴヌクレオチドを
プローブとした場合には４０℃で１６時間、ＨｐａＩ−
ＡｆｌII 0.5kb断片をプローブとした場合には６８℃で
１６時間ハイブリダイゼーション処理した。処理したフ
ィルターは、ＳＷＳ（0.3 ×SSC 、0.05% SDS ）中に浸
し、５０mer オリゴヌクレオチドをプローブとした場合
には５２℃、３０分間処理を２回行い、ＨｐａＩ−Ａｆ
ｌII 0.5kbをプローブとした場合には６８℃、３０分間
処理を２回行って洗浄した。各々のフィルターは、風乾
した後、Ｘ線フィルム（フジフィルム社製）に密着させ
感光させた。

【００５５】その結果、コリネバクテリウム・カルナエ
ATCC15991 以外のコリネ型グルタミン酸生産菌では、い
ずれのプローブを用いた場合にも約6.0kb の染色体Ｈｉ
ｎｄIII ＤＮＡ切断片とハイブリッドを形成した。一
方、コリネバクテリウム・カルナエATCC15991 において
は、いずれのプローブを用いた場合にも約2.0kb のＨｉ
ｎｄIII 染色体ＤＮＡ断片とハイブリッドを形成した。
これらの結果から、これらグルタミン酸生産菌のＩＣＬ
遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC1303
2 のＩＣＬ構造遺伝子領域だけでなく、そのプロモータ
ー領域においても相同性を有することが明らかとなっ
た。

【００５６】実施例６ＩＣＬプロモーターによるクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ構造遺伝
子の発現大腸菌のプラスミドｐＫＫ２３２−８は、大腸菌由来の
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子領域中、プロモーター配列を除去した翻訳開始に必要
な配列から構造遺伝子までの領域を有し、その下流に大
腸菌リボソームＲＮＡ遺伝子由来のターミネーター配列
Ｔ₁Ｔ₂を配したＤＮＡ断片を含んでいる〔Brosius.
J. ジーン(Gene), 27 , 151(1984)〕。該ＤＮＡ断片を
含みグルタミン酸生産菌で複製できるプラスミドｐＣＧ
ＫＫ２７−３を第４図に示すように作製した。

【００５７】ｐＫＫ２３２−８ＤＮＡ（ファルマシア社
製）５μｇを含む緩衝液Ｃ 50μlに0.３単位のＰｓｔ
Ｉを添加し、３７℃で１時間処理した後、６８℃で１０
分間加温して反応を停止した。一方、特開昭57-186489
に記載した方法で保有株から調製したグルタミン酸生産
菌ベクターｐＣＧ１１（特開昭57-134500)DNA ２μgを
１２単位のＰｓｔＩを添加した緩衝液Ｃ４９μｌ中で
３７℃で１時間反応させさらに加温処理した。ｐＫＫ２
３２−８およびｐＣＧ１１ＤＮＡの各処理液を0.8%アガ
ロースゲル電気泳動にかけた後、ＤＮＡ回収精製キット
を用いて各々5.1kb および6.8kb ＤＮＡ断片を回収し
た。両ＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４リガーゼを加えて連結
処理した。

【００５８】このリガーゼ反応液を用いて、実施例２
（３）に従ってE.coli ATCC33694を形質転換し、スペク
チノマイシン２５μｇ／mlを含むＬＢプレート上でスペ
クチノマイシン耐性形質転換体を分離した。形質転換体
から抽出したプラスミドＤＮＡを制限酵素で切断解析
し、該形質転換体のうちの１つの株から第４図に示すよ
うにｐＫＫ２３２−８とｐＣＧ１１が連結されたプラス
ミドｐＣＧＫＫ２７−３を取得した。

【００５９】さらに、ｐＣＧＫＫ２７−３ＤＮＡでコリ
ネバクテリウム・グルタミクムATCC13032 を実施例３
（１）に記載した方法で形質転換した。スペクチノマイ
シン耐性で選択された形質転換体は、ｐＣＧＫＫ２７−
３を保有していたが、クロラムフェニコール耐性を示さ
ず、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
構造遺伝子はATCC13032 株でも発現しないことを確認し
た。

【００６０】次に、ＩＣＬプロモーター活性を含むＤＮ
Ａ断片をｐＣＧＫＫ２７−３に組み込んだ（第５図参
照）。ＩＣＬプロモーター含有断片として、第３図に示
す0.６kbのＳｍａＩ−ＡｌｕＩ断片を用いた。ｐＫＴ１
９ＤＮＡ５μｇを緩衝液Ｄ〔10mM Tris-HCl (pH7.5)
、20mM KCl、10mM MgCl₂、1mM DTT 〕４９μｌ中で１
０単位のＳｍａＩを添加して３０℃、１時間処理した
後、0.２M KCl ６μｌおよび１０単位のＡｆｌIIを添加
し３７℃で１時間反応した。反応液を１％アガロースゲ
ルに載せ、電気泳動後ＤＮＡ回収精製キットを用いて0.
８kbのＳｍａＩ−ＡｆｌIIＤＮＡ断片を単離した。この
ＤＮＡを含む緩衝液Ａ〔10mM Tris-HCl (pH7.5) 、10mM
MgCl₂、1mM DTT 〕４９μｌに１０単位のＡｌｕＩを
添加して、３７℃、１時間反応した後、６８℃、１０分
間加熱処理し、ＳｍａＩ−ＡｌｕＩＤＮＡ断片含有液を
調製した。

【００６１】一方、コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032 の形質転換体から単離したｐＣＧＫＫ２７−
３ＤＮＡ５μｇを、緩衝液Ｄ４９μｌ中で１０単位
のＳｍａＩを添加して、３０℃、１時間反応させさらに
加熱処理した。このｐＣＧＫＫ２７−３ＤＮＡ含有液と
前記のＳｍａＩ−ＡｌｕＩＤＮＡ断片含有液を混合し、
常法によりリガーゼ処理した。処理液を用いてコリネバ
クテリウム・グルタミクムATCC13032 を形質転換し、菌
液を酢酸アンモニウム10mg／ml、スペクチノマイシン 4
00μg ／mlおよびクロラムフェニコール５μｇ／mlを含
有するＲＣＧＰプレート上に塗布した。３０℃で７日間
培養して形質転換体のコロニーを得た。その１株から、
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ構造
遺伝子含有ＤＮＡ断片の直前に、ＳｍａＩ−ＡｌｕＩＤ
ＮＡ断片を組み込んだプラスミドｐＫＴ２２が取得され
た（第５図参照）。

【００６２】この形質転換株およびATCC13032 株をＭＳ
ＹＥ培地およびＭＡＹＥ培地で３０℃で１６時間培養し
集菌した。該菌体を破砕し、得られた細胞抽出液中のク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性
を、シャウらの方法〔メソッド・イン・エンザイモロジ
ー(Methods in Enzymology), 43 ,737(1975)〕に従っ
て測定した。１分間に１μmol のクロラムフェニコール
のアセチル化を触媒する酵素活性を１単位と定義した。

【００６３】上記と同様な方法で、表２に示すコリネ型
細菌５菌種にｐＫＴ２２を各々導入し、得られた形質転
換体をＭＳＹＥ培地およびＭＡＹＥ培地で培養し、その
細胞抽出液中のクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ活性を測定した。結果を表２に示す。

【００６４】

【表２】

【００６５】表２に示したように形質転換株は、ＭＡＹ
Ｅ培地で培養した時、高レベルのクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼを産生していることが認め
られた。著量のクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動解析において２４kDa の蛋白バンドとして観察され
た。以上の結果から、クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ構造遺伝子はＩＣＬプロモーターによ
り誘導的に発現していることが確認された。

【００６６】実施例７ＩＣＬプロモーターによるβ−
ガラクトシダーゼ構造遺伝子の発現ＩＣＬプロモーターにより大腸菌のβ−ガラクトシダー
ゼ構造遺伝子を発現する発現ベクターの作製を試みた。
第６図に工程の概略を示した。

【００６７】ＩＣＬ遺伝子を含むプラスミドｐＫＴ２０
１０μｇを含む緩衝液Ｃ 98μlに２４単位のＳｔｕ
Ｉを添加し、３７℃で２時間反応後、等量のフェノール
で１回抽出した。さらに、等量のクロロホルム／イソア
ミルアルコール（24／1 ，v/v)で１回抽出し、エタノー
ル沈澱後真空乾燥した。このＤＮＡをキロシークエンス
ディレーションキット（宝酒造社製）を用いてエキソヌ
クレアーゼIII による欠失処理をした。これら欠失断片
を含む緩衝液Ｃ４８μｌに２０単位のXhoＩを添加
し、３７℃で２時間反応させた。

【００６８】一方、β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子含
有ＤＮＡ断片をプラスミドｐＥ’ｌａｃ１（特開昭63-2
73469)から調製した。該プラスミドは、大腸菌ラクトー
スオペロン中β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子のＮ末端
から８番目のアミノ酸のコドンから上流の配列が欠如し
たＤＮＡ配列を含んでいる。ｐＥ’ｌａｃ１ＤＮＡ５
μｇを含む緩衝液Ｄ４９μｌに１０単位のＳｍａＩを
添加し、３０℃で２時間反応させた。さらに1.5 μl の
５ＭＮａＣｌと１０単位のＳａｌＩを添加し、３７℃で
２時間反応させた。プラスミドｐＫＴ２０およびｐＥ’
ｌａｃ１の切断片を各々0.8%アガロースゲル電気泳動で
分離した後、ＤＮＡ回収精製キットを用いて各々約7.6k
b および6.2kb の断片として回収した。両者を常法のリ
ガーゼ処理により連結した。

【００６９】このリガーゼ処理液を用いてコリネバクテ
リウム・グルタミクムATCC13032 を実施例３（１）の方
法に従って形質転換した後、菌液をスペクチノマイシン
400μg ／ml、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）４０μｇ／ml
及び酢酸アンモニウム0.01ｇ／mlを含有するＲＣＧＰプ
レート上に塗布した。３０℃、７日間培養後、このプレ
ート上で青く染まった形質転換体が得られた。該形質転
換体のうちの１つは、6.2kb のラクトースオペロン由来
ＤＮＡ断片がＩＣＬ遺伝子含有ＤＮＡ断片内に挿入され
たプラスミドｐＫＴ２３を保有していた（第６図参
照）。

【００７０】この形質転換体とコリネバクテリウム・グ
ルタミクムATCC13032 をＭＳＹＥ培地およびＭＡＹＥ培
地にて３０℃で１６時間培養し集菌した。菌体を破砕
し、細胞抽出液のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定し
た。β−ガラクトシダーゼ活性の測定は、ミラーらの方
法〔エクスペリメント・イン・モレキュラー・ジェネテ
ィクス（Experiments in Molecular Genetics), 352
、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(C
old Spring Harbor Laboratory)(1972) 〕に従って行っ
た。１分間に１μmolのＯ−ニトロフェノールの生成を
触媒する酵素活性を１単位とし、蛋白質１mg当りの比活
性を算出した。

【００７１】上記と同様な方法で、表３に示すコリネ型
細菌４菌種にｐＫＴ２３を各々導入し、得られた形質転
換体をＭＳＹＥ培地およびＭＡＹＥ培地で培養し、その
細胞抽出液中のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。
結果を表３に示す。

【００７２】

【表３】

【００７３】その結果、形質転換体のみが、ＭＡＹＥ培
地で培養したときに高レベルのβ−ガラクトシダーゼを
産生していた。著量のβ−ガラクトシダーゼが、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動解析において１１６
kDa より少し大きい蛋白バンドとして検出された。さら
に、ｐＫＴ２３上でのＩＣＬ遺伝子領域の５’側のＤＮ
Ａ断片とβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子の結合位置を
調べた。ｐＫＴ２３ＤＮＡ２μｇおよびプラスミドｐ
ＵＣ１１８ＤＮＡ（宝酒造社製）２μｇをそれぞれに含
む緩衝液Ａ49μｌに、それぞれ１０単位のＫｐｎＩを添
加し、３７℃で２時間反応させた。さらに、0.５μｌの
５MＮａＣｌと１０単位のＢａｍＨＩを加えて滅菌水で
反応液量を５５μｌに調整し、３７℃で２時間反応させ
た。これらｐＫＴ２３およびｐＵＣ１１８切断片処理物
を、各々0.８％アガロースゲル電気泳動にかけ、各々約
0.７kbおよび7.２kbの断片をＤＮＡ回収精製キットを用
いて回収した。両者を常法のリガーゼ処理により連結し
た後、実施例４（３）に従って塩基配列を決定した。

【００７４】その結果、配列番号４で示されるイソクエ
ン酸リアーゼのＮ末端から６３番目までのアミノ酸をコ
ードするＤＮＡ断片にＮ末端８アミノ酸を欠くβ−ガラ
クトシダーゼ構造遺伝子がインフレームで連結されてい
ることがわかった。以上の結果から、ＩＣＬプロモータ
ーの支配下にβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白が誘導的に
合成されることがわかった。

【００７５】

【発明の効果】本発明によれば、コリネ型細菌において
有用遺伝子産物を効率よく生産させるための遺伝子発現
調節ＤＮＡを提供することができる。

【００７６】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：Ｎ末端フラグメント配列 Ser Asn Val Gly Lys Pro Arg Thr Ala Gln Glu Ile Gln Gln Asp Asp 1 5 10 15 Asp Thr

【００７７】配列番号：2 配列の長さ：５０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｙｅｓアンチセンス：Ｙｅｓフラグメント型：Ｎ末端フラグメント配列 GTATCATCAT CCTGCTGGAT TTCCTGGGCG GTGCGTGGCT TGCCAACGTT 50

【００７８】配列番号：3 配列の長さ：２１３５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：コリネバクテリウムグルタミクム(Corynebac
terium glutamicum) 株名：ATCC 13032 配列の特徴特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：514..1806 特徴を決定した方法：Ｅ配列 GTTAACGGTT GTGAAAACTC TTTTAAGAAA AGCACTCTGA CTACCTCTGG AATCTAGGTG 60 CCACTCTTCT TTCGATTTCA ACCCTTATCG TGTTTGGCGA TGTGATCAGA CTAAGTGATC 120 ACCGTCACCA GCAAAAGGGG TTTGCGAACT TTACTAAGTC ATTACCCCCG CCTAACCCCG 180 ACTTTTATCT AGGTCACACC TTCGAAACCT ACGGAACGTT GCGGTGCCTG CATTTTCCCA 240 TTTCAGAGCA TTTGCCCAGT ACATCCGTAC TAGCAACTCC CCCGCCCACT TTTTCTGCGA 300 AGCCAGAACT TTGCAAACTT CACAACAGGG GTGACCACCC GCACAAAACT TAAAAACCCA 360 AACCGATTGA CGCACCAATG CCCGATGGAG CAATGTGTGA ACCACGCCAC CACGCAAACC 420 GATGCACATT ACGTCGAAAC AGTGACAGTG CATTAGCTCA TACTTTGTGG TGGCACCGCC 480 CATTGCGAAT CAGCACTTAA GGAAGTGACT TTG ATG TCA AAC GTT GGA AAG CCA 534 Met Ser Asn Val Gly Lys Pro 1 5 CGT ACC GCA CAG GAA ATC CAG CAG GAT TGG GAC ACC AAC CCT CGT TGG 582 Arg Thr Ala Gln Glu Ile Gln Gln Asp Trp Asp Thr Asn Pro Arg Trp 10 15 20 AAC GGC ATC ACC CGC GAC TAC ACC GCA GAC CAG GTA GCT GAT CTG CAG 630 Asn Gly Ile Thr Arg Asp Tyr Thr Ala Asp Gln Val Ala Asp Leu Gln 25 30 35 GGT TCC GTC ATC GAG GAG CAC ACT CTT GCT GCC GCG GCT CAG AGA TCC 678 Gly Ser Val Ile Glu Glu His Thr Leu Ala Ala Ala Ala Gln Arg Ser 40 45 50 55 TCT GGG ACG CAG TCA CCC AGG AAG GTG ACG GAT ACA TCA ACG CTT GGC 726 Ser Gly Thr Gln Ser Pro Arg Lys Val Thr Asp Thr Ser Thr Leu Gly 60 65 70 GCA CTC ACC GGT AAC CAG GCT GTT CAG CAG GTT CGT GCA GGC CTG AAG 774 Ala Leu Thr Gly Asn Gln Ala Val Gln Gln Val Arg Ala Gly Leu Lys 75 80 85 GCT GTC TAC CTG TCC GGT TGG CAG GTC GCA GGT GAC GCC AAC CTC TCC 822 Ala Val Tyr Leu Ser Gly Trp Gln Val Ala Gly Asp Ala Asn Leu Ser 90 95 100 GGC CAC ACC TAC CCT GAC CAG TCC CTC TAC CCA GCG AAC TCC GTT CCA 870 Gly His Thr Tyr Pro Asp Gln Ser Leu Tyr Pro Ala Asn Ser Val Pro 105 110 115 AGC GTC GTT CGT CGC ATC AAC AAC GCA CTG CTG CGT TCC GAT GAA ATC 918 Ser Val Val Arg Arg Ile Asn Asn Ala Leu Leu Arg Ser Asp Glu Ile 120 125 130 135 GCA CGC ACC GAA GCG ACA CCT CCG TTG ACA ACT GGG TTG TCC CAA TCG 966 Ala Arg Thr Glu Ala Thr Pro Pro Leu Thr Thr Gly Leu Ser Gln Ser 140 145 150 TCG CGG ACG GCG AAG TGG CTT CGG TGG AGC ACT CAA CGT CTA CAA CTC 1014 Ser Arg Thr Ala Lys Trp Leu Arg Trp Ser Thr Gln Arg Leu Gln Leu 155 160 165 CAG AAG GCA ATG ATC GCA GCT GGC GCT GCA GGC ACC CAC TGG GAA GAC 1062 Gln Lys Ala Met Ile Ala Ala Gly Ala Ala Gly Thr His Trp Glu Asp 170 175 180 CAC GTC GCT TCT GAA AAG AAG TGT GGC CAC CTC GGC GGC AAG GTT CTG 1110 His Val Ala Ser Glu Lys Lys Cys Gly His Leu Gly Gly Lys Val Leu 185 190 195 ATC CCA ACC CAG CAG CAC ATC CGC ACC CTG AAC TCT GCC CGC CTT GCA 1158 Ile Pro Thr Gln Gln His Ile Arg Thr Leu Asn Ser Ala Arg Leu Ala 200 205 210 215 GCA GAC GTT GCA AAC ACC CCA ACT GTT GTT ATC GCA CGT ACC GAC GCT 1206 Ala Asp Val Ala Asn Thr Pro Thr Val Val Ile Ala Arg Thr Asp Ala 220 225 230 GAG GCA GCA ACC CTG ATC ACC TCT GAC GTT GAT GAG CGC GAC CAA CCA 1254 Glu Ala Ala Thr Leu Ile Thr Ser Asp Val Asp Glu Arg Asp Gln Pro 235 240 245 TTC ATC ACC GGT GAG CGC ACC GCA GAA GGC TAC TAC CAC GTC AAG AAT 1302 Phe Ile Thr Gly Glu Arg Thr Ala Glu Gly Tyr Tyr His Val Lys Asn 250 255 260 GGT CTC GAG CCA TGT ATC GCA CGT GCA AAG TCC TAC GCA CCA TAC GCA 1350 Gly Leu Glu Pro Cys Ile Ala Arg Ala Lys Ser Tyr Ala Pro Tyr Ala 265 270 275 GAT ATG ATC TGG ATG GAG ACC GGC ACC CCT GAC CTG GAG CTC GCT AAG 1398 Asp Met Ile Trp Met Glu Thr Gly Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Lys 280 285 290 295 AAG TTC GCT GAA GGC GTT CGC TCT GAG TTC CCA GAC CAG CTG CTG TCC 1446 Lys Phe Ala Glu Gly Val Arg Ser Glu Phe Pro Asp Gln Leu Leu Ser 300 305 310 TAC AAC TGC TCC CCA TCC TTC AAC TGG TCT GCA CAC CTC GAG GCA GAT 1494 Tyr Asn Cys Ser Pro Ser Phe Asn Trp Ser Ala His Leu Glu Ala Asp 315 320 325 GAG ATC GCT AAG TTC CAG AAG GAA CTC GGC GCA ATG GGC TTC AAG TTC 1542 Glu Ile Ala Lys Phe Gln Lys Glu Leu Gly Ala Met Gly Phe Lys Phe 330 335 340 CAG TTC ATC ACC CTC GCA GGC TTC CAC TCC CTC AAC TAC GGC ATG TTC 1590 Gln Phe Ile Thr Leu Ala Gly Phe His Ser Leu Asn Tyr Gly Met Phe 345 350 355 GAC CTG GCT TAC GGA TAC GCT CGC GAA GGC ATG ACC TCC TTC GTT GAC 1638 Asp Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Arg Glu Gly Met Thr Ser Phe Val Asp 360 365 370 375 CTG CAG AAC CGT GAG TTC AAG GCA GCT GAA GAG CGT GGC TTC ACC GCT 1686 Leu Gln Asn Arg Glu Phe Lys Ala Ala Glu Glu Arg Gly Phe Thr Ala 380 385 390 GTT AAG CAC CAG CGT GAG GTT GGC GCA GGC TAC TTC GAC CAG ATC GCA 1734 Val Lys His Gln Arg Glu Val Gly Ala Gly Tyr Phe Asp Gln Ile Ala 395 400 405 ACC ACC GTT GAC CCG AAC TCT TCT ACC ACC GCT TTG AAG GGT TCC ACT 1782 Thr Thr Val Asp Pro Asn Ser Ser Thr Thr Ala Leu Lys Gly Ser Thr 410 415 420 GAA GAA GGC CAG TTC CAC AAC TAG GACCTACAGG TTCTGACAAT TTAAATCTCC 1836 Glu Glu Gly Gln Phe His Asn *** 425 430 CTACATCTGT ACAACGGATG TAGGGAGTTT TTCCTTATAT ATGCCCTCCA CAAATCCCCT 1896 ATCGTGTGAG ATGTGTTTCA TAGGTGCCCC CAACGTTGCC TGTTGACTGC AAATTTTCCG 1956 AAAGAATCCA TAAACTACTT CTTTAAGTCG CCAGATTAAA GTCGTCAATG AAAGGACATA 2016 CATGTCTATT TCCCGCACCG TCTTCGGCAT CGCAGCCACC GCAGCCCTGT CTGCAGCTCT 2076 CGTTGCGTGT TCTCCACCTC ACCAGCAGGA TTCCCCAGTC CAGCGCACCA ATGAGATCT 2135

【００７９】配列番号：４配列の長さ：７０２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA フラグメント型：Ｎ末端フラグメント起源生物名：コリネバクテリウムグルタミクム (Coryneba
cterium glutamicum) 株名：ATCC 13032 配列の特徴特徴を表す記号：transit peptide 存在位置：514..702 特徴を決定した方法：Ｅ配列 GTTAACGGTT GTGAAAACTC TTTTAAGAAA AGCACTCTGA CTACCTCTGG AATCTAGGTG 60 CCACTCTTCT TTCGATTTCA ACCCTTATCG TGTTTGGCGA TGTGATCAGA CTAAGTGATC 120 ACCGTCACCA GCAAAAGGGG TTTGCGAACT TTACTAAGTC ATTACCCCCG CCTAACCCCG 180 ACTTTTATCT AGGTCACACC TTCGAAACCT ACGGAACGTT GCGGTGCCTG CATTTTCCCA 240 TTTCAGAGCA TTTGCCCAGT ACATCCGTAC TAGCAACTCC CCCGCCCACT TTTTCTGCGA 300 AGCCAGAACT TTGCAAACTT CACAACAGGG GTGACCACCC GCACAAAACT TAAAAACCCA 360 AACCGATTGA CGCACCAATG CCCGATGGAG CAATGTGTGA ACCACGCCAC CACGCAAACC 420 GATGCACATT ACGTCGAAAC AGTGACAGTG CATTAGCTCA TACTTTGTGG TGGCACCGCC 480 CATTGCGAAT CAGCACTTAA GGAAGTGACT TTG ATG TCA AAC GTT GGA AAG CCA 534 Met Ser Asn Val Gly Lys Pro 1 5 CGT ACC GCA CAG GAA ATC CAG CAG GAT TGG GAC ACC AAC CCT CGT TGG 582 Arg Thr Ala Gln Glu Ile Gln Gln Asp Trp Asp Thr Asn Pro Arg Trp 10 15 20 AAC GGC ATC ACC CGC GAC TAC ACC GCA GAC CAG GTA GCT GAT CTG CAG 630 Asn Gly Ile Thr Arg Asp Tyr Thr Ala Asp Gln Val Ala Asp Leu Gln 25 30 35 GGT TCC GTC ATC GAG GAG CAC ACT CTT GCT GCC GCG GCT CAG AGA TCC 678 Gly Ser Val Ile Glu Glu His Thr Leu Ala Ala Ala Ala Gln Arg Ser 40 45 50 55 TCT GGG ACG CAG TCA CCC AGG AAG 702 Ser Gly Thr Gln Ser Pro Arg Lys 60

【００８０】

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図はＩＣＬ遺伝子のＨｉｎｄIII 6.０kbク
ローン化ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す。

【図２】第２図はｐＫＴ１０の作製工程を示す。

【図３】第３図はＩＣＬ遺伝子のＨｉｎｄIII 6.0kb ク
ローン化ＤＮＡ断片のサブクローニングにおける制限酵
素地図を示す。

【図４】第４図はｐＣＧＫＫ２７ー３の作製工程を示
す。

【図５】第５図はｐＫＴ２２の作製工程を示す。

【図６】第６図はｐＫＴ２３の作製工程を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 9/88 7823−4Ｂ 15/17 15/20 15/27 15/54 15/56 15/58 15/60 15/67 15/77 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｅ 8214−4ＢＨ 8214−4ＢＦ 8214−4ＢＣ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/38 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 9/38 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 9/38 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】コリネ型細菌のイソクエン酸リアーゼ
（ＩＣＬ）遺伝子に由来するＤＮＡであって、タンパク
質をコードする構造遺伝子とともにベクターＤＮＡに組
み込まれ、宿主コリネ型細菌に導入されたときに、該構
造遺伝子の発現を調節する作用を有するＤＮＡ。
【請求項２】構造遺伝子の発現が、培地中の炭素源を
糖質にしたときに抑制され、培地中の炭素源を非糖質に
したときまたは糖質非存在培地で誘導されるものである
請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】配列番号３に示される塩基配列の第１番
から第７０２番までの塩基配列に包含されるＤＮＡであ
る請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項４】構造遺伝子が、ＩＣＬ、β−ガラクトシ
ダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ、インシュリン、成長ホルモン、インターフェロン
および顆粒球コロニー刺激ホルモンから選ばれる酵素ま
たはタンパク質をコードする遺伝子である請求項１記載
のＤＮＡ。
【請求項５】ＩＣＬ遺伝子を採取するコリネ型細菌
が、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およ
びミクロバクテリウム属から選ばれるものである請求項
１記載のＤＮＡ。
【請求項６】コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・
グルタミクムATCC13032 、コリネバクテリウム・アセト
アシドフィラムATCC13870 、コリネバクテリウム・アセ
トグルタミクムATCC15806、コリネバクテリウム・カル
ナエATCC15991、コリネバクテリウム・ハーキュリスATC
C13868 、コリネバクテリウム・メラセコーラATCC17965
、コリネバクテリウム・リリウムATCC15990 、ブレビ
バクテリウム・イマリオフィラムATCC14068 、ブレビバ
クテリウム・サッカロリティクムATCC14066 、ブレビバ
クテリウム・チオゲニタリスATCC19240 、ブレビバクテ
リウム・ディバリカツムATCC14020 、ブレビバクテリウ
ム・フラブムATCC14067 、ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムATCC13869 、ブレビバクテリウム・ロゼ
ウムATCC13825 および、ミクロバクテリウム・アンモニ
アフィラムATCC15354 から選ばれる請求項５記載のＤＮ
Ａ。
【請求項７】宿主コリネ型細菌が、コリネバクテリウ
ム属、ブレビバクテリウム属およびミクロバクテリウム
属から選ばれるものである請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項８】宿主コリネ型細菌が、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムATCC13032 、コリネバクテリウム・ア
セトアシドフィラムATCC13870 、コリネバクテリウム・
アセトグルタミクムATCC15806 、コリネバクテリウム・
カルナエATCC15991 、コリネバクテリウム・ハーキュリ
スATCC13868 、コリネバクテリウム・メラセコーラATCC
17965 、コリネバクテリウム・リリウムATCC15990 、ブ
レビバクテリウム・イマリオフィラムATCC14068 、ブレ
ビバクテリウム・サッカロリティクムATCC14066 、ブレ
ビバクテリウム・チオゲニタリスATCC19240 、ブレビバ
クテリウム・ディバリカツムATCC14020 、ブレビバクテ
リウム・フラブムATCC14067 、ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムATCC13869 、ブレビバクテリウム・
ロゼウムATCC13825 および、ミクロバクテリウム・アン
モニアフィラムATCC15354 から選ばれる請求項７記載の
ＤＮＡ。
【請求項９】コリネ型細菌のイソクエン酸リアーゼ
（ＩＣＬ）遺伝子に由来するＤＮＡであって、タンパク
質をコードする構造遺伝子とともにベクターＤＮＡに組
み込まれて宿主コリネ型細菌に導入されたときに、該構
造遺伝子の発現を調節する作用を有するＤＮＡとタンパ
ク質をコードする構造遺伝子とがベクターＤＮＡに組み
込まれた組換えＤＮＡ。
【請求項１０】コリネ型細菌のイソクエン酸リアーゼ
（ＩＣＬ）遺伝子に由来するＤＮＡであって、タンパク
質をコードする構造遺伝子とともにベクターＤＮＡに組
み込まれて宿主コリネ型細菌に導入されたときに、該構
造遺伝子の発現を調節する作用を有するＤＮＡとタンパ
ク質をコードする構造遺伝子とがベクターＤＮＡに組み
込まれた組換えＤＮＡを含む形質転換体。
【請求項１１】コリネ型細菌のイソクエン酸リアーゼ
（ＩＣＬ）遺伝子に由来するＤＮＡであって、タンパク
質をコードする構造遺伝子とともにベクターＤＮＡに組
み込まれて宿主コリネ型細菌に導入されたときに、該構
造遺伝子の発現を調節する作用を有するＤＮＡとタンパ
ク質をコードする構造遺伝子とがベクターＤＮＡに組み
込まれた組換えＤＮＡを含む形質転換体を培地に培養
し、培養物中に該タンパク質を生成蓄積させ、該培養物
から該タンパク質を採取することを特徴とするタンパク
質の製造法。